專利名稱：產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及擴(kuò)增靶核酸序列的方法。
在與核酸和遺傳物質(zhì)相關(guān)的技術(shù)中，經(jīng)常需要確定基因、基因部分或核苷酸序列在活生物體、該生物的細(xì)胞提取物或任何其他生物樣品中是否存在。搜索特定的核苷酸序列具有重大意義，特別是對(duì)于檢測(cè)病原生物、確定等位基因的存在、檢測(cè)宿主基因組中損傷的存在和檢測(cè)特定mRNA的存在或細(xì)胞宿主中修飾的存在。因此，可以通過分析甚至定量某些基因的表達(dá)來診斷許多遺傳疾病。對(duì)這些基因的表達(dá)進(jìn)行定量也是基礎(chǔ)性的。
文獻(xiàn)中描述了多種類型的用于檢測(cè)核酸的方法。這些方法，特別是需要檢測(cè)多核苷酸的方法，基于DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雙鏈體中核酸互補(bǔ)鏈的配對(duì)特性，所述配對(duì)通過雙鏈DNA中腺嘌呤與胸腺嘧啶堿基(A-T)和鳥嘌呤與胞嘧啶堿基(G-C)之間氫鍵的建立，或者通過DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈體中腺嘌呤與尿嘧啶堿基(A-U)之間氫鍵的建立。核酸鏈的配對(duì)通常稱為“核酸雜交”或簡(jiǎn)稱為“雜交”。
一般地，在鑒定了需要分析的生物或疾病的特異性序列之后，應(yīng)當(dāng)從樣品中提取核酸，并確定此序列(也稱為“目的序列”)是否存在。對(duì)此目的已經(jīng)開發(fā)了多種檢測(cè)方法。
檢測(cè)核酸樣品中目的序列的存在的最直接方法是獲得“探針”，其序列與靶核酸的一部分充分互補(bǔ)，從而與后者雜交?？梢允谷绱撕铣傻奶结樑c含有核酸的樣品接觸，如果存在目的序列，則探針將會(huì)雜交并形成反應(yīng)產(chǎn)物。在不存在目的序列并且避免所有非特異性雜交現(xiàn)象時(shí)，將沒有反應(yīng)產(chǎn)物形成。如果合成的探針與可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)，則可通過測(cè)定存在的標(biāo)記物的量來檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。Southern印跡法(Southern E.M.，J.Mol.Biol.，98，503(1975))或Northern印跡法或者斑點(diǎn)印跡或夾心雜交技術(shù)(DUNN A.R.和HASSEL J.K.，Cell，12，23(1977))組成了可使用方法的實(shí)例。
然而，此方法的主要困難在于，它不能直接應(yīng)用于樣品中存在的目的序列拷貝數(shù)低的情況。在這些條件下難于區(qū)分出強(qiáng)于反應(yīng)背景噪聲的顯著信號(hào)(即區(qū)分開探針與其目的序列的特異性結(jié)合和探針與不同于目的序列的序列之間的非特異性結(jié)合)。對(duì)這一問題的一種解決方案為通過補(bǔ)充反應(yīng)來增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。因此，已經(jīng)描述了多種方法以提高這些雜交技術(shù)的檢測(cè)能力。這些稱為“擴(kuò)增”的方法可以分為三類靶、探針或信號(hào)的擴(kuò)增。一方面，Lewis(1992，GeneticEngineering News 121-9)的文章，另一方面，Abramson和Myers(1993，Curer.Opus.Biotechnol.44147)的文章，組成了這些方法的非常好的總括性綜述。
靶擴(kuò)增是特異性倍增樣品中存在的核酸片段。它使得能夠顯著地提高待檢測(cè)的靶核酸序列的拷貝數(shù)。
文獻(xiàn)中描述的靶擴(kuò)增技術(shù)主要基于重復(fù)進(jìn)行體外DNA合成循環(huán)或者重復(fù)進(jìn)行體外RNA合成循環(huán)，前者通過DNA聚合酶來延伸與待擴(kuò)增靶序列雜交的核苷酸引物來進(jìn)行(“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”，也稱為PCR參閱專利US 4 683 195、US 4 683 202和US 4 800 159；EP 201 184；稱為“修復(fù)鏈反應(yīng)”或RCR的方法參閱專利申請(qǐng)WO 90/01069；稱為“鏈置換擴(kuò)增”(SDA)的方法參閱專利EP 0 497 272；“外切核酸酶介導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增”方法參閱專利EP 500 224)，后者通過使用RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來進(jìn)行。
已經(jīng)描述了基于擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物的這些靶擴(kuò)增方法中的幾種。專利申請(qǐng)WO 88/10315中描述的“TAS”方法由三步驟循環(huán)的重復(fù)組成。第一個(gè)步驟使得能夠在逆轉(zhuǎn)錄酶和脫氧核苷酸引物存在下由RNA合成cDNA，所述脫氧核苷酸引物含有對(duì)于噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子特異的序列。在使RNA/cDNA異源雙鏈體熱變性之后，在反義寡核苷酸引物存在下通過逆轉(zhuǎn)錄酶來復(fù)制單鏈cDNA鏈。在第二個(gè)步驟中如此獲得的DNA同源雙鏈體含有噬菌體的DNA依賴性RNA聚合酶可以結(jié)合的雙鏈啟動(dòng)子。第三個(gè)步驟是轉(zhuǎn)錄，使每個(gè)模板產(chǎn)生30至1000個(gè)RNA分子，所述RNA分子繼而可以用作合成cDNA的模板，從而使擴(kuò)增循環(huán)繼續(xù)(DAVIS等認(rèn)，1990.J.Infect.Dis.16213-20)。
存在多種由TAS衍生的方法，包括專利申請(qǐng)WO 90/06995和專利EP 0 373 960中描述的“自動(dòng)維持序列復(fù)制”(或3SR)，專利申請(qǐng)WO91/02818和歐洲申請(qǐng)EP 329 822中描述的“基于核酸序列的擴(kuò)增”(或NASBA)方法，和專利US 5 194 370中描述的“單引物序列復(fù)制”(或SPSR)方法。
這些方法都包括三種酶活性的組合RNA-和DNA-依賴性DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)、核糖核酸酶H(RNaseH，大腸桿菌(Escherichia coli)的酶，和/或與逆轉(zhuǎn)錄酶相關(guān)的酶活性)和DNA-依賴性RNA聚合酶(T7噬菌體的RNA聚合酶)。這些方法基于相同的原理，并按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的連續(xù)過程在固定的溫度(37℃至45℃)下進(jìn)行，以通過cDNA來復(fù)制RNA靶。對(duì)于TAS的情況，通過用于逆轉(zhuǎn)錄步驟的引物將RNA聚合酶(T7噬菌體)的結(jié)合位點(diǎn)引入cDNA中。然而，RNA/cDNA異源雙鏈體的變性通過RNase H活性對(duì)該異源雙鏈體中RNA的特異性水解而等溫地來進(jìn)行。接著使用第二種寡核苷酸引物通過逆轉(zhuǎn)錄酶來復(fù)制游離的cDNA。通過T7 RNA聚合酶將DNA/DNA同源雙鏈體轉(zhuǎn)錄成RNA，該RNA又可重新作為模板用于下一循環(huán)。
專利US 5 194 370中描述的稱為“連接激活轉(zhuǎn)錄”(或LAT)的另一方法使用與3SR、SPSR和NASBA方法相同的酶活性，并以相同的循環(huán)進(jìn)行運(yùn)作。然而，它的區(qū)別在于安裝啟動(dòng)子序列的方式，在這種情況下，通過在DNA連接酶存在下連接含有啟動(dòng)子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)而在cDNA末端引入所述啟動(dòng)子序列。
還存在兩種其他基于擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物的靶擴(kuò)增方法，描述于專利申請(qǐng)EP 369 775。一種方法與LAT的差異僅在于啟動(dòng)子由兩種不同的寡核苷酸組成。另一種方法使用兩種酶活性連接酶和RNA聚合酶，所述RNA聚合酶能識(shí)別雙鏈DNA啟動(dòng)子，能沿著RNA模板進(jìn)行延伸。稱為移動(dòng)性啟動(dòng)子的啟動(dòng)子由兩種寡核苷酸組成。一種帶有有義啟動(dòng)子序列和使得能夠在RNA靶的3’末端上進(jìn)行雜交的探針序列，另一種僅帶有反義啟動(dòng)子序列。反義啟動(dòng)子寡核苷酸的5’末端通過雜交與靶的3’末端并列在一起，然后與此末端連接。通過合適的RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄引起合成了多個(gè)轉(zhuǎn)錄物。這些轉(zhuǎn)錄物與第二個(gè)移動(dòng)性啟動(dòng)子雜交并連接。RNA模板的轉(zhuǎn)錄引起合成了互補(bǔ)轉(zhuǎn)錄物?？梢灾貜?fù)該過程，導(dǎo)致起始靶序列的指數(shù)式擴(kuò)增。
還可以提及專利申請(qǐng)WO 99/4385中描述的方法，其是核酸的非特異性擴(kuò)增方法。這種擴(kuò)增方法也基于轉(zhuǎn)錄，但僅需要一種引物。在3’端封閉的所述引物使得能夠加入位于有義RNA 3’端的T7啟動(dòng)子序列。接著，此序列使得能夠轉(zhuǎn)錄反義cRNA。由于所使用的引物將與mRNA的polyA尾雜交，因此此方法是非特異性的。
一般地，為了得到擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增方法例如PCR或NASBA需要兩種引物。作為其結(jié)果，擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物本身接著成為擴(kuò)增的模板，使擴(kuò)增成為指數(shù)型的。盡管這些方法使得能夠得到非常好的擴(kuò)增產(chǎn)率，但他們?nèi)匀徊贿m合用于同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶(稱為多重?cái)U(kuò)增)，然而在需要分析幾種基因的表達(dá)譜時(shí)，這一步驟是必要的。此外，申請(qǐng)WO99/4385中所描述的方法基于擴(kuò)增所有的mRNA，這在DNA芯片的分析中會(huì)促進(jìn)背景噪聲的產(chǎn)生。此外，此方法局限于基因的3’區(qū)。因此，這種方法不適合用于研究突變或者研究位于基因中間或其5’區(qū)的靶區(qū)域。
本發(fā)明提出通過提供特異性線性擴(kuò)增方法來解決現(xiàn)有技術(shù)的所有缺點(diǎn)，所述方法使得能夠同時(shí)擴(kuò)增不同基因的靶區(qū)域，所述靶區(qū)域可以位于基因的3’、5’或中間。
在這一方面中，本發(fā)明涉及由以下物質(zhì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法●包含“引物”區(qū)和目的區(qū)的待擴(kuò)增RNA序列，和●包含啟動(dòng)子區(qū)和能與待擴(kuò)增RNA序列的所述“引物”區(qū)雜交的區(qū)域的擴(kuò)增引物，所述方法在恒溫下進(jìn)行，并包括下列步驟a)將所述引物與待擴(kuò)增RNA雜交，b)通過逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性來延伸引物，以產(chǎn)生待擴(kuò)增RNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，c)通過具有核糖核酸酶H活性的酶來切割與所述cDNA雜交的待擴(kuò)增RNA，以獲得與所述cDNA雜交的待擴(kuò)增RNA片段，d)通過逆轉(zhuǎn)錄酶和鏈置換酶來延伸所述待擴(kuò)增RNA片段的末端，以獲得RNA-DNA/DNA雜交體，e)通過具有RNA聚合酶活性的酶從在步驟d)中形成的RNA-DNA/DNA雜交體獲得RNA轉(zhuǎn)錄物。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“轉(zhuǎn)錄物”意指轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即在起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子控制下的模板轉(zhuǎn)錄過程中新合成的RNA。
