專利名稱：：作為選擇性標記的同源amds基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)化生物的選擇標記基因。
背景技術(shù)：
：A/^g///^m'^/awflmdS基因可能是用于轉(zhuǎn)化有絲真菌的最頻繁使用的選擇性標記，其己應用于大多數(shù)工業(yè)上重要的有絲真菌，例如匈一腸m'ger(KellyandHynes1985,EMBOJ.4:475-479)、Pem'c贏,附c/z/^sogewwm(BeriandTurner1987,Curr.Genet11:639-641)、TWc/zodermare&sez.(Pentillaetal.1987，Gene61:155-164)、(Christensenetal.1988，Bio/technology6:1419-1422)禾口7Wc/zoJwwa/wm.a艦m(Pe'eretal.1991,SoilBioLBiochem.23:1043-1046)。^m/S基因作為選擇性標記的流行最可能是下述事實的結(jié)果其是惟一可獲得的非抗生素標記基因，其可在真菌轉(zhuǎn)化中用作為顯性選擇性標記。顯性選擇性標記提供了下述好處它們可直接用于任何菌株，而不需要突變型受體菌株。然而，抗生素抗性基因?qū)τ谟糜诠I(yè)菌株來說并不優(yōu)選，因為考慮到大規(guī)模使用攜帶此類基因的生產(chǎn)菌株在生物圈傳播抗生素抗性基因的潛在風險，在大多數(shù)國家管理機構(gòu)都反對使用抗生素標記。t/S基因作為顯性標記甚至已用于已知含有內(nèi)源amt/S基因的真菌，艮卩AmWw/a/iy(Tilburnetal.1983，Gene26:205-221)禾口(Gomietal,1991，Gene108:91-98)中。在這些情況下，可通過將CsCl加入選擇培養(yǎng)基來遏制非轉(zhuǎn)化子的背景。此外，因為存在更高的基因劑量，高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子提供了相對于非轉(zhuǎn)化子的高的生長優(yōu)勢(當乙酰胺作為唯一氮源的時候)。除了其顯性特征之外，am^S選擇性標記提供了作為雙向標記的好處。這意味著，與使用乙酰胺作為唯一碳源或氮源針對amdS基因的存在進行的陽性選擇不同，可使用氟乙酰胺來進行反向選擇，以選出并非存在amdS基因的(HynesandPateman1970,Mol.Gen.Genet108,107-106)。氟乙酰胺反向選擇已被用于從攜帶有基因的重組構(gòu)建體來加工經(jīng)過遺傳改造的菌株(例如，Wardetal.1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.39,738-743)。awdS標記的一個缺點在于下述事實Am'血/朋sawc/S基因在工業(yè)真菌，例如J.m'ger、Ao^Z(3e、JVeese/禾口尸.c/z^sogewww中是異源基因。艮卩使這對于大多數(shù)分子生物學家來說看似是無足輕重的，但是管理機構(gòu)經(jīng)常反對，因為含有異源Am'^/a朋amt/S基因的生產(chǎn)菌株具有新的(該基因是異源的)并且不必要的(一旦獲得了轉(zhuǎn)化菌株，該標記基因就不是必需的了)屬性，其風險無法預見。我們之前通過開發(fā)下述用于獲得不含選擇性標記的重組生產(chǎn)菌株的方法來解決這一問題(EP-A-0635574)。在這種方法中，amdS標記的雙向性被用于從特別構(gòu)建的表達盒中除去標記，這在表達盒一旦引入真菌基因組后進行。但是該方法與工業(yè)生產(chǎn)菌株中通常必需的高拷貝數(shù)較不兼容。鑒于這些情況，人們?nèi)匀恍枰达@性選擇性標記。從關(guān)于Aw^/朋5"mdS基因作為同源顯性標記的用途的第一份報道以來，大量的研究努力使得人們發(fā)現(xiàn)了多種其它am必基因，以用作同源選擇標記，例如，在j.077加e、6".cerev/j7'ae、尸.c/z^sogem/m(描述于EP0758020A2中)中。但是，在科學界中己有懷疑Am'ger根本不含可用作為顯性標記的功能性固必基因(Debetsetal.，Mol.Gen.Genet.(1990)222:284-290;Debetsetal.,Mol.Gen.Genet.(1990)224:264-268;FinkelsteinandBall,BiotechnologyofFilamentousfungi;Technologyandproducts(1992)ISBN0-7506-9115-8)。該偏見在過去數(shù)年被大大強化，因為幾乎十年間都沒有從Aw'gw中鑒定出麵dS基因。最近，在Am'ger中鑒定出了功能性awc/S基因(描述于EP0758020A2中)。但是，人們?nèi)孕枰@性雙向選擇標記基因。附圖描述圖1展示了j.m'ger表達載體pGBFIN-32。圖2展示了Am'ger表達載體pGBFINAMD-2，用于表達新穎的編碼乙酰胺酶的基因AMD2。圖3展示了Am'gw表達載體pGBFINAAE-l，用于表達新穎的編碼乙酰胺酶的基因AAE1。發(fā)明詳述下面定義了用于本說明書的若干術(shù)語。術(shù)語"基因"在本文中被定義為編碼多肽的DNA序列，無論該DNA序列是cDNA或基因組DNA序列，該術(shù)語可含有一個或多個內(nèi)含子。術(shù)語"選擇標記基因"(或者"選擇性標記基因")在本文中被定義為編碼下述多肽的基因，所述多肽向含有該基因的細胞提供下述表型，該表型允許對含有該選擇標記基因的細胞加以陽性或陰性選擇。選擇標記基因可用于區(qū)別經(jīng)轉(zhuǎn)化和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，或者可用于鑒定經(jīng)歷過重組或者其它類型的遺傳修飾的細胞。"乙酰胺酶"在本文中被定義為能催化乙酰胺水解為乙酸和氨，和/或能催化相關(guān)酰胺化合物(例如丙烯酰胺或&氨基酸)的酶。術(shù)語"amdS基因"在本文中被定義為優(yōu)選可從有絲真菌獲得，編碼上文定義的乙酰胺酶的基因。優(yōu)選地，基因顯示出與本領(lǐng)域己知的——禾中或多禾中amt/S基因(艮卩，來自j.mV/M/a朋、力.wj加e、j.m'ger、P.c/zo^ogewwm的amt/S基因或來自6*.cerev&ae的amc/S類以基因)的序歹U相似性。amdS基因優(yōu)選編碼大約500至600個氨基酸的蛋白。amdS基因因此通常被含有在大約2.0kb的DNA片段中。當然，在基因組amdS基因中內(nèi)含子的存在可將長度增加至例如大約2.5kb或更多。術(shù)語"同源"基因在本文中被定義為可從屬于與實際上含有該基因的菌株相同的物種(包括其變體)的菌株獲得的基因。優(yōu)選地，供體和受體菌株是同樣的。應當理解，這同樣應用于同源基因編碼的多肽。當突變體或片段的來源基因是同源基因的時候，基因的片段和突變體也被認為是同源的。此外，只要編碼序列是同源的，調(diào)控序列和編碼序列的非天然組合也被認為是同源的。