專利名稱：病毒tnf受體和相關(guān)蛋白質(zhì)的趨化因子結(jié)合活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由痘病毒編碼并稱為細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B和D(CrmB和CrmD)的腫瘤壞死因子受體(TNFR)的C-末端結(jié)構(gòu)域(CTD)及其同源物、衍生物或片段的應(yīng)用，以調(diào)節(jié)趨化因子活性和提高TNFR的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合多肽、藥物組合物和檢測試劑盒(test kit)。
背景技術(shù)：
痘病毒是編碼多達(dá)200個(gè)基因的復(fù)合DNA病毒。天花病毒(VaV)是天花的病因，天花是最具破壞性的人類疾病之一，其由于牛痘病病毒(VV)在WHO全球根除運(yùn)動(dòng)中用作天花疫苗而被根除。牛痘病毒(CPV)與VV相關(guān)，并被認(rèn)為是在許多哺乳動(dòng)物中引起偶發(fā)性感染的侵蝕性病毒。鼠痘病毒(Ectromelia virus，EV)是天然小鼠病原體，并且是鼠痘的病因，鼠痘是一種普遍的與人類天花類似的小鼠疾病。
免疫應(yīng)答逐漸成為一種防止通過病原體(如，病毒)感染的有效機(jī)制。為了在免疫活性宿主中復(fù)制，已經(jīng)形成了逃避免疫應(yīng)答的病毒機(jī)制(Alcami & Koszinowski，2000)。痘病毒編碼廣泛的抵抗宿主免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)(Alcami，2003，Seet et al.，2003)。由痘病毒編碼的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制之一是產(chǎn)生結(jié)合細(xì)胞因子(調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)家族)的分泌蛋白質(zhì)。
已經(jīng)描述了四種由痘病毒編碼的分泌性TNFR并且稱為細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B(CrmB)、CrmC、CrmD以及CrmE(Hu et al.，1994，Loparev et al.，1998，Saraiva & Alcami，2001，Smith et al.，1996)。這些蛋白質(zhì)具有與人類TNFR中存在的富半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)類似并且構(gòu)成TNF結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。所述病毒蛋白質(zhì)缺少細(xì)胞TNFR的跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖1和圖2)。
已經(jīng)證實(shí)所有四種vTNFR都分泌自病毒感染的細(xì)胞，結(jié)合TNF以及阻斷TNF的生物學(xué)活性。預(yù)測vTNFR的CRD結(jié)合TNF，并且這已經(jīng)對由黏液瘤病毒(M-T2)編碼的CrmB同源物得以證明(Schreiber et al.，1997)，并且我們自己的實(shí)驗(yàn)表明，CrmD的三個(gè)N-末端CRD編碼TNF結(jié)合和抑制活性(參見下文)。
稱為CrmB和CrmD的兩個(gè)vTNFR的代表性成員是CPVCrmB(SEQ ID No11和12)、VaV CrmB(SEQ ID No9和10)、CPV CrmD(SEQ ID No1和2)以及EV CrmD(SEQ ID No3和4)。CrmB和CrmD具有另外的CTD，其沒有與數(shù)據(jù)庫中的細(xì)胞蛋白類似的氨基酸序列(圖1和圖2)。這個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥NF結(jié)合不是必需的并且其功能還沒有明確。由痘病毒編碼的三個(gè)開放閱讀框(ORF)具有與vTNFR的CTD類似的氨基酸序列。這些ORF的代表性成員為EV E12(CTD1)(SEQ ID No5和6)、EV E184(CTD2)(SEQ ID No19和20)、以及CPV B21R/V218(CTD3)(登記號為O72758以及SEQ ID No13和14)(圖1和圖2)。
許多結(jié)合趨化因子的分泌性蛋白質(zhì)已經(jīng)描述在若干痘病毒和皰疹病毒中(Alcami et al.，1998，Bryant et al.，2003，Grahamet al.，1997，Lalani et al.，1997，Parry et al.，2000，van Berkel et al.，2000)(表1)。這些病毒編碼的趨化因子結(jié)合蛋白(vCKBP)不具有與細(xì)胞七個(gè)-跨膜-結(jié)構(gòu)域趨化因子受體或其它細(xì)胞蛋白類似的氨基酸序列(Alcami，2003，Seet et al.，2003，Seet & McFadden，2002)。對由CPV編碼的35kDa vCKBP和由鼠γ-皰疹病毒68(MHV-68)編碼的M3的結(jié)構(gòu)和功能研究已證實(shí)，這些病毒蛋白質(zhì)表現(xiàn)為具有結(jié)合趨化因子的能力的新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)(Alexander et al.，2002，Carfi et al.，1999)。已經(jīng)證明了一些vCKBP有阻斷白細(xì)胞遷移入感染組織的能力和病毒致病性(Bridgeman et al.，2001，Graham et al.，1997，Johnston &McFadden，2004，Lalani et al.，1999，Reading et al.，2003)。
到目前為止，病毒TNF受體(vTNFR)細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B(CrmB)和CrmD的C-末端結(jié)構(gòu)域(CTD)沒有對時(shí)間的規(guī)定功能并且沒有類似于宿主蛋白質(zhì)的序列。我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)檫@些vTNFR賦予了結(jié)合多種趨化因子的能力，并且獨(dú)立于vTNFR的TNF結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達(dá)的CTD結(jié)合細(xì)胞因子。還在預(yù)測要被分泌的三種另外的痘病毒編碼的蛋白中發(fā)現(xiàn)了這種蛋白結(jié)構(gòu)域，并且我們證實(shí)，由鼠痘病毒(EV)的E12基因和牛痘病毒(CPV)的B21R基因編碼的它們中的兩個(gè)結(jié)合趨化因子。我們提出vTNFR的CTD定義了一種結(jié)合趨化因子的新型結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域。這些蛋白質(zhì)可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)趨化因子活性，并且在許多人類疾病中被用來調(diào)節(jié)不利的免疫和炎性反應(yīng)。這種融合于可溶性TNFR的CTD的表達(dá)可以提高已經(jīng)用于臨床的TNFR的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。此外，該CTD提高vTNFR的N-末端富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的TNF結(jié)合活性，并且vTNFR結(jié)合該TNF配體超家族的其他成員。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面，包括一種來自痘病毒的病毒TNF受體CrmB和/或CrmD的C-末端結(jié)構(gòu)域(CTD)及其來自痘病毒的同源物CTD1、CTD2和CTD3，包括功能性同源物、衍生物和片段，以用于結(jié)合趨化因子和它們的類似物和/或提高TNFR的免疫調(diào)節(jié)性。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面包括來自痘病毒的CrmB和/或CrmD的CTD及其來自痘病毒的功能性同源物CTD1、CTD2和CTD3，包括同源物、衍生物和片段，以用于阻斷趨化因子與相應(yīng)的細(xì)胞表面受體的結(jié)合和/或調(diào)節(jié)趨化因子結(jié)合活性。
可以通過以下方式獲得來自痘病毒的CrmB和/或CrmD的CTD的同源物，例如，通過編碼來自CrmB和/或CrmD的CTD的核苷酸序列的突變和來自該突變的序列的表達(dá)，和/或通過利用相關(guān)基因序列或從相關(guān)基因序列衍生?？商鎿Q地，它們可以這樣獲得，例如通過篩選包含蛋白質(zhì)序列或編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫來鑒定與來自CrmB和/或CrmD的CTD同源的基因序列，例如通過篩選Swissprot數(shù)據(jù)庫，其中可以利用Blast程序例如利用任何可能的算法來確定同源性?？山邮艿恼麄€(gè)序列的同源性水平為至少約20％，例如約30％。來自CrmB和/或CrmD的CTD的功能性片段與其它蛋白質(zhì)的同源性可以低于這個(gè)水平，例如約10％。
可以通過合適的相當(dāng)于交聯(lián)測定的方法(利用例如放射性同位素標(biāo)記的趨化因子)或者通過測量蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的其它方法(如表面等離子體共振，SPR，BIAcore)來檢測包括來自CrmB或CrmD的CTD的衍生物或片段或CTD同源物(CTD1、CTD2、和CTD3)的功能性同源物結(jié)合趨化因子的能力。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，來自CrmB的CTD包含SEQ ID No26或SEQ ID No28中的任何一個(gè)；來自CrmD的CTD包含SEQ ID No22或SEQ ID No24中的任何一個(gè)；并且CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)包含下述中的任何一個(gè)SEQID No8、SEQ ID No14、SEQ ID No6、SEQ ID No20、SEQ IDNo18、SEQ ID No16、以及由基因CPV V201(登記號Q8QMP4)、D12L(登記號P87598)、B6R(登記號O72743)或B21R(登記號O72758)編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第二方面提供了一種編碼本發(fā)明的CTD(包括同源物、衍生物以及片段)的核酸分子。后者核酸的互補(bǔ)鏈；以及由于遺傳密碼的簡并而與編碼根據(jù)本發(fā)明的CTD(包括同源物、衍生物、以及片段)的序列不同的核酸分子也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，編碼來自CrmB的CTD的序列包含SEQ ID No 25或SEQ ID No27中的任何一個(gè)；編碼來自CrmD的CTD的序列包含SEQ ID No21或SEQ ID No23中的任何一個(gè)；編碼功能性同源物的CTD的序列包含由下述基因編碼的序列中的任何一個(gè)V014(SEQ ID No7)、V201、V218(SEQID No13)、D12L、B6R、B21R、E12(SEQ ID No5)、E184(SEQID No19)、VACWR189(SEQ ID No17)或VACWR206(SEQ IDNo15)(圖1和圖2)。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，可以制備一種融合多肽，其包括融合至相同或其它來源的多肽序列的來自CrmB或CrmD的CTD或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)中的任何一個(gè)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，來自CrmB或CrmD的CTD或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)可以與其它物質(zhì)共價(jià)或非共價(jià)連接。連接產(chǎn)物可以是融合蛋白。融合至可溶性TNFR的CTD的表達(dá)提高已經(jīng)用于臨床的TNFR的免疫調(diào)節(jié)性能。該C-末端結(jié)構(gòu)域提供一種分子框架(molecular scaffolding)，其提高N-末端CRD的TNF結(jié)合活性；例如，CRD(1，2)結(jié)合性質(zhì)以這種方式提高。此外，這種提高可以使vTNFR結(jié)合TNF配體超家族的其它成員。
因此，在本發(fā)明的又一方面，該融合多肽包括融合至vTNFR的N-末端TNF結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選融合至人源的TNFR的來自CrmB或CrmD的CTD或它們的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性類似物、衍生物和片段)。
在本發(fā)明的又一具體實(shí)施方式
