專利名稱：用于產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、藥劑學(xué)、農(nóng)業(yè)-林業(yè)-漁業(yè)和食物科學(xué)領(lǐng)域中用于向用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體、用于產(chǎn)生所述載體的細(xì)胞，和使用所述載體向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的方法。
背景技術(shù)：
用于將基因轉(zhuǎn)移到真核生物中的已知方法包括使用病毒載體的方法、通過內(nèi)吞作用、電穿孔或者基因槍轉(zhuǎn)移裸DNA的技術(shù)等等。病毒載體用于基因治療領(lǐng)域中以用于廣泛的應(yīng)用，包括基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用。例如，腺病毒載體適于在靶細(xì)胞中大量瞬時表達(dá)目的基因。反轉(zhuǎn)錄病毒載體由于穩(wěn)定整合到宿主染色體中的功能而用于長期穩(wěn)定表達(dá)。預(yù)期該載體可以用于遺傳疾病的基因治療領(lǐng)域，或者轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)領(lǐng)域中。然而，因為反轉(zhuǎn)錄病毒載體通過病毒感染導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)移，所以病毒的向性引起了問題。如果細(xì)胞不在細(xì)胞表面表達(dá)受體，那么就不發(fā)生基因轉(zhuǎn)移。為了克服該問題，已經(jīng)試圖通過經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄病毒載體包膜的修飾進(jìn)行的假型化(pseudotyping)改變宿主范圍，或者增加效價。主要通過將常規(guī)反轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如來自鼠白血病病毒的載體)中的包膜蛋白用來自另一病毒物種的包膜蛋白替代來實現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體的假型化。例如，已經(jīng)開發(fā)了其中用水泡性口膜炎病毒包膜糖蛋白VSV-G感染寬范圍宿主的反轉(zhuǎn)錄病毒載體(專利文件1，非專利文件1)，和其中用長臂猿白血病病毒(GaLV)包膜增加轉(zhuǎn)移到人造血干細(xì)胞中的效率的載體(專利文件2，非專利文件2)。
已經(jīng)檢查了一種針對僅改變包膜(一種糖蛋白)的糖鏈修飾而不改變包膜蛋白的氨基酸序列的技術(shù)，在該技術(shù)中，減少反轉(zhuǎn)錄病毒表面上的α(1，3)半乳糖基表位以防止體液組分對反轉(zhuǎn)錄病毒載體的滅活(專利文件3)。其中提供了破壞反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞中的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因、利用糖鏈合成抑制劑、利用糖鏈降解酶等等。然而，基因破壞需要復(fù)雜的程序，并且必須確定使用糖鏈合成抑制劑或者糖鏈降解酶的合適條件。
N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(GnT-III)是將等分的(bisecting)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)殘基轉(zhuǎn)移到糖蛋白上的N-連接的糖鏈的酶。已經(jīng)從大鼠和人克隆了編碼GnT-III的基因(非專利文件3，非專利文件4)。
已經(jīng)報導(dǎo)當(dāng)將GnT-III基因轉(zhuǎn)移到受乙型肝炎病毒感染的細(xì)胞中時，因為病毒基因表達(dá)的抑制而導(dǎo)致病毒的產(chǎn)生受到抑制(非專利文件5)。關(guān)于反轉(zhuǎn)錄病毒，GnT-III對病毒產(chǎn)生或者所產(chǎn)生的病毒的感染效率的影響還未知。
專利文件1WO 94/29440專利文件2WO 94/23048專利文件3WO 96/03520非專利文件1J.C.Burns等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908033-8037(1993)非專利文件2A.D.Miller等人，J.Virol.652220-2224(1991)非專利文件3A.Nishikawa等人，J.Biol.Chem.，26718199-18204(1992)非專利文件4Y.Ihara等人，J.Biochem.，113692-698(1993)非專利文件5E.Miyoshi等人，J.Biol.Chem.，27028311-28315(1995)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的問題預(yù)期通過修飾反轉(zhuǎn)錄病毒的包膜進(jìn)行的假型化在改變宿主范圍、提高感染效率或者提高病毒顆粒的穩(wěn)定性中是有效的。然而，不能容易地得到增加感染效率的包膜。那么，本發(fā)明人不修飾反轉(zhuǎn)錄病毒的包膜，而是修飾生產(chǎn)細(xì)胞的細(xì)胞膜上的糖鏈的結(jié)構(gòu)，旨在提高病毒的感染效率。
解決問題的手段作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明已經(jīng)有了下面的發(fā)現(xiàn)。如果使用一種細(xì)胞制備反轉(zhuǎn)錄病毒載體，那么在具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)(例如，纖連蛋白片段)的存在下，基因轉(zhuǎn)移的效率顯著提高，在所述細(xì)胞中，N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性增強并且從該細(xì)胞產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒用于基因轉(zhuǎn)移。從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的第一方面涉及具有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因的細(xì)胞，其中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性被增強。
第一方面的細(xì)胞為例如其中來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因被整合到染色體中的細(xì)胞，或者用含有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
根據(jù)第一方面，可以將N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III基因人工轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。例如，可以使用其中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III基因整合到染色體中的細(xì)胞，或者用含有所述基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III基因可以置于異源啟動子控制下。
例如，第一方面的細(xì)胞可以來自選自293細(xì)胞和293T細(xì)胞的細(xì)胞。
本發(fā)明的第二方面涉及反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞，其通過用重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)化第一方面的細(xì)胞得到。
本發(fā)明的第三方面涉及產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，其包括培養(yǎng)第二方面的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞；和收集培養(yǎng)物上清液。
本發(fā)明的第四方面涉及反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其根據(jù)第三方面的用于產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法產(chǎn)生。
本發(fā)明的第五方面涉及將基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中的方法，其包括在具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)存在下，用第四方面的反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染靶細(xì)胞。
根據(jù)第五方面，具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)的例子是纖連蛋白或其片段。
