專利名稱：：神經(jīng)干細(xì)胞的制作方法神經(jīng)干細(xì)胞本發(fā)明涉及神經(jīng)干細(xì)胞以及培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(NS細(xì)胞或NSC)以促進(jìn)干細(xì)胞的對(duì)稱分裂和自我更新的培養(yǎng)條件和方法。也提供了組合物、細(xì)胞群體、細(xì)胞系和單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞。雖然據(jù)說祌經(jīng)干細(xì)胞可在體外分離自多種來源，但迄今仍不可能在對(duì)稱分裂、未分化狀態(tài)的大規(guī)模培養(yǎng)中擴(kuò)展細(xì)胞。從實(shí)驗(yàn)和治療觀點(diǎn)來看，都非常需要使在此狀態(tài)中長期擴(kuò)展細(xì)胞。獲得的純神經(jīng)干細(xì)胞群體能夠定向分化為三種細(xì)胞類型神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(雖然作為不均一細(xì)胞群體的一小部分)的一種已知方法是神經(jīng)球(neurosphere)系統(tǒng)。此系統(tǒng)包括連續(xù)傳代不均一的細(xì)胞聚集體，其中僅有一小部分是真正的神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)球中的大多數(shù)細(xì)胞是定型祖細(xì)胞。有許多關(guān)于神經(jīng)球的不均一性和不穩(wěn)定性，以及它們產(chǎn)生神經(jīng)元的能力有限的報(bào)道(如Morshead等，2002)。Rappa等，A^/myc/e"ce2003報(bào)道了以下方法將神經(jīng)球細(xì)胞平板接種在纖連蛋白上1-7天以轉(zhuǎn)染神經(jīng)球細(xì)胞，然后重建神經(jīng)球但不提供神經(jīng)球內(nèi)干細(xì)胞(如果有)的顯著表征。Suslov等，2002提供了明確數(shù)據(jù)證明，神經(jīng)球系統(tǒng)太不均一，以致于不能有意義地表征其中的任何干細(xì)胞。主要結(jié)論是，神經(jīng)球內(nèi)不僅不均一-"顯示克隆內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞譜系多樣性，即除NSC以外，它們含有不同分化狀態(tài)的神經(jīng)元祖細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞"-而且不同克隆神經(jīng)球品系之間的基因表達(dá)型存在很大差異。正如論文中明確確認(rèn)的那樣，Suslov的基因表達(dá)型分析沒有建立神經(jīng)球內(nèi)干細(xì)胞的定義-"獲得的分子表型表明我們系統(tǒng)中的產(chǎn)克隆NSC是不均一的，其中的亞組反映出不同的神經(jīng)發(fā)育定型"。本領(lǐng)域的許多文獻(xiàn)描述了膠質(zhì)細(xì)胞的特性。Skogh等，MCN2001描述了表達(dá)GFAP以及對(duì)RC2和干蛋白染色易變的膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物-應(yīng)注意，在體內(nèi)，放射狀膠質(zhì)中不表達(dá)小鼠GFAP(Rakic，2003)。他們報(bào)道，他們的細(xì)胞不表達(dá)神經(jīng)原性放射狀膠質(zhì)的標(biāo)記Pax6(Malatesta等，2001，2003)，他們沒有檢測到其它放射狀膠質(zhì)標(biāo)記。他們有不均一的培養(yǎng)物，沒有進(jìn)行克隆分析。關(guān)于體外放射狀膠質(zhì)的其它報(bào)道認(rèn)為它們是分化中間體或最終產(chǎn)物。因此，Bibel等(NatNeurosci，2004)報(bào)道了從ES細(xì)胞通過瞬時(shí)放射狀膠質(zhì)樣細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元，Gregg和Weiss(JNeurosci，23:11587-601,2003;美國專利公開2003/0032181)描述了神經(jīng)球細(xì)胞"分化"為放射狀膠質(zhì)。Hartfuss等(DevBiol，2001)證明，放射狀膠質(zhì)存在于神經(jīng)球。Gregg和Weiss發(fā)現(xiàn)，放射狀膠質(zhì)是神經(jīng)球的分化產(chǎn)物，可以斷定"這些結(jié)果表明神經(jīng)干細(xì)胞可產(chǎn)生RGC[放射狀膠質(zhì)細(xì)胞]和成年動(dòng)物CNS中可重演(recapitulate)RGC指導(dǎo)的遷移"。流行的觀點(diǎn)是放射狀膠質(zhì)是神經(jīng)球產(chǎn)生的分化細(xì)胞類型之一。Liour和Yu(Glia,2003)證明，放射狀膠質(zhì)細(xì)胞分化可獲自ES細(xì)胞，但本領(lǐng)域的其它報(bào)道沒有提到神經(jīng)原性放射狀膠質(zhì)的擴(kuò)展。Gobbel等，Sm/"Wm2003報(bào)道了多能大鼠細(xì)胞能增殖為"松散地粘附于基材上生長的細(xì)胞的球狀簇"，即不形成均一的單層。而且，此論文的摘要斷定"這些細(xì)胞在3次分裂中大約兩次產(chǎn)生有絲分裂后細(xì)胞，因此使擴(kuò)展困難"。他們的培養(yǎng)物中廣泛出現(xiàn)產(chǎn)膠質(zhì)細(xì)胞的分化，但作者發(fā)現(xiàn)"相對(duì)少"(<3%)神經(jīng)元。他們沒有提供細(xì)胞的分子表型。WO01/30981描述了可分化為神經(jīng)元的細(xì)胞的培養(yǎng)物。但這些細(xì)胞是GFAP和干蛋白陽性，被描述為星形膠質(zhì)細(xì)胞，是相對(duì)不純的混合群體。干細(xì)胞需要特定細(xì)胞微環(huán)境或小生境的觀點(diǎn)是干細(xì)胞生物學(xué)中的正統(tǒng)觀點(diǎn)。雖然不總是承認(rèn)，但己知神經(jīng)球干細(xì)胞僅構(gòu)成祖細(xì)胞、母細(xì)胞和未成熟的分化后代等全部細(xì)胞中的一小部分。此種混合細(xì)胞類型的聚集可構(gòu)成其中可能有干細(xì)胞的小部分細(xì)胞的小生境。文獻(xiàn)中沒有報(bào)道過由ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞的均一群體，僅產(chǎn)生可能在變?yōu)槟z質(zhì)細(xì)胞限制性之前瞬時(shí)擴(kuò)展的神經(jīng)上皮前體細(xì)胞(如Brustle等，Science1999)。因此，本領(lǐng)域中存在許多問題。所有報(bào)道都承認(rèn)他們的培養(yǎng)物是不均一的。不可能用神經(jīng)球系統(tǒng)維持對(duì)稱分裂和不分化狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。培養(yǎng)大量神經(jīng)干細(xì)胞的其它嘗試沒有成功地超過5-20代，細(xì)胞高度傾向于分化也阻礙了這些嘗試。例外是有關(guān)成年大鼠海馬干細(xì)胞的工作，但這些是染色體組型異常，并且低效率地形成神經(jīng)元。當(dāng)瞬時(shí)神經(jīng)發(fā)育前體已知時(shí)，沒有分離和純化到永生或接近永生的自我更新干細(xì)胞。需要由ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞，然后在純培養(yǎng)物中維持這些神經(jīng)干細(xì)胞，但迄今這還不可能。也需要由ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞用于移植，但已知ES產(chǎn)生的細(xì)胞群體中持續(xù)存在ES和其它非神經(jīng)細(xì)胞會(huì)在受試動(dòng)物中產(chǎn)生腫瘤。還需要由胚胎和出生后的CNS獲得純神經(jīng)干細(xì)胞群體。完全理解控制神經(jīng)干細(xì)胞行為的分子和細(xì)胞事件是必要的，它不僅是理解胚胎發(fā)生的途徑，而且是可分離、擴(kuò)展和控制神經(jīng)干細(xì)胞用于將來的治療應(yīng)用的框架。本領(lǐng)域已知的神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法(由于上述原因)不適合用于這些研究和治療應(yīng)用。因此，需要開發(fā)培養(yǎng)能將細(xì)胞維持在對(duì)稱分裂自我更新狀態(tài)中的大量神經(jīng)干細(xì)胞的方法和條件。尤其需要有確定成分培養(yǎng)基，它應(yīng)滿足上述要求，因?yàn)榕R床上非常需要采用確定成分培養(yǎng)基。本發(fā)明解決了一個(gè)或多個(gè)上述問題。更具體說，本發(fā)明提供了促進(jìn)神經(jīng)干(NS)細(xì)胞對(duì)稱分裂的方法，該方法包括用含有以下成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)所述細(xì)胞(a)EGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物；和(b)FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在無血清的條件下，如用無血清和無血清抽提物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。還優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞使其附著于基材，或稱為貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)基也優(yōu)選含有胰島素或細(xì)胞上胰島素受體的另一種激動(dòng)劑。在本
發(fā)明內(nèi)容中，應(yīng)理解術(shù)語"促進(jìn)"包括將神經(jīng)干細(xì)胞維持在對(duì)稱分裂狀態(tài)中。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了支持和優(yōu)選促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞以未分化狀態(tài)自我更新和對(duì)稱分裂許多代的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基基本上防止神經(jīng)干細(xì)胞的不對(duì)稱分裂和分化。本發(fā)明還提供了獲得神經(jīng)干細(xì)胞的方法，特別是如本文所述的方法，還提供了由這種方法獲得的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了神經(jīng)細(xì)胞群體、組合物、細(xì)胞系、產(chǎn)克隆細(xì)胞系和單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，其包括自我更新、對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明其它方面提供了促進(jìn)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，以及將獲得的神經(jīng)干細(xì)胞維持在自我更新、對(duì)稱分裂、基本上不分化的狀態(tài)中。定義部分"神經(jīng)干細(xì)胞"本說明書中所用"神經(jīng)干細(xì)胞"指在維持產(chǎn)生神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的能力時(shí)能夠進(jìn)行20-30次以上細(xì)胞分裂的細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選能夠進(jìn)行40次以上、更優(yōu)選50次以上、最優(yōu)選進(jìn)行無限次細(xì)胞分裂。神經(jīng)干細(xì)胞能夠?qū)ΨQ或不對(duì)稱分裂。在對(duì)稱分裂時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞分裂形成兩個(gè)子神經(jīng)干細(xì)胞或兩個(gè)定型祖細(xì)胞，盡管本文中除非另有規(guī)定的對(duì)稱分裂指對(duì)稱的自我更新；當(dāng)不對(duì)稱分裂時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞分裂形成一個(gè)子神經(jīng)干細(xì)胞和一個(gè)定型祖細(xì)胞(如神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞)。本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞可描述為放射狀膠質(zhì)，已證明它能表達(dá)放射狀膠質(zhì)標(biāo)記RC2、3CB2、GLAST、BLBP和Pax6中的至少一禾中(優(yōu)選全部)。本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)RC2、3CB2和GLAST。該細(xì)胞更優(yōu)選表達(dá)RC2、3CB2、GLAST和BLBP或Pax-6中的至少一種。本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞的特征也可以是神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記干蛋白或波形蛋白、LewisX抗原、Musashi-l或凸素(prominin)中至少一種(優(yōu)選全部)的表達(dá)呈陽性，Oct-4或Nanog中至少一種(優(yōu)選兩者)的表達(dá)呈陰性(也參見實(shí)施例1-3)。本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞的定義是多能的，即，它們能夠分化成許多神經(jīng)細(xì)胞類型(如神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞)。以下實(shí)施例證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞保留了它們的效能，且能夠分化成所有預(yù)計(jì)的細(xì)胞類型。"神經(jīng)干細(xì)胞來源"可能由各種來源產(chǎn)生本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞。例如，神經(jīng)干細(xì)胞可直接衍生自胚胎、成年動(dòng)物組織、胎組織或胚胎干(ES)細(xì)胞(野生型或遺傳修飾的ES細(xì)胞)。本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞優(yōu)選衍生自小鼠或人ES細(xì)胞，或者衍生自小鼠或人胚胎細(xì)胞。本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞可衍生自人、靈長動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物和鳥類等。神經(jīng)干細(xì)胞優(yōu)選衍生自哺乳動(dòng)物，尤其是小鼠、大鼠和人。"EGF受體家族"本說明書所用術(shù)語"EGF受體家族"指可被EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子家族活化的受體家族(通常是同源二聚體或異源二聚體受體)。受體由四個(gè)高度同源的跨膜糖蛋白ErbB-l(也稱為EGF-R)、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4組成。"EGF受體"包括EGF受體家族的任何單體或二聚體受體復(fù)合物。各受體具有胞外配體結(jié)合域，此結(jié)構(gòu)域是一個(gè)單疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)通過1型受體酪氨酸激酶活性進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。配體與任何受體的結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化和自身磷酸化，然后許多細(xì)胞底物的磷酸化導(dǎo)致一系列生物效應(yīng)。受體二聚化可由各種刺激引發(fā)，包括受體配體和有毒環(huán)境刺激如UV輻射。各二聚體受體能通過征集不同含有SH2的效應(yīng)物蛋白啟動(dòng)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。例如，EGF-R二聚體可與銜接蛋白Grb復(fù)合，偶聯(lián)于鳥嘌昤核苷酸釋放因子SOS。Grb-SOS復(fù)合物可直接結(jié)合于受體中的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，或者間接通過She結(jié)合。這些蛋白相互作用使SOS與Ras緊密相鄰，允許Ras活化。這隨后能活化ERK和JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而活化調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，如c-fos、AP-l和Elk-l。EGF受體也可活化PLCY信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。"FGF受體"本說明書中所用術(shù)語"FGF受體"描述跨膜FGF受體酪氨酸激酶家族的任何成員。這些受體有四種主要的同種型FGFR1、2、3和4，己知其作用與肝素及硫酸乙酰肝素(HS)系統(tǒng)緊密相關(guān)。FGF受體包括FGF受體家族的任何單體或二聚體(同源或異源二聚體)復(fù)合物。與FGF受體相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括MAP激酶途徑和PLCY途徑。"培養(yǎng)基"本發(fā)明所用培養(yǎng)基優(yōu)選包含任選補(bǔ)充附加組分的基本培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基是為神經(jīng)干細(xì)胞提供必需的碳和/或維生素和/或礦物質(zhì)來源的培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基通常不含蛋白質(zhì)，本身不能支持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新/對(duì)稱分裂。優(yōu)選地，本發(fā)明所用培養(yǎng)基不包含任何不明確的組分(如血清和/或飼細(xì)胞)，即成分未知或可能包含不明確或未指明的變化因子的組分。使用不含血清和血清提取物的完全確定成分培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是可以產(chǎn)生培養(yǎng)和后續(xù)操作神經(jīng)干細(xì)胞的有效且一致的方案。"