專利名稱：使用腈水解酶突變體生產(chǎn)3－羥基羧酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶，所述腈水解酶用于將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸。
背景技術(shù)：
具有優(yōu)異性能、獨(dú)特性質(zhì)、改善的成本效率、品質(zhì)以及低生態(tài)影響的新聚合物正引起工業(yè)界的注意。特別是，需要具有支鏈、致密結(jié)構(gòu)以及末端帶反應(yīng)基的功能聚合物，因?yàn)榕c常規(guī)線型統(tǒng)計(jì)共聚物相比，它們具有更低的特性粘度和更高的活性。
這樣優(yōu)異的聚合物可通過(guò)共聚高支化(hyperbranching)羥基羧酸共聚單體(高支化ABn型，其中A和B是具有羥基或羧基衍生的反應(yīng)基部分，n是2或更大)(Hult等，pp.656-658和Voit等，pp.658-659 inConcise Polymeric Materials Encyclopedia，編輯.J.C.Salomone，CRCPress，New York，1999)和多種線型羥基羧酸共聚單體(線型AB型)包括3-羥基戊酸(3-HVA)和3-羥基丁酸(3-HBA)得以制備。
3-羥基羧酸用作為共聚單體用于制造線型聚酯。聚酯被用作為熱塑性、熱固性、半結(jié)晶、非晶形、剛性和彈性體材料。它們是纖維、薄膜、模制品和涂料的主要成分(Goodman，pp.793-799 inConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering，編輯.J.I.Kroschwitz，John Wiley & Sons，New York，1990)。
已在使用皺落假絲酵母(Candida rugosa)的發(fā)酵中通過(guò)戊酸的3-羥基化作用制備了3-羥基戊酸(Hasegawa等，J.Ferment.Technol.59257-262(1981)；JP 59053838 B4)，并且通過(guò)使用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、產(chǎn)藍(lán)色素?zé)晒饧賳伟?Pseudomonasfluorescens)、氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)和Arthrobactercrystallopietes，經(jīng)發(fā)酵的戊酸的3-羥基化作用，類似地制備了3-羥基戊酸的單一對(duì)映體(U.S.3,553,081)。這些用于戊酸發(fā)酵氧化的方法通常產(chǎn)生低產(chǎn)物濃度的3-羥基戊酸，并且從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離3-羥基戊酸需要精心設(shè)計(jì)且費(fèi)用昂貴。已通過(guò)化學(xué)降解(Seebach等，HeIv.CMm.Acta 772007-2034(1994))或聚(3-羥基丁酸酯/3-羥基戊酸酯)發(fā)酵自降解(WO 9929889)制備得到(R)-(-)-3-羥基戊酸，但是羥基丁酸/羥基戊酸共聚物的降解同樣需要費(fèi)力地將3-羥基丁酸與副產(chǎn)物3-羥基戊酸分離。還已通過(guò)酶促還原3-氧代戊酸(Bayer等，Appl. Microbiol.Biotechnol.42543-547(1994))或不對(duì)稱氫化甲基3-氧代戊酸酯接著皂化(Burk等，Organometallics 92653-2655(1990))制備得到(R)-(-)-3-羥基戊酸。
通過(guò)多種化學(xué)方法，腈容易地轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸。這些方法需要強(qiáng)的酸性和堿性反應(yīng)條件和高反應(yīng)溫度，且通常產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物和/或作為不需要的廢棄物的大量無(wú)機(jī)鹽。用于化學(xué)水解額外具有羥基的腈的反應(yīng)條件，例如用于將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸的反應(yīng)條件，通常會(huì)導(dǎo)致不期望的伯、仲或叔羥基消除，產(chǎn)生碳-碳雙鍵。
腈酶催化水解為相應(yīng)的羧酸是經(jīng)常優(yōu)選的化學(xué)方法，因?yàn)樵摲磻?yīng)通常在環(huán)境溫度下進(jìn)行，無(wú)需強(qiáng)的酸性或堿性反應(yīng)條件，并以高轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生高選擇性的所需產(chǎn)物。兩種酶——腈水合酶和酰胺酶的組合可用于在水溶液中將脂肪腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸。開(kāi)始，通過(guò)腈水合酶將脂肪腈轉(zhuǎn)化為酰胺，接著，隨后通過(guò)酰胺酶將酰胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸。已知多種細(xì)菌菌屬具有不同的腈水合酶和酰胺酶活性譜(Sugai等，Biosci.Biotech.Biochem.611419-1427(1997))，包括紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)硫桿菌屬(Alcaligenes)、節(jié)核細(xì)菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無(wú)芽孢桿菌屬(Bacteridium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和微球菌屬(Micrococcus)。真菌節(jié)鐮孢(Fusariummerismoides)TG-1還已用作為催化劑用于水解脂肪腈和二腈(Asano等，Agric.Biol.Chem.442497-2498(1980))。來(lái)自紅球菌(Bhodococcussp.)(來(lái)自Novo Industri的SP409)的固定化腈水合酶和酰胺酶被用于將3-羥基丙腈、3-羥基庚腈和3-羥基壬腈水解為相應(yīng)的3-羥基羧酸，產(chǎn)率分別為63％、62％和83％(de Raadt等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，137-140(1992))。使用TLC也觀察到了相應(yīng)的酰胺的形成。與此相反，蒼白芽孢桿菌(Bacillus pallidas)Dac521的純化的腈水合酶水解多種脂肪腈，但不水解3-羥基丙腈(Cramp等，Biochim.Biophys.Acta1431249-260(1999))。
單種酶——腈水解酶在水溶液中也將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸和氨，但沒(méi)有酰胺中間體形成(方程式1和2)。
Kobayashi等(Tetrahedron 465587-5590(1990)和J.Bacteriology1724807-4815(1990))已描述了一種分離自紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)K22的脂族腈水解酶，其催化多種脂肪腈水解為相應(yīng)的羧酸。業(yè)已分離了來(lái)自睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)的腈水解酶，其能將一系列脂族α，ω-二腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氰羧酸或二羧酸(CA 2，103，616；Levy-Schil等，Gene 16115-20(1995))。還利用紫紅紅球菌NCIMB 11216(Bengis-Garber等，Appl.Microbiol.Biotechnol.3211-16(1989)；Gradley等，Biotechnology Lett.1641-46(1994))、紫紅紅球菌PA-34(Bhalla等，Appl.Microbiol.Biotechnol.37184-190(1992))、尖鐮孢(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)(Goldlust等，Biotechnol.Appl.Biochem.11581-601(1989))、不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)AK 226(Yamamoto等，Agric.Biol.Chem.551459-1473(1991))、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 8750(Yamamoto等，J.Ferment.Bioeng.73425-430(1992))和敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W(Gavagan等，J.Org.Chem.634792-4801(1998))生產(chǎn)了脂族腈水解酶。
業(yè)已克隆并重組表達(dá)了編碼敏捷食酸菌72 W(ATCC 55746)腈水解酶的基因((WO 01/75077；相應(yīng)于US 6,870,038)和Chauhan等，ApplMicrobiol Biotechnol，61118-122(2003))。敏捷食酸菌72W腈水解酶以高產(chǎn)率將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸(US 6,562,603)。所產(chǎn)生的3-羥酸被用作為基質(zhì)用于制備包括高支化共聚多酯在內(nèi)的聚合物。兩種特別有用的3-羥基羧酸是3-羥基戊酸(3-HVA)和3-羥基丁酸(3-HBA)。用于以高達(dá)100％轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)率將3-羥基戊腈(3-BTVTST)或3-羥基丁腈(3-HBN)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸的，具有改善的腈水解酶活性的腈水解酶，對(duì)于減少工業(yè)生產(chǎn)成本應(yīng)當(dāng)是十分有用的。
因此，所要解決的問(wèn)題就是提供具有用于將3-羥基腈高產(chǎn)率地轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的羧酸的活性的腈水解酶。更具體地說(shuō)，用于將3-羥基腈(如3-羥基戊腈或3-羥基丁腈)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸的，具有腈水解酶活性顯著改善的腈水解酶(相對(duì)于敏捷食酸菌72W的腈水解酶活性)，應(yīng)當(dāng)能用于減少工業(yè)生產(chǎn)成本。
發(fā)明概述當(dāng)將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥酸時(shí)，突變并篩選具有改善的的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶。相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性，鑒定了具有改善的腈水解酶活性的幾個(gè)氨基酸取代。因此，提供了編碼相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶具有改善的腈水解酶活性的多肽的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子編碼如SEQ IDNO4所示序列的至少一個(gè)氨基酸取代的序列，所述取代選自a)在第210位用丙氨酸、異亮氨酸或半胱氨酸取代；b)在第65位用半胱氨酸取代；c)在第168位用賴氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代；和d)在第174位用異亮氨酸取代。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種編碼酶促活性的腈水解酶多肽的分離的核酸片段，所述多肽具有選自SEQ ID NO6、8、12、14、16和18的多肽序列；并且，當(dāng)在相同反應(yīng)條件下將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸時(shí)，具有與敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的腈水解酶活性相比至少高1.8倍的腈水解酶活性。
還包括在本發(fā)明之中的是一種分離的核酸片段，所述核酸片段選自SEQ ID NOs5、7、11、13、15和17，其中所述分離的核酸片段編碼一種多肽，當(dāng)在相同的水溶液反應(yīng)條件下將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸時(shí)，所述多肽具有相對(duì)于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性至少高1.8倍的腈水解酶活性改善。本發(fā)明的另外施方案包括本發(fā)明核酸片段所編碼的多肽；包含可操作地連接到適合的調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明分離的核酸片段的嵌合基因；包含本發(fā)明嵌合基因的表達(dá)盒；包含本發(fā)明嵌合基因的轉(zhuǎn)化的微生物；以及包含本發(fā)明表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化的微生物。
另一個(gè)實(shí)施方案是一種用于將3-羥基腈水解為3-羥基羧酸的改良方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基腈與改良的腈水解酶催化劑接觸，所述改良的腈水解酶催化劑特征在于在相同的反應(yīng)條件下，與敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性相比具有至少1.8倍改善，所述改良的腈水解酶催化劑為本發(fā)明分離的核酸片段所編碼；和(b)任選地分離步驟(a)中生產(chǎn)的3-羥基羧酸。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種用于將3-羥基戊腈水解為3-羥基戊酸的改良方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基戊腈與本發(fā)明分離的核酸片段所編碼的腈水解酶催化劑接觸，所述腈水解酶催化劑特征在于在相同的反應(yīng)條件下，相對(duì)于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性具有至少1.8倍腈水解酶活性改善；和(b)任選地分離步驟(a)中生產(chǎn)的3-羥基戊酸。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種用于將3-羥基丁腈水解為3-羥基丁酸的改良方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基丁腈與具有SEQ ID NO6的多肽序列的酶促活性的腈水解酶催化劑接觸，所述腈水解酶催化劑特征在于在相同的反應(yīng)條件下，相對(duì)于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性具有至少1.9倍腈水解酶活性改善；和(b)任選地分離步驟(a)中生產(chǎn)的3-羥基丁酸。
所提供序列簡(jiǎn)述通過(guò)下列詳細(xì)說(shuō)明和所附的序列表計(jì)算機(jī)可讀形式，其內(nèi)容引入作為本申請(qǐng)的一部分，可以更全面地理解本發(fā)明。
以下序列符合37 C.F.R.1.821-1.825 (“包含核苷酸序列和/或氨基酸序列披露的專利申請(qǐng)要求——序列細(xì)則”)，并且也符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)和EPC和PCT的序列表要求(細(xì)則5.2和49.5(a-bis)，以及行政規(guī)程第208節(jié)和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式符合37C.F.R.§1.822的規(guī)定。SSEQ ID NO1是用于易錯(cuò)PCR的引物的核酸序列，并用于擴(kuò)增敏捷食酸菌72W腈水解酶。
SEQ ID NO2是用于易錯(cuò)PCR的引物的核酸序列，并用于擴(kuò)增敏捷食酸菌72W腈水解酶。
SEQ ID NO3是在質(zhì)粒pNM18中用作為對(duì)照的敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的核酸序列。為了便于在大腸桿菌中表達(dá)，除起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG之外，該序列與野生型敏捷食酸菌72W腈水解酶序列相同。
SEQ ID NO4是表達(dá)自質(zhì)粒pNM18的敏捷食酸菌72W腈水解酶的推斷的氨基酸序列。
SEQ ID NO5是質(zhì)粒pNM18/B2和pNM18/H9中突變的腈水解酶編碼序列的核酸序列。
SEQ ID NO6是表達(dá)自質(zhì)粒pNM18/B2和pNM18/H9的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。
SEQ ID NO7是質(zhì)粒pNM18/B4中突變的腈水解酶編碼序列的核酸序列。
SEQ ID NO8是表達(dá)自質(zhì)粒pNM18/B4的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是用于產(chǎn)生在敏捷食酸菌72W腈水解酶的第210位殘基處具有單個(gè)氨基酸取代(Thr210→Met)的突變的腈水解酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NO10是用于產(chǎn)生在敏捷食酸菌72W腈水解酶的第210位殘基處具有單個(gè)氨基酸取代(Thr210→Met)的突變的腈水解酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NO11是突變的腈水解酶的核酸序列，所述核酸序列含有引起在敏捷食酸菌72W腈水解酶第210位殘基處單個(gè)氨基酸取代(Thr210→Cys)的密碼子改變。
SEQ ID NO12是在敏捷食酸菌72W腈水解酶第210位殘基處含有單個(gè)氨基酸取代(Thr210→Cys)的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。