發(fā)明效果本發(fā)明提供了重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其在具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)存在下，導(dǎo)致高基因轉(zhuǎn)移效率。通過使用該載體，目的基因可以高效率地穩(wěn)定轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。因為反轉(zhuǎn)錄病毒不僅可以用于治療遺傳疾病，還可以用于治療其他各種疾病，所以本發(fā)明可廣泛用于醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域中。
附圖簡述

圖1代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖2代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖3代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖4代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖5代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖6代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖7代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖8代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖9代表用來自各種克隆的病毒觀察到的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖10代表根據(jù)各種感染方法使用來自293T或者細(xì)胞系293T/hG3-1的雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖11代表根據(jù)各種感染方法使用來自293T或者細(xì)胞系293T/hG3-1的雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖12代表根據(jù)各種感染方法使用來自293T或者細(xì)胞系293T/hG3-1的雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖13代表根據(jù)各種感染方法使用來自293T或者細(xì)胞系293T/hG3-1的親嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖14代表根據(jù)各種感染方法使用來自293T或者細(xì)胞系293T/hG3-1的親嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移效率。
本發(fā)明的最佳實施方式通常根據(jù)本發(fā)明使用重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體。具體地，優(yōu)選復(fù)制缺陷型重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體。消除這種載體的可復(fù)制性從而使得它不能在受感染的細(xì)胞中自主復(fù)制，并且因此該載體是不致病的。載體可以侵入宿主細(xì)胞如脊椎動物細(xì)胞(尤其哺乳動物細(xì)胞)并且將插入載體的外源基因穩(wěn)定整合到染色體DNA中。
對于外源基因沒有具體限制?？梢圆迦胂Ｍ谀康募?xì)胞中表達(dá)的任何基因。其實例包括編碼多肽(酶、生長因子、細(xì)胞因子、受體、結(jié)構(gòu)蛋白等等)、反義RNA、核酶、誘餌(decoy)和導(dǎo)致RNA干擾的RNA的基因。根據(jù)本發(fā)明，可能使用插入重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體中的外源基因，從而使得其表達(dá)處于合適的啟動子(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體中的LTR啟動子或者外源啟動子)的控制下。在載體中可以存在與啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點協(xié)作的另一種調(diào)節(jié)元件(例如，增強子序列)以便完成外源基因的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，所轉(zhuǎn)移的基因可以含有置于下游的終止子序列。此外，可以包括合適的標(biāo)記基因，其使得能夠選擇具有所轉(zhuǎn)移的基因的細(xì)胞(例如，藥物抗性基因、編碼熒光蛋白的基因、編碼起報道分子功能的酶(如β-半乳糖苷酶或者螢光素酶)的基因)。
對于根據(jù)本發(fā)明使用的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體(此處也稱作重組反轉(zhuǎn)錄病毒)也沒有具體限制?？梢允褂靡阎姆崔D(zhuǎn)錄病毒載體，如反轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如，MFG載體、α-SGC載體(WO 92/07943)、pBabe(Nucleic Acids Research，183587-3596(1990))、pLXIN(Clontech)或pDON-AI(Takara Bio))、慢病毒載體(人免疫缺陷病毒(HIV)-衍生的載體、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)-衍生的載體等等)或者其修飾形式。
本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體是通過N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(下文中稱作GnT-III)的作用進(jìn)行糖鏈修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的表面上糖鏈的修飾在反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞中發(fā)生。用反轉(zhuǎn)錄病毒載體或者對應(yīng)于該載體的反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞，所述細(xì)胞具有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因并且其中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III基因活性被增強。
用于產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的一般方法包括通過將攜帶外源基因并且具有包裝信號的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞中的生產(chǎn)方法，所述反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞中已經(jīng)轉(zhuǎn)移了編碼反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)蛋白的gag-pol基因和env基因；和用gag-pol基因和env基因的表達(dá)載體質(zhì)粒和攜帶外源基因并且具有包裝信號的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染入沒有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)蛋白的正常細(xì)胞中的生產(chǎn)方法。兩種方法都可以用于本發(fā)明。
根據(jù)前一種方法，如果選擇有效方法轉(zhuǎn)染重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒，那么可以瞬時產(chǎn)生病毒載體，或者可能確立長期穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞系以獲得反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系。已知的包裝細(xì)胞系如PG13(ATCCCRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86或GP+envAM-12(US 5,278,056)或Psi-Crip(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，856460-6464(1988))可以用于該方法。
關(guān)于后一種方法，在大多數(shù)情況中預(yù)期瞬時病毒產(chǎn)生，并且得到高效價病毒需要更高的轉(zhuǎn)染效率。例如，在多數(shù)情況中將轉(zhuǎn)染效率高的293細(xì)胞或者293T細(xì)胞用作宿主。