中，所制備的包括融合至其它起源的多肽序列的來自CrmB或CrmD的CTD或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)中的任何一個(gè)的融合蛋白為后者賦予趨化因子結(jié)合性質(zhì)。
為了某些目的，可以通過已知的化學(xué)連接方法(例如，一個(gè)伴侶的生物素化和另一個(gè)與生物素的結(jié)合伴侶如抗生物素蛋白的衍生化)將結(jié)合伴侶(coupling partner)連接至來自CrmB或CrmD的CTD或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)。
如上所述的來自CrmB或CrmD的CTD或它們的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)中的任何一個(gè)(本發(fā)明的蛋白質(zhì))例如可以用于結(jié)合趨化因子和它們的類似物(其具有動(dòng)物源或者具有相應(yīng)于親代病毒(該蛋白來自其)的宿主范圍的特異性)，和/或結(jié)合趨化因子和它們的類似物(其具有人源和/或特異性)。
在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的衍生物中，落入本發(fā)明范圍的是具有編碼通過缺失或取代修飾的本發(fā)明蛋白質(zhì)的序列的多肽，其保留本發(fā)明的蛋白質(zhì)的趨化因子結(jié)合性質(zhì)。例如，它可以用于缺失任何免疫原性氨基酸基序，或者用一個(gè)免疫原性較小的氨基酸序列替代這樣的基序。可替換地，一種可以在宿主中誘導(dǎo)免疫耐受性的修飾可以被引入編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的序列中。
本發(fā)明還擴(kuò)展至核苷酸序列，例如并入合適的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子及其經(jīng)修飾的形式(包括同源物，如片段或它們與其它多肽的融合產(chǎn)物)的DNA盒，以及包含在合適的質(zhì)?；蚱渌d體(例如，病毒載體)中的這樣的表達(dá)盒。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以例如用來結(jié)合C趨化因子、CC趨化因子、CXC趨化因子或CX3C趨化因子，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用來在體外(例如生物樣品中)或體內(nèi)阻斷這樣的細(xì)胞因子與它們的受體的結(jié)合或者抑制該生物學(xué)活性。
這種作用可以用于例如利用標(biāo)記反應(yīng)物的特異性結(jié)合測試，例如，用于診斷和測量目的。根據(jù)所進(jìn)行的構(gòu)建用于所希望目的的實(shí)驗(yàn)，該標(biāo)記反應(yīng)物可以為本發(fā)明的蛋白質(zhì)、或者一種趨化因子、或者一種趨化因子受體。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面還在于用于實(shí)施這樣的實(shí)驗(yàn)的組合物，例如本發(fā)明的蛋白質(zhì)的標(biāo)記產(chǎn)物；這些的任意一種的校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)等分試樣本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合至一種適于參與本文所述的特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的固體相的產(chǎn)物；該反應(yīng)中的結(jié)合伴侶之一的校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)等分試樣；以及與這樣的試劑的兩種或多種相關(guān)的檢測試劑盒。該實(shí)驗(yàn)可以例如是用于一種趨化因子或一種趨化因子受體的測定。
該結(jié)合作用還可以用于抑制由可以被本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的趨化因子介導(dǎo)的作用。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，一種藥物組合物(其包含來自CrmB和/或CrmD的CTD和/或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)和/或其功能性同源物、衍生物或片段、和/或與其它蛋白質(zhì)和/或表達(dá)盒和/或質(zhì)?；蚱渌d體的融合物)可以用于在體內(nèi)結(jié)合一種趨化因子或一種趨化因子類似物，或用于在體內(nèi)阻斷一種趨化因子與一種相應(yīng)的細(xì)胞表面受體的結(jié)合，以產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，一種藥物組合物可以包含合適治療(抗炎)量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，以用作抗炎劑。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以和與本身相容的傳統(tǒng)藥物賦形劑進(jìn)行配制，以遞送至一個(gè)需要治療的受治者。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式
，可以在合適的啟動(dòng)子的控制下，插入編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白的任何一種的核苷酸序列。該基因遞送系統(tǒng)可以是病毒或非病毒載體系統(tǒng)。當(dāng)靶細(xì)胞在治療對象的宿主體內(nèi)時(shí)，這樣的一種載體可以為靶轉(zhuǎn)染細(xì)胞賦予產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)(例如，用于抗炎目的)的能力。這樣的抗炎目的可以包括，例如用于抑制由趨化因子(例如通過促進(jìn)疾病或與疾病相關(guān)的趨化因子)介導(dǎo)的作用，該疾病例如是一種炎性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎?？寡啄康倪€包括在通過載體系統(tǒng)的基因遞送后，減少針對該載體系統(tǒng)的元件和/或針對在靶細(xì)胞中表達(dá)的其它基因產(chǎn)物的宿主免疫應(yīng)答，不管其是來自于與遞送本發(fā)明的蛋白質(zhì)相同的載體還是來自于用于這樣的另一個(gè)遞送基因的單獨(dú)的遞送載體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的載體可以通過例如任何合適的全身遞送途徑施加給體內(nèi)的細(xì)胞?？商鎿Q地，這種給予可以通過例如直接注射，如通過靜脈注射到靶細(xì)胞所在部位處或靶細(xì)胞所在部位附近和/或要治療的受治者的炎癥部位而加以靶向。
可以選擇施加形式以限制宿主對本發(fā)明的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者一種表達(dá)它們的載體系統(tǒng)可以與另一種免疫抑制物或抗炎物質(zhì)一起遞送。
本發(fā)明的又一方面涉及針對不含本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或vTNFR的VV疫苗。一些vTNFR和CTD相關(guān)蛋白通過一些VV菌株進(jìn)行表達(dá)，該VV菌株用作人類的天花疫苗或作為用于表達(dá)來自其它病原體的蛋白質(zhì)以誘導(dǎo)免疫性的重組病毒載體。通過限制病毒復(fù)制和/或病毒誘導(dǎo)的免疫病理反應(yīng)，在用VV進(jìn)行天花免疫接種后，這些蛋白質(zhì)的趨化因子結(jié)合活性的中和可以減少報(bào)道的不良作用。中和vTNFR或CTD的趨化因子結(jié)合活性的抗體或試劑可以減弱人類天花，使免于致命的人類天花，并且減少由VV疫苗接種引起的不良作用。
本發(fā)明的另一方面包括一種通過用包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的試劑孵育包含趨化因子或趨化因子類似物的樣品來檢測趨化因子或趨化因子類似物的方法。
本發(fā)明的另一方面涉及基于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的抗體或抑制vTNFR或CTD同源物的趨化因子結(jié)合活性的試劑，本發(fā)明的蛋白質(zhì)在用于制備一種用于治療由VV疫苗接種引起的不良作用或由天花引起的病理反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的其它方面的形成對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。


圖1不同病毒中的vTNFR和CTD同源物的示意性表示。標(biāo)注了每個(gè)病毒中的基因名稱。
圖2vTNFR CrmB和CrmD與CTD同源物的多個(gè)序列對比。
圖3作為IL-8(CXCL8)結(jié)合蛋白的EV CrmD的鑒定。(a)125I-IL-8交聯(lián)來自EV-感染的細(xì)胞的介質(zhì)表明存在不是由VV表達(dá)的一種IL-8結(jié)合活性。(b)由重組VV表達(dá)的EV全長CrmD結(jié)合IL-8，而CrmD CRD(1-4)不結(jié)合。(c)125I-IL-8與重組CrmD的結(jié)合在過量人類或小鼠TNF存在的情況下不被抑制。(d)125I-IL-8與CPV CrmD和CrmB的交聯(lián)在桿狀病毒中表達(dá)。
圖4CrmD CRD和CTD在TNF結(jié)合和活性抑制中的作用。(a)含EV CrmD CRD和CTD的組合的構(gòu)建體的示意性表示。(b)125I-TNF與U937細(xì)胞的結(jié)合與來自感染有表達(dá)所示的CrmD構(gòu)建體的VV重組體的細(xì)胞上清液的競爭。(c)在劑量逐漸增加的感染有所示的重組VV或VV VVR的細(xì)胞上清液存在的情況下，將重組CrmD構(gòu)建體的生物學(xué)活性確定為小鼠L929細(xì)胞中TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的百分比。(d)由來自感染有所示的重組桿狀病毒的細(xì)胞的上清液對TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制。
圖5結(jié)合至EV CrmD的趨化因子。純化的重組EV CrmD蛋白被胺連接至一個(gè)CM5生物傳感芯片達(dá)到5000RU的水平。這個(gè)芯片用于在BIAcoreX(Uppsala，Sweden)中觀察與所有商業(yè)上可獲得的人類趨化因子的結(jié)合。在所有的情況下，以10μl/min的流速注射30μl的一種100nM趨化因子溶液。對于每種趨化因子，針對在解離120s后(復(fù)合體的穩(wěn)定性)的結(jié)合水平繪示最大結(jié)合水平。小圖表通過SPR動(dòng)力分析確定的用于所示趨化因子的親和力。對于動(dòng)力學(xué)分析，純化的重組EV CrmD蛋白被胺連接至一個(gè)CM5生物傳感芯片達(dá)到1200RU的水平(Rmax＜200RU)。以30μl/min的流速注射不同濃度的趨化因子2分鐘，并且另外監(jiān)測離解5分鐘。借助BIAevaluation軟件利用1∶1 Langmuir結(jié)合模型進(jìn)行曲線擬合。
圖6駱駝痘病毒(CMLV)和VaV病毒CrmB蛋白的氨基酸序列的對比。保守的殘基用星號示出。突變的位點(diǎn)用紅色示出。示出了CRD(1-4)和CTD。
圖7VaV CrmB的不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合TNF和趨化因子。通過SPR分析的人類TNFα(紅色)和人類CXCL 12β(CK，藍(lán)色)與全長VaV CrmB、VaV CrmB CRD(1-4)或VaV CrmB CTD純化蛋白的結(jié)合。
圖8由VaV CrmB對TNF和趨化因子生物學(xué)活性的抑制。(a)TNF-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制。在37℃，在 的補(bǔ)充有放線菌素D(4□g/ml)的完全DMEM中，將TNF用所示量的純化重組蛋白預(yù)孵育2h。隨后將混合物加入到96孔板中的2×104L929細(xì)胞(前一天接種)中并且16到18小時(shí)后評估細(xì)胞死亡。在每種情況下繪示cuadruplicates的O.D.490nm(平均值±SD)?！癈elulas”/“celActD”用于細(xì)胞生存力的對照；“TNF”用于細(xì)胞死亡的對照；“CrmB”用VaV CrmB預(yù)孵育的TNF；“CRD”用VaV CrmB CRD(1-4)預(yù)孵育的TNF；“IgG1”用IgG1預(yù)孵育的TNF，用于特異性的對照。(b)趨化性分析。將人類CCL25(100nM)單獨(dú)地或在增加量的純化重組蛋白存在的情況下在37℃孵育30分鐘，并被置于24孔穿通孔室的下室。這個(gè)期間之后，將5×105個(gè)MOLT-4細(xì)胞在100□l的含0.1％FCS的完全RPMI中加入到上孔，并且將該板在37℃孵育4小時(shí)。MOLT-4細(xì)胞朝底部孔遷移的％通過FACS分析來確定。將100％的遷移設(shè)置為僅在趨化因子存在下遷移的細(xì)胞數(shù)量。