術(shù)語“序列”意指含有天然堿基(如果涉及脫氧核糖核苷酸性質(zhì)的序列則為A、C、G、T，如果涉及核糖核苷酸性質(zhì)的序列則為A、C、G、U)和/或一種或多種經(jīng)修飾的堿基的核苷酸序列，所述經(jīng)修飾的堿基例如為肌苷、5-甲基-脫氧胞苷、脫氧尿苷、5-二甲基氨基-脫氧尿苷、2，6-二氨基-嘌呤、5-溴-脫氧尿苷或允許雜交反應(yīng)的任何經(jīng)修飾的堿基。也可以在核苷酸間鍵(可包括如硫代磷酸酯鍵、Hphosphonate鍵、烷基磷酸酯鍵)的水平上或在骨架的水平上修飾多核苷酸序列，例如對(duì)于α-寡核苷酸(法國(guó)專利號(hào)2 607 507)或PNA(EGHOLM等人，1992.J.Am.Chem.Soc.1141895-1897)的情況。在經(jīng)修飾的多核苷酸序列中，如上文所指出的，多種修飾可以組合存在。此序列可以是DNA或RNA性質(zhì)或者DNA/RNA嵌合體性質(zhì)，并且“長(zhǎng)度”通常為至少5個(gè)脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，其中可以任選地含有至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。序列可以含有各自與不同功能相關(guān)的多個(gè)不同的區(qū)域。
為了實(shí)施本發(fā)明的方法，從待擴(kuò)增RNA序列開始，其可以被看作是待擴(kuò)增RNA的第一個(gè)模型。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，待擴(kuò)增RNA可以是任何核糖核酸序列。優(yōu)選地，待擴(kuò)增RNA為信使RNA。
特別地，待擴(kuò)增RNA包含目的區(qū)，即能與所述目的區(qū)的特異性雜交探針雜交的多核苷酸。因此，該探針使得能夠如下文所述地檢測(cè)目的區(qū)存在與否。
該待擴(kuò)增RNA還包含“引物”區(qū)，即下文定義的擴(kuò)增引物可以與其特異性雜交的多核苷酸。優(yōu)選地，“引物”區(qū)位于待擴(kuò)增RNA序列的目的區(qū)的3’區(qū)。
“能與另一序列/區(qū)域雜交的序列或區(qū)域”這種表述意指可以在雜交條件下與另一序列/區(qū)域雜交的序列或區(qū)域，所述雜交條件可以根據(jù)各種情況以已知方式確定。也稱為互補(bǔ)序列/區(qū)域。與另一序列或區(qū)域嚴(yán)格互補(bǔ)的序列或區(qū)域是其中每個(gè)堿基都能與另一序列的堿基配對(duì)而沒有錯(cuò)配的序列。術(shù)語“雜交”意指這樣的過程，在該過程中，在適當(dāng)條件下，具有充分互補(bǔ)性序列的兩個(gè)核苷酸片段能夠形成具有穩(wěn)定且特異的氫鍵的雙鏈。通過嚴(yán)緊性(即操作條件的嚴(yán)格性)來確定雜交條件。進(jìn)行雜交的嚴(yán)緊性越高，特異性就越高。特別地，按照探針/靶雙鏈體的堿基組成來定義嚴(yán)緊性，還通過兩個(gè)核酸間的錯(cuò)配程度進(jìn)行定義。嚴(yán)緊性還取決于反應(yīng)參數(shù)，如雜交溶液中存在的離子種類的濃度和類型、變性劑的性質(zhì)和濃度和/或雜交溫度。進(jìn)行雜交反應(yīng)的條件嚴(yán)緊性主要取決于使用的雜交探針。所有這些資料都是熟知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合適的條件。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“擴(kuò)增引物”意指當(dāng)與待擴(kuò)增核酸(DNA或RNA性質(zhì))雜交時(shí)使得能夠引發(fā)延伸反應(yīng)的序列。本發(fā)明使用的引物可以分成兩個(gè)區(qū)域，它們是(在5’-3’方向上)●可以被RNA聚合酶識(shí)別從而起始轉(zhuǎn)錄(即合成RNA)的啟動(dòng)子區(qū)。該啟動(dòng)子區(qū)包含啟動(dòng)子和由RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。特別地，該啟動(dòng)子區(qū)包含RNA聚合酶啟動(dòng)子的一條鏈。例如，可以提及RNA聚合酶的天然啟動(dòng)子、來自天然啟動(dòng)子并保留其功能性的截短的序列或能夠起始轉(zhuǎn)錄的“環(huán)”結(jié)構(gòu)，如MOLLEGAARD N.E.等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，3892-3895所述。該啟動(dòng)子區(qū)還可以包含有利于起始轉(zhuǎn)錄的序列，其功能為限制形成無效的轉(zhuǎn)錄物。RNA聚合酶可以是DNA依賴性的，這使得能夠從DNA序列來轉(zhuǎn)錄RNA；●能夠與待擴(kuò)增RNA的“引物”區(qū)雜交(即與待擴(kuò)增RNA的所述“引物”區(qū)互補(bǔ))的區(qū)域。該區(qū)域可以是DNA性質(zhì)的。
因此，引物的5’末端可以包含不與所述待擴(kuò)增RNA雜交的核苷酸(啟動(dòng)子的反義序列、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的反義序列等)，而3’末端必須具有允許在合適的溫度和嚴(yán)緊性條件下起始引物延伸的長(zhǎng)度和核苷酸組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，引物為DNA性質(zhì)的。引物的3’不封閉，這使得能夠穩(wěn)定DNA-RNA雜交體。
本發(fā)明的方法為等溫方法，即在多個(gè)步驟中不需要對(duì)溫度進(jìn)行任何改變。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該方法在37℃和50℃之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選40℃和45℃之間，更加優(yōu)選41℃。
在步驟a)中，在允許引物/待擴(kuò)增RNA序列雜交的所述區(qū)域范圍內(nèi)使所述引物與待擴(kuò)增RNA雜交。在合適的嚴(yán)緊性和溫度條件下，通過待擴(kuò)增RNA的預(yù)設(shè)區(qū)與引物的預(yù)設(shè)區(qū)之間的互補(bǔ)性來進(jìn)行所述雜交。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在此步驟之前進(jìn)行變性待擴(kuò)增RNA(優(yōu)選在65℃)的步驟。
在步驟b)中，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性來延伸引物，以產(chǎn)生待擴(kuò)增RNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸序列(cDNA)。此步驟需要存在脫氧核糖核苷酸，酶使用所述脫氧核糖核苷酸通過互補(bǔ)性來合成cDNA。在與步驟a)中相當(dāng)?shù)暮线m的嚴(yán)緊性和溫度條件下，在引物的5’-3’方向進(jìn)行所述延伸。這種逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
在步驟c)中，用具有RNase H活性的酶切割與所述cDNA雜交的RNA，從而獲得與所述cDNA雜交的RNA片段。RNase H活性使得能夠水解RNA-DNA雜交體，而不水解RNA-RNA或DNA-DNA雜交體。RNase H活性可以通過單獨(dú)的酶(特別地，例如大腸桿菌的RNase H酶)而獲得，或者通過逆轉(zhuǎn)錄酶(特別地，例如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)的RNase H活性而獲得。
在步驟d)中，通過逆轉(zhuǎn)錄酶和鏈置換酶來延伸所述RNA片段的末端，從而獲得RNA-DNA/DNA復(fù)合體。所述逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
在步驟e)中，通過具有RNA聚合酶活性的酶從在步驟d)中形成的RNA-DNA/DNA復(fù)合體獲得RNA轉(zhuǎn)錄物。通過在5’-3’方向合成與轉(zhuǎn)錄的核苷酸鏈反向平行且互補(bǔ)的RNA來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄所使用的具有RNA聚合酶活性的酶是能夠與引物的啟動(dòng)子結(jié)合并在體外從引物的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始起始RNA合成的酶。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，具有RNA聚合酶活性的酶為噬菌體的RNA聚合酶，優(yōu)選T7噬菌體的RNA聚合酶，但也可以使用其他聚合酶，如噬菌體T3、SP6、gh-1等的RNA聚合酶。當(dāng)然，位于引物上的啟動(dòng)子序列必須適合于在步驟e)中使用的RNA聚合酶。
本發(fā)明的擴(kuò)增方法可以通過在適當(dāng)條件下加入實(shí)施該方法所需的所有化合物(即待擴(kuò)增RNA、酶、擴(kuò)增引物和脫氧核糖核苷酸)來進(jìn)行。該反應(yīng)介質(zhì)不含有可能干擾擴(kuò)增過程的物質(zhì)，如可以抑制所需酶的活性的物質(zhì)、可以干擾引物與待擴(kuò)增RNA雜交的物質(zhì)或者可以降解擴(kuò)增產(chǎn)物的物質(zhì)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，施行步驟a)至e)的時(shí)間足以獲得足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)錄物。優(yōu)選地，施行步驟a)至e)的時(shí)間為30分鐘至3小時(shí)30分鐘，更加優(yōu)選1小時(shí)30分鐘至2小時(shí)30分鐘。
然后，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來檢測(cè)如此獲得的轉(zhuǎn)錄物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法還包括以下步驟f)使用所述目的區(qū)的特異性雜交探針來檢測(cè)產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物。
術(shù)語“檢測(cè)”意指通過物理方法的直接檢測(cè)或使用標(biāo)記物的檢測(cè)方法。存在多種用于檢測(cè)核酸的檢測(cè)方法[參閱如Kricka等人，Clinical Chemistry，1999，No.45(4)，第453-458頁；或Keller G.H.等人，DNA Probes，第二版，Stockton Press，1993，第5和6部分，第173-249頁]。術(shù)語“標(biāo)記物”意指能產(chǎn)生信號(hào)的示蹤物。這些示蹤物的非限制性列表包括產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)(如通過比色法、熒光或發(fā)光而可檢測(cè)的)的酶例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或葡糖-6-磷酸脫氫酶；生色團(tuán)例如熒光、發(fā)光或染料化合物；可以通過電子顯微術(shù)或其電特性(如電導(dǎo)率)、可以通過電流分析法或伏安法、或者通過阻抗測(cè)量而可檢測(cè)的高電子密度基團(tuán)；可以通過光學(xué)方法如衍射、表面等離子體共振(résonance plasmon de surface)或接觸角變化，或者通過物理方法如原子力光譜法、隧道效應(yīng)等而可檢測(cè)的基團(tuán)；放射性分子如32P、35S或125I。因此，可以在本發(fā)明的擴(kuò)增步驟中標(biāo)記多核苷酸，如通過將標(biāo)記的核苷三磷酸用于擴(kuò)增反應(yīng)。還可以使用間接系統(tǒng)，例如能與抗配體反應(yīng)的配體。配體/抗配體對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，這例如是以下對(duì)的情況生物素/鏈霉抗生物素蛋白、半抗原/抗體、抗原/抗體、肽/抗體、糖/凝集素、多核苷酸/該多核苷酸的互補(bǔ)序列、組氨酸連續(xù)序列(稱為“標(biāo)簽”，用于金屬如鎳)。在這種情況下，配體帶有結(jié)合劑。抗配體可以通過如以上段落所述的標(biāo)記物直接進(jìn)行檢測(cè)，或者其自身可以通過配體/抗配體進(jìn)行檢測(cè)。