為了防止出現(xiàn)復(fù)制型反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，優(yōu)選在根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞中，gag-pol基因和env基因的位置不接近。例如，本發(fā)明優(yōu)選使用gag-pol基因和env基因整合在染色體上的不同位置的細(xì)胞，或者其中轉(zhuǎn)移了含有g(shù)ag-pol基因的質(zhì)粒和含有env基因的另一質(zhì)粒的細(xì)胞。
env基因不局限于編碼來自與將產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒載體相同的病毒的包膜蛋白的基因。本發(fā)明還包括假型包裝細(xì)胞，其具有來自異種病毒的env基因。例如，來自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)或者貓內(nèi)源性病毒的env基因或者編碼可以作為env發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)的基因都可以用作env基因。
本發(fā)明不限于反轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞包括不含具有包裝信號的DNA的細(xì)胞，所述DNA是重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體(轉(zhuǎn)移載體)的基因組，前提是它可以通過轉(zhuǎn)移這種DNA而產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
通過增強反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞的GnT-III活性，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中病毒表面蛋白上的糖鏈被修飾。
本文使用的GnT-III活性的增強指與正常水平相比，細(xì)胞中GnT-III酶促活性增加。盡管不預(yù)期限制本發(fā)明，但是用作根據(jù)本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞的細(xì)胞中的GnT-III活性為該細(xì)胞的固有GnT-III活性的5倍或者更高，優(yōu)選10倍或者更高。例如，通過測量GnT-III活性或者通過使用已知方法(例如，RT-PCR或者RNA印跡雜交)測量從編碼GnT-III的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量，可以證實GnT-III酶促活性的增加。
通過已知的方法可以完成GnT-III活性的增強，所述方法為諸如染色體上編碼GnT-III的基因的表達(dá)誘導(dǎo)、染色體上GnT-III基因的修飾(增加拷貝數(shù)、插入啟動子、增強子等等)、將GnT-III基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中或者通過細(xì)胞的誘變得到GnT-III基因高表達(dá)細(xì)胞系。
編碼人GnT-III的基因的結(jié)構(gòu)是已知的(J.Biochem.，113692-698(1993))。可能基于該信息修飾染色體上的GnT-III基因。例如，確定將用作反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞的細(xì)胞中編碼GnT-III的基因的位置；向該基因的上游區(qū)插入與天然位于該基因上游并且控制該基因的表達(dá)的啟動子不同的異源啟動子(例如，強啟動子或者誘導(dǎo)型啟動子)；并且然后可能增加該基因的表達(dá)水平?？赡艿玫竭@樣的細(xì)胞，其中根據(jù)如實施例中描述的用于將編碼GnT-III的基因人工轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法更容易地增強GnT-III活性。
通過將插入載體中的基因轉(zhuǎn)移到宿主中，可以將編碼GnT-III的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞。合適的載體可以選自已知的載體。例如，可以使用質(zhì)粒載體、病毒載體等等。如果將使用質(zhì)粒載體，那么例如使用常規(guī)轉(zhuǎn)染方法(磷酸鈣方法、陽離子脂質(zhì)體方法，等等)可以將它轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。此外，可以使用將轉(zhuǎn)移的編碼GnT-III的基因整合到細(xì)胞中的染色體DNA中的方法。根據(jù)本發(fā)明，反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞中GnT-III的表達(dá)可以是瞬時表達(dá)或者穩(wěn)定表達(dá)。
膜定位信號存在于反轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的N末端。如下進(jìn)行考慮將糖鏈附著到細(xì)胞中的包膜蛋白；通過蛋白水解酶將蛋白質(zhì)切割成TM蛋白質(zhì)和SU蛋白質(zhì)；形成多聚體并在細(xì)胞膜表面上表達(dá)所述多聚體。gag-pol融合蛋白和gag蛋白形成剛好位于細(xì)胞膜下的殼體，并且將基因組RNA整合入以完成裝配，從而導(dǎo)致從細(xì)胞出芽。反轉(zhuǎn)錄病毒芽被宿主細(xì)胞的脂雙層包裝。預(yù)期從高表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒的病毒顆粒的表面蛋白進(jìn)行糖鏈修飾。從而，盡管不希望限制本發(fā)明，但是如下進(jìn)行考慮。如果在病毒生產(chǎn)細(xì)胞中GnT-III活性增強，那么將具有如下化學(xué)式1的等分GlcNAc結(jié)構(gòu)的糖鏈附著到來自細(xì)胞的膜蛋白或者病毒包膜蛋白。通過GnT-III的作用產(chǎn)生糖鏈。備選地，可以增加寡甘露糖(oligomannose)型或者雜合型糖鏈修飾的比率。
例如，可以從穩(wěn)定表達(dá)GnT-III的細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清液得到具有用GnT-III修飾的糖鏈的反轉(zhuǎn)錄病毒，通過將GnT-III表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞中得到所述細(xì)胞系。還可能如下所述得到GnT-III修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒將GnT-III表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到293細(xì)胞、293T細(xì)胞等等以得到穩(wěn)定表達(dá)GnT-III的細(xì)胞系；并用gag-pol和env基因的表達(dá)載體質(zhì)粒和攜帶外源基因并且具有包裝信號的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染具有轉(zhuǎn)移的GnT-III的293細(xì)胞、293T細(xì)胞等等。備選地，可能用GnT-III表達(dá)載體質(zhì)粒和gag-pol和env基因的表達(dá)載體質(zhì)粒和攜帶外源基因并且具有包裝信號的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染293細(xì)胞、293T細(xì)胞等等得到GnT-III修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒。所得到的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以通過0.45-μm過濾器過濾并保存在低溫冰箱中待用。
從其中根據(jù)本發(fā)明的方法增強了GnT-III活性的細(xì)胞制備的重組反轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)致卓越的感染效率，尤其在具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)存在下，在基因轉(zhuǎn)移中的優(yōu)良的感染效率。
在例如WO 95/26200、WO 97/18318或者Nature Medicine，2876-882(1996)中描述了基因轉(zhuǎn)移方法，其中使用具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)。此類方法包括其中使用在相同分子中具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合位點和靶細(xì)胞結(jié)合位點兩者的功能物質(zhì)的方法，和其中使用具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合位點的功能物質(zhì)和具有靶細(xì)胞結(jié)合位點的功能物質(zhì)的混合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的反轉(zhuǎn)錄病毒可以用于這兩種方法。
