專利名稱：：適體藥物化學(xué)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明通常關(guān)于核酸領(lǐng)域，更尤其關(guān)于用作治療劑、診斷劑的適體和用于如目標(biāo)-驗(yàn)i正的研究中的適體。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于提高治療、-珍斷學(xué)和研究中應(yīng)用的適體的原津+和方法。
背景技術(shù)：
：適體是核酸分子，這類分子除了通過經(jīng)典的Watson-Crick石威基配對作用以外還通過相互作用對分子有特異的結(jié)合親合力。與通過噬菌體展示或單克隆抗體("mAbs，，)生產(chǎn)的肽相似，適體能夠特異的結(jié)合所選中的靶點(diǎn)并調(diào)節(jié)靶點(diǎn)活性或結(jié)合相互作用，例如，通過結(jié)合的適體可以阻礙耙點(diǎn)發(fā)揮功能活性。從寡核苷酸隨機(jī)序列庫中進(jìn)行體外篩選過程可以發(fā)現(xiàn)，得到的適體，可以產(chǎn)生一百多種蛋白，其中包括生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、酶、免疫球蛋白和受體。一種典型的適體，有10-15kDa大小(20-45個(gè)核苷酸)，通過納摩爾到亞納摩爾親合力結(jié)合到輩巴點(diǎn)上，能夠區(qū)分密切相關(guān)的其它輩巴點(diǎn)(例如，適體通常不能結(jié)合同一個(gè)基因族的其它蛋白)。一系列的結(jié)構(gòu)研究表示，適體能夠使用同一類型的結(jié)合作用(例如，氬鍵，靜電互補(bǔ)，疏水接觸，空間排阻)，增強(qiáng)抗原-抗體復(fù)合物的特異性和親合性。適體在用作治療劑和診斷應(yīng)用中有很多理想的特性，包括高特異性和高親合性，生物有效性，和極好的藥代動(dòng)力學(xué)屬性。另外與抗體和其它蛋白生物體相比，它們能夠提供特異竟?fàn)?性優(yōu)勢，t匕J(口l)速度和控制適體可通過完整的體外過程產(chǎn)生，允i午迅速產(chǎn)生起始引導(dǎo)物，包括治療的引導(dǎo)物。體外篩選方法可以嚴(yán)格控制適體的特異性和親合力，允許生成引導(dǎo)物，包括對有毒的和非免疫原性的引導(dǎo)物。2)毒性與免疫原性作為一類分子，適體具有已經(jīng)證明的治療可接受的毒性，且缺乏免疫原性。雖然由于對自身抗體的免疫應(yīng)答，許多單克隆抗體療效受到嚴(yán)重限制，但很難得到對適體的抗體，最可能的原因是T細(xì)胞無法通過MHC遞呈適體，免疫應(yīng)答不能識別核酸片段。3)給藥雖然目前大多數(shù)抗體療法是通過靜脈輸液(通常超過2-4小時(shí))、適體可皮下注射(以猴科為研究對象，皮下給藥，適體生物有效性〉80%,參見(Tucker等人的文獻(xiàn)J.ChromatographyB.732:203-212，1999))給藥。由于適體具有好的溶解度(〉150mg/mL)和相對低分子量(適體:10-50kDa;抗體:150kDa),周劑量的適體可以以小于0.5mL的體積注射給藥。此外，小分子的適體可以滲透進(jìn)入不允許抗體或抗體片段滲透的構(gòu)象收縮區(qū)，展現(xiàn)了基于適體治療或預(yù)防的另一優(yōu)勢。4)可測性和成本治療性適體是化學(xué)合成的，因此容易根據(jù)生產(chǎn)的需求進(jìn)行頭見模化生產(chǎn)。而目前規(guī)?；a(chǎn)中的困難限制了一些生物制品的可用性，并且大型蛋白制品工廠投資巨大，單一大型核苦酸合成4義的產(chǎn)量可達(dá)100公斤/年，需要一個(gè)相對適度的初期投資。與高度優(yōu)化的抗體相比，目前適體合成原料的成本以千克規(guī)^莫計(jì)算大約500美元/克，隨著工藝的不斷改進(jìn)，預(yù)計(jì)未來五年原津牛成本降^f氐至小于100美元/克。5)穩(wěn)定性治療性適體顯示化學(xué)惰性。它們暴露于例如受熱或接觸到變性試劑等因素后，自身可重新獲得活性，適體以凍干粉形式在室溫下儲存可長達(dá)一年以上。此外，適體開發(fā)過程易于進(jìn)行先導(dǎo)修飾，例如適體序列優(yōu)化和最小化適體長度[Conradetal.1996,Eatonetal.1997]。jt匕夕卜，2'修飾如2'-F和2'-0-Me在不損害適體與靶點(diǎn)的結(jié)合相互作用情況下可#皮用于抗核酸酶的穩(wěn)、定性。參見如，Lineta.NucleicAcidsRes.22，5229-5234(1994》Jellineketal,Biochemistry1995，34,11363-1137;Linetal,NucleicAcidsRes.,1994,22,5229-5234;Kubiketal"JImmunol"1997，159(1),259-267;和Pagmtisetal"Nat.Biotechnol"1997，1,68-73。然而，僅有一些以提高除了抗核酸酶之外的性能，如乾點(diǎn)親合性為目的的適體內(nèi)化學(xué)取代的實(shí)施例。參見如Greenetal，.Chem.Biol.,10,683-695(1995)，Eatonetal"Bioorg.Med.Chem.,5，1087-1096(1997),Eeetal,J.Med.Chem.,41,4224-4231(1998),Heetal,J.Med.Chem.，41,2234-2242(1998)，Wangetal"Biochemistry,32,11285-11292(1993)，和Krawczyketal.,NucleosidesandNucleotides,14，1109-1116(1995)?；瘜W(xué)取代已經(jīng)被引入到適體轉(zhuǎn)錄文庫內(nèi)，這些適體是以篩選具有不同性能如增強(qiáng)的靶點(diǎn)親合性的適體為目標(biāo)而被開發(fā)出。參見如，Lathametal"NucleicAcidsRes.,22,2817-2822(1994)，Vaishetal".Biochemistry,42,8842-8851(2003),Saitohetal"NucleicAcidsRes.Suppl，2，215-216(2002),Masudetal，Bioorg.Med.Chem.,12，1111-1120(2004)，Kingetal,Biochemistry,41,9696-9706(2002),andYang,X.andGorenstein,D.G.Curr.DrugTargets,5，705-715(2004)。然而，經(jīng)轉(zhuǎn)錄引入到轉(zhuǎn)錄文庫內(nèi)的取代是一種整體方法，其中所有給定種類的核苷同時(shí)被取代。這種整體方法不考慮開發(fā)能夠提高理想適體性能的單一取代，例如，適體靶點(diǎn)親合力，^旦可能在適體內(nèi)的其他位點(diǎn)不^皮容受。除了改變對核酸酶的耐受力之外，最小化所需的化學(xué)取代數(shù)量將有益于改變適體性能，例如獲得特殊治療和/或診斷標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明提供了滿足這些和其他需求的原料和方法。
發(fā)明內(nèi)容適體用于治療疾病，i貪斷應(yīng)用和/或用在力n目才示確i人的研究中。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒別結(jié)合耙點(diǎn)的取代適體的一種方法，其中被取代適體比未被取代的相同的適體具有更高的靶點(diǎn)結(jié)合親合力。本方法的一個(gè)實(shí)施方案包括步驟如下a)在石成基位、糖基位或^壽酸位點(diǎn)或未^皮取代核苦酸的片,爻處取代單一核苷酸，和b)分析對靶點(diǎn)具有結(jié)合親合力的被取代適體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的取代步驟進(jìn)一步包括在相同位點(diǎn)如具有相同化學(xué)l多飾的位點(diǎn)用至少兩個(gè)祐修飾的核苦酸取代至少兩個(gè)未裙修飾的核苷酸，而在其他實(shí)施方案中，取代步驟包^舌在不同位點(diǎn)，例如具有不同化學(xué)修飾的位點(diǎn)上用至少兩個(gè)被修飾的核苷酸取代至少兩個(gè)未^t^修飾的核苷酸。在本發(fā)明所有方面的一些實(shí)施方案中，例如在功能試驗(yàn)如以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析中，除了在#皮取代的和/或兩次取代適體中檢測出結(jié)合親合力的提高之外，還檢測出適體活性的^是高。在本發(fā)明的方法的一些方面中，分析試-驗(yàn)步驟包4舌在功能分析試驗(yàn)，如以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析中測試適體對耙點(diǎn)的活性。在一些實(shí)施方案中，取代步驟進(jìn)一步包括在同一位點(diǎn)，例如具有相同化學(xué)<多飾位點(diǎn)上用至少三個(gè)<奮飾核苷酸取代至少三個(gè)未被取代核苦酸，然而在其他實(shí)施方案中，至少三個(gè)核苷酸中的兩個(gè)在不同的位點(diǎn)#皮#~飾，例如具有不同化學(xué)^f奮飾的位點(diǎn)。也提供了經(jīng)這個(gè)發(fā)明主題的方法鑒別的適體。本發(fā)明也提供了特異性結(jié)合靶點(diǎn)的單鏈適體，其中該適體包括一種具有選擇取代的核苷或殘基的核酸序列，相對于具有相同核苷序列^f旦沒有耳又代核苷的第二適體來講，該適體具有對輩巴點(diǎn)提高的結(jié)合親合性，其中被取代核苷包括在磷酸、糖基或義咸基位點(diǎn)的修飾。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括不超過4個(gè)、不超過3個(gè)、不超過2個(gè)或不超過一個(gè)核苷酸或殘基取代的單鏈適體，其中被取代核苦酸包括在堿基、糖基或磷酸位點(diǎn)上的化學(xué)修飾，并且其中單鏈適體特異性結(jié)合靶點(diǎn)，其結(jié)合親合力相對于第二單鏈適體對靶點(diǎn)結(jié)合親合力來講有所提高，第二單鏈適體等同于第一單鏈適體，4旦無取代發(fā)生。在這個(gè)發(fā)明主題的一些實(shí)施方案中，被取代單鏈適體包括比無取代的第二個(gè)適體對適體靶點(diǎn)具有更高活性。本發(fā)明也提供了鑒別被取代單鏈適體的方法，該方法包4舌步l^如下a)用石克代石粦酸或二石克代石粦酸取^單鏈適體內(nèi)核苷酸內(nèi)連接部位上的磷酸；b)分析被取代單鏈適體對靶點(diǎn)的親合力；和c)鑒別出相對于起始適體對靶點(diǎn)的親合力，具有更高親合力的單鏈適體，其中，除了其無;s危代磷酸鹽:f又代之外，該起始適體同源于被修飾的單鏈適體。如上面被采用的，單鏈適體包括具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的適體。在本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案中，硫代磷酸取代發(fā)生在未橋連位點(diǎn)處。本發(fā)明目的在于適用本發(fā)明適體的立體化學(xué)混合物，包括外消旋混合物，以及實(shí)質(zhì)上純凈的立體化學(xué)混合物，例如一個(gè)非對映體的95%或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的該主題方法的取代步驟進(jìn)一步包括通過化學(xué)合成在核苷酸內(nèi)連接部位上加入一個(gè)硫代褲酸取代。在一些實(shí)施方案中，取代步驟不包括在單鏈適體的3'或5'末端處的兩個(gè)核苷之間的核苷酸內(nèi)連4妾處的硫代磷酸取代。在一些實(shí)施方案中，取代步驟包括在單鏈適體內(nèi)加入單一好u代磷酸取代。在一些實(shí)施方案，單一取代的好i/R/粦酸取代的單鏈適體對靶點(diǎn)的結(jié)合親合力，比起始適體對靶點(diǎn)的親合力至少高兩倍，至少高三〗咅，至少高四倍或至少高五倍。在本發(fā)明這一方面的方法的一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步包括向被取代單鏈適體中加入附加取代而生成二次取代單鏈適體的步f《。在該方法的一些實(shí)施方案進(jìn)一步包纟舌分沖斤二次取^單鏈適體對靶點(diǎn)親合力，并鑒別此二次取代單鏈適體具有與起始未取代單鏈適體相等或更高的親合力。而在其他實(shí)施方案中，該發(fā)明主題的方法包括分析二次取代單鏈適體對輩巴點(diǎn)的親合力和鑒別鑒別合力。在一些實(shí)施方案中，附加取代為在不同于首個(gè)硫代石粦酸取代位點(diǎn)的磷酸位點(diǎn)處的另外的硫代磷酸取代。在一些實(shí)施方案中，其中二次取代適體包括至少兩個(gè)在不同核苦酸位點(diǎn)上的石危代磷酸取代，二次取代適體對靶點(diǎn)的結(jié)合親合力至少比起始未取代適體和/或一次修飾適體的靶點(diǎn)結(jié)合親合力高至少二倍、三倍、四倍或五倍。在一些實(shí)施方案中，附加的取代選自由在堿基位點(diǎn)取代一個(gè)#皮>修飾核苷酸、在糖基位點(diǎn)取代一個(gè)^皮修飾核苷酸、和在石粦酸位點(diǎn)取>[、一個(gè)#^修飾核苦酸組成的組。在一些實(shí)施方案中，附加的取代選自由在磷酸位點(diǎn)處的二硫代磷酸取代、肌普取代另一個(gè)核苷酸；2'-脫氧二氫尿嘧啶核苷取代一種尿嘧咬核苷，2'-脫氧-5-曱基核苷取代另一種核苷酸，2'-脫氧核苷取代2'-OMe核苷酸，2'-OMe核苷取代2'-脫氧核苷酸，和2-氨基噪呤取代一種噤呤組成的組。在一些實(shí)施方案中，附加的取代選自由2'-脫氧肌普或2'-0Me月幾苦取代另一個(gè)核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧，定核苷取^一個(gè)尿嘧啶核苷，2'-脫氧-5-曱基胞嘧啶取代胞嘧啶，和一個(gè)2，-脫氧核苷酸取代2'-OMe核苷酸組成的組。還提供了由該發(fā)明此方面的方法鑒別的一種適體。在一些實(shí)施方案中，其中二次取代適體包括至少兩種不同類型的取代，其中之一為石克代石粦酸取代，二次取^適體的靶點(diǎn)結(jié)合親合力至少比起始未取代適體和/或一次修飾適體的乾點(diǎn)結(jié)合親合力高至少二倍、三倍、四倍或五倍。在發(fā)明的其它方面，一種鑒別取代適體的方法包括步驟如下a)向起始適體中加入一種取^物，其中該耳又^選自由月幾苦耳又代另一種核苷酸，2'-脫氧二氫尿嘧咬核苷取代尿嘧i定核普、2'-脫氧-5-甲基胞嘧咬取代胞嘧啶，2-氨基嘌呤取代一種噤呤和2'-脫氧核苷酸取代2'-OMe核苦酸；b)分析取代適體對靶點(diǎn)的親合力；和c)相對于起始適體，鑒別對靶點(diǎn)具有較高親合力的被取代適體，其中所述起始適體除了其無取代核苷酸之外，與禎:耳又4戈適體同源。在一些實(shí)施方案中，該方法的加入步驟進(jìn)一步包括通過化學(xué)合成向起始適體中加入耳又^物。在該發(fā)明方面的方法的一些實(shí)施方案中，鑒別出的取代適體是單鏈的。在一些實(shí)施方案中，該發(fā)明方面的方法包i舌用力幾苷取^另一個(gè)核苦酸。在該發(fā)明方法的一些實(shí)施方案中，一個(gè)月幾苷^皮另一個(gè)核苷酸，如噪p令取^，而在一些實(shí)施方案中，2'-脫氧核苦酸凈皮2'-OMe核香酸取代。在一些實(shí)施方案中，其中一個(gè)月幾苷一皮另一個(gè)核苷酸，例如一個(gè)噤p令耳又代，^皮耳又代適體的耙點(diǎn)結(jié)合親合力比起始的未取代適體的把點(diǎn)親合力高至少二倍、三倍、四倍或5倍。在一些實(shí)施方案中，其中2'-脫氧核苷酸被2'-OMe核香酸取代，靶點(diǎn)結(jié)合親合力比起始的未取代適體的輩巴點(diǎn)親合力高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍或至少80倍。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括向^皮取代適體中加入另外取代物的步驟，其中另外的取代物具有不同于第一個(gè)取代的類型，導(dǎo)致生成二次取代適體。