圖9結(jié)合至VaV CrmB的趨化因子。純化的重組VaV CrmB蛋白被胺連接至一個(gè)CM5生物傳感芯片達(dá)到5000RU的水平。這個(gè)芯片用于在BIAcoreX(Uppsala，Sweden)中觀察與所有商業(yè)上可獲得的人類趨化因子的結(jié)合。在所有的情況下，以10μl/min的流速注射30μl的一種100nM趨化因子溶液。對于每種趨化因子，針對在解離120s后(復(fù)合體的穩(wěn)定性)的結(jié)合水平繪示最大結(jié)合水平。小圖表通過SPR動(dòng)力分析確定的用于所示趨化因子的親和力。對于動(dòng)力學(xué)分析，純化的重組VaV CrmB蛋白被胺連接至一個(gè)CM5生物傳感芯片達(dá)到1200RU的水平(Rmax＜200RU)。以30μl/min的流速注射不同濃度的趨化因子2分鐘，并且另外監(jiān)測離解5分鐘。借助BIAevaluation軟件利用1∶1 Langmuir結(jié)合模型進(jìn)行曲線擬合。
圖10VV 35kDa vCKBP與VaV CrmB的CRD(1-4)的融合為CrmB賦予了結(jié)合趨化因子的能力。(a)用于趨化因子結(jié)合的交聯(lián)試驗(yàn)。將來自模擬感染的High5細(xì)胞(感染重組桿狀病毒“Bac VaV CrmB CRD(1-4)”(Bac106)，“Bac VaV CrmB”(Bac107)，和“Bac VaV CrmB CRD(1-4)/35K”(Bac109))的上清液用400pM的125I-CCL3加以孵育。重組蛋白和CCL3之間的復(fù)合體通過利用EDC發(fā)生交聯(lián)，并且通過SDS-PAGE和放射自顯影法來分析產(chǎn)物。(b)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制。在 的補(bǔ)充有放線菌素D(4□g/ml)的完全DMEM中，將TNF在37℃用相應(yīng)的上清液預(yù)孵育2小時(shí)。隨后將混合物加入到96孔板中的2×104L929細(xì)胞(前一天接種)中并且在16到18小時(shí)后評估細(xì)胞死亡。對不同樣品繪示O.D.490nm。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以及可用于實(shí)現(xiàn)其具體實(shí)施方式
的材料和方法在下面的實(shí)施例中將進(jìn)一步說明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法1.1-痘病毒CPV、EV和VV通過感染鋪滿的單層Bsc-I細(xì)胞而在體外進(jìn)行增殖。
1.2-駱駝痘病毒CrmB的克隆和VaV CrmB的產(chǎn)生利用寡核苷酸CMLV 264 Eco(5’-GCGGAATTCATGAAGTCCGTATTATACTCG)和CMLV 264 Xho(5’-GCGCTCGAGTAAAAAGTGGGTGGGTTTGG)并且純化的CMLVDNA作為模版通過PCR來擴(kuò)增駱駝痘病毒的菌株CMS的ORF 264(相應(yīng)于CrmB基因)。PCR產(chǎn)物被克隆入EcoRI/XhoI消化的pBacl(Novagen)以產(chǎn)生質(zhì)粒pRA1。通過DNA測序確定擴(kuò)增基因中缺少突變。根據(jù)制造商的說明，利用“QuikChange Multi Site-DirectedMutagenesis Kit(Strategene)”，通過質(zhì)粒pRA1的多位點(diǎn)定點(diǎn)突變來獲得相應(yīng)于VaV(菌株Bangladesh 1975；ORF 188)的DNA。引入的突變示于圖6中。在若干連續(xù)的幾輪定點(diǎn)突變后，獲得質(zhì)粒pRA105。這種質(zhì)粒包含編碼融合至由原始pBac1質(zhì)粒提供的C-末端His標(biāo)簽的VaV(BSH 1975菌株)CrmB的序列。通過直接測序確認(rèn)了存在所有的突變并且不存在不希望的其它突變。
1.3-表達(dá)來自EV或CPV的CrmD的重組桿狀病毒(baculovirus)和牛痘病毒的構(gòu)建為了在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)，將編碼全長或截短型CrmD(表3)的DNA用特異性寡核苷酸(表4)進(jìn)行PCR-擴(kuò)增，并克隆入pBAC-1中。通過在轉(zhuǎn)染有重組pBAC-1質(zhì)粒和如所述(Alcami et al.，1998)的線性桿狀病毒DNA的SF21昆蟲細(xì)胞中的同源重組而產(chǎn)生重組桿狀病毒。
vTNFR也從VV表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。感興趣的基因被克隆入pMJ601，用于從強(qiáng)大VV啟動(dòng)子表達(dá)該基因(Davison & Moss，1990)。通過同源重組將感興趣的基因插入VV基因組的胸苷激酶座位，在溴脫氧尿苷的存在下選擇該重組VV并且通過顏色選擇進(jìn)行鑒定(□-半乳糖苷酶的表達(dá)并用X-gal染色)。VTNFR從VV WesternReserve(一種不編碼TNF結(jié)合活性的病毒株)被表達(dá)(Alcami et al.，1999)。
1.4-表達(dá)融合于CPV 35kDa蛋白的VaV CrmB、VaV CrmBCRD(1-4)、VaV CrmB CTD、EV E12、EV E184、CPV V218和VaV CrmB CRD(1-4)的重組桿狀病毒的產(chǎn)生融合于C-末端His標(biāo)簽的全長VaV CrmB基因被亞克隆入EcoRI/SphI消化的pFastBac1(Invitrogen)以產(chǎn)生pRA107。利用pRA107作為模版，利用寡核苷酸VaV 188 Eco(5’-GCGGAATTCATGAAGTCCGTATTATACTTG)和VaV 188 CRDs1-4 Xho (5’-GCGCTCGAGACACGATGTGTCGTTAACTGG)，通過PCR擴(kuò)增包括四個(gè)CRD并相應(yīng)于殘基1(M)到192(C)的VaV CrmB的N-末端結(jié)構(gòu)域。該擴(kuò)增的片段用由EcoRI/XhoI消化的pBac1(Novagen)提供的C-末端his標(biāo)簽符合讀框地被克隆，以生成pRA99。用EcoRI/SphI消化pRA99并且攜帶融合于His標(biāo)簽的VaV CrmB CRD1-4的片段象先前一樣被克隆入pFastBac1以產(chǎn)生pRA106。利用pRA107作為模版，將VaV CrmB的CTD(殘基T194到L348)用寡核苷酸VaV188Cter-PfIMI(5’-CGCCCACCCAATGGAACTAGGACGACCAC-TACCGG)和H347R 3進(jìn)行PVR擴(kuò)增。該片段用PfmII和XhoI消化并且克隆入用同樣的酶消化的pRA107中。這產(chǎn)生了pRA108，一種編碼由VaVCrmB的29N-末端殘基(其包括預(yù)測的信號肽)和隨后的CrmB的CTD以及另外的His標(biāo)簽構(gòu)成的融合蛋白的質(zhì)粒。在所有情況下，通過對全部插入物進(jìn)行測序而確認(rèn)了在pRA106、pRA107和pRA108中不存在不希望的突變。
利用寡核苷酸E1(5’-GCGGGA-TCCATGATAAACATAAACATAAACACAATAC)和E2(5’-GCGGCGGCCGCAT-TAATAGTTCTAGTAGCGCAAG)并且純化的EV(菌株naval.Cam)DNA作為模版通過PCR來擴(kuò)增EV基因E12。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆入Bam HI/NotI消化的pBac1(Novagen)生成質(zhì)粒pMS51中。E12基因被亞克隆入Bam HI/Xho I消化的pRA106以產(chǎn)生質(zhì)粒pAH18，其包含融合于pFastbac(Invitrogen)主鏈中編碼His-標(biāo)簽的C-末端序列的E12基因。利用寡核苷酸5’V218 EcoRI(5’-CGCGAATTCATGATGATATACGGATTAATAGC)和3’V218 Sall(5’-GCGGTCGACACCATCGACACCACTCATC)并且純化的病毒DNA作為模版，PCR-擴(kuò)增CPV Brighton Red菌株ORFV218。PCR產(chǎn)物被克隆入EcoRI/Xho I消化的pRA106以產(chǎn)生質(zhì)粒pAH17，其包含融合于pFastbac(Invitrogen)主鏈中編碼His-標(biāo)簽的C-末端序列的CPV V218基因。利用寡核苷酸5’35KBR-S23(5’-CGCCTCGAGTCATTCTCATCCTCATCCTC)和3’35KBR(-stop)(5’-CGCCTCGAGGACACACGCTATAAGTTTTGC)并且純化的病毒DNA作為模版，PCR-擴(kuò)增相應(yīng)于CPV(菌株Brighton Red)35kDa蛋白的殘基S23-V246的片段。PCR產(chǎn)物被克隆入Xho I消化的pRA106以產(chǎn)生質(zhì)粒pRA109。該質(zhì)粒攜帶編碼VaV CrmB CRD(1-4)的序列，其符合讀框地融合于pFastBac主鏈(Invitrogen)中編碼CPV 35kDa vCKBP(不具有其信號肽，而具有C-末端His標(biāo)簽)的序列。
如制造商所述，利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)來獲得重組桿狀病毒。簡單地說，質(zhì)粒pRA106、pRA107、pRA108、pRA109、pAH17和pAH18被轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH10Bac細(xì)菌(一個(gè)轉(zhuǎn)座事件)，產(chǎn)生相應(yīng)的重組桿粒。這些產(chǎn)物被純化并轉(zhuǎn)染入High5昆蟲細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)染后三天，從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液收獲重組桿狀病毒vBac106、vBac107、vBac1068、vBac109、vBacAH17和vBacAH18。在一個(gè)單獨(dú)的步驟中進(jìn)一步擴(kuò)增這些病毒以產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的高效價(jià)重組病毒原種。
用寡核苷酸5’E184(5’-GCGGAATTCATGTATAAAAAAGTAATAACGTTT)和3’E184 XhoI(5’-CGCCTCGAGAAAATCATATTTTGAATAATATGTA)并且純化的EV DNA作為模版，PCR-擴(kuò)增來自EV的E184基因。PCR產(chǎn)物被克隆入用EcoRI和XhoI消化的pRA106質(zhì)粒，產(chǎn)生pAH11。確認(rèn)正確的DNA序列。如上所述，質(zhì)粒pAH11被用于產(chǎn)生重組桿狀病毒vBacAH11，表達(dá)融合于組氨酸標(biāo)簽的EV E184蛋白以促進(jìn)該蛋白的純化。
1.5-蛋白質(zhì)表達(dá)和純化為了表達(dá)該重組蛋白，將High5細(xì)胞以高感染復(fù)數(shù)(multiplicity)(10pfu/細(xì)胞)加以感染，并且在感染后三天(d.p.i.)收集來自感染培養(yǎng)物的上清液。通過蛋白質(zhì)印跡法，和/或在全長和N-末端VaV CrmB構(gòu)建體的情況下的溶液中TNF結(jié)合分析來確認(rèn)這些上清液中蛋白質(zhì)的存在(Alcami et al.，1999)。利用YM-3膜(Millipore)在攪拌超濾池(Amicon)上將該樣品濃縮至約2.5ml，并且在PD-10脫鹽柱(Amersham-Pharamcia Biosciences)上將緩沖液變換為結(jié)合緩沖液(50mM磷酸鹽、300mM NaCl、10mM咪唑，pH7.4)。按照制造商的說明，利用Vivapure金屬鰲合柱(Vivascience)親和-純化His-標(biāo)記的重組蛋白。在考馬斯-藍(lán)染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上檢查純化蛋白的純度和數(shù)量。為了TNF保護(hù)和趨化性抑制實(shí)驗(yàn)，針對PBS透析重組蛋白。
1.6-通過表面等離子共振(SPR)進(jìn)行生物分子相互作用分析利用BIAcore X生物傳感器(Biacore，Uppsala，Sweden)來確定細(xì)胞因子結(jié)合特異性和親和力常數(shù)。對于配體篩選實(shí)驗(yàn)，在每個(gè)情況下，純化的重組蛋白被胺連接至CM5芯片達(dá)到約5000RU(5000pg/mm2)的水平。隨后以5μl/min的流速注射在HBS-EP緩沖液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％(v/v)表面活性劑P20；pH7.4)中的100nM的商業(yè)上可獲得的細(xì)胞因子(Peprotech，R&D Systems)，并且監(jiān)測結(jié)合和解離。在每次注射后利用10mM甘氨酸-HCl pH2.0再生該表面。對于動(dòng)力學(xué)分析，將重組蛋白以低密度(Rmax＜200RU)固定。隨后不同濃度的相應(yīng)分析物以30μl/min的流速注射超過2分鐘并且使其解離另外5分鐘。利用BIAevaluation 3.2軟件分析所有的Biacore感應(yīng)圖(sensorgram)。通過減去基準(zhǔn)流動(dòng)細(xì)胞反應(yīng)而去除體積折射率變化，并且從全部分析物感應(yīng)圖減去空白注射的平均反應(yīng)以去除系統(tǒng)假象(artifact)。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)被全面擬合至1∶1的langmuir模型。