培養(yǎng)表面"本發(fā)明所有方面中培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的典型表面是本領(lǐng)域所認(rèn)識(shí)可用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)表面，包括塑料、金屬、復(fù)合材料表面，盡管通常采用可購得的表面如塑料組織培養(yǎng)板。這種培養(yǎng)板的直徑通常為數(shù)厘米。若擴(kuò)大生產(chǎn)，可用更大直徑的此類培養(yǎng)板并使用許多重復(fù)培養(yǎng)板單元。培養(yǎng)表面還可包含細(xì)胞粘附蛋白質(zhì)，通常包被于表面。呈現(xiàn)于干細(xì)胞上的受體或其它分子結(jié)合于蛋白質(zhì)或其它細(xì)胞培養(yǎng)基材，促進(jìn)與表面的粘附并促進(jìn)生長。尤其優(yōu)選明膠包被板。本發(fā)明基于以下觀察結(jié)果用包含EGF受體激動(dòng)劑或EGF和EGF-2受體激動(dòng)劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)附著于基材的神經(jīng)干細(xì)胞，可促進(jìn)干細(xì)胞的無限對(duì)稱分裂，顯著地阻止其分化為神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞?，F(xiàn)在詳細(xì)討論本發(fā)明的各個(gè)方面。本發(fā)明第一方面提供了一種促進(jìn)神經(jīng)干(NS)細(xì)胞對(duì)稱分裂的方法，在包含下述成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞(a)EGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物；和(b)FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物。本發(fā)明獲取神經(jīng)干細(xì)胞的另一方法包括(1)獲取包含神經(jīng)干細(xì)胞的混合細(xì)胞群體；(2)將細(xì)胞重新接種在包含下述成分的培養(yǎng)基中(a)EGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物；和(b)FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物。(3)培養(yǎng)細(xì)胞；(4)收獲細(xì)胞聚集體；(5)將細(xì)胞重新接種在包含下述成分的培養(yǎng)基中(a)EGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物；和(b)FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物。(6)培養(yǎng)細(xì)胞；(7)將細(xì)胞以單細(xì)胞形式重新接種在包含下述成分的培養(yǎng)基中(a)EGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物；和(b)FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物。可通過選擇表達(dá)祌經(jīng)干細(xì)胞特異標(biāo)記的細(xì)胞補(bǔ)充本方法，例如將此類表達(dá)標(biāo)記連接于與其在分化后代中的表達(dá)相比，優(yōu)選在神經(jīng)干細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。該方法優(yōu)選包括于65%或低于65%匯合，更優(yōu)選于55%或低于55%匯合，特別是低于50%匯合時(shí)傳代細(xì)胞。本發(fā)明方法的其它優(yōu)選特征列于本發(fā)明實(shí)施例9的方案中。本發(fā)明的培養(yǎng)物優(yōu)選貼壁培養(yǎng)物，即細(xì)胞附著于基材。基材一般為培養(yǎng)容器或其它物理支持物(如培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、珠或其它載體)的表面。優(yōu)選地，包被基材以改善細(xì)胞粘附，合適的包被物包括層粘連蛋白、聚賴氨酸、聚鳥氨酸和明膠。也優(yōu)選以單層培養(yǎng)物培養(yǎng)細(xì)胞，而不以懸液、球或簇培養(yǎng)細(xì)胞。在密度較高時(shí)，細(xì)胞可能開始相互堆積，但培養(yǎng)物基本上是單層或以單層開始，并附著于基材?？蓛?yōu)選利用EGF家族受體激動(dòng)劑激活EGF家族受體下游的一條或多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑。EGF家族受體激動(dòng)劑適合作為EGF家族信號(hào)因子的成員，并優(yōu)選結(jié)合于EGF受體的胞外結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"激動(dòng)劑"也包括EGF家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的模擬物、融合蛋白、抗體或嵌合物及能激活EGF家族受體的片段、變體和衍生物。組成EGF家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的分子的特點(diǎn)為包含至少一個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域。此結(jié)構(gòu)域由6個(gè)半胱氨酸殘基通過形成二硫鍵產(chǎn)生的三個(gè)肽環(huán)確定?？赏ㄟ^EGF受體家族的受體作用從而激活這些受體下游途徑的特定激動(dòng)劑包括EGF、TGF-a、雙調(diào)蛋白、肝素結(jié)合-EGF、表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)、p—?jiǎng)游锢w維素、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白l-4和畸胎癌生長因子-l(Cripto-l)。優(yōu)選的激動(dòng)劑是EGF本身?？蓛?yōu)選利用FGF的受體激動(dòng)劑激活EGF受體家族下游的一條或多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。FGF的受體激動(dòng)劑適合作為EGF家族信號(hào)因子的成員。術(shù)語"激動(dòng)劑"也包括FGF家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的模擬物、融合蛋白、抗體或嵌合物及能激活FGF受體的片段、變體和衍生物。優(yōu)選地，F(xiàn)GF受體激動(dòng)劑是FGF-2或?qū)诱尺B蛋白-FGF。應(yīng)理解EGF受體家族或FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也能被組成性活化受體或各自信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)子(如MEK或Bcl2)激活。在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被細(xì)胞通透性小分子所激活，從而繞過各自受體且直接激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，本發(fā)明術(shù)語"激活物"包括能激活EGF家族受體或FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的所有分子。有效維持本發(fā)明中神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物的激活物如下列實(shí)施例1-1和l-2所述。這里，大量和神經(jīng)干細(xì)胞的克隆群體維持于包含EGF和FGF-2的培養(yǎng)基中，并可傳代數(shù)次。此外，可忽略/沒有神經(jīng)干細(xì)胞的分化，因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞標(biāo)記在受試細(xì)胞群體中普遍存在(見實(shí)施例1-3)，并且保持效力并能夠分化為所有期望的細(xì)胞類型(見實(shí)施例l陽4)。因此，本發(fā)提供一種將大量神經(jīng)干細(xì)胞群體有效地維持于自我更新、對(duì)稱分裂和未分化狀態(tài)的方法。本發(fā)明的組合物包括含有神經(jīng)干細(xì)胞的組合物，其中神經(jīng)干細(xì)胞為貼壁培養(yǎng)物且組合物中至少50%、70%或80%細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞的比例進(jìn)一步優(yōu)選為至少90%，更優(yōu)選為至少95%，非常優(yōu)選為至少97%。而且，本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞可大批傳代。優(yōu)選神經(jīng)干細(xì)胞至少已傳代30次，更優(yōu)選至少60次，非常優(yōu)選至少90次。而且，在本發(fā)明的一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞群體中，至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%的所述細(xì)胞為對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞。該組合物中細(xì)胞的特征還有單獨(dú)或組合的本發(fā)明任意或全部特點(diǎn)。也提供了包含以下組分的組合物神經(jīng)干細(xì)胞；EGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物；和FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物。組合物優(yōu)選包含基本培養(yǎng)基。也優(yōu)選在組合物中至少80%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%的神經(jīng)干細(xì)胞為對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞。在上述神經(jīng)細(xì)胞群體和組合物中，神經(jīng)干細(xì)胞優(yōu)選不含編碼癌基因的外源性遺傳物質(zhì)，即細(xì)胞未被永生化。在特定實(shí)施方式中，群體/組合物中的神經(jīng)干細(xì)胞的特征是它們表達(dá)至少一種以下蛋白祌經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記干蛋白或波形蛋白；S0X-2;放射狀膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記RC2、3CB2、GLAST、BLBP或Pax-6;LewisX抗原；Musashi-l;禾口凸素；并且不表達(dá)至少一種以下蛋白Oct4，和N肌og。細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)RC2、3CB2和GLAST。在其它實(shí)施方式中，(任選除前述標(biāo)記特征以外)細(xì)胞表達(dá)BLBP、Pax-6、祌經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記干蛋白或波形蛋白、LewisX抗原、Musashi-l或凸素中的至少一種。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中(任選除前述標(biāo)記特征以外)細(xì)胞不表達(dá)Oct4或Nanog中的至少一種。在其它實(shí)施方式中(任選除上述標(biāo)記特征以外)細(xì)胞表達(dá)Sox-2，且不表達(dá)Sox-l。在包含小鼠衍生的NS細(xì)胞的某些組合物/群體中，不超過1%的細(xì)胞表達(dá)GFAP或PIII微管蛋白，因此確認(rèn)有可忽略的細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元。在其它組合物/群體中，不超過1%的細(xì)胞表達(dá)成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物。本發(fā)明也可利用大鼠細(xì)胞進(jìn)行。因此，我們?nèi)〕龃笫驝NS細(xì)胞并利用本發(fā)明方法獲取具有下列特點(diǎn)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物(i)高純度，一般是超過80%或90%的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，和(ii)多次倍增，超過50、100,甚至超過200次倍增后仍然能夠形成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞占很大比例(至少50%)。本領(lǐng)域中，來自大鼠的細(xì)胞明顯具有高度均一性，并且僅來自成年動(dòng)物的海馬。我們的細(xì)胞并非獲自此來源，而是獲自大鼠CNS。該方面值得注意是本發(fā)明的方法在三個(gè)物種(大鼠、小鼠和人)中有效。通常可見如果依照本發(fā)明方法一個(gè)單細(xì)胞形成一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞集落后，可從該集落的細(xì)胞中獲取神經(jīng)元。例如，可通過分別染色(i)核(即對(duì)所有細(xì)胞染色)和(ii)神經(jīng)元(即僅神經(jīng)元)測定?？赏ㄟ^比較著色細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量計(jì)算形成神經(jīng)元的細(xì)胞比例。本發(fā)明另一方面提供了制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包括(i)按照上述方法培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，從而獲得神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物，和(ii)分離所述培養(yǎng)物中的神經(jīng)干細(xì)胞。優(yōu)選地，分離的神經(jīng)干細(xì)胞為條件控制以對(duì)稱方式分裂的細(xì)胞。許多細(xì)胞來源可用于產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞。在一種方法中，獲得動(dòng)物神經(jīng)組織中的細(xì)胞并根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)，以獲取對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物。神經(jīng)組織可來自成年或胎組織。神經(jīng)組織可來自CNS，對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞群體可獲自人或小鼠的成年或胎兒CNS的提取物。優(yōu)選包含鑒定為具有放射狀膠質(zhì)表型細(xì)胞的神經(jīng)組織，例如來自小腦核視網(wǎng)膜提取物的細(xì)胞鑒定具有此表型，兩者均代表另外合適的細(xì)胞來源。神經(jīng)干細(xì)胞可獲自病變神經(jīng)組織，用于模擬疾病，如為此目的從腦腫瘤中獲取細(xì)胞?；蛘?，利用本發(fā)明由患病個(gè)體產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞，然后(i)利用這些細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或(ii)進(jìn)行遺傳修飾后將細(xì)胞移植回該個(gè)體。因此細(xì)胞可獲自患有神經(jīng)變性疾病，包括例如，阿爾茨海默病和帕金森病或腦腫瘤的個(gè)體。獲取神經(jīng)干細(xì)胞的其它方法包括(i)獲取能分化為神經(jīng)干細(xì)胞的多能或全能干細(xì)胞，(ii)用全能干細(xì)胞非允許的培養(yǎng)基以及在(a)EGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動(dòng)劑和(b)FGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動(dòng)劑的存在下培養(yǎng)(i)的細(xì)胞。使用中，利用此方法移除潛在污染的ES細(xì)胞，或者至少大大減少其數(shù)量，產(chǎn)生較純培養(yǎng)物和降低移植產(chǎn)生畸胎瘤的可能性的培養(yǎng)物。干細(xì)胞適合為全能干細(xì)胞，尤其是ES或EG細(xì)胞。本方法優(yōu)選包括在EGF受體激動(dòng)劑和FGF受體激動(dòng)劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。利用本發(fā)明的NS細(xì)胞，我們通過去除EGF和FGF并加入血清或BMP4獲得了星型細(xì)胞，通過去除EGF間隔約一周后去除FGF并將細(xì)胞接種于層粘連蛋白獲得神經(jīng)元，通過去除EGF和FGF獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞。通常，用于產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞的本發(fā)明所有方法任選包括進(jìn)一步使神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元、星形細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法，還任選地在(如)實(shí)驗(yàn)中使用神經(jīng)元、星形細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行移植或其它操作。一旦分離出神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物，可用于建立神經(jīng)干細(xì)胞系。建立此細(xì)胞系優(yōu)選包括下列步驟(a)獲取單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，(b)依照前述任意方法培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，從而獲得神經(jīng)干細(xì)胞的克隆群體。在特定實(shí)施方式中，用于建立細(xì)胞系的神經(jīng)干細(xì)胞為對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞，或條件化使其以對(duì)稱方式分裂的神經(jīng)干細(xì)胞。