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括分析二次取代適體對靶點(diǎn)的親合力并鑒別二次取代適體具有等同于或大于起始未取代單鏈適體的靶點(diǎn)親合力。在該發(fā)明主題的方法的一些實(shí)施方案中，附加的取^選自由石咸基〗立點(diǎn)上耳又代一種核苷酸，在糖基位點(diǎn)上耳又代一種核苦酸，和在》粦酸^f立點(diǎn)上取代一種修飾核苦酸組成的組。在一些實(shí)施方案中，附加的取代選自由磷酸位點(diǎn)上二硫代磷酸取代，肌苷取代另一種核苦酸；2'-脫氧二氫尿嘧，定核苷耳又^尿嘧，定核苷，2'-脫氧-5-甲基核苦酸取代另一種核苦酸，2'-脫氧核苷酸取代2'-OMe核苦酸，2'-0Me核芬酸取代2'-脫氧核*酸，和2-氨基噪呤取代一種噤呤組成的組，其中另一種取代不同于第一種取代。在一些實(shí)施方案中，另一種取代選自由2'-脫氧肌苷或2'-OMe肌苷取代另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧啶核苷取代尿嘧啶核苷，2'-脫氧-5-曱基胞嘧啶取代胞嘧啶，和2'-脫氧核苷酸耳又代2'-OMe核苦酸組成的組。在該發(fā)明主題的方法的一些實(shí)施方案中，第一取代為2'-脫氧取代2'-0Me核苷酸并且另一種取^代為月幾苦:f又代另一種核香酸。在本發(fā)明主題的方法的一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括向被取代適體中加入附加取代而導(dǎo)致生成二次取代適體，其中附加的取代與第一取代類型相同但發(fā)生在不同的核苷酸位點(diǎn)上。在本發(fā)明該方面的一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包4舌分4斤二次取代適體對把點(diǎn)的親合力并且鑒別二次取代適體，該二次取代適體具有與起始未取代單鏈適體和/或取代適體等同或更大的結(jié)合親合力。本發(fā)明也提供了一種單鏈適體，其包括不超過四個(gè)、不超過三個(gè)、不超過兩個(gè)或不超過一個(gè)石克代石粦酸骨架取^，其中單鏈適體以一種特異結(jié)合親合力結(jié)合耙點(diǎn)，相對于與第一適體同源但缺少一個(gè)硫代磷酸修飾的第二單鏈適體的把點(diǎn)結(jié)合親合力，該靶點(diǎn)結(jié)合親合力更高。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方面的適體包括選自由具有堿基位點(diǎn)上修飾核苷酸的取代，糖基位上修飾的核苦酸和具有磷酸位點(diǎn)上修飾核苦酸組成的組中附加的核苦酸取代，其中當(dāng)^皮取代的核苷酸包括^粦酸位點(diǎn)上一種》爹飾時(shí)，該-修飾不是石克代磷酸取代。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明該主題的適體包括選自由在磷酸位點(diǎn)上的二硫代磷酸取代，肌苦取代另一種核苦酸；2'-脫氧二氫尿嘧咬核苷取代尿嘧啶核苷、2'-脫氧-5-曱基核苦酸取代另一種核苷酸，2'-脫氧核苷酸取代2'-OMe核苦酸，2'-OMe核苦酸取代2'-脫氧核苷酸，和2-氨基噪呤取代一種嘌呤組成組的一種另外核芬酸取代。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明該方面的適體包括一種單鏈適體，其包括選自由月幾苷取代另一種核苷酸、2'-脫氧二氬尿嘧啶核苷取代尿嘧啶核苦，2'-脫氧-5-甲基胞嘧咬取代胞嘧咬，和2-氨基嘌呤取代一種噤呤和一種2'-脫氧核苦酸取代一種2'-OMe核苷酸組成組的一種核苷酸耳又代，其中一皮取^單鏈適體以一種結(jié)合親合力特異性結(jié)合一種靶點(diǎn)，相對于與第一適體同源但缺少一個(gè)核苷酸取代第二單鏈適體的草巴點(diǎn)結(jié)合親合力，該草巴點(diǎn)結(jié)合親合力更高。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明該主題的適體包4舌選自由肌苷取代另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧咬核苦取代尿嘧咬核苦，2'-脫氧-5-曱基胞嘧啶取代胞嘧啶，和一種2-氨基嘌呤取代一種嘌呤和一種2'-脫氧核苦酸耳又4戈一種2'-OMe核苦酸組成組的至少兩個(gè)核苷酸取代或至少三個(gè)核苷酸取代，其中二次取代單鏈適體特異性結(jié)合一種靶點(diǎn)，相對于與第一適體同源但缺少至少兩個(gè)核苷取代的第二單鏈適體的靶點(diǎn)結(jié)合親合力，該靶點(diǎn)結(jié)合親合力更高。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明該方面的二次取4戈單鏈適體以輩巴點(diǎn)結(jié)合親合力特異性結(jié)合一種靶點(diǎn)，相對于與第一適體同源但缺少核苷酸取代中的一個(gè)的第二單鏈適體的把點(diǎn)結(jié)合親合力，該把點(diǎn)結(jié)合親合力更高。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明該主題的三重取^單鏈適體以一種把點(diǎn)結(jié)合親合力特異性結(jié)合一種乾點(diǎn)，相對于與第一適體同源^f旦缺少至少核苷酸取^中的一個(gè)的第二單鏈適體的乾^點(diǎn)結(jié)合親合力，該靶點(diǎn)結(jié)合親合力更高。在一種特殊實(shí)施方案中，核苷酸:f又^為用2'-脫氧核普酸取—種2'-OMe核苦酸。在一些實(shí)施方案中，核苷取^為用月幾普取氏一種噤呤。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了能夠特異性結(jié)合輩巴點(diǎn)的適體，其中該適體包括具有在一種一皮選定位點(diǎn)上石克代-粦酸修飾磷酸骨架的核苷酸序列，相對于具有相同的核苷酸序列^f旦缺少碌u代磷酸修飾的第二適體對同一草巴點(diǎn)的結(jié)合親合力，該-修飾增強(qiáng)了所述適體對革巴點(diǎn)的結(jié)合親合力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了穩(wěn)定適體的方法，該方法包括的步驟如下a)向起始適體中引入穩(wěn)定化修飾而導(dǎo)致生成一種修飾的適體，其中起始適體具有預(yù)先確定的耙點(diǎn)結(jié)合親合力，和b)分析被修飾適體對靶點(diǎn)的結(jié)合親合力，在結(jié)合親合力小于起始適體對靶點(diǎn)結(jié)合親合力的地方引入一種核香酸取代而生成一種被取代的適體，其中核苷酸取代生成的適體對耙點(diǎn)的親合力大于被修飾適體對耙點(diǎn)的親合力。在發(fā)明該主題的方法的一些實(shí)施方案中，被取代適體包括與起始適體的靶點(diǎn)結(jié)合親合力大體上相同的一種乾點(diǎn)結(jié)合親合力。在本發(fā)明這方面的方法的一些實(shí)施方案中，取代的適體與起始適體具有基本上相同的靶點(diǎn)結(jié)合親合性。在一些實(shí)施方案中，穩(wěn)定化^^飾為選自由提高適體對核酸酶降解的耐受性，提高堿基對強(qiáng)度，提高抗水性和提高對熱降解的耐受性所組成的組的一種修飾。在一種特殊實(shí)施方案中，穩(wěn)定化修飾為提高對核酸酶降解耐受性的一種修飾。在一種更特殊的實(shí)施方案中，穩(wěn)定化修飾包括用2'-OMe核普酸取代其它核苷酸，尤其加入多于一個(gè)2'-OMe取代其它核苷酸。在一些實(shí)施方案中，取代步驟包括選自由在堿基位點(diǎn)上一種修飾核苷酸的取代，在糖基位點(diǎn)上的一種修飾核苷酸的取代，在磷酸位點(diǎn)上的一種修飾核普酸的耳又代所組成的組的一種取代。在特殊的實(shí)施方案中，取代選自由肌苷耳又代另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嗜啶核苦取代尿嘧咬核苷，2'-脫氧-5-甲基胞嘧啶取代一種胞嘧咬，一個(gè)2-氨基嘌呤取代一種噤呤，辟u代磷酸取代核苷酸取代一種未取代核苷酸和2'-脫氧核苦酸取代一種2'-OMe核苦酸所組成的組。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，取代為一個(gè)硫代磷酸取代核苷酸取代一個(gè)未取代核普酸。附圖簡述圖l是一個(gè)示意圖，代表了從寡聚核普酸隨機(jī)序列庫中體外篩選適體(SELEXTM)的過程。圖2顯示一種40kDa的分支狀PEG。圖3顯示40kDa的已經(jīng)附著到適體5，末端的分支狀PEG。圖4是一個(gè)描繪各種聚乙二醇化策略的插圖，表示了標(biāo)準(zhǔn)單聚乙二醇化、多聚乙二醇化，和通過聚乙二醇化完成的寡聚化作用。圖5為描述指示適體結(jié)合率(縱軸)對人IL-23濃度的曲線圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明一個(gè)或一個(gè)以上實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在下面進(jìn)4亍了完整的描述。雖然任<可與這里描述的相似或相同的方法或材沖?？梢杂糜趯?shí)現(xiàn)或檢測本發(fā)明，但這里描述的是優(yōu)選的方法和材料。本發(fā)明的其他特點(diǎn)，對象和優(yōu)點(diǎn)從說明書中顯而易見。在說明書中，除非文意另有明確指出，單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)的形式。除非另有規(guī)定，這里使用的所有科學(xué)技術(shù)名詞與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員的通常理解具有同等的意義。如果發(fā)生沖突，以本說明書的解釋為準(zhǔn)。適體開發(fā)適體，這里也統(tǒng)稱為核酸配體，包括經(jīng)除了典型的Wat離核酸分子。鑒別一種適體的適宜的方法為命名為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化"("SELEXTM")的過程，在圖1中和下面更詳細(xì)地進(jìn)行了描述。一旦作為引導(dǎo)物的適體，例如，治療和/或診斷引導(dǎo)物和/或目標(biāo)確i人，^皮鑒別出，引導(dǎo)適體可被^修飾而獲得預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。例如，引導(dǎo)適體可4皮截?cái)喽梢粋€(gè)短適體，該短適體保留或獲得對預(yù)期靶點(diǎn)有效結(jié)合親合力，例如等同于或比母體適體的耙點(diǎn)結(jié)合親合力好的靶點(diǎn)結(jié)合親合力。引導(dǎo)適體的初級核普酸序列可在一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)上一皮改變而增強(qiáng)生成適體對耙點(diǎn)的結(jié)合親合力。51導(dǎo)適體也能被化學(xué)修飾而獲得預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。不進(jìn)行修飾或這些修飾方法的聯(lián)合可用于獲得特殊用途的適體性能。SELEX方法SELEXTM過程是一種與靶分子有高特異結(jié)合能力的扭酸分子體外進(jìn)化的方法，在文獻(xiàn)，例如1990年6月11日提交，現(xiàn)已放棄的美國專利申請第07/536,428號，名為"核酸配體"的美國專利第5,475,096號和名為"核酸配體"的美國專利第5,270,163號(也可參見WO91/19813)中所述。每種SELEXTM鑒定的核酸配體，即每種適體，都是纟會(huì)定草a點(diǎn)化合物或分子的一種特異配體。SELEX頂過程是基于這樣一種獨(dú)特觀點(diǎn)，即核酸具有足夠的能力形成多種二維或三維結(jié)構(gòu)，且具有足夠的多功能性，使其單體可以用作幾乎各種化學(xué)化合物，不管是單體還是聚合體的配體。任何大小的分子或組合物都可作為輩巴點(diǎn)。SELEXTM依賴于包括隨機(jī)核酸序列的單鏈寡核苷酸庫上的起始點(diǎn)，該單鏈寡4亥苦酸包4舌至少一個(gè)降解^f立點(diǎn)。該方法通常用于大約IO"種核普酸種類的樣本，^f旦也可以用于1018種不同寡核苷酸種類的樣本。在包含大量可能序列和結(jié)構(gòu)的核酸文庫內(nèi)，對給定靶點(diǎn)存在較寬范圍的結(jié)合親合力。對靶點(diǎn)具有較高親合力(較低離解常數(shù))的那些核酸最可能結(jié)合該耙點(diǎn)。該文庫與靶點(diǎn)在適宜于結(jié)合的條件下混合，并經(jīng)過反復(fù)的結(jié)合，分離或擴(kuò)增。在第一次分離、離解和擴(kuò)增后，第二個(gè)核酸混合物生成，與較高結(jié)合親合力候選物富集。另一輪的篩選逐漸趨向于最佳配體。采用同一種篩選方案，可獲得任何預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合親合力和選擇性。生成的核酸混合物經(jīng)常主要由一個(gè)或一些序列組成。這些能纟皮復(fù)制出，排序和個(gè)別地測試作為純凈配體或適體的結(jié)合親合力。更特別地，起始文庫中的寡核苷酸可能為修飾的或未修飾的DNA、RNA、或DNA/RNA雜合體。指定適體用途將獲悉起始寡核苷酸文庫組合物的選擇。例如，適于作為治療劑的適體優(yōu)選廉價(jià)合成，在體內(nèi)安全和穩(wěn)定。在生物液體存在中的穩(wěn)定性也可能對適體在診斷和目標(biāo)確定應(yīng)用中使用是很重要的。取決于指定的醫(yī)學(xué)指征，一般，在體內(nèi)使用野生型RNA和DNA適體不是充分穩(wěn)定的，因?yàn)樗鼈儗怂崦附到獾撵`敏性。耐核酸酶降解能通過加入修飾的核苷到適體中而明顯提高。SELEXTM方法包括含有修飾核苷酸的高親合力核酸配體的鑒定，所述修飾核苷酸能改變配體特性，比如改變了體內(nèi)穩(wěn)定性或改善運(yùn)輸特性。這種<奮飾的例子包4舌核糖和/或;粦酸和/或堿基的化學(xué)取代。SELEXTM鑒定含有l(wèi)奮飾核苷酸的核酸配體在文獻(xiàn)中都有描述，如在美國專利第5,660,985號中描述到的寡核苷酸含有在2，核糖位點(diǎn)，5嘧淀位點(diǎn)，8噤呤位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾的核苷酸衍生物，在美國專利第5,756,703號中描述的寡核苷酸包含了嘧啶2'位的各種修飾，在美國專利第5,580,737號中描述的寡核苷酸能是高親合力的特異核酸配體含有一個(gè)或多個(gè)2'-氨基(2'-NH2),2，-氟-(2'-F)和/或2'-OMe(2'-OMe)的核苷酸修飾。本發(fā)明中預(yù)期核酸配體的》務(wù)飾包4舌，^旦不限于那些能夠提供其他化學(xué)基團(tuán)的修飾，這些化學(xué)基團(tuán)能增加核酸配體堿基或核酸配體整體額外電荷，極化性，疏水性，氫4建，靜電作用和流動(dòng)性。產(chǎn)生抗核酸酶的寡核苦酸混合物的修飾包4舌一個(gè)或更多個(gè)核苦酸間連4妄的取4氣，^修飾的并唐基，^修飾的石威基，或它們的組合。這種修飾包括，但不限于，2'位糖修飾，5-位嘧咬修飾。8-位嘌呤修飾，環(huán)外氨基修飾，4-硫代尿嘧咬取代修飾，5-溴或5-硤尿嘧啶修飾；骨架修飾，硫代磷酸或烷基磷酸鹽修飾，甲基化物，和非正常堿基對組合如等堿基異胞苦和異鳥苷。修飾還包括3，和5M多飾^。帽子。在一種實(shí)施方案中，提供的寡核苷酸中P(O)O基團(tuán)被P(O)S("疏代")，P(S)S("二硫代")，P(0)NR2("胺酯代")，P(O)R，P(O)OR',CO或CH2("甲酰基")或3'-氨基(-NH-CH2-CH2-)取代，其中R或R'分別是H或被取代的或未被取代的烷基。連接基團(tuán)可通過-O-,-N-，或-S-聯(lián)接接連接到臨近的核苦。并不是寡核苷酸中所有的聯(lián)接都需要相同。