術(shù)語異源在本文中指下述基因或多肽，針對其的供體和受體菌株不屬于同樣的物種或其變體。術(shù)語"內(nèi)源"基因在本文中被定義為關(guān)注的生物基因組中基因的天然存在的拷貝。術(shù)語"真菌"在本文中指真菌界Eumycota門的所有成員，由此包括所有有絲真菌和酵母。"有絲真菌"包括Eumycota和Oomycota亞門的所有有絲形式(如前文Hawksworthetal.,1995所定義)。有絲真菌的特征在于幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、脫乙酰幾丁質(zhì)、甘露聚糖和其它復雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長通過菌絲延長進行，碳代謝是專性需氧的。有絲真菌菌株包括但不限于，v4crewcwz'wm、J^sperg77/w5、Jwreo&awWww、Oyptococcws、Fz7z'6os7'(^wm、i^wsar/ww、f/wmz'co/a、MagwflpoW/ze、Afwcor、Afyce/鄉(xiāng)磁ora、iVeoc函'maWx、7Vewras7ora、尸aed/麵少ces、J°em.d〃/wm、i^Vowyce51、6t/n.zopAj〃wm、7b;/aro附j;ces1、T7zermooyci^、7Tn'e/avz.a、7b(ypoc/acfew2禾口ZWc/zo^/er附a的菌t朱?？紤]到術(shù)語黑J^erg/肌，術(shù)語^Ls;ergz7/2^在本文中被定義為包括可在如Raper禾口Fennell(1965,In:TheGenusAspergillus,TheWilliams&WilkinsCompany,Baltimore,pp293-344)所定義的j^erg^/wm'ger組中發(fā)現(xiàn)的所有(黑)y^j^rgz，。類似地，此外，對于其它A/7e，7/M物種而言，我們指上文Raper和Fennell所定義的^s^ergz7/uy組，其由此包括這些作者包括在特定組中的所有物種和變體。從關(guān)于A"!Ww/a朋麵dS基因作為同源顯性標記的用途的第一份報道以來，大量的研究努力使得人們發(fā)現(xiàn)了多種其它"mdS基因，以用作同源選擇標記，例如，在Ao^yzae、S.cerev&z'ae、P.c/zo^oge腦m(描述十EP0758020A2中)中以及Am'gw中(在EP0758020A2中描述過)。令人吃驚地，我們在Am'取r中發(fā)現(xiàn)了五種新穎的可能的amdS基因。本發(fā)明的新穎的amdS基因可被用作為同源的選擇性標記基因，其在木文中被理解為表示，amdS基因被用于對與最初獲得amdS基因的物種相同的物種的轉(zhuǎn)化子加以選擇。這提供了下述優(yōu)點獲得的轉(zhuǎn)化子不含外源選擇性標記基因。原則上，這允許構(gòu)建不含外源DNA(除了完全必要的之外，即將被表達的感興趣的(異源)基因)的重組菌株。在第一個方面，本發(fā)明涉及可從卻一腸，優(yōu)選勿一仏"m',獲得的、編碼乙酰胺酶的DNA序列，其中，所述DNA序列并非EP0758020A2中所述的SEQIDNO:18，該序列選自下述物質(zhì)構(gòu)成的組a.具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11、SEQIDNO:14或SEQIDNO:17的核苷酸序列的DNA序列，以及b.(a)中的DNA序列中任何序列的片段或突變體。在一種優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)(a)或(b)的序列編碼的乙酰胺酶包含下述氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列與SEQIDNO:3、SEQIDNO:8、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19中序列之一具有的位置同一性超過40%。優(yōu)選地，匹配百分比，即位置同一性為至少大約50%，更優(yōu)選至少大約60%,進一步更優(yōu)選至少大約70%，進一步更優(yōu)選至少大約80%，進一步更優(yōu)選至少大約85%，進一步更優(yōu)選至少大約90%，進一步更優(yōu)選至少大約95%,進一步更優(yōu)選至少大約97%,進一歩更優(yōu)選至少大約98%，進一步更優(yōu)選至少大約99%，最優(yōu)選地，匹配百分比，即同一性等于100%。就本發(fā)明的目的而言，兩條多肽，或者兩條核酸序列之間的同一性程度，即匹配百分比優(yōu)選使用最優(yōu)整體比對方法CDA來測定(Huang，1994,AContextDependentMethodforComparingSequences,Proceedingsofthe5thSymposiumonCombinatorialPatternMatching,LectureNotesinComputerScience807,Springer-Verlag,54-63)，其中使用如下參數(shù)(1)用于(多)肽比對錯配-2，缺口打開(GapOpen):11，缺口延伸(GapExtend):1，文本長度(ContextLength):10，匹配獎勵(MatchB0皿S):1，以及(ii)用于核苷酸序列比對錯配-15，缺口打開5，缺口延伸2，文本長度10，匹配獎勵1。術(shù)語"同一性程度"、"同一性"和"匹配百分比"可交換使用，以表示通過上述最優(yōu)整體比對方法計算出的、兩條多肽或核酸序列之間的同一性的程度。用于比對和測定同源性的其它程序的例子是Clustal方法(Higgms，1989,CABIOS5:151-153)、使用LASERGENE.TM.MEGALIGN.TM.軟件(DNASTAR，Inc.,Madison,Wis.)的Wilbur-Lipman方法(WilburandLipman，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726-730)、BLAST(NCBI)、用于最優(yōu)整體比對的GAP(Huang)、用于多條序列比對的MAP(Huang)、MultiBLAST(NCBI)、ClustalW、CapAssembler禾口SmithWaterman。