SEQ ID NO13是突變的腈水解酶的核酸序列，所述核酸序列含有引起在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處單個(gè)氨基酸取代(Phe168→Lys)的密碼子改變。
SEQ ID NO14是在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處含有單個(gè)氨基酸取代(Phe168→Lys)的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。
SEQ ID NO15是突變的腈水解酶的核酸序列，所述核酸序列含有引起在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處單個(gè)氨基酸取代(Phe168→Val)的密碼子改變。
SEQ ID NO16是在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處含有單個(gè)氨基酸取代(Phe168→Val)的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。
SEQ ID NO17是突變的腈水解酶的核酸序列，所述核酸序列含有引起在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處單個(gè)氨基酸取代(Phe168→Leu)的密碼子改變。
SEQ ID NO18是在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處含有單個(gè)氨基酸取代(Phe168→Leu)的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。
生物保藏簡(jiǎn)述申請(qǐng)人業(yè)已按照布達(dá)佩斯條約條款的規(guī)定進(jìn)行了以下生物學(xué)保藏保藏人識(shí)別參考國(guó)際保藏指定編號(hào)保藏日敏捷食酸菌72W ATCC 55746 1996年3月8日大腸桿菌SS1001ATCC PTA-1177 2000年1月11日如本文使用的“ATCC”指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，位于10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209 U.S.A.的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)?！皣?guó)際保藏名稱”是在ATCC保藏的培養(yǎng)物的保藏號(hào)。
所列出的保藏物應(yīng)當(dāng)在所指明的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)保藏至少三十(30)年，并且公眾在得到披露其的專利授權(quán)之后可以獲得。保藏物的可利用性并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施本發(fā)明的許可，這種實(shí)施會(huì)破壞通過(guò)政府行為授予的專利權(quán)。
發(fā)明詳述提供了幾種腈水解酶，當(dāng)以高達(dá)100％轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)率將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸時(shí)，相對(duì)于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性，所述腈水解酶具有顯著改善的腈水解酶活性。還提供了使用本發(fā)明的腈水解酶用于生產(chǎn)3-羥基羧酸(3-HVA和3-HBA)的方法。
利用易錯(cuò)PCR和/或位點(diǎn)定向誘變突變敏捷食酸菌72W腈水解酶以產(chǎn)生一系列突變的腈水解酶，所述突變的腈水解酶具有改善的用于將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸的腈水解酶活性。如所附實(shí)施例所述，使用轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞(未固定化的和固定化的)，測(cè)定用于3-羥基羧酸生產(chǎn)的腈水解酶活性的改善。
具有將3-羥基腈的腈官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)羧酸能力的腈水解酶類提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)。與化學(xué)或其他酶促方法相比，使用本發(fā)明腈水解酶的腈水解能用于由相對(duì)便宜和容易獲得的起始原料以高產(chǎn)率合成3-羧酸，具有十分少的副產(chǎn)物和污染產(chǎn)生。
所要求保護(hù)的用于制備3-羥基戊酸或3-羥基丁酸的方法產(chǎn)生很少的污染或反應(yīng)副產(chǎn)物，且3-羥基羧酸易于從產(chǎn)物混合物中回收。先前已知的用于將3-羥基腈水解為3-羥基羧酸的化學(xué)方法無(wú)法產(chǎn)生使用酶催化的腈水解所獲得的高產(chǎn)率和選擇性。非酶促腈水解反應(yīng)通常涉及在升溫下加熱腈溶液，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿存在下常常要好幾次，然而酶催化的反應(yīng)在環(huán)境溫度下于水溶液及中性pH中進(jìn)行，無(wú)需添加酸或堿。例如，業(yè)已使用氫氧化鋇來(lái)將3-氨基丙腈水解為3-丙氨酸，產(chǎn)率85-90％(Ford，J.H.，Org.Synth.，Coll.vol.III34-36(1955))，以及將3-氰基丁酸水解為甲基丁二酸，產(chǎn)率72％(Brown，G.B.，Org Synth.Coll.vol.III615-617(1955))；使用3-羥基戊腈重復(fù)這兩種方法的第一種，產(chǎn)生很少的或無(wú)法檢測(cè)的3-羥基戊酸(參見(jiàn)比較實(shí)施例)。
通過(guò)本發(fā)明生產(chǎn)的3-羥基戊酸和3-羥基丁酸被用作為配料來(lái)制備聚酯(特別是多支聚酯和高支化羥基羧酸共聚單體)，以及在生物可降解的聚酯生產(chǎn)中被用作為共聚單體(US 6,562,603)。業(yè)已使用二羥甲基丙酸作為支化共聚單體和多種線型羥基羧酸和內(nèi)酯制備了幾類多支共聚多酯多元醇。這些聚合物的某些顯示了引人注意的特性。也已報(bào)道了具有相似的總成分(但具有不同的微結(jié)構(gòu))的相應(yīng)的嵌段共聚物(如Trollsas等，Macromolecules，308508(1997)和Trollsas等，J.Polym.ScLPart(A)Polymer Chemistry 362793(1998)中描述的DMPA/ε-己內(nèi)酯嵌段共聚物)。當(dāng)在使用二羥甲基丙酸或三羥甲基乙酸的共聚反應(yīng)中，諸如3-羥基戊酸的3-羥基羧酸代替ε-己內(nèi)酯作為線型共聚單體時(shí)，也已報(bào)道了具有期望的、顯著增加的Tg的用于活性涂層的多支共聚多酯多元醇基質(zhì)(US 6,562,603)。更高的Tg明顯地?cái)U(kuò)大了支化共聚多酯可以使用的應(yīng)用范圍。
在本說(shuō)明書中使用了許多術(shù)語(yǔ)和縮寫。提供以下定義。
飽和的“烴基”定義為任何全部由碳和氫組成的基團(tuán)，在此單鍵專門用于將碳原子連接在一起。因此，任何具有至少一個(gè)碳原子的穩(wěn)定的碳和氫原子排列包括在飽和的烴基范圍內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“高支化的”、“多支的”和“樹(shù)枝狀大分子”(樹(shù)狀聚體)通常可被描述為具有樹(shù)形結(jié)構(gòu)的三維的、多支的分子。樹(shù)狀聚體是高對(duì)稱的，而類似的稱為高支化或多支的大分子則可在一定程度上具有不對(duì)稱性，且還保持多支樹(shù)形結(jié)構(gòu)。樹(shù)狀聚體可以說(shuō)是高支化大分子的單分散變體。高支化的、多支的和樹(shù)枝狀大分子通常由引發(fā)劑或具有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)活性部位的核、多個(gè)周圍分支層以及任選的鏈終止分子層組成。所述層通常稱為段(generations)。
在本文中“腈水解酶催化劑”指具有腈水解酶活性特性的酶催化劑。所述酶催化劑可以全微生物細(xì)胞、透化處理的微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞提取物的一種或多種細(xì)胞成分、部分純化的酶或純化的酶的形式存在。術(shù)語(yǔ)“改良的腈水解酶”、“突變的腈水解酶”和“蛋白質(zhì)工程的腈水解酶”可交換地用于指在相同反應(yīng)條件下，對(duì)于將3-羥基腈(如3-羥基戊腈或3-羥基丁腈)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸，與敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性相比具有顯著改善的腈水解酶活性的現(xiàn)有腈水解酶。如本文使用的“相同的反應(yīng)條件”應(yīng)指相同的和/或基本上相似的反應(yīng)條件，其中所測(cè)定的腈水解酶活性的差異歸因于現(xiàn)有腈水解酶的結(jié)構(gòu)差異，表現(xiàn)為本文所述的氨基酸取代。敏捷食酸菌72W腈水解酶如SEQ ID NO3所示。除起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG之外，其與野生型敏捷食酸菌72W腈水解酶相同(導(dǎo)入以便于在大腸桿菌中表達(dá))。在本發(fā)明中，表達(dá)自pNM18的敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ IDNO3)的編碼序列被認(rèn)為是適合的對(duì)照用于腈水解酶活性比較。
在本發(fā)明中，“一單位酶活性”或“一單位活性”或 “U”定義為在規(guī)定溫度下每分鐘產(chǎn)生1μmol規(guī)定的3-羥基羧酸產(chǎn)物所需要的酶活性量。在本發(fā)明中，例證生產(chǎn)的3-羥基羧酸是3-羥基戊酸和3-羥基丁酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“腈水解酶活性”指每單位質(zhì)量(例如毫克)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞干重或珠子重量的酶活性。測(cè)定的對(duì)照的腈水解酶活性與細(xì)胞干重或珠子重量成正比。由于如使用SDS-PAGE凝膠的激光光密度分析所定量的，無(wú)法區(qū)別在敏捷食酸菌72W對(duì)照(SEQ ID NO4)和改良的突變體之間的腈水解酶表達(dá)水平，因此相對(duì)于細(xì)胞干重或珠子重量測(cè)定對(duì)照和報(bào)道的腈水解酶活性改善。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)“相對(duì)的腈水解酶活性”指表示為參考(對(duì)照)腈水解酶活性的多倍(或分?jǐn)?shù))的腈水解酶活性。在本發(fā)明中，相對(duì)的腈水解酶活性的“顯著改善”是在相同的反應(yīng)條件下，與對(duì)照的腈水解酶活性相比至少高1.2倍的腈水解酶活性的改善。在另一個(gè)實(shí)施方案中中，所述改善是在相同的反應(yīng)條件下，與對(duì)照的腈水解酶活性相比至少高1.8倍的腈水解酶活性的改善。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述改善是在相同的反應(yīng)條件下，與對(duì)照的腈水解酶活性相比至少高5倍的腈水解酶活性的改善。
“3-羥基腈”等同于“β-羥基腈”。“3-羥基腈”包括但不限于，下列化合物3-羥基丙腈、3-羥基丁腈、3-羥基戊腈、3-羥基己腈、3-羥基庚腈、3-羥基壬腈、3-羥基-3-異丙基-4-甲基戊腈、3-羥基-3-苯基丙腈、2-丙基-3-羥基戊腈和3-羥基-3-甲基-n-戊腈。在本發(fā)明中優(yōu)選的3-羥基腈包括3-羥基戊腈和3-羥基丁腈。
“3-羥基羧酸”等同于“β-羥基羧酸”?！?-羥基羧酸”包括但不限于，下列化合物3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基-3-異丙基-4-甲基戊酸、3-羥基-3-苯基丙酸、2-丙基-3-羥基戊酸、3-羥基-2，2-二甲基丙酸和3-羥基-3-甲基-n-戊酸。在本發(fā)明中生產(chǎn)的3-羥基羧酸包括3-羥基戊酸和3-羥基丁酸。所產(chǎn)生的3-羥基羧酸可以酸或其相應(yīng)的銨鹽的形式存在。
“3-羥基戊腈(3-Hydroxyvaleronitrile)”也被稱為3-羥基戊腈(3-hydroxypentanenitrile)和3-HVN。
“3-羥基戊酸(3-Hydroxyvaleric acid)”也被稱為3-羥基戊酸(3-hydroxypentanoic acid)和3-HVA。
“3-羥基丁腈(3-Hydroxybutyronitrile)”也被稱為3-羥基丁腈(3-hydroxybutanenitrile)和3-HBN。
“3-羥基丁酸(3-Hydroxybutyric acid)也被稱為3-羥基丁酸(3-hydroxybutanoic acid)和3-HBA。
術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”、“異源的宿主細(xì)胞”和“宿主生物”指能接受外源或異源基因、基因片段活DNA片段的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“重組生物”、“轉(zhuǎn)化宿主”、“轉(zhuǎn)化體”、“轉(zhuǎn)基因生物”和“轉(zhuǎn)化的微生物宿主”指已用異源或外源DNA轉(zhuǎn)化的宿主生物。本發(fā)明的重組生物表達(dá)編碼活性腈水解酶的外源編碼序列或基因?！稗D(zhuǎn)化”指DNA片段轉(zhuǎn)移入宿主生物中。所述轉(zhuǎn)移的DNA片段可以在染色體或染色體外摻入(即通過(guò)載體)宿主生物中的?！稗D(zhuǎn)化盒”指含有一組便于準(zhǔn)備插入宿主細(xì)胞中的遺傳元件的DNA特定片段，通常作為質(zhì)粒的一部分?！氨磉_(dá)盒”指含有一組便于準(zhǔn)備插入宿主細(xì)胞中的遺傳元件的DNA特定片段，通常作為質(zhì)粒的一部分，還供在宿主中增強(qiáng)基因表達(dá)之用。
術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！焙汀拜d體”指通常攜帶不是宿主細(xì)胞主要新陳代謝的一部分的基因的染色體外元件，且通常以環(huán)狀雙鏈DNA分子形式存在。這樣的元件可以是來(lái)自任何來(lái)源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中許多核苷酸序列業(yè)已被結(jié)合或重組入獨(dú)特的結(jié)構(gòu)中。
“基因”指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括位于編碼序列前面的調(diào)節(jié)序列(5′非編碼序列)和位于編碼序列后面的調(diào)節(jié)序列(3′非編碼序列)?！疤烊换颉敝缸匀唤缰信c它自身的調(diào)節(jié)序列一起出現(xiàn)的基因?！扒逗匣颉敝赋颂烊换蛞酝獾娜魏位?，包括在自然狀態(tài)下不是一起出現(xiàn)的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含來(lái)自不同來(lái)源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或來(lái)自相同來(lái)源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，但是排列方式與天然排列方式不同。“內(nèi)源基因”指處在天然生物的基因組中的天然位點(diǎn)上的天然基因?！巴庠椿颉敝刚Ｇ闆r下不存在于宿主生物中的基因，但是所述基因是通過(guò)基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物中的。外源基因可包含插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是已通過(guò)轉(zhuǎn)化操作導(dǎo)入基因組的基因。
術(shù)語(yǔ)“核酸”指活細(xì)胞中存在的高分子量復(fù)合化合物，其基本單位是通過(guò)磷酸橋連接在一起的核苷酸。核酸分為兩種類型核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。
當(dāng)在上下文的核酸中提及時(shí)，字母“A”、“G”、“T”和“C”分別指嘌呤堿基(腺嘌呤(C5H5N5)和鳥(niǎo)嘌呤(C5H5N5O))以及嘧啶堿基(胸腺嘧啶(C5H6N2O2)和胞嘧啶(C4H5N3O))。
術(shù)語(yǔ)“編碼序列”或“編碼區(qū)”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。術(shù)語(yǔ)“ORF”、“開(kāi)放閱讀框”、“編碼序列”和“編碼區(qū)”可交換地用于指DNA序列的一部分，其翻譯為蛋白質(zhì)。在DNA序列翻譯為蛋白質(zhì)序列中，序列中的ORFs通常通過(guò)指示起始的三堿基對(duì)(起始密碼子)和指示終止的三堿基對(duì)(終止密碼子)來(lái)描繪。
如本文使用的“分離的核酸分子”或“片段”是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，任選地含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。一種以DNA聚合物形式存在的分離的核酸分子可由一個(gè)或多個(gè)cDNA、基因組DNA或合成的DNA的片斷組成。
術(shù)語(yǔ)“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性內(nèi)切酶”指一種催化雙鏈DNA中的特定核苷酸序列水解切割的酶。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指要被檢測(cè)的引物、探針、寡聚物片段、標(biāo)記的復(fù)制封閉探針、以及寡聚體對(duì)照物，并且一般指多聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)以及任何是嘌呤或嘧啶堿基(核苷酸)或修飾的嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷物的多核苷酸。還包括在“寡核苷酸”定義中的是核酸類似物(如肽核酸)和那些業(yè)已在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行修飾的(如硫代磷酸酯鍵)(也參見(jiàn)Thuong等，Biochimie(1985)JuI-Aug 67(7-8)673-684.)。在“核酸”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”的長(zhǎng)度之間，沒(méi)有預(yù)期的差別。