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，寡核苷酸包括修飾的糖基，如，一個(gè)或一個(gè)以上羥基被卣素基團(tuán)、脂肪族基團(tuán)或有酯或氨基功能的基團(tuán)所取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，2'位的呋喃糖殘基被0甲基，O-烷基，O-烯基，S-烷基，S-烯基，或卣素基團(tuán)任意一個(gè)取代。2'修飾的糖的合成方法在例如，即，Sproat,等人的文獻(xiàn)Nucl.AcidRes.19:733-738(1991);cotton等人的文獻(xiàn)Nucl.AcidRes.19:2629-2635(1991)和Hobbs等人的文獻(xiàn)Biochemistry12:5138-5145(1973)中進(jìn)行了描述。產(chǎn)生2'"奮飾適體的SELEX方法在文獻(xiàn)中已作描述，例如，2002年12月3日4是出的美國臨時(shí)專利申請編號第60/430,76l號，2003年7月15日提出的美國臨時(shí)專利申請編號60/487,474;2003年11月4日提出的美國臨時(shí)專利申請編號60/517,039;2003年12月3號提出的美國專利申請編號10/729,581;2004年7月21日4是出的美國臨時(shí)專利申請第10/873,856號，標(biāo)題"體外篩選2'-氧-甲基取代核酸的方法"，和2005年6月30日提出的美國臨時(shí)專利申請編號60/696,292標(biāo)題為"改善含有核酸轉(zhuǎn)錄子的完全2'-修飾的原料和方法"，這里提到的每個(gè)專利通過在此引述全部并入本文。在該7>開方法中，在4爭錄;昆合物中可以-使用^f壬^T修飾纟且合生成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列庫，例如包括嘧啶核苷(2，-OH)，2'-脫氧嘧咬核苷(2'-脫氧)，2'-F和2'-氧甲基核苷酸。包含2，-OHA和G與2，-OMeC和U的轉(zhuǎn)錄混合物統(tǒng)稱為"rRmY"混合物，被其選擇的適體統(tǒng)稱為"rRmY"適體。包含2'曙脫氧A和G與2'-OMeU和C的轉(zhuǎn)錄混合物統(tǒng)稱為為"dRmY"混合物，相應(yīng)的被選擇適體統(tǒng)稱為"dRmY"適體。包含2'-OHG與2'-0MeA，C,和U的轉(zhuǎn)錄混合物統(tǒng)稱為"rGmH"混合物，相應(yīng)的^皮選擇適體統(tǒng)稱為"rGmH"適體。交替包含2'-OMeA，C，U和G與2'-OMeA，U和C以及2'-FG的轉(zhuǎn)錄混合物被命名為"交替混合物"，相應(yīng)的被選擇適體統(tǒng)稱為"交替混合物適體"。包含2'-OMeA，U,C，和G，其中10。/。以上的核糖核苷酸是G's的轉(zhuǎn)錄混合物統(tǒng)稱為"r/mGmH"混合物，相應(yīng)的4皮選擇適體統(tǒng)稱為"r/mGmH"適體。包含2'國FG與2'-OMeA,U，和C的轉(zhuǎn)錄混合物尋皮命名為"fGmH"混合物，相應(yīng)的被選擇適體統(tǒng)稱為"fGmH"適體。包含2'-脫氧與G2'-OMeA，U和C的轉(zhuǎn)錄混合物統(tǒng)稱為"dGmH"混合物，相應(yīng)的被選4奪適體統(tǒng)稱為"dGmH"適體。包含2'-脫氧A與2'-OMeC，G和U的轉(zhuǎn)錄混合物統(tǒng)稱為"dAmB"混合物，相應(yīng)的被選擇適體統(tǒng)稱為"dAmB"適體。包含所有2'-OH核苷酸的轉(zhuǎn)錄混合物統(tǒng)稱為"rN"混合物，相應(yīng)的^皮選^奪適體統(tǒng)稱為"rN"，"rRrY"或"RNA，，適體。含有2'-OH三磷酸腺苷和三磷酸鳥苷和2'-脫氧三磷酸胞苷和三磷酸胸苷的轉(zhuǎn)錄混合物統(tǒng)稱為rRdY混合物并且相應(yīng)凈皮篩選的適體統(tǒng)稱為"rRdY"適體。"mRmY"適體為除了起始核苦是2'-OH，僅包含2'-OMe核苦酸的適體。在那些例子中，RNA文庫用作起始文庫，其一般通過合成DNA文庫，可才喿作地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用T7RNA聚合酶或修飾的T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄DNA文庫，并且純化轉(zhuǎn)錄文庫而生成。當(dāng)以包含核酸起始序列庫的混合物開始時(shí)，SELEXtm方法包括步驟(a)混合物與靶點(diǎn)在適宜于結(jié)合的條件下接觸(b)從與靶分子特異結(jié)合的核酸中分離出未結(jié)合核酸；(c)分離核酸-靶點(diǎn)復(fù)合物；(d)擴(kuò)增從核酸-靶點(diǎn)復(fù)合物分離出的核酸，產(chǎn)生富集配體的核酸混合物；(e)多次循環(huán)重復(fù)結(jié)合，分開，分離，和擴(kuò)增步驟以產(chǎn)生對靶分子具有高特異性高親合力的核酸配體。在RNA適體-陂篩選的情況下，SELEXTM進(jìn)一步包括步驟(i)步驟(d)中的擴(kuò)增之前，反轉(zhuǎn)錄從核酸-靶點(diǎn)復(fù)合物中分離出的核酸；(ii)重新開始過程之前轉(zhuǎn)錄步驟(d)中擴(kuò)增的核酸。重復(fù)篩選和擴(kuò)增循環(huán)直到達(dá)到所需目的。在最常規(guī)的情況下，重復(fù)篩選/擴(kuò)增，一直到循環(huán)所得物的結(jié)合強(qiáng)度沒有明顯的改善為止。作為SELEX過程的一部分，可才喿作地最小化篩選出的結(jié)合耙點(diǎn)的適體，以確定有理想結(jié)合親合力的最小序列。纟皮選出的序列和/或最小化的序列通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變?nèi)芜x的進(jìn)行修飾以增加結(jié)合親合力或確定序列中結(jié)合活性的必需序列。例，"摻雜物再篩選"可用于探究適體或最小化適體所必需的序列。摻雜物篩選是一種SELEXTM體外篩選過程，釆用以主體適體序列為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì)合成的、退化的序列庫反復(fù)進(jìn)行篩選。退化水平在野生型核苷酸70%到85%的范圍內(nèi)。中性突變體或在一些情況下序列改變可引起親合力的提高。組合物序列的信息可用于鑒定最小的結(jié)合基序，對適體藥物化學(xué)也有幫助。適體藥物化學(xué)適體藥物化學(xué)用于提高適體性能，而獲得特殊的標(biāo)準(zhǔn)，例如，治療標(biāo)準(zhǔn)。在適體篩選之后，且通常在上面描述的可#:作的最小化和突變步驟之后，進(jìn)行適體藥物化學(xué)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，適體藥物化學(xué)采用一種策略，其中不同組的適體變異體由化學(xué)合成。這些組的變異體與其母適體的區(qū)別在于在起始核苦或其它殘基位點(diǎn)耳又代單一核苷或取代其他殘基。取代核苷酸或其他殘基不同于由至少一個(gè)化學(xué)修飾取代的核苦酸或其他殘基。在一個(gè)核普酸的背景下，化學(xué)^^飾可發(fā)生在核苷酸堿基、糖基、或磷酸位上。在本發(fā)明的方法中，化學(xué)修飾在一個(gè)核苷酸的》咸基位上的情況下，化學(xué)修飾不產(chǎn)生在A、U、G、C組內(nèi)或A、T、G、C纟且內(nèi)一個(gè)核苷酸耳又^另一個(gè)的互^:現(xiàn)象。在變異適體組內(nèi)，適體變異體由于取代核苦酸或其他殘基("取代的")的位置不同而彼此不同。性能，尤其結(jié)合親合力可能有了很大的改進(jìn)，以至于達(dá)到某一特定的治療標(biāo)準(zhǔn)是4艮有必要將單個(gè)取代基包含入內(nèi)。另外，從單取代變異適體獲得的信息可進(jìn)一步用來設(shè)計(jì)其他組的變異適體，在這些變異適體中可以同時(shí)引入一個(gè)以上的取代基。其中一種設(shè)計(jì)方案是將所有的單取代的適體變異體分類，選出前四個(gè)，并將這四個(gè)適體變異體盡可能以雙倍(6)，三倍(4)和四倍(l)的形式組合，合成組合物并4企測。在第二個(gè)設(shè)計(jì)策略中，最好的單取代適體變異體^:為母體，合成并一企測所有可能的雙取代適體變異體，包括最高級單取代適體變異體。在另一個(gè)設(shè)計(jì)策略中，單一取代變異體與其他單一取代變異組合，被合成出來并進(jìn)行分析，其中取代不顯著性不利影響結(jié)合親合性。此外，不顯著性不利影響結(jié)合親合性的單一取代變異體和/或增強(qiáng)結(jié)合親合性的那些取代可與第二類型取代聯(lián)合，被合成出并進(jìn)行分析。例如，肌苷取代或許與用2，-脫氧核苷酸取代2，-OMe核香酸聯(lián)合而相對于未取代起始適體或任一單取代母體，產(chǎn)生一個(gè)具有較高親合力的變異體。也可以使用其他策略，這些策略可能重復(fù)祐使用，隨著不斷對進(jìn)一步的改進(jìn)適體變異體的鑒定，取代的數(shù)目逐漸增加。例如，一些取4戈策略采用阻斷取^。特木;也，適體的二級結(jié)構(gòu)阻斷核苷從母體中被修飾阻斷的核苷取代。例如，預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)包括一個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，包括在預(yù)期莖中的核苷酸阻斷可由修飾核苷酸(例如，2'-OMe核苷酸)以及形成環(huán)的那些取4、。增強(qiáng)親合力的阻斷禍J呆留下來。不增強(qiáng)親合力的阻斷可進(jìn)一步在那個(gè)阻斷區(qū)域內(nèi)采用單一取代策略被表征出來。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定化取代，例如，耐核酸酶2'-OMe取代，可被引入到適體內(nèi)，相對于未取代起始適體，實(shí)際上減少取代適體的結(jié)合親合力。第二個(gè)取代，例如，硫代磷酸取代，可被引入到取代適體內(nèi)并分析結(jié)合親合力，其結(jié)合親合力等同于或高于未取代起始適體的結(jié)合親合力。適體的藥物化學(xué)尤其用于探究在局部而非全部引入取代基團(tuán)。因?yàn)檫m體是在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的的序列庫中發(fā)現(xiàn)的，任何SELEXTM過程引入的取代基必定是整體引入。比如，想要在核苷之間引入硫代磷酸酯連接，那么只能在每個(gè)A(或者每個(gè)G，C,T，U等)引入(整體取代)。如果適體需要在某些A(或每個(gè)G,C,T,U等)(局部取代)中引入疏代磷酸酯聯(lián)接，但又不允許其他的A之間引入，那么就不能通過該過程實(shí)現(xiàn)。適體的藥物化學(xué)過程中所用的取代種類不僅限于核苦酸，更確切地說它們是取代物，可做為固定相合成試劑并能將其引入到低聚物合成方案中。適體的藥物化學(xué)方案包括引入空間排阻，憎水性，親水性，親脂性，疏油性，正電荷，負(fù)電荷，中性電荷，兼性離子，極化性，抗核酸酶性，構(gòu)象剛性，構(gòu)象靈活性，蛋白結(jié)合特性，聚集等集團(tuán)。適體藥物化學(xué)方案可能包括堿基修飾，糖修飾或磷酸連接修飾。當(dāng)考慮在治療學(xué)適體中可能是有益的取代基種類時(shí)，優(yōu)選引入下面一種或一種以上取4、基(1)天然存在的取代基團(tuán)，比如2'-脫氧，2'-核糖，2'-氧曱基噤呤或嘧，定或2'-脫氧-5-曱基胞嘧啶。(2)已經(jīng)成為被批準(zhǔn)的治療劑的一部分的取代基團(tuán)，比如與硫代^岸酸連接的寡核苦酸。(3)能水解或降解成上述兩種類型之一的取代基團(tuán)，例如與甲石克^磷酸連4婁的寡核苦酸。本發(fā)明的適體能釆用本領(lǐng)域中周知的任何寡核苷酸合成技術(shù)，包括固相寡核苦酸合成技術(shù)而合成出來(參見，例如，F(xiàn)roehleretal，Nucl.AcidRes.14:5399-5467(1986)andFroehleretal，Tet.Lett.27:5575-5578(1986))和液相方法如三酯合成方法(參見，例如，Soodetal,Nucl.AcidRes.4:2557(1977)andHiroseetal,Tet.Lett"28:2449(1978))。適體治療試劑的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布調(diào)節(jié)很重要的一點(diǎn)是，對于所有基于包括適體在內(nèi)的寡核苦酸的治療，其藥代動(dòng)力學(xué)特性應(yīng)與期望的藥物應(yīng)用相匹配。針對細(xì)胞外靶點(diǎn)的適體不涉及細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)的困難(抗過敏和基于RNAi的治療就是例子)，這類適體仍然能分散于靶器官或組織，或在一端時(shí)期內(nèi)留在體內(nèi)(未經(jīng)《多飾)，與理想的定量給藥方案一致。因此，本發(fā)明提供了影響適體成分藥代動(dòng)力學(xué)的物質(zhì)和方法，特別是提供了調(diào)節(jié)適體藥代動(dòng)力學(xué)的能力。適體藥代動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)能力(即，調(diào)整能力)可通過將修飾基團(tuán)(如PEG共聚體)結(jié)合到適體和/或結(jié)合修飾核苷(如2，-氟或2，-氧-曱基)以改變核苷酸的化學(xué)成分來獲得。調(diào)節(jié)適體藥代動(dòng)力學(xué)的能力用于改進(jìn)現(xiàn)有藥物應(yīng)用，或者新藥物應(yīng)用的發(fā)展。例如，在一些藥物的實(shí)際應(yīng)用中，如在需要快速清除藥物的抗新生物的或緊急護(hù)理處置中，減少適體在循環(huán)中的滯留時(shí)間是非常需要的。另外，在一些藥物的實(shí)際應(yīng)用中，如，需要藥物系統(tǒng)循環(huán)的維持療法，增加適體在循環(huán)中的維持時(shí)間很有必要。此外，適體藥代動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)能力也用于調(diào)節(jié)適體藥物在研究主體體內(nèi)的生物分布。例如，在一些藥物的應(yīng)用中，需要改變適體藥物在體內(nèi)的生物分布以輩巴向于特定的組織或器官(或一組器官)。在這些應(yīng)用中，適體藥物在特定組織或器官積聚。在另一些藥物的應(yīng)用中，需要輩巴向于呈現(xiàn)出細(xì)月包標(biāo):^己物或與疾病相關(guān)癥狀的靶組織，有細(xì)胞損傷或其他病變的耙組織，這樣有利于適體藥物在受到影響的組織中聚積。如在2004年3月5日提出的名為"適體治療劑藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布的控制調(diào)節(jié)"的美國臨時(shí)申請第60/550,790號和2005年3月7日提出的名為"適體治療劑藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布的控制調(diào)節(jié)"的美國非臨時(shí)申請第11/075,648號中描述適體治療劑的PEG化產(chǎn)物(如，連接一個(gè)20kDaPEG聚合體的PEG化產(chǎn)物)用于靶向于炎性組織，從而有利于PEG化的適體藥物在炎性組織中的聚積。為確定適體藥物(如適體連4姿體或含有發(fā)生化學(xué){務(wù)飾的適體，如修飾核苷)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布圖象，監(jiān)測了各種參數(shù)。這些參數(shù)包括，例如，適體治療劑的半衰期(t^)，血漿清除率(CL)，分布體積(Vss),濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)，最大血清濃度或血漿濃度(Cma》，和平均滯留時(shí)間(MRT)。