對功能物質(zhì)沒有具體的限制，只要它具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性和/或靶細(xì)胞結(jié)合活性。具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)的實例包括來自纖連蛋白的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(肝素-II結(jié)構(gòu)域)、成纖維細(xì)胞生長因子、V型膠原片段、上述多肽的衍生物和變體、聚賴氨酸和DEAE-葡聚糖。能夠結(jié)合目的靶細(xì)胞的任何物質(zhì)都可以用作具有靶細(xì)胞結(jié)合活性的功能物質(zhì)。盡管不希望限制本發(fā)明，但具有靶細(xì)胞結(jié)合活性的功能物質(zhì)的實例包括具有細(xì)胞結(jié)合活性的多肽(細(xì)胞骨架蛋白，等等)、識別細(xì)胞或者細(xì)胞表面上的生物分子的抗體、生長因子、細(xì)胞因子和糖鏈。
在根據(jù)本發(fā)明的用于將基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的方法的一個實施方案中，在含有來自纖連蛋白的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能物質(zhì)存在下，用從GnT-III活性增強的細(xì)胞制備的重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細(xì)胞。優(yōu)選的示例性功能物質(zhì)是具有細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)域和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域兩者的纖連蛋白片段。結(jié)合VLA-5和/或VLA-4的細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)域作為細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)域尤其優(yōu)選。使用諸如用蛋白酶消化的方法，可以從自活體純化的纖連蛋白制備這種纖連蛋白片段，或者它可以用重組DNA技術(shù)制備。例如，Takara Bio以RetroNectin名稱銷售的重組纖連蛋白片段優(yōu)選用于本發(fā)明，所述片段具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、VLA-5-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和VLA-4-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
實施例下面的實施例更詳細(xì)地闡明本發(fā)明，但是不應(yīng)理解為限制其范圍。
實施例1用于表達(dá)人GnT-III的質(zhì)粒載體的構(gòu)建制備含有編碼人GnT-III的DNA的DNA片段(GenBank E13194，SEQ ID NO1)并將其插入用于基因表達(dá)的質(zhì)粒載體pTriEx-3 Hygro(Novagen)中的NcoI和Sse8387I位點中以構(gòu)建重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒稱作phG3-Hygro。
將該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)JM109，并且將一個轉(zhuǎn)化體菌落在5ml LB培養(yǎng)基中于37℃搖動下培養(yǎng)8小時。然后，將其在80ml LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴大培養(yǎng)，并用QIA filter Plasmid MaxiKit(Qiagen)純化質(zhì)粒DNA。
實施例21.分離293T細(xì)胞轉(zhuǎn)移克隆使用含有10％胎牛血清(JRH)的Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)作為生長培養(yǎng)基在37℃、5％CO2下培養(yǎng)人293T細(xì)胞(Mol.Cell Biol.，7379-387(1987))。將3×106個人293T細(xì)胞接種到每個6cm組織培養(yǎng)板(Iwaki Glass)中并過夜培養(yǎng)。第二天，證實人293T細(xì)胞達(dá)到半?yún)R合，通過抽吸取出培養(yǎng)基，并向每板加入3ml新鮮生長培養(yǎng)基。
將10μg phG3-Hygro和62μl 2M CaCl2與最多500μl無菌蒸餾水在聚苯乙烯圓底管(Falcon)中混合。緊在加入500μl轉(zhuǎn)染緩沖液(50mM HEPES、10mM KCl、12mM D-葡萄糖、280mM NaCl、1.5mMNa2HPO4(pH7.10))后，利用從電移液器排出將混合物起泡20秒。將制備的溶液均勻地逐滴加入到含有293T細(xì)胞的上述平板中。制備具有以相似的方式轉(zhuǎn)移的pTriEx-3Hygro(模擬試驗)的293T細(xì)胞作為對照。將這些細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)9小時。然后，通過抽吸取出培養(yǎng)物上清液，向每板加入4ml新鮮生長培養(yǎng)基，并在37℃、5％CO2下培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后2天通過用胰蛋白酶(Gibco)處理使每個人293T細(xì)胞從平板脫附，并懸浮在10ml生長培養(yǎng)基中。計數(shù)細(xì)胞數(shù)目，并將細(xì)胞以6×106、4×106或2×106個細(xì)胞/板的密度接種到每個10cm組織培養(yǎng)板(Iwaki Glass)中，并在37℃、5％CO2下培養(yǎng)。將含有濃度為0.3mg/ml的潮霉素(Invitrogen)的生長培養(yǎng)基用于從第二天培養(yǎng)。
用潮霉素選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)16天(同時每3或4天一次更換培養(yǎng)基)后，用克隆環(huán)(Iwaki Glass)克隆出現(xiàn)的潮霉素抗性菌落，并將其接種到48孔組織培養(yǎng)板(Iwaki Glass)的孔中。培養(yǎng)各自克隆的人293T細(xì)胞，同時根據(jù)生長速率使用24孔組織培養(yǎng)板(Iwaki Glass)、6-cm板和10-cm板傳代。最后，得到如下10個模擬轉(zhuǎn)移的人293T細(xì)胞克隆，其中轉(zhuǎn)移了pTriEx-3Hygro作為對照(293T/M)；和20個人293T細(xì)胞克隆，其中轉(zhuǎn)移了phG3-Hygro(293T/hG3)。
2.表達(dá)的證實使用TRIzol(Invitrogen)從上面“1”得到的每個293T/hG3克隆的1×107個細(xì)胞提取總RNA。如下用總RNA作為模板合成cDNA。通過混合1μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)XL(5U/μl，Life Sciences)、2μl 10×RNA PCR緩沖液(Takara Bio)、0.5μlRNA酶抑制劑(40U/μl)、1μl隨機9聚體(Random 9mers)(50pmol/μl)、2μl dNTP混合物(每種10mM)、4μl 25mM MgCl2、1μl模板(對應(yīng)于1μg)和無RNA酶的蒸餾水到20μl總體積來制備反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物如下進(jìn)行反應(yīng)30℃10分鐘；42℃30分鐘；99℃5分鐘；和4℃5分鐘。反應(yīng)后，使用1μl反應(yīng)混合物作為模板和一對人GnT-III-特異引物(hG3-F1(SEQ ID NO2)和hG3-R4(SEQ ID NO3))通過PCR反應(yīng)進(jìn)行人GnT-III基因的檢測。如下進(jìn)行反應(yīng)94℃5分鐘；30個循環(huán)的94℃30秒，56℃30秒和72℃30秒；最后72℃7分鐘。將phG3-Hygro用作陽性對照，并將以相似的方式從293T/M克隆制備的1μl RT-PCR產(chǎn)物用作陰性對照。PCR反應(yīng)后，將8μl每種反應(yīng)混合物在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以觀察擴增的片段。結(jié)果，盡管甚至對陰性對照也觀察到人GnT-III基因片段的擴增，但是與陰性對照相比，使用從293T/hG3克隆制備的模板得到的擴增產(chǎn)物的量更大。從而，表明在上面“1”中分離的293T/hG3克隆中表達(dá)了來自phG3-Hygro的人GnT-III。