術(shù)語(yǔ)“引物”指一種寡核苷酸(合成的或天然存在的)，其作為核酸合成或當(dāng)置于互補(bǔ)鏈合成為聚合酶所催化的條件下時(shí)沿互補(bǔ)鏈復(fù)制的起始點(diǎn)。
“合適的調(diào)節(jié)序列”指影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工、RNA穩(wěn)定性或相關(guān)編碼序列翻譯且位于編碼序列上游(5′非編碼序列)、之中或下游(3′非編碼序列)的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。
“啟動(dòng)子”指一種能控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3′。啟動(dòng)子可以完全來(lái)自天然基因、或由來(lái)源于天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或甚至包含合成的DNA片斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白的是不同的啟動(dòng)子可在不同組織或細(xì)胞類型中、或在不同發(fā)育階段、或響應(yīng)不同的環(huán)境條件指導(dǎo)基因的表達(dá)。能使基因在大部分細(xì)胞類型中在大多數(shù)時(shí)間下或在大多數(shù)的環(huán)境條件下表達(dá)的啟動(dòng)子，通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。能使基因僅在特定化合物或環(huán)境條件存在下表達(dá)的啟動(dòng)子，通常稱為“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”。由于在大多數(shù)情況下，調(diào)節(jié)序列的確切邊界還未完全確定，因此不同長(zhǎng)度的DNA片段可以具有相同的啟動(dòng)子活性。
如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指核酸序列在單一核酸片段上的締合，使得一個(gè)的功能受另一個(gè)影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能影響編碼序列表達(dá)時(shí)，其就是與編碼序列可操作地連接的(即所述編碼序列受所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)。編碼序列可沿有義或反義方向可操作地與調(diào)控序列連接。
“3′非編碼序列”指位于編碼序列下游并包括多腺苷酸化識(shí)別序列(通常限于真核生物)和其他編碼能影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的序列的DNA序列。多腺苷酸化信號(hào)(通常限于真核生物)通常特點(diǎn)在于影響多聚腺苷酸束添加到mRNA前體的3′末端上。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)充分意識(shí)到，在使用核苷酸密碼子以確定所給定的氨基酸中，特定宿主細(xì)胞具有“密碼子偏倚”。因此，當(dāng)合成用于改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的基因時(shí)，期望設(shè)計(jì)能使其密碼子使用反映優(yōu)選的宿主細(xì)胞密碼子偏倚的基因。對(duì)序列信息可獲得的來(lái)源于宿主細(xì)胞的基因的調(diào)查，可以確定其的密碼子偏倚。密碼子優(yōu)化是本領(lǐng)域眾所周知的，且業(yè)已被描述用于不同的系統(tǒng)，包括但不限于，酵母(Outchkourov等，Protein Expr Purif，24(1)18-24(2002))和大腸桿菌(Feng等，Biochemistry，39(50)15399-15409(2000))。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指由編碼基因產(chǎn)物序列的基因轉(zhuǎn)錄并翻譯為所述基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物通常為蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”可交換地用于指表達(dá)的基因產(chǎn)物。
“密碼子簡(jiǎn)并”指允許核苷酸序列改變而不影響所編碼多肽的氨基酸序列的遺傳密碼的趨異。例如，本領(lǐng)域眾所周知三聯(lián)密碼子CTT、CTC、CTA和CTG都編碼氨基酸亮氨酸。本領(lǐng)域還眾所周知在給定位置產(chǎn)生化學(xué)等價(jià)的氨基酸(“保守改變”)，但不影響所編碼蛋白質(zhì)的功能特性的基因改變是常見(jiàn)的。因此，編碼氨基酸丙氨酸——一種疏水性氨基酸的密碼子，可為編碼另一種更低疏水性殘基(例如甘氨酸)或更高疏水性殘基(例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子所取代，而不影響所編碼蛋白質(zhì)的功能特性。同樣地，用一個(gè)帶負(fù)電荷殘基取代另一個(gè)(例如用天冬氨酸取代谷氨酸)或用一個(gè)帶正電荷殘基取代另一個(gè)(例如用賴氨酸取代精氨酸)也可被認(rèn)為產(chǎn)生功能性等價(jià)產(chǎn)物。導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子N-末端和C-末端部分改變的核苷酸改變也不應(yīng)被認(rèn)為要改變所述蛋白質(zhì)活性。每個(gè)被提議的修飾都充分地落在本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)范圍內(nèi)，如確定所編碼產(chǎn)物的生物學(xué)活性是否保持。
敏捷食酸菌72W (ATCC 55746)腈水解酶敏捷食酸菌72W腈水解酶(EC 3.5.5.1)是一種用于由脂肪族或芳香族腈產(chǎn)生羧酸的穩(wěn)定催化劑(US 6,870,038和Chauhan等，(同上))。還已顯示能催化3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸(US 6,562,603)。
所有已知的腈水解酶，包括敏捷食酸菌72W腈水解酶，在酶活性中心中都具有親核的半胱氨酸(Cowan等，Extremophiles，2207-216(1998)；Pace，H.和Brenner，C，Genome Biology，2(1)reviews 1-9(2001)；和Chauhan等，同上)且都易受硫醇試劑(1.0mM濃度的氯化銅、硝酸銀、乙酸汞或氯化鐵，每一種都引起敏捷食酸菌72W腈水解酶酶活性大幅減少)影響而失活。半胱氨酸殘基也能被不可逆地氧化為亞磺酸，導(dǎo)致酶活性損失。盡管腈水解酶對(duì)多種失活機(jī)制敏感，但是固定化的敏捷食酸菌72W細(xì)胞是穩(wěn)定的，在多次重復(fù)利用反應(yīng)后能保持其大部分腈水解酶活性(US 6,870,038)。
業(yè)已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶和其他細(xì)菌腈水解酶的序列比較(Chauhan等，同上)。該72W腈水解酶具有幾個(gè)保守的特征結(jié)構(gòu)域，包括鄰近氨基末端的16-氨基酸區(qū)(SEQ ID NO4的氨基酸殘基40-55)和含有必需的半胱氨酸殘基的催化區(qū)(SEQ ID NO4的氨基酸殘基160-173)。該半胱氨酸殘基(SEQ ID NO4的Cys164)，連同保守的谷氨酸(SEQ ID NO4的Glu48)以及賴氨酸殘基(SEQ ID NO4的Lys130)，形成在所有腈水解酶中都存在的催化三聯(lián)基序(Pace，H.，和Brenner，C，同上)。盡管在報(bào)道的腈水解酶中存在某些結(jié)構(gòu)上類似的保守，但是這些酶的底物特異性變化很大(O′Reilly，C.和Turner，P.，JAppl Microbiol，951161-1174(2003))。
酶特性在指定條件下，測(cè)試具有改善的相對(duì)腈水解酶活性的突變的72W腈水解酶，所述腈水解酶活性能將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸或?qū)?-羥基丁腈轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酸。使用測(cè)量3-HVN至3-HVA轉(zhuǎn)化的篩選方法來(lái)選擇那些具有改善的腈水解酶活性的腈水解酶突變體。
通過(guò)與對(duì)照(敏捷食酸72W(ATCC 55746)腈水解酶)的腈水解酶活性比較測(cè)定腈水解酶活性的改善。通過(guò)將所測(cè)得的活性單位(U)除以催化劑重量計(jì)算腈水解酶活性。可根據(jù)純化的蛋白質(zhì)重量、細(xì)胞濕量、細(xì)胞干重或固定化的催化劑(GA/PEI-交聯(lián)的催化劑/藻酸鹽珠子)的重量測(cè)定催化劑重量。在本發(fā)明中，腈水解酶活性記錄為每克細(xì)胞干重的活性單位(U/g DCW)或每克催化劑珠子(固定化的催化劑對(duì)照)的活性單位?；诩?xì)胞干重作為單位催化劑重量的腈水解酶活性對(duì)照，應(yīng)當(dāng)考慮腈水解酶蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平。測(cè)定不同轉(zhuǎn)化體和對(duì)照之間的表達(dá)水平，并觀察到是基本上相同的。因此。對(duì)于不同的突變體而言，所報(bào)道的腈水解酶活性的改善歸因于酶結(jié)構(gòu)上的修飾。
在相同的載體(pTrcHis2-TOPO)和宿主(大腸桿TOP10)或大腸桿菌FM5背景中表達(dá)本發(fā)明突變的腈水解酶(以及敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶對(duì)照；SEQ ID NO4)的編碼序列。SDS-PAGE分析(如使用激光光密度分析法定量)證明了在每種突變體(和對(duì)照)中腈水解酶蛋白質(zhì)表達(dá)水平是基本上相同的(如由于使用相同的表達(dá)系統(tǒng)和宿主所預(yù)期的)。相對(duì)酶活性被記錄為對(duì)不同突變的催化劑所測(cè)定的腈水解酶活性對(duì)于在表達(dá)敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ IDNO4)的大腸桿菌對(duì)照轉(zhuǎn)化株中所測(cè)定的腈水解酶活性的倍數(shù)增加。
對(duì)于未固定化的催化劑，通過(guò)測(cè)定每克細(xì)胞干重的0.5 M的3-羥基腈溶液在25℃(pH7.0)下轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸的轉(zhuǎn)化率，確定突變的腈水解酶的腈水解酶活性(U/g細(xì)胞干重)。對(duì)于固定化的催化劑對(duì)照，通過(guò)在35℃(pH7.0)下測(cè)定0.4M的3-HVN溶液轉(zhuǎn)化為3-HVA的轉(zhuǎn)化率確定具體的活性，并記錄為每克珠子的腈水解酶活性單位(U/g珠子)。一單位的腈水解酶活性(U)相當(dāng)于在25℃(或35℃下，對(duì)于固定化的催化劑)下1微摩爾3-羥基羧酸/分鐘的產(chǎn)生。在本發(fā)明中，在3-羥基戊酸或3-羥基丁酸產(chǎn)生的基礎(chǔ)上記錄腈水解酶活性單位。
對(duì)于特定的突變的腈水解酶，使用下列格式之一，關(guān)于敏捷食酸菌72W氨基酸序列(SEQ ID NO4)DNA編碼區(qū)中的點(diǎn)取代突變以及所得到的氨基酸改變得到詳細(xì)說(shuō)明1.擴(kuò)展格式提供了SEQ ID NO4中野生型氨基酸(使用標(biāo)準(zhǔn)的3-字母縮寫)和相應(yīng)的氨基酸殘基位置，之后是在相同的殘基位置處見(jiàn)于突變體中的新氨基酸，例如。“Thr210改變?yōu)锳la”或“Thr210→Ala”描述了一種在SEQ ID NO4中氨基酸殘基第210位處作為突變的結(jié)果——蘇氨酸被該改變?yōu)楸彼岬耐蛔儭?br> 2.簡(jiǎn)寫形式野生型氨基酸(表示為標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫)之后是SEQ ID NO4的氨基酸殘基位置，再后是突變的氨基酸(也表示為標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫)。例如，“T210A”描述了一種在SEQ IDNO4中氨基酸殘基第210位處作為突變的結(jié)果——蘇氨酸被該改變?yōu)楸彼岬耐蛔儭?br> 3-羥基腈水解為3-羥基羧酸通過(guò)將3-羥基腈(例如3-羥基戊腈或3-羥基丁腈)與酶催化劑的水懸浮液混合進(jìn)行水解反應(yīng)。完整的重組微生物細(xì)胞(表達(dá)本發(fā)明突變的腈水解酶)可用作為酶催化劑，無(wú)需任何預(yù)處理?；蛘撸鑫⑸锛?xì)胞可固定在聚合物基質(zhì)(如藻酸鹽珠子或聚丙烯酰胺凝膠(PAG)顆粒)中或固定在不溶性載體(如硅藻土)上以便于所述酶催化劑的回收和再使用。純化的或部分純化的酶還可分離自所述全細(xì)胞，并且可被直接用作為催化劑，或者所述酶可固定在聚合物基質(zhì)中或固定在不溶性載體上。先前已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定化(US 6,870,038)。業(yè)已廣泛地報(bào)道了用于細(xì)胞或分離的酶固定化的方法，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知(Methods in Biotechnology，Vol.1Immobilization ofEnzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，編輯；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997)。
反應(yīng)混合物水溶液中酶催化劑的濃度取決于所述酶催化劑特定的催化活性，并被選擇以獲得所期望的反應(yīng)速率。在水解反應(yīng)中用作為催化劑的微生物細(xì)胞的細(xì)胞濕重通常在每毫升總反應(yīng)體積0.001g-0.250g濕細(xì)胞之間，優(yōu)選為每毫升0.002g-0.050g濕細(xì)胞。
選擇水解反應(yīng)溫度以優(yōu)化反應(yīng)速率和酶催化劑活性的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度可在僅高于反應(yīng)混合物凝固點(diǎn)(大約0℃)到65℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選的反應(yīng)溫度在5℃-35℃。微生物細(xì)胞催化劑懸浮液可通過(guò)將細(xì)胞懸于蒸餾水中，或懸于保持5.0-10.0優(yōu)選6.0-9.0的反應(yīng)初始pH的緩沖水溶液中得到制備。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，由于來(lái)自相應(yīng)的腈官能團(tuán)的羧酸銨鹽的形成，可改變反應(yīng)混合物的pH。反應(yīng)可進(jìn)行直至將3-羥基戊腈或3-羥基丁腈完全轉(zhuǎn)化，不需要控制pH，或在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中可添加適合的酸或堿以維持所需的pH。
在25℃下，發(fā)現(xiàn)3-羥基戊腈和3-羥基丁腈可以任何比例與水完全混溶。在選擇使得3-羥基腈的溶解性也取決于溶液溫度和/或水相中鹽濃度(緩沖液或產(chǎn)物3-羥基羧酸銨鹽)的反應(yīng)條件的情況下，反應(yīng)混合物可最初由兩相組成含有酶催化劑和溶解的3-羥基腈的水相以及有機(jī)相(不溶解的3-羥基腈)。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，3-羥基腈溶解在水相中，最后獲得單一相的產(chǎn)物混合物。反應(yīng)還可通過(guò)以大約等于酶促水解反應(yīng)速率的速率將3-羥基腈添加到反應(yīng)混合物中得以進(jìn)行，由此維持了單一相反應(yīng)混合物水溶液，并避免了潛在的在高原料濃度下酶底物抑制的問(wèn)題。
從產(chǎn)物混合物中分離3-羥基羧酸3-羥基戊酸或3-羥基丁酸可作為質(zhì)子化羧酸及其相應(yīng)的銨鹽的混合物(取決于所述產(chǎn)物混合物的pH)存在于產(chǎn)物混合物中，亦可作為羧酸鹽與任何可額外地存在于產(chǎn)物混合物中的緩沖液額外地存在。視所需，3-羥基羧酸產(chǎn)物可作為質(zhì)子化羧酸或作為羧酸鹽分離自反應(yīng)混合物。
在3-羥基腈完全轉(zhuǎn)化下，產(chǎn)物混合物中3-羥基羧酸的終濃度可在0.001M至3-羥基羧酸產(chǎn)物溶解度極限的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，3-羥基戊酸的濃度應(yīng)在0.10M-2.0M范圍內(nèi)。通過(guò)使用濃鹽酸將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)到1.0-2.5之間、用氯化鈉飽和所得到的溶液、并用諸如甲基叔丁醚、乙醚或二氯甲烷的適合的有機(jī)溶劑萃取3-羥基戊酸，可從反應(yīng)混合物(在除去催化劑后)中分離3-羥基戊酸。然后將所混合的有機(jī)萃取物與合適的干燥劑(如硫酸鎂)一起混合、攪拌，過(guò)濾，并除去溶劑(如通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，以高產(chǎn)率和高純度(通常為98-99％純的)產(chǎn)生所期望的產(chǎn)物。如果需要，所述產(chǎn)物可通過(guò)重結(jié)晶或蒸餾來(lái)進(jìn)一步純化。
使用類似于那些上述用于3-羥基戊腈的方法(參見(jiàn)隨后的實(shí)施例)將3-羥基丁腈酶促水解為3-羥基丁酸，在高達(dá)100％的3-羥基丁腈轉(zhuǎn)化下，以100％產(chǎn)率產(chǎn)生3-羥基丁酸。