經(jīng)標(biāo)記的核苷酸將是核糖核苷酸。還可以在擴(kuò)增步驟之后標(biāo)記多核苷酸，例如按照文獻(xiàn)WO-A-91/19812中所述的夾心雜交技術(shù)與經(jīng)標(biāo)記的探針雜交。這些探針還可用于OLISA技術(shù)，如申請(qǐng)WO 03/098217所述。
還可以使用識(shí)別根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增出的RNA的所述目的區(qū)的雜交探針來進(jìn)行該檢測(cè)。術(shù)語“雜交探針”意指包含5至100個(gè)核苷酸基序(特別是6至35個(gè)核苷酸基序)的核苷酸片段，其具有在給定的條件下與目的區(qū)形成雜交復(fù)合體的雜交特異性。這種雜交探針可以是捕獲探針。在這種情況下，可以用標(biāo)記物對(duì)靶核苷酸片段進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記。可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄?即直接或間接地，例如通過共價(jià)或吸附)使捕獲探針固定在或者可固定在固體支持物上。接著進(jìn)行所述探針與經(jīng)標(biāo)記的靶核苷酸片段之間的雜交反應(yīng)。
雜交探針還可以是檢測(cè)探針。在這種情況下，可以用標(biāo)記物對(duì)雜交探針進(jìn)行標(biāo)記。接著進(jìn)行所述檢測(cè)探針與靶核苷酸片段之間的雜交反應(yīng)。夾心測(cè)試還可以使用固定在固體支持物上的捕獲探針，靶核苷酸片段與所述捕獲探針雜交，檢測(cè)探針與所述靶核苷酸片段雜交。
無論使用捕獲探針還是檢測(cè)探針，雜交反應(yīng)都可以在固體支持物上進(jìn)行，所述固體支持物包括可以在其上固定核酸的所有材料?？梢允褂煤铣刹牧匣蛱烊徊牧?其任選地進(jìn)行化學(xué)修飾)作為固體支持物，特別是多糖如基于纖維素的材料，例如紙，纖維素衍生物如乙酸纖維素和硝酸纖維素或葡聚糖，聚合物，共聚物(特別是基于苯乙烯型單體的)，天然纖維如棉花，和合成纖維如尼龍；無機(jī)材料如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；膠乳；磁性顆粒；金屬衍生物、凝膠等。固體支持物可以是微量滴定板形式、申請(qǐng)WO-A-94/12670所述的膜形式、顆粒形式或生物芯片形式。術(shù)語“生物芯片”意指尺寸很小的固體支持物，在所述支持物的預(yù)設(shè)位置上固定了大批捕獲探針。生物芯片(更準(zhǔn)確地，DNA芯片)的概念出現(xiàn)于20世紀(jì)90年代初。由于已經(jīng)開始開發(fā)蛋白質(zhì)芯片，因此目前這一概念已經(jīng)得到了擴(kuò)展。它基于整合了微電子學(xué)、核酸化學(xué)、圖像分析和信息學(xué)的多學(xué)科技術(shù)。工作原理基于分子生物學(xué)雜交現(xiàn)象，即兩個(gè)DNA和/或RNA序列的堿基通過互補(bǔ)性而配對(duì)。
生物芯片方法基于使用固定在固體支持物上的捕獲探針，在所述捕獲探針上讓用熒光染料直接或間接標(biāo)記的靶核苷酸片段樣品發(fā)生作用。捕獲探針以特定的方式安置在支持物或芯片上，每個(gè)雜交給出關(guān)于該靶核苷酸片段的一條特定信息。獲得的信息是累加的，并使得能夠例如定量一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)水平。為了分析靶基因的表達(dá)，可以制備帶有非常大量的探針的生物芯片，所述探針相應(yīng)于轉(zhuǎn)錄成mRNA的靶基因的全部或部分。接著使例如來自需要分析的靶基因的mRNA的互補(bǔ)DNA進(jìn)行雜交。雜交后，洗滌支持物或芯片，用例如掃描儀讀數(shù)并通過信息學(xué)對(duì)熒光分析結(jié)果進(jìn)行處理。為說明起見，可以提及Affymetrix公司開發(fā)的用于分子診斷的DNA芯片(″AccessingGenetic Information with High-Density DNA arrays″，M.Chee等人，Science，1996，274，610-614.″Light-generatedoligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis″，A.Caviani Pease等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，5022-5026)。在這一技術(shù)中，捕獲探針一般較小，約為20個(gè)核苷酸。在出版物G.Ramsay，Nature Biotechnology，1998，No.16，第40-44頁；F.Ginot，Human Mutation，1997，No.10，第1-10頁；J.Cheng等人，Molecular diagnosis，1996，No.1(3)，第183-200頁；T.Livache等人，Nucleic Acids Research，1994，No.22(15)，第2915-2921頁；J.Cheng等人，Nature Biotechnology，1998，No.16，第541-546頁中或者在專利US-A-4,981,783、US-A-5,700,637、US-A-5,445,934、US-A-5,744,305和US-A-5,807,522中給出了生物芯片的其他實(shí)例。還可以提及Apibio公司開發(fā)的低密度芯片，如申請(qǐng)WO 03/098217所述。固體支持物的主要特征必須是保留捕獲探針與靶核苷酸雜交的特征，同時(shí)對(duì)檢測(cè)方法產(chǎn)生最小的背景噪聲。本發(fā)明特別適用于這些低密度芯片系統(tǒng)。
可以實(shí)施本發(fā)明的方法以產(chǎn)生來源于多種不同基因的RNA轉(zhuǎn)錄物。使得能夠同時(shí)擴(kuò)增不同基因的靶區(qū)域，這正是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一，所述靶區(qū)域可以位于基因的3’、5’或中間。
在這一方面中，本發(fā)明還涉及由以下物質(zhì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法●至少第一待擴(kuò)增RNA序列和第一擴(kuò)增引物，所述第一待擴(kuò)增RNA序列包含“引物”區(qū)和目的區(qū)，所述第一擴(kuò)增引物包含啟動(dòng)子區(qū)和能與第一待擴(kuò)增RNA序列的所述“引物”區(qū)雜交的區(qū)域，●至少第二待擴(kuò)增RNA序列和第二擴(kuò)增引物，所述第二待擴(kuò)增RNA序列與所述第一待擴(kuò)增RNA序列不同，并包含“引物”區(qū)和目的區(qū)，所述第二擴(kuò)增引物包含啟動(dòng)子區(qū)和能與第二待擴(kuò)增RNA序列的所述“引物”區(qū)雜交的區(qū)域，所述方法在恒溫下進(jìn)行，并包括下列步驟a)所述第一和第二引物與所述第一和第二待擴(kuò)增RNA雜交，b)通過逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性來延伸所述第一和第二引物，以產(chǎn)生第一待擴(kuò)增RNA的第一互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列和第二待擴(kuò)增RNA的第二互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，c)通過具有核糖核酸酶H活性的酶來切割分別與第一和第二cDNA雜交的第一和第二待擴(kuò)增RNA，以獲得與第一cDNA雜交的第一待擴(kuò)增RNA片段和與第二cDNA雜交的第二待擴(kuò)增RNA片段，d)通過逆轉(zhuǎn)錄酶和鏈置換酶來延伸所述第一和第二待擴(kuò)增RNA片段的末端，以獲得RNA-DNA/DNA雜交體，e)通過具有RNA聚合酶活性的酶從在步驟d)中形成的RNA-DNA/DNA雜交體獲得所述第一和第二待擴(kuò)增RNA的轉(zhuǎn)錄物。
可以以相當(dāng)?shù)姆绞绞褂么朔椒◤膩碓从?、4、5、10個(gè)或更多個(gè)不同基因的待擴(kuò)增RNA開始來產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物。
按照與上文所述相當(dāng)?shù)姆椒ㄊ┬胁襟Ea)至e)，并且其施行時(shí)間足以獲得足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)錄物，如上文所定義。
為了檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物，優(yōu)選在步驟f)中使用第一雜交探針來檢測(cè)第一待擴(kuò)增RNA的轉(zhuǎn)錄物，和使用第二雜交探針來檢測(cè)第二待擴(kuò)增RNA的轉(zhuǎn)錄物。
優(yōu)選地并如上文所定義，具有RNA聚合酶活性的酶為噬菌體的RNA聚合酶，更加優(yōu)選T7噬菌體的RNA聚合酶。
所附的圖用于作為說明性示例，而不具有任何限制性的性質(zhì)。它們使得能夠更清楚地理解本發(fā)明。


圖1示意性地顯示了本發(fā)明方法的步驟。
圖2顯示了雜交探針發(fā)射的信號(hào)，所述雜交探針與如實(shí)施例2所述根據(jù)本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)錄物雜交。
圖3顯示了按照實(shí)施例3所述方案擴(kuò)增一系列轉(zhuǎn)錄物(1×107、1×108、1×109和1×1010個(gè)拷貝)之后得到的線性回歸。
圖4顯示了使按照實(shí)施例4所述方案獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交并顯影之后，與每個(gè)特異性探針相關(guān)的所發(fā)射出的信號(hào)(3次重復(fù)的平均值)及其標(biāo)準(zhǔn)偏差。
在圖1中，以波浪線代表核糖核酸性質(zhì)的序列，而直線代表脫氧核糖核酸性質(zhì)的序列。
在步驟a)中，DNA性質(zhì)的引物(以長(zhǎng)虛線代表)與RNA模板的“引物”區(qū)(以粗線代表)雜交，引物5’端的啟動(dòng)子序列不與模板RNA雜交。為了更清楚地理解本發(fā)明，以短虛線代表需要在擴(kuò)增階段后檢測(cè)的目的序列，其位于“引物”區(qū)的5’側(cè)。然而，目的序列和“引物”序列可以是單一的相同序列。
在步驟b)中，使具有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性的酶發(fā)揮作用，以按5’-3’方向延伸與RNA模板雜交的引物。獲得了序列與RNA模板序列互補(bǔ)的DNA(cDNA，以虛線代表)。由此在靶區(qū)域與模板RNA的5’末端之間獲得了模板RNA/cDNA雙鏈雜交體序列。由于其缺乏互補(bǔ)性，因此引物的啟動(dòng)子序列和位于靶RNA的靶區(qū)域的3’側(cè)的序列仍保持為未雜交(單鏈)的序列。
在步驟c)中，使具有RNase H活性的酶發(fā)揮作用，從而誘導(dǎo)模板RNA內(nèi)的切割。這些切割是非特異性的，使得能夠釋放與cDNA雜交的RNA片段的3’OH末端(以叉號(hào)代表)。