優(yōu)選根據(jù)上述制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法獲得單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)上述方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)克隆群體，即其中所有的細(xì)胞為單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞的后代。單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞和細(xì)胞系(可用上述方法任選獲得)也形成本發(fā)明的一部分。在第一個(gè)實(shí)施方式中，提供在FGF受體家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物和FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物存在的條件下維持的細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞和細(xì)胞系中細(xì)胞的特征為它們表達(dá)至少一種以下蛋白神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記干蛋白或波形蛋白；S0X-2;放射細(xì)胞特異性標(biāo)記RC2、3CB2、GLAST、BLBP或Pax-6;LewisX抗原；Musashi-l;禾口凸素；并且不表達(dá)至少一種以下蛋白Oct4，和Nanog。細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)RC2、3CB2和GLAST。在其它實(shí)施方式中，(任選地除前述標(biāo)記特征以外)細(xì)胞表達(dá)BLBP、Pax-6、神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記干蛋白或波形蛋白，LewisX抗原，Musashi-l或凸素中的至少一種。在尤其優(yōu)選實(shí)施方式中(任選地除前述標(biāo)記特征以外)，細(xì)胞不表達(dá)Oct4或Nanog中的至少一種。在其它特定實(shí)施方式中(任選地除上述標(biāo)記特征以外)，細(xì)胞表達(dá)Sox-2并不表達(dá)Sox-l。在某些小鼠衍生的細(xì)胞系中，不超過P/。的細(xì)胞表達(dá)GFAP或(3III微管蛋白。在其它(如人)細(xì)胞系中，不超過1%的細(xì)胞表達(dá)成熟星形細(xì)胞、神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記。單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞和細(xì)胞系的細(xì)胞優(yōu)選不含編碼癌基因的外源性遺傳物質(zhì)，即它們沒有被永生化。上述細(xì)胞系也優(yōu)選為神經(jīng)干細(xì)胞系。第三方面，本發(fā)明提供獲得并維持對(duì)稱分裂神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染群體的方法，其包括(a)用編碼可選擇標(biāo)記A的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，其中所述可選擇標(biāo)記在神經(jīng)前體細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)；(b)促進(jìn)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞；(c)選擇表達(dá)可選擇標(biāo)記A的神經(jīng)前體細(xì)胞；和(d)根據(jù)以前所述的任何方法培養(yǎng)選擇的細(xì)胞。可選擇標(biāo)記A可編碼抗生素抗性、細(xì)胞表面標(biāo)記或另一種可選擇標(biāo)記，如EP-A-0695351所述。神經(jīng)前體細(xì)胞特異性啟動(dòng)子可選自Sox-l、Sox-2、Sox-3、BLBP和干蛋白祌經(jīng)增強(qiáng)子。實(shí)施例1-1中提供了此選擇方案的其它詳細(xì)內(nèi)容?？蛇z傳修飾本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞(即單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，以及本發(fā)明組合物、細(xì)胞系和群體中存在的神經(jīng)干細(xì)胞)。因此，提供了轉(zhuǎn)染本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包括(a)用編碼可選擇標(biāo)記B和多肽的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞；和(b)選擇表達(dá)可選擇標(biāo)記B的神經(jīng)干細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記B可編碼抗生素抗性或細(xì)胞表面標(biāo)記，可能與可選擇標(biāo)記A相同或不同。合適的轉(zhuǎn)染方法是己知方法，包括電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染(nedeofection)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒轉(zhuǎn)染。遺傳修飾的神經(jīng)干細(xì)胞也形成本發(fā)明的一部分，因此，本發(fā)明提供了單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，或本發(fā)明組合物、群體或細(xì)胞系中存在的神經(jīng)干細(xì)胞，它們還包含構(gòu)建物。應(yīng)理解，這些祌經(jīng)干細(xì)胞可能除了可選擇標(biāo)記B外已經(jīng)包含可選擇標(biāo)記A。如前所述，本發(fā)明方法適用于衍生自任何來源的神經(jīng)干細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了由ES細(xì)胞來源獲得神經(jīng)干細(xì)胞的方法。根據(jù)該方法，將ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)祖細(xì)胞，如單層培養(yǎng)或胚胎樣小體分化，然后用NSA培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)祖細(xì)胞，從而促進(jìn)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞。此外，考慮到NSA培養(yǎng)基可能包含補(bǔ)充成分，如補(bǔ)充的葡萄糖和HEPES?；蛘?，補(bǔ)充有葡萄糖和HEPES的培養(yǎng)基(優(yōu)選基本培養(yǎng)基)也可用于促進(jìn)此分化。在NSA和/或葡萄糖和HEPES的存在下，培養(yǎng)條件有助于神經(jīng)干細(xì)胞增殖，額外優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)物中存在的任何非神經(jīng)細(xì)胞優(yōu)選死亡。這產(chǎn)生基本純的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物(如存在的所有細(xì)胞的至少80%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%)。實(shí)施例l-5提供了此方法的其它細(xì)節(jié)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，實(shí)施例1-5的方法可用于制備對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞群體，然后用上述本發(fā)明培養(yǎng)方法維持該細(xì)胞群體。實(shí)施例1-5的方法也可用于測定因子對(duì)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的作用。在優(yōu)選的測定實(shí)施方式中，用實(shí)施例l-5所述的方法在受試因子的存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞?？赏ㄟ^(例如)測定得到的細(xì)胞的標(biāo)記特征來評(píng)價(jià)該因子的作用，即顯示出細(xì)胞是否與本發(fā)明細(xì)胞具有相似的標(biāo)記特征，或者是否維持ES標(biāo)記特征。受試因子可以是誘導(dǎo)因子或阻斷因子。神經(jīng)干細(xì)胞在治療神經(jīng)病和神經(jīng)變性疾病，尤其是治療諸如帕金森病和阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化和肌萎縮側(cè)索硬化等疾病以及腦損傷中的使用引起了許多關(guān)注。本發(fā)明方法、組合物、細(xì)胞群體、細(xì)胞系和單個(gè)細(xì)胞都能夠用于這種治療，以及生產(chǎn)這種治療所用制劑?？捎帽景l(fā)明治療的具體神經(jīng)病和神經(jīng)變性疾病包括帕金森病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、中風(fēng)、多發(fā)性硬化和亨廷頓病。因此，在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了上述細(xì)胞系、神經(jīng)細(xì)胞群體、單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞和組合物用于細(xì)胞治療以及生產(chǎn)治療神經(jīng)變性疾病和腦損傷所用的制劑中的應(yīng)用?？捎昧姿猁}緩沖鹽水(PBS)配制這些制劑。上述疾病的治療方法可包括將本發(fā)明的單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞系、組合物或細(xì)胞群體植入患者?；颊邇?yōu)選為哺乳動(dòng)物，患者更優(yōu)選是人。在胚胎和成年動(dòng)物CNS中證明此種移植是成功的，實(shí)施例1-6中更詳細(xì)地描述了此種移植。本發(fā)明細(xì)胞，尤其是細(xì)胞系可用于測定誘導(dǎo)因子和阻斷因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用。這種測定可包括將本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞(即組合物、細(xì)胞系和群體中存在的細(xì)胞，或單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞)與受試因子相接觸?？赏ㄟ^測定得到的細(xì)胞的標(biāo)記特征適當(dāng)?shù)卦u(píng)價(jià)該因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用，即顯示出該細(xì)胞是否與本發(fā)明細(xì)胞具有相似的標(biāo)記特征，或者這些標(biāo)記是否丟失。本發(fā)明細(xì)胞也適合于測定藥物。為了評(píng)價(jià)形成神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞的比例，使細(xì)胞無性增殖；將細(xì)胞單獨(dú)種板，并非形成克隆集落的所有細(xì)胞，而只有形成克隆集落通常超過50%的細(xì)胞能產(chǎn)生神經(jīng)元(在合適的操作方案下)或膠質(zhì)細(xì)胞(也在合適的操作方案下)。細(xì)胞不同于現(xiàn)有技術(shù)，因?yàn)楫?dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員宣稱能夠鑒定、甚至增殖具有神經(jīng)干細(xì)胞特性的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞群體是高度不均一的。這是重要區(qū)別，因?yàn)椴患兊娜后w包括將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給其余神經(jīng)干細(xì)胞以剌激分化并進(jìn)一步減少神經(jīng)干細(xì)胞的比例的細(xì)胞。雖然現(xiàn)有技術(shù)的方法可由單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)球，本發(fā)明能夠由單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生基本純的群體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式(以下實(shí)施例中更詳盡地描述)中，所有NS細(xì)胞集落產(chǎn)生15%或更多，優(yōu)選至少20%，更優(yōu)選約20-30。/。TuJ陽性神經(jīng)元。在密度較高的培養(yǎng)物中，我們對(duì)TuJ陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。35%LC1NS細(xì)胞在115代(連續(xù)培養(yǎng)一年以上)后獲得神經(jīng)元形態(tài)并表達(dá)pIII-微管蛋白。這些細(xì)胞在此階段保持雙倍體核型。LC1是未克隆的群體。因此，該數(shù)據(jù)表明，就膠質(zhì)-限制性前體或遺傳轉(zhuǎn)化而言，選擇壓力很小?？梢栽诓慌c異源細(xì)胞共同培養(yǎng)并且沒有成分不確定的條件培養(yǎng)基、胞外基質(zhì)組分或血清的情況下培養(yǎng)本發(fā)明細(xì)胞，這是以前除ES細(xì)胞以外的任何干細(xì)胞類型所不具有的特征。因此，在本發(fā)明下述內(nèi)容中，優(yōu)選以確定條件在均一的培養(yǎng)物中培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。即使微孔板中分離的單個(gè)NSC也可擴(kuò)展，這表明對(duì)除EGF和FGF以外的胞外信號(hào)的依賴性很小，在體外NSC必需的外源性自我更新信號(hào)可以減少到EGF禾BFGF。在實(shí)施例中更詳細(xì)說明的其它實(shí)施方式中，通過接種單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的基本上每個(gè)集落，即至少卯％、優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少97。/。的集落(i)顯示在FGF加EGF存在的情況下神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)相同并且沒有分化標(biāo)記，和(ii)在撤消生長因子時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元。在具體實(shí)施例中，每個(gè)集落都具有這些特性。這是對(duì)稱的自我更新的證據(jù)。而且，非克隆的NS細(xì)胞培養(yǎng)物的集落試驗(yàn)數(shù)據(jù)與克隆的NS5細(xì)胞系的數(shù)據(jù)相當(dāng)。連續(xù)形成NS5的可擴(kuò)展未分化集落表明產(chǎn)克隆細(xì)胞是干細(xì)胞，它們數(shù)量的擴(kuò)大與NS群體成比例。形式上，可通過兩種機(jī)制增加干細(xì)胞數(shù)量從頭產(chǎn)生或?qū)ΨQ的自我更新分裂。前者需要前干細(xì)胞來源，即全能細(xì)胞或胎原基，它們都不存在于本文NS細(xì)胞培養(yǎng)物中，所以在NS細(xì)胞培養(yǎng)物中必須進(jìn)行對(duì)稱的自我更新。以下實(shí)施例獲得的特定NS細(xì)胞表達(dá)Sox2、Pax6、Emx2、Oligl、01ig2、干蛋白、BLBP、GLAST、波形蛋白，并且對(duì)RC2、3CB2、SSEA-1和凸素具有免疫反應(yīng)性。它們優(yōu)選不表達(dá)Soxl，并且對(duì)GFAP和神經(jīng)元抗原是陰性。這些NS細(xì)胞缺少全能標(biāo)記和其它胚層的標(biāo)記。我們主張，在CNS發(fā)育期間神經(jīng)干細(xì)胞特征被掩蔽(僅在離體時(shí)可證實(shí))，用ES細(xì)胞通常就是這樣。NS細(xì)胞中不能維持Soxl表達(dá)的發(fā)現(xiàn)是新的、不可預(yù)見的，表明用Soxl進(jìn)行連續(xù)譜系選擇或許沒有生產(chǎn)力。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，在培養(yǎng)物中，NS細(xì)胞，例如ES細(xì)胞-衍生的未克隆(CGR8-NS)和克隆(NS5)NS細(xì)胞系以及胎皮層衍生的未克隆(Corl)和克隆(Corl-3)NS細(xì)胞系顯示出放射狀膠質(zhì)標(biāo)記3CB2、BLBP、GLAST、干蛋白、RC2禾口波形蛋白的表達(dá)。在這些培養(yǎng)物中優(yōu)選少于10%，更優(yōu)選少于5%，尤其是少于2%的細(xì)胞表達(dá)GFAP。在具體實(shí)施例中，在少于1。/。的細(xì)胞中表達(dá)GFAP。我們也證明，ES細(xì)胞衍生的NS細(xì)胞115代后一致地表達(dá)干蛋白和RC2而不表達(dá)GFAP和|3111-微管蛋白，這說明NS細(xì)胞表型是穩(wěn)定的。優(yōu)選的本發(fā)明細(xì)胞由ES細(xì)胞分化，并且(l)連續(xù)表達(dá)干蛋白和RC2，和(2)在30代后，優(yōu)選60代后，更優(yōu)選100代后連續(xù)不表達(dá)GFAP和(5111-微管蛋白。不表達(dá)GFAP和卩III-微管蛋白指在少于5%的細(xì)胞、優(yōu)選少于2%的細(xì)胞中觀察到表達(dá)。我們己經(jīng)通過RT-PCR進(jìn)行了分析，RT-PCR證實(shí)，在特定的NS細(xì)胞中不存在全能、中胚層或內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子。我們也進(jìn)行了Affymetrix(RTM)表達(dá)型分析，證實(shí)不存在譜系不適合的轉(zhuǎn)錄物，并證明在三種不同的NS細(xì)胞培養(yǎng)物(ES衍生的、胎皮層衍生的和克隆的胎皮層衍生的)中神經(jīng)標(biāo)記和放射狀膠質(zhì)標(biāo)記的一致表達(dá)。由ES細(xì)胞分化獲得NS細(xì)胞優(yōu)選包括在連續(xù)的貼壁培養(yǎng)物中維持細(xì)胞，更優(yōu)選省去形成神經(jīng)球的步驟。然而，由來自胚胎或成年動(dòng)物腦的原代細(xì)胞分離物分化獲得NS細(xì)胞任選地包括(i)首先形成懸浮聚集體或神經(jīng)球，和(ii)然后在貼壁培養(yǎng)物中維持細(xì)胞。我們?cè)趯?shí)施例中發(fā)現(xiàn)，數(shù)天后該聚集體可附著在明膠包被的塑料板上，然后將長出NS細(xì)胞。