其中"AUC"指的是適體藥物血漿濃度-適體給藥后時(shí)間圖象下面積。AUC值用于估計(jì)生物利用度(即，適體藥物給藥后適體藥物在循環(huán)中的百分比)和所給適體藥物的總清除率(CL)(即，適體藥物從循環(huán)中清除的比率)。分布體積將適體藥物血漿濃度與體內(nèi)適體總量聯(lián)系起來。Vss越大，越容易在血漿中找到適體。本發(fā)明通過將適體與調(diào)節(jié)基團(tuán)，如小分子物質(zhì)、肽、或聚合物末端基團(tuán)相結(jié)合，或通過向適體內(nèi)引入修飾核苷，提供了以控制方式調(diào)節(jié)體內(nèi)經(jīng)穩(wěn)定化處理過的適體組合物的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布的材津+和方法。4艮據(jù)這里的殺又述，^務(wù)飾基團(tuán)的結(jié)合和/或改變核苷的化學(xué)組合物改變了適體在循環(huán)中的滯留時(shí)間和在纟且織中分布的才艮本方面。寡苷核酸藥物除了被核酸酶修飾清除也通過腎臟過濾來清除。因此抗核酸酶的寡苷核酸的給藥通常是靜3永注射，如果過濾不受到阻礙，其顯示的體內(nèi)半衰期小于IO分鐘?？梢酝ㄟ^促進(jìn)血流快速分布入組織或增加寡苷核酸分子表面積4吏其超過腎小球有效截面來實(shí)現(xiàn)阻礙過濾。下述的將小分子藥物連4妄到PEG聚合物上(PEG化產(chǎn)物)可以顯著的延長適體在循環(huán)中的滯留時(shí)間，因而減少了給藥次數(shù)并加強(qiáng)對血管革巴點(diǎn)的效力。適體可以連接多種修飾基團(tuán)-高分子量聚合物，如，PEG，肽，例如破傷風(fēng)抗毒素(HIV破傷風(fēng)抗毒素蛋白的13個(gè)氨基酸片段(Vives，etal,(1997),J.Biol.Chem.272(25):16010-7))，Ant(來自果蠅觸角基因同源蛋白第三個(gè)螺旋一個(gè)16個(gè)氨基酸序列(Pietersz,等人(2001)，Vaccme19(11畫12):1397-405)),疫苗19(11-12):1397-405))和精氨酸7(—個(gè)短的帶陽性電荷的可滲透入細(xì)胞的肽，由聚精氨酸(Arg7)組成)(Rothbard，等人(2000),Nat.Med.6(11):1253-7;Rothbard，J等人(2002)，J.Med.Chem.45(17》3612-8))，和小分子，如親脂混合物膽固醇。上述這些多種連接物，由于PEG基團(tuán)的復(fù)合作用使得適體在體內(nèi)的特性都發(fā)生了很大的變化。例如，2'F和2，-氧-曱基修飾的與20kDaPEG聚合物連接的適體阻礙了腎臟的濾過，促進(jìn)了健康組織和發(fā)炎組織的分布。而且20kDaPEG聚合物-適體連接體與40kDaPEG聚合的。盡管PEG化產(chǎn)物的一個(gè)作用在于對適體的清除上，但由于20kDa基團(tuán)的出現(xiàn)延長了適體在系統(tǒng)中的滯留時(shí)間，從而促進(jìn)了適體在組織中，尤其是高灌注器官和炎性部4立的分布。20kDaPEG聚合物連接體將適體定向運(yùn)輸?shù)桨l(fā)炎部位，PEG化的適體就4艮容易在炎性組織中積聚。在一些例子中，20kDaPEG化的適體連接體能到達(dá)細(xì)J包內(nèi)部，如腎臟細(xì)月包內(nèi)部。<多飾核苦可用于調(diào)節(jié)適體的血漿清除率。如，與未經(jīng)^修飾的適體相比，結(jié)合了2'-F和2，-OMe穩(wěn)定化學(xué)物質(zhì)的而未連4l"的適體(由于在體內(nèi)和體外都顯示了很高的核酸酶穩(wěn)定性，是目前該代適體的典型代表)顯示能快速從血漿清除(即，快速血漿清除率)并快速分布入組織，尤其是腎組織。PEG衍生的核酸如上述，帶有高分子量的非免疫原性聚合物的核酸書亍生物有改變核酸的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效特性的潛力，4吏其成為有-丈的治療劑。活性方面有益的變化包括增加了抵抗核酸酶降解的能力，減少了腎臟的濾過作用，減少了在免疫系統(tǒng)中的出現(xiàn)，改變了藥物在體內(nèi)的生物分布。發(fā)明的適體組合物可從聚烴基乙二醇("PAG")衍生而來。PAG衍生核酸的例子可在2003年11月21日提出的專利申請第10/718,833號中找到，該申請?jiān)谶@里通過引i正全部并入本文。發(fā)明中使用代表性聚合物包括聚乙二醇("PEG"),也被認(rèn)為是聚乙烯氧化物("PEO")，和聚丙烯乙二醇(包括聚異丙基乙二醇)。另外，在多種應(yīng)用中，可隨機(jī)或阻斷不同烴基氧化物(如乙烯氧化物和丙烯氧化物)的共聚物。最常見的形式，聚二醇(如聚乙二醇)是一個(gè)線形聚合物，每個(gè)末端終止于烴基HO-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH。這個(gè)聚合物a-，Q-二羥聚乙二醇，可用HO-PEG-OH代表，其中PEG-形式代表下列結(jié)構(gòu)單位-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-,其中n的取值范圍是4到10,000。如示，PEG分子是雙功能的，有時(shí)被稱為"雙羥基PEG"。PEG分子末端部分是相對無反應(yīng)性的羥基基團(tuán)，-OH)，可被基活或轉(zhuǎn)化為功能基團(tuán)，便于PEG或其他組合物在復(fù)合物中的反應(yīng)位點(diǎn)連接。這種激活的雙羥基PEG在此稱為雙激活PEGs。例如，通過使用N-羥基琥珀酰亞胺中琥珀酰亞胺活性酯基團(tuán)取代相對的非反應(yīng)羥基基團(tuán)(-OH),雙羥基PEG的末端基團(tuán)被激活，起到與氨基酸基團(tuán)選擇反應(yīng)活性碳酸酯的作用。在很多應(yīng)用中，需要用基本上無反應(yīng)性的基團(tuán)對PEG分子的一端封端，使PEG分子成為單功能性(或單激活)分子。蛋白質(zhì)藥物對激活的PEGs通常顯示多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，雙功能激活的PEGs導(dǎo)致廣泛的交叉連接，產(chǎn)生4艮少的功能基團(tuán)。為生成單激活PEGs,雙羥基PEG分子末端的羥基由非反應(yīng)甲基端基團(tuán)-OCH3取代。PEG分子的未封端末端轉(zhuǎn)化為反應(yīng)端，可被激活以便于蛋白質(zhì)分子在表面的反應(yīng)位點(diǎn)連接。PAGs是一種在水溶液和有才幾溶液中具有良好溶解性，無毒性，無免疫原性的聚合物。PAGs可將聚合體共價(jià)連接到不溶性分子上使PAG-分子連接體變成可溶的。例如，水溶性藥物紫杉醇連接到PEG上就變成水溶性的。Greenwald等人，J.Org.Chem.60'.331-336(1995)。PAG連4秦體不僅用于增加溶解性和穩(wěn)定性也用于延長分子在血液循環(huán)中的半衰期。本發(fā)明的聚烷基化合物的大'J、一般在5-80kDa之間，盡管可以使用任意大小，但是還是要根據(jù)適體和應(yīng)用來確定。發(fā)明的另一些PAG復(fù)合物大小在10-80kDa之間。還有其他發(fā)明的PAG復(fù)合物大小在10-60kDa之間。例如，一個(gè)PAG聚合體大小可能至少是IO，20，30，40，50,60，或80kDa。這種聚合體可以是線形化的或有支鏈的。在一些實(shí)施方案中，聚合體是PEG。在一些實(shí)施方案中，聚合體是支鏈PEG。在另一些實(shí)施方案中，如圖2所述，聚合物是40kDa的支鏈PEG。在一些實(shí)施方案中，如圖3所述，40kDa的支鏈PEG連接到適體的5'端。與生物蛋白藥物相比，核酸治療劑一般是由激活的核苷單體化學(xué)合成的。PEG-核酸連4妄體可通過^f吏用反復(fù)單體合成方法結(jié)合PEG來制備。例如，通過轉(zhuǎn)^^成脫氧核苦亞^粦酰胺形式^敫活PEGs,然后加入到固相寡核苦酸合成中?；蛘?，寡核苦酸合成是通過在特異位點(diǎn)加入反應(yīng)PEG結(jié)合位點(diǎn)。最常見的是通過在5'-末端加入主要的自由氨基酸(在固相合成最后連接步驟中使用修飾脫氧核苷亞磷酰胺而加入)。通過這種方式，反應(yīng)PEG(、激活后將與氨基酸反應(yīng)形成連接鍵)連接到純化的寡核苷酸上，連4妄反應(yīng)在溶液中進(jìn)行。PEG連接體改變藥物生物分布的能力與很多因素有關(guān)，包括連接體的表面大小(用術(shù)語水力半徑來測量)。大的連4妄體OlOkDa)已知能有效阻止腎臟過濾，從而增加小的高分子血漿半衰期(即肽，抗過壽文寡核苦酸)。已經(jīng)i正實(shí)，隨著PEG大小增加到50kDa左右，PEG連接體阻止過濾的能力也增加了(由于半衰期變成由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的新陳代i射決定，勝過由腎臟的清除決定，進(jìn)一步的增加只有很少的有益作用)。高分子量PEGs(〉10kDa)的生成是困難的，效率低下，且價(jià)格昂貴。作為合成高分子量PEG核酸連接體的一條途徑，先前的工作目的集中于生成更高的分子量激活的PEGs。生成這種分子的一種方法包4舌形成^L活的分支PEG，其中兩個(gè)或多個(gè)PEGs連接到帶有激活基團(tuán)的中心核。這些高分子量PEG分子的末端部分，如相對無反應(yīng)性的羥基(-OH)，可以激活或轉(zhuǎn)化為功能基團(tuán)，以便于一個(gè)或更多個(gè)PEGs連4姿到其他組合物的反應(yīng)位點(diǎn)上。分支的活化的PEGs可以多于兩個(gè)作用位點(diǎn)。當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)末端被:、激活，這種激活的高分子量PEG分子在此稱為多激活PEGs。在一些情況中，分支的PEGs分子中并不是所有的作用位點(diǎn)都被激活。在任意兩個(gè)位點(diǎn)都被激活的情況下的PEG分子被稱為雙激活PEGs。在只有一個(gè)位點(diǎn)激活的情況下，這種PEG分子^皮稱為單^t活PEGs。這種途徑的一個(gè)例子是，通過連4妄單曱氧基PEGs到賴氨酸中心來制備激活PEG,該中心:故激活以利于隨后的反應(yīng)(Harris等人，Nature,vol.2:214-221,2003)。本發(fā)明提供了另一種合成高分子量PEG-核酸連接體(優(yōu)選，適體)的經(jīng)濟(jì)有效的路線，包括多PEG化核酸。本發(fā)明也包括PEG-連接的多亞基寡核苦酸，如二聚化適體。本發(fā)明與高分子量組合物相關(guān)，該組合物中PEG經(jīng)穩(wěn)定化處理的基團(tuán)作為4妄頭將適體4要照不同比例分開。如PEG連4妻在一個(gè)適體序列內(nèi)，高分子量適體組合物的線形組合是核酸-PEG-核酸(-PEG-核酸)n,其中n大于等于1。發(fā)明的高分子量組合物包括分子量至少10kDa的組合物。代表性的組合物分子量大小在10到80kDa之間。發(fā)明的高分子量組合物至少是IO,20，30，40,50,60，或80kDa大小。穩(wěn)定化處理的基團(tuán)是一種分子或分子的一部分，改進(jìn)了本發(fā)明高分子量適體的藥代動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)特性。在一些情況中，穩(wěn)定化處理的基團(tuán)是一種分子或分子的一部分，能將兩或多個(gè)適體或適體區(qū)域相互4矣近，或減少發(fā)明高分子量適體組合物的總轉(zhuǎn)動(dòng)自由度。一個(gè)穩(wěn)定化處理的基團(tuán)可以是聚烴基乙二醇，例如聚乙二醇，這種聚乙二醇可以是線形的或有支鏈的，均聚物或雜聚物。另一些穩(wěn)定化處理的基團(tuán)包括聚合物例如肽核酸(PNA)。寡核苷酸可以是穩(wěn)定化處理的基團(tuán)；這種寡核苷酸可包括修飾核苦酸，和/或疏代磷酸脂類的修飾聯(lián)接。穩(wěn)定化處理的結(jié)構(gòu)可以是適體組合物的完整的一部分，即共^介連接到適體上。發(fā)明的組合物包括高分子量適體組合物，其中兩或多個(gè)核酸基團(tuán)共價(jià)連接到至少一個(gè)聚烴基乙二醇基團(tuán)上。聚烴基乙二醇基團(tuán)起到穩(wěn)定基團(tuán)的作用。在組合物中聚烴基乙二醇基團(tuán)任意一端共價(jià)連接到適體，這樣聚烴基乙二醇基團(tuán)將核酸在一個(gè)分子中連接起來。有人說聚烴基乙二醇基團(tuán)是一個(gè)連接基團(tuán)。在這樣的組合物中，共價(jià)分子的基本結(jié)構(gòu)包括線形排列的核酸-PAG-核酸。包含基本結(jié)構(gòu)核酸-PAG-核酸的組合物就是一個(gè)例子。另一個(gè)例子是線形排列的核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。為了生成核酸-PEG-核酸連接體，先合成核酸，這樣就提供了一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)(即單激活)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該反應(yīng)位點(diǎn)是5'末端的一個(gè)氨基酸基團(tuán)，它是通過在寡核苷酸固相合成最后一步添加^奮飾劑脫氧核苷亞石岸酰胺而引入的。脫4呆護(hù)和純化^修飾寡核苷酸后，在高濃度的能減少激活的PEG自發(fā)水解的溶液中再生成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核香酸濃度是lmM，再生溶液濃度包含200mM緩沖液和NaHCO3緩沖液，pH8.3.連4妄體的合成通過緩慢的加入高度純化的雙激活PEG引發(fā)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，雙羥基PEG通過在兩端琥珀酰亞胺丙酸鹽的書t生而〖敫活。反應(yīng)后，PEG核酸連接體通過凝膠電泳或液相色譜純化分離出完全連接體，部分連接體和非連接體。多PAG分子(隨機(jī)或阻斷共聚體)或小PAG鏈可被連接以獲取不同的長度(或分子量)。非PAG4妄頭可用于不同長度的PAG鏈之間。2'-0-甲基，2'-氟和其他經(jīng)修飾的核苷酸i奮飾物穂、定了適體抵抗核酸酶降解的能力，延長了體內(nèi)半衰期。3'-3'-dT帽、脫堿基或氨基基團(tuán)也增加了核酸外切酶的抵抗力。參見美國專利第5674,685號；第5,668,264號；第6，207，816號和第6,229,002號，其中每個(gè)都通過在此引i正而全文合并于本文。反應(yīng)性核酸的PAG衍生作用高分子量PAG-核酸-PAG連接體可通過單功能激活的PEG與含有多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)核酸的反應(yīng)來制備。在實(shí)施方案中，核酸是雙反應(yīng)的或雙激活的含有多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)通過傳統(tǒng)的脫氧核苷亞磷酰胺合成方法引入到寡核苷酸上的一個(gè)5'-氨基酸基團(tuán)和一個(gè)3'-氨基酸基團(tuán)，例如在圖4所示的3'，5'二PEG化產(chǎn)物。在另一些實(shí)施方案中，可在內(nèi)部引入反應(yīng)位點(diǎn)，如在嘧"定的第54立，嘌呤的第8位，或核糖的2'位點(diǎn)引入主要氨基酸的結(jié)合位點(diǎn)。在這些實(shí)施方案中，核酸可有幾個(gè)激活的或反應(yīng)〗立點(diǎn)，有人"i兌可祐多激活。合成和純化后，在促進(jìn)與寡核苷酸反應(yīng)選擇性反應(yīng)同時(shí)也減少了自發(fā)水解的條件下，^修飾寡核苷酸與單位點(diǎn)激活的PEG連接。在優(yōu)選實(shí)施方案中，單甲氧化PEG由羥基琥珀酰亞胺丙酸鹽激活，連接反應(yīng)在pH8.3進(jìn)行。為了促進(jìn)雙取代PEG的合成，4是供了相對于寡核苷酸計(jì)量過量的PEG。