參考文獻逐對比對(1)BLAST,(2)GAP,(3)MAP，(4)Sm他Waterman禾卩(5)CapAssembler(1)TatussovaTAandMaddenTLH999)BLAST2sequences,anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequence.i^MSM.cra歸丄e"174:247-50(2)(3)HuangX(1994)Onglobalsequencealignment.C戸f」，/5z.oscz'10:227-35(4)SmithTFandWatermanMS(1981)Identificationofcommonmolecularsubsequences.J她/飾/147:195-197(5)Huan2Xa992)Acontigassemblyprogrambasedonsensitivedetectionoffragmentoverlaps.Gew麵Zcs14:18-25(5)Hua取X〖1996)Animprovedsequenceassemblyprogram.G^oto.c^33:21-31(6)ThompsonJD,HigginsDG,andGibsonTJ(1994)CIAJSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,油c/ez'ciese^c/z22:4673-4680用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域己知的，其包括從基因組DNA的分離，從cDNA的制備或其組合。從上述基因組DNA對本發(fā)明的核酸序列的克隆可例如通過使用下述方法來進行，所述方法基于聚合酶鏈式反應(PCR)或?qū)Ρ磉_文庫進行的抗體篩選(以探測具有共同結(jié)構(gòu)特征的被克隆的DNA片段)(見，例如Innisetal.,1990,PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork,)。其它核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)可以使用。本文提供的序列信息不應被狹義地理解為需要包括進錯誤鑒定的堿基。本文公開的特定序列可容易地用于從有絲真菌，特別是Am'gw中分離出完整基因，接著還可以容易地對其進行進一步序列分析由此鑒定出序列錯誤。除非另有指明，本文中通過對DNA分子測序測得的所有核苷酸序列都是用自動DNA測序儀測得的，本文中，測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通過對上文測定的DNA序列進行翻譯推斷出來的。因此，如本領(lǐng)域技術(shù)人員針對通過該自動方法測得的任何DNA序列已知的那樣，本文測定的任何核苷酸序列可能含有一些錯誤。典型地，通過自動方法測定的核苷酸序列與被測序的DNA的實際核苷酸序列至少大約90%相同，更典型地，至少大約95%至至少大約99.9%相同?？梢酝ㄟ^其它方法，包括本領(lǐng)域公知的手動DNA測序方法對實際序列進行更為精確的測定。本領(lǐng)域還已知，較之實際序列，測得的核苷酸序列中的單個插入或缺失將導致對核苷酸序列的翻譯中出現(xiàn)讀碼框位移，這會使得測得的核苷酸序列編碼的預期氨基酸序列從上述插入或缺失的點開始就完全不同于被測序的DNA序列實際編碼的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒定出此類被錯誤鑒定的堿基，并且知道如何更正此類錯誤。As^erg7'〃us1屬的優(yōu)選物禾中是屬于J5pergz7/"51m'ger的組、^s/^rg7.〃u5g/awcws的組、爿，，7/wstenrw的組、爿i"pergz'仏w/^n'c加的組、血/ergz7/1^/wm一〖ws的組、A，rgz7/t^cerv/肌s的組、^^erg〃/iwor朋to的組、^perg/〃twc/av她i1的組、y^/ergz'〃twveraz.co/or的組、y^/erg7'仏"的組、J^spergz'/Zus的組、y4印erg7'/Zt"oc/zracem1的組、爿i"/ergz7/us1c朋Ac/ws的組、J^ergW/wscreweus1的組、i^pergzY/z^的組、J5pergz7/ws5q/"e的組和J5pergz7/iw07加e的組的有絲真菌。在第二個方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明第一個方面的DNA序列的核酸構(gòu)建體。"核酸構(gòu)建體"在本文中被定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其是從天然存在的基因分離出的，或己經(jīng)過修飾以含有以自然界中不存在的方式組合及并置的核酸片斷。當核酸構(gòu)建體含有編碼序列表達所需的所有控制序列時，術(shù)語"核酸構(gòu)建體"與術(shù)語"表達盒"同義。術(shù)語"編碼序列"在本文中被定義為能轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成包括本發(fā)明乙酰胺酶活性的多肽的序列。編碼序列的邊界通常通過mRNA5'末端的ATG起始密碼子和mRNA3'末端終止開放讀碼框的翻譯終止密碼子序列來界定。編碼序列可包括但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。表達應被理解為包括對多肽的生產(chǎn)中涉及的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。術(shù)語"控制序列"在本文中被定義為包括對于多肽表達來說必須或有益的所有組分。每種控制序列可以是編碼多肽的核酸序列天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于，引導序列、最優(yōu)翻譯起始序列(如Kozak，1991，J.Biol.Chem.266:19867-19870所述)、聚腺苷化序列、前肽(pro-peptide)序列、前原月太(pre-pro-peptide)序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。就最小程度而言，控制序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。為了引入特異性限制性位點以協(xié)助控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)域連接，控制序列可與連接子(linker)—起提供。術(shù)語"可操作地相連"在本文中被定義為下述構(gòu)型，其中，控制序列以相對于DNA序列的編碼序列的下述位置被合適地放置，所述位置使得控制序列能指導多肽的生產(chǎn)?？刂菩蛄锌梢允呛线m的啟動子序列，這是能被宿主細胞識別用于表達核酸序列的核酸序列。啟動子序列含有能介導多肽表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在細胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，其包括突變型、截短的和雜交的啟動子，其可從編碼對細胞來說同源或異源的細胞外或細胞內(nèi)多肽的基因獲得?？刂菩蛄羞€可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，這是能被真菌宿主細胞識別用來終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3'末端可操作地相連。