我們測定了在本發(fā)明細(xì)胞的早期和晚期傳代階段產(chǎn)生的神經(jīng)元和星形細(xì)胞的比例，尤其是第8代和第115代的LC1NS細(xì)胞。后一培養(yǎng)物代表了12個(gè)月的擴(kuò)展，倍增期為24小時(shí)。在晚期傳代階段獲得的神經(jīng)元數(shù)量稍有減少，但總數(shù)仍〉35%。獨(dú)立地衍生自46CES細(xì)胞的NS5克隆細(xì)胞系在第30代時(shí)神經(jīng)元分化效率水平相似。在LC1NS細(xì)胞和NS5細(xì)胞的時(shí)間點(diǎn)，GFAP免疫反應(yīng)性星形細(xì)胞的產(chǎn)生接近100%。而且，用多次傳代培養(yǎng)、然后用GFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、在植入前進(jìn)一步擴(kuò)展的LCINS細(xì)胞獲得體內(nèi)數(shù)據(jù)，證明神經(jīng)元和星形細(xì)胞的廣泛分化。與放射狀膠質(zhì)標(biāo)記表達(dá)的一致性組合，關(guān)于未克隆的LC1NS細(xì)胞穩(wěn)定分化潛力的數(shù)據(jù)表明，在FGF禾卩EGF中貼壁培養(yǎng)有助于干細(xì)胞自我更新和抑制定型為膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元的命運(yùn)。我們發(fā)現(xiàn)由ES細(xì)胞分化獲得的NS細(xì)胞在植入后5周時(shí)間內(nèi)不會(huì)形成腫瘤，從而區(qū)別于ES細(xì)胞，ES細(xì)胞在4周內(nèi)會(huì)在小鼠腦中產(chǎn)生肉眼可見的畸胎瘤。本發(fā)明也涉及核重編程方法和通過這些方法獲得的細(xì)胞和動(dòng)物。核重編程是使體細(xì)胞，任選干細(xì)胞或終末分化的細(xì)胞的核重編程的技術(shù)，以便用作潛能相對(duì)較高的細(xì)胞核；最終，完全重編程的細(xì)胞核用作全能細(xì)胞核，重編程常常用來指全部重編程為全能。本領(lǐng)域已經(jīng)建立了通過核轉(zhuǎn)移重編程的方法，該方法在WO96/07732所述發(fā)明公開后為公眾所知，有時(shí)稱為"多利羊"發(fā)明。因此，核轉(zhuǎn)移可用于克隆非人動(dòng)物。核轉(zhuǎn)移法有許多問題。主要是它們的效率仍低，因?yàn)楂@得的細(xì)胞是很少重編程的，以致于不是完全全能的。也需要能夠?qū)俗鳛橹鼐幊痰囊徊糠诌M(jìn)行遺傳操作。但是，由于獲得供體細(xì)胞核的克隆群體困難，此操作目前不可能或不可靠。即使用克隆的細(xì)胞核，重編程方法是需要許多單獨(dú)步驟的復(fù)雜過程。最后，一些種類的ES細(xì)胞仍然難以分離。采用重編程技術(shù)(如果可用且可靠)可提供產(chǎn)生這些種類的全能細(xì)胞的另選途徑。本發(fā)明其它方面的目的是為上述問題提供另選方法并提供解決的方案。因此，本發(fā)明提供了核重編程的方法，其中供體細(xì)胞核獲自本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞可高效率地重編程，因此本發(fā)明提供了有效重編程的方法，也有助于產(chǎn)生許多種類的遺傳修飾的重編程細(xì)胞，尤其是全能干細(xì)胞。通過本發(fā)明使單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞無性繁殖的能力指遺傳操作后可獲得細(xì)胞的克隆群體，所有細(xì)胞都具有相同的遺傳修飾，并用于重編程方法。也可能根據(jù)存在特定的細(xì)胞表面標(biāo)記和/或不存在其它標(biāo)記來鑒定神經(jīng)干細(xì)胞-這種方法具有以下優(yōu)點(diǎn)可省去根據(jù)本文所述發(fā)明的某些方面培養(yǎng)的步驟，因?yàn)榭蓮幕旌系娜后w如腦勻漿物中直接收集神經(jīng)干細(xì)胞。因此，本文提供了核重編程方法，其中供體核來自根據(jù)本發(fā)明的任何實(shí)施方式或方面獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。核重編程的具體方法包括-獲得供體細(xì)胞；-獲得受體細(xì)胞；-將供體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，其中供體細(xì)胞是(i)神經(jīng)干細(xì)胞，或(ii)按照本發(fā)明方法獲得的細(xì)胞；和-培養(yǎng)細(xì)胞，以便重編程供體細(xì)胞核，從而獲得重編程的細(xì)胞。通常在處理的一個(gè)階段去除受體細(xì)胞核，因此得到的細(xì)胞是雙倍體，任選在轉(zhuǎn)移供體細(xì)胞核之前和之后進(jìn)行此步驟。本發(fā)明NS細(xì)胞提供的有趣的可能性之一是引入遺傳損傷，如可誘導(dǎo)惡變的遺傳損傷。因此，另一種選擇是遺傳操作供體細(xì)胞核。這可用于引入突變或感興趣的基因，如產(chǎn)生用于測定或其它測試目的的細(xì)胞或動(dòng)物，其中用同一操作獲得許多細(xì)胞。操作的范圍很寬。一個(gè)例子是將引起疾病的遺傳序列或推定的引起疾病的遺傳序列引入供體細(xì)胞核，用于藥物篩選。另一種選擇是獲得包含衍生自重編程細(xì)胞的組織的動(dòng)物并用該組織進(jìn)行試驗(yàn)。優(yōu)選的是，將該細(xì)胞重編程回全能，如通過將細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，利用所需神經(jīng)干細(xì)胞中細(xì)胞表面標(biāo)記的本發(fā)明知識(shí)能夠省去培養(yǎng)步驟，而在其它情況下需要從混合群體中分離神經(jīng)干細(xì)胞。一種所述的重編程方法包括提供混合的細(xì)胞群體，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記特征由混合群體中分離神經(jīng)干細(xì)胞，將分離細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。用其它方法，可遺傳操作分離細(xì)胞，然后將其細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。同時(shí)，可培養(yǎng)分離細(xì)胞以獲得克隆的細(xì)胞群體，然后將該群體中一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。更詳細(xì)說，本發(fā)明細(xì)胞的一個(gè)應(yīng)用是高通量藥物篩選。本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞和由其獲得的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等可用于篩選，(如)以鑒定在任一細(xì)胞類型上有活性的因子。該細(xì)胞或后代可用于腦癌模型。用于篩選的細(xì)胞和后代可獲自神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是CNS的腫瘤，以及由其衍生的神經(jīng)細(xì)胞和其后代相信所有人都明白篩選的本質(zhì)，但主要包括獲得本發(fā)明細(xì)胞或其分化后代，在受試因子的存在下培養(yǎng)該細(xì)胞或后代，測定該因子對(duì)細(xì)胞或后代的作用。在具體篩選應(yīng)用中，提供的細(xì)胞是本發(fā)明細(xì)胞或用本發(fā)明獲得的細(xì)胞，該細(xì)胞經(jīng)過修飾以表達(dá)EGF受體或另一種EGF受體?？稍谟糜诤Y選前修飾細(xì)胞。例如，細(xì)胞可遺傳修飾，在基因中引入突變，或引入編碼已知或懷疑與疾病(尤其是神經(jīng)細(xì)胞疾病包括帕金森病和阿爾茨海默病)有關(guān)的基因產(chǎn)物的核酸。可引入帕金突變?？杀磉_(dá)或突變編碼與阿爾茨海默病有關(guān)的蛋白如APP的基因，或者改變其表達(dá)。本發(fā)明細(xì)胞可用作細(xì)胞治療的細(xì)胞來源。它們提供了可能用于核轉(zhuǎn)移核來源的患者的干細(xì)胞來源。它們可用于遞送基因治療，包括神經(jīng)保護(hù)性基因治療。在示范性治療中，本發(fā)明細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)?？砂凑毡景l(fā)明并進(jìn)行遺傳操作來獲得這些細(xì)胞。可植入該細(xì)胞以恢復(fù)受損的神經(jīng)環(huán)路和/或恢復(fù)腦功能。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于所獲細(xì)胞的純度。在移植或培養(yǎng)中純?nèi)后w更容易控制，因?yàn)樵诓痪慌囵B(yǎng)物中，由于更多細(xì)胞已經(jīng)定型為膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)，獲得的神經(jīng)元百分?jǐn)?shù)降低。一些治療需要神經(jīng)元和星形細(xì)胞。其它治療需要膠質(zhì)細(xì)胞(如MS的少突膠質(zhì)細(xì)胞，其它應(yīng)用的星形細(xì)胞、游走細(xì)胞)。本發(fā)明提供了克隆非人動(dòng)物的方法。克隆非人動(dòng)物的一種方法包括(i)由非人動(dòng)物獲得神經(jīng)干細(xì)胞，(ii)獲得與該非人動(dòng)物相同物種的卵母細(xì)胞，(iii)將神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中，和(iv)將(iii)中獲得的細(xì)胞植入相同種類的雌性動(dòng)物體內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了基于神經(jīng)干細(xì)胞分離的非人動(dòng)物克隆的有效方法。相信該克隆方法可應(yīng)用于基本上所有非人動(dòng)物，尤其是家畜，包括牛、豬、羊、貓、犬、雞和其它家畜；以及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，包括小鼠和大鼠。本發(fā)明第一次使得能夠以與ES細(xì)胞相同的方式培養(yǎng)雙倍體、產(chǎn)克隆、可轉(zhuǎn)染、組織干細(xì)胞的純?nèi)后w。這是干細(xì)胞生物學(xué)中的顯著進(jìn)步，它開辟了許多新的實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)。例如，對(duì)不均一神經(jīng)球培養(yǎng)物的依賴嚴(yán)重阻礙了以前對(duì)"神經(jīng)干細(xì)胞"分布型分析的研究(如Suslov等)。而且，NS細(xì)胞的放射狀膠質(zhì)特征限定了它的體內(nèi)對(duì)應(yīng)物。能夠培養(yǎng)和遺傳操作放射狀膠質(zhì)的純?nèi)后w也開辟了分析可用作干細(xì)胞和專門化支架細(xì)胞的這些受人關(guān)注細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)的新機(jī)會(huì)。最后，能夠在沒有異源細(xì)胞或細(xì)胞提取物的簡單培養(yǎng)基中增殖NS細(xì)胞證實(shí)，可僅由生長因子驅(qū)動(dòng)自我更新，而不需要迄今干細(xì)胞生物學(xué)家認(rèn)為是不可缺少的復(fù)雜的微環(huán)境小生境。本發(fā)明開辟了用該細(xì)胞進(jìn)行核重編程和任選的遺傳操作的新途徑。本發(fā)明提供由NS細(xì)胞有效產(chǎn)生神經(jīng)元。在本文方案中更詳盡地描述的方法中，獲得神經(jīng)元的方法包括(a)在存在FGF受體激動(dòng)劑且不存在EGF受體激動(dòng)劑的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞；和(b)然后，在沒有FGF受體激動(dòng)劑且沒有EGF受體激動(dòng)劑的情況下培養(yǎng)該細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)(如)沒有EGF的期間引發(fā)細(xì)胞在(如)隨后撤消FGF時(shí)成為神經(jīng)元。優(yōu)選將神經(jīng)干細(xì)胞接種在單層培養(yǎng)物中。一般地，將NS細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含EGF但含有FGF-2的培養(yǎng)基中，去除培養(yǎng)基中的FGF-2(包括將該細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含F(xiàn)GF-2的培養(yǎng)基中)之前培養(yǎng)一段時(shí)間，例如至少2天，或至少4天。在具體方法中，在含有FGF-2但不含EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞一周，然后撤消FGF-2。撤消FGF導(dǎo)致培養(yǎng)物中一些細(xì)胞死亡，但有相當(dāng)百分?jǐn)?shù)的細(xì)胞存活并形成神經(jīng)元。此方法可用作衍生NS細(xì)胞的本文所述任何方法的另選方法。應(yīng)理解，可根據(jù)本發(fā)明所有方面，在體內(nèi)或體外實(shí)施方法和應(yīng)用。附圖中說明了本發(fā)明方法和組合物，其中圖1顯示由ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)干(NS)細(xì)胞；圖2顯示NS細(xì)胞可獲自不同ES細(xì)胞系和胎兒前腦；圖3顯示成年動(dòng)物腦內(nèi)NS細(xì)胞的摻入和分化；圖4顯示人ES細(xì)胞或胎衍生的NS細(xì)胞；和圖5顯示分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NS細(xì)胞在電壓和電流鉗條件下的電活性。以下更詳盡的說明附圖，圖1顯示從ES細(xì)胞中產(chǎn)生神經(jīng)干(NS)細(xì)胞:A.在EGF和FGF-2的存在下增殖貼壁NS細(xì)胞培養(yǎng)物(LC1)，(a)顯示出未表達(dá)神經(jīng)元(b)或星形細(xì)胞(c)抗原，并且均一表達(dá)了前體標(biāo)記RC2(d)和干蛋白(未顯示)。加入血清時(shí)LC1細(xì)胞分化為免疫陽性星形細(xì)胞(e)，去除生長因子時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元(f-h)。115代后所獲神經(jīng)元占總細(xì)胞數(shù)的比例保持>35%(1)。B，通過Soxl神經(jīng)譜系選擇產(chǎn)生克隆的NS-5細(xì)胞。a禾口c，第l代和第5代神經(jīng)前體各自的相差圖(Phaseimage)。b和d，對(duì)應(yīng)的Soxl-GFP熒光。e，接種于Terasaki孔1小時(shí)后的單細(xì)胞。f，20代時(shí)克隆細(xì)胞系的相差圖。C，ES細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞/放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記的RT-PCR(46C，親代ES細(xì)胞系；P5，神經(jīng)分化后的5代；NS-5克隆的NS細(xì)胞系；LC1，NS群體(第17代)；腦，E12.5/E16.5小鼠腦)。D，NS-5對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞/放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記的免疫反應(yīng)性。E，NS-5分化為星形細(xì)胞(a，b)和神經(jīng)元(d，e)，它們喪失干蛋白免疫反應(yīng)性(c，f)。F,NS-5細(xì)胞集落(a)在撤消生長因子時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元，(b)在EGF/FGF存在下保持均一地表達(dá)沒有GFAP免疫反應(yīng)性的RC2和BLBP(c，d)。G，NS-5的中期擴(kuò)散(Metaphasespread)(第31代)。圖2顯示NS細(xì)胞可衍生自各種ES細(xì)胞系和胎兒前腦NS細(xì)胞衍生自獨(dú)立的ES細(xì)胞系(CGR8，E14Tg2a)或原代皮層組織(Cor-l)和紋狀體組織(Str-l)。A，干細(xì)胞/放射狀膠質(zhì)標(biāo)記的RT-PCR。B，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的RT-PCR。C，通過形態(tài)(a，f)和神經(jīng)干細(xì)胞/放射狀膠質(zhì)標(biāo)記的免疫反應(yīng)性(b，c，g，h)不能區(qū)分ES衍生的細(xì)胞系(CGR8-NS)和胎衍生的細(xì)胞系(Cor-l)與LC1，它們各自可分化為神經(jīng)元(d，i)和星形細(xì)胞(e，j)。圖3顯示成年動(dòng)物腦內(nèi)NS細(xì)胞的摻入和分化a-h，用eGFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的LC1NS細(xì)胞植入海馬(a，b)或紋狀體(c-h)4周后的共聚焦圖像。b，d分別是a圖和c圖中插圖的高倍放大圖。e，f是植入eGFP的NS細(xì)胞(綠色)的例子，顯示出與神經(jīng)元標(biāo)記TuJ(e，紅色)或MAP-2(f，紅色)的共表達(dá)(黃色)。g，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP(紅色)。h，神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記干蛋白(紅色)。i，植入成年小鼠紋狀體4周后植入物產(chǎn)生的神經(jīng)元(MAP2)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、祖細(xì)胞(干蛋白)的定量分析，以及細(xì)胞(Ki67)增殖。數(shù)據(jù)是5個(gè)獨(dú)立動(dòng)物的至少500個(gè)eGFP+細(xì)胞的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)。標(biāo)尺a，c，訓(xùn)tim;b、d、e，40詣；f-h，20um。圖4顯示人ES細(xì)胞或胎衍生的NS細(xì)胞A，由人ES細(xì)胞衍生。a，人ES原代培養(yǎng)物。b，人ES細(xì)胞分化為神經(jīng)-花結(jié)結(jié)構(gòu)。c，NS擴(kuò)展培養(yǎng)基中的第9代。d，單個(gè)細(xì)胞顯示放射狀膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。e-h，神經(jīng)干細(xì)胞/放射狀膠質(zhì)標(biāo)記的免疫染色。B，由人胎兒前腦衍生。i，皮層產(chǎn)生的神經(jīng)球。j，粘附和生長。k，NS擴(kuò)展培養(yǎng)基中的第5代。I，放射狀膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。