反應(yīng)之后，PEG-核酸連才妄體經(jīng)凝月交電泳或液相色i普分離出完全，部分和非連4妾才羊本。在這里供連4妻的連4妻區(qū)域可有一個(gè)或一個(gè)以上聚烴基二醇基團(tuán)。這種PAGs可有不同的長度，也可用于合適的連々妄體中以獲得理想的不同分子大小的組合物。特定連接體的效果可受到其化學(xué)成分和長度的影響。很長、很短、或與輩巴分子形成不宜的空間結(jié)構(gòu)和/或離子間相互作用的適體會(huì)排出適體與靶分子形成復(fù)合物的可能。連接體如果長于核苷酸之間的距離就會(huì)通過減少配體的有效濃度而降低連4妄的穩(wěn)定性。因此，通常有必要優(yōu)化接頭成分和長度以使適體最大程度的連接到靶點(diǎn)上。藥物組合物本發(fā)明也包括含有本發(fā)明修飾的適體分子的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，這些組合物更適于內(nèi)用，包4舌有效劑量的本發(fā)明的有藥物活性的化合物，單獨(dú)或同一個(gè)或一個(gè)以上藥學(xué)可接受載體組合使用。尤其是由于化合物的低毒性使得其非常有用。本發(fā)明的組合物可用于治療，預(yù)防和/或改進(jìn)病癥，比如疾病或不適，也可以減輕這些疾病患者的癥;j犬。發(fā)明的組合物可以用于對患有某種疾病或不適的患者給藥，這種疾病或不適和特異結(jié)合了發(fā)明適體的靶點(diǎn)有關(guān)或是有其引起的。該方法包括對病人或患者給藥能夠結(jié)合病癥所包括的耙點(diǎn)(例如，蛋白)的適體或包括適體的混合物，由于適體與耙點(diǎn)之間的結(jié)合改變了輩巴點(diǎn)的生物功能，/人而治療了病癥。有病癥的患者或主體，即，本發(fā)明方法處理的病人或主體可以是脊推動(dòng)物，更尤其是哺乳動(dòng)物，或更尤其是人。實(shí)際上，適體或其藥學(xué)上可接受的鹽都是在其足可以發(fā)揮生物學(xué)活性的劑量下應(yīng)會(huì)藥，其中其生物學(xué)活性例如抑制適體耙點(diǎn)與輩巴點(diǎn)受體的結(jié)合。本發(fā)明的治療或藥物組合物通常包括有效劑量治療的適體，溶于或分散于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中。藥學(xué)上可接受的介質(zhì)或載體還包括任何的或所有的溶劑，分散介質(zhì)，包衣材料，抗細(xì)菌或真菌試劑，等滲試劑或吸收延長試劑等等。這些介質(zhì)或試劑用作藥物活性底物在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。增加的活性成分也可以力口入到本發(fā)明的治療組合物中。依照本文的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚藥物或藥學(xué)組合物的制備。一般地，這些組合物可以制備成液態(tài)或懸浮態(tài)的注射劑；注射前能溶解或懸浮于液體中的固體試劑；口月良的片劑或其他固體試劑；控時(shí)釋放膠嚢；或當(dāng)前使用的其他形式，包括滴眼液，乳液，洗液，藥膏，吸入劑等等。外科大夫，內(nèi)科大夫或衛(wèi)生健康工作者使用消毒劑，比如鹽洗液，處理手術(shù)區(qū)的特定部位可能是有效的。組合物也可以通過孩i:型裝置，孩史?；蛭阶饔脕斫o藥。治療試劑將4要照與處方劑量相一致的方式，在能起到藥理學(xué)作用的劑量下給藥。制劑可以4艮容易地以多種不同劑型的給藥，如上述可注射溶液類型，但也可以使用藥物緩釋膠嚢或類似類型。在這種背景下，活性成分的量和^合藥的組合物的體積取決于要處理的宿主動(dòng)物。給藥所需活性化合物需要的精確的量取決于執(zhí)行者所做的判斷并因個(gè)體不同而有差異。通常使用分散活性化合物所需要的最小的體積的組合物。雖然適宜的給藥方案也不同，但典型的給藥方案是先執(zhí)行化合物給藥并監(jiān)測結(jié)果然后再按一定的時(shí)間間隔上進(jìn)一步控制藥物劑量。藥物組合物是已滅菌的和/或包含輔劑，如防腐劑，穩(wěn)定劑，潤濕劑或乳化劑，促溶劑，調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖液。另外，藥物成分也包含其他有治療價(jià)值的物質(zhì)。藥物組合物按傳統(tǒng)的混合，制粒，包衣方法進(jìn)行制備，活性成分一般占0.1%至75%,優(yōu)選占1%至50%。液體，尤其是注射組合物可通過例如溶解，分散等來制備?；钚越M合物溶解于或混合于藥學(xué)純?nèi)軇?，如，水，鹽溶液，葡萄糖液，甘油，乙醇等，從而形成可注射，溶液或懸浮液。另外，還可制成適合在注射前溶解于液體中的固體。本發(fā)明的組合物可通過靜脈(注射和輸液)、腹腔、皮下或月幾肉內(nèi)注射的形式給藥。這幾種形式都是藥學(xué)上為人熟知的普通纟支術(shù)。注射劑可按照傳統(tǒng)的方式，以液體溶液的方式或懸浮液的形式來進(jìn)行制備。非腸胃癥合藥通常用于皮下注射，月幾肉注射或靜月永注射和輸液。另外，非腸胃給藥的一種方法使用了緩慢釋放或持續(xù)釋;改系統(tǒng)的植入，保i正了藥物維持在一個(gè)恒定的濃度，依據(jù)美國專利第3,710,795號所述，在這里該專利通過引用合并于本文中。此外，本發(fā)明的優(yōu)選化合物可以〗吏用本領(lǐng)i或普通4支術(shù)人員已知的方式通過適當(dāng)?shù)谋怯霉ぞ?，吸入器鼻部局部^會(huì)藥，或通過透皮貼劑形式由真皮途徑鼻內(nèi)》會(huì)藥。皮月夫貼劑通過透皮途徑給藥，在該領(lǐng)域里都是為人熟知的技藝。使用經(jīng)皮運(yùn)輸系統(tǒng)的形式纟會(huì)藥，整個(gè)劑量方案中劑量^會(huì)藥應(yīng)該是連續(xù)的而不是間斷。另一些優(yōu)選的局部制劑包括乳劑，藥膏，洗劑，氣霧劑和凝"交體，其中活性成分典型的濃度在0.01%至15%,w/w或w/v范圍內(nèi)。對于固體組合物，賦形劑包括藥用級的甘露糖，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖化鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂等等。上文所定義的活性化合物可以使用栓劑作為栽體，聚烴基二醇就使用栓劑作為載體，例如丙二醇。在一些實(shí)施方案中，栓劑很容易從脂肪酸乳劑和懸浮液中制備。本發(fā)明化合物也可以通過脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)給藥，比如小單層脂質(zhì)體，大單層脂質(zhì)體，多層脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可通過多種磷脂形成，包括膽固醇，硬脂醇或卵磷脂。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)組合物薄膜與藥物的水溶液結(jié)合形成脂質(zhì)層包裹藥物，在美國專利第5,262,564號中有此描述。比如，在此描述的適體分子可以以復(fù)合物的形式被提供，該復(fù)合物是適體與通過使用為人熟知的方法構(gòu)造的親脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物相連形成的。此外，脂質(zhì)體可將適體運(yùn)送到其表面上來內(nèi)部耙向和運(yùn)送細(xì)胞毒素藥劑從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在美國專利第6，011,020號中提供了一個(gè)核酸相關(guān)復(fù)合物的例子。本發(fā)明的組合物也可作為靶向性藥物載體與可溶性聚合物相連。這樣的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羥丙氨-甲基丙烯酰胺-苯酚，多羥基乙氨基苯酚(polyhydroxyethylaspanamidephenol)、棕櫚?；?戈的聚環(huán)氧乙烷聚賴氨酸(polyethyleneoxidepolylysine)。jt匕夕卜，本發(fā)明的纟且合4勿可連4妄到一類能生物降解的聚合物上，有利于實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放，比如，聚乳酸，聚s-己內(nèi)酯，多羥基酪酸，聚原酸酯，聚縮醛(樹脂)，聚二羥基吡喃，聚丙烯酸脂和交聯(lián)的或兩性的凝"交共聚物。必要時(shí)，給藥的藥物組合物也可以包括小量的無毒副作用物質(zhì)，如潤濕劑，乳化劑，pHi爰沖試劑，和其他的例如醋酸鈉和三羥乙基胺油酸鹽的底物。所-使用適體的癥會(huì)藥方案是依據(jù)一系列因素來選擇的，包括類型，種類，年齡，重量，性別和病人的體檢狀況；需要治療的嚴(yán)重程度；給藥途徑；病人的肝功和腎功；使用的特定適體和鹽。普通的技術(shù)熟練的醫(yī)師或獸醫(yī)可以很容易確定并指出治療，預(yù)防，預(yù)測或拖延病情需要藥物的有歲丈劑量。為了達(dá)到指定歲文果所用的本發(fā)明的口"良劑量在0.05-7500mg/day的范圍內(nèi)。組合物優(yōu)選地以裂痕片的形式提供，其中含有0.5,1.0，2.5，5.0，10.0,15.0,25.0，50.0，100.0,250.0，500.0和1000.0mg的活性成分。輸液用量，鼻內(nèi)用量和經(jīng)皮吸收用量在0.05-7500mg/day范圍內(nèi)。皮下，靜脈和腹腔膜的用量則在0.05-3800mg/day范圍內(nèi)。本發(fā)明化合物的有效血漿水平在0.002mg/mL至50mg/mL范圍內(nèi)。本發(fā)明的4匕合物以每日一次的劑量形式給藥，或?qū)⒚咳湛倓┝糠譃閮纱危位蛩拇谓o藥。所有在此引用的專利和刊物都被在此引證而全部合并與本文，就如同每個(gè)專利文件和刊物都被分別明確逐個(gè)的引證而合并于本文。引用刊物和專利文件并不表明其是現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，也不表明對其內(nèi)容或日期的i人可。本發(fā)明已通過書面描述的方式進(jìn)行描述，本領(lǐng)域:忮術(shù)人員將意識到本發(fā)明可在多種不同實(shí)施方案中實(shí)踐。前面的描述和下面的實(shí)施例都是用以闡述的而不是對所附權(quán)利要求的限制。實(shí)施例三個(gè)適體ARC979、ARC445和ARC1172,每個(gè)對不同的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)具有高度親合力和特異性，按照SELEXTM方法被鑒別出來和最小化。ARC979(SEQIDNO1)是IL-23的一種34個(gè)核苷酸的適體，其含有2'-脫氧嘌f令和2'-OMe嘧t定("dRmY"組合物)，具有下列序列5'-ACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGU畫3。ARC445(SEQIDNO2)為IgE的一個(gè)23個(gè)核苷酸的適體，其含有2'-脫氧噪呤和2'-OMe嘧啶("dRmY"組合物)，具有下列序列5'-AGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCU-3'。ARC1172(SEQIDNO3)為vonWillebrand因子(，VWF")的一個(gè)41個(gè)核苦酸DNA適體，具有下列序列5'-GGCGTGCAGTGCCTTCGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC畫3'。如下面描述的，適體藥物化學(xué)應(yīng)用于ARC979、ARC445、和ARC1172，相對于他們各自母體或起始適體，生成具有豐交好性能的衍生適體。這里描述的適體對其各自靶點(diǎn)的結(jié)合親合力采用定點(diǎn)雜交結(jié)合試驗(yàn)通過確定適體靶點(diǎn)解離常數(shù)((KD)測量出來。對于KD確定，化學(xué)合成適體釆用變性聚丙烯酰胺凝月交電泳進(jìn)4亍純化，采用y-"PATP在5端標(biāo)記，與一系列稀釋的靶點(diǎn)蛋白混合并在下面描述的結(jié)合反應(yīng)條件下，室溫下培養(yǎng)30分鐘。采用MinifoldIdot-blot，96孔真空過濾裝置(Schleicher&Schuell,Keene,NH),經(jīng)硝化纖維素過濾分析該結(jié)合反應(yīng)。采用三層多濾介質(zhì)，由底到上由Protran硝？匕纖維素、(Schleicher&Schuell)、Hybond國Pnylon(AmershamBiosciences)和GB002gelblotpaper(Schleicher&Schuell)組成。結(jié)合蛋白質(zhì)的RNA在硝化纖維素過濾器上^皮捕獲，然而，無蛋白質(zhì)結(jié)合RNA在尼龍過濾器上被捕獲。gelblotpaper簡單作為其他過濾器的支撐介質(zhì)。過濾之后，過濾器層被分離、干燥并置于熒光屏上(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)并采用Storm860Phosphorimagerblot成像系統(tǒng)(AmershamBiosciences)確定數(shù)量。實(shí)施例1:由硫代磷酸取代增強(qiáng)適體把點(diǎn)親合力實(shí)施例IA:抗IL-23適體ARC979中的石克代磷酸取代—組引入單一硫代磷酸取代的ARC979(SEQIDNOl)衍生適體(GlenResearch,Sterling,VA)通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)化學(xué)合成得到。在每組書f生物中，單一辟uK嶙酸取^在每個(gè)核苷酸內(nèi)連接位處有系統(tǒng)地被引入，每個(gè)核苷酸內(nèi)連接位點(diǎn)生成在一個(gè)不同核苷酸內(nèi)位點(diǎn)處具有碌i/R/粦酸取代的一個(gè)適體的組內(nèi)的每個(gè)杏f生物。在上面描述的斑點(diǎn)雜交試—瞼在下面結(jié)合反應(yīng)條件下，將這些衍生物凝膠純化并分析IL-23結(jié)合IXPBS(無Ca—或Mg—)加0.lmg/mLBSA,在室溫下培養(yǎng)30分鐘。對于ARC979衍生物結(jié)合，被結(jié)合適體分?jǐn)?shù)vs.全長人IL-23濃度^入下列方程中計(jì)算出KD:片段適體結(jié)合率=幅度，[IL-23]/(KD+[IL-23]))+原有結(jié)合.當(dāng)與起始適體ARC979的結(jié)合親合力比較，ARC979中包含單一硫代磷酸取代不能不良影響大部分位點(diǎn)中的結(jié)合親合力(例如，導(dǎo)致顯著性較高KD值)。六個(gè)位點(diǎn)處的兩個(gè)核苷酸之間的核苷酸內(nèi)結(jié)合中點(diǎn)硫代磷酸取代(如表1和圖5中顯示的)導(dǎo)致耙點(diǎn)結(jié)合親合力提高{例如，較低Ko值)。與母體ARC979對比，顯示出增強(qiáng)的親合力的ARC979單一石危代^疇酸書f生物的核香酸序列在表1中列出。除非另外指出，表1中列出的每個(gè)序列是以5'-3'方向。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包4舌具有如下面表1中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，還包括含有表1描述適體的核酸序列還包括3'帽子，{如反向dT帽子(3T)),和/或5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。小寫字母"m",和"d"分別表示2-0-曱基和2'-脫氧修飾，"s"表示一個(gè)核苦酸間硫代磷酸取代。表1:被'歸選的ARC979硫代蜂酸取代衍生物的K;<table>complextableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>「001141實(shí)施例IB:抗vWF適體中的硫代磷酸取代一組引入單一石克代磷酸取代的ARC1172(SEQIDNO3)衍生適體(GlenResearch,Sterling,VA)通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)化學(xué)合成得到。