在細胞中起作用的任何終止子可用于本發(fā)明。優(yōu)選用于真菌宿主細胞的終止子可從編碼vlo^加eTAKA-淀粉酶、Am'gw葡糖淀粉酶(ghicoamylase，g/W)、A"Wm/朋5鄰氨基苯甲酸鹽合酶、Aalpha葡糖苷酶、trpC基因和Fw^^wmox，;wnwz胰蛋白酶類似蛋白酶的基因獲得?？刂菩蛄羞€可以是合適的引導序列，這是mRNA的非翻譯區(qū)域，其對于通過真菌宿主細胞的翻譯來說是重要的。引導序列與編碼多肽的核酸序列的5'末端可操作地相連。在細胞中起作用的任何引導序列都可用于木發(fā)明。優(yōu)選用于真菌宿主細胞的引導序列可從編碼Ao^z^TAKA-淀粉酶和AmVMa似丙糖磷酸酯異構(gòu)酶和Am'gwg/aA的基因獲得。其它控制序列可從尸em'd/^mIPNS基因或；cK:基因、beta微管蛋白基因獲得。WO01/021779中提到的所有控制序列通過引用并入本文?？刂菩蛄羞€可以是聚腺苷化序列，這是與核酸序列3'末端可操作地相連，并且當被轉(zhuǎn)錄時能被真菌宿主細胞作為信號識別以向被轉(zhuǎn)錄的mRNA加上聚腺苷殘基的序列。在細胞中起作用的任何聚腺苷化序列都可用于木發(fā)明。優(yōu)選用于真菌宿主細胞的聚腺苷化序列從編碼Aoo^"eTAKA-淀粉酶、Am'gw葡糖淀粉酶、AmWw/fl朋鄰氨基苯甲酸鹽合酶、FwsanY〖mo砂^orwm胰蛋白酶類似蛋白酶和Aalpha葡糖苷酶的基因獲得。在其插入到載體之前對編碼多肽的核酸序列的操作可能是想要的或必需的，這取決于表達載體。用于利用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。在一種優(yōu)選的實施方式中，包含根據(jù)本發(fā)明第一方面的DNA序列的核酸構(gòu)建體包含對于所述DNA序列來說是天然的啟動子。在另一種優(yōu)選的實施方式中，包含根據(jù)本發(fā)明第一方面的DNA序列的核酸構(gòu)建體包含對于所述DNA序列來說是外源的啟動子。在該實施方式中，同源amdS基因的天然啟動子可被不同的啟動子置換。該置換啟動子在本文中被稱為外源啟動子，其可以比天然amdS啟動子更強，或者其可以以不同的方式被調(diào)控。或者，對天然amdS啟動子的置換可用于協(xié)助對轉(zhuǎn)化子的選擇，例如，通過在乙酰胺或相關(guān)酰胺化合物作為唯一N源或C源時轉(zhuǎn)化子相對非轉(zhuǎn)化子的生長優(yōu)勢來進行。優(yōu)選地，外源啟動子還可與其中使用它們的宿主同源。合適的外源啟動子可從編碼糖分解的酶或醇代謝涉及的酶獲得，例如來自編碼磷酸甘油酸酯激酶、甘油醛-磷酸酯脫氫酶、丙糖磷酸激酶、丙酮酸激酶或醇脫氫酶基因的啟動子。可使用的優(yōu)選的可誘導啟動子是淀粉誘導、銅誘導、油酸誘導的啟動子。在本發(fā)明的另一種實施方式中，前述段落的核酸構(gòu)建體還包括將被表達的感興趣的基因。感興趣的基因可與單獨的控制序列可操作地相連，或可處于與本發(fā)明乙酰胺酶基因可操作地相連的序列的控制之下。優(yōu)選地，核酸構(gòu)建體將被包括于合適的載體中，以使得能引入宿主細胞。載體可以是能方便地經(jīng)歷重組DNA過程并能導致編碼多肽的核酸序列表達的任何載體(例如質(zhì)?；虿《?。典型地，對載體的選擇將取決于載體與載體將被引入的有絲真菌細胞之間的兼容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，即作為其復制不依賴染色體復制的染色體外主體存在，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。適用于真菌宿主細胞的自主保持的克隆載體可包含AMAl-序歹U(見，例如AleksenkoandClutterbuck(1997),FungalGenet.Biol.21:373-397)?；蛘撸d體可以是下述載體，當其被引入有絲真菌細胞時，其被整合進基因組，與其已被整合進的染色體一起復制。整合型克隆載體可在有絲真菌宿主的染色體中隨機整合或在預定目標位點整合。整合型克隆載體可包含下述DNA片段，該片段與有絲真菌宿主細胞基因組中預定目標基因座中的、用于將克隆載體整合到預定基因座上的DNA序列同源。為促進定位整合，優(yōu)選在轉(zhuǎn)化宿主細胞之前對克隆載體進行線性化。線性化優(yōu)選進行至如下程度使得克隆載體的至少一端側(cè)翼，但優(yōu)選地，任意一端側(cè)翼，有與目標基因座同源的序列。目標基因座側(cè)翼的同源序列的長度優(yōu)選為至少30bp，優(yōu)選地，至少50bp，優(yōu)選地，至少0.1kb，進一步優(yōu)選地，至少0.2kb，更優(yōu)選地，至少0.5kb，進一步更優(yōu)選地，至少1kb，最優(yōu)選地，至少2kb。優(yōu)選地，克隆載體中與目標基因座同源的DNA序列是從高度表達的基因座獲得的，這意味著，其是從能在有絲真菌宿主細胞中高水平表達的基因獲得的。能高水平表達的基因，即，能高度表達的基因在本文中被定義為其mRNA占細胞總mRNA的至少0.5%(w/w)的基因，例如，在誘導條件下的；或者其基因產(chǎn)物占細胞總蛋白的至少1%(w/w)的基因；或者，在分泌出的基因產(chǎn)物的情況下，可分泌至至少0.1g/1的水平(如EP357127Bl所述)。大量優(yōu)選的高度表達的真菌基因的例子是來自J^^^'///或7WcAo&rm的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脫氫酶、木聚糖酶、磷酸甘油醛脫氫酶或纖維二糖水解酶(celloWohydrolase，cbh)基因。用于這些目的的最優(yōu)選的高度表達的基因是葡糖淀粉酶基因(優(yōu)選Am'gw葡糖淀粉酶基因)、Aoo^aeTAKA-淀粉酶基因、w油/。m1基因、7Wc/ode削areesdc&Zz基因(優(yōu)選地，cM1)。載體系統(tǒng)可以是單個載體或質(zhì)粒，或兩個或多個載體或質(zhì)粒，它們一起含有將被引入到有絲真菌細胞中的總DNA或轉(zhuǎn)座子。在第三個方面，本發(fā)明涉及一種多肽，其具有本發(fā)明第一個方面的DNA序列編碼的乙酰胺酶活性。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述多肽包含序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:8、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19中的任一序列。在第四個方面，本發(fā)明涉及一種真菌宿主細胞，其中包含根據(jù)本發(fā)明第二個方面的核酸構(gòu)建體。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述宿主細胞還包含將被表達的感興趣的基因。將被表達的感興趣的基因可編碼多肽。多肽可以是對真菌宿主細胞來說天然或異源的任何多肽。術(shù)語"異源多肽"在本文中被定義為野生型真菌宿主細胞不生產(chǎn)的多肽。