在步驟d)中，通過具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和鏈置換活性的酶延伸如此釋放出的3’OH末端。延伸終止于合成與引物的啟動(dòng)子序列互補(bǔ)的鏈。這樣獲得了多種不同的RNA-DNA/DNA雙鏈雜交體序列，其包含在DNA依賴性RNA聚合酶作用下能起始轉(zhuǎn)錄的雙鏈啟動(dòng)子區(qū)(以圓圈代表)。如此，以說明性的方式顯示了從兩個(gè)不同切割位點(diǎn)開始獲得的兩種不同雜交體。在步驟e)中，DNA依賴性RNA聚合酶的作用使得能夠獲得與在步驟d)中獲得的多種不同雜交體相對(duì)應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄物。從而獲得一群大小不同但都包含需要檢測(cè)的目的區(qū)的轉(zhuǎn)錄物。
給出以下實(shí)施例用于舉例說明，但不具有任何限制性的性質(zhì)。它們使得能夠更清楚地理解本發(fā)明。
實(shí)施例1獲得待擴(kuò)增RNA序列按照供應(yīng)商推薦的方案，在雙啟動(dòng)子載體pCR-II-TOPO(Invitrogen)中，從來自HML-4內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第一待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQ ID No.1GUCACUGUCA AGCCUCCAGA UGCCAUCCCU UUGACUUGAA AACUCAGCCAGUUUGGGUGG AUCAGUGGCC GCUCCCAAAA AAUAAGCUGG AGGCGCUCCA
UAAUUUAGUC CUGGAACAGU UAGAAUUGGG ACACAUUGAG GAAUCUUUCUCUCCAUGGAA UUCACUUGUC UUUGUUAUCC AAAAGAAAUC UGGGGAAAACAGAGAAUGCU CACUCAUCUU AGGGCAGUUA AUGCUGUACU UCAACCUCUGGGGACAUUAC AAUCUGGCUU ACCCUCCCGC UCUAUGCUCG CUGAGUAUUGGCCUCUAAUC CUCAUAGAUC UUAAAGAUUG CUUUUUUAAC AUUCCACUGGCCUCUCAGGA CUUUGAAAAG UUUGCUUUUA UGGUCCCUUC CCUCAACAAUGUCGCUCAGG CUACAUGCUA CUAUUGGAAA GUCCUACCAC AAGGCAUGCUUAAUAGUCCC ACUAUUUGUC AGUAUUUUGU GGGGCGUGUG CUUCAACCUGUCAGGGAUCA GUUUCCCCGA UGUUACAUCG UUCACUACAU GGAUGAUCUCCUCUGCACAG CCCCCCCAUA CACCAUUUUG AUUUCCUGCU UUUCUGUGAUUCAACAGGCC AUUUCAGAAG CAGGUUUGAC UAUUGCACCA GAAAAAAUUCAAACUACCUC UCAUUUUCAA UAUUUGGGCA UGCAGUUGGA AGACAAGCUGAUUACACCAC AAAAAGUUCA GCUUAGGAGA GACGCCU。
使用Ampliscribe T7 Flash試劑盒(Epicentre)并按照供應(yīng)商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
以相似的方式從來自HERV-4.1內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第二待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQ ID No.2GGCCAAGAGA UAAGACCAG CUCUGGCUAA GCGGUGGCCA AGAGUGUGGGCGGAAGACAA CCCUCCAGGG UUGGCAGUCA ACCAAGCCCC CGUGCUUAUAGAAGUUAAGC CUGGGGUCCA GCCGGUUAGG CAAAAACAGU ACCCGGUCCUCAGAGAAGCU CUUGAAGGUA UCCAGGUCCA UCUCAAGUGC CUAAGAACCUUUAGAAUUAU AGUUCCUUGU CAGUCUCCAU GGAACACUCC CCUCCUGCCUGUUCCCAAGC CUGGGACCAA GGACUACAGG CCGGUACAGG AUUUGCGCUUGGUUAAUCAG GCUACAGUGA CUUUACAUCC AACAGUACCU AACCUGUACACAUUGCUGGG GUUGCUGCCA GCUGAGGACA GCUGGUUCAC CUGCUUGGACCUGAAAGAUG CCUUCUUUAG CAUCAGAUUA GCCCCUGAGA GACAGAAGCUGUUUGCCUUU CAGUGGGAAG AUCCAGAGUC AGGUGUCACU ACUCAAUACACUUGGACCCA GCCUCCCCAA AGGUUCAAGA ACUCCCCCAC CAUCUUUGGGGAGGCGUUGG CUCGAGACCU CCAGAAGUUU CCCACCAGAG ACCUAGGCUG
CGUGUUGCUC CAGUACGUUG AUGACCUUUU GCUGGGACAC CCCACGGCAGUCGGGUGCGC CAAGGGAACA GAUGCUCUAC UCCGGCACCU GGAGGACUGUGGGUAUAAGG UGUCCAAGAA AAAAAGCUCA GAUCUGCCGA CAGCAGGUAUGUUACUUGGG AUUUACUAUC CAACAGGGGG AGCACAGCCU GGGAUCAGAAAGAAAGCAGG UCAUUUGUAA UCUACCGGAG CCUAAGACCA GAAGGCAGGUGAGAGAAU。
實(shí)施例2通過本發(fā)明方法從實(shí)施例1中定義的RNA序列產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物為了擴(kuò)增SEQ ID No.1的RNA序列，使用SEQ ID No.3的引物序列SEQ ID No.3TAATACGACT CACTATAGGG AGATCTAGCA GCATAGGGGGGGCTGTGCAG AGGAGATCAT CC，其包含●包含T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子(在SEQ ID No.3中以斜體標(biāo)出)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(在SEQ ID No.3中以粗體標(biāo)出)的啟動(dòng)子區(qū)，●能與待擴(kuò)增RNA序列的引物區(qū)雜交的區(qū)域(在SEQ ID No.3中以下劃線標(biāo)出)。
該引物在3’端未封閉。
應(yīng)該指出，能與引物區(qū)雜交的區(qū)域可以更短，特別是可以包含15至30個(gè)堿基對(duì)。還應(yīng)該指出，在起始位點(diǎn)和能與引物區(qū)雜交的區(qū)域之間包含了促進(jìn)起始的序列，其限制了無效轉(zhuǎn)錄物的形成。
為了擴(kuò)增SEQ ID No.2的RNA序列，使用SEQ ID No.4的引物序列SEQ ID No.4TAATACGACT CACTATAGGG AGATCTAGCA GCATACAGCAAAAGGTCATC AACGTACTGG AG其中包含●包含T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子(在SEQ ID No.4中以斜體標(biāo)出)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(在SEQ ID No.4中以粗體標(biāo)出)的啟動(dòng)子區(qū)，●能與待擴(kuò)增RNA序列的引物區(qū)雜交的區(qū)域(在SEQ ID No.4中以下劃線標(biāo)出)。
該引物在3’端未封閉。
應(yīng)該指出，能與引物區(qū)雜交的區(qū)域可以更短，特別是可以包含15至30個(gè)堿基對(duì)。還應(yīng)該指出，在起始位點(diǎn)和能與引物區(qū)雜交的區(qū)域之間包含了促進(jìn)起始的序列，其限制了無效轉(zhuǎn)錄物的形成。
轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在反應(yīng)混合物(NucliSens Basic Kit，bioMérieux)中進(jìn)行，所述反應(yīng)混合物包含具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶(AMV-RT)、具有RNase H活性的酶(RNase H)和具有RNA聚合酶活性的酶(T7 RNA聚合酶)。
在以下引物存在下進(jìn)行擴(kuò)增●SEQ ID No.3的引物序列(0.5μM)，用于擴(kuò)增SEQ ID No.1的RNA序列，●SEQ ID No.4的引物序列(0.5μM)，用于擴(kuò)增SEQ ID No.2的RNA序列，●SEQ ID No.3的引物序列(0.5μM)和SEQ ID No.4的引物序列(0.5μM)，用于同時(shí)擴(kuò)增SEQ ID No.1的RNA序列和SEQ ID No.2的RNA序列。
因此，以整合有生物素的方式對(duì)于SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的RNA序列進(jìn)行了擴(kuò)增●彼此獨(dú)立地進(jìn)行為此，將水溶液中已知量的SEQ ID No.1的RNA或SEQ ID No.2的RNA(5μl H2O中有1×109或1×1010個(gè)拷貝)與10μl反應(yīng)混合物(NucliSens Basic Kit)混合，在所述反應(yīng)混合物中已經(jīng)預(yù)先加入了UTP-生物素(0.6mM)以及使得能夠擴(kuò)增SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的引物，●同時(shí)進(jìn)行為此，將水溶液中已知量的SEQ ID No.1的RNA和SEQ ID No.2的RNA與10μl反應(yīng)混合物(NucliSens Basic Kit)混合，在所述反應(yīng)混合物中已經(jīng)預(yù)先加入了UTP-生物素以及使得能夠擴(kuò)增SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2的引物。
對(duì)于每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)，得到的體積均為15μl(足夠量的無核酸酶的H2O)。然后將混合物于65℃孵育5分鐘，接著于41℃孵育5分鐘，以使引物與待擴(kuò)增RNA雜交。
然后加入體積為5μl的酶混合物(NucliSens Basic Kit)。將體積為20μl的混合物于41℃孵育90分鐘，以使1.引物與待擴(kuò)增RNA雜交，2.通過逆轉(zhuǎn)錄酶活性來延伸引物，以產(chǎn)生待擴(kuò)增RNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，3.通過具有核糖核酸酶H活性的酶來切割與所述cDNA雜交的待擴(kuò)增RNA，從而獲得與所述cDNA雜交的待擴(kuò)增RNA片段，4.通過逆轉(zhuǎn)錄酶和鏈置換酶來延伸所述待擴(kuò)增RNA片段的末端，從而獲得RNA-DNA/DNA雜交體，5.通過具有RNA聚合酶活性的酶從在步驟d)中形成的RNA-DNA/DNA雜交體獲得RNA轉(zhuǎn)錄物。
通過ELOSA方法分析獲得的RNA轉(zhuǎn)錄物(Mallet F.等人，1993)。此方法允許通過核酸序列與移植到微量滴定板孔底的寡核苷酸探針(稱為檢測(cè)探針)的雜交來特異性地檢測(cè)核酸序列。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.1的探針為序列SEQ ID No.5CAACCTGTCAGGGATCAGTTTC。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.2的探針為序列SEQ ID No.6CTCGAGACCTCCAGAAGTTTCC。