在每組書亍生物中，單一石充代石粦酸取代在每個(gè)核苷酸內(nèi)連才妻位處有系統(tǒng)地被引入，每個(gè)核苦酸內(nèi)連接位點(diǎn)生成在一個(gè)不同核苦酸內(nèi)位點(diǎn)處具有石危代磷酸取代的一個(gè)適體的組內(nèi)的每個(gè)書于生物。在上面描述的斑點(diǎn)雜交試—驗(yàn)在下面結(jié)合反應(yīng)條件下，將這些4汙生物凝膠純化并分析vWF結(jié)合lXDulbecco'sPBS緩沖液，其包括0.1mg/mLBSA,Ca十+和Mg++,在24。C下用標(biāo)記適體培養(yǎng)30分鐘。對于ARC1172衍生適體的Ko值通過采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51，SynergySoftwareM戈入下列方考呈y=(max/(l+K/protein))+yint中計(jì)算出來。當(dāng)與起始適體ARC1172比較，ARC1172中系統(tǒng)包含的單一硫代磷酸取代不能不良影響大部分位點(diǎn)中的結(jié)合親合力并產(chǎn)生一個(gè)具有提高的(例如，較低的)Ko值的適體。如表2中指出的，214立點(diǎn)處的G和22^f立點(diǎn)處的T之間單一石克^石粦f臾取^六個(gè)位點(diǎn)處的兩個(gè)核苦酸之間的核苦內(nèi)結(jié)合中點(diǎn)石克^磷酸取代導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)接過，相對于母體分子ARC1172,其顯示出可測量的親合力的改善(例如，4交低Kd植)在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如下面表2中描述的具有y-"P核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表2中描述的適體的核酸序列還包括5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。在一些實(shí)施方案中，表2中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，3'反向dT帽子(3T))。小寫字母"d"表示2'-脫氧修飾，"s"表示一個(gè)核苷間硫代磷酸取代。表2:ARC1172和ARC1759的結(jié)合親合力<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>ARC1172(SEQIDNO3)中進(jìn)行的多重修飾，包括2'-OMe穩(wěn)定性取^，獲得ARC1361(SEQIDNO12)。ARC1361(SEQIDNO12)作為堿基序列，引入單一硫代磷酸磷酸骨架修飾，導(dǎo)致產(chǎn)生一組19個(gè)石克代石粦酸耳又代的ARC1361書f生物，每一個(gè)在不同位點(diǎn)處具有一個(gè)疏代磷酸取代。如下面表3中發(fā)現(xiàn)的，多重修飾引入到ARC1172中獲得ARC1361,該ARC1361導(dǎo)致結(jié)合親合力約減少4倍。相對于大概等于ARC1172(SEQIDN03)母體適體的結(jié)合親合力的ARC1361(SEQIDNO12)起始適體，單一硫^石壽酸:f又代才是高了ARC1368(SEQIDNO13)的結(jié)合親合力超過4倍。表3:ARC1172、ARC1361和ARC1368的結(jié)合親合力<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)施例2:肌芬取代增強(qiáng)適體靶點(diǎn)親合力實(shí)施例2A:抗-IgE適體ARC1335中2'-脫氧肌苷取代在用2'-脫氧肌苦(dl)取代2'-脫氧嘌呤殘基的期間，與ARC1335母體分子對比，用月幾苷取^噤呤殘基乂于ARC1335(SEQIDNO14)衍生物的結(jié)合親合力的影響被測定出來。ARC1335為含有在ARC445核苷酸位點(diǎn)1、2、7、10、14和17位點(diǎn)處用2'-〇Me取代2'-脫氧噤呤殘基的ARC445衍生物。在某一時(shí)刻，用2'-脫氧肌香取代每個(gè)2'-脫氧鳥嘌呤核苷的一組適體衍生物被合成出來并采用斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)測試結(jié)合性，先前描述的結(jié)合反應(yīng)條件(Dulbecco'sPBS(Ca+十和]\^++)加0.1mg/mLBSA，室溫下培養(yǎng)30分鐘來測試是否2'-脫氧肌苷取代提高了人IgE的親合力和效能。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51，SynergySoftware),代入到方程中計(jì)算出kd值。在dl系列的書f生物中，取氏不利影響^f立點(diǎn)6-9處的結(jié)合親合力(例如，提高了Kd植)，然而他們不能容受位點(diǎn)16-21處的取代(例如，校低Kd植)。如下面表3中觀察到的，dl系列結(jié)果產(chǎn)生許多幾乎相等的親合力的結(jié)構(gòu)(ARC1562、ARC1564、和ARC1566)并且相對于如在ARC1335(母體適體)中的兩個(gè)2'-OMe取代產(chǎn)生的提高的結(jié)合親合力，提高了親合力(ARC1566),并且相對于初始適體ARC445(SEQIDNO2)，很大程度提高了親合力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有下面表4中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表4中描述的適體的核酸序列，還包括3'帽子(例如，反向dT帽子(3T))，和/或5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原性化合物(即，PEG)上。在其他實(shí)施方案中，表4中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，3'反向dT帽子(3T))。小寫字母"m"，和"d"分別表示2-0-曱基和2'-脫氧修飾，"I"表示一個(gè)肌苷取代鳥嘌呤核苷。表4:ARC445肌苦衍生物序列和KD總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>實(shí)施例2B:抗-IL-23適體ARC979中-2'脫氧肌苷取代在用2'-脫氧肌苷(dl)取代2'-脫氧噤呤殘基的期間，與ARC979母體分子對比，用肌苷取代嘌呤殘基對ARC979(SEQIDNO1M汙生物的結(jié)合親合力的影響^皮測定出來。一組適體書f生物，其中ARC979的每個(gè)鳥嘌呤核苷，在某一刻，用2'-脫氧月幾苦取代并且每個(gè)腺苷被2'-脫氧肌苷取代的一組適體書f生物被合成出來并測試結(jié)合性。先前表述的斑點(diǎn)雜交試一驗(yàn)用于表征合成的書f生物適體的相對結(jié)合親合力并且每一個(gè)在相同結(jié)合試一驗(yàn)中同時(shí)與母體分子ARC979比較。對于Ko確定，化學(xué)合成適體釆用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化，釆用y-"PATP在5端標(biāo)記，在先前描述的纟爰沖液條件下(Dulbecco'sPBS(Ca—和Mg++)>0.1mg/mLBSA，室溫下培養(yǎng)30分鐘)，在斑點(diǎn)雜交試l^中采用蛋白質(zhì)滴定測試對全長人IL-23的直4妾結(jié)合。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware),入到方禾呈y=(max/(l+Kyprotein))+yint中計(jì)算出KD值。在ARC979的情況中，用2'-脫氧肌*系統(tǒng)取代2'-脫氧鳥嘌呤核苷不能不良影響結(jié)合親合力的顯著性提高。然而，如從下面表5中計(jì)算的K。值可觀察出，與ARC979親合力比較，用2'-脫氧肌苷系統(tǒng)取代2'-脫氧腺苷產(chǎn)生具有提高親合力(例如，較低Ko值)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)，ARC1652和ARC1654。除非另外指出，表5中的序列是以5'-3'方向。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有如下面表5中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表5描述的適體的核酸序列還包括的3'帽子，{如反向dT帽子(3T)),和/或5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。小寫字母"m",和"d"分別表示2-0-曱基和2'-脫氧修飾，"I"表示一個(gè)肌苷取代腺苦。表5:ARC979/ARC13862'-脫氧肌苷衍生物的序列和Ko總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>*30分鐘RT培養(yǎng)確定Kd但*1XDulbecco'sPBS(Ca+十和Mg十+)加0.1mg/mLBSA反應(yīng)緩沖液實(shí)施例2C:抗-IL-23適體ARC1386中的2'-OMe肌脊取代ARC1386(具有3'-反向dT的ARC979)先前確定容受特歹未^f立點(diǎn)上的2'-OMe取^。ARC1386中的2'-OMe殘基用2'-OMe肌苦殘基(ml)(GlenResearch,Sterling,VA)系統(tǒng)取代而導(dǎo)致產(chǎn)生一組化學(xué)合成衍生物適體，這種化學(xué)合成衍生物適體具有在每個(gè)不同2'畫OMe殘基上用2'國OMe肌苦取代的適體。2'-OMe肌苦取代對結(jié)合親合力的影響采用斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)進(jìn)行確定。先前表述的定點(diǎn)雜交試驗(yàn)用于表征合成適體與母體分子ARC979比較的相對效能。對于Ko確定，化學(xué)合成適體采用變性聚丙烯酰胺凝月交電泳進(jìn)4亍純化，采用y-"PATP在5端標(biāo)記，在Dulbecco'sPBS(Ca"和Mg+"和0.1mg/mLBSA中，在定點(diǎn)雜交試驗(yàn)中采用蛋白質(zhì)滴定測試對全長人IL-23的直接結(jié)合。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware),代入到方程y=(max/(l+K/protein))+yint中計(jì)算出KD{直。在兩個(gè)例子中，與母體分子ARC1386進(jìn)行比較，用2'-OMe肌苷單一取代2'-OMe尿嘧啶核苷產(chǎn)生具有提高親合力(例如，較低Ko值)。母體適體被實(shí)施每個(gè)定點(diǎn)雜交試驗(yàn)。這種結(jié)構(gòu)的序列和相應(yīng)的結(jié)合親合力在下表6中列出，其中相對于ARC1386,2'-OMe肌苷提高了結(jié)合親合力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有如下面表6中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表6描述的適體的核酸序列還包括5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原性化合物(即，PEG)上。在其他實(shí)施方案中，表6中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，3'反向dT帽子(3T))。小寫字母"m"，和"d"分別表示2-0-甲基和2'-脫氧修飾，T表示一個(gè)力幾苦取4義鳥噪p令核苦。表6:ARC9792，-OMe月幾苷f汙生物的序列和K?？偨Y(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實(shí)施例3:2'-脫氧二氬尿嗜啶核苷取代提高了適體靶點(diǎn)親合力如與母體ARC1386分子進(jìn)行比較，用2'-脫氧二氫尿嘧啶核苦(dhU)系統(tǒng)取代2'-OMe尿嘧啶核苷殘基，檢查出對具有3'-反向dT衍生物的影響。2'-OMe尿嘧啶核苷殘基被2'-脫氧二氫尿嘧咬核苷(GlenResearch,Sterling,VA)系統(tǒng)取代而導(dǎo)致產(chǎn)生一組化學(xué)合成衍生適體，該組的每一個(gè)適體具有在ARC1386中不同2'-OMe尿嗜啶核苦位點(diǎn)處的被取代2'-脫氧二氫尿嘧啶核苷。相對于母體分子ARC1386,先前描述的定點(diǎn)雜交試馬全用于表征大部分合成適體的相對較能。對于Ko確定，化學(xué)合成適體采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)4亍純化，采用y-"PATP在5端標(biāo)記，在先前描述的緩沖液條件下Dulbecco'sPBS(Ca—和Mg++)和0.1mg/mLBSA，在斑點(diǎn)雜交試-驗(yàn)中采用蛋白質(zhì)滴定測試對全長人IL-23的直接結(jié)合。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51，SynergySoftware),代入到方程y=(max/(l+Kyprotein))+yint中計(jì)算出Kd但。該結(jié)構(gòu)的序列和相應(yīng)結(jié)合親合力，其中相對于ARC1386，2'-脫氧二氫尿嘧啶核苦取代提高的結(jié)合親合力在下面的表7中被列出。如在表7中觀察到，如相對于母體分子ARC1386，用2'-OMe尿嘧咬核苷:f又代2'-脫氧二氫尿嘧啶核苷提高了結(jié)合親合力(例如，較低Ko值)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有如下面表7中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表7描述的適體的核酸序列還包括5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。在其他實(shí)施方案中，表7中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，3'反向dT帽子(3T))。小寫字母"m","d"和"dh"分別表示2誦0-曱基,2'-脫氧修飾，和二氫2'-脫氧修飾。表7:ARC9792'-脫氧二氫尿嘧啶核苷衍生物的序列和Ko總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>*30分鐘RT培養(yǎng)確定Kd但*1XDulbecco'sPBS(Ca+十和Mg+"加0.1mg/mLBSA反應(yīng)緩沖液實(shí)施例4:2'-脫氣取代增強(qiáng)適體耙點(diǎn)親合力通過用2'-脫氧殘基系統(tǒng)取代2'-OMe嘧咬制備出一組ARC445衍生物。采用定點(diǎn)雜交試驗(yàn)和先前描述的結(jié)合反應(yīng)條件(Dulbecco'sPBS((Ca十+和Mg十+)和0.1mg/mLBSA,0,1mg/mLssDNA，和1mg/mLtRNA，室溫下i咅養(yǎng)30分鐘)測試2'-脫氧系列刈-人IgE結(jié)合。相對于一個(gè)衍生物中的母體分子ARC445，引入2，-脫氧殘基取代穩(wěn)定化的2'-OMe殘基提高結(jié)合親合力。該結(jié)構(gòu)的序列和相應(yīng)Ko值，其中相對于ARC445，2'-脫氧取代提高的結(jié)合親合力在下面表8中列出。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有如下面表8中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表8描述的適體的核酸序列還包括的3'帽子，{如反向dT帽子(3T)),和/或5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。