3.GnT-III酶促活性的定量收集上面“1”中得到的兩種293T/hG3克隆(細(xì)胞系293T/hG3-1和293T/hG3-67)和兩種293T/M克隆(細(xì)胞系293T/M2和293T/M3)以及293T細(xì)胞的每一種的106到107個細(xì)胞，并用PBS洗滌。向通過離心得到的沉淀中加入100μl CelLyticTMM細(xì)胞裂解試劑(Cell LysisReagent)(Sigma)，并在室溫混合15分鐘。以20400×g離心15分鐘后，收集上清液作為GnT-III粗酶溶液并進(jìn)行活性測量。用BCA ProteinAssay Reagent試劑盒(Pierce)對部分粗酶溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。
將3μl GnT-III粗酶溶液、5μl 2×緩沖液(250mM MES-NaOH(pH6.25)、200mM MnCl2、400mM N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、1.0％Triton X-100)、1μl 0.2M UDP-GlcNAc和1μl Gn，Gn-bi-PA(385pmol/μl，Takara Bio，PA-糖鏈(Sugar Chain)O12，結(jié)構(gòu)在下面的化學(xué)式2中顯示)的混合物在37℃反應(yīng)2小時。反應(yīng)后，向其中加入10μl反應(yīng)終止溶液(2％四硼酸鈉、250mM EDTA)，通過在98℃加熱5分鐘滅活酶，并通過以20400×g離心3分鐘得到上清液。用HPLC如下所述分析10μl上清液柱PALPAK Type R(CA80004.6mm×250mm，Takara Bio)；洗脫液含有0.5％1-丁醇的100mM乙酸三乙胺緩沖液(pH4.0)；柱溫度40℃；和流速1.0ml/分鐘。用熒光檢測器以320nm的激發(fā)波長和400nm的發(fā)射波長進(jìn)行檢測。在這些條件下，糖鏈Gn，Gn-bi-PA在9.6分鐘時洗脫，而糖鏈Gn(Gn)Gn-bi-PA在18.1分鐘時洗脫。將GnT-III活性鑒定為基于所產(chǎn)生的Gn(Gn)Gn-bi-PA(其結(jié)構(gòu)在下面的化學(xué)式3中顯示)的量和以前確定的粗酶溶液的蛋白質(zhì)量計算的GnT-III的比活性。結(jié)果，GnT-III活性如下定義293T細(xì)胞的活性為1.0細(xì)胞系293T/M22.4；細(xì)胞系293T/M31.0；細(xì)胞系293T/hG3-132.2；和細(xì)胞系293T/hG3-6759.3。根據(jù)上面的內(nèi)容，表明由于來自phG3-Hygro的人GnT-III基因，在293T/hG3克隆中GnT-III酶促活性被增強。
[化學(xué)式3]
實施例3從293T/hG3克隆制備病毒1.制備病毒上清液在上面實施例2中分離的293T/hG3克隆中，選擇證實了GnT-IU基因表達(dá)的7個克隆，并從它們制備雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒上清液。在對照實驗中，用293T細(xì)胞和兩個293T/M克隆進(jìn)行相同的程序。向6孔組織培養(yǎng)板(Iwaki Glass)的每孔中接種每個細(xì)胞克隆的1.5×106個細(xì)胞，并在含有10％胎牛血清的2ml DMEM中在37℃、5％CO2下過夜培養(yǎng)。第二天，證實每種細(xì)胞克隆達(dá)到半?yún)R合，通過抽吸從每孔取出培養(yǎng)基，并向每孔加入1.5ml含有10％胎牛血清的新鮮DMEM。向每孔還加入終濃度為25μM的氯喹(Wako Pure ChemicalIndustries)。在聚苯乙烯圓底管中組合下面的用于表達(dá)反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)蛋白gag-pol的27.5μg質(zhì)粒載體pGP(Takara Bio)；用于表達(dá)雙嗜性env的27.5μg質(zhì)粒載體pE-ampho(Takara Bio)；用于反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)的55μg質(zhì)粒載體，其中質(zhì)粒pQBI25(Quantum Biotechnologies)中的水母來源的紅移綠色熒光蛋白(rsGFP)的基因插入到反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pDON-AI(Takara Bio)中；341μl 2M CaCl2；和無菌蒸餾水至2750μl。將混合物分成兩個1300-μl部分。緊在向每管加入1300μl轉(zhuǎn)染緩沖液后，利用從電移液器排出將混合物起泡20秒。向每孔中逐滴均勻加入500μl混合物。將平板在37℃、5％CO2下溫育9小時。然后，取出1.5ml培養(yǎng)物上清液，向每孔加入2ml含有10％胎牛血清的新鮮DMEM，并繼續(xù)培養(yǎng)?；蜣D(zhuǎn)移后24小時，將每孔中的培養(yǎng)基用含有10％胎牛血清的2ml新鮮DMEM更換。再培養(yǎng)24小時后，收集培養(yǎng)物上清液，通過0.45-μm過濾器(Millipore)過濾，并作為病毒上清液原種在-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.病毒上清液效價的測量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(J.Virol.，621120-1124(1988))用NIH/3T3細(xì)胞(ATCC CRL-1658)測量病毒上清液的效價。具體地，向6孔組織培養(yǎng)板的每孔加入在含有10％牛血清(Gibco)的2ml DMEM中的5×104個NIH/3T3細(xì)胞，并在37℃、5％CO2下培養(yǎng)過夜。通過抽吸取出培養(yǎng)基，向孔中加入病毒上清液的1ml連續(xù)稀釋液，并向其中還加入終濃度為8μg/ml的海地美溴銨(溴化己二甲銨(polybrene)，Aldrich)。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)4到6小時。向其中還加入含有10％牛血清的1ml DMEM，并繼續(xù)培養(yǎng)72小時。用流式細(xì)胞儀FACSVantage(Becton-Dickinson)分析從板收集的細(xì)胞，并確定表達(dá)rsGFP的NIH/3T3細(xì)胞的比率。根據(jù)將每孔輸入細(xì)胞數(shù)乘以rsGFP表達(dá)性細(xì)胞的比率所得的值和病毒上清液的稀釋率來計算1ml上清液中感染性顆粒數(shù)目(I.V.P./ml)來確定病毒效價。幾次制備病毒以用來測量病毒效價。來自293T/hG3克隆的病毒上清液的效價為1.9×105I.V.P./ml到2.8×106I.V.P./ml。來自用于對照實驗中的293T細(xì)胞的病毒上清液的效價為9.4×105I.V.P./ml到1.6×106I.V.P./ml，且來自用于對照實驗中的293T/M克隆的病毒上清液的效價為1.8×106I.V.P./ml到2.6×106I.V.P./ml。
實施例41.制備CH-296包被的平板向24孔非組織培養(yǎng)物處理的平板(Falcon)的每孔加入濃度為32μg/ml的500μl纖連蛋白片段CH-296(RetroNectin，Takara Bio)。讓平板在4℃靜置過夜，在室溫下用2％BSA/PBS封閉30分鐘，并用PBS洗滌。將該平板用作CH-296-包被的平板并且在必要時制備。
2.基因轉(zhuǎn)移到NIH/3T3細(xì)胞中在實施例3中制備的病毒上清液中，從細(xì)胞系293T/hG3-1和293T/hG3-67制備的作為人GnT-III修飾的病毒的病毒被選擇用于基因轉(zhuǎn)移到NIH/3T3細(xì)胞中。將從293T細(xì)胞制備的病毒用作對照，并將從細(xì)胞系293T/M2制備的病毒選擇用作模擬病毒。將這些病毒用于感染CH-296-包被的平板中的NIH/3T3細(xì)胞，并如下所述檢查從具有轉(zhuǎn)移的人GnT-III基因的細(xì)胞制備的反轉(zhuǎn)錄病毒的感染性的改變。
將在10cm平板中生長到半?yún)R合的NIH/3T3細(xì)胞通過用胰蛋白酶處理從平板脫附，懸浮在含有10％牛血清的10ml DMEM中，并通過以190×g離心3分鐘收集。計數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，并將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)為在含有10％牛血清的DMEM中為2×105個細(xì)胞/ml。將實施例3中所得各自病毒上清液通過用含有10％胎牛血清(JRH)的DMEM稀釋調(diào)節(jié)到2×104I.V.P./ml。向CH-296-包被的平板的每孔中加入100μlNIH/3T3細(xì)胞懸浮液、200μl稀釋的病毒上清液和200μl含有10％牛血清的DMEM。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)3天。3天后，用流式細(xì)胞儀FACS Vantage分析NIH/3T3細(xì)胞，并確定表達(dá)rsGFP的NIH/3T3細(xì)胞的比率為基因轉(zhuǎn)移效率。在使用CH-296-包被的平板的感染對照實驗中，向24孔組織培養(yǎng)板的每孔加入在含有10％牛血清的500μl DMEM中的2×104個NIH/3T3細(xì)胞。在37℃、5％CO2下培養(yǎng)過夜后，通過抽吸取出培養(yǎng)基，并向每孔加入如上述制備的2×104I.V.P./ml的200μl病毒上清液和含有10％牛血清的300μlDMEM。以8μg/ml的終濃度進(jìn)一步加入溴化己二甲銨。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)3天。3天后，用流式細(xì)胞儀FACS Vantage分析NIH/3T3細(xì)胞以確定表達(dá)rsGFP的NIH/3T3細(xì)胞的比率。