用生物素標(biāo)記RNA轉(zhuǎn)錄物使得能夠由于鏈霉抗生物素蛋白-酶綴合物與相應(yīng)底物的作用而揭示出雜交，并通過光譜法讀出OD。OD與通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的量成比例。
圖2中顯示了得到的結(jié)果。字母A至D相應(yīng)于彼此獨(dú)立地?cái)U(kuò)增SEQID No.1和SEQ ID No.2的條件(A1×109個(gè)拷貝的SEQ ID No.1；B1×109個(gè)拷貝的SEQ ID No.2；C1×1010個(gè)拷貝的SEQ ID No.1；D1×1010個(gè)拷貝的SEQ ID No.2)，而字母E至H相應(yīng)于同時(shí)擴(kuò)增SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2(E1×109個(gè)拷貝的SEQ ID No.1和1×109個(gè)拷貝的SEQ ID No.2；F1×1010個(gè)拷貝的SEQ ID No.1和1×1010個(gè)拷貝的SEQ ID No.2；G1×109個(gè)拷貝的SEQ ID No.1和1×1010個(gè)拷貝的SEQ ID No.2；H1×1010個(gè)拷貝的SEQ ID No.1和1×109個(gè)拷貝的SEQID No.2)。通過SEQ ID No.5的檢測(cè)探針(灰色柱)的存在或通過SEQ ID No.6的檢測(cè)探針(黑色柱)的存在來檢測(cè)得到的轉(zhuǎn)錄物。
結(jié)果顯示，在獨(dú)立擴(kuò)增與同時(shí)進(jìn)行的擴(kuò)增之間檢測(cè)到的信號(hào)相當(dāng)。
因此，無論待擴(kuò)增RNA為SEQ ID No.1還是SEQ ID No.2，均產(chǎn)生數(shù)量相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄物(當(dāng)按照條件A和條件B進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，OD讀數(shù)相當(dāng))。此外，當(dāng)待擴(kuò)增RNA的量提高時(shí)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量更多(按照條件A進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的OD讀數(shù)比按照條件C進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)低；類似地，按照條件B進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的OD讀數(shù)比按照條件D進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)低)。
最后，同時(shí)擴(kuò)增SEQ ID No.1和SEQ ID No.2時(shí)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量與彼此獨(dú)立地?cái)U(kuò)增SEQ ID No.1和SEQ ID No.2時(shí)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量相當(dāng)。甚至在以相差1個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的轉(zhuǎn)錄物量進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，信號(hào)仍然與彼此獨(dú)立地?cái)U(kuò)增SEQ ID No.1和SEQ ID No.2時(shí)得到的信號(hào)相同。
通過在OLISA芯片上分析產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物得到相似的結(jié)果。OLISA芯片是排列在標(biāo)準(zhǔn)形式96孔平板上的低密度DNA芯片(每個(gè)芯片至多128個(gè)探針)。將冠狀分布的寡核苷酸檢測(cè)探針移植到孔底。使用鏈霉抗生物素蛋白-酶綴合物進(jìn)行探針/靶雜交體的比色法揭示，其中包括用生物素標(biāo)記靶。
額外的用RNase進(jìn)行消化的步驟確認(rèn)，檢測(cè)的產(chǎn)物確實(shí)是cRNA。
因此，這些結(jié)果證明，本發(fā)明的方法特別適合于擴(kuò)增用于在DNA芯片上對(duì)其進(jìn)行定量分析的轉(zhuǎn)錄物。這是因?yàn)?，此方法是轉(zhuǎn)錄方法，并且擴(kuò)增產(chǎn)物不會(huì)成為擴(kuò)增模板，這一事實(shí)使該擴(kuò)增具有線性性質(zhì)，所述線性性質(zhì)非常適合于在生物芯片上對(duì)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量。
實(shí)施例3評(píng)估本發(fā)明方法的擴(kuò)增的線性基于用作待擴(kuò)增RNA序列的SEQ ID No.2和用作擴(kuò)增引物的SEQID No.4來進(jìn)行本實(shí)施例。
根據(jù)實(shí)施例2中所述的條件進(jìn)行該產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法。在這種情況下，以0.5μM的濃度使用SEQ ID No.2的引物。按照與實(shí)施例2中所闡述的相似的原理，擴(kuò)增出一系列轉(zhuǎn)錄物(1×107、1×108、1×109和1×1010個(gè)拷貝)，并使用SEQ ID No.6的探針在OLISA芯片上分析反應(yīng)產(chǎn)物。
如圖3所示，采用由每個(gè)點(diǎn)的至少4次測(cè)量得到的平均值而進(jìn)行的線性回歸導(dǎo)致獲得相關(guān)系數(shù)R2＝0.9781的直線。因此，這證明了本發(fā)明方法的擴(kuò)增的線性。
實(shí)施例4多重?cái)U(kuò)增對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，如上文實(shí)施例1和2中所述實(shí)施擴(kuò)增方案。
按照供應(yīng)商推薦的方案，在雙啟動(dòng)子載體pCR-II-TOPO(Invitrogen)中，從來自HML-2內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第一待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQ ID No.7CACUGUAGAG CCUCCUAAAC CCAUACCAUU AACUUGGAAAACAGAAAAAC UGGUGUGGGU AAAUCAGUGG CCACUACCAAAACAAAAACU GGAGGCUUUA CAUUUAUUAG CAAAUGAACAGUUAGAAAAG GGUCAUAUUG AGCCUUCAUU CUCGCCUUGGAAUUCUCCUG UGUUUGUAAU UCAGAAGAAA UCAGGCAAAUGGCAUAUGUU AACUGACUUA AGGGUCGUAA ACGCCGUAAUUCAACCCAUG GGGCCUCUCC AACCCGGGUU GCCCUCUCCGGCCAUGAUCC CAAAAGAUUG GCCUUUAGUU AUAAUUGAUCUAAAGGAUUG CUUUUUUACC AUCCCUCUGG CGGAGCAGGAUUGCGAAAAA UUUGCCUUUA CUAUACCAGC CAUAAAUAAUAAAGAACCAG CCACCAGGUU UCAGUGGAAA UUGUUACCUCAGGGAAUGCU UAAUAGUCCA ACUAUUUGUC AGACUUUUGUAGGUCGAGCU CUUCAACCAG UUAGAGACAA GUUUUCAGAC
UGUUAUAUUA UUCAUUAUAU UGAUGAUAUU UUAUGUGCUACAGAAACGAG AGAUAAAUUA AUUGACUGUU AUACAUUUCUGCAAGCAGAG GUUGCCAAUG CAGGACUGGC AAUAGCAUCUGAUAAGAUCC AAACCUCUAC UCCUUUUCAU UAUUUAGGGAUGCAGAUAGA AAAUAGAAAA AUUAAGCCAC AAAAAAUAGAAAUAAGAAAA GACACAUUAA AAACACUAAA UGAUUUUCAAAAAUUGCUGG GAGAUAUUAA UUGGAUUCGG CCAACUCUAGGCAUUCCUAC UUAUGCCAUG UCAAAUUU。
使用Ampliscribe T7 Flash試劑盒(Epicentre)并按照供應(yīng)商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
以相似的方式，按照供應(yīng)商推薦的方案，在雙啟動(dòng)子載體pCR-II-TOPO(Invitrogen)中，從來自HML-5內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第二待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQID No.8UAUCCAAUUU GGGUAGACCA GUGGCCUUUA AAGGGAGAGAAAUUGCAAAG AGCCCAUGAG UUUGUUGAAG AGCAAUUAAAAGCCAGCCAU AUAGAACCAU CAAAAAGACC UUGGAAUUCACCCAUUUUCA UCAUUCCCAA AAAGUCUGGU AAAUAGAGACUUUUGCAUGA CUAACAUGCU AUCAAUGCUA AUUUGAAACCUAUGGGACCC CUUGAGCAGG UGUUCUCCUC CCCUUCAGUGAUUCCUUGAG AUUGGCAUAU AAUAGUUAUU GGCUUAAAAUACUGCAUUUG UACUAUUCCC UUUGCAGAAC AGGACAGAGAAAAAUUUGUG UUUAUAAUAC CAGCUAUAAA UAACGAAAGGCCAGCUCCCC GAUUUCACUG GAAAGUGCUU CCUGAAGGGAUGCUAAACAG UCCUACCAUG UGUCAGUAUC AUGUAAAUCAAGCUUUGCUC CUCAGUAGAA AAGAAUUUCC UAAUUGCAAGACUAUUCAUU UUAUGGAUGA UAUUUUACUA GCAGCCCCAAUGGAUCCAGC ACUUUUAAGU UUAUGUGCCU CUGUUGUAAAGAAUACACAG UUAAGAGGUU UAAUCAUAGC ACCUGAAAAA
GUACAGAUGU CCUCUCCUUG GAAAUAUCUU GGGUACAUACUAACUUCGUG GUCAGUAAGA CCUCAAAAGG UUAAAUUAAAUACUAGCAAC UUACACACCU UAAAUGAUUA UCAGAAAUUACUAGGCAAUA UUAACUGGCU UUGCCCCACC UUGGGCAUAACUACUGAUAA GUUACAGAAC CUGUUUUCUA UCUUAAAAGACAAUGCUGCU CUAGACUCUC CCAGGUAUUU AACUCCUGCAGCACAAAGGG AAAUUGAGGA AGUAGAGCAC。
使用Ampliscribe T7 Flash試劑盒(Epicentre)并按照供應(yīng)商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