術(shù)語"多肽"在本文中不用來指特定長度的被編碼產(chǎn)品，因此其包括肽、寡肽和蛋白。多肽還可以是重組多肽，這是對于細胞來說天然的多肽，其通過下述核酸序列編碼，所述核酸序列包含對于該核酸序列來說外源的、在對多肽的生產(chǎn)中涉及的一種或多種控制序列。多肽可以是野生型多肽或其變體。多肽還可以是雜交體多肽，其含有從至少兩種不同多肽獲得的部分或完整多肽序列的組合，其中，至少兩種不同多肽中的一種或多種可能與細胞是異源的。多肽還包括上述多肽的天然存在的等位基因和經(jīng)工程改造的變異。優(yōu)選地，多肽是抗體或其一部分、抗原、凝血因子、酶、激素或激素變體、受體或其一部分、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報道蛋白或轉(zhuǎn)運蛋白、細胞內(nèi)蛋白、分泌過程涉及的蛋白、折疊過程涉及的蛋白、伴侶分子、肽氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白、糖基化因子、轉(zhuǎn)錄因子。優(yōu)選地，多肽是細胞外分泌的?；蛘?，多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶、連接酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、酯酶.或者，多肽是碳水化合物酶，例如，纖維素酶，例如內(nèi)葡聚糖酶，P-葡聚糖酶，纖維二糖水解酶或3-葡糖苷酶，半纖維素酶或膠質(zhì)水解(pectinolytic)酶，例如，木聚糖酶，木糖苷酶，甘露聚糖酶，半乳$&酶，半乳糖苷酶，膠質(zhì)甲酯酶，膠質(zhì)裂解酶，果膠酸鹽/酯裂解酶，內(nèi)聚半乳糖醛酸酶，外聚半乳糖醛酸酶，鼠李半乳糖醛酸酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯木聚糖水解酶，半乳糖醛酸酶，裂解酶或淀粉水解酶；水解酶，異構(gòu)酶或連接酶，磷酸酶(例如，植酸酶)，酯酶(例如脂肪酶)，蛋白水解酶，氧化還原酶(例如氧化酶)，轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。更優(yōu)選地，目標基因編碼植酸酶。進一步更優(yōu)選地，多肽是氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、內(nèi)切蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、alpha-半乳糖苷酶、beta-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、alpha-葡糖苷酶、beta-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、蛋白水解酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變構(gòu)酶(mutanase)、氧化鎂、膠質(zhì)水解酶、過氧化物酶、磷脂酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、單加氧酶。或者，多肽是人胰島素或其類似物、人生長因子、促紅細胞生成素、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)或促胰島素生成素(insulinotropin)。編碼異源多肽的核酸序列可從任何原核、真核或其它來源獲得。就木發(fā)明的目的而言，術(shù)語"從……獲得"在本文中與給定的來源一起使用時將表示，多肽是通過該來源或通過已插入了來自該來源的基因的細胞生產(chǎn)的?；蛘撸嚯目梢允羌毎麅?nèi)蛋白或酶，例如伴侶分子、蛋白酶或轉(zhuǎn)錄因子。這方面的一個例子在ApplMicrobiolBiotechnol.1998Oct;50(4):447-54("AnalysisoftheroleofthegenebipA,encodingthemajorendoplasmicreticulumchaperoneproteininthesecretionofhomologousandheterologousproteinsinblackAspergilli.PuntPJ,vanGemerenIA，Drint-KuijvenhovenJ,HessingJG，vanMuijlwijk-HarteveldGM,BeijersbergenA,VerripsCT,vandenHondelCA)中有所描述。這可用于，例如，提高宿主細胞作為蛋白生產(chǎn)者的效率，如果該多肽(例如伴侶分子、蛋白酶或轉(zhuǎn)錄因子)已知是蛋白生產(chǎn)中限制性因素的話。在本發(fā)明的方法中，真菌宿主細胞還可用于對對細胞來說是天然的多肽的重組生產(chǎn)?？赏ㄟ^例如將編碼多肽的基因放置于不同啟動子的控制下，以增強多肽的表達、通過使用信號序列加速目標天然多肽向細胞外的運輸以及增加編碼細胞正常生產(chǎn)的多肽的基因的拷貝數(shù)，來重組生產(chǎn)天然多肽。在術(shù)語"異源多肽"的范圍內(nèi)，本發(fā)明還包括，對對細胞來說天然的多肽的上述重組生產(chǎn)，包括程度至此類表達涉及使用對細胞并非天然的遺傳元件，或者使用天然元件，但這些元件已被操作，以按照并非正常存在于有絲真菌細胞中的方式發(fā)揮功能。用于分離或克隆編碼異源多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其包括從基因組DNA的分離，從cDNA的制備及其組合。在本發(fā)明的方法中，異源多肽還可包括融合的或雜交的多肽，其中，另一個多肽在該多肽或其片段的N末端或C末端融合。融合的多肽是通過將編碼一種多肽的核酸序列(或其一部分)與編碼另一種多肽的核酸序列(或其一部分)融合產(chǎn)生的。用于生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域己知的，其包括，將編碼多肽的編碼序列連接起來，使得它們符合讀碼框原則，并且使得融合的多肽的表達處于同樣的啟動子和終止子的控制之下。雜交體多肽可包含從至少兩種不同多肽獲得的部分或全部多肽序列的組合，其中，所述多肽中的一條或多條對突變型真菌細胞來說可能是異源的。可通過多種方法，對編碼感興趣的異源多肽的經(jīng)分離的核酸序列進行操作，以提供所述多肽的表達。表達應當被理解為包括生產(chǎn)多肽過程所涉及的任何步驟，其包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。在其插入到載體之前，對編碼多肽的核酸序列的操作可能是想要的或必需的，這取決于表達載體。用于利用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。