使用3-羥基羧酸的聚合物合成先前業(yè)已報(bào)道了使用線型3-羥基羧酸或其酯合成多支共聚多酯(US 6,562,603)，其中至少兩個(gè)重復(fù)單位來(lái)源于至少一個(gè)結(jié)構(gòu)為R1O-CR4R5CR6R7C(O)OR1的線型3-羥基羧酸或其酯，以及至少一個(gè)結(jié)構(gòu)為(R2O)n-R-[C(O)OR1]m的高支化羥基羧酸或其酯，其中R是C1-12烴基或具有n+m自由價(jià)的部分或完全取代的羥基，在此某些或所有的氫原子可被碳原子取代，R1是H、C1-12或羥基取代的C1-12烴基，R3、R4、R5、R6、R7是H或C1-12烴基，R2是H或(O)CR3，n+m是3或更多，且條件是n和m之一是1，這些重復(fù)單位還可來(lái)源于可形成聚酯的等價(jià)化合物，例如羥基羧酸酯?；衔?R2O)n-R-[C(O)OR1]m，由于具有三個(gè)或更多的官能團(tuán)，有時(shí)被稱為高支化單體。超過(guò)一個(gè)這樣的單體可以這樣聚合的形式存在。優(yōu)選n+m是3或4。本領(lǐng)域眾所周知的常用酯化催化劑(例如，質(zhì)子酸、路易斯酸或堿性催化劑包括磺酸，磷酸或膦酸，醇鈦，二烷基錫氧化物，錫、鋅、錳、鈣、鎂或銻的氧化物、碳酸鹽和羧酸鹽)可與這些單體一起使用來(lái)形成聚酯。用于制備聚酯的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
3-羥基羧酸的分析適合于分析3-羥基羧酸產(chǎn)生的分析方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于HPLC、CE、GC和MS。例如，HPLC分析被用于測(cè)定3-羥基戊酸產(chǎn)生的量，其使用了折光率檢測(cè)器和Supelco LC-18-DB柱(15cm×4.6mm直徑)，用溶于10mM乙酸/10mM乙酸鈉水溶液中的7.5％(v/v)甲醇作為流動(dòng)相(對(duì)于3-羥基戊腈反應(yīng))，或Bio-Rad HPX-87H柱(30cm×7.8mm直徑)和在50℃下0.001N硫酸作為流動(dòng)相(對(duì)于3-羥基丁腈反應(yīng))。
微生物表達(dá)本發(fā)明的腈水解酶突變體可在異源宿主細(xì)胞中生產(chǎn)，優(yōu)選在微生物宿主中生產(chǎn)。在本發(fā)明中特別有用的是容易適用于大規(guī)模發(fā)酵方法的細(xì)胞。這樣的生物體是工業(yè)生物工藝領(lǐng)域眾所周知的，其的例子可見(jiàn)于Recombinant Microbes for Industrial and AgriculturalApplications，Murooka等，編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY(1994)，并包括發(fā)酵細(xì)菌以及酵母和絲狀真菌。宿主細(xì)胞可包括但不限于叢毛單胞菌(Comamonas sp.)、棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、短桿菌(Brevibacterium sp.)、紅球菌、固氮菌(Azotobacter sp.)、檸檬酸桿菌(Citrobacter sp.)、腸桿菌(Enterobacter sp.)、梭狀芽孢桿菌(Clostridiumsp.)、克雷白氏桿菌(Klebsiella sp.)、沙門氏菌(Salmonella sp.)、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、糖酵母(Saccharomycessp.)、接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)、畢赤氏酵母(Pichia sp.)、克魯維氏酵母(Kluyveromyces sp.)、假絲酵母(Candida sp.)、漢森氏酵母(Hansenula sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、德巴利氏酵母(Debaryomycessp.)、毛霉(Mucor sp.)、球擬酵母(Torulopsis sp.)、甲基桿菌(Methylobacteria sp.)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、埃希氏桿菌(Escherichiasp.)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)、根瘤菌(Rhizobium sp.)和鏈霉菌(Streptomyces sp.)。特別優(yōu)選的是大腸桿菌。其中突變的腈水解酶基因可被表達(dá)的適合的大腸桿菌宿主細(xì)胞的例子包括，但不限于在此列舉的宿主細(xì)胞和MG1655(ATCC 47076)、FM5(ATCC 53911)、W3110(ATCC 27325)、MC4100(ATCC 35695)、W1485(ATCC 12435)及其衍生物。
先前已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶的異源表達(dá)(Chauhan等，同上和US 6,870,038)。Chauhan等報(bào)道了一種表達(dá)活性敏捷食酸菌72W腈水解酶的大腸桿菌菌株(大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177))。與野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO3)相比，該重組表達(dá)的(大腸桿菌SS1001)腈水解酶的編碼序列含有兩個(gè)微小的序列改變。起始密碼子由GTG改變?yōu)锳TG以利于重組表達(dá)，且在克隆過(guò)程中導(dǎo)入引起鄰近C-末端的單個(gè)氨基酸改變的人工產(chǎn)物(Pro367 [CCA]→Ser[TCA])。
本發(fā)明突變的腈水解酶，如SEQ ID NOs5、7、11、13、15和17提供的編碼序列所示，在重組宿主(大腸桿菌)中表達(dá)。在工業(yè)上合適的宿主中進(jìn)行重組表達(dá)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，與由大多數(shù)獲得目的基因的微生物得到的遺傳工具相比，對(duì)于大多數(shù)常用的生產(chǎn)宿主，其遺傳工具箱通常得到充分開(kāi)發(fā)。與在天然宿主中表達(dá)相比，在這些宿主中重組表達(dá)一般更具成本效率。例如，業(yè)已顯示當(dāng)通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，敏捷食酸菌72W細(xì)胞得在甘油——一種相當(dāng)昂貴的碳底物上生長(zhǎng)，而使用便宜的葡萄糖卻無(wú)法成功地生長(zhǎng)。與此相反，與敏捷食酸菌72W細(xì)胞相比，在約一半時(shí)間內(nèi)，大腸桿菌轉(zhuǎn)化體就可在葡萄糖上生長(zhǎng)至相同的細(xì)胞密度，顯著地降低了生物催化劑生產(chǎn)成本(US 6,870,038)。
含有指導(dǎo)高水平外源蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這些可用于構(gòu)建用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明突變的腈水解酶的基因產(chǎn)物的嵌合基因。然后，通過(guò)轉(zhuǎn)化可將這些嵌合基因?qū)脒m當(dāng)?shù)奈⑸镏校蕴峁└咚降耐蛔兊碾嫠饷副磉_(dá)。本發(fā)明的核苷酸被用來(lái)產(chǎn)生具有相對(duì)于天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶(pNM18對(duì)照；SEQ ID NO4)增加的或改變的活性水平的基因產(chǎn)物。
此外，在改變宿主細(xì)胞特性上嵌合基因應(yīng)當(dāng)是有效的。例如，在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下，將至少一個(gè)編碼本發(fā)明的腈水解酶的嵌合基因拷貝導(dǎo)入宿主細(xì)胞，賦予了該宿主細(xì)胞改善的將3-羥基戊腈或3-羥基丁腈分別轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸或3-羥基丁酸的能力。本發(fā)明的嵌合基因應(yīng)包含適合的用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明突變的腈水解酶序列基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列可包括，但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。如果這些序列來(lái)源于宿主生物體，則是優(yōu)選的；但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到也可以使用異源調(diào)節(jié)序列。
通過(guò)將嵌合基因克隆入適合的表達(dá)載體中，其可被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦??？捎糜谶m合的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體或表達(dá)盒是本領(lǐng)域眾所周知的。一般而言，所述載體或表達(dá)盒含有指導(dǎo)有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、可選擇的標(biāo)記以及容許自主復(fù)制或染色體整合的序列。適合的載體包含具有轉(zhuǎn)錄起始控制的編碼序列的5′區(qū)和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段的3′區(qū)。盡管這樣的控制區(qū)無(wú)需來(lái)源于選擇作為生產(chǎn)宿主的特定物種自身的基因，當(dāng)這兩個(gè)控制區(qū)都來(lái)源于與宿主細(xì)胞同源的基因時(shí)，則是最優(yōu)選。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)序列應(yīng)包括啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子一般響應(yīng)于特定的刺激(如IPTG誘導(dǎo)的lac啟動(dòng)子)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以響應(yīng)于多種刺激，包括化學(xué)藥品、生長(zhǎng)周期、溫度改變、pH改變和摩爾滲透壓濃度改變，僅舉了幾個(gè)例子。
用于在期望的宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)本發(fā)明突變的腈水解酶表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子為數(shù)眾多，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母屬中表達(dá))；AOX1(用于在畢赤氏酵母中表達(dá))；和lac、trp、1PL、1PR、T7、tac、PBAD、npr和trc(用于在大腸桿菌中表達(dá))。例子包括至少一種選自大腸桿菌的色氨酸操縱子啟動(dòng)子Ptrp、大腸桿菌的乳糖操縱子啟動(dòng)子Plac、大腸桿菌的Ptac啟動(dòng)子、λ噬菌體右翼啟動(dòng)子PR、λ噬菌體左翼啟動(dòng)子PL、T7啟動(dòng)子和來(lái)自甲醇酵母(Pichia pastoris)的GAP基因的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，或是至少一種強(qiáng)啟動(dòng)子，選自由從毛單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、固氮菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷白氏桿菌屬、沙門氏菌屬、乳酸桿菌屬、曲霉屬、糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、接合酵母屬、克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、漢森氏酵母屬、杜氏藻屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、Methylobacteria、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬組成的微生物。
終止控制區(qū)還可來(lái)源于不同的優(yōu)選宿主自身的基因。任選地，終止位點(diǎn)可以是不需要的；但是，如果包括的話，則是最優(yōu)選的。
此外，所插入的遺傳物質(zhì)可包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)。所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)可來(lái)自λ噬菌體CII基因或選自從毛單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、固氮菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷白氏桿菌屬、沙門氏菌屬、乳酸桿菌屬、曲霉屬、糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、接合酵母屬、克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、漢森氏酵母屬、杜氏藻屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、Methylobacteria、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
任選地，本發(fā)明的基因產(chǎn)物可優(yōu)選地為轉(zhuǎn)化的宿主的分泌產(chǎn)物。期望蛋白質(zhì)分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中簡(jiǎn)化了純化程序并降低了費(fèi)用。分泌信號(hào)序列通常用于促進(jìn)可表達(dá)的蛋白質(zhì)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞膜?？赏ㄟ^(guò)將編碼分泌信號(hào)的DNA序列摻入宿主中產(chǎn)生能分泌的轉(zhuǎn)化的宿主。用于選擇適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)例如EP546049；WO 9324631)。所述分泌信號(hào)DNA可位于表達(dá)控制DNA和本發(fā)明的編碼序列或編碼序列片段之間，以及位于帶有后者的閱讀框中。
蛋白質(zhì)工程通過(guò)誘變生產(chǎn)本發(fā)明突變的腈水解酶。預(yù)期本發(fā)明的核苷酸可用于生產(chǎn)具有進(jìn)一步增強(qiáng)的或改變的活性的基因產(chǎn)物。用于突變天然基因序列以產(chǎn)生具有改變的或增強(qiáng)的活性的基因產(chǎn)物的多種方法是公知的，包括但不限于1)隨機(jī)誘變，2)結(jié)構(gòu)域交換(使用鋅指結(jié)構(gòu)域或限制性內(nèi)切酶)，3)易錯(cuò)PCR(Melnikov等，Nucleic Acids Research，27(4)1056-1062(1999))；4)位點(diǎn)定向誘變(Coombs等，Proteins(1998)，pp259-311，1 plate.Angeletti，Ruth Hogue，Ed.，AcademicSan Diego，CA)；和5)“基因改組”(US 5,605,793；US 5,811,238；US 5,830,721；和US5,837,458，在此并入作為參考)。
通過(guò)錯(cuò)誤摻入核苷酸，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可用于擴(kuò)增帶有伴隨多個(gè)突變產(chǎn)生的DNA片段。這可通過(guò)改變PCR條件例如改變dNTPs比率或在反應(yīng)中添加不同數(shù)量的氯化錳而得以實(shí)現(xiàn)(Fromant等，AnalBiochem，224(1)347-53(1995)；Lin-Goerke等，Biotechniques，23(3)409-12(1997))。然后，可克隆突變的DNA片段庫(kù)以產(chǎn)生突變質(zhì)粒文庫(kù)，在諸如大腸桿菌的宿主中表達(dá)后，接著可對(duì)所述文庫(kù)進(jìn)行篩選。
由于基因改組的方法容易實(shí)施且誘變率高并易于篩選，因此其是特別具有吸引力的?；蚋慕M的方法包括在具有與目的基因相似性和/或差異的額外幾群DNA區(qū)存在下，用限制性內(nèi)切核酸酶將目的基因切割為特定大小的片段。然后，該片段庫(kù)應(yīng)變性并重退火以產(chǎn)生突變的基因。接著，篩選改變活性的所述突變的基因。
可通過(guò)該方法突變本發(fā)明的微生物序列，并篩選改變或增強(qiáng)的活性。該序列應(yīng)當(dāng)是雙鏈的且可以具有從50bp到10kB不同的長(zhǎng)度。使用本領(lǐng)域眾所周知的限制性內(nèi)切核酸酶，該序列可以被隨機(jī)消化為約10bp到1000bp的片段(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.E.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)；在下文中“Maniatis”)。除本發(fā)明的微生物序列之外，可以添加與微生物序列全部或部分能雜交的片段群。同樣地，也可以添加不能與本發(fā)明序列雜交的片段群。一般來(lái)說(shuō)，與總的核酸相比，這些附加的片段群以約10-20倍過(guò)量添加。一般地，如果執(zhí)行該方法，則混合物中不同的特定核酸片段的數(shù)目會(huì)在約100至約1000。對(duì)混合的隨機(jī)核酸片段群變性以形成單鏈酸片段，然后重退火。只有那些具有與其他單鏈核酸片段同源的區(qū)域的單鏈核酸片段會(huì)重退火。可通過(guò)加熱變性隨機(jī)核酸片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定完全變性雙鏈核酸所必需的條件。優(yōu)選溫度為約80℃-100℃?？赏ㄟ^(guò)冷區(qū)重退火核酸片段。優(yōu)選溫度為約20℃-75℃?？赏ㄟ^(guò)添加聚乙二醇(“PEG”)或鹽加速?gòu)?fù)性。適合的鹽濃度可在0mM-200mM。然后在核酸聚合酶和dNTPs(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)存在下溫育退火的核酸片段。所述核酸聚合酶可以是Klenow片段、Taq聚合酶或任何其他本領(lǐng)域公知的DNA聚合酶?？稍谕嘶鹣惹?、退火同時(shí)或退火后，添加所述聚合酶到隨機(jī)核酸片段。在聚合酶存在下，變性、復(fù)性和溫育循環(huán)重復(fù)期望的次數(shù)。優(yōu)選所述循環(huán)重復(fù)約2-50次，更優(yōu)選所述次序重復(fù)10-40次。所得到的核酸是一種約50bp至約100kB的較大的雙鏈多核苷酸，且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的克隆和表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)于表達(dá)和改變的活性可進(jìn)行篩選(Maniatis，同上)。