以相似的方式，按照供應(yīng)商推薦的方案，在雙啟動(dòng)子載體pCR-II-TOPO(Invitrogen)中，從來自HERV-H內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第三待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQID No.9CACCCUUACC CUGCUCAAUG CCAAUAUCCC AUCCCACAGCAUGCUUUAAA AGGAUUAAAG CCUGUUAUCA CUCGCCUGCUACAGCAUGGG CUUCUAGAAC CUAUAAACUC UCUUUUCAAUUCCCCCAUUU UACCUGUCCA AAAACCGGAU AAGUCUUACAGACUAGUUCA GAAUCUGCGU CUUAUCAACC AAAUUGUUUUGCCUAUCCAC CCUGUGGUGC CCAACCUGUA CACUCUUUUGUCCUCAAUAC CUUCCUCCAC AACUCACUAU UCCGUGCUUGAUCUUAAAGA UGGUUUUUUC ACUAUUCUCC UGCACUCCUCGUCCCAGCCU CUCUUUGCUU UCACCUGGAC UGACCCUGACACCCAUCAGU CCCAGCAGCU UACCUGGACU GUGCUGCCGCAAGGUUUCAG GGACAGCCCU CGUUACUUCA GCCAAGCUCUUUCUCAUGAU CUACUUUCCU UCCACCCCUC CGCUUCUCACCUUAUUCAAU AUAUUGAUGA GCUUCUUCUU UGUAGCCCCUCCUUUGAAUC UUCUCAAUAA GACACACUUC UGCUCCUUCAGCAUUUAUUC UCCAAAGGAU AUCGGGUAUC CCCCUCCAAAGCUCAAAUUU CUUCUCCAUC CGUUACCUAC CUCGGCAUAA
UUCUUCAUAA GAACACACGU GCUCUCCCUG CCGACCGUGUCUGACUAAUC UCUCAAGCCC CAACCCCUUC UACAAAACAACAACUCCUUU CCUUCCUGGG CGUGGUUGGA UACUUUCGCCUUUGGAUACC UGGUUUUGCC AUCCUAACAA AACCAUUAUAUAAACUCACA AAAGGAAACU UAGCUGACCC CAUAGAUCCUAAAUCCUUUC CCCACUCCUC UUUCUG。
使用Ampliscribe T7 Flash試劑盒(Epicentre)并按照供應(yīng)商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
以相似的方式，按照供應(yīng)商推薦的方案，在雙啟動(dòng)子載體pCR-II-TOPO(Invitrogen)中，從來自ERV-9內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第四待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQID No.10CUGAAGCUCU UAAAGGAUUA CAGGAUAUUG UUAAACAUUUAAAAGCUCAA GGCUUAGUAA GGAAAUGCAG CAGUCCCUGCAACACCCCAA UUCUAGGAGU ACAAAAACCA AAUGGUCACUGGAGACUAGU GCAAGAUCUU AGACUCAUCA AUGAGGCAGUAAUUCCUCUA UAUCCAGUUG UACCCAACCC CUAUACCCUGCUUUCUCAAA UACCAGAGGA AGCAGAAUGG UUCAUGGUUCUGGACCUCAA GGAUGCCUUC UUCUGUUUCC CCUGCACUCUGACUCCCAGU UUCUGUUUGC CUUUGAGGAU CCCACAGACCACACGUCCCA ACUUACAUGG AUGGUCUUGC CACAAGGGUUUAGGGAUAGC CCUCACCUGU UUGGUCAGGC ACUGGCCCAAGAUCUAGGCC ACUUCUCAAG UCCAGGCACU UUGGUCCUUCAGUAUGUGGA UGAUUUACUU UUGGCUACCA GUUCAGAAGCCUCAUGCCAG CAGGCUACUC UAGAUCUCUU GAACUUUCUACCUAAUCAAG GGUACAAGGC AUCUAGGUCA AAGGUGCAGCUUUGCUUACA GCAGGCUAAA UAUCUAGGCC UAAUCUUAGCCAGAGGGACC AGGGCCCUCA GCAAGGAAUG AAUACAGCCUAUACUGGCUU AUCCUUGCCC UAAGACAUUA AAACAGUUGC
AGGGGUUCCU UGGAAUCACC GGCUUUUGCC GACUAUGGAUCCCUGGAUAC AGUGAGAUAG UCAGGCCCCU CCAUACUCUAAUCAAGGAGA CCC。
使用Ampliscribe T7 Flash試劑盒(Epicentre)并按照供應(yīng)商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
以相似的方式，按照供應(yīng)商推薦的方案，在雙啟動(dòng)子載體pCR-II-TOPO(Invitrogen)中，從來自HERV-W內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第五待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQID No.11GACCCAAGGC CCAACAAGGA CUCCAAAAGA UUGUUAAGGACCUAAAAGCC CAAGGCCUAG UAAAACCAUG CAGUAACCCCUGCAGUACUC CAAUUUUAGG AGUACAGAAA CCCAACAGACAGUGGAGGUU AGUGCAAGAU CUCAGGAUUA UCAAUGAGGCUGUUGUUCCU CUAUAGCCAG CUGUACCUAG CCCUUAUACUCUGCUUUCCC AAAUACCAGA GGAAGCAGAG UGGUUUACAGUCCUGGACCU UCAGGAUGCC UUCUUCUGCA UCCCUGUACAUCCUGACUCU CAAUUCUUGU UUGCCUUUGA AGAUACUUCAAACCCAACAU CUCAACUCAC CUGGACUUUU UACCCCAAGGUUCAGGGAUA GUCCCCAUCU AUUUGCCAGG CAUUAGCCCAAGACUUGAGC CAAUCCUCAU ACCUGGACAC UUGUCUUCGGUAGGUGGAUG AUUUACUUUU GGCCGCCCAU UCAGAAACCUUGUGCCAUCA AGCCACCCAA GCGCUCUUCA AUUUCCUCGCUACCUGUGGC UACAUGGUUU CCAAACCAAA GGCUCAACUCUGCUCACAGC AGGUUACUUA GGGCUAAAAU UAUCCAAAGGCACCAGGGCC CUCAGUGAGG AACACAUCCA GCCUAUACUGGCUUAUCCUC AUCCCAAAAC CCUAAAGCAA CUAAGGGGAUUCCUUGGCGU AAUAGGUUUC UGCCGAAAAU GGAUUCCCAGGUAUGGCGAA AUAGCCAGGU CAUUAAAUAC ACUAAUUAAGGAAACUCAGA AAGCCAAUAC CCAUUUAGUA AGAUGGACAA
CUGAAGUAGA AGUGG。
使用Ampliscribe T7 Flash試劑盒(Epicentre)并按照供應(yīng)商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
以相似的方式，按照供應(yīng)商推薦的方案，在雙啟動(dòng)子載體pCR-II-TOPO(Invitrogen)中，從來自HERV-R內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第六待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQID No.12AUCAUAAUCC AAUGCCAGUC ACCCUGGAAC ACUCCACUUUUGCUGGUACA AAAACCAUUG CCUGGACCAG GAUCUGAUGAGUAUAUACUG GUGCAGGGCU UGCAUGCUGU AAACCAAGCCACGGUGACCA UACAUCCAGU AGUACCAAAC CUGUAUACUUUAAUGGGACU UAUUCUAGCA AGUGCCACCU GGUUUACAGUCCUGGACUUA AAGGAUGCUU UCCUCUGUCU CUACCUGGCACCAGUUAGUC AGCCCAUCUU UGCAUUUUAA UGGGACAAUUCAGUCACAGG CACAGGGGGA CAGCUCGCCU GGACUAGUCUCCCACAAGGG UUCAAGAAUU CUCCCACAAU CUUUGGGGAAGCACUGGCCU CAGACCUCAA GGCAUACACC CCACCAAAUGACAACUGCGC CUUGUUGCAG UACAUAGACA ACCCUUCUUUUGGCAGCCCC AACCCCAAGA GGACUGUAAC UGGGGGAACCCAGGACCUCC UCCAUCUCUU AUGGGAAAGC AGGGUAUAGAGUAUCCAAAA AGAAGGCCCA AAUUUGCCAU GAAAAGGUUAAAUAUUUAGG CUUCAUAGUA AGCCAAGGGG AACGCUGGCUUGGCCAUGGA UGAAAGCAAG CCAUUUGUGC ACUUCCAACUCCAACCACCU GGCGCCAAAU AGGGGAAUUC UUAGGGGCAGCAGGGUUCUG CCAUAUCUGG AUCCCAAAUU UCUCACUUAUAGCCAGGCCC UUAUAUGAAG CCACAAGGGA GGGUGAAAAGGAACCCCUCC UCUGAAAGGC UGACCAGAAG AAGGUGUUUAAACAAAUCAA AGAAGCUCUA ACUCAGGCUC CAGCCUUAGGACUGCCAGAU ACUACU。
使用Ampliscribe T7 Flash試劑盒(Epicentre)并按照供應(yīng)商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
以相似的方式，按照供應(yīng)商推薦的方案，在雙啟動(dòng)子載體pCR-II-TOPO(Invitrogen)中，從來自HERV-L內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因區(qū)域的克隆序列開始產(chǎn)生第七待擴(kuò)增RNA序列，其相應(yīng)于SEQID No.13UUAAUGGAGU UAUGGCUCAG GUCUGACUUA CAGCAGGUCCAGUGGGUCCC UGGACUCAUC CUGUGUUCAU UUUCCCAGUGCCAGAAUGCA UAAUUGGCAU UGUCAUACUU AGAGGCUGGCAGAACCCCCA CAUUGAUUCU GUGACUGGUA AGGUGAGGGCUAUUAUGGUG GGAAAGGCCA AAUGGAAGCC AUUGGAGCUGCCUUUACCUA GGAAAAUAGU AAAUCAAAAA CAUUAUCACCACCCUGGAGG GAUUGCAGAG AUUAGUGCCA CCAUCAAGGACUUGAAAAAU GCAGGGGUGG CGAUUCCCAU AACAUCCUUGUUCAACUCUC CUUUUUGGCC UGUGCAGAAG ACAGAUGGAUCUUGGAGAAU GAGAGUGGAU UAUCAUAAGC UUAACCAAGUGGUGACUCCA AUUGCAGCUG CUAUACAAGA UGUGGUUUUCAUUGCUCAAG CAAAUUAAUA CAUCUCCUGG UACCUUGUAUGCAGCCAUUG ACUUGGCAAA UGGCCUUUUA CCCAUUCCAUAAGCCCCACC AGAAGCGAUU UGCCUUCAGC UGGCAAGGCCAGCAAUGUAU CUUUACUGUC CUACUUCAGG GGUAUAUCAACUCUCCGGCU UUGUGUCAUA AUCUUAUUCA GAGUGAUCUUGAUCACUUUU CACUGCCACA AGAUAUCACA CUGGUCCAUUACAUUGAUGG CAUUAUGUUG AUUGGAUCCA AUGAGCAAGAAGUAGCAAAC ACACUGGACU UAUUGGUGAG ACAUUUGCAUGCCAUAGGAU GGGAAAUAAA UCCAAAUAAA AUUCACGCACCCUCUACCUC AGUAAAAUU。
使用Ampliscribe T7 Flash試劑盒(Epicentre)并按照供應(yīng)商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