在另一種優(yōu)選的實施方式中，真菌宿主細胞的內(nèi)源乙酰胺酶活性可通過下述方法降低通過隨機誘變、定點誘變、PCR產(chǎn)生的誘變、核苷酸插入核/或缺失和/或取代、基因打斷或基因置換技術(shù)，反義技術(shù)、RNAi技術(shù)或其組合對一個或多個內(nèi)源乙酰胺酶基因進行修飾和/或失活。方法包括但不限于，對親本細胞進行誘變，選出能生產(chǎn)較之親本細胞而言具有降低活性的乙酰胺酶的突變細胞。誘變可以是特異性或隨機的，例如通過使用合適的物理或化學誘變劑，通過使用合適的寡核苷酸，或者通過對DNA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變來進行。此外，誘變可通過使用這些誘變劑的任何組合來進行。適合本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的例子包括紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、蟻酸和核苷酸類似物。使用此類試劑時，典型地，通過下述方法來進行誘變在存在選用的誘變劑的情況下，在合適條件下培養(yǎng)待誘變親本細胞，以及選出展示出降低的基因表達的突變細胞。或者，可通過使用與基因核酸序列互補的核苷酸序列進行已建立起來的反義技術(shù)，來進行對基因的修飾或失活。更具體地，可通過引入與核酸序列互補的核苷酸序列(其可在細胞中轉(zhuǎn)錄，并且能與細胞中產(chǎn)生的mRNA雜交)來降低或去除有絲真菌細胞對基因的表達。在允許互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，翻譯出的蛋白質(zhì)的量由此減少或消失。表達反義RNA的例子展示于ApplEnvironMicrobiol.2000Feb;66(2):775-82.(Characterizationofafoldase，proteindisulfideisomeraseA,intheproteinsecretorypathwayofAspergillusniger.NgiamC,JeenesDJ，PimtPJ，VanDenHondelCA，ArcherDB)或(ZrennerR,WillmitzerL,SonnewaldU.Analysisoftheexpressionofpotatouridinediphosphate-glucosepyrophosphorylaseanditsinhibitionbyantisenseRNA.Planta.(1993);190(2):247-52.)中。此外，可通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)(FEMSMicrob.Lett.237(2004):317-324)來獲得對基因的修飾、負調(diào)或失活。在該方法中，核苷酸序列(其表達待受到影響的)的同樣的正義或反義部分被依次克隆，中間是核苷酸間隔，并且插入到表達載體中。此種分子轉(zhuǎn)錄后，小的(21-23)核苷酸片段的形成將導致待受影響的mRNA的定位降解。對特定mRNA的去除可進行至多種不同的程度。WO2005/05672A1和/或WO2005/026356A1描述的RNA干擾技術(shù)可用于對基因的負調(diào)、修飾或失活?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明另一種優(yōu)選的實施方式，新穎的amdS基因的序列可用于失活生物基因組中am^S基因的內(nèi)源拷貝(或多個拷貝)，該生物指從其中獲得該畫必基因的生物。為達到此目的，使用新穎的fl/WS基因的序列來構(gòu)建失活載體，以通過同源重組將載體定位至該基因的內(nèi)源拷貝。然后，可通過置換或通過向內(nèi)源amdS基因的插入來造成失活。對內(nèi)源amt/S基因的失活提供了下述好處其可在使用amdS基因作為選擇性標記用于引入感興趣基因的轉(zhuǎn)化中，降低未轉(zhuǎn)化細胞的背景?；蛘?，內(nèi)源flmdS基因座可用作整合的界定位點，用于將被表達的感興趣的基因。在另一種優(yōu)選的實施方式中，在用本發(fā)明第二方面的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過的、以及可選包含待表達的感興趣的基因和/或具有降低的內(nèi)源乙酰胺酶活性的真菌宿主細胞中，本發(fā)明的第二方面的核酸構(gòu)建體被缺失，或被失活，這是通過對重組DNA構(gòu)建體或其組合進行基因置換和/或失活和/或修飾和/或打斷來進行的。在該實施方式中，對真菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化之后，對轉(zhuǎn)化子進行后續(xù)加工處理(curing)，以獲得EP-A1-0635574所述的MARKERGENEFREETM重組菌株?；蛘?，可使用用于降低內(nèi)源乙酰胺酶表達的已有過描述的方法來進行加工處理?？蛇x地，較之野生型細胞，宿主細胞包含提高的解折疊蛋白應答(UPR)，以增加對目標多肽的生產(chǎn)能力?？赏ㄟ^US2004/0186070A1禾口Z或US2001/0034045A1和/或WO01/72783A2所述的技術(shù)來增加UPR。更具體地，HAC1禾口/或IRE1禾口/或PTC2的蛋白水平已被調(diào)節(jié)，用于獲得具有提高的UPR的宿主細胞。或者替代性地，或與提高的UPR組合，可對宿主細胞進行遺傳修飾，以獲得較之野生型細胞展示出更低的蛋白酶表達和/或蛋白酶分泌的表型，以提高對感興趣的多肽的生產(chǎn)能力。此類表型可通過對蛋白酶表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(例如prtT)進行缺失和/或修飾和/或失活來獲得。通過調(diào)節(jié)prtT來降低蛋白酶的表達可通過US2004/0191864A1所述的技術(shù)來進行?；蛘咛娲缘?，或與提高的UPR和/或展示出更低的蛋白酶表達和/或蛋白酶分泌的表型組合，宿主細胞展示出草酸缺陷型表型，以提高對感興趣的多肽的生產(chǎn)產(chǎn)量。草酸缺陷型表型可通過WO2004/07002.2A2所述的技術(shù)來獲得?；蛘咛娲缘?，或與提高的UPR和/或展示出更低的蛋白酶表達和/或蛋白酶分泌和/或草酸缺陷型的表型組合，宿主細胞展示出較之野生型細胞的表型差異組合，以提高對感興趣的多肽的生產(chǎn)產(chǎn)量。這些差異可包括但不限于葡糖淀粉酶和/或中性alpha淀粉酶A和/或中性alpha淀粉酶B、蛋白酶和草酸水解酶的降低的表達。通過宿主細胞展示出的所述表型差異可通過US2004/0191864A1所述的技術(shù)進行遺傳修飾來獲得。在一種更為優(yōu)選的實施方式中，真菌宿主細胞是有絲真菌細胞，優(yōu)選地，屬于y^spe《z7/M5、尸e"z'"犯ww或7WcAwfeww屬的種。更優(yōu)選地，有絲真菌宿主纟田胞屬于J5pe，'〃附w一r、Ji"/erg77/wi"、J5_perg77/w5so乂ae、JWcAo<ierwflreesez'或尸ew'd〃/wwc/z;^soge"Mm白勺纟且。