上述實驗的結(jié)果在圖1中顯示。在圖中，用以制備病毒上清液的細(xì)胞沿著橫軸示出。(Pb)代表溴化己二甲銨存在下的感染組，而(RN)代表使用CH-296-包被的平板的感染組?？v軸代表基因轉(zhuǎn)移效率(％)。
關(guān)于其中使用溴化己二甲銨進(jìn)行感染的對照實驗，各自病毒的表達(dá)rsGFP的NIH/3T3細(xì)胞的比率彼此幾乎相等。當(dāng)使用CH-296-包被的平板時，用人GnT-III修飾的病毒感染的NIH/3T3細(xì)胞的表達(dá)rsGFP的細(xì)胞的比率與用未修飾的病毒感染的NIH/3T3細(xì)胞的比率相比增加了1.7到2.2倍(圖1)。這表明當(dāng)使用CH-296包被的平板時，用人GnT-III修飾膜表面的反轉(zhuǎn)錄病毒的感染性增加了。
3.基因轉(zhuǎn)移到血細(xì)胞中用含有10％胎牛血清的RPMI-1640(Sigma)作為生長培養(yǎng)基在37℃、5％CO2下培養(yǎng)人K562細(xì)胞(ATCC CCL-243)。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640作為生長培養(yǎng)基在終濃度為2ng/ml的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，Schering-Plough)的存在下，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)人TF-1細(xì)胞(ATCC CRL-2003)。根據(jù)上面“2”中描述的方法用CH-296包被的平板以M.O.I.(感染復(fù)數(shù))＝0.2感染實施例3中制備的病毒上清液。將各自細(xì)胞的生長培養(yǎng)基用于制備細(xì)胞和稀釋病毒。感染后3天將細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀FACS Vantage分析以測定表達(dá)rsGFP的細(xì)胞的比率。結(jié)果在圖2和3中顯示。圖2顯示了K562細(xì)胞的結(jié)果，且圖3顯示了TF-1細(xì)胞的結(jié)果。在圖中，用以制備病毒上清液的克隆的名稱在橫軸上示出?？v軸代表基因轉(zhuǎn)移效率(％)。
用人GnT-III-修飾的病毒感染的K562和TF-1細(xì)胞的表達(dá)rsGFP的細(xì)胞的比率與用未修飾的病毒感染的K562和TF-1細(xì)胞的比率相比，增加了1.5到1.7倍。
4.基因轉(zhuǎn)移到各種細(xì)胞中在37℃、5％CO2下進(jìn)行培養(yǎng)，其中對于HT1080細(xì)胞(ATCCCCL-121)、293細(xì)胞(ATCC CRL-1573)、A375M細(xì)胞(Cancer Lett.，38137-147(1987))、KB細(xì)胞(ATCC CCL-17)和MDA-MB-435S細(xì)胞(ATCC HTB-129)，使用含有10％胎牛血清的DMEM作為生長培養(yǎng)基，或者對于MKN1細(xì)胞(BRC RCB1003)，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640作為生長培養(yǎng)基。在實施例3中制備的病毒上清液中，使用從293T/hG3-1制備的病毒作為人GnT-III-修飾的病毒，而使用從293T和293T/M2制備的病毒作為對照。如上面“2”中描述的在M.O.I.＝0.2的條件下，用溴化己二甲銨或者CH-296-包被的平板進(jìn)行各種細(xì)胞的感染。感染后3天將各自細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀FACSVantage分析以測定表達(dá)rsGFP的細(xì)胞的比率。結(jié)果在圖4-9中顯示。圖4-9中分別顯示了HT1080細(xì)胞、293細(xì)胞、A375M細(xì)胞、KB細(xì)胞、MDA-MB-435S細(xì)胞和MKN1細(xì)胞的結(jié)果。在圖中，用以制備病毒上清液的克隆的名稱沿著橫軸示出。(Pb)代表溴化己二甲銨存在下的感染組，而(RN)代表使用CH-296-包被的平板的感染組?？v軸代表基因轉(zhuǎn)移效率(％)。
用人GnT-III-修飾的病毒感染的細(xì)胞的表達(dá)rsGFP的細(xì)胞的比率與用未修飾的病毒感染的細(xì)胞的比率相比增加了。
實施例5從293T/hG3克隆制備病毒和基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中1.制備病毒上清液在實施例2中分離的證實了表達(dá)的293T/hG3克隆中，選擇細(xì)胞系293T/hG3-1，并制備雙嗜性病毒上清液和親嗜性病毒上清液。在對照實驗中用293T細(xì)胞進(jìn)行相同的程序。將293T或293T/hG3克隆的3×106個細(xì)胞接種到6cm組織培養(yǎng)板(Iwaki Glass)中，并在含有10％胎牛血清的4ml DMEM中于37℃、5％CO2下培養(yǎng)過夜。第二天，證實293T或293T/hG3克隆的細(xì)胞達(dá)到半?yún)R合，通過抽吸取出平板中含有10％胎牛血清的DMEM，并向每板加入含有10％胎牛血清的3ml新鮮DMEM。向每板還加入終濃度為25μM的氯喹(Wako PureChemical Industries)。在兩個聚苯乙烯圓底管中的每一個中組合下面的組分以用于制備雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒5μg質(zhì)粒載體pGP(TakaraBio)；用于表達(dá)雙嗜性env的5μg質(zhì)粒載體pE-ampho(Takara Bio)；用于反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)的10μg質(zhì)粒載體(攜帶rsGFP基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pDON-AI(Takara Bio))；62μl 2M CaCl2；和無菌蒸餾水至500μl。類似地，在兩個聚苯乙烯圓底管的每一個中組合下面的組分以用于制備親嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒5μg質(zhì)粒載體pGP；用于表達(dá)親嗜性env的5μg質(zhì)粒載體pE-eco(Takara Bio)；用于反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)的10μg質(zhì)粒載體(攜帶rsGFP基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pDON-AI(Takara Bio))；62μl 2M CaCl2；和無菌蒸餾水至500μl。緊在向每管加入500μl轉(zhuǎn)染緩沖液后，用從電移液器排出將混合物起泡20秒。向每板均勻逐滴加入1ml混合物。將平板在37℃、5％CO2下溫育9小時。9小時后，取出3ml培養(yǎng)物上清液，向每板加入4ml含有10％胎牛血清的新鮮DMEM，并在37℃、5％CO2下培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時，將每板中的培養(yǎng)基用含有10％胎牛血清的4ml新鮮DMEM更換。再在37℃、5％CO2下培養(yǎng)24小時后，通過0.45-μm過濾器(Millipore)過濾培養(yǎng)物上清液，并作為病毒上清液原種在-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.病毒上清液效價的測量如實施例3的“2”(病毒上清液效價的測量)中描述的用NIH/3T3細(xì)胞測量病毒上清液的效價。雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒的效價為1.9×106I.V.P./ml(來自293/hG3克隆的病毒上清液)和1.1×106I.V.P./ml(來自用于對照實驗的293T細(xì)胞的病毒上清液)。親嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒的效價為3.7×106I.V.P./ml(來自293/hG3克隆的病毒上清液)和6.0×106I.V.P./ml(來自用于對照實驗的293T細(xì)胞的病毒上清液)。