此外，可通過(guò)使用基因改組(外顯子改組)方法融合功能域裝配雜合蛋白質(zhì)(Nixon等，PNAS，941069-1073(1997))。本發(fā)明基因的功能域可與其他基因的功能域相結(jié)合以產(chǎn)生具有期望催化功能的新酶?？墒褂肞CR重疊延伸方法構(gòu)建雜合酶并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)將其克隆入不同的表達(dá)載體中。
3-羥基羧酸的工業(yè)生產(chǎn)在期望使用本發(fā)明突變的腈水解酶基因商業(yè)性生產(chǎn)3-羥基羧酸之處，多種培養(yǎng)方法可應(yīng)用于生產(chǎn)腈水解酶催化劑。發(fā)酵，其可以分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)的模式進(jìn)行，為本領(lǐng)域所常見(jiàn)和眾所周知的(ThomasD.Brock inBiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，(1989)；Deshpande，Mukund V.，Appl. Biochem. Biotechnol.36(3)227-234(1992))。
典型的分批培養(yǎng)方法是一種封閉系統(tǒng)，在其中培養(yǎng)基組合物在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)就設(shè)定好的，在培養(yǎng)過(guò)程中不進(jìn)行人工改變。因此，在培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)始時(shí)，就將期望的生物體接種培養(yǎng)基，并且在不添加任何物質(zhì)到該系統(tǒng)中的情況下，讓其生長(zhǎng)或進(jìn)行代謝活動(dòng)。但是，一般來(lái)說(shuō)，“分批”培養(yǎng)是針對(duì)碳源的添加而言的分批，并且通常試圖控制諸如pH和氧濃度的因素。在分批系統(tǒng)中，該系統(tǒng)的代謝物和生物量組成穩(wěn)定地改變著，直到培養(yǎng)結(jié)束。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞通過(guò)靜止停滯期到高速生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期并最終到達(dá)穩(wěn)定期，其中，在穩(wěn)定期生長(zhǎng)速度降低或停止。如果不進(jìn)行處理。處在靜止期的細(xì)胞最終會(huì)死亡。對(duì)數(shù)期的細(xì)胞通常決定最終產(chǎn)物或在某些系統(tǒng)中的中間產(chǎn)物的產(chǎn)量。靜止期或指數(shù)期后生產(chǎn)可以在其他系統(tǒng)中獲得。
標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的變化形式是補(bǔ)料分批系統(tǒng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法同樣適用于本發(fā)明，并且包括典型的分批系統(tǒng)，所不同的是，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，以增量形式添加底物。當(dāng)代謝物抑制傾向于抑制細(xì)胞的代謝以及當(dāng)培養(yǎng)基中需要具有有限量的底物時(shí)，可以使用補(bǔ)料分批系統(tǒng)。要測(cè)定補(bǔ)料分批系統(tǒng)的實(shí)際底物濃度是困難的，因此，根據(jù)可測(cè)定因素，如pH，溶解氧，以及諸如CO2的廢氣的分壓的變化進(jìn)行估算。分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法是常用的并且為本領(lǐng)域眾所周知，其例子可見(jiàn)于Brock(同上)和Deshpande(同上)。
腈水解酶催化劑的商業(yè)性生產(chǎn)還可以通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。連續(xù)培養(yǎng)是一種開(kāi)放系統(tǒng)，其中，將規(guī)定的培養(yǎng)基連續(xù)地添加到生物反應(yīng)器中，并且同時(shí)將等量的條件培養(yǎng)基取出進(jìn)行加工。連續(xù)培養(yǎng)通常將細(xì)胞保持在恒定的高液相密度下，其中，細(xì)胞主要是在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)?；蛘?，可用固定化的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，其中連續(xù)添加碳和養(yǎng)分以及不斷地從細(xì)胞團(tuán)塊中將有價(jià)值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物或廢棄產(chǎn)物取出?？墒褂枚喾N由天然和/或合成材料組成的載體進(jìn)行細(xì)胞固定化。
連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)可以調(diào)節(jié)能夠影響細(xì)胞生長(zhǎng)或最終產(chǎn)物濃度的一種因素或任意數(shù)目的因素。例如，一種方法能保持限制養(yǎng)分，如讓碳源或氮含量處在固定比例上，并且允許所有其他參數(shù)處在適當(dāng)水平上。在其他系統(tǒng)中，可以連續(xù)地改變影響生長(zhǎng)的多種因素，同時(shí)保持通過(guò)培養(yǎng)基濁度測(cè)量的細(xì)胞濃度恒定。連續(xù)系統(tǒng)試圖保持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件，因此，通過(guò)取出培養(yǎng)基所導(dǎo)致的細(xì)胞減少，必須與培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度平衡。調(diào)節(jié)連續(xù)培養(yǎng)方法的養(yǎng)分和生長(zhǎng)因子的方法，以及用于使產(chǎn)物形成速度最大化的方法在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域中是眾所周知的，并且由Brock(同上)詳細(xì)披露了多種方法。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有適合的碳底物。適合的碳底物可以包括，但不限于諸如葡萄糖和果糖的單糖、諸如乳糖或蔗糖的二糖、諸如淀粉或纖維素或其混合物的多糖、以及來(lái)自諸如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖漿和大麥芽的可再生原料的未純化的混合物。因此，預(yù)計(jì)用于本發(fā)明的碳源可包括多種含碳底物，并且僅受受限于所選擇的生物體。
實(shí)施例適用于細(xì)菌培養(yǎng)物保持和生長(zhǎng)的材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。適用于下列實(shí)施例的技術(shù)可見(jiàn)于Manual ofMethods for GeneralBacteriology；Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W. Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，編輯；American Society for MicrobiologyWashington，DC，(1994)或Brock(同上)。
PCR擴(kuò)增、通過(guò)核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶產(chǎn)生期望的末端用于DNA克隆的DNA修飾、連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化需要的操作是本領(lǐng)域眾所周知的。在此使用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且由Maniatis(同上)和T.J.Silhavy等(inExperiments withGene Fusions，(1984)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring，NY)；以及Ausubel等(inCurrent Protocols in MolecularBiology(1994-1998)John Wiley & Sons，Inc.，New York)所描述。
除非另作說(shuō)明，所有用于細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和保持的試劑和原料都獲得自Aldrich Chemicals(Milwankee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。業(yè)已通過(guò)在三乙基鋁存在下將氰化氫與1，2-環(huán)氧丁烷反應(yīng)(FR 1446127)，以通過(guò)在二正丁基硼烷基三氟甲基磺酸鹽(di-n-butylboryl triflate)存在下乙腈與丙醛的反應(yīng)制備了3-羥基戊腈(Hamana等，Chem.Lett.1401-1404(1982))。業(yè)已通過(guò)脂肪酶催化的2-氰基-1-甲基乙酸乙酯水解制備了旋光性的3-羥基戊腈(Itoh等，J.Org.Chem.629165-9172(1997))。
說(shuō)明書中相應(yīng)于測(cè)量單位、技術(shù)、特性或化合物的縮寫如下“s”表示秒，“min”表示分鐘，“h”表示小時(shí)，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mM”表示毫摩爾，“M”表示摩爾，“mmol”毫摩爾，“amp”表示氨芐青霉素，“kb”表示千堿基，“kd”表示千道爾頓，“nm”表示納摩，和“wt“表示重量，“ORF”表示開(kāi)放閱讀框，“PCR”表示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，“SSC”表示檸檬酸鈉鹽水緩沖液，“HPLC”表示高效液相色譜，“ca”表示大約，“rxn”表示反應(yīng)，“dcw”表示細(xì)胞干重，“OD”表示在指定波長(zhǎng)下的光密度，“AU”表示吸光度單位，“rpm”表示每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，“slpm”表示每分鐘標(biāo)準(zhǔn)升數(shù)，“U”表示單位，“IU”表示國(guó)際單位，以及“IPTG”表示異丙基β-D-硫代半乳糖苷。
實(shí)施例1通過(guò)易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)構(gòu)建敏捷食酸菌72W腈水解酶隨機(jī)誘變文庫(kù)根據(jù)廠商使用說(shuō)明，使用Puregene DNA分離試劑盒(GentraSystems，Minneapolis，MN)由敏捷食酸72W(ATCC 55746)制備基因組DNA。根據(jù)GeneMorph PCR誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)提供的使用說(shuō)明，對(duì)敏捷食酸菌72W腈水解酶基因(編碼序列；SEQ IDNO3)進(jìn)行易錯(cuò)PCR，使用標(biāo)識(shí)為SEQ ID NO1(5′-GCGCATATGGTTTCGTATAACAGCAAGTTCC-3′)和SEQ ID NO2(5′-ATAGGATCCTTATGGCTACTTTGCTGGGACCG-3′)的引物。使用的推薦產(chǎn)生低突變頻率(0-3次突變/kb)和中等突變頻率(3-7次突變/kb)的反應(yīng)條件。根據(jù)pTrcHis2 TOPO TA表達(dá)試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的使用說(shuō)明，將10％的1.1kb PCR產(chǎn)物連接入表達(dá)載體pTrcHis2 TOPO中。根據(jù)供應(yīng)廠商(Invitrogen)的推薦，將一半的連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中。將1％的轉(zhuǎn)化混合物涂布(plated)在補(bǔ)充有50mg/L氨芐青霉素的LB平板上。所得到的轉(zhuǎn)化體共計(jì)200-400個(gè)克隆，表明所產(chǎn)生的總PCR產(chǎn)物能產(chǎn)生400,000-800,000個(gè)克隆，遠(yuǎn)多于篩選改善的酶活性所需的。通過(guò)隨機(jī)選擇的克隆樣品的核苷酸序列分析證實(shí)了突變頻率。如所預(yù)計(jì)的，序列分析也證實(shí)了大約50％的插入物是以正向存在。SDS-PAGE分析證實(shí)了當(dāng)如推薦的進(jìn)行生長(zhǎng)和誘導(dǎo)時(shí)(Invitrogen)，基本上所有的克隆都具有表達(dá)41kD腈水解酶蛋白質(zhì)的正向插入物。
此外，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增了敏捷食酸菌72W腈水解酶基因，使用標(biāo)識(shí)為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的引物，并根據(jù)廠商推薦，將所得到的DNA產(chǎn)物克隆入pTrcHis2-TOPO(Invitrogen)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pNM18。用pNM18轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10產(chǎn)生的菌株用作為對(duì)照。除起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG之外，pNM18中的敏捷食酸菌72W腈水解酶“對(duì)照”序列和野生型敏捷食酸菌72W的編碼序列相同，利于在大腸桿菌中表達(dá)。
實(shí)施例2對(duì)敏捷食酸菌72W腈水解酶隨機(jī)誘變文庫(kù)篩選增加的腈水解酶活性將來(lái)自每個(gè)易錯(cuò)PCR文庫(kù)的大約5,000個(gè)克隆涂布在補(bǔ)充有50mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂上。使用機(jī)器人技術(shù)在96-孔微量滴定板中進(jìn)行高通量篩選。在單個(gè)克隆于補(bǔ)充有50mg/L氨芐青霉素和1mMIPTG的液體LB中在37℃200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)18h后，培養(yǎng)物在37℃下補(bǔ)充10mM 3-羥基戊腈(3-HVN)，持續(xù)1h，80Hz線性振蕩。通過(guò)濾出細(xì)菌終止反應(yīng)，并將要被分析的上清液密封在微量滴定板中并貯藏在4℃直到分析。通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法(APCI-MRM，流動(dòng)相95％MeOH/5％H20，5mL/min；注射針洗滌50％MeOH/50％H2O，每注射針4mL/min)測(cè)定產(chǎn)生的3-羥基戊酸(3-HVA)。鑒定了顯示3-HVN轉(zhuǎn)化超過(guò)對(duì)照(大腸桿菌TOP10/pNM18)大約5倍的三個(gè)克隆，并命名為大腸桿菌TOP10/pNM18/B4、大腸桿菌TOP10/pNM18/B2和大腸桿菌TOP10/pNM18/H9。
實(shí)施例3測(cè)定大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)、大腸桿菌TOP10/pNM18/B4、大腸桿菌TOP10/pNM18/B2和大腸桿菌TOP10/pNM18/H9腈水解酶活性通過(guò)將含有50mg/L氨芐青霉素的50mL的LB培養(yǎng)基添加到無(wú)菌的125mL燒瓶中，然后刮取冷凍的細(xì)胞原液入燒瓶中并在37℃和200rpm下溫育所得到混合物12-16h，制備接種物。記錄所得到培養(yǎng)物的光密度，然后將80％甘油水溶液以15％(v/v)的終濃度添加，并將所得到接種物的14.3mL等分試樣添加到50-mL離心管中，在使用前冷凍貯藏在-80℃下。向4-L無(wú)菌燒瓶中添加1.80L的LB肉湯、0.9mL氨芐青霉素水溶液(100mg/mL)以及1.8mL的IPTG水溶液(1.0M)。然后，向該燒瓶中添加87.5mL的大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)、大腸桿菌TOP10/pNM18/B4、大腸桿菌TOP10/pNM18/B2或大腸桿菌TOP10/pNM18/H9接種物，混合燒瓶的內(nèi)含物，并將所得到的混合物的250-mL等分試樣轉(zhuǎn)移到六個(gè)無(wú)菌1-L燒瓶的每一個(gè)中。培養(yǎng)物在37℃下以200rpm旋轉(zhuǎn)混合溫育8h，通過(guò)在4℃下離心收集來(lái)自每個(gè)燒瓶的細(xì)胞，并冷凍貯藏在-80℃下。
向裝備有磁力攪拌條的4-mL玻璃管形瓶中添加1.0mL的1.0M 3-羥基戊腈水溶液，并再溫控水浴中將管形瓶及其內(nèi)含物平衡在25℃。一邊攪拌，一邊將預(yù)平衡至25℃的含有400mg濕細(xì)胞糊的1.0mL的0.100M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)添加到管形瓶中。在預(yù)定時(shí)間，取出樣品(0.100mL)并與由0.100mL水、0.020mL的6.0N乙酸和0.200mL的0.20M丁酸鈉水溶液(HPLC外標(biāo)物)組成的溶液混合。離心所得到的混合物，并通過(guò)HPLC對(duì)所得到的上清液分析3-羥基戊酸，使用Supelco LC-18-DB柱(15cm×4.6mm)流動(dòng)相10mM乙酸鈉(NaOAc)水溶液、10mM乙酸(AcOH)、7.5％(v/v)甲醇?；?-羥基戊酸的產(chǎn)生速率，測(cè)定中所使用的每一細(xì)胞糊的細(xì)胞干重(dcw)被用于測(cè)定大腸桿菌TOP10/pNM18(表1)、大腸桿菌TOP10/pNM18/B4(表2)、大腸桿菌TOP10/pNM18/B2(表3)和大腸桿菌TOP10/pNM18/H9(表4)的腈水解酶活性。大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)、大腸桿菌TOP10/pNM18/B4、大腸桿菌TOP10/pNM18/B2和大腸桿菌TOP10/pNM18/H9相對(duì)腈水解酶活性的比較列于表5中。