在第五個方面，本發(fā)明涉及一種方法，用于在第四個方面的真菌宿主細胞中生產(chǎn)感興趣的化合物。使用本領(lǐng)域已知的方法，在有益于乙酰胺酶和感興趣的化合物表達的條件下，培養(yǎng)第四個方面的宿主細胞。例如，可通過在合適的培養(yǎng)基中、允許多肽被表達和/或分離的條件下進行搖瓶培養(yǎng)、實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模的發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)發(fā)生于包含碳源和氮源以及無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域已知的方法來進行(見，例如Bennett,J.W.andLaSure,L.，eds.,MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供貨商處獲得，或者使用公開的組合物(例如，AmericanTypeCultureCollection目錄中的)來制備。可選地，通過本領(lǐng)域已知的方法從培養(yǎng)基中回收感興趣的化合物。如果多肽分泌進營養(yǎng)培養(yǎng)基，可直接從培養(yǎng)基回收多肽。如果多肽不分泌，從細胞裂解物回收多肽。可通過本領(lǐng)域已知的方法來分離得到的感興趣的化合物。例如，可通過傳統(tǒng)方法，包括但不限于，離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從營養(yǎng)培養(yǎng)基分離感興趣的化合物。然后可通過本領(lǐng)域已知的大量方法對經(jīng)分離的感興趣的化合物加以進一步純化，所述方法包括但不限于，色譜(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排除)、電泳方法(例如制備等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)或萃取(見，例如ProteinPurification,J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。在一種優(yōu)選的實施方式中，在培養(yǎng)基中用下述方法來培養(yǎng)第四個方面的宿主細胞，其中，所述培養(yǎng)基包含乙酰胺作為唯一碳源和/或氮源，所述方法中，所述培養(yǎng)導致根據(jù)本發(fā)明的細胞的比例富集。在另一種優(yōu)選的實施方式中，通過將CsCl加入到包含乙酰胺作為唯一碳源和/或氮源的培養(yǎng)基中來降低非轉(zhuǎn)化子背景。本發(fā)明還公開了根據(jù)本發(fā)明的真菌細胞，優(yōu)選地，有絲真菌細胞，其具有在含有乙酰胺作為唯一碳源和/或氮源的培養(yǎng)基上良好生長的能力，并且所述能力不是異源乙酰胺酶基因的表達導致的，其是同源乙酰胺酶的表達(優(yōu)選地過量表達)導致的。細胞在含有乙酰胺作為唯一碳和/或氮源的培養(yǎng)基上良好生長的能力在本文中被定義為較之相應的野生型細胞生長得更快的能力，其中，野生型被理解為表示針對其乙酰胺酶基因型來說是野生型的。本發(fā)明還將由下述實施例加以描述，所述實施例不應被理解為限制本發(fā)明的范圍。實施例常規(guī)分子克隆技術(shù)在本文所述的實施例中，標準分子克隆技術(shù)，例如對核酸的分離和純化、對核酸的電泳、對核酸的酶促修飾、切割和/或擴增、對五.CO"的轉(zhuǎn)化等者卩按照文獻(Sambrooketal.(1989)"MolecularCloning:alaboratorymanual",ColdSpringHarbourLaboratories,ColdSpringHarbour,NewYork;l皿isetal.(eds.)(1990)"PCRprotocols,aguidetomethodsandapplications"AcademicPress,SanDiego)所述來進行。所用的^LspergW/wsm'ger菌株(CBS513.88)已保藏于CBSInstitute,保藏號為CBS513.88。實施例1新穎的Aw'ggrflmdS基因的鑒定通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的DNA序列同源性檢索，對真菌的經(jīng)完全注釋的基因組序列加以仔細檢查，鑒定出新穎的可能的來自Am'ger的乙酰胺酶基因。乙酰胺酶基因同源物AMD2的基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2禾nSEQIDNO:3。乙酰胺酶同源物AAE1的基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示為SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。乙酰胺酶同源物AAE2的基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示為SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。乙酰胺酶同源物AAE3的基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示為SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。乙酰胺酶同源物AAE4的基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示為SEQIDNO:17、SEQIDNO:18和SEQIDNO:19。實施例2對新穎的Am'gg/^m^/S基因的分子克隆在PCR反應中，用來自CBS513.88的基因組DNA作為模板，用SEQIDNO:4禾卩SEQIDNO:5用于擴增AMD-2基因。按照廠商說明書，用限制性酶PacI和血cI來消化得到的PCR片段(SEQIDNO:20)，將其連接進用尸"cl、^cl線性化過的圖1所示Am'g^表達載體中。這得到了下述構(gòu)建體，其中，編碼可能的乙酰胺酶的AMD2基因被放置于glaA啟動子的控制之下(圖2)。此外，在PCR反應中，用來自CBS513.88的基因組DNA作為模板，用SEQIDNO:9和SEQIDNO:10用于擴增AAE1基因。按照廠商說明書，用限制性酶和Acl來消化得到的PCR片段(SEQIDNO:21)，將其連接進用尸acl、j化l線性化過的圖1所示Am'gw表達載體中。這得到了下述構(gòu)建體，其中，編碼可能的乙酰胺酶的AAEl基因被放置于glaA啟動子的控制之下(圖3)。得到的編碼可能的新穎的Am'ger乙酰胺酶的表達構(gòu)建體(圖2和3)被用于轉(zhuǎn)化A"&wCBS513.88。通過PCR，針對乙酰胺酶構(gòu)建體的存在對轉(zhuǎn)化子加以分析。在實施例3中對選出的克隆進行進一步分析。