3.用人GnT-III修飾的雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移在實施例5的“1”中制備的病毒上清液中，將使用細(xì)胞系293T/hG3-1制備的人GnT-III-修飾的雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒和作為對照的用293T細(xì)胞制備的雙嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒用于根據(jù)溴化己二甲銨(Pb)方法或者上清液(SN)方法，用CH-296-包被的平板在M.O.I.＝0.2的條件下，基因轉(zhuǎn)移到NIH/3T3細(xì)胞中。此外，使用CH-296-包被的平板，根據(jù)下面的三種方法之一進(jìn)行向HT1080細(xì)胞和K562細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移Pb方法、SN方法和結(jié)合的病毒(BV)方法。在每種方法中，在M.O.I.＝0.2的條件下感染HT1080細(xì)胞，并在M.O.I.＝2.0的條件下感染K562細(xì)胞。根據(jù)實施例4的“2”中描述的方法進(jìn)行Pb方法和SN方法。如下所述進(jìn)行BV方法。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640將病毒上清液調(diào)節(jié)到8×103I.V.P./ml(用于感染HT1080細(xì)胞)或8×104I.V.P./ml(用于感染K562細(xì)胞)，并向CH-296-包被的平板的每孔中加入500-μl等分試樣。然后使平板在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃下靜置4小時以促進(jìn)病毒對CH-296的吸附。4小時后，取出病毒上清液，用0.5ml/孔的1×PBS洗滌平板，并向每孔加入調(diào)節(jié)到4×104/ml的500μl細(xì)胞懸浮液以用于感染。在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)細(xì)胞3天。3天后，對各自細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀FACS Vantage(Becton-Dickinson)分析以確定表達(dá)GFP的細(xì)胞的比率。結(jié)果在圖10-12中顯示。NIH/3T3細(xì)胞、HT1080細(xì)胞和K562細(xì)胞的結(jié)果分別在圖10-12中顯示。在圖中，在橫軸示出感染方法。Pb代表溴化己二甲銨存在下的感染組，SN代表使用CH-296包被的平板，根據(jù)上清液方法的感染組，且BV代表使用CH-296包被的平板，根據(jù)結(jié)合的病毒方法的感染組。縱軸代表基因轉(zhuǎn)移效率(％)。
在CH-296存在下用人GnT-III修飾的病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)rsGFP的細(xì)胞的比率與用未修飾的病毒感染的細(xì)胞的比率相比增加了。
4.用人GnT-III修飾的親嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移在實施例5的“1”中制備的病毒上清液中，將使用細(xì)胞系293T/hG3-1制備的人GnT-III修飾的親嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒和作為對照的用293T細(xì)胞制備的親嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒用于根據(jù)Pb方法或者SN方法，用CH-296-包被的平板在M.O.I.＝0.2的條件下基因轉(zhuǎn)移到NIH/3T3細(xì)胞中。此外，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640作為生長培養(yǎng)基在37℃、5％CO2下培養(yǎng)小鼠L1210細(xì)胞(ATCC CCL-219)，并使用CH-296-包被的平板，根據(jù)下面的三種方法之一進(jìn)行在M.O.I.＝2.0條件下的感染Pb方法、SN方法和BV方法。根據(jù)實施例4的“2”中描述的方法進(jìn)行Pb方法和SN方法。根據(jù)如上面“3”中描述的方法進(jìn)行BV方法。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)3天。3天后，對各自細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀FACS Vantage(Becton-Dickinson)分析以確定表達(dá)GFP的細(xì)胞的比率。結(jié)果在圖13和14中顯示。NIH/3T3細(xì)胞和L1210細(xì)胞的結(jié)果分別在圖13和14中顯示。在圖中，在橫軸示出感染方法。Pb代表溴化己二甲銨存在下的感染組，SN代表使用CH-296包被的平板，根據(jù)上清液方法的感染組，而BV代表使用CH-296包被的平板，根據(jù)結(jié)合的病毒方法的感染組?？v軸代表基因轉(zhuǎn)移效率(％)。
在CH-296存在下用人GnT-III修飾的病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)rsGFP的細(xì)胞的比率與用未修飾的病毒感染的細(xì)胞的比率相比增加了。
工業(yè)適用性本發(fā)明提供了重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其在具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)存在下導(dǎo)致高的基因轉(zhuǎn)移效率。通過使用該載體，目的基因可以高效率地穩(wěn)定轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。因為反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以不僅用于治療遺傳疾病，還可以治療其他各種疾病，所以本發(fā)明可廣泛用于醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域中。
序列表自由文本SEQ ID NO2；用于擴增編碼GnT-III的基因的合成引物hG3-F1。
SEQ ID NO3；用于擴增編碼GnT-III的基因的合成引物hG3-R4。
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>用于產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞<130>666218<150>JP 2004-283918<151>2004-09-29<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1593<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgagacgct acaagctctt tctcatgttc tgtatggccg gcctgtgcct catctccttc 60ctgcacttct tcaagaccct gtcctatgtc accttccccc gagaactggc ctccctcagc 120cctaacctgg tgtccagctt tttctggaac aatgccccgg tcacgcccca ggccagcccc 180gagccaggag gccctgacct gctgcgtacc ccactctact cccactcgcc cctgctgcag 240ccgctgccgc ccagcaaggc ggccgaggag ctccaccggg tggacttggt gctgcccgag 300gacaccaccg agtatttcgt gcgcaccaag gccggcggcg tctgcttcaa acccggcacc 360aagatgctgg agaggccgcc cccgggacgg ccggaggaga agcctgaggg ggccaacggc 420tcctcggccc ggcggccacc ccggtacctc ctgagcgccc gggagcgcac ggggggccga 480ggcgcccggc gcaagtgggt ggagtgcgtg tgcctgcccg gctggcacgg acccagctgc 540ggcgtgccca ctgtggtgca gtactccaac ctgcccacca aggagcggct ggtgcccagg 600gaggtgccgc gccgcgtcat caacgccatc aacgtcaacc acgagttcga cctgctggac 660gtgcgcttcc acgagctggg cgacgtggtg gacgcctttg tggtgtgcga gtccaacttc 720