1.7-TNF所致的細(xì)胞毒性的抑制如前所述在小鼠L929細(xì)胞上進(jìn)行TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(Loparev et al.，1998，Saraiva & Alcami，2001，Schreiber et al.，1997，Smith et al.，1996)。在補(bǔ)充有放線菌素D(4□g/ml)(Sigma)的完全DMEM中，將TNF(20ng/ml)(R&D Systems)用純化的重組蛋白在37℃預(yù)孵育2h。隨后將該混合物加入到96孔板中前一天接種的2×104個(gè)細(xì)胞上，并且按照制造商的指導(dǎo)，利用“CellTiter96 Aqueous One Solution cell proliferation assay”(Promega)，在16-18小時(shí)后評估細(xì)胞死亡。
1.8-趨化性實(shí)驗(yàn)如前所述，利用具有3□m孔徑的過濾器的24孔Transwell板(Costar)來評估MOLT-4細(xì)胞的遷移(Zaballos et al.，1999)。簡單地說，將人類CCL25(100nM)(R&D Systems)單獨(dú)地或在數(shù)量增加的純化重組蛋白存在的條件下在37℃孵育30分鐘，并放置在下室內(nèi)。然后，在包含0.1％FCS的100□l完全RPMI中將5×105個(gè)MOLT-4細(xì)胞被加入到上孔，并且在37℃，5％CO2，95％加濕的孵育箱中孵育該板。在4小時(shí)后，通過流式細(xì)胞儀確定MOLT-4細(xì)胞向下室的遷移。
實(shí)施例2結(jié)果2.1-由EV和CPV編碼的vTNFR CrmD結(jié)合趨化因子為了尋找結(jié)合趨化因子的新型病毒分泌蛋白質(zhì)，我們用1251-CXCL8進(jìn)行了交聯(lián)實(shí)驗(yàn)，并且鑒定了由痘病毒EV編碼的新型分泌vCKBP(圖3a)。這種活性在VV樣品中缺少，并且具有比由VV和其它痘病毒編碼的35kDa vCKBP更大的分子大小，vCKPB是一種可以交聯(lián)CXCL8但是由于其對CXCL8的低親和力而不阻斷其生物活性的蛋白質(zhì)(Alcami et al.，1998，Graham et al.，1997，Lalani et al.，1998)。出乎意料的是，我們發(fā)現(xiàn)由EV編碼的vTNFR CrmD(已知結(jié)合TNF)具有另外的結(jié)合CXCL8的性質(zhì)(圖3b)。利用在VV表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的截短型的CrmD蛋白，我們已經(jīng)證實(shí)，CrmD的3個(gè)N-末端CRD對于阻斷TNF活性是必要的(圖4a、4b和4c)，而CTD對于TNF結(jié)合不是必需的，但是CTD為CrmD賦予了結(jié)合趨化因子的能力(圖3b)。CrmD的不同結(jié)構(gòu)域看起來涉及TNF和趨化因子結(jié)合，因?yàn)樵赥NF存在的情況下，CXCL8交聯(lián)至CrmD不能被阻斷(圖3c)，而在CXCL8存在的情況下，TNF結(jié)合至CrmD不被抑制(未示出)。利用表面等離子共振(SPR，BIAcore X)技術(shù)，我們檢測了純化的EV CrmD與所有商業(yè)上可獲得的人源和鼠源趨化因子的可能相互作用，并且已經(jīng)確定CrmD以高親和力與許多趨化因子結(jié)合(圖5)。
2.2-由CPV和VaV編碼的vTNFR CrmB結(jié)合趨化因子為了檢測編碼延伸的CTD的其它vTNFR是否結(jié)合趨化因子，我們在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)了來自CPV的CrmB，并且證實(shí)它在交聯(lián)實(shí)驗(yàn)中結(jié)合CXCL8(圖3d)。CrmB也由人類病原體VaV(天花的病因)編碼。我們通過來自相關(guān)的駱駝痘病毒的CrmB基因的大量定點(diǎn)突變產(chǎn)生了VaV的CrmB基因(圖6)，并且在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)了該蛋白。我們首先檢測了純化的VaV CrmB蛋白結(jié)合TNF(圖7)并抑制TNF生物活性(圖8a)。我們還通過SPR檢測了CrmB與所有可獲得的人類趨化因子的結(jié)合，并且我們證明了CrmB以高親和力與大量趨化因子結(jié)合(圖9)。缺少CTD的截短型VaV CrmB不結(jié)合趨化因子(圖7)。此外，VaV CrmB的CTD的表達(dá)和純化已經(jīng)證明了CTD編碼CrmB的趨化因子結(jié)合活性(圖7)。這通過表明TNF和趨化因子結(jié)合至CrmB中不同的位點(diǎn)(未示出)的SPA分析得以確認(rèn)。
2.3-在體外由VaV編碼的vTNFR CrmB阻斷由CCL25誘導(dǎo)的MoIt4細(xì)胞的遷移vTNFR CrmB和CrmD對一些趨化因子的高親和力表明這些病毒蛋白質(zhì)可以用作鰲合趨化因子的假目標(biāo)受體，并且阻止趨化因子結(jié)合到白細(xì)胞上的其特異性受體和誘導(dǎo)觸發(fā)細(xì)胞遷移的信號。我們證實(shí)，VaV CrmB抑制表達(dá)相關(guān)受體的MoIt4細(xì)胞響應(yīng)于趨化因子CCL25的遷移(圖8b)。
2.4.-與vTNFR的CTD(CTD同源物)相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合趨化因子如上所述，由痘病毒編碼的三種蛋白質(zhì)具有與vTNFR(CrmB和CrmD)的CTD類似的氨基酸序列(圖1和圖2)。稱為CTD1、CTD2、CTD3的這些蛋白質(zhì)具有表明它們是被分泌的N-末端信號肽。這些蛋白質(zhì)、EV E12(CTD1)、EV184(CTD2)和CPV B21R(CTD3)的兩種在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)已表明兩種蛋白質(zhì)均被分泌入培養(yǎng)基中。檢測純化的EV E12蛋白對于全部小鼠趨化因子的結(jié)合，并且發(fā)現(xiàn)其以高親和力結(jié)合多種趨化因子(表2)。另外，我們已通過SPR確定純化的蛋白CPV B21R和V E184結(jié)合來自小鼠的CCL21，CCL24，CCL25，CCL27，CCL28，CXCL10，CXCL11，CXCL12β，CXCL13和CXCL14，以及人類CCL26。已經(jīng)證實(shí)VV VVR B7R(CTD2)被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔并且被留在細(xì)胞內(nèi)而不是被分泌(Price et al.，2000)。一些CTD同源物可以起作用以阻斷趨化因子(如CCL27)的活性，已知其也在細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)(Gortz et al.，2002)。在鼠皮層內(nèi)模式下缺乏B7R基因的VV突變體被減弱(Price et al.，2000)。
2.5.-來自EV的vTNFR CrmD和來自VaV的CrmB結(jié)合其它TNF配體超家族成員TNF是具有結(jié)構(gòu)類似的免疫調(diào)節(jié)劑的大家族(稱為TNF配體(TNFL)超家族)的成員(Locksley et al.，2001，Wallach，2001)。通過SPR檢測EV CrmD和VaV CrmB結(jié)合所有商業(yè)上可獲得的TNF配體超家族成員，并發(fā)現(xiàn)其結(jié)合APRIL(TNFL 13)(CrmDKd 110 pM；CrmB Kd 2nM)和LIGHT(TNFL14)(CrmD Kd 140nM；CrmB Kd 2nM)。這表明CrmD和CrmB(和可能是其它vTNFR)可以抑制多種TNF配體超家族成員的生物活性。
2.6-vTNFR的CTD可以影響CRD以高親和力結(jié)合TNF的能力如上所證實(shí)的，包括N-末端CRD(1，2)的截短的vTNFR CrmD喪失了對于TNF的親和力，并且不阻斷TNF生物活性，而CRD(1-3)結(jié)合TNF并且抑制其活性(圖4a、4b、4c)。令人驚奇的是，當(dāng)CRD(1，2)融合至CTD被表達(dá)時(shí)，它恢復(fù)TNF抑制活性，表明CTD可以提高vTNFR的N-末端CRD的TNF結(jié)合活性(圖4d)。
2.7-病毒編碼的蛋白質(zhì)形成有獨(dú)立結(jié)合免疫配體的結(jié)構(gòu)域這里所示的數(shù)據(jù)表明，vTNFR CrmB和CrmD由兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(圖1和圖2)。N-末端CRD具有結(jié)合TNF的能力，而CTD以獨(dú)立的方式結(jié)合趨化因子。這通過如下發(fā)現(xiàn)得以證實(shí)當(dāng)獨(dú)立表達(dá)時(shí)，來自CrmB的CRD(1，4)保留TNF結(jié)合活性，而來自CrmB的CTD具有趨化因子結(jié)合活性。病毒蛋白質(zhì)的這些區(qū)域代表結(jié)合免疫調(diào)節(jié)劑的結(jié)構(gòu)模塊或結(jié)構(gòu)域的這個(gè)概念通過以下發(fā)現(xiàn)被著重強(qiáng)調(diào)(1)純化的VaV CrmB的CTD結(jié)合趨化因子(圖7)；(2)由CPV編碼的CrmB和CrmD的CTD可以被交換并且仍提供趨化因子結(jié)合活性(未示出)；(3)與vTNFR CTD相關(guān)的三種不同的蛋白質(zhì)(EV E12、EV E184和CPV B21R)編碼趨化因子結(jié)合活性(表2)；以及(4)CPV 35kDa vCKBP與VaV CrmB的CRD(1.4)的融合在不影響TNF抑制活性的情況下為該蛋白提供了結(jié)合趨化因子的能力(圖10)。因此，這些病毒結(jié)構(gòu)域可以被交換或者結(jié)合以產(chǎn)生阻斷多種細(xì)胞因子的活性的免疫調(diào)節(jié)蛋白。我們提出vTNFR的CTD限定結(jié)合免疫系統(tǒng)涉及的免疫蛋白(如趨化因子)或其他蛋白質(zhì)的新型蛋白結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域，并為vTNFR賦予結(jié)合除了TNF之外的其他免疫調(diào)節(jié)蛋白的能力。
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表1.由牛痘病毒和皰疹病毒編碼的趨化因子結(jié)合蛋白

表2.通過SPR獲得的EV E12蛋白對于不同趨化因子的親和力常數(shù)(KD)。純化的重組蛋白被低水平硫醇連接，并且利用BIAcoreX以高流速注射不同濃度的所示細(xì)胞因子。每種情況下的KD利用BIAevaluation軟件來確定。

表3制備的為了表達(dá)vTNFR的重組質(zhì)粒。涉及的插入物是利用所示的寡核苷酸對通過PCR從病毒DNA進(jìn)行擴(kuò)增(寡核苷酸序列見表4)。EV是菌株Hampstead，CPV是菌株Brighton Red。


表4在桿狀病毒和VV系統(tǒng)中用于表達(dá)EV CrmD和CPV CrmB的寡核苷酸寡核苷酸序列(5’＞3’)5’CrmD-7 CGCGTTTAAACGGATCCATGATGAAGATGACACCATCATA3’CrmD-9CGCCTCGAGATCTCTTTCACAATCATTTGGTGG3’CrmD-15 CGCGGTACCTCAATCTCTTTCACAATCATTTGG3’CrmD-22 CGCGGTACCTTAATCTATGCTGTTAAAGGACAGATCAC3’CrmD-23GCGAAGCTTTTACCATGGGTAGTATCCGGATGCACAGACAC3’CrmD-24 GCGAAGCTTTTACCATGGACAAGAGGTCTTGTTAACAGGATAC3’CrmD-29 GCGGCGGCCGCGTAGTATCCGGATGCACAGACAC5’PT-1 GCGGCGGCCGCCAATTCGAGTATAGGAAGCAGCAGTAC3’PT-2 GCGCTCGAGATCTCTTTCACAATCATTTGGTGG3’PT-3 GCGGCGGCCGCATCTATGCTGTTAAAGGACAGATCAC3’PT-4 GCGGCGGCCGCACAAGAGGTCTTGTTAACAGGATAC5’PT-5 GCGGCGGCCGCCACTCGGACGACCACTACCGGTCTC3’PT-6 GCGCTCGAGTAAAAAGTGGGTGGGATACTGGGAA3’PT-7 GCGGCGGCCGCACACGATGTGTCGTTGACGGGATAC5’SF-1 GCGGGTACCGAATTCACCATGGAGTCATATATATTGCTATTGC