如實(shí)施例2中所述，在以下引物存在下進(jìn)行擴(kuò)增●SEQ ID No.14的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGACA CATAAAATAT CATCAACATA(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQ IDNo.7的RNA序列，●SEQ ID No.15的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGATG CAGAGGAGAT CATCCATGTA(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQ IDNo.1的RNA序列，●SEQ ID No.16的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGACT AGTAAAATAT CATCCATAAA(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQ IDNo.8的RNA序列，●SEQ ID No.17的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGAAA AGTAGAAGGT CATCAATATA(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQ IDNo.9的RNA序列，●SEQ ID No.18的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGAAG TAAATCATCC ACATACTGAA G(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQID No.10的RNA序列，●SEQ ID No.19的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGAAA GTAAATCATC CACGTACCGA(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQ IDNo.11的RNA序列，●SEQ ID No.20的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGACC AGCAAAAGGT CATCAACGTA(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQ IDNo.2的RNA序列，●SEQ ID No.21的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGACC AAAAGAAGGT TGTCTATGTA(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQ IDNo.12的RNA序列，●SEQ ID No.22的引物序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGATC ARCATAATGY CATCAATGTA(0.75μM)，用于擴(kuò)增SEQ IDNo.13的RNA序列。
如實(shí)施例2中所述，在OLISA芯片上分析得到的RNA轉(zhuǎn)錄物。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.1的探針為序列SEQ ID No.5CAACCTGTCAGGGATCAGTTTC。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.2的探針為序列SEQ ID No.6CTCGAGACCTCCAGAAGTTTCC。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.7的探針為序列SEQ ID No.23CAACCAGTTA GAGACAAGTT TTCA。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.8的探針為序列SEQ ID No.24TTGCTCCCCA GTAGAAAAGA ATT。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.9的探針為序列SEQ ID No.25GACAGCCCCC ATTACTTCAG TCAAG。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.10的探針為序列SEQ ID No.26CCAAGATCTA GGCCACTTCT CA。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.11的探針為序列SEQ ID No.27CATCTATTTG GCCAGGCATT A。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.12的探針為序列SEQ ID No.28AGACCTCAAG GCATACACCC。
使得能夠證實(shí)SEQ ID No.13的探針為序列SEQ ID No.29GCTTTGTGTC ATAATCTTAT TCG。
從四個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增中計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并顯示于圖4中。
本發(fā)明的技術(shù)使得能夠混合地?cái)U(kuò)增轉(zhuǎn)錄物(在此，多達(dá)9種不同的)。此外，應(yīng)該注意到，在測(cè)試范圍內(nèi)(每種轉(zhuǎn)錄物有106至108個(gè)拷貝)，在測(cè)量信號(hào)和引入反應(yīng)體積中的轉(zhuǎn)錄物的量之間存在線性關(guān)系。這表明，此技術(shù)使得能夠同時(shí)并且特異性地?cái)U(kuò)增多種轉(zhuǎn)錄物。因此，對(duì)通過此方法得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA芯片分析(或通過其他方法的分析)允許對(duì)初始樣品的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量。
序列表<110>bioMérieux SA<120>產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法<130>unknown<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>737<212>RNA<213>HML.4<400>1gucacuguca agccuccaga ugccaucccu uugacuugaa aacucagcca guuugggugg 60aucaguggcc gcucccaaaa aauaagcugg aggcgcucca uaauuuaguc cuggaacagu120uagaauuggg acacauugag gaaucuuucu cuccauggaa uucacuuguc uuuguuaucc180aaaagaaauc uggggaaaac agagaaugcu cacucaucuu agggcaguua augcuguacu240ucaaccucug gggacauuac aaucuggcuu acccucccgc ucuaugcucg cugaguauug300gccucuaauc cucauagauc uuaaagauug cuuuuuuaac auuccacugg ccucucagga360cuuugaaaag uuugcuuuua uggucccuuc ccucaacaau gucgcucagg cuacaugcua420cuauuggaaa guccuaccac aaggcaugcu uaauaguccc acuauuuguc aguauuuugu480ggggcgugug cuucaaccug ucagggauca guuuccccga uguuacaucg uucacuacau540ggaugaucuc cucugcacag cccccccaua caccauuuug auuuccugcu uuucugugau600ucaacaggcc auuucagaag cagguuugac uauugcacca gaaaaaauuc aaacuaccuc660
ucauuuucaa uauuugggca ugcaguugga agacaagcug auuacaccac aaaaaguuca720gcuuaggaga gacgccu 737<210>2<211>857<212>RNA<213>HERV.E4.1<400>2ggccaagaga uaagaccagc ucuggcuaag cgguggccaa gagugugggc ggaagacaac 60ccuccagggu uggcagucaa ccaagccccc gugcuuauag aaguuaagcc ugggguccag120ccgguuaggc aaaaacagua cccgguccuc agagaagcuc uugaagguau ccagguccau180cucaagugcc uaagaaccuu uagaauuaua guuccuuguc agucuccaug gaacacuccc240cuccugccug uucccaagcc ugggaccaag gacuacaggc cgguacagga uuugcgcuug300guuaaucagg cuacagugac uuuacaucca acaguaccua accuguacac auugcugggg360uugcugccag cugaggacag cugguucacc ugcuuggacc ugaaagaugc cuucuuuagc420aucagauuag ccccugagag acagaagcug uuugccuuuc agugggaaga uccagaguca480ggugucacua cucaauacac uuggacccag ccuccccaaa gguucaagaa cucccccacc540aucuuugggg aggcguuggc ucgagaccuc cagaaguuuc ccaccagaga ccuaggcugc600guguugcucc aguacguuga ugaccuuuug cugggacacc ccacggcagu cgggugcgcc660aagggaacag augcucuacu ccggcaccug gaggacugug gguauaaggu guccaagaaa720aaaagcucag aucugccgac agcagguaug uuacuuggga uuuacuaucc aacaggggga780gcacagccug ggaucagaaa gaaagcaggu cauuuguaau cuaccggagc cuaagaccag840
aaggcaggug agagaau 857<210>3<211>62<212>DNA<213>人工<400>3taatacgact cactataggg agatctagca gcataggggg ggctgtgcag aggagatcat 60cc 62<210>4<211>62<212>DNA<213>HERV-E4<400>4taatacgact cactataggg agatctagca gcatacagca aaaggtcatc aacgtactgg 60ag 62<210>5<211>22<212>DNA<213>HML.4<400>5
caacctgtca gggatcagtt tc 22<210>6<211>22<212>DNA<213>HERV.E4.1<400>6ctcgagacct ccagaagttt cc 22<210>7<211>828<212>RNA<213>HML-2<400>7cacuguagag ccuccuaaac ccauaccauu aacuuggaaa acagaaaaac uggugugggu 60aaaucagugg ccacuaccaa aacaaaaacu ggaggcuuua cauuuauuag caaaugaaca120guuagaaaag ggucauauug agccuucauu cucgccuugg aauucuccug uguuuguaau180ucagaagaaa ucaggcaaau ggcauauguu aacugacuua agggucguaa acgccguaau240ucaacccaug gggccucucc aacccggguu gcccucuccg gccaugaucc caaaagauug300gccuuuaguu auaauugauc uaaaggauug cuuuuuuacc aucccucugg cggagcagga360uugcgaaaaa uuugccuuua cuauaccagc cauaaauaau aaagaaccag ccaccagguu420ucaguggaaa uuguuaccuc agggaaugcu uaauagucca acuauuuguc agacuuuugu480aggucgagcu cuucaaccag uuagagacaa guuuucagac uguuauauua uucauuauau540