m-p，神經(jīng)干細(xì)胞/放射狀膠質(zhì)標(biāo)記。C，分化。q，TuJ陽性未成熟神經(jīng)元。r，GFAP陽性星形細(xì)胞。圖5顯示A.三種不同的NS細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中孵育6天(a)、20天(b)和30天(c)后，以不同膜電位(-70+40mV，來自保持電位-90mV)獲得的重疊的內(nèi)向和外向電流追蹤。B.通過獲得(A)中所示電流記錄后立即由電壓鉗轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏縻Q，對(duì)與(A)相同的三種細(xì)胞(a、b和c)注射去極化矩形電流脈沖后獲得的重疊的電壓反應(yīng)。虛線代表-60mV的電壓水平。C.在分化培養(yǎng)基逐漸增加培養(yǎng)時(shí)間(如標(biāo)記所示)的細(xì)胞中-20mV引發(fā)的平均Na+電流。條線代表SE。D.在10mMBa21t1TTX存在下-40mV和OmV引發(fā)的重疊的內(nèi)向電流；保持電位為-90mV。E.與(D)中相同的細(xì)胞的電流/電壓關(guān)系。通過以下實(shí)施例證明了本發(fā)明的應(yīng)用。實(shí)施例實(shí)施例1-1分離和培養(yǎng)大量NS細(xì)胞群體近年來建立了ES細(xì)胞分化操作方案，在貼壁單層培養(yǎng)中能夠有效和一致地產(chǎn)生50-70%Soxl陽性神經(jīng)前體細(xì)胞。為了分離、擴(kuò)展和表征這些培養(yǎng)物中的神經(jīng)前體細(xì)胞(衍生自小鼠)，采用以前產(chǎn)生的細(xì)胞系(46C細(xì)胞)，它含有耙向Soxl基因座的GFP-IRES-嘌呤霉素報(bào)道盒(Ying等，2003b)。7天后將嘌呤霉素加入分化培養(yǎng)物中，3天內(nèi)，超過95。/。的其余細(xì)胞是GFP+神經(jīng)前體細(xì)胞。此時(shí)，將細(xì)胞再接種在補(bǔ)充有EGF/FGF-2(無嘌呤霉素)的N2B27培養(yǎng)基中。這些細(xì)胞快速生長，在數(shù)代內(nèi)就呈現(xiàn)均一的形態(tài)。這些46C神經(jīng)前體細(xì)胞(46C-NP)保持連續(xù)培養(yǎng)20代以上仍保持特征性雙極形態(tài)。這些培養(yǎng)物中的細(xì)胞死亡非常少，接種效率高，倍增時(shí)間約為25小時(shí)。實(shí)施例1-2細(xì)胞系的培養(yǎng)為了分離克隆的細(xì)胞系，將來自第5代46C-NP細(xì)胞的大量培養(yǎng)物的單個(gè)細(xì)胞接種于微孔板的單獨(dú)孔中。在95個(gè)單個(gè)細(xì)胞中，15個(gè)生長成集落，這些細(xì)胞中，4個(gè)細(xì)胞系保持連續(xù)生長10代以上。一個(gè)細(xì)胞系(NP5)顯示出特征性雙極細(xì)胞，其均一形態(tài)與大量群體中觀察到的相同。此NP5細(xì)胞系可以在培養(yǎng)物中無限地維持(NP541代；5個(gè)月以上)。實(shí)施例1-3NS細(xì)胞的表征為了表征大量群體和克隆細(xì)胞系，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法測定一系列標(biāo)記。正如所料，發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞系對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記干蛋白或波形蛋白為陽性。重要的是，這些細(xì)胞也對(duì)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記RC2、3CB2和星形細(xì)胞-特異性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLAST)為陽性。少于1。/。的細(xì)胞對(duì)GFAP或MII微管蛋白為陽性，這預(yù)示在這些細(xì)胞傳代期間星形細(xì)胞或神經(jīng)元很少同時(shí)分化。不像靈長動(dòng)物/人細(xì)胞，嚙齒動(dòng)物放射狀膠質(zhì)對(duì)GFAP為陰性。而且，這些細(xì)胞對(duì)識(shí)別LewisX抗原的抗體SSEA-l(以前用于富集成年動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞)具有免疫反應(yīng)性。用一系列標(biāo)記進(jìn)行RT-PCR，以確認(rèn)它們作為放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的身份。所有四種克隆細(xì)胞系以及大量群體對(duì)Oct4或Nanog為陰性，這證實(shí)了它們不是ES細(xì)胞，而它們表達(dá)干蛋白、波形蛋白和GLAST，與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測一致。而且，各細(xì)胞系顯示出放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記BLBP的表達(dá)。這些細(xì)胞也表達(dá)Musashi-l和凸素。有趣的是，46C-NP的大量培養(yǎng)物逐漸丟失了Soxl的表達(dá)(如GFP報(bào)道物所評(píng)價(jià))，以致于到第5代(~2周)，保持綠色的細(xì)胞非常少。同時(shí)，沒有克隆細(xì)胞系顯示出Soxl驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)，RT-PCR證實(shí)，這些細(xì)胞不表達(dá)Soxl，而表達(dá)相關(guān)的SoxBl類蛋白Sox2?？傊?，這些結(jié)果提示，可用嘌呤霉素選擇方案分離一系列Soxl表達(dá)的神經(jīng)前體細(xì)胞，可分離和無性擴(kuò)展具有前腦放射狀膠質(zhì)細(xì)胞特性的Soxl-、Sox2+細(xì)胞。實(shí)施例1-4。NS細(xì)胞系分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞NS細(xì)胞系表達(dá)的分子標(biāo)記證實(shí)，它們是一類神經(jīng)前體細(xì)胞。為了證實(shí)這些細(xì)胞是真正的多能干細(xì)胞(即能夠作為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞分化)，測試了設(shè)計(jì)用于測試細(xì)胞潛能的一系列條件。以前通過以下方案研究神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)的分化，包括去除促分裂原和/或加入血清或其它細(xì)胞因子。在此情況下，去除塑料板上培養(yǎng)的增殖的NP5和46C-NP細(xì)胞中的EGF、FGF或二者。同時(shí)去除EGF和FGF導(dǎo)致24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞快速且廣泛地死亡。相反，僅用FGF培養(yǎng)在3天內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。僅用EGF培養(yǎng)不導(dǎo)致細(xì)胞死亡或分化，但細(xì)胞增殖減少。因此，EGF顯然起塑料板上培養(yǎng)的NS細(xì)胞必需的細(xì)胞存活信號(hào)(由FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分補(bǔ)償)的作用。也測定了去除細(xì)胞因子后血清對(duì)增殖細(xì)胞的作用。用此方式處理的細(xì)胞即使在沒有EGF的情況下也能存活，并以同步方式快速分化，以致于100%細(xì)胞獲得GFAP染色陽性和干蛋白染色陰性的大扁平星形細(xì)胞。因此，增殖群體內(nèi)所有NS細(xì)胞都能夠分化為星形細(xì)胞。可在沒有血清時(shí)加入BMP4，然后去除塑料板上的EGF/FGF，從而模擬此作用。CNTF和TGF-b的作用與BMP4相似，雖然星形細(xì)胞形態(tài)不同，并且最初細(xì)胞死亡更多。BMP、CNTF和LIF各自顯示誘導(dǎo)原代皮層祖細(xì)胞的星形細(xì)胞命運(yùn)(Gross等，1996;Lillien和Raff，1990;Nakashima等，1999)。與這些研究一致，發(fā)現(xiàn)用BMP-4或血清處理能快速誘導(dǎo)Id基因(>30倍)(數(shù)據(jù)未顯示)。在試圖誘導(dǎo)神經(jīng)元分化時(shí)，測試了去除層粘連蛋白處理的培養(yǎng)皿上的EGF。為了避免在塑料板上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)觀察到的細(xì)胞死亡，在有FGF而沒有EGF的情況下將細(xì)胞接種在層粘連蛋白基材上。在這些條件下，在塑料或明膠上沒有觀察到PCD，細(xì)胞存活。細(xì)胞的形態(tài)改變?yōu)楦友由斓碾p極形式，具有放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的特征性終足(end-feet)。這些細(xì)胞顯示出增殖顯著降低(通過摻入BrdU)，但維持了放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記(RC2、波形蛋白、干蛋白)并且不分化，因?yàn)樵诟呙芏葏^(qū)域僅觀察到一小部分神經(jīng)元或星形細(xì)胞。為了誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，6天后將培養(yǎng)基由NSA/N2+FGF2改變?yōu)椴缓現(xiàn)GF2的NSA/B27。這能促進(jìn)約40-60%神經(jīng)元分化(如MAP2和PIII微管蛋白抗體染色測定)。如GABA免疫反應(yīng)性測定，這些神經(jīng)元是Y-氨基丁酸能的，而有少量星形細(xì)胞(GFAP)。這些結(jié)果與前述FGF在防止神經(jīng)元分化中的作用一致。也發(fā)現(xiàn)，可用與ES細(xì)胞相似的方法凍融各細(xì)胞系。在進(jìn)一步測試中，嘗試由單個(gè)細(xì)胞開始分化。此克隆擴(kuò)展和分化表明，所有細(xì)胞都能夠形成神經(jīng)元。實(shí)施例1-5不用遺傳選擇方案分離任何ES細(xì)胞系中的NS細(xì)胞起初，優(yōu)化用于分離NP5的N2B27培養(yǎng)基，使ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)前體細(xì)胞，從而允許ES細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞良好存活。因此，在不用嘌呤霉素選擇時(shí)，由于ES細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞類型的遺留，不可能用EGF和FGF-2有效擴(kuò)展46C-NP細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。為了克服此問題并由其它非靶向的ES細(xì)胞系產(chǎn)生放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，測試了允許神經(jīng)前體細(xì)胞而非其它細(xì)胞類型存活和擴(kuò)展的其它基本培養(yǎng)基組合。采用市售培養(yǎng)基NS-A培養(yǎng)基(Euroclone)，發(fā)現(xiàn)在第7天再接種46CES細(xì)胞單層分化導(dǎo)致形成細(xì)胞塊/球，以及非神經(jīng)細(xì)胞死亡。隨后這些細(xì)胞塊發(fā)生附著，長出均一細(xì)胞群體。此可傳代細(xì)胞群體(>75代)的進(jìn)一步表征揭示出與之前用嘌呤霉素選擇方案觀察到的表達(dá)標(biāo)記相同的分布型。因此，該細(xì)胞對(duì)祌經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記(干蛋白、波形蛋白)、以及放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記(RC2、GLAST、BLBP和Pax6)為陽性。一旦建立了僅在形態(tài)上差異小和標(biāo)記基因中無差異后，在N2B27或NSA培養(yǎng)基中46C-NP細(xì)胞的特性類似。用此方案，分離了六種其它ES細(xì)胞系CGR8、E14T、Oct4-GIP、Sll、Rl和V6.5。這些細(xì)胞系各自具有相似形態(tài)和表達(dá)分布型，并可不斷傳代。實(shí)施例1-6NS細(xì)胞的移植為了測試NS細(xì)胞的體內(nèi)潛力，將它們植入胚胎和成年動(dòng)物CNS，以及腎囊移植物中。在NP5上測試電穿孔。發(fā)現(xiàn)用方波電穿孔器能對(duì)它們進(jìn)行有效的電穿孔。也可用lipofectamineplus試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這是主要優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槟壳翱色@得用于小鼠的所有遺傳操作。為了快速評(píng)價(jià)移植細(xì)胞，用攜帶eGFP標(biāo)記基因的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)46C-NP。感染非常有效，幾乎95%的細(xì)胞成功地標(biāo)記，隨著傳代eGFP信號(hào)強(qiáng)烈且穩(wěn)定。采用慢病毒感染允許轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地整合，并在移植細(xì)胞的長期分析中保持信號(hào)穩(wěn)定。評(píng)價(jià)移植胚胎腦后(一種環(huán)境，其中所包含所有分子和因子能夠維持并指導(dǎo)未成熟神經(jīng)細(xì)胞的分化)細(xì)胞的行為。按照Magrassi和同事所述(Magrassi等，Deve/opweW1999)方法，將100,000個(gè)細(xì)胞重懸于2微升終體積中，采用E14.5小鼠胚胎作為受體。移植后細(xì)胞存活良好(在移植物中對(duì)約20000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行近似評(píng)估)，容易檢測到eGFP信號(hào)，它們顯示移植后早期時(shí)間點(diǎn)已有的遷移活性。在移植后不同時(shí)間點(diǎn)(第四天、第七天、兩周和一個(gè)月)，分析移植細(xì)胞的命運(yùn)。在第四天及一周時(shí)，干蛋白免疫反應(yīng)性表明大多數(shù)細(xì)胞仍不成熟，但有23%表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記Tuj-l，16.3%獲得膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP。這些數(shù)據(jù)表明像所期望的多能NS細(xì)胞一樣，移植的NS能夠在體內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。也將NS細(xì)胞移植入成年動(dòng)物紋狀體。在這些移植物中，細(xì)胞存活良好(存活總比胚胎移植物低)并向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)分化。移植后兩周進(jìn)行的定量分析表明43.3%細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)記Tuj-l，26.6%顯示對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP的免疫反應(yīng)性。如干蛋白的表達(dá)表明，小部分細(xì)胞(11.1%)仍保持不成熟表型。腎囊中植入NP5-GFP不增加畸胎瘤的發(fā)生率(11=4，數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例2實(shí)施例2-1方法小鼠細(xì)胞的培養(yǎng)和分化Ying和Smith,2003詳細(xì)描述了ES細(xì)胞和神經(jīng)分化。通常，在補(bǔ)充有N2和10ng/mlEGF及FGF-2的NS-A培養(yǎng)基(NS擴(kuò)展培養(yǎng)基)(Euroclone)中，在未包被塑料板上培養(yǎng)的神經(jīng)分化單層培養(yǎng)物于第七天重新種板，產(chǎn)生稱為LC1的NS細(xì)胞和其它ES細(xì)胞衍生的NS細(xì)胞。細(xì)胞形成聚集體，然后貼壁長出NS細(xì)胞。于第七天在分化中的貼壁培養(yǎng)物中加入0.5ug/ml嘌呤霉素后產(chǎn)生46C-NS細(xì)胞。三天后將細(xì)胞重新接種于未包被的T75培養(yǎng)瓶，用添加10ng/mlEGF和FGF-2(Peprotech)但不含嘌呤霉素的N2B27培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過有限稀釋將單細(xì)胞接種于96孔板(Nunc)產(chǎn)生克隆細(xì)胞系NS-5(接種一小時(shí)后進(jìn)行單細(xì)胞評(píng)分)。采用標(biāo)準(zhǔn)操作程序產(chǎn)生E16.5小鼠胚胎皮層/紋狀體的原代培養(yǎng)物并使其附著在用0.1%明膠處理的培養(yǎng)瓶中。采用NS擴(kuò)展培養(yǎng)基使Cor-l和Str-l細(xì)胞在明膠上擴(kuò)展。為了分化為星形細(xì)胞，用補(bǔ)充有1%胎牛血清或10ng/mlBMP4(R&DSystem)的NS-A培養(yǎng)基將NS細(xì)胞以1X105細(xì)胞/孔重新接種于四孔板。為了分化為神經(jīng)元，用僅補(bǔ)充FGF-2的NS-A培養(yǎng)基將5X104NS細(xì)胞接種于多聚鳥氨酸/層粘連蛋白處理的孔。七天后，將培養(yǎng)基更換為補(bǔ)充有B27(Gibco)但沒有生長因子的NS-A。為了克隆分化，將1000個(gè)NS-5或Cor-l細(xì)胞接種于用層粘連蛋白預(yù)處理的10cm培養(yǎng)板中，在EGF/FGF-2中擴(kuò)展12天并如上述原位分化。NS細(xì)胞的表征利用合適的TRITC或FITC第二偶聯(lián)物進(jìn)行免疫組化檢測，利用DAPI染色進(jìn)行核計(jì)數(shù)。以如下稀釋度使用第一抗體干蛋白(1:10)，波形蛋白(1:50)，Pax6(l:5)，3CB2(1:20)，RC2(1:50)(DSHB);TuJ(l:200)(Covance);GFAP(1:300)(多克隆抗體和單克隆抗體，Sigma)，MAP2(l:200)(Chemicon和BectonDickinson);NeuN(l:200)，GABA(1:200)，Gad65/67(l:200)(Chemicon);突觸素(Synaptophysin)(1:200)(Sigma);01ig2(l:5000)(H.Takebayashi);Emx2(l:2000)(A.Corte);BLBP(1:500)(N.Heintz);凸素/mAbl3A4(l:200)(W.Huttner)。