序列表序列表<110>安東尼奧·阿爾卡米<120>病毒TNF受體和相關(guān)蛋白質(zhì)的趨化因子結(jié)合活性<130>1<160>28<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>963<212>DNA<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>基因<222>(1)..(963)<223>基因V221<400>1atgatgaata tgacaccatc atacatcttg ttggtatata tgttcgtagt cgtaagtgga 60gatgttcctt atgaacacat taatgggaaa tgtaacggta ccgactataa tagtaataat 120ctatgttgta aacaatgcga tcctggaatg tatatgactc attcctgtaa taccacttct 180aatacaaaat gtgacaagtg cccagatggc acctttacat ccattcctaa tcatattccc 240acgtgtctaa gttgtcgagg caaatgtagc agtaatcatg tagagactaa atcgtgtagt 300aacacacagg acagagtatg tgtctgtgca tccggatact actgcgaatt tgaaggatca 360aacggttgca ggctatgtgt accacaaaca aagtgtgatt ctggttacgg tgtatatggc 420tactcatcta aaggagatgt aatatgtaaa aagtgtccgg gtaatataga taaatgtgat 480ctgtccttta acagcataga tgtagaaatt aatatgtatc ctgttaacaa gacctcttgt 540aattcgagta taggaagtag cagtaccata tcaacttccg agttaacaat tactctaaaa 600catgaggatt gtactactgt ctttattgga gattactatt cagtcgttga taaactagca 660acttcaggtt tctttacaaa cgataaagta catcaagacc tcacaacgca gtgcaagatt 720aatctagaaa tcaaatgtaa ttctggagga gaatctagac aactaacacc cacgacgaag 780gtatacttta tgcctcattc agaaacggta actgtggtag gagactgtct ctctaatctc 840gatgtctata tagtatatgc caatacggac gcgatatatt ccgacatgga tgtcgtcgct 900tatcatacta gttatatact aaatgttgat catattccac caaatgattg tgaaagagat 960tga 963<210>2<211>320<212>PRT<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(320)<223>細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物D(CrmD)<400>2Met Met Asn Met Thr Pro Ser Tyr Ile Leu Leu Val Tyr Met Phe Val1 5 10 15Val Val Ser Gly Asp Val Pro Tyr Glu His Ile Asn Gly Lys Cys Asn20 25 30
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gcgtgtctaa gttgtcgagg caaatgtagc agtaatcaag tagagactaa atcgtgtagt 300aacacacagg acagagtatg tgtctgtgca tccggatact actgcgaatt tgaaggatca 360aacggttgca ggctatgtgt accacaaaca aagtgtggtt ctggttacgg tgtatatggc 420tactcatcta aaggagatgt aatatgtaaa aagtgtccgg gtaatataga taaatgtgat 480ctgtccttta acagcataga tgtagaaatt aatatgtatc ctgttaacaa gacctcttgt 540aattcgagta taggaagcag cagtaccata tcaacttccg agttaacaat tactctaaca 600catgaggatt gtactcctgt ctttattgga gattactatt cagtcgttga taaactagca 660acttcaggtt tctttacaaa cgataaagta catcaagacc tcacaacgca gtgcaagatt 720aatctagaaa tcaaatgtaa ttctggaaga gaatctagac aactaacacc cacgacgaag 780gtatacctta tgcctcattc agaaacggta actgtggtag gagactgtct ctctaatctc 840gatgtctata tagtatatgc caatacggac gcgatatatt ccgacatgga cgtcgtcgcg 900tatcatacta gttatatact aaatgttgat catattccac caaatgattg tgaaagagat 960<210>4<211>320<212>PRT<213>鼠痘病毒菌株Naval<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(320)<223>細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物D(CrmD)<400>4Met Met Lys Met Thr Pro Ser Tyr Ile Leu Leu Val Tyr Met Phe Val1 5 10 15Val Val Ser Gly Asp Val Pro Tyr Thr Pro Ile Asn Gly Lys Cys Asn20 25 30Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asn Asn Leu Cys Cys Lys Gln Cys Asn Pro35 40 45Gly Met Tyr Met Thr His Ser Cys Asn Thr Thr Ser Asn Thr Lys Cys50 55 60Asp Lys Cys Pro Asp Asp Thr Phe Thr Ser Ile Pro Asn His Ser Pro65 70 75 80Ala Cys Leu Ser Cys Arg Gly Lys Cys Ser Ser Asn Gln Val Glu Thr85 90 95Lys Ser Cys Ser Asn Thr Gln Asp Arg Val Cys Val Cys Ala Ser Gly100 105 110Tyr Tyr Cys Glu Phe Glu Gly Ser Asn Gly Cys Arg Leu Cys Val Pro115 120 125Gln Thr Lys Cys Gly Ser Gly Tyr Gly Val Tyr Gly Tyr Ser Ser Lys130 135 140Gly Asp Val Ile Cys Lys Lys Cys Pro Gly Asn Ile Asp Lys Cys Asp145 150 155 160Leu Ser Phe Asn Ser Ile Asp Val Glu Ile Asn Met Tyr Pro Val Asn165 170 175Lys Thr Ser Cys Asn Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr180 185 190Ser Glu Leu Thr Ile Thr Leu Thr His Glu Asp Cys Thr Pro Val Phe195 200 205
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(202)<223>CTD-1<400>6Met Ile Asn Ile Asn Ile Asn Thr Ile Leu Ile Phe Ala Ser Leu Phe1 510 15Val Ala Ser Phe Ala Asn Asp Tyr Pro Pro Pro Gly Phe Phe Glu Asn20 25 30Lys Tyr Ile Thr Asp Thr Phe Asn Tyr Ile Ser Ile Asp Phe Glu Leu35 40 45
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(202)<223>CTD-1
<400>8Met Ile Asn Ile Asn Ile Asn Thr Ile Leu Ile Phe Ala Ser Leu Phe1 5 10 15Val Ala Ser Phe Ala Asn Asp Tyr Pro Pro Pro Gly Phe Phe Glu Asp20 25 30Lys Tyr Ile Thr Asn Thr Phe Asn Tyr Ile Ser Ile Asp Phe Glu Leu35 40 45Tyr Pro Val Asn Val Ser Ser Cys Asn Arg Leu Ser Thr Lys Gln Ser50 55 60Ser Asp Val Ile Ser Thr Ser Glu Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Thr65 70 7580Asp Cys Asp Pro Val Phe Val Thr Glu Tyr Tyr Ser Val Lys Asp Lys85 90 95Thr Ala Ile Ala Gly Leu Phe Thr Asp Thr Thr Lys Lys Gln Asn Thr100 105 110Ser Lys Met Cys Thr Leu Asn Ile Glu Val Lys Cys Asn Ala Glu Thr115 120 125Glu Pro Val Leu Ile Gly Asn Phe Thr Arg Val Pro Glu Lys Ala Ser130 135 140Thr His Ala Glu Asn Phe Thr Leu Ile Gly Asn Cys Leu Ser Asp Leu145 150 155 160His Leu Tyr Ile Ala Tyr Val Asn Thr Asp Glu Glu Phe Glu Glu Asp165 170 175Thr Ala Thr Val His Ile Gly Asn Lys Leu Asp Ile Asn Gly Ile Pro180 185 190Pro Asn Met Cys Ala Thr Arg Thr Ile Asn195 200<210>9<211>1047<212>DNA<213>天花主要病毒菌株Bangladesh<220>
<221>基因<222>(1)..(1047)<223>基因G2R<400>9atgaagtccg tattatactt gtatatattg tttctctcat gtataataaa cggaagagat 60gcagcaccgt atacaccacc caatggaaag tgtaaagaca ccgaatacaa acgccataat 120ctgtgttgtt tatcgtgtcc tccgggaaca tacgcttcca gattatgtga tagcaagact 180aacacacaat gtacaccgtg tggttcgggt acctttacat ctcgcaataa tcatttaccc 240gcttgtctaa gttgtaacgg aagatgcaat agtaatcagg tagagacgcg atcgtgtaac 300acgactcaca atagaatctg tgaatgctct cccggatatt attgtcttct taaaggatca 360tccggatgca aggcatgtgt ttcccaaaca aaatgtggaa taggatacgg agtatccgga 420cacacgtctg ttggagacgt catctgttct ccgtgtggtt tcggaacata ttctcacacc 480gtctcttccg cagataaatg cgaacccgta cccaacaata catttaacta tatcgatgtg 540gaaattacac tgtatccagt taacgacaca tcgtgtactc ggacgaccac taccggtctc 600agcgaatcca tcttaacgtc ggaactaact attactatga atcatacaga ttgcaatccc 660