acggcttatg gggagccgcg gccgctcaag ttccgggaga tgctgaccaa tggcaccttc 780gagtacatcc gccacaaggt gctctatgtc ttcctggacc acttcccgcc cggcggccgg 840caggacggct ggatcgccga cgactacctg cgcaccttcc tcacccagga cggcgtctcg 900cggctgcgca acctgcggcc cgacgacgtc ttcatcattg acgatgcgga cgagatcccg 960gcccgtgacg gcgtcctttt cctcaagctc tacgatggct ggaccgagcc cttcgccttc 1020cacatgcgca cgtcgctcta cggcttcttc tggaagcagc cgggcaccct ggaggtggtg 1080tcaggctgca cggtggacat gctgcaggca gtgtatgggc tggacggcat ccgcctgcgc 1140cgccgccagt actacaccat gcccaacttc agacagtatg agaaccgcac cggccacatc 1200ctggtgcagt ggtcgctggg cagccccctg cacttcgccg gctggcactg ctcctggtgc 1260ttcacgcccg agggcatcta cttcaagctc gtgtccgccc agaatggcga cttcccacgc 1320tggggtgact acgaggacaa gcgggacctg aactacatcc gcggcctgat ccgcaccggg 1380ggctggttcg acggcacgca gcaggagtac ccgcctgcag accccagcga gcacatgtat 1440gcgcccaagt acctgctgaa gaactacgac cggttccact acctgctgga caacccctac 1500caggagccca ggagcacggc ggcgggcggg tggcgccaca ggggtcccga gggaaggccg 1560cccgcccggg gcaaactgga cgaggcggaa gtc 1593<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增編碼GnT-III的基因的合成引物hG3-F1<400>2aaccatggcg atgagacgct acaagctc 28
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增編碼GnT-III的基因的合成引物hG3-R4<400>3ctctccagca tcttggtgcc 20
權(quán)利要求
1.具有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因的細(xì)胞，其中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性被增強。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因整合到染色體中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其用含有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中通過人工轉(zhuǎn)移N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III基因來增強N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞，其中通過將N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III基因整合到染色體中來增強N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞，其中通過用含有N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化來增強N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中將N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III基因置于異源啟動子控制下。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其來自選自293細(xì)胞和293T細(xì)胞的細(xì)胞。
9.反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞，其具有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因，該細(xì)胞中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性被增強，并且該細(xì)胞被重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體或者重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
10.產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，該方法包括培養(yǎng)反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞，其具有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因，該細(xì)胞中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性被增強，并且該細(xì)胞被重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體或者重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；和收集培養(yǎng)物上清液。
11.反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其根據(jù)用于產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法產(chǎn)生，其中該方法包括培養(yǎng)反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞，其具有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因，該細(xì)胞中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性被增強，并且該細(xì)胞被重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體或者重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；和收集培養(yǎng)物上清液。
12.將基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中的方法，該方法包括培養(yǎng)反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞，其具有來自反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因和env基因，該細(xì)胞中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性被增強，并且該細(xì)胞被重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體或者重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；收集培養(yǎng)物上清液以得到反轉(zhuǎn)錄病毒載體；和在具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)存在下，用反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染靶細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述具有反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能物質(zhì)是纖連蛋白或者其片段。
全文摘要
在攜帶反轉(zhuǎn)錄病毒來源的gag－pol基因和env基因的細(xì)胞中增強了N－乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III活性。通過用上面的細(xì)胞構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體，可以得到具有修飾的糖鏈結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。通過該方法構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒載體尤其在功能物質(zhì)存在下顯示出高感染效率。
文檔編號C12N5/10GK101031651SQ20058003313
公開日2007年9月5日 申請日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者蝶野英人, 奧山洋美, 江頭知惠, 小山信人, 峰野純一, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶生物工程株式會社