陰性對(duì)照為ES細(xì)胞、分化NS細(xì)胞或僅有第二抗體。利用RNeasy試劑盒(Qiagen)提取總RNA，并利用SuperscriptII(Invitrogen)生eftrwTAJ丑4^dtl厶。m畫l;47疋t^/^)cA^莊TX、iLFJC六士^";n;丑^^nm士產(chǎn)+戰(zhàn)〃人Li^丄、Arv丄-nrvo|"不p一/乂L^yjsu、厶jiV日^IV7I'，,j/71'RVj、m_iwijn丄、，y+曰30個(gè)循環(huán)。中期展開時(shí)，用5毫升0.56。/。KCl處理細(xì)胞20分鐘，在甲醇乙酸(3:1)中冰上固定15分鐘，鋪展于玻璃載片上并用TOPRO-3(Molecularprobes)染色。人胚胎和胎兒培養(yǎng)物具有知情同意書的人組織研究由洛錫安健康部研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在人類受精和胚胎學(xué)機(jī)構(gòu)頒發(fā)的R0132許可證下，捐贈(zèng)冷凍的多余人胚胎用于研究。由卡內(nèi)基分期(Carnegiestage)19/20胎兒切下人皮層，然后選擇性終止，同意在Polkinghorne指導(dǎo)方法下進(jìn)行研究。移植物按照Magrassi等1998所述進(jìn)行胎手術(shù)。在暴露于透照的情況下，利用玻璃毛細(xì)管將lulHBSS中的5X1()4細(xì)胞注入E14.5SpragueDawley大鼠胚胎的端腦囊泡中。將注射的胚胎放回腹腔發(fā)育到足月。分娩后第七天處死動(dòng)物(出生后天(P)l，11=16)和移植后五周(P30，n=8)。對(duì)于成年動(dòng)物移植，將129或CD1小鼠置于Kopf立體定向儀中，含2X1()5NS細(xì)胞的5ulHBSS細(xì)胞懸液注入紋狀體(r^22)或海馬(r^21)。兩周后(11=16)和四周后(11=10)處死移植小鼠并經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛。利用如下抗體對(duì)冷凍切片(16um)進(jìn)行染色(小鼠)NeuN(l:IOO)和Ki67(l:10)(Chemicon),MAP2(1:200;BectonDickinson),干蛋白(1:5;RonMcKay);(兔)卩III微管蛋白(1:500;Covance);GFAP(1:200;Dako);第二抗體，得克薩斯紅(載體)(JacksonImmunoResearch)和AlexaFluor488(MolecularProbes)。用防褪色溶液保存切片，用NikonTE2000-SECLIPSE和BioradRadiance2100共聚焦顯微鏡分析。實(shí)施例2-2誘導(dǎo)ES細(xì)胞單層分化七天，然后將其再接種于補(bǔ)充有EGF和FGF-2的基本培養(yǎng)基(NS-A加N2)中。在這些極限條件下(不允許ES細(xì)胞存活)，存活細(xì)胞主要交聯(lián)成為漂浮簇。3-5天后收獲這些聚集體并重新接種于新鮮培養(yǎng)基中。它們?cè)?-3日內(nèi)貼壁并長出形態(tài)均一的雙極細(xì)胞群體，稱為LC1細(xì)胞。傳代后LC1細(xì)胞繼續(xù)以貼壁培養(yǎng)物形式生長，常形成網(wǎng)格。它們可隨約24小時(shí)的倍增時(shí)間連續(xù)快速增殖。LC1細(xì)胞顯示神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記干蛋白和RC2但星形細(xì)胞分化標(biāo)記GFAP或神經(jīng)元抗原的表達(dá)可忽略不計(jì)(圖1A)。暴露于血清或BMP時(shí)，48小時(shí)內(nèi)LC1細(xì)胞呈現(xiàn)典型星形細(xì)胞形態(tài)并隨后一致地表達(dá)GFAP(圖IA，e)。相反，再接種在無EGF的層粘連蛋白上5-7天后撤消FGF-2，出現(xiàn)具有神經(jīng)元過程的細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記III型P-微管蛋白、MAP2(圖1A，f、g)和neuN(未顯示)。大多數(shù)神經(jīng)元呈GAD67(圖1A，g)和GABA(未顯示)染色和第七天一個(gè)亞群體顯示表達(dá)成熟標(biāo)記突觸蛋白(圖1A，h)。傳代115次后，產(chǎn)生大量神經(jīng)元(>35%)(圖1A，i)。綜合觀察結(jié)果，晚期傳代時(shí)LC1細(xì)胞保留雙倍染色體內(nèi)容物(未顯示)，這證實(shí)了自我更新的神經(jīng)干(NS)細(xì)胞的存在。實(shí)施例2-3為測定細(xì)胞聚集體對(duì)于NS細(xì)胞的產(chǎn)生是否必要，我們?cè)谡麄€(gè)衍生過程中保持細(xì)胞附著。利用46CES細(xì)胞進(jìn)行譜系選擇(Li等，1998)，在這種細(xì)胞中，GFPirespac報(bào)告基因/選擇盒整合入神經(jīng)特化的特異性標(biāo)記Soxl基因(Aubert等，2003)。分化誘導(dǎo)后瞬時(shí)嘌呤霉素選擇產(chǎn)生純化的神經(jīng)前體細(xì)胞群體而沒有ES細(xì)胞殘留(Stavridis等，2003)(圖1B，a、b)。然后，F(xiàn)GF-2和EGF加入到培養(yǎng)表達(dá)Soxl的祌經(jīng)前體細(xì)胞富集培養(yǎng)基中。細(xì)胞在此條件中保持粘附。3-4代后細(xì)胞異質(zhì)性減少，表現(xiàn)為雙極細(xì)胞數(shù)逐漸增加并開始形成廣泛的網(wǎng)格。引起興趣的是，細(xì)胞在此階段不表達(dá)Soxl(圖1B，c、d)但保持對(duì)Sox2和干蛋白陽性。為確立神經(jīng)干(NS)細(xì)胞的存在，在Terasaki孔中分離單細(xì)胞并擴(kuò)展為貼壁培養(yǎng)物(圖1B，e、f)。最初五個(gè)克隆系衍生相似形態(tài)并以大量LC1群體為生長特征。這些細(xì)胞缺少全能因子Oct4和Nanog及早期神經(jīng)標(biāo)記Soxl的可檢測的表達(dá)，但保留泛神經(jīng)上皮標(biāo)記Sox2和干蛋白(圖1C)。因此，通過連續(xù)貼壁培養(yǎng)Soxl陽性早期神經(jīng)外胚層前體細(xì)胞產(chǎn)生NS細(xì)胞。實(shí)施例2-4更詳細(xì)地檢測了克隆NS-5，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)Pax6、Glast和BLBPmRNA，并且對(duì)RC2、波形蛋白、3CB2、SSEA1/Lexl和凸素呈免疫陽性(圖1D)。認(rèn)為這組標(biāo)記可診斷神經(jīng)原性放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，它是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間神經(jīng)元和星形細(xì)胞的前體(Campbell等，2002;Hartfuss等，2001)。與未克隆LC1細(xì)胞一樣，NS-5細(xì)胞對(duì)星形細(xì)胞和神經(jīng)元分化是合適的(圖1E)。以克隆密度接種于EGF加FGF-2的NS-5細(xì)胞產(chǎn)生雙極細(xì)胞集落。每個(gè)集落顯示基本上所有細(xì)胞都表達(dá)RC2和BLBP，不表達(dá)GFAP(圖1F，c、d)?？商舫鲞@些亞克隆并繼續(xù)擴(kuò)展。為了測定NS培養(yǎng)物內(nèi)能夠祌經(jīng)元分化的細(xì)胞的頻率，我們?cè)僖淮我钥寺∶芏冉臃NNS-5細(xì)胞，在EGF/FGF-2中擴(kuò)展12天，然后僅在FGF-2中擴(kuò)展5天，然后再在沒有生長因子的條件下擴(kuò)展7天。每個(gè)集落(126/126)都產(chǎn)生TuJ陽性細(xì)胞(圖1F，b)。這些數(shù)據(jù)表明，NS培養(yǎng)物中所有集落形成細(xì)胞都對(duì)神經(jīng)元分化是合適的。最后，像LC1那樣，NS-5細(xì)胞維持雙倍體染色體組(圖1G)并且代表不需要復(fù)合物細(xì)胞微環(huán)境就能自我更新的未轉(zhuǎn)化的克隆神經(jīng)干(NS)細(xì)胞系。實(shí)施例2-5為了評(píng)價(jià)無血清單層誘導(dǎo)方案是否是產(chǎn)生NS細(xì)胞的必要條件，通過在含血清培養(yǎng)基中形成胚胎樣小體和暴露于視黃酸誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化(Bain等，1995)。用G418對(duì)聚集體進(jìn)行Sox2譜系選擇(Li等，1998;Billon等，2002)48小時(shí)，然后再接種于存在FGF-2和EGF而沒有血清的培養(yǎng)基中。貼壁后，增殖的Sox2陽性、干蛋白陽性細(xì)胞顯示出NS細(xì)胞典型的雙極形態(tài)和網(wǎng)格生長，加上在多代后有星形細(xì)胞和神經(jīng)元分化的能力(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，NS細(xì)胞衍生自胚胎樣小體。實(shí)施例2-6利用沒有譜系選擇的單層誘導(dǎo)產(chǎn)生NS細(xì)胞，如三種獨(dú)立的ES細(xì)胞分離物E14TG2a、CGR8禾QRl的LC1中所述。所有受試NS細(xì)胞系中至少95%的細(xì)胞表達(dá)干蛋白和RC2。更詳細(xì)地檢測了CGR8和E14TG2a衍生的NS細(xì)胞，它們顯示出全組放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(圖2A)、神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記物Sox2和Sox3、以及bHLH轉(zhuǎn)錄因子01ig2和Mashl(圖2B)。由于這些轉(zhuǎn)錄因子的假定決定性作用，下調(diào)Soxl但保持Sox2是這些NS細(xì)胞的顯著特征(Pevny等，1998)。因此，當(dāng)Soxl標(biāo)記所有神經(jīng)外胚層前體時(shí)，它不保留在Sox2可能起到關(guān)鍵作用的干細(xì)胞中。NS細(xì)胞也表達(dá)前體細(xì)胞擴(kuò)展中涉及的Emx2(Hein等,2001;Galli等，2002)。經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫染色評(píng)價(jià)所有受試NS培養(yǎng)物都經(jīng)歷星形細(xì)胞和神經(jīng)元分化(圖2C)。實(shí)施例2-7根據(jù)它們與放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的明顯關(guān)系，我們檢測了NS細(xì)胞是否從ES細(xì)胞的預(yù)適應(yīng)到離體增殖產(chǎn)生，或是否可衍生自胎兒祌經(jīng)組織。來自E16.5胎腦的原代胎兒CNS細(xì)胞在加入生長因子的基本培養(yǎng)基中對(duì)塑料板的貼壁能力差，并且自發(fā)地形成聚集體。6-7天后，這些聚集體沉降到明膠包被的塑料板上。14天后，用胰酶消化長出物并接種于明膠包被的塑料板上。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，使形態(tài)上可鑒定為NS細(xì)胞的細(xì)胞增殖，然后擴(kuò)展為連續(xù)細(xì)胞系。這些胎腦衍生細(xì)胞與ES細(xì)胞衍生的NS細(xì)胞表達(dá)相同的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記和神經(jīng)原性標(biāo)記(圖2A，B)并顯示出一致的mRNA分布型。它們對(duì)星形細(xì)胞和神經(jīng)元分化同樣是合適的(圖2C)。將皮層衍生的Cor-l細(xì)胞以單細(xì)胞接種，然后集落須經(jīng)依次撤消生長因子，如對(duì)NS-5所述。每個(gè)集落都產(chǎn)生TuJ陽性神經(jīng)元。這說明Corl培養(yǎng)物中所有產(chǎn)克隆細(xì)胞都是神經(jīng)原性的。也不難對(duì)Cor-l細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，并由單個(gè)細(xì)胞連續(xù)擴(kuò)展，表現(xiàn)出自我更新。因此，NS細(xì)胞衍生自胎腦并共享ES細(xì)胞衍生的NS細(xì)胞的關(guān)鍵特性。大多數(shù)NS細(xì)胞具有預(yù)計(jì)為放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的延長的雙極形態(tài)、薄層延伸、終足和卵形核(Rakic，2003)。也存在具有延伸短的扁平和致密細(xì)胞。中期標(biāo)記物磷酸化的組蛋白H3的免疫染色表明，致密細(xì)胞是有絲分裂細(xì)胞。延時(shí)視像顯微鏡檢查證實(shí)了細(xì)胞分裂前形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。此外，延時(shí)揭示出，NS細(xì)胞經(jīng)歷著絲粒間(interkinetic)核遷移，這是體內(nèi)神經(jīng)上皮和放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的良好鑒定的特征。因此，NS細(xì)胞是神經(jīng)原性放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的體外可連續(xù)擴(kuò)展的類似物。實(shí)施例2-8使凍/融傳代40次的小鼠神經(jīng)球在NS擴(kuò)展培養(yǎng)基中貼附于明膠包被的塑料板上。長出與NS細(xì)胞難區(qū)分的雙極細(xì)胞。這些細(xì)胞可連續(xù)增殖為均一的RC2陽性、GFAP陰性細(xì)胞群，然后誘導(dǎo)分化為星形細(xì)胞或神經(jīng)元。實(shí)施例2-9我們研究了植入小鼠腦后NS細(xì)胞的行為。通過子宮內(nèi)注射E14.5將慢病毒eGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的ES細(xì)胞衍生的LCl細(xì)胞引入發(fā)育腦中(Magrassi等，1998)。出生后處死動(dòng)物，檢測腦切片中存在的eGFP陽性細(xì)胞。NS細(xì)胞后代遷移入不同腦區(qū)。免疫組化分析揭示出eGFP與前體表記干蛋白，神經(jīng)元表記TuJ、NeuN和MAP2，以及GFAP(數(shù)量較少)的共表達(dá)。也將NS細(xì)胞注射入成年小鼠紋狀體。在這種情況下，GFP陽性細(xì)胞保持定位在注射部位附近。移植4周后，44.4i5.7。/。GFP表達(dá)細(xì)胞具有神經(jīng)元形態(tài)，并且對(duì)MAP2為免疫陽性，37.4±6.1%表達(dá)GFAP，4.2±1.9%保持干蛋白的表達(dá)(圖3)。僅在1.0±0.6%GFP陽性細(xì)胞中檢測到增殖標(biāo)記Ki67，表明NS細(xì)胞在體內(nèi)從細(xì)胞周期退出。與此一致的是，我們?cè)谝浦?個(gè)月后在共計(jì)35個(gè)腦中未觀察到不受調(diào)節(jié)的增殖或腫瘤形成的組織學(xué)證據(jù)。而且，植入小鼠腎囊的NS細(xì)胞不增殖或產(chǎn)生畸胎瘤。這些數(shù)據(jù)說明，NS細(xì)胞可在胎兒和成年動(dòng)物腦環(huán)境中存活并分化，這有別于ES細(xì)胞(Bmstle等，1997)，它們不產(chǎn)生畸胎瘤。而且，與傳代神經(jīng)球的移植物顯著相反，神經(jīng)元分化的頻率顯著相對(duì)高(Rossi等，2002)。實(shí)施例2-10最后，我們研究了相似的NS細(xì)胞是否可分離自人來源。在由捐贈(zèng)的多余胚胎產(chǎn)生人ES細(xì)胞的過程中，我們?cè)?-6周后觀察到培養(yǎng)物廣泛分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞典型的花結(jié)結(jié)構(gòu)。將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到NS擴(kuò)展培養(yǎng)基中。再過3-4周后，這些培養(yǎng)物中出現(xiàn)類似于NS細(xì)胞的雙極細(xì)胞(圖4A)，連續(xù)培養(yǎng)5個(gè)月。我們也從選擇性終止中獲得卡內(nèi)基分期19-20人胎兒皮層組織。解離的細(xì)胞起初形成漂浮的聚集體，7天后再接種并使其貼附于明膠包被的塑料板上，用于由小鼠胎腦衍生NS細(xì)胞。建立增殖培養(yǎng)物(圖4B)。來自ES細(xì)胞和胎兒組織的人NS培養(yǎng)物的特征是存在與雙極細(xì)胞相連的扁平細(xì)胞。然而，所有細(xì)胞都表達(dá)不成熟的前體標(biāo)記物干蛋白、波形蛋白和3CB2(圖4B)。延時(shí)監(jiān)測證實(shí)，兩種細(xì)胞形態(tài)是可塑的和可互相轉(zhuǎn)化的。這些人類細(xì)胞也顯示出低水平的GFAP，與放射狀膠質(zhì)細(xì)胞中人GFAP啟動(dòng)子活性一致(Rakic，2003;Malatesta等，2000)。它們的增殖比小鼠細(xì)胞更慢，倍增時(shí)間為數(shù)天。依次撤消EGF禾[]FGF-2后，它們似乎產(chǎn)生不成熟的神經(jīng)元細(xì)胞(圖4C)。在血清中傳代后產(chǎn)生了具有典型星形細(xì)胞形態(tài)和強(qiáng)烈GFAP免疫反應(yīng)性的細(xì)胞(圖4C)。實(shí)施例3采用膜片鉗技術(shù)的全細(xì)胞變體研究了體外分化期間培養(yǎng)物中NS細(xì)胞的電生理特性，以了解從電生理觀點(diǎn)看，特定處理后這些細(xì)胞是否可有效轉(zhuǎn)化為成熟和有功能的神經(jīng)元。電生理記錄的溶液在浴液中建立電極和細(xì)胞之間的密封，浴液由以下組分組成(毫摩爾/升)155NaCl、1.0CaCl2、1MgCl2、3.0KC1、10葡萄糖、10HEPES/NaOH(pH7.4)。為電流鉗記錄和電壓鉗中的總電流記錄建立全細(xì)胞配置后，尖頭填充溶液含有(毫摩爾/升)128KC1、10NaCl、11EGTA、4Mg隱ATP、10HEPES/KOH(pH7.4)。為了在電壓鉗條件下研究電壓門控Na+通道，使膜片尖頭充滿(毫摩爾/升)130CsCl、10NaCl、20TEA-C1、IOEGTA、2MgCl2、4Mg-ATP、10HEPES/CsOH(pH7.4)，胞外溶液含有(毫摩爾/升)130NaCl、2CaCl2、2MgCl2、10葡萄糖、5氯化四乙銨、CdCl20.2、10HEPES/NaOH(pH7.4)。為了研究電壓門控Ca^通道，使膜片尖頭充滿(毫摩爾/升)120CsCl，20TEA國C1，10EGTA，2MgCl2，4Mg隱ATP，10HEPES/CsOH(pH7.4)，胞外溶液含有(毫摩爾/升)130NaCl、10BaCl2、10葡萄糖、5氯化四乙銨、104-AP1、TTXl(T3、HEPES/NaOH(pH7.4)。膜片鉗記錄用Ax叩atch200B膜片鉗放大器(AxonInstrumentsInc.