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(348)<223>細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B(CrmB)<400>10Met Lys Ser Val Leu Tyr Leu Tyr Ile Leu Phe Leu Ser Cys Ile Ile15 10 15Asn Gly Arg Asp Ala Ala Pro Tyr Thr Pro Pro Asn Gly Lys Cys Lys20 25 30Asp Thr Glu Tyr Lys Arg His Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro Pro35 40 45Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln Cys50 55 60Thr Pro Cys Gly Ser Gly Thr Phe Thr Ser Arg Asn Asn His Leu Pro65 70 75 80Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asn Ser Asn Gln Val Glu Thr85 90 95Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg Ile Cys Glu Cys Ser Pro Gly100 105 110Tyr Tyr Cys Leu Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys Lys Ala Cys Val Ser115 120 125Gln Thr Lys Cys Gly Ile Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Ser Val130 135 140Gly Asp Val Ile Cys Ser Pro Cys Gly Phe Gly Thr Tyr Ser His Thr145 150 155 160Val Ser Ser Ala Asp Lys Cys Glu Pro Val Pro Asn Asn Thr Phe Asn165 170 175Tyr Ile Asp Val Glu Ile Thr Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser Cys180 185 190Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Leu Thr Ser Glu195 200 205Leu Thr Ile Thr Met Asn His Thr Asp Cys Asn Pro Val Phe Arg Glu210 215 220Glu Tyr Phe Ser Val Leu Asn Lys Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe Thr225 230 235 240Gly Glu Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr Leu Asn Phe245 250 255Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Gly Ser Ser Phe Lys Gln Leu Thr Lys260 265 270
Ala Lys Asn Asp Asp Gly Met Met Ser His Ser Glu Thr Val Thr Leu275 280 285Ala Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile Leu Tyr Ser Asn290 295 300Thr Asn Ala Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser Tyr Arg Val Gly305 310 315 320Asn Val Leu Asp Asp Asp Ser His Met Pro Gly Ser Cys Asn Ile His325 330 335Lys Pro Ile Thr Asn Ser Lys Pro Thr Arg Phe Leu340 345<210>11<211>1068<212>DNA<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>基因<222>(1)..(1068)<223>基因V005<400>11atgaagtcat atatattgct attgctgctt tcatgtataa tcataataaa cagcgatata 60acaccgcatg aaccatccaa cggaaagtgt aaagacaacg aatacaaacg ccatcatcta 120tgttgtttat cgtgtcctcc gggaacatac gcttccagat tatgcgatag caagactaac 180acaaacacac aatgtacgcc gtgtgcgtcg gacaccttta cgtctcgcaa taatcattta 240cccgcttgtc taagttgtaa cggaagatgc gatagtaatc aggtagagac gcgatcgtgt 300aacacgactc acaatagaat ctgtgattgt gctcccggat attattgttt tctcaaagga 360tcatccggat gcaaggcatg tgtttcccaa acaaagtgtg gaataggata cggagtatcc 420ggacacacgc ctaccggaga cgtcgtctgt tctccgtgtg gtctcggaac atattctcac 480accgtctctt ccgtagataa atgcgaaccc gtacccagta atacctttaa ctatatcgat 540gtggaaatta atctgtatcc cgtcaacgac acatcgtgta ctcggacgac cactaccggt 600ctcagtgaat ccatctcaac ttcggaacta acgattacta tgaatcataa agactgcgat 660cccgtctttc gtaatggata cttctccgtt cttaatgagg tagcaacttc agggttcttt 720acaggacaaa atagatatca gaatatttca aaggtatgca ctctgaattt cgagattaaa 780tgtaataaca aagattctta ttcttcctcc aaacagttaa cgaaaacaaa gaatgatgac 840gactccatca tgccgcattc ggaatcggta actctagtgg gcgactgtct atccagcgtc 900gacatctata tactatatag taataccaat actcaagact acgaaactga tacaatctct 960tatcatgtgg gtaatgttct cgatgtcgat agccatatgc ccggtaggtg cgatacacat 1020aaactgatta ctaattccaa ttcccagtat cccacccact ttttatag 1068<210>12<211>355<212>PRT<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(355)<223>細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B(CrmB)<400>12
Met Lys Ser Tyr Ile Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Ile Ile Ile Ile1 5 10 15Asn Ser Asp Ile Thr Pro His Glu Pro Ser Asn Gly Lys Cys Lys Asp20 25 30Asn Glu Tyr Lys Arg His His Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro Pro Gly35 40 45Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Asn Thr Gln50 55 60Cys Thr Pro Cys Ala Ser Asp Thr Phe Thr Ser Arg Asn Asn His Leu65 70 75 80Pro Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asp Ser Asn Gln Val Glu85 90 95Thr Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg Ile Cys Asp Cys Ala Pro100 105 110Gly Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys Lys Ala Cys Val115 120 125Ser Gln Thr Lys Cys Gly Ile Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Pro130 135 140Thr Gly Asp Val Val Cys Ser Pro Cys Gly Leu Gly Thr Tyr Ser His145 150 155 160Thr Val Ser Ser Val Asp Lys Cys Glu Pro Val Pro Ser Asn Thr Phe165 170 175Asn Tyr Ile Asp Val Glu Ile Asn Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser180 185 190Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ser195 200 205Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Lys Asp Cys Asp Pro Val Phe Arg210 215 220Asn Gly Tyr Phe Ser Val Leu Asn Glu Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe225 230 235 240Thr Gly Gln Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr Leu Asn245 250 255Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Asp Ser Tyr Ser Ser Ser Lys Gln260 265 270Leu Thr Lys Thr Lys Asn Asp Asp Asp Ser Ile Met Pro His Ser Glu275 280 285Ser Val Thr Leu Val Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile290 295 300Leu Tyr Ser Asn Thr Asn Thr Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser305 310 315 320Tyr His Val Gly Asn Val Leu Asp Val Asp Ser His Met Pro Gly Arg325 330 335Cys Asp Thr His Lys Leu Ile Thr Asn Ser Asn Ser Gln Tyr Pro Thr340 345 350His Phe Leu355<210>13<211>582<212>DNA<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>基因<222>(1)..(582)<223>基因V218<400>13atgatgatat acggattaat agcctgtctt atattcgtga cttcatccac cgctagtccc 60ctttacattc ccgttattcc acccattacg gaagataaat cgtttaatag tgtagaggta 120ttagtttcct tgtttagaga tgagcaaaaa gactatactg taacttcgca gttcaataac 180tacactatcg ataccaaaga ctggactatc aacgtactat ccacacctga tggtctggag 240ataccattga ccaatataac ttattggtca cggtttccaa ctataggtca tgcattgttc 300aaatcagagt ccgaggatat cttccaaaag aacatgagta ttctaggtgt ctctattgaa 360tgtaagaagc catcgacatc atttactttt ttgaccgtgc gtaaaatatc tcgagtattt 420aatagatttc cagatatggc ttactatcga ggagactgtc tagaagtcgt ttatgtaaca 480atgacttata aaaatactaa aactggagag actgattaca catacctctc taatgtgggg 540attcctgaat actatcggtt gatgagtggt gtcgatggtt ga582<210>14<211>193<212>PRT<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(193)<223>CTD-3<400>14Met Met Ile Tyr Gly Leu Ile Ala Cys Leu Ile Phe Val Thr Ser Ser1 5 10 15Thr Ala Ser Pro Leu Tyr Ile Pro Val Ile Pro Pro Ile Thr Glu Asp20 25 30Lys Ser Phe Asn Ser Val Glu Val Leu Val Ser Leu Phe Arg Asp Glu35 40 45Gln Lys Asp Tyr Thr Val Thr Ser Gln Phe Asn Asn Tyr Thr Ile Asp50 55 60Thr Lys Asp Trp Thr Ile Asn Val Leu Ser Thr Pro Asp Gly Leu Glu65 70 75 80Ile Pro Leu Thr Asn Ile Thr Tyr Trp Ser Arg Phe Pro Thr Ile Gly85 90 95His Ala Leu Phe Lys Ser Glu Ser Glu Asp Ile Phe Gln Lys Asn Met100 105 110Ser Ile Leu Gly Val Ser Ile Glu Cys Lys Lys Pro Ser Thr Ser Phe115 120 125Thr Phe Leu Thr Val Arg Lys Ile Ser Arg Val Phe Asn Arg Phe Pro130 135 140Asp Met Ala Tyr Tyr Arg Gly Asp Cys Leu Glu Val Val Tyr Val Thr145 150 155 160Met Thr Tyr Lys Asn Thr Lys Thr Gly Glu Thr Asp Tyr Thr Tyr Leu165 170 175Ser Asn Val Gly Ile Pro Glu Tyr Tyr Arg Leu Met Ser Gly Val Asp180 185 190Gly