小寫字母"m"，和"d"分別表示2-0-甲基和2'-脫氧修飾。表8:ARC4452'-脫氧衍生物的序列和KD總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>*30分鐘RT培養(yǎng)確定KD*1XDulbecco'sPBS(Ca十+和Mg++)+0.1mg/mLBSA，0.1mg/mLssDNA,和1mg/mLtRNA反應(yīng)纟爰沖、液實(shí)施例5:ARC1335中聯(lián)合2'-脫氧肌香取代提高結(jié)合親合力通過在ARC1335中大于一個(gè)位點(diǎn)處聯(lián)合2'-脫氧肌苷取代制備一組ARC1335衍生物，ARC1335中的大于一個(gè)位點(diǎn)已經(jīng)顯示出容受月幾苷取代(參見，例如，實(shí)施例2A)。在定點(diǎn)雜交試驗(yàn)中和先前描述的結(jié)合反應(yīng)條件(Dulbecco'sPBS(Ca—和Mg++)加0.1mg/mLBSA，室溫下培養(yǎng)30分鐘后測試多重取代ARC1335衍生物對人IgE結(jié)合性。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware)，4<入到方禾呈中計(jì)算出KD<直。如下面表9中觀察到的，相對于ARC1335(無肌苷取代)、ARC1566(位點(diǎn)20處的單一肌苷取代)和ARC1560(位點(diǎn)14處的單一肌苦取代)，結(jié)合位點(diǎn)14和20處的2'-脫氧肌苷取代導(dǎo)致提高了結(jié)合親合力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有如下面表8中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表9中描述的適體的核酸序列還包括的3'帽子，{如反向dT帽子(3T)),和/或5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。在其他實(shí)施方案中，表9中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，3'反向2'-脫氧胸腺嘧啶脫氧核苷帽子(3T))。小寫字母"m",和"d"分別表示2-0-甲基和2'-脫氧修飾，"I"表示一個(gè)月/L香修飾。表9:ARC1335中結(jié)合肌苷取代的相關(guān)序列和KD<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實(shí)施例6:ARC445中結(jié)合石克代磷酸取代增強(qiáng)結(jié)合親合力通過在ARC445中大于一個(gè)位點(diǎn)處聯(lián)合石克代磷酸取代化學(xué)合成一組ARC445衍生物。在定點(diǎn)雜交試-驗(yàn)和先前描述的結(jié)合反應(yīng)條件(Dulbecco'sPBS((Ca—和Mg—)和0.1mg/mLBSA,0.1mg/mLssDNA，和lmg/mLtRNA,室溫下，培養(yǎng)30分鐘)下，測試多重取代ARC445書f生物對人IgE結(jié)合。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware),4戈入至'J方禾呈y=(max/(1+K/protein))+yint中i十算出KD<直。如下面表9中觀察到的，相對于ARC445和一些相應(yīng)的單一取代位點(diǎn)，在一些位點(diǎn)處的聯(lián)合石克代磷酸取代提高了結(jié)合親合力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有如下面表10中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表10中描述的適體的核酸序列還包括的3'帽子，{如反向dT帽子(3T))，和/或5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。在其他實(shí)施方案中，表10中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，3'反向2，-脫氧胸腺嘧啶脫氧核苷帽子(3T))。小寫字母"m"，和"d"分別表示2'-0曱基和2'-脫氧修飾，"s"表示一個(gè)-克代;粦酸^修飾。表10:ARC445中結(jié)合肌苷取代相關(guān)序列和K]<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>實(shí)施例7:ARC1335中聯(lián)合2'-氨基嘌呤取代提高結(jié)合親合力具有在每個(gè)不同A或G處2-氨基嘌呤取代的一組ARCl335單一取代衍生物被合成出。在聯(lián)合位點(diǎn)處不容受聯(lián)合2-氨基嘌呤取代。在斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)和先前描述的結(jié)合反應(yīng)條件(Dulbecco'sPBS((0&++和]^8++)和0.1mg/mLBSA，室溫下，i咅養(yǎng)30分鐘，測試多個(gè)位點(diǎn)處具有2-氨基嘌呤取代的ARC1335衍生物對人IgE的結(jié)合親合力。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51，SynergySoftware),4戈入到方禾呈y=(max/(l+K/protein))+yint中計(jì)算出Kd值。如下面表11中觀察到的，位點(diǎn)1、8和14處的單獨(dú)2-氨基嘌呤取代導(dǎo)致起始適體ARC1335(無2'-氨基噪呤取代)上結(jié)合親合力降低(例如，較高Ko值)。然而，與導(dǎo)致ARC1335結(jié)合親合力相等的位點(diǎn)8和14處單獨(dú)取代相比，位點(diǎn)8和14處的聯(lián)合2'-氨基嘌呤取代導(dǎo)致結(jié)合親合力提高(例如，較低Kd伍)。此外，相對于位點(diǎn)1、8和14處的單獨(dú)取代，位點(diǎn)1、8和14處的聯(lián)合2'-氨基嘌呤取代導(dǎo)致結(jié)合親合力提高(例如，校低Kd植)并且顯著性提高結(jié)合親合力，該結(jié)合親合力高于起始適體ARC1335的結(jié)合親合力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有如下面表11中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表ll中描述的適體的核酸序列還包括的3'巾冒子，(如反向dT帽子(3T))，和/或5'氨基(NH》修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。在其他實(shí)施方案中，表11中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，反向dT帽子(3T))。小寫字母"m"，和"d"分別表示2'-0曱基和2'-脫氧修飾，"mAP"表示一個(gè)2'-OMe-2-氨基嘌呤取代，并且"dAP"表示2'-脫氧-2-氨基噪呤取代。表11:ARC445中聯(lián)合2-氨基噤呤取代相關(guān)序列和KD<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>實(shí)施例8:結(jié)合2'-脫氧-5曱基胞嘧吱取代提高適體靶點(diǎn)親合力—組ARC445衍生物3皮i殳計(jì)和合成出來，其中2'-OMe月包嘧口定3皮2'-脫氧-5-曱基月包嘧口定(5mC)殘基(GlenResearch,Sterling,VA)系統(tǒng)地取代。生成的組的每個(gè)適體包括在ARC445內(nèi)不同2'曙OMe位點(diǎn)處的5mC取代?；谶@個(gè)序列生成的數(shù)據(jù)，第二組ARC445衍生物被設(shè)計(jì)出來，其中聯(lián)合5mC殘基在大于一個(gè)位點(diǎn)處被取代，單個(gè)5mC取代顯示出具有很少或沒有對結(jié)合親合力產(chǎn)生不良影響。采用先前表述的定點(diǎn)雜交試-瞼測試這些5mC系列對人IgE的結(jié)合。對于Ko確定，化學(xué)合成適體采用變性聚丙烯酰胺凝月交電泳進(jìn)行純化，采用y-32PATP在5'端標(biāo)記，在Dulbecco'sPBS(Ca屮+和Mg屮+)和0.1mg/mLBSA，0.1mg/mLssDNA,和1mg/mLtRNA中，采用蛋白質(zhì)滴定測試對全長人IL-23的直接結(jié)合。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51，SynergySoftware),代入到方程y=(max/(l+K/protein))+yint中計(jì)算出K。值。如下面表12中觀察到的，用位點(diǎn)3、11、和22處的單個(gè)5mC取代2'-OMe胞嘧啶導(dǎo)致很少改變到不改變結(jié)合親合力。然而，這些單一5mC取代的雙重或三重組合導(dǎo)致結(jié)合親合力的提高(例如，較低KD值)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包4舌具有如下面表12中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表12中描述的適體的核酸序列還包括的3'帽子，{如反向dT帽子(3T)),和/或5'氨基(NH2)修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。在其他實(shí)施方案中，表ll中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，3'反向2'-脫氧胸腺嘧啶脫氧核苷帽子(3T))。小寫字母"m"，和"d"分別表示2'-0甲基和2'-脫氧修飾，"5m"表示一個(gè)2'-脫氧-5-曱基修飾。表12:ARC4452'-脫氧-5-甲基胞嘧啶書f生物的序列和Ko總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>*1XDulbecco'sPBS(Ca+屮和Mg++)+0.1mg/mLBSA，0.1mg/mLssDNA，和1mg/mLtRNA反應(yīng)纟爰沖液實(shí)施例9:結(jié)合2'-脫氧-5甲基胞嗜咬取代和2'-脫氧胞嗜咬提高適體靶點(diǎn)親合力—組ARC445書亍生物被/沒計(jì)和合成出來，其中ARC445的位點(diǎn)3、11、和22處的2'-脫氧-5-曱基胞嘧啶(5mC)取代(GlenResearch,Sterling,VA)的聯(lián)合與位點(diǎn)處用2'-脫氧胞嘧啶殘基(dC)的一個(gè)或多個(gè)取代2'-OMe胞嘧啶殘基進(jìn)行聯(lián)合，位點(diǎn)處，dC取代先前被確定被很好容受(ARC445的位點(diǎn)處12和22，參見實(shí)施例4)。采用先前表述的斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)測試這些衍生物對人IgE的結(jié)合。對于Ko確定，化學(xué)合成適體采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化，采用，32PATP在5'端標(biāo)記，在Dulbecco'sPBS(Ca+十和Mg+十)和0.1mg/mLBSA,0.1mg/mLssDNA，和1mg/mLtRNA中，釆用蛋白質(zhì)滴定測試對全長人IL-23的直接結(jié)合。采用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware),代入到方禾呈y=(max/(l+K/protein))+yint中i十算出KD^i。如下面表13中觀察到的，用ARC445的位點(diǎn)3、11、和22處的一個(gè)或一個(gè)以上2'-脫氧-5-甲基胞嘧啶取代的不同聯(lián)合與ARC445的位點(diǎn)處12或22處的一個(gè)或一個(gè)以上2'-脫氧胞嘧啶取代進(jìn)行聯(lián)合，不會(huì)不利影響結(jié)合親合力，并且導(dǎo)致產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)，其中結(jié)合親合力被適度提高(例如，校低Kd植)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有如下面表13中描述的核酸序列的適體。在一些實(shí)施方案中，表13中描述的適體的核酸序列還包括的3'帽子，(如反向dT帽子(3T))，和/或5'氨基(NH》修飾，以便于化學(xué)結(jié)合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上。在其他實(shí)施方案中，表11中描述的核酸序列沒有所表示的3'帽子(即，3'反向2'-脫氧胸腺嘧啶脫氧核苷帽子(3T))。小寫字母"m",和"d"分別表示2'-0曱基和2'-脫氧修飾，"5m"表示2'-脫氧-5-甲基胞嘧啶修飾，并且"dC"表示2'-脫氧胞嘧啶修飾。表13:ARC4452'-脫氧-5-曱基胞嘧啶序列和2'-脫氧胞嘧啶衍<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>權(quán)利要求1.鑒別被取代的單鏈適體的方法，包括下列步驟a)用硫代磷酸或二硫代磷酸取代單鏈適體內(nèi)核苷酸內(nèi)連接部位上的磷酸；b)分析被取代的單鏈適體對靶點(diǎn)的親合力；和c)鑒別出相對于起始適體，對靶點(diǎn)具有更高親合力的單鏈適體，其中起始適體除了其無硫代磷酸取代之外同源于被修飾的單鏈適體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中取代步驟進(jìn)一步包括通過化學(xué)合成在核苷酸內(nèi)連接部位上加入錄u代磷酸取代。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中取代步驟不包括在單鏈適磷酸取代。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中取代步驟包括在單鏈適體內(nèi)加入單一碌u/R/粦酸耳又^。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中被取代單鏈適體包括的耙點(diǎn)結(jié)合親合力比起始適體的結(jié)合親合力至少高兩倍。6.由權(quán)利要求5所述的方法鑒別的被取代單鏈適體。7.4艮據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，進(jìn)一步包括向一皮取代單鏈適體中加入一種附加取代而導(dǎo)致產(chǎn)生二次取代單鏈適體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包括分析二次取代單鏈適體對耙點(diǎn)親合力并鑒別該二次耳又代單鏈適體具有與起始未取代單鏈適體的親合力相等或更高的親合力。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包括分析二次取代單鏈適體對靶點(diǎn)的親合力并鑒別該二次取代單鏈適體具有與碌u代磷酸取代單鏈適體的親合力相等或更高的親合力。10.由4又利要求9所述的方法鑒別的二次取氏單鏈適體。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中附加取代為附加的硫代磷酸取代，該取代發(fā)生在不同于首個(gè)硫代磷酸取代位點(diǎn)的磷酸^f立點(diǎn)處。12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中附加的取代選自在堿基位點(diǎn)耳又代一種^^修飾核香酸、在糖基位點(diǎn)取代一種纟皮修飾核苷酸、和在^壽酸位點(diǎn)取—種#皮{奮飾核苦酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中附加的取代選自在磷酸位點(diǎn)處的二疏代磷酸取代、肌苷取代另一種核苦酸；2'-脫氧二氫尿嘧啶核苷取代尿嘧啶核苦，2'-脫氧-5-曱基核普酸取代另一種核苷酸，2'-脫氧核芬酸取代2'-OMe核普酸，2'-OMe核普酸取代2'-脫氧核苷酸，和2-氨基噤呤取代一種嘌呤。