，Burlingame，CA)，在電壓鉗條件下以膜片鉗全細(xì)胞設(shè)置(19)室溫(20-24'C)記錄離子電流，用與IBM兼容性PC連接的Digidata1322AA/D轉(zhuǎn)換器(AxonInstrumentsInc.,Burlingame,CA)以采樣間隔26-100微秒數(shù)字化記錄的離子電流。用以下軟件包pClamp9(AxonInstrumentsInc.，Burlingame,CA)禾口ORIGIN6(MicrocalSoftwareInc.，Northampton,MA)進(jìn)行刺激、獲取和數(shù)據(jù)分析。在電壓鉗實(shí)驗(yàn)中，首先用模擬電路降低漏泄電流和電容性電流的線性組分，然后用P/N法幾乎完全消除。膜片吸管由硼硅酸鹽玻璃管制成，并經(jīng)過煅燒拋光。內(nèi)部充滿溶液時(shí)吸管的最終阻抗為3-4MQ。以5KHz過濾電流。圖5A顯示出在不同體外分化階段(用分化培養(yǎng)基分別培養(yǎng)6、20和30天)的三種NS細(xì)胞的全細(xì)胞電壓鉗步驟至測試電位去極化期間獲得的電流記錄，所用浴和吸管填充溶液適合于分離內(nèi)向(Na+)和外向(K+)電壓門控離子電流。通過簡單地檢査電流示蹤證明，在體外分化早期己經(jīng)存在相當(dāng)大的外向電壓門控電流(6天，示蹤a)。此電流(可通過施加含有5mM氯化四乙銨的胞外鹽水阻斷)具有延遲-整流器K+電流的特征。在分化晚期其幅度僅稍有增加(20-30天，分別是示蹤b和c)。相反，隨著接觸分化培養(yǎng)基的時(shí)間不斷增加，6天后可以忽略內(nèi)向電流幅度急劇增加。圖5B顯示胞內(nèi)注射保持電位約-80mV產(chǎn)生的70300pA矩形去極化電流刺激后引發(fā)的電壓反應(yīng)，圖5A顯示在相同細(xì)胞中從電壓鉗轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏縻Q模式。實(shí)際上，電壓門控內(nèi)向電流的幅度增加反映了分化細(xì)胞引發(fā)動(dòng)作電位的能力。實(shí)際上，僅接觸分化試劑6天和顯示可以忽略的內(nèi)向電流的細(xì)胞不能引發(fā)再生的電壓反應(yīng)(圖5B中用(a)標(biāo)記的示蹤物)。相反，在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)30天的細(xì)胞中可引發(fā)具有去極化速率相對(duì)較快的過調(diào)節(jié)作用電位(圖5B中用(c)標(biāo)記的示蹤物)，并顯示大內(nèi)向電流(圖A中的示蹤c)。在用分化試劑處理20天的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)具有一時(shí)性作用電位的中間位置(圖5B中用(b)標(biāo)記的示蹤物)，且顯示中度內(nèi)向電流(圖A中的示蹤b)。由此初步分析可以看出，這些細(xì)胞的興奮性特性與內(nèi)向電壓門控電導(dǎo)率的大小嚴(yán)格相關(guān)。定量分析此電導(dǎo)率隨與分化培養(yǎng)基的接觸時(shí)間而變化，用不同分化階段的細(xì)胞和應(yīng)用對(duì)研究電壓門控Na+通道的活性特異性的胞內(nèi)和胞外鹽水引發(fā)內(nèi)向電流(參見方法)。在細(xì)胞分化的任何時(shí)間，快速失活性內(nèi)向電流被選擇性Na通道阻斷劑河豚毒素(l口M)完全阻斷，在測試電位為-20-10mV時(shí)達(dá)到峰值，這顯示神經(jīng)元中電壓門控Na+電流的典型特征(數(shù)據(jù)未顯示)。在圖5C中顯示了-20mV時(shí)Na+電流幅度的進(jìn)展隨接觸分化培養(yǎng)基的時(shí)間而變化。有趣的是，Na+電導(dǎo)率增加與接觸分化培養(yǎng)基的細(xì)胞增多完全相關(guān)。實(shí)際上，在處理30天內(nèi)，Na+電流幅度平均增加約十倍(從頭5天期間的-55土14pA(n二17)到25天以上的-434士135pA(『13))。以相同方式，在體外分化的頭15天期間，Na+電流在0+20mV的電流鉗條件下引發(fā)再生電位(在閾值和峰值之間測定的口V)(n=6)，然而，處理25天以上后，它達(dá)到+30+70mV的值(11=6)?？傊?，在用分化培養(yǎng)基處理25天以上的NS細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)興奮性特性和潛在的電壓門控Na+電導(dǎo)率是神經(jīng)元向其成年表型發(fā)育的典型特征。支持前述結(jié)論的另一特征是接觸分化培養(yǎng)基至少7天或更長時(shí)間后，大多數(shù)受試細(xì)胞中存在電壓門控Ca^通道電導(dǎo)率。圖5D顯示了從泡在10mMB^+中的相同細(xì)胞使膜去極化至所示測試電位獲得的樣品示蹤。-40mV引發(fā)電流組分的快速活化和相對(duì)快速的失活(口f21ms)是神經(jīng)元LVACa^通道電流的回憶(Carbone和Lux，1987)。相反，0mV引發(fā)的Ba"電流(顯示出慢(口h二73ms)且不完全的失活)具有神經(jīng)元HVAC^+通道電流的典型特征。圖5E的電流-電壓關(guān)系驗(yàn)證了此細(xì)胞中存在兩種不同Ca^通道(LVA和HVA)電導(dǎo)率。LVA電流平均在-40mV時(shí)達(dá)到峰值，而HVA電流的I/V關(guān)系在0mV時(shí)達(dá)到峰值。在27個(gè)細(xì)胞中，可檢測到19個(gè)細(xì)胞的HVABa"+電流，在60%己表現(xiàn)出HVACa^電流的細(xì)胞(n^13)中檢測到LVA電流組分。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)元可起以下作用它們可以激發(fā)動(dòng)作電位，活性神經(jīng)元的標(biāo)記。因此，根據(jù)本發(fā)明，我們獲得并均一地增殖了確定的NS細(xì)胞，作為ES細(xì)胞和胎兒腦提取物的分化后代。NS細(xì)胞以簡單的貼壁單層培養(yǎng)物無性增殖并保持雙倍體。長時(shí)間擴(kuò)展后，它們?cè)隗w外和植入成年動(dòng)物腦中時(shí)有效分化為神經(jīng)元和星形細(xì)胞。NS細(xì)胞也在體外形成少突膠質(zhì)細(xì)胞。NS細(xì)胞均一地表達(dá)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和星形細(xì)胞的胎兒前體的形態(tài)特征和分子特征。我們能夠建立小鼠和人胎兒腦的貼壁NS細(xì)胞系。實(shí)施例6用以下方法獲得小鼠ES細(xì)胞和胎兒皮層的NS細(xì)胞。獲得的NS細(xì)胞均一地表達(dá)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。用免疫化學(xué)方法分析特異性衍生自CGR8ES細(xì)胞或E16胎兒皮層的NS細(xì)胞中所示標(biāo)記物的表達(dá)(內(nèi)標(biāo)Cor-l和克隆衍生物Cor-1.3)。大容量檢測證明，幾乎所有細(xì)胞都表達(dá)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，而這些細(xì)胞對(duì)GFAP為陰性。實(shí)施例7用以下方法由擴(kuò)展的小鼠胎兒前腦神經(jīng)球產(chǎn)生NS細(xì)胞。衍生自胎兒神經(jīng)球長期培養(yǎng)物(40代)的NS細(xì)胞系與ES衍生的NS細(xì)胞系的形態(tài)相同，表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞/放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物免疫反應(yīng)性，并可分化為神經(jīng)元和星形細(xì)胞。這表明，獲自新鮮胎兒神經(jīng)球的NS細(xì)胞與凍存、然后長時(shí)間培養(yǎng)為神經(jīng)球的那些神經(jīng)球相同。實(shí)施例8將LC1小鼠NS細(xì)胞植入大鼠胎兒腦。植入E14.5大鼠腦室1周后，拍攝經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染eGFP的NS細(xì)胞的共聚焦圖像。供體細(xì)胞由腦室遷移入成簇實(shí)質(zhì)中，作為單個(gè)細(xì)胞。植入的細(xì)胞顯示出與eGFP和神經(jīng)元標(biāo)記物MAP2、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP或祖細(xì)胞標(biāo)記物干蛋白的共定位。因此，NS細(xì)胞在植入大鼠胎兒腦后遷移和分化。實(shí)施例9衍生和操作NS細(xì)胞系的方法我們?cè)O(shè)計(jì)了以下衍生和操作NS細(xì)胞系的方法。由ES細(xì)胞衍生小鼠NS細(xì)胞系在貼壁單層培養(yǎng)物中，ES細(xì)胞可有效轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)Soxl的神經(jīng)祖細(xì)胞[Pl]。本文別處描述了用于此ES細(xì)胞分化的詳細(xì)方案和疑難解答[P2]。簡要說，通常在明膠包被的組織培養(yǎng)塑料板上，在無飼細(xì)胞的條件下，用補(bǔ)充有10%胎牛血清和100U/ml重組白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)基培養(yǎng)ES細(xì)胞[P3]。在T75培養(yǎng)瓶(Iwaki)中將未分化的ES細(xì)胞擴(kuò)展至80n/。匯合，胰酶消化，重懸于N2B27培養(yǎng)基[P2]。將細(xì)胞接種到用0.1。/。明膠溶液(Sigma)包被至少IO分鐘，然后干燥的9cm培養(yǎng)板(Iwaki)上。由于初始接種密度是有效神經(jīng)誘導(dǎo)的重要參數(shù)，并且可因ES細(xì)胞系而不同，我們通常接種幾種不同的每板細(xì)胞密度(0.8X106、1X1()S和1.2X106)。每天更換培養(yǎng)基，同時(shí)去除脫附或死亡的細(xì)胞。在這些條件下，4-5天內(nèi)50-80%細(xì)胞將經(jīng)歷神經(jīng)譜系特化，從第5天起可檢測到明顯的神經(jīng)元分化?？赏ㄟ^如下方法使不均一祖細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)變?yōu)榫坏腘S細(xì)胞系。在第7天用胰酶消化分化培養(yǎng)物，再將2-3X106細(xì)胞接種于未包被的T75培養(yǎng)瓶中的NS擴(kuò)展培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含NS-A培養(yǎng)基(Euroclone)，補(bǔ)充有終濃度2mM的L-谷胺酰胺(Gibco)、修飾的N2補(bǔ)充物(在室內(nèi)新鮮制備)[P2]以及小鼠EGF(Peprotech)和人FGF-2(Peprotech)各10ng/ml。擴(kuò)展培養(yǎng)基可在4。C儲(chǔ)存長達(dá)4周。2-3天內(nèi)，培養(yǎng)瓶的懸浮培養(yǎng)物中將含有數(shù)千個(gè)漂浮的聚集體(絕對(duì)數(shù)量因初始ES細(xì)胞分化效率而不同)。通過溫和離心或在30ml通用試管中重力沉降IO分鐘收獲細(xì)胞聚集體。此步驟去除了細(xì)胞碎片和死細(xì)胞，從而富集NS細(xì)胞創(chuàng)建者(foimder)并保證完全交換培養(yǎng)基。將細(xì)胞再接種于明膠包被的T75培養(yǎng)瓶(Iwaki)的10ml新鮮NS擴(kuò)展培養(yǎng)基中。再過3-7天后，細(xì)胞聚集體將貼附于培養(yǎng)瓶，短時(shí)間后長出具有特征性雙極NS細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞。廣泛長出細(xì)胞后(再過3-4天)，用胰酶消化整個(gè)群體，并以單細(xì)胞再接種到含有擴(kuò)展培養(yǎng)基的明膠包被的T75培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞非常迅速地生長(倍增時(shí)間25小時(shí))并保持貼壁。在幾代內(nèi)消除了殘留的分化細(xì)胞和母細(xì)胞(由GFAP和TuJl免疫染色監(jiān)測)，培養(yǎng)物對(duì)NS細(xì)胞標(biāo)記物為均一的陽性。對(duì)于46CES細(xì)胞(Soxl-GFP-IRES-pac敲入)[P4]而言，可用嘌呤霉素(0.5口g/ml)瞬時(shí)選擇通過連續(xù)貼壁培養(yǎng)消除非神經(jīng)細(xì)胞并產(chǎn)生NS細(xì)胞。用N2B27培養(yǎng)基將46CES細(xì)胞(1X10"接種到明膠包被的9cm培養(yǎng)皿上，以誘導(dǎo)神經(jīng)定型。六天后，加入嘌呤霉素處理48小時(shí)。然后，用含EGF(10ng/ml)和FGF-2(10ng/ml)的N2B27培養(yǎng)基將富集的Soxl表達(dá)細(xì)胞群(3-5X106)再接種到明膠包被的9cm培養(yǎng)板上。起初形態(tài)不均一的Soxl表達(dá)群體逐漸獲得Soxl陰性特征，3-4代后，獲得均一的NS細(xì)胞形態(tài)和標(biāo)記物表達(dá)。由胎兒CNS和神經(jīng)球衍生小鼠NS細(xì)胞系NS細(xì)胞擴(kuò)展培養(yǎng)基中胎兒E16.5皮層和原代培養(yǎng)物解離后，懸液中形成細(xì)胞簇。通過接種到含有擴(kuò)展培養(yǎng)基的明膠包被的基材上不難使這些原代聚集體轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁NS細(xì)胞系。為了促進(jìn)貼壁，先通過沉降有效去除細(xì)胞碎片/死細(xì)胞和完全交換培養(yǎng)基很重要。細(xì)胞聚集體在2-5天內(nèi)將貼壁并長出。然后可用胰酶將長出的細(xì)胞消化為單細(xì)胞，在NS細(xì)胞擴(kuò)展培養(yǎng)基中再接種和增殖。可通過將傳代的胎兒神經(jīng)球[P5]解離和直接接種到明膠包被的塑料板上的NS擴(kuò)展培養(yǎng)基中方便地建立NS細(xì)胞。在初始的幾代中，衍生的NS細(xì)胞系傾向于聚集、從培養(yǎng)瓶上脫附和再形成神經(jīng)球，尤其是若細(xì)胞密度高時(shí)。因此，應(yīng)該在50%或低于50%匯合時(shí)傳代培養(yǎng)物。自發(fā)聚集的傾向是可變的，但通常在進(jìn)一步傳代后降低，或者通過建立克隆細(xì)胞系。NS細(xì)胞的傳代和擴(kuò)展一旦建立后，用NS擴(kuò)展培養(yǎng)基增殖NS細(xì)胞。在明膠包被的培養(yǎng)板/培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)NS細(xì)胞，通常以1:2至1:5分瓶。NS細(xì)胞的倍增時(shí)間約為25小時(shí)。用胰酶/EDTA或通過無鈣鎂PBS(Sigma)孵育傳代細(xì)胞。為了建立克隆細(xì)胞系，可使單個(gè)細(xì)胞沉積在含有擴(kuò)展培養(yǎng)基的明膠包被的微孔中。較不嚴(yán)格地說，可以非常低的密度—每9cm培養(yǎng)皿1000個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞。在兩周內(nèi)出現(xiàn)集落，可挑出并擴(kuò)展集落。深低溫保藏和回收NS細(xì)胞凍/融后不難回收NS細(xì)胞。通常，我們用胰酶消化60-90%匯合的T75培養(yǎng)瓶，并將沉淀重懸于添加10%DMSO的1.5mlNS擴(kuò)展培養(yǎng)基中。然后，將其分裝到3個(gè)lml凍存管(Nunc)中，儲(chǔ)存于-80'C?？稍谶@些條件下儲(chǔ)存6個(gè)月以上后回收NS細(xì)胞。如果需要長期儲(chǔ)存，將凍存小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中。通過將小瓶迅速置入37。C使NS細(xì)胞解凍，然后轉(zhuǎn)移到10ml預(yù)熱的NS擴(kuò)展培養(yǎng)基中。離心細(xì)胞，然后重懸于新鮮擴(kuò)展培養(yǎng)基中以去除DMSO。對(duì)于NS細(xì)胞而言，深低溫保藏后的細(xì)胞回收率>95%。NS細(xì)胞的星形細(xì)胞和神經(jīng)元分化在明膠包被的培養(yǎng)瓶/板上NS細(xì)胞接觸BMP4(10ng/ml)或1%FCS的NS-A溶液(含有N2，不含EGF/FGF)2天內(nèi)，NS細(xì)胞快速分化為GFAP陽性星形細(xì)胞。對(duì)于星形細(xì)胞分化而言，細(xì)胞密度不是重要參數(shù)。對(duì)神經(jīng)元分化而言，用不含鈣/鎂的Accutase(Sigma)的PBS溶液使細(xì)胞脫附，從而收獲NS細(xì)胞，再將0.5-1.0乂104細(xì)胞接種于聚鳥氨酸/層粘連蛋白包被的4孔板(Nunc)的各孔中，各孔中含補(bǔ)充有FGF-2(5ng/ml)、修飾的N2和B27(Gibco)的NS-A培養(yǎng)基。我們發(fā)現(xiàn)，與其它基本培養(yǎng)基相比，用NS-A基本培養(yǎng)基更容易發(fā)生神經(jīng)元分化。每2-3天更換一半體積的培養(yǎng)基，以保持培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)。在這些條件中7天后，我們將培養(yǎng)基交換為以1:1的比例混有神經(jīng)基本培養(yǎng)基(Gibco)的NS-A，其中補(bǔ)充有0.25XN2力nB27，不含EGF或FGF。此配方能促進(jìn)進(jìn)一步的神經(jīng)元分化和成熟。為了長期培養(yǎng)神經(jīng)元(超過14天)，我們將培養(yǎng)基交換為存在BDNF(10ng/ml)、補(bǔ)充有B27但不含N2的神經(jīng)基本培養(yǎng)基。乂乂丄X3觀/re4口、JJW開亇Hrf^ii^bTrni在0.1。/。明膠(Sigma)包被的培養(yǎng)瓶/板上用擴(kuò)展培養(yǎng)基擴(kuò)展人NS細(xì)胞，對(duì)于小鼠NS細(xì)胞而言，再補(bǔ)充100U/ml重組人白血病抑制因子(LIF)。細(xì)胞的倍增時(shí)間約為1周。達(dá)到~30%匯合后，用胰酶一分為二地傳代。應(yīng)該避免過度生長，以維持單層培養(yǎng)物并防止聚集和脫附。就神經(jīng)元分化而言，用Accutase(Sigma)收獲人NS細(xì)胞，再將大約1乂104細(xì)胞接種于含有擴(kuò)展培養(yǎng)基的聚鳥氨酸/層粘連蛋白(Sigma)包被的12孔板(Iwaki)的各孔中。擴(kuò)展細(xì)胞，直到它們達(dá)到約80%匯合。去除擴(kuò)展培養(yǎng)基中的EGF和LIF能誘導(dǎo)神經(jīng)元分化。在沒有EGF和LIF的情況下處理7天后，將培養(yǎng)基交換為以1:1的比率混有神經(jīng)基本培養(yǎng)基(Gibco)的NS-A，其中補(bǔ)充有0.5XN2、B27、FGF2(5ng/ml)和BDNF(10ng/ml)。在這些條件下再過7天后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為補(bǔ)充有B27和BDNF(10ng/ml)但不含N2或FGF-2的神經(jīng)基本培養(yǎng)基。