<210>15<211>573<212>DNA<213>牛痘病毒菌株Western Reserve<220>
<221>基因<222>(1)..(573)<223>基因VACWR206<400>15atgatgatat acggattaat agcgtgtctt atattcgtga cttcatccat cgctagtcca 60ctttatattc ccgttattcc acccatttcg gaagataaat cgttcaatag tgtagaggta 120ttagtttcct tgtttagaga tgaccaaaaa gactatacgg taacttctca gttcaataac 180tacactatcg ataccaaaga ctggactatc ggcgtactat ccacacctga tggtttggat 240ataccattga ctaatataac ttattggtca cggtttacta taggtcgtgc attgttcaaa 300tcagagtctg aggatatttt ccaaaagaaa atgagtattc taggtgtttc tatagaatgt 360aagaagtcgt cgacattact tacttttttg accgtgcgta aaatgactcg agtatttaat 420aaatttccag atatggctta ttatcgagga gactgtttaa aagccgttta tgtaacaatg 480acttataaaa atactaaaac tggagagact gattacacgt acctctctaa tggggggttg 540cctgcatact atcgtaatgg ggtcgatggt tga 573<210>16<211>190<212>PRT<213>牛痘病毒菌株Western Reserve<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(190)<223>CTD-3<400>16Met Met Ile Tyr Gly Leu Ile Ala Cys Leu Ile Phe Val Thr Ser Ser1 5 10 15Ile Ala Ser Pro Leu Tyr Ile Pro Val Ile Pro Pro Ile Ser Glu Asp20 25 30Lys Ser Phe Asn Ser Val Glu Val Leu Val Ser Leu Phe Arg Asp Asp35 40 45Gln Lys Asp Tyr Thr Val Thr Ser Gln Phe Asn Asn Tyr Thr Ile Asp50 55 60Thr Lys Asp Trp Thr Ile Gly Val Leu Ser Thr Pro Asp Gly Leu Asp65 70 75 80Ile Pro Leu Thr Asn Ile Thr Tyr Trp Ser Arg Phe Thr Ile Gly Arg85 90 95Ala Leu Phe Lys Ser Glu Ser Glu Asp Ile Phe Gln Lys Lys Met Ser100 105 110Ile Leu Gly Val Ser Ile Glu Cys Lys Lys Ser Ser Thr Leu Leu Thr115 120 125Phe Leu Thr Val Arg Lys Met Thr Arg Val Phe Asn Lys Phe Pro Asp130 135 140Met Ala Tyr Tyr Arg Gly Asp Cys Leu Lys Ala Val Tyr Val Thr Met145 150 155 160
Thr Tyr Lys Asn Thr Lys Thr Gly Glu Thr Asp Tyr Thr Tyr Leu Ser165 170 175Asn Gly Gly Leu Pro Ala Tyr Tyr Arg Asn Gly Val Asp Gly180 185 190<210>17<211>549<212>DNA<213>牛痘病毒菌株Western Reserve<220>
<221>基因<222>(1)..(549)<223>基因VACWR189<400>17atgtataaaa aactaataac gtttttattt gtaataggtg cattagcatc ctattcgaat 60aatgagtaca ctccgtttaa taaactgagt gtaaaactct atatagatgg agtagataat 120atagaaaatt catatactga tgataataat gaattggtgt taaattttaa agagtacaca 180atttctatta ttacagagtc atgcgacgtc ggatttgatt ccatagatat agatgttata 240aacgactata aaattattga tatgtatacc attgactcgt ctactattca acgcagaggt 300cacacgtgta gaatatctac caaattatca tgccattatg ataagtaccc ttatattcac 360aaatatgatg gtgatgagcg acaatattct attactgcag agggaaaatg ctataaagga 420ataaaatatg aaataagtat gatcaacgat gatactctat tgagaaaaca tactcttaaa 480attggatcta cttatatatt tgatcgtcat ggacatagta atacatatta ttcaaaatat 540gatttttaa 549<210>18<211>182<212>PRT<213>牛痘病毒菌株Western Reserve<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(182)<223>CTD-2<400>18Met Tyr Lys Lys Leu Ile Thr Phe Leu Phe Val Ile Gly Ala Leu Ala1 5 10 15Ser Tyr Ser Asn Asn Glu Tyr Thr Pro Phe Asn Lys Leu Ser Val Lys20 25 30Leu Tyr Ile Asp Gly Val Asp Asn Ile Glu Asn Ser Tyr Thr Asp Asp35 40 45Asn Asn Glu Leu Val Leu Asn Phe Lys Glu Tyr Thr Ile Ser Ile Ile50 55 60Thr Glu Ser Cys Asp Val Gly Phe Asp Ser Ile Asp Ile Asp Val Ile65 70 75 80Asn Asp Tyr Lys Ile Ile Asp Met Tyr Thr Ile Asp Ser Ser Thr Ile85 90 95Gln Arg Arg Gly His Thr Cys Arg Ile Ser Thr Lys Leu Ser Cys His100 105 110Tyr Asp Lys Tyr Pro Tyr Ile His Lys Tyr Asp Gly Asp Glu Arg Gln115 120 125
Tyr Ser Ile Thr Ala Glu Gly Lys Cys Tyr Lys Gly Ile Lys Tyr Glu130 135 140Ile Ser Met Ile Asn Asp Asp Thr Leu Leu Arg Lys His Thr Leu Lys145 150 155 160Ile Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Asp Arg His Gly His Ser Asn Thr Tyr165 170 175Tyr Ser Lys Tyr Asp Phe180<210>19<211>546<212>DNA<213>鼠痘病毒菌株Naval<220>
<221>基因<222>(1)..(546)<223>基因E184<400>19atgtataaaa aactaataac gtttttattt gtaataggtg cagtagcatc ttattcgaat 60aatgagtaca ctccgtttaa taaacttagt gtaaaactgt atatagatgg agtagataat 120atagaaaatt catatactga taataatgaa ttggtgttaa attttaaaga gtacacaatt 180tctattatta cagagtcatg cgacgtcgga tttgattcca tagatataga tgttataaac 240gactataaaa ttcttgatat gtataccatt gactcgtcta ccattcaacg cagaggtcac 300acatgcaaaa tatctaccaa attatcatgc cattatgata agcaccctta tattcacaaa 360tatgagggtg atgagcgaca atattctatt actgcagagg gaaaatgcta taaaggaata 420aaatatgaaa taagtatgat gcacgatgat acgctattga gaaaacatac tcttaaaatt 480ggatctactt atatattcga tcgccatgga catagtaata catattattc aaaatatgat 540ttttaa546<210>20<211>181<212>PRT<213>鼠痘病毒菌株Naval<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(181)<223>CTD-2<400>20Met Tyr Lys Lys Leu Ile Thr Phe Leu Phe Val Ile Gly Ala Val Ala15 10 15Ser Tyr Ser Asn Asn Glu Tyr Thr Pro Phe Asn Lys Leu Ser Val Lys20 25 30Leu Tyr Ile Asp Gly Val Asp Asn Ile Glu Asn Ser Tyr Thr Asp Asn35 40 45Asn Glu Leu Val Leu Asn Phe Lys Glu Tyr Thr Ile Ser Ile Ile Thr50 55 60Glu Ser Cys Asp Val Gly Phe Asp Ser Ile Asp Ile Asp Val Ile Asn65 70 75 80Asp Tyr Lys Ile Leu Asp Met Tyr Thr Ile Asp Ser Ser Thr Ile Gln85 90 95Arg Arg Gly His Thr Cys Lys Ile Ser Thr Lys Leu Ser Cys His Tyr100 105 110
Asp Lys His Pro Tyr Ile His Lys Tyr Glu Gly Asp Glu Arg Gln Tyr115 120 125Ser Ile Thr Ala Glu Gly Lys Cys Tyr Lys Gly Ile Lys Tyr Glu Ile130 135 140Ser Met Met His Asp Asp Thr Leu Leu Arg Lys His Thr Leu Lys Ile145 150 155 160Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Asp Arg His Gly His Ser Asn Thr Tyr Tyr165 170 175Ser Lys Tyr Asp Phe180<210>21<211>480<212>DNA<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>C區(qū)<222>(1)..(480)<223>來自細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物D(CmrD)的CTD<400>21tcctttaaca gcatagatgt agaaattaat atgtatcctg ttaacaagac ctcttgtaat 60tcgagtatag gaagtagcag taccatatca acttccgagt taacaattac tctaaaacat 120gaggattgta ctactgtctt tattggagat tactattcag tcgttgataa actagcaact 180tcaggtttct ttacaaacga taaagtacat caagacctca caacgcagtg caagattaat 240ctagaaatca aatgtaattc tggaggagaa tctagacaac taacacccac gacgaaggta 300tactttatgc ctcattcaga aacggtaact gtggtaggag actgtctctc taatctcgat 360gtctatatag tatatgccaa tacggacgcg atatattccg acatggatgt cgtcgcttat 420catactagtt atatactaaa tgttgatcat attccaccaa atgattgtga aagagattga 480<210>22<211>159<212>PRT<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)..(159)<223>來自細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物D(CrmD)的CTD<400>22Ser Phe Asn Ser Ile Asp Val Glu Ile Asn Met Tyr Pro Val Asn Lys15 10 15Thr Ser Cys Asn Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr Ser20 25 30Glu Leu Thr Ile Thr Leu Lys His Glu Asp Cys Thr Thr Val Phe Ile35 40 45Gly Asp Tyr Tyr Ser Val Val Asp Lys Leu Ala Thr Ser Gly Phe Phe50 55 60Thr Asn Asp Lys Val His Gln Asp Leu Thr Thr Gln Cys Lys Ile Asn65 70 75 80Leu Glu Ile Lys Cys Asn Ser Gly Gly Glu Ser Arg Gln Leu Thr Pro85 90 95Thr Thr Lys Val Tyr Phe Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr Val Val100 105 110