表1大腸桿菌TOP10/pNM18腈水解酶活性(對(duì)照)
表2大腸桿菌TOP10/pNM18/B4腈水解酶活性
表3大腸桿菌TOP10/pNM18/B2腈水解酶活性
表4大腸桿菌TOP10/pNM18/H9腈水解酶活性
表5TOP10/pNM18突變體腈水解酶活性總結(jié)
實(shí)施例4鑒定敏捷食酸菌72W腈水解酶中賦予增加的腈水解酶活性的突變使用核苷酸序列分析確定在3個(gè)克隆(TOP10/pNM18/B4、TOP10/pNM18/B2和TOP10/pNM18/H9)每一個(gè)中存在的具有增加的腈水解酶活性的突變，并推斷相應(yīng)的氨基酸改變。與TOP10/pNM18對(duì)照(SEQ ID NOs3和4)相比，TOP10/pNM18/B2和TOP10/pNM18/H9(SEQ ID NOs5和6)，其是相同的，具有一個(gè)氨基酸改變(Thr210改變?yōu)锳la；T210A)，TOP10/pNM18/B4(SEQ ID NOs7和8)具有3個(gè)氨基酸改變(Tyr65改變?yōu)镃ys(Y65C)；Phe174改變?yōu)镮le(F174I)；以及Thr210改變?yōu)镮le(T210I))。這些改變都不包含在該酶的催化結(jié)構(gòu)域中，或眾多腈水解酶之間通常的保守區(qū)中，表明無(wú)法預(yù)測(cè)演繹出在這些特定殘基處的改變會(huì)產(chǎn)生腈水解酶活性改善。如通過(guò)SDS-PAGE凝膠激光光密度分析所定量的，這些改變都不具有任何可檢測(cè)到的對(duì)腈水解酶蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的影響。
實(shí)施例5在蘇氨酸殘基210處的飽和誘變使用QuikChange位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)將72W腈水解酶第210位的蘇氨酸殘基改變?yōu)槠渌?9種氨基酸的任何一種。根據(jù)廠商使用說(shuō)明，使用簡(jiǎn)并寡核苷酸，并通過(guò)核苷酸測(cè)序測(cè)定證實(shí)所產(chǎn)生的密碼子改變。通過(guò)使用非簡(jiǎn)并的寡核苷酸摻入期望的特定密碼子改變，制備通過(guò)上述方法無(wú)法獲得的任何密碼子改變。例如，使用標(biāo)識(shí)為SEQ ID NO9(5′-CGAAGCCAACGCGACGGTCATGCGCTCGTACGCAATCGAAGG-3′)和SEQ ID NO10(5′-CCTTCGATTGCGTACGAGCGCATGACCGTCGCGTTGGCTTCG-3′)的引物(下劃線核苷酸顯示新的密碼子)獲得210Met(T210M)。
測(cè)定所有20種酶變體的腈水解酶活性。除先前鑒定的210AIa(T210A)改善之外(實(shí)施例3和4)，對(duì)于210Cys(T210C，SEQ ID NOs11和12)觀察到相對(duì)于對(duì)照(pNM18)增加的活性(表6和7)。如通過(guò)SDS-PAGE分析所測(cè)定的，210Cys改變對(duì)腈水解酶蛋白質(zhì)的產(chǎn)生沒(méi)有可檢測(cè)到的影響。我們發(fā)現(xiàn)在殘基210處沒(méi)有其他改變能產(chǎn)生腈水解酶活性改善；對(duì)于腈水解酶活性，某些改變沒(méi)有效果(例如，210VaI(T210V))，并且某些改變具有有害的效果(例如，210GIy(T210G))。這些結(jié)果表明無(wú)法預(yù)測(cè)演繹出在殘基210處任何給定突變的效果。
表6大腸桿菌TOP10/pNM18/210Cys腈水解酶活性
表7210Cys突變體腈水解酶活性總結(jié)
實(shí)施例6大腸桿菌TOP10/pNM18細(xì)胞(對(duì)照)或大腸桿菌TOP10/pNM18/H9細(xì)胞在鈣-交聯(lián)的藻酸鹽中的固定化向4.0-L無(wú)菌燒瓶中添加1.80L的LB肉湯、0.9mL氨芐青霉素水溶液(100mg/mL)和1.8mL的IPTG水溶液(1.0M)。然后，向該燒瓶中添加87.5mL大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)或大腸桿菌TOP10/pNM18/H9接種物，混合燒瓶?jī)?nèi)含物，并將所得到混合物的250-mL等分試樣轉(zhuǎn)移到7個(gè)無(wú)菌1-L燒瓶的每一個(gè)中。在37℃下以200rpm旋轉(zhuǎn)混合溫育培養(yǎng)物8h，混合得到的細(xì)胞懸浮液，在40℃離心收集細(xì)胞并貯藏于-80℃。對(duì)于大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)，在600nm處的平均起始OD為0.133 AU，8h后平均結(jié)束OD為2.13 AU，產(chǎn)生ca.6g細(xì)胞糊。對(duì)于大腸桿菌TOP10/pNM18/H9，平均結(jié)束OD為1.68 AU，產(chǎn)生ca.5g細(xì)胞糊。
在50℃下，一邊快速攪拌，一邊緩慢地向裝備有磁力攪拌條并含有7.46g蒸餾的去離子水的100-mL培養(yǎng)瓶中添加0.413g的FMCBioPolymer ProtanalLF 10/60藻酸鹽。一邊快速攪拌，一邊將混合物加熱到75-80℃，直至藻酸鹽完全溶解，并在水浴中將所得到的溶液冷卻到25℃。攪拌的同時(shí)向藻酸鹽懸浮液添加4.75g大腸桿菌(pNM18)濕細(xì)胞糊(23.7％細(xì)胞干重)和2.37mL蒸餾水，或4.97g大腸桿菌(pNM18/H9)濕細(xì)胞糊(22.6％細(xì)胞干重)和2.15mL蒸餾水。在25℃下，攪拌的同時(shí)通過(guò)注射器將細(xì)胞/藻酸鹽混合物逐滴添加到80mL的0.20M乙酸鈣緩沖液(pH7.0)中。在攪拌2h后，將緩沖液從所得到珠子上輕輕倒出，在25℃下重懸于30mL的0.20M乙酸鈣緩沖液(pH7.0)中。攪拌的同時(shí)，在25℃下添加0.61g的25wt％戊二醛(GA)水溶液并與珠子混合1.0h。接著，向該懸浮液添加2.42g的12.5wt％聚氮丙啶(PEI)(BASF LupasolPR971L，平均分子量ca.750,000)水溶液，并在25℃下與珠子再混合1h。然后在25℃下用30mL的5mM乙酸鈣緩沖液(pH7.0)洗滌交聯(lián)的珠子兩次，并在5℃下貯藏于含有1.0M乙酸銨、4mM乙酸鈣和10mM碳酸氫銨的含水緩沖液(pH7.1)中。
實(shí)施例7藻酸鹽-固定的大腸桿菌TOP 10/pNM18/H9或大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)作為催化劑用于3-羥基戊腈水解的比較在裝備有高架攪拌器的50-mL夾套式反應(yīng)器(使用環(huán)流式溫度水浴中控制溫度)放置6.0g如實(shí)施例6所述制備的GA/PEI-交聯(lián)的大腸桿菌TOP10/pNM18細(xì)胞/藻酸鹽珠子(對(duì)照)。向該反應(yīng)器中添加13.4mL蒸餾的去離子水、0.2mL 0.20M乙酸鈣緩沖液(pH7.0，在反應(yīng)混合物中2.0mM鈣離子終濃度)和0.40mL(0.386g)3-羥基戊腈(0.400M總濃度)，并在35℃下攪拌混合物。將樣品(0.200mL)與0.200mL 200mM丁酸鈉(HPLC外標(biāo)物)混合，通過(guò)HPLC分析上清液。25h后，3-HVN的轉(zhuǎn)化率為100％，3-HVA的產(chǎn)率為100％。大腸桿菌TOP10/pNM18細(xì)胞/藻酸鹽珠子催化劑(對(duì)照)的腈水解酶活性為0.4493-HVN U/g珠子。
除催化劑是6.0g如實(shí)施例6所述制備的GA/PEI-交聯(lián)的大腸桿菌TOP10/pNM18/H9細(xì)胞/藻酸鹽珠子之外，立即重復(fù)上述反應(yīng)。19h后，3-HVN的轉(zhuǎn)化率為100％，3-HVA的產(chǎn)率為100％。大腸桿菌TOP10/pNM18/H9細(xì)胞/藻酸鹽珠子催化劑的腈水解酶活性是2.85 3-HVN U/g珠子(與對(duì)照相比，6.35-倍改善)。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物混合物從催化劑珠子上輕輕倒出，并在35℃下將額外的13.3mL蒸餾的去離子水、0.2mL 0.20M乙酸鈣緩沖液(pH7.0，2.0mM在反應(yīng)混合物中2.0mM鈣離子終濃度)和0.40mL(0.386g)3-羥基戊腈(0.400M總濃度)與固定化的細(xì)胞催化劑混合。20h后，3-HVN的轉(zhuǎn)化率為100％，3-HVA的產(chǎn)率為100％。催化劑的腈水解酶活性是2.99U/g珠子。重復(fù)該循環(huán)操作總共21次連續(xù)反應(yīng)，對(duì)于每次反應(yīng)，將催化劑的腈水解酶活性和活性回收百分率列于表11中。對(duì)于反應(yīng)21(表8)，20h后3-HVN的轉(zhuǎn)化率為100％，3-HVA的產(chǎn)率為100％，催化劑的腈水解酶活性是最初催化劑活性的81％。
表8在35℃下0.40M 3-HVN反應(yīng)中，GA/PEI-交聯(lián)的大腸桿菌TOP10/pNM18/H9細(xì)胞/藻酸鹽珠子的腈水解酶活性和催化劑活性回收百分率
實(shí)施例8大腸桿菌FM5/pNM18(對(duì)照)和FM5/pNM18/H9細(xì)胞的構(gòu)建和發(fā)酵利用本領(lǐng)域眾所周知的氯化鈣方法，用質(zhì)粒pNM18(實(shí)施例1)和pNM18/H9(實(shí)施例2)獨(dú)立地轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株FM5(ATCC 53911)。
在14-L Braun Biostat C發(fā)酵罐(B.Braun Biotech InternationalGmbh，Melsungen，Germany)中，于含有葡萄糖、氨水、酵母抽提物和鹽的礦質(zhì)培養(yǎng)基中制備產(chǎn)生腈水解酶。在發(fā)酵罐接種前，分別含有質(zhì)粒pNM18和pNM18/H9的大腸桿菌菌株FM5/pNM18(對(duì)照)和FM5/pNM18/H9(如實(shí)施例1和2所述)在種子培養(yǎng)物中生長(zhǎng)10-20h。在規(guī)定時(shí)間添加IPTG，并在IPTG添加24h后收獲細(xì)胞。
發(fā)酵方案以含有80g酵母抽提物、160g酪蛋白氨基酸(easeaminoacids)、8.0g MgSO4*7H2O、8.0g(NH4)2SO4和10mL Mazu DF204消泡劑(BASF Corporation，Mount Olive，NJ)的7.5L起始批量的方式制備容器培養(yǎng)基。滅菌后，添加369g葡萄糖溶液(60％w/w)、160mL微量元素溶液(表9)、200mL PO4溶液(21.0g K2HPO4和的11.0g KH2PO4溶于蒸汽滅菌的調(diào)節(jié)pH至6.8的200mL diH2O中)和100mg/L氨芐青霉素。使用NH4OH(40％w/v)和20％w/v H2PO4作為pH控制物。攪拌、通氣、pH、壓力、溶解氧濃度(DO)和溫度的設(shè)定值如下表10所述。溶解氧濃度控制在25％空氣飽和度，同時(shí)攪拌以首先開(kāi)始增加需氧量并接著通氣。500mL種子培養(yǎng)物在36℃、300rpm下于2-L燒瓶中生長(zhǎng)10-20h至＞2.0的ODλ＝550。在發(fā)酵罐中，20-30 OD的培養(yǎng)物密度下，添加額外的AMP至100mg/L。在對(duì)于FM5/pNM18 35-40ODλ＝550和對(duì)于FM5/pNM18/H9 20-30 ODλ＝550下，對(duì)FM5/pNM18(對(duì)照)IPTG添加至0.1mM，對(duì)FM5/pNM18/H9則添加至1mM。葡萄糖進(jìn)料開(kāi)始在＜5g/L，預(yù)定速率描述于表11。如果葡萄糖累積超過(guò)2g/L，則降低葡萄糖進(jìn)料速率。IPTG添加24小時(shí)后，將細(xì)胞冷卻至5-10℃并通過(guò)離心收獲。
表9微量元素溶液
表10發(fā)酵運(yùn)轉(zhuǎn)條件
表11葡萄糖進(jìn)料方案
如實(shí)施例3所述測(cè)定大腸桿菌FM5轉(zhuǎn)化體的3-HVN腈水解酶活性。在兩次相同的發(fā)酵運(yùn)轉(zhuǎn)中產(chǎn)生的大腸桿菌FM5菌株的腈水解酶活性列于下表12中，并與敏捷食酸菌72W和大腸桿菌SS1001(ATCCPTA-1177；US 6,870,038)的腈水解酶活性比較。與敏捷食酸菌72W相比，大腸桿菌SS1001腈水解酶催化劑改善(先前所述的)歸因于改善的腈水解酶表達(dá)。與此相反，與大腸桿菌FM5/pNM18(對(duì)照)相比，已證實(shí)的大腸桿菌FM5/pNM18/H9顯著的改善歸因于由酶結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)生的改善的腈水解酶活性。與大腸桿菌FM5/pNM18(對(duì)照)相比，大腸桿菌FM5/pNM18/H9除大約5.5倍腈水解酶活性改善之外，值得注意的是的大腸桿菌FM5/pNM18/H9的腈水解酶活性較大腸桿菌SS1001也高約4.2倍。
表12大腸桿菌FM5菌株與敏捷食酸菌72W以及大腸桿菌SS1001的3-HVN腈水解酶活性比較
實(shí)施例9大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)和大腸桿菌TOP10/pNM18/H9水解3-HBN和3-HVN的腈水解酶活性比較根據(jù)實(shí)施例3所述方法，重復(fù)制備大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)和大腸桿菌TOP10/pNM18/H9，并如實(shí)施例3所述，對(duì)所得到的細(xì)胞測(cè)定水解0.5M 3-羥基戊腈(3-HVN)或0.5M 3-羥基丁腈(3-HBN)的腈水解酶活性(表13)。相對(duì)于大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)，大腸桿菌TOP10/pNM18/H9對(duì)3-HBN的腈水解酶活性是ca.1.9倍。
表13大腸桿菌TOP10/pNM18(對(duì)照)和大腸桿菌TOP10/pNM18/H9水解3-HBN和3-HVN的腈水解酶活性
實(shí)施例1072W腈水解酶催化結(jié)構(gòu)域的靶向飽和誘變根據(jù)廠商使用說(shuō)明，使用簡(jiǎn)并寡核苷酸和位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)完成敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ IDNO4)催化結(jié)構(gòu)域(160G 161G162L 163N164C 165W166E 167H168F169Q170P171L 172S173K)的那些在已知細(xì)菌腈水解酶中不普遍保守的殘基(下劃線的)中的飽和誘變。具體來(lái)說(shuō)，構(gòu)建9個(gè)小文庫(kù)(500-1000個(gè)克隆)，每個(gè)文庫(kù)靶向各自的活性部位殘基。如前所述(實(shí)施例2)，對(duì)這些文庫(kù)篩選增加的3-HVN腈水解酶活性。鑒定了11個(gè)克隆(所有的都來(lái)自168F(Phe168)的小文庫(kù))，每個(gè)克隆都證實(shí)具有超過(guò)對(duì)照(pNM18)大約2-3倍的3-HVA產(chǎn)生。使用核苷酸測(cè)序確定賦予增加的腈水解酶活性的特定密碼子改變(表14)。盡管沒(méi)有直接測(cè)定腈水解酶活性，但是SDS-PAGE分析測(cè)定每個(gè)突變體產(chǎn)生了基本上相同的腈水解酶蛋白質(zhì)水平。因此，推斷由突變體增加的3-HVA產(chǎn)生歸因于酶增加的腈水解酶活性。
表14殘基168飽和誘變改善總結(jié)
<110>E.I.duPont de Nemours and Company，Inc．Di Cosimo，RobertPayne，MarkO′Keefe，Daniel<120>使用腈水解酶突變體生產(chǎn)3-羥基羧酸<130>CL2584 PCT<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gcgcatatgg tttcgtataa cagcaagttc c31<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ataggatcct tatggctact ttgctgggac cg32<210>3<211>1110<212>DNA<213>敏捷食酸菌72W<220>
<221>CDS<222>(1)..(1110)<400>3atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag48Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15ccg gta tgg ctc aac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc96Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg arc gct ttc ccg gaa144Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45
gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag192Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta240Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa288Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat336Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg384Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc432Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt480Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 150 155 160gga ttg aac tgc tgg gaa cat ttc caa ccg ctc agc aag ttc atg atg528Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met165 170 175tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc576Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg624Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr195 200 205gtc acc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg672Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220acg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac720Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac768Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag816Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att cta ctg gcg aag864Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg912Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300
gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att960Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga1008Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg325 330 335ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga1056Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 350acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca1104Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365aag tag1110Lys<210>4<21l>369<212>PRT<213>敏捷食酸菌72W<400>4Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45Val Phe Ile Pro G1y Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140
Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 450 155 160Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met165 170 175Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asp Ala Thr195 200 205Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asn225 230 235 240Glu Gln Arg Ala Leu Lau Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255Gly Pno Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Ara Ser Ara Val Glu Asn Phe Arg325 330 335Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 356Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365Lys<210>5
<211>1110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變的腈水解酶B2和H9<220>
<221>CDS<222>(1)..(1110)<400>5atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag48Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15ccg gta tgg ctc gac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc96Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa144Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Tle Ala Phe Pro Glu35 40 45gta ttc att ccg ggc tac ccc tat taa aca tgg ctc ggc gac gtg aag192Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac aag aat tca tta gag cta240Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gca cgc cgc aac aaa288Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat336Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc aag atc gtt gcc aat cgg384Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc432Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt480Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 150 155 160gga ttg aac tgc tgg gaa cat ttc caa ccg ctc agc aag ttc atg atg528Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys phe Met Met165 170 175tac agc ctc ggt gag caa gtc cac att gca tcg tgg ccg gcg atg tcc576Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190cct ctt cag ccg gat gtt ttc cag ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg624Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
195 200 205gtc gcc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg672Val Ala Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220acg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac720Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac768Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag816Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att ctg ctg gcg aag864Gly Ile Leu Iyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg912Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att960Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga1008Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Pne Arg325 330 335ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga1056Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 350acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca1104Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365aag tag1110Lys<210>6<211>369<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突變的腈水解酶B2和H9<400>6Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Tle2O 25 30
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly G1u Gly130 135 140Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met165 170 175Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr195 200 205Val Ala Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
275 280 285Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg325 330 335Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 350Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365Lys<210>7<211>1110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變的腈水解酶B4<220>
<221>CDS<222>(1)..(1110)<400>7atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag48Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15ccg gta tgg ctc gac aca gac gca acg atc gac aag tca atc agg atc96Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa144Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag192Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60tgc agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta240Cys Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa288Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu AIa Ala Arg Arg Asn Lys
85 90 95atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat336Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg384Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc432Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt480Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Pne Ala Phe Gly Arg Val Gly145 15O 155 160gga ttg aac tgc tgg gaa cat ttc caa ccg ctc agc aag atc atg atg528Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Ile Met Met165 170 175tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc576Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acgPro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr195 200 205gtc atc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg672Val Ile Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 22Oacg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac720Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac768Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag816Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att ctg ctg gcg aag864Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg912Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att960Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga1008Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg325 330 335ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga1056
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 350acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca1104Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365aag tag1110Lys<210>8<211>369<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突變的腈水解酶B4<400>8Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60Cys Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Ara Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Ile Met Met
165 170 175Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr195 200 205Val Ile Arg ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg325 330 335Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 350Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365Lys<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<22O>
<223>引物
<400>9cgaagccaac gcgacggtca tgcgctcgta cgcaatcgaa gg 42<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10ccttcgattg cgtacgagcg catgaccgtc gcgttggctt cg 42<210>11<21l>1110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Thr210改變?yōu)镃ys的突變的腈水解酶<220>
<221>CDS<222>(1)..(1110)<400>11atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag48Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15ccg gta tgg ctc gac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc96Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa144Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag192Val Pne Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta240Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn ser Leu Glu Leu65 70 75 80ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaaZ88Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat336Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg384Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc432