在整個(gè)此方法中，就小鼠NS細(xì)胞而言，每2或3天更換一半培養(yǎng)基。再過10天后，具有與TuJl和MAP2的免疫反應(yīng)性的神經(jīng)元形態(tài)細(xì)胞多達(dá)總細(xì)胞數(shù)的40%。與用于測定祌經(jīng)元分化的小鼠NS細(xì)胞方案(其中出現(xiàn)的GFAP陽性細(xì)胞很少)相比，也產(chǎn)生了大量星形細(xì)胞。因此，'本發(fā)明提供了獲得和維持對(duì)稱分裂、不分化狀態(tài)的許多物種神經(jīng)干細(xì)胞的方法和培養(yǎng)基。用獲自或提取自ES細(xì)胞、胎兒和成年動(dòng)物來源的細(xì)胞實(shí)施本發(fā)明。在所有情況下，通過本文所述方法得到的細(xì)胞的外觀和行為基本相同；它們都可以高純度培養(yǎng)物維持，大量(如幾百次)倍增后，仍有高比例的細(xì)胞保持形成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的能力。特別地，NS細(xì)胞成功地獲自人(ES，胎兒CNS)，小鼠(ES，胎兒CNS，成年動(dòng)物CNS)和大鼠(胎兒CNS)。在純?nèi)后w的培養(yǎng)物中培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞，移植后能在體內(nèi)生長并分化，但不形成腫瘤。參考文獻(xiàn)1.Reynolds,B.A.和Weiss,S.由成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分離細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元禾口星形細(xì)胞(Generationofneuronsandastrocytesfromisolatedcellsoftheadultmammaliancentralnervoussystem).Sc/e"ce255，1707-10(1992)。2.Garcion,E.、Halilagic,A.、Faissner,A.禾卩ffrench-Constant,C.通過胞夕卜基質(zhì)分子生腱蛋白C產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育的小生境(GenerationofanenvironmentalnicheforneuralstemcelldevelopmentbytheextracellularmatrixmoleculetenascinC)。Deve/opmeW131，3423-32(2004)。3.Morshead,C.M.、Benveniste,P.、Iscove,N.N.和vanderKooy,D.造血能力是可依賴遺傳和外遺改變的神經(jīng)干細(xì)胞的罕見特性(Hernatopoieticcompetenceisararepropertyofneuralstemcellsthatmaydependongeneticandepigeneticalterations)./VaZMed8，268-73(2002)。4.Suslov，O.N.、Kukekov,V.G.、Ignatova,T.N.和Steindler,D.A.克隆神經(jīng)球的分子表型分析證明神經(jīng)干細(xì)胞不均一'性(Neuralstemcellheterogeneitydemonstratedbymolecularphenotypingofclonalneurospheres).iVaWJcadSc/99，14506-11(2002)。5.Malatesta,P.等.神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞后代放射狀膠質(zhì)命運(yùn)的區(qū)域差異(Neuronalorglialprogeny:regionaldifferencesinradialgliafate).A^ewraw37，751-64(2003)。6.Anthony,T.E.、Klein,C.、Fishell,G.和Heintz,N.在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的所有區(qū)域中方文射狀膠質(zhì)用作神經(jīng)元祖細(xì)胞(Radialgliaserveasneuronalprogenitorsinallregionsofthecentralnervoussystem).jVewraw41,881-90(2004)。7.Ying,Q,L.、Stavridis,M.、Griffiths,D.、Li,M.和Smith,A.在貼壁單層培養(yǎng)中胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīn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得和維持對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染群體的方法，其包括(a)用編碼可選擇標(biāo)記A的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，其中所述可選擇標(biāo)記A可在神經(jīng)前體細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)；(b)促進(jìn)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞；(c)選擇表達(dá)可選擇標(biāo)記A的神經(jīng)干細(xì)胞；和(d)按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述方法培養(yǎng)選擇的細(xì)胞。46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述可選擇標(biāo)記A編碼抗生素抗性或細(xì)胞表面標(biāo)記物。47.如權(quán)利要求45或46所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)前體細(xì)胞特異性啟動(dòng)子選自Sox-l、Sox-2、Sox-3和BLBP。48.如權(quán)利要求45-47中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法的步驟以(a)、(b)、(c)、(d)的順序進(jìn)行。49.一種促進(jìn)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，其包括通過(1)單層培養(yǎng)或(2)胚胎樣小體分化，使ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)祖細(xì)胞，和用NSA培養(yǎng)基培養(yǎng)所述神經(jīng)祖細(xì)胞。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述NSA培養(yǎng)基包含葡萄糖和HEPES。51.—種制備和維持對(duì)稱分裂的神經(jīng)干細(xì)胞群體的方法，其包括按照權(quán)利要求49或50所述方法獲得神經(jīng)前體細(xì)胞群體；和按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法培養(yǎng)所述群體。52.—種測定某因子對(duì)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的作用的體外方法，其包括按照權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)所述的方法在所述因子的存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞。53.—種測定某因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用的體外方法，其包括使權(quán)利要求6-13所述組合物、權(quán)利要求14-20所述群體、權(quán)利要求31-42所述細(xì)胞系或權(quán)利要求22-27所述單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞中存在的神經(jīng)干細(xì)胞與所述因子接觸。54.如權(quán)利要求52或53所述的體外方法，其特征在于，所述因子可以是誘導(dǎo)性因子或阻斷性因子。55.—種權(quán)利要求6-13所述組合物、權(quán)利要求14-20所述群體、權(quán)利要求31-42所述細(xì)胞系或權(quán)利要求22-27所述單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞中存在的神經(jīng)干細(xì)胞在生產(chǎn)治療神經(jīng)變性疾病和腦損傷的制劑中的應(yīng)用。56.—種治療神經(jīng)變性疾病和腦損傷的方法，其包括將權(quán)利要求6-13所述組合物、權(quán)利要求14-20所述群體、權(quán)利要求31-42所述細(xì)胞系或權(quán)利要求22-27所述單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞中存在的神經(jīng)干細(xì)胞植入患者。57.—種轉(zhuǎn)染權(quán)利要求6-13所述組合物、權(quán)利要求14-20所述群體、權(quán)利要求31-42所述細(xì)胞系或權(quán)利要求22-27所述單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞中存在的神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包括(a)用編碼可選擇標(biāo)記B的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，其中可在組織特異性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)所述可選擇標(biāo)記B;和(b)選擇表達(dá)可選擇標(biāo)記B的神經(jīng)干細(xì)胞。58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述可選擇標(biāo)記B編碼抗生素抗性或細(xì)胞表面標(biāo)記物。59.—種權(quán)利要求6-13所述組合物、權(quán)利要求14-20所述群體、權(quán)利要求31-42所述細(xì)胞系或權(quán)利要求22-27所述單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞中存在的神經(jīng)干細(xì)胞，還包含可選擇標(biāo)記B。60.—種包含神經(jīng)干細(xì)胞的組合物，其特征在于，所述神經(jīng)干細(xì)胞是貼壁培養(yǎng)物，組合物中至少80%的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。61.如權(quán)利要求60所述的組合物，其特征在于，所述組合物中至少90%細(xì)胞是祌經(jīng)干細(xì)胞。62.如權(quán)利要求60或61所述的組合物，其特征在于，所述神經(jīng)干細(xì)胞已傳代至少30次。63.如權(quán)利要求62所述的組合物，其特征在于，所述神經(jīng)干細(xì)胞已傳代至少60次。64.—種獲得神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包括(n芬潛能^4H^先袖經(jīng)干細(xì)朐的多能成仝能干細(xì)朐.(ii)用全能干細(xì)胞非允許的培養(yǎng)基以及在(a)EGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動(dòng)劑和(b)FGF家族受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動(dòng)劑存在下培養(yǎng)(i)的細(xì)胞。65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞是全能干細(xì)胞。66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述全能干細(xì)胞是ES細(xì)胞或EG細(xì)胞。67.如權(quán)利要求64-66中任一項(xiàng)所述的方法，其包括在EGF受體激動(dòng)劑和FGF受體激動(dòng)劑的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞。68.如權(quán)利要求64-67中任一項(xiàng)所述的方法，還由所述神經(jīng)干細(xì)胞獲得神經(jīng)元、星形細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞。69.—種核重編程的方法，其中供體核來自權(quán)利要求22-27、31-42、59和60-63中任一項(xiàng)所述的神經(jīng)干細(xì)胞或按照權(quán)利要求1-5、21、28-30、45-51和64-68中任一項(xiàng)所述方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。70.—種核重編程的方法，其包括-獲得供體細(xì)胞；-獲得受體細(xì)胞；-將供體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，其中供體細(xì)胞是(i)權(quán)利要求22-27、31-42、59和60-63中任一項(xiàng)所述的神經(jīng)干細(xì)胞，或(ii)按照權(quán)利要求1-5、21、28-30、45-51和64-68中任一項(xiàng)所述方法獲得的細(xì)胞；和-培養(yǎng)所述細(xì)胞，以重編程所述供體細(xì)胞核，從而獲得重編程的細(xì)胞。71.如權(quán)利要求70所述的方法，包括任選在轉(zhuǎn)移供體細(xì)胞核之前和任選在轉(zhuǎn)移供體細(xì)胞核之后去除受體細(xì)胞核。72.如權(quán)利要求70或71所述的方法，包括遺傳操作供體細(xì)胞核。73.如權(quán)利要求72所述的方法，包括將引起疾病的遺傳序列或推定的引起疾病的遺傳序列引入供體細(xì)胞核。74.如權(quán)利要求73所述的方法，其包括-培養(yǎng)所述重編程的細(xì)胞，以獲得衍生自重編程細(xì)胞的許多細(xì)胞；和-將所述多個(gè)細(xì)胞用于試驗(yàn)。75.如權(quán)利要求70-74中任一項(xiàng)所述的方法，其包括-獲得包含衍生自重編程細(xì)胞的組織的動(dòng)物；和-用所述組織進(jìn)行試驗(yàn)。76.如權(quán)利要求70-75中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述受體細(xì)胞是卵母細(xì)胞。77.—種重編程細(xì)胞的方法，其包括-提供混合的細(xì)胞群體；-分離混合群體中如權(quán)利要求22-27、31-42、59和60-63中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞；和-將分離的細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。78.如權(quán)利要求77所述的方法，其包括在將分離的細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中之前遺傳操作所述分離的細(xì)胞。79.如權(quán)利要求77或78所述的方法，其包括-培養(yǎng)所述分離的細(xì)胞，以獲得克隆的細(xì)胞群體；和-將所述群體中一個(gè)細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。80.—種克隆非人動(dòng)物的方法，其包括(i)獲得非人動(dòng)物的神經(jīng)干細(xì)胞；(ii)獲得與所述非人動(dòng)物同種的動(dòng)物的卵母細(xì)胞；(iii)將所述祌經(jīng)干細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移到所述卵母細(xì)胞中；(iv)將(iii)中獲得的細(xì)胞植入所述同種的雌性動(dòng)物體內(nèi)。81.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)干細(xì)胞是(i)按照權(quán)利要求22-27、31-42、59和60-63中任一項(xiàng)所述的神經(jīng)干細(xì)胞，或(ii)按照權(quán)利要求1-5、21、28-30、45-51和64-68中任一項(xiàng)所述的方法獲得的細(xì)胞。82.—種參照任一實(shí)施例基本如以上所述的促進(jìn)神經(jīng)干(NS)細(xì)胞對(duì)稱分裂的方法。83.—種參照任一實(shí)施例基本如以上所述的細(xì)胞系。84.—種獲得神經(jīng)元的方法，其包括(a)在存在FGF受體激動(dòng)劑和不存在EGF受體激動(dòng)劑的情況下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞；和(b)然后，在沒有FGF受體激動(dòng)劑、也沒有EGF受體激動(dòng)劑的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞。85.如權(quán)利要求84所述的方法，其包括將細(xì)胞接種于單層培養(yǎng)物。86.如權(quán)利要求84或85所述的方法，其包括將NS細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含EGF但含有FGF-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少2天，然后去除培養(yǎng)基中的FGF-2。87.如權(quán)利要求84-86中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，按照權(quán)利要求l-5、21、28-30、45-51和64-68中任一項(xiàng)所述的方法獲得神經(jīng)干細(xì)胞。全文摘要利用EGF受體家族的受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物，任選與FGF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活物聯(lián)用，由ES細(xì)胞或者胎兒或成年動(dòng)物腦分離物獲得貼壁神經(jīng)干細(xì)胞的均一、對(duì)稱的分裂群體。神經(jīng)干細(xì)胞群體非常純，并在超過100次傳代后仍保持分化為神經(jīng)元的能力。文檔編號(hào)C12N5/06GK101124319SQ200580025096公開日2008年2月13日申請(qǐng)日期2005年6月9日優(yōu)先權(quán)日2004年6月9日發(fā)明者A·G·史密斯,L·孔蒂,S·M·波拉德申請(qǐng)人:愛丁堡大學(xué)管理處