實施例3新穎的Am'germw/S基因作為選擇標記基因在轉(zhuǎn)化CBS513.88中的用途為測定編碼可能的乙酰胺酶Am'ger同源物的基因是否能在對Am'ger的轉(zhuǎn)化中用作為選擇標記基因，AMD2禾I3AAE1表達構(gòu)建體(圖2和3)被用于轉(zhuǎn)化A&gerCBS513.88。最初將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于含有50嗎/ml腐草霉素的培養(yǎng)基上，以選出含有完整表達構(gòu)建體的基因，因為質(zhì)粒骨架含有賦予腐草霉素抗性的BLE基因(圖1、2和3)。隨后，將腐草霉素抗性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至瓊脂培養(yǎng)基，其中含有乙酰胺作為唯一氮源。只有含AMD2或AAE1表達構(gòu)建體(通過PCR分析證實的)的抗性轉(zhuǎn)化子能在含有乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長，表明AMD2禾nAAE1的確可在對Am'g^的轉(zhuǎn)化中用作為新穎的乙酰胺酶標記基因。本文描述和要求保護的本發(fā)明不限于本文公開的具體實施方式的范圍，因為這些實施方式僅用于闡述本發(fā)明的若干方面。任何等同的實施方式都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，除了本文所展示和描述的之外，木領(lǐng)域技術(shù)人員可從前述說明書明顯獲得對本發(fā)明的多種改變。此類改變也在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以本文的公開內(nèi)容為準，包括定義。<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>與被保藏的微生物相關(guān)的說明(PCTRule13to)<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>權(quán)利要求1.編碼乙酰胺酶的DNA序列，其可從Aspergillus獲得，優(yōu)選地，可從Aspergillusniger獲得，其中，所述DNA序列不是EP0758020A2所描述的SEQIDNO18，但其選自下述物質(zhì)所構(gòu)成的組c.具有SEQIDNO1、SEQIDNO6、SEQIDNO11、SEQIDNO14或SEQIDNO17的核苷酸序列的DNA序列，以及d.(a)的DNA序列中任何序列的片段或突變體。2.如權(quán)利要求1所述的編碼乙酰胺酶的DNA序列，其中所述乙酰胺酶包含下述氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列與SEQIDNO:3、SEQIDNO:8、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19中序列之一具有的位置同一性超過40%。3.—種核酸構(gòu)建體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項所述的DNA序列。4.如權(quán)利要求3所述的核酸構(gòu)建體，其包含對于權(quán)利要求1或2任意一項所述的DNA序列來說天然的啟動子。5.如權(quán)利要求3所述的核酸構(gòu)建體，其包含對于權(quán)利要求1或2任意一項所述的DNA序列來說外源的啟動子。6.如權(quán)利要求3至5中任意一項所述的核酸構(gòu)建體，其還包含將被表達的感興趣的基因。7.由根據(jù)權(quán)利要求1或2中任意一項所述的DNA序列編碼的多肽。8.根據(jù)權(quán)利要求7的多肽，其包含SEQIDNO:3、SEQIDNO:8、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19中的任一序列。9.一種真菌宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求3至6中任意一項所述的核酸構(gòu)建體。10.—種真菌宿主細胞，其中包含根據(jù)權(quán)利要求3至6中任意一項所述的核酸構(gòu)建體，并且還包含將被表達的感興趣的基因。11.根據(jù)權(quán)利要求9或10任意一項所述的真菌宿主細胞，其中內(nèi)源乙酰胺酶活性通過下述方法降低通過特異性誘變或隨機誘變、定點誘變、PCR產(chǎn)生的誘變、核苷酸插入和/或缺失和/或取代、基因打斷或基因置換技術(shù)，反義技術(shù)、RNAi技術(shù)或其組合對一個或多個內(nèi)源乙酰胺酶基因進行修飾和/或失活。12.如權(quán)利要求9至11中任意一項所述的真菌宿主細胞，其中，根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項所述的DNA序列或根據(jù)權(quán)利要求3至6任意一項所述的核酸構(gòu)建體被缺失，或被失活，這是通過對重組DNA構(gòu)建體或其組合進行基因置換和/或失活和/或修飾和/或打斷來進行的。13.如權(quán)利要求9至12中任意一項所述的真菌宿主細胞，其中，所述真菌細胞是有絲真菌細胞，優(yōu)選地，屬于^^e^z7/M、Pem'c〃/"鼎或7V/c/zo&rwa屬的種的細胞。14.如權(quán)利要求9至13中任意一項所述的真菌宿主細胞，其中，所述有絲真菌細胞屬于v4，rg〃/i^、爿5pe;^77/z^、爿i77erg7.〃ws15.—種方法，用于在真菌宿主中生產(chǎn)感興趣的化合物，所述方法包括如下步驟a.在有益于乙酰胺酶表達和感興趣的化合物的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求9至14中任意一項所述的真菌宿主細胞，以及可選地，b.回收所述感興趣的化合物。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中培養(yǎng)基含有乙酰胺作為唯一碳和/或氮源。全文摘要本發(fā)明涉及來自A.niger的新穎的功能性amdS基因，其可在對生物的轉(zhuǎn)化中用作為顯性、雙向選擇標記基因。本發(fā)明還涉及在經(jīng)本發(fā)明的amdS基因轉(zhuǎn)化過的真菌宿主細胞中對感興趣的化合物的生產(chǎn)。優(yōu)選的真菌宿主細胞是有絲真菌細胞。本發(fā)明的amdS基因提供了鑒定其它Aspergillus物種中功能性同源物的手段。文檔編號C12N9/80GK101198697SQ200580035377公開日2008年6月11日申請日期2005年10月17日優(yōu)先權(quán)日2004年10月15日發(fā)明者布倫達·沃恩克,科尼利斯·瑪麗亞·雅各布斯·沙吉,約翰尼斯·翰德里克·溫德·德,蒂鮑特·喬斯·維恩策爾申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司