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt480Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 150 155 160gga ttg aac tgc tgg gaa cat ttc caa ccg ctc agc aag ttc atg atg528Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met165 170 175tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc576Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg624Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr195 200 205gtc tgc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg672Val Cys Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220acg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac720Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac768Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag816Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att ctg ctg gcg aag864Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg912Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att960Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga1008Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg325 330 335ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga1056Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 350acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca1104Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365aag tag1110Lys
<210>12<211>369<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Thr210改變?yōu)镃ys的突變的腈水解酶<400>12Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met165 670 175Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met ser180 185 190Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr195 200 205
Val Cys Arg ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr240 245 250Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg325 330 335Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala ser Lys Arg Leu Gly340 345 350Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365Lys<210>13<211>1110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Phe168改變?yōu)長(zhǎng)ys的突變的腈水解嗨<220>
<221>CDS<222>(1)..(1110)<400>13atg gtt tcg tta aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag48Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15ccg gta tgg ctc gac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc96
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa144Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag192Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta240Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa288Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat336Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 110ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg384Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc432Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt480Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 150 155 160gga ttg aac tgc tgg gaa cat aaa caa ccg ctc agc aag ttc atg atg528Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Lys Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met165 170 175tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc576Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg624Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr195 200 205gtc acc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gta ctt tac tca672Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220acg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac720Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac768Glu Gln Grg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag816Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270
ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att ctg ctg gcg aag864Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg912Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att960Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga 1008Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg325 330 335ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga 1056Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 350acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca 1104Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365aag tag 1110Lys<210>14<211>369<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Phe168改變?yōu)長(zhǎng)ys的突變的腈水解酶<400>14Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu1 5 10 15Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile20 25 30Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu35 40 45Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys50 55 60Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu65 70 75 80Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys85 90 95
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr100 105 115Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg115 120 125Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly130 135 140Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Lys Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met165 170 175Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser180 185 190Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr195 200 205Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser210 215 220Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp225 230 235 240Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr245 250 255Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu260 265 270Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys275 280 285Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser290 295 300Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile305 310 315 320Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg320 330 335Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly340 345 350
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala355 360 365Lys<210>15<211>1110<212>DNA<213>人工序列<22O>
<223>Phe168改變?yōu)閂al的突變的腈水解酶<220>
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權(quán)利要求
1.一種編碼如SEQ ID NO4的氨基酸序列所示的酶促活性多肽的分離的核酸分子，所述分離的核酸分子進(jìn)一步包含至少一個(gè)引起SEQ ID NO4的至少一個(gè)氨基酸取代的突變，所述取代選自a)在第210位用丙氨酸、異亮氨酸或半胱氨酸取代；b)在第65位用半胱氨酸取代；c)在第168位用賴氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代；和d)在第174位用異亮氨酸取代，其中所述核酸分子編碼一種多肽，當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸時(shí)，所述多肽與敏捷食酸菌72W(ATCC55746)腈水解酶的活性相比具有至少高1.8倍的腈水解酶活性。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，編碼選自SEQ ID NO6、8、12、14、16和18的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，具有選自SEQ ID NO5、7、11、13、15和17的核酸序列。
4.一種包含可操作地連接有合適的調(diào)節(jié)序列的權(quán)利要求1、2或3的分離的核酸分子的嵌合基因。
5.一種包含權(quán)利要求4的嵌合基因的表達(dá)盒。
6.一種包含權(quán)利要求的嵌合基因的轉(zhuǎn)化的微生物。
7.一種包含權(quán)利要求5的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化的微生物。
8.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化的微生物，其中所述微生物選自叢毛單胞菌、棒狀桿菌、短桿菌、紅球菌、固氮菌、檸檬酸桿菌、腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、克雷白氏桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、畢赤氏酵母、克魯維氏酵母、假絲酵母、漢森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉、球擬酵母、甲基桿菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、根瘤菌和鏈霉菌。
9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化的生物體，其中所述轉(zhuǎn)化的微生物是一種大腸桿菌菌株，選自MG1655(ATCC 47076)、FM5(ATCC 53911)、W3110(ATCC 27325)、MC4100(ATCC 35695)和W1485(ATCC 12435)。
10.一種用于將3-羥基腈水解為3-羥基羧酸的方法，包括步驟(a)在相同的反應(yīng)條件下，將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基腈與腈水解酶催化劑接觸，由此所述3-羥基腈被水解為相應(yīng)的3-羥基羧酸，所述腈水解酶催化劑為權(quán)利要求1、2或3的分離的核酸分子所編碼；和(b)任選地分離步驟(a)中產(chǎn)生的3-羥基羧酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述3-羥基腈是3-羥基戊腈或3-羥基丁腈。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述腈水解酶催化劑特征在于與敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶活性相比，腈水解酶活性增加至少5倍。
13.一種用于將3-羥基戊腈水解為3-羥基戊酸的方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基戊腈與權(quán)利要求1、2或3的分離的核酸分子編碼的腈水解酶催化劑接觸，由此所述3-羥基戊腈被水解為3-羥基戊酸；和(b)任選地分離步驟(a)中產(chǎn)生的3-羥基戊酸。
14.一種用于將3-羥基丁腈水解為3-羥基丁酸的方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基丁腈與包含SEQ ID NO6的多肽序列的腈水解酶催化劑接觸，在相同的反應(yīng)條件下，與敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶活性相比，所述腈水解酶催化劑具有至少1.8倍的腈水解酶活性的改善，由此所述3-羥基丁腈被水解為3-羥基丁酸；和(b)任選地分離步驟(a)中產(chǎn)生的3-羥基丁酸。
全文摘要
該發(fā)明涉及具有改善的用于將3－羥基腈轉(zhuǎn)化為3－羥基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶突變體。更具體地說(shuō)，使用易錯(cuò)PCR和位點(diǎn)定向誘變突變敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶基因以產(chǎn)生具有改善的用于將3－羥基腈(如3－羥基丁腈或3－羥基戊腈)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3－羥基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶。也提供了一種使用所述改善的突變體生產(chǎn)3－羥基羧酸的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK101072871SQ200580035301
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2005年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月16日
發(fā)明者M·S·佩恩, R·迪科西莫, D·P·奧基夫 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司