Gly Asp Cys Leu Ser Asn Leu Asp Val Tyr Ile Val Tyr Ala Asn Thr115 120 125Asp Ala Ile Tyr Ser Asp Met Asp Val Val Ala Tyr His Thr Ser Tyr130 135 140Ile Leu Asn Val Asp His Ile Pro Pro Asn Asp Cys Glu Arg Asp145 150 155<210>23<211>477<212>DNA<213>鼠痘病毒菌株Naval<220>
<221>C區(qū)<222>(1)..(477)<223>來自細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物D(CrmD)的CTD<400>23tcctttaaca gcatagatgt agaaattaat atgtatcctg ttaacaagac ctcttgtaat 60tcgagtatag gaagcagcag taccatatca acttccgagt taacaattac tctaacacat 120gaggattgta ctcctgtctt tattggagat tactattcag tcgttgataa actagcaact 180tcaggtttct ttacaaacga taaagtacat caagacctca caacgcagtg caagattaat 240ctagaaatca aatgtaattc tggaagagaa tctagacaac taacacccac gacgaaggta 300taccttatgc ctcattcaga aacggtaact gtggtaggag actgtctctc taatctcgat 360gtctatatag tatatgccaa tacggacgcg atatattccg acatggacgt cgtcgcgtat 420catactagtt atatactaaa tgttgatcat attccaccaa atgattgtga aagagat477<210>24<211>159<212>PRT<213>鼠痘病毒菌株Naval<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)..(159)<223>來自細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物D(CrmD)的CTD<400>24ser Phe Asn Ser Ile Asp Val Glu Ile Asn Met Tyr Pro Val Asn Lys1 5 10 15Thr Ser Cys Asn Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr Ser20 25 30Glu Leu Thr Ile Thr Leu Thr His Glu Asp Cys Thr Pro Val Phe Ile35 40 45Gly Asp Tyr Tyr Ser Val Val Asp Lys Leu Ala Thr Ser Gly Phe Phe50 55 60Thr Asn Asp Lys Val His Gln Asp Leu Thr Thr Gln Cys Lys Ile Asn65 70 75 80Leu Glu Ile Lys Cys Asn Ser Gly Arg Glu Ser Arg Gln Leu Thr Pro85 90 95Thr Thr Lys Val Tyr Leu Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr Val Val100 105 110Gly Asp Cys Leu Ser Asn Leu Asp Val Tyr Ile Val Tyr Ala Asn Thr115 120 125
Asp Ala Ile Tyr Ser Asp Met Asp Val Val Ala Tyr His Thr Ser Tyr130 135 140Ile Leu Asn Val Asp His Ile Pro Pro Asn Asp Cys Glu Arg Asp145 150 155<210>25<211>546<212>DNA<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>C區(qū)<222>(1)..(546)<223>細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B(CrmB)的CTD<400>25acctttaact atatcgatgt ggaaattaat ctgtatcccg tcaacgacac atcgtgtact 60cggacgacca ctaccggtct cagtgaatcc atctcaactt cggaactaac gattactatg 120aatcataaag actgcgatcc cgtctttcgt aatggatact tctccgttct taatgaggta 180gcaacttcag ggttctttac aggacaaaat agatatcaga atatttcaaa ggtatgcact 240ctgaatttcg agattaaatg taataacaaa gattcttatt cttcctccaa acagttaacg 300aaaacaaaga atgatgacga ctccatcatg ccgcattcgg aatcggtaac tctagtgggc 360gactgtctat ccagcgtcga catctatata ctatatagta ataccaatac tcaagactac 420gaaactgata caatctctta tcatgtgggt aatgttctcg atgtcgatag ccatatgccc 480ggtaggtgcg atacacataa actgattact aattccaatt cccagtatcc cacccacttt 540ttatag546<210>26<211>181<212>PRT<213>牛痘病毒菌株Brighton Red<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)..(181)<223>細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B(CrmB)的CTD<400>26Thr Phe Asn Tyr Ile Asp Val Glu Ile Asn Leu Tyr Pro Val Asn Asp1 5 10 15Thr Ser Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Ser20 25 30Thr Ser Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Lys Asp Cys Asp Pro Val35 40 45Phe Arg Asn Gly Tyr Phe Ser Val Leu Asn Glu Val Ala Thr Ser Gly50 55 60Phe Phe Thr Gly Gln Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr65 70 75 80Leu Asn Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Asp Ser Tyr Ser Ser Ser85 90 95Lys Gln Leu Thr Lys Thr Lys Asn Asp Asp Asp Ser Ile Met Pro His100 105 110Ser Glu Ser Val Thr Leu Val Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile115 120 125Tyr Ile Leu Tyr Ser Asn Thr Asn Thr Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr130 135 140
Ile Ser Tyr His Val Gly Asn Val Leu Asp Val Asp Ser His Met Pro145 150 155 160Gly Arg Cys Asp Thr His Lys Leu Ile Thr Asn Ser Asn Ser Gln Tyr165 170 175Pro Thr His Phe Leu180<210>27<211>528<212>DNA<213>天花主要病毒菌株Bangladesh<220>
<221>C區(qū)<222>(1)..(528)<223>細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B(CrmB)的CTD<400>27acatttaact atatcgatgt ggaaattaca ctgtatccag ttaacgacac atcgtgtact 60cggacgacca ctaccggtct cagcgaatcc atcttaacgt cggaactaac tattactatg 120aatcatacag attgcaatcc cgtatttcgt gaggaatact tctctgtcct taataaggta 180gcaacttcag gattttttac aggagaaaat agatatcaaa atatttcaaa ggtgtgtact 240ttaaattttg agattaaatg taataacaaa ggttcttcct tcaaacagct aacgaaagca 300aagaatgatg acggtatgat gtcgcattcg gagacggtaa ctctagcggg tgactgtcta 360tctagcgtcg acatctatat actatatagt aataccaatg ctcaagacta cgaaactgat 420acaatctctt atcgtgtggg taatgttctc gatgatgata gccatatgcc cggtagttgc 480aatatacata aaccgatcac taattccaaa cccacccgct ttttatag 528<210>28<211>175<212>PRT<213>天花主要病毒菌株Bangladesh<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)..(175)<223>細(xì)胞因子應(yīng)答修飾物B(CrmB)的CTD<400>28Thr Phe Asn Tyr Ile Asp Val Glu Ile Thr Leu Tyr Pro Val Asn Asp1 5 10 15Thr Ser Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Leu20 25 30Thr Ser Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Thr Asp Cys Asn Pro Val35 40 45Phe Arg Glu Glu Tyr Phe Ser Val Leu Asn Lys Val Ala Thr Ser Gly50 55 60Phe Phe Thr Gly Glu Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr65 70 75 80Leu Asn Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Gly Ser Ser Phe Lys Gln85 90 95Leu Thr Lys Ala Lys Asn Asp Asp Gly Met Met Ser His Ser Glu Thr100 105 110Val Thr Leu Ala Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile Leu115 120 125
Tyr