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中附加的取代選自2'-脫氧肌苷或2'-OMe肌苷取代另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧，定核苷取代尿嘧咬核苷，2'-脫氧-5-曱基胞嘧咬取代胞嘧咬，和一種2'-脫氧核苷酸取代2'-OMe核苦酸。15.鑒別^皮取代適體的方法，其包括下列步驟a)向起始適體中加入一種取代物，其中該取代選自由月幾普取代另一種核苷，2'-脫氧二氫尿嘧啶核苷取代尿嘧咬核苷、2'-脫氧-5-曱基胞嘧啶取代胞嘧咬，2-氨基嘌呤取代"票呤和2'-脫氧核苷酸取代2'-OMe核苦酸；b)分析被取代適體對輩巴點(diǎn)的親合力；和c)鑒別相對于起始適體對靶點(diǎn)親合力，對耙點(diǎn)具有增強(qiáng)的親合力的被取代適體，其中，除了其無取代核苷酸之外，該起始適體與一皮取代適體同源。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中加入步驟進(jìn)一步包括通過4匕學(xué)合成向起始適體中加入取^物。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中鑒別出的取代適體是單鏈的。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中方法進(jìn)一步包括向被取代適體中加入另外取代物的步驟，其中另外的取代物與第一耳又代的類型不同，^v而產(chǎn)生二次^c代適體。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，進(jìn)一步包括分析二次取代適體對靶點(diǎn)的親合力并鑒別該二次取代適體具有等同于或大于起始未取代單鏈適體的耙點(diǎn)親合力的親合力。20.才艮據(jù)4又利要求18所述的方法，進(jìn)一步包括分析二次取代適體對靶點(diǎn)的親合力并鑒別該二次取代適體具有等同于或高于被取代單鏈適體的耙點(diǎn)親合力的親合力。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，附加的取代選自由堿基位點(diǎn)上取代一種核苷酸，在糖基位點(diǎn)上取代一種核苷酸，和在磷酸^f立點(diǎn)上取^一種》務(wù)飾核苦酸組成的組。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中附加的取代選自由磷酸位點(diǎn)上二硫代磷酸取代，肌苷取代另一種核苷酸；2'-脫氧二氫尿嘧啶核苷取代尿嘧啶核苷，2'-脫氧-5-曱基核香酸取代另一種核苦酸，2'-脫氧核苷酸取代一種2'-OMe核苦酸，2'-OMe核苷酸取代2'-脫氧核苷酸，和2-氨基嘌呤取代一種嘌呤組成的組，其中附加取代不同于第一取代。23.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中附加的取代選自由2'-脫氧肌苷或2'-OMe肌苷取代另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧啶核苷取代尿嘧咬核苷，2'-脫氧-5-甲基胞嘧啶取代胞嘧咬，和2'-脫氧核苦酸取代2'-OMe核苦酸組成的組。24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括向被取代適體中加入附加取代而導(dǎo)致生成二次取代適體，其中附加的取代與第一取代相同類型^f旦發(fā)生在不同的核苦酸位點(diǎn)上。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括分析二次取代適體對靶點(diǎn)的親合力并且鑒別該二次取代適體具有與起始未取代單鏈適體和/或取代適體的乾點(diǎn)親合力等同或更大的親合力。26.由權(quán)利要求24所述的方法鑒別的二次取代適體。27.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中加入步驟進(jìn)一步包括用肌苷取代另一種核苦。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中肌普取代適體包括一種結(jié)合親和力，該結(jié)合親和力比起始未取代適體的親合力至少高2倍。29.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中加入步驟進(jìn)一步包括用2'-脫氧核苷酸取代2'-OMe核苦酸。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中2'-脫氧取代適體包括一種結(jié)合親和力，該親和力比起始未取代適體的親合力至少高2倍。31.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中第一取代為2'-脫氧取代2'-OMe核苷酸，附加取代為肌苦取代。32.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中二次取代單鏈?zhǔn)４姿徇m體包括一種結(jié)合親合力，其比起始未取代適體和/或取代適體的結(jié)合親和力至少高33.—種單鏈適體，包括不超過一個(gè)的硫代磷酸骨架取代，其中該單鏈適體以一種結(jié)合親合力特異性結(jié)合靶點(diǎn)，相對于第一適體同源但缺少一個(gè)硫代磷酸修飾的第二單鏈適體來講，該靶點(diǎn)結(jié)合親合力纟皮增強(qiáng)。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的單鏈適體，包括不超過一個(gè)的附加硫代》岸酸取代。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的單鏈適體，包括不超過2個(gè)的附加硫代磷酸取代。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的單鏈適體，包括不超過3個(gè)的附加硫代磷酸取代。37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的單鏈適體，進(jìn)一步包括選自由具有一種;咸基位點(diǎn)上修飾核香酸的取代，一種糖基位上修飾的核苦酸和具有一種^粦酸位點(diǎn)上l奮飾核苦酸組成的組中附加的核苷酸取代，其中當(dāng)被取代的核苦酸包括磷酸位點(diǎn)上一種修飾時(shí)，該修飾不是硫代磷酸取代。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的單鏈適體，其中附加的核普酸取代選自由在一種磷酸位點(diǎn)上的二硫代磷酸取代，肌普取代另一種核苷酸；2'-脫氧二氫尿嗜p定核苷取代尿嘧咬核苦、一種2'-脫氧-5-甲基核苷酸取代另一種核苦酸，一種2'-脫氧核苦酸取一種2'-OMe核苷酸，一種2'-OMe核苦酸取代2'-脫氧核苷酸，和一種2-氨基嘌呤取代一種噪呤組成的組。39.包括一種核苦酸取代的單鏈適體，該核苷酸取代選自由肌苷取代另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧咬核苷耳又代尿嘧"定核苷，2'-脫氧-5-甲基胞嘧啶取代胞嘧咬，和一種2-氨基噤呤取代一種噤呤和一種2'-脫氧核苷酸取代一種2'-OMe核普酸組成的組，其中被取代單鏈適體以一種結(jié)合親合力特異性結(jié)合一個(gè)靶點(diǎn)，相對于與第一適體同源但缺少核苷酸取代的第二單鏈適體來i井，該輩巴點(diǎn)結(jié)合親合力一皮增強(qiáng)。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的單鏈適體，包括至少兩個(gè)核苷酸取代選自由肌苷取代另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧啶核苦取代尿嘧啶核苷，2'-脫氧-5-曱基胞嘧啶取代胞嘧啶，和一種2-氨基嘌呤取代一種噤呤和一種2'-脫氧核苷酸耳又代一種2'-OMe核苷酸組成的組，其中二次耳又代單鏈適體以一種結(jié)合親合力特異性結(jié)合一個(gè)靶點(diǎn)，相對于與第一適體同源^f旦缺少至少兩個(gè)核苷酸取代的第二單鏈適體來講，該靶點(diǎn)結(jié)合親合力被增強(qiáng)。41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的單鏈適體，包括至少三個(gè)核苦酸取代選自由肌苷取代另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧。定核苷取代尿嘧啶核苷，2'-脫氧-5-曱基胞嘧啶取代胞嘧啶，和一種2-氨基嘌呤取代一種噪呤和一種2'-脫氧核苦取—種2'-OMe核苷酸組成的組，其中三重取4氣單鏈適體以一種輩巴點(diǎn)結(jié)合親合力特異性結(jié)合一個(gè)靶點(diǎn)，相對于與第一適體同源但缺少至少三個(gè)核苷酸取代的第二單鏈適體來講，該耙點(diǎn)結(jié)合親合力被增強(qiáng)。42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的單鏈適體，其中二次取代單鏈適體以一種結(jié)合親合力特異性結(jié)合一個(gè)靶點(diǎn)，相對于第二個(gè)單鏈適體的靶點(diǎn)結(jié)合親合力，該靶點(diǎn)結(jié)合親合力被增強(qiáng)，第二個(gè)單鏈適體與第一個(gè)同源但缺少核香酸取代中的一個(gè)。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的單鏈適體，其中三重取代單鏈適體以一種靶點(diǎn)結(jié)合親合力特異性結(jié)合靶點(diǎn)，相對于與第一適體同源4旦缺少至少核苦酸取中的一個(gè)的第二單l連適體，該輩巴點(diǎn)結(jié)合親合力^^皮增強(qiáng)。44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的單鏈適體，其中核苦取代為用2'-脫氧核苷酸取代一種2'-OMe核普酸。45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的單鏈適體，其中核苦酸取代為肌苦取代一種噤呤。46.特異性結(jié)合靶點(diǎn)的適體，其中適體包括一種核酸序列，該核酸序列在被選定位點(diǎn)上具有碌u代磷酸修飾的磷酸骨架，相對于具有相同的核普酸序列{旦缺少碌u代石粦酸1^飾的第二個(gè)適體對同一靶點(diǎn)的結(jié)合親合力來講，該選定位點(diǎn)上的取代能增強(qiáng)該適體對輩巴點(diǎn)的結(jié)合親合力，{務(wù)飾包括月幾苦取氏另一種核苷酸、2'-脫氧二氫尿嘧咬核苷取代尿嘧-定核苷，2'-脫氧-5-曱基胞啶取代胞嘧啶，和一種2-氨基嘌呤取代一種嘌呤。47.穩(wěn)定適體的方法，包4舌下列步驟a)向起始適體中引入穩(wěn)定化修飾而生成一種修飾的適體，其中起始適體具有預(yù)先確定的靶點(diǎn)結(jié)合親合力，b)分析被修飾適體對靶點(diǎn)的結(jié)合親合力，在結(jié)合親合力小于起始適體的靶點(diǎn)結(jié)合親合力的位點(diǎn)，引入一種核苦酸取代而生成一種被取代適體，其中被取代的適體對把點(diǎn)的結(jié)合親合力大于修飾適體對靶點(diǎn)的結(jié)合親合力。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，這里的被取代適體包括的革巴點(diǎn)結(jié)合親合力與起始適體的靶點(diǎn)結(jié)合親合力基本相同。49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，核酸酶耐受性的修飾。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，OMe核苷取代另一種核普酸51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，個(gè)2'-OMe取代另一種核香酸。這里的穩(wěn)定化修飾是一種提高這里的穩(wěn)定化》務(wù)飾包括用2'-其中引入步驟包括引入大于152.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中取代步驟包括選自由在石咸基位點(diǎn)上一種{奮飾核苷酸的取,在沖唐基位點(diǎn)上的一種<多飾核苷酸的取代，在^粦酸〗立點(diǎn)上的一種<多飾核苷酸的取4戈組成組的取代。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中取代選自由辟u代磷酸取代i核苷酸取代一種未取代核苷酸，二辟u^/舞酸取代核芬酸取^一種未取4義核苷酸和2'-脫氧核普酸取2'-OMe核苦酸組成的組。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中取代為硫代磷酸取代核苦酸取代一種未耳又代核苦酸。55.鑒別結(jié)合靶點(diǎn)的被取代適體的方法，其中被取代適體具有比未被取代的同源適體結(jié)合力更大的耙點(diǎn)結(jié)合親合力，該方法包括下列步驟a)在堿基、糖基、或磷酸位點(diǎn)處，用被修飾的單一核芬酸耳又代為^^修飾的核苷，和b)分析被取代適體對耙點(diǎn)的結(jié)合親合力。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中取代步驟進(jìn)一步包括在相同位點(diǎn)用至少兩個(gè)修飾核苦酸取代至少兩個(gè)未修飾核苦酸。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中取代步驟進(jìn)一步包括在相同位點(diǎn)用至少三個(gè)〗奮飾核苷酸^f又代至少三個(gè)未〗奮飾核苦酸。58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中取代步驟進(jìn)一步包括在不同位點(diǎn)用至少兩個(gè)》f飾核苷酸取代至少兩個(gè)未》務(wù)飾核普酸。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中取代步驟進(jìn)一步包括用至少三個(gè)<奮飾核苷酸取代至少三個(gè)未<多飾核苷酸，其中凈皮取^的三個(gè)核苷酸中的至少兩個(gè)》務(wù)飾在不同的位點(diǎn)。60.特異性結(jié)合靶點(diǎn)的適體，其中適體包括一種核酸序列，該核酸序列具有選定的取代核苷，相對于具有相同的核苷酸序列但無被取代核苦酸的第二個(gè)適體對同一耙點(diǎn)的結(jié)合親合力來講，選定的取代核苦能夠增強(qiáng)該適體對耙點(diǎn)的結(jié)合親合力，其中被取代核苷酸包括在磷酸、糖基或堿基位點(diǎn)處的一種j務(wù)飾。61.包括不超過一個(gè)核苷酸取代的單鏈適體，其中^皮取代核苷酸包括在石威基、糖基或磷酸位點(diǎn)上的化學(xué)〗奮飾，并且其中，單鏈適體以一種靶點(diǎn)結(jié)合親合力特異性結(jié)合輩巴點(diǎn)，相對于與第一適體同源但無取代的第二單鏈適體來講，該乾點(diǎn)結(jié)合親合力凈皮增強(qiáng)。全文摘要本發(fā)明通常關(guān)于核酸領(lǐng)域，更尤其關(guān)于用作治療劑、診斷劑和用于例如目標(biāo)驗(yàn)證的研究中的適體。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于提高治療、診斷和研究中應(yīng)用的適體的原料和方法。文檔編號C12Q1/68GK101356284SQ200580034801公開日2009年1月28日申請日期2005年9月7日優(yōu)先權(quán)日2004年9月7日發(fā)明者安東尼·多米尼克·克費(fèi),查爾斯·威爾遜,約翰·L·戴納,馬庫斯·庫爾茨申請人:阿切埃米克斯有限公司