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auccuaacaa aaccauuaua uaaacucaca aaaggaaacu uagcugaccc cauagauccu840aaauccuuuc cccacuccuc uuucug 866<210>10<211>773<212>RNA<213>ERV-9<400>10cugaagcucu uaaaggauua caggauauug uuaaacauuu aaaagcucaa ggcuuaguaa 60ggaaaugcag cagucccugc aacaccccaa uucuaggagu acaaaaacca aauggucacu120ggagacuagu gcaagaucuu agacucauca augaggcagu aauuccucua uauccaguug180uacccaaccc cuauacccug cuuucucaaa uaccagagga agcagaaugg uucaugguuc240uggaccucaa ggaugccuuc uucuguuucc ccugcacucu gacucccagu uucuguuugc300cuuugaggau cccacagacc acacguccca acuuacaugg auggucuugc cacaaggguu360uagggauagc ccucaccugu uuggucaggc acuggcccaa gaucuaggcc acuucucaag420uccaggcacu uugguccuuc aguaugugga ugauuuacuu uuggcuacca guucagaagc480cucaugccag caggcuacuc uagaucucuu gaacuuucua ccuaaucaag gguacaaggc540aucuagguca aaggugcagc uuugcuuaca gcaggcuaaa uaucuaggcc uaaucuuagc600cagagggacc agggcccuca gcaaggaaug aauacagccu auacuggcuu auccuugccc660uaagacauua aaacaguugc agggguuccu uggaaucacc ggcuuuugcc gacuauggau720cccuggauac agugagauag ucaggccccu ccauacucua aucaaggaga ccc 773<210>11
<211>815<212>RNA<213>HERV-W<400>11gacccaaggc ccaacaagga cuccaaaaga uuguuaagga ccuaaaagcc caaggccuag 60uaaaaccaug caguaacccc ugcaguacuc caauuuuagg aguacagaaa cccaacagac120aguggagguu agugcaagau cucaggauua ucaaugaggc uguuguuccu cuauagccag180cuguaccuag cccuuauacu cugcuuuccc aaauaccaga ggaagcagag ugguuuacag240uccuggaccu ucaggaugcc uucuucugca ucccuguaca uccugacucu caauucuugu300uugccuuuga agauacuuca aacccaacau cucaacucac cuggacuuuu uaccccaagg360uucagggaua guccccaucu auuugccagg cauuagccca agacuugagc caauccucau420accuggacac uugucuucgg uagguggaug auuuacuuuu ggccgcccau ucagaaaccu480ugugccauca agccacccaa gcgcucuuca auuuccucgc uaccuguggc uacaugguuu540ccaaaccaaa ggcucaacuc ugcucacagc agguuacuua gggcuaaaau uauccaaagg600caccagggcc cucagugagg aacacaucca gccuauacug gcuuauccuc aucccaaaac660ccuaaagcaa cuaaggggau uccuuggcgu aauagguuuc ugccgaaaau ggauucccag720guauggcgaa auagccaggu cauuaaauac acuaauuaag gaaacucaga aagccaauac780ccauuuagua agauggacaa cugaaguaga agugg 815<210>12<211>856<212>RNA<213>HERV-R
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gctttgtgtc ataatcttat tcg 2權(quán)利要求
1.由以下物質(zhì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法·包含“引物”區(qū)和目的區(qū)的至少一種待擴(kuò)增RNA序列，和·包含啟動(dòng)子區(qū)和能與待擴(kuò)增RNA序列的所述“引物”區(qū)雜交的區(qū)域的擴(kuò)增引物，所述方法在恒溫下進(jìn)行，并包括下列步驟a)將所述引物與待擴(kuò)增RNA雜交，b)通過逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性來延伸引物，以產(chǎn)生待擴(kuò)增RNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，c)通過具有核糖核酸酶H活性的酶來切割與所述cDNA雜交的待擴(kuò)增RNA，以獲得與所述cDNA雜交的待擴(kuò)增RNA片段，d)通過逆轉(zhuǎn)錄酶和鏈置換酶來延伸所述待擴(kuò)增RNA片段的末端，以獲得RNA-DNA/DNA雜交體，e)通過具有RNA聚合酶活性的酶從在步驟d)中形成的RNA-DNA/DNA雜交體獲得RNA轉(zhuǎn)錄物。
2.權(quán)利要求1的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法，所述方法還包括以下步驟f)使用所述目的區(qū)的特異性雜交探針來檢測(cè)產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物。
3.權(quán)利要求1或2的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法，根據(jù)所述方法，施行步驟a)至e)的時(shí)間足以獲得足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)錄物。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法，其中具有RNA聚合酶活性的酶為噬菌體的RNA聚合酶，優(yōu)選T7噬菌體的RNA聚合酶。
5.由以下物質(zhì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法·至少第一待擴(kuò)增RNA序列和第一擴(kuò)增引物，所述第一待擴(kuò)增RNA序列包含“引物”區(qū)和目的區(qū)，所述第一擴(kuò)增引物包含啟動(dòng)子區(qū)和能與第一待擴(kuò)增RNA序列的所述“引物”區(qū)雜交的區(qū)域，·至少第二待擴(kuò)增RNA序列和第二擴(kuò)增引物，所述第二待擴(kuò)增RNA序列與所述第一待擴(kuò)增RNA序列不同，并包含“引物”區(qū)和目的區(qū)，所述第二擴(kuò)增引物包含啟動(dòng)子區(qū)和能與第二待擴(kuò)增RNA序列的所述“引物”區(qū)雜交的區(qū)域，所述方法在恒溫下進(jìn)行，并包括下列步驟a)所述第一和第二引物與所述第一和第二待擴(kuò)增RNA雜交，b)通過逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性來延伸所述第一和第二引物，以產(chǎn)生第一待擴(kuò)增RNA的第一互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列和第二待擴(kuò)增RNA的第二互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，c)通過具有核糖核酸酶H活性的酶來切割分別與第一和第二cDNA雜交的第一和第二待擴(kuò)增RNA，以獲得與第一cDNA雜交的第一待擴(kuò)增RNA片段和與第二cDNA雜交的第二待擴(kuò)增RNA片段，d)通過逆轉(zhuǎn)錄酶和鏈置換酶來延伸所述第一和第二待擴(kuò)增RNA片段的末端，以獲得RNA-DNA/DNA雜交體，e)通過具有RNA聚合酶活性的酶從在步驟d)中形成的RNA-DNA/DNA雜交體獲得所述第一和第二待擴(kuò)增RNA的轉(zhuǎn)錄物。
6.權(quán)利要求5的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法，所述方法還包括以下步驟f)使用第一雜交探針來檢測(cè)第一待擴(kuò)增RNA的轉(zhuǎn)錄物，和使用第二雜交探針來檢測(cè)第二待擴(kuò)增RNA的轉(zhuǎn)錄物。
7.權(quán)利要求5或6的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法，根據(jù)所述方法，施行步驟a)至e)的時(shí)間足以獲得足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)錄物。
8.權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法，其中具有RNA聚合酶活性的酶為噬菌體的RNA聚合酶，優(yōu)選T7噬菌體的RNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及由以下物質(zhì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物的方法·包含“引物”區(qū)和目的區(qū)的至少一種待擴(kuò)增RNA序列，和·包含啟動(dòng)子區(qū)和能與待擴(kuò)增RNA序列的所述“引物”區(qū)雜交的區(qū)域的擴(kuò)增引物，所述方法在恒溫下進(jìn)行，并包括下列步驟a)將所述引物與待擴(kuò)增RNA雜交，b)通過逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性來延伸引物，以產(chǎn)生待擴(kuò)增RNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，c)通過具有核糖核酸酶H活性的酶來切割與所述cDNA雜交的待擴(kuò)增RNA，以獲得與所述cDNA雜交的待擴(kuò)增RNA片段，d)通過逆轉(zhuǎn)錄酶和鏈置換酶來延伸所述待擴(kuò)增RNA片段的末端，以獲得RNA－DNA/DNA雜交體，e)通過具有RNA聚合酶活性的酶從在步驟d)中形成的RNA－DNA/DNA雜交體獲得RNA轉(zhuǎn)錄物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101044250SQ200580036116
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月1日
發(fā)明者F·馬萊, G·奧利奧爾, J－P·皮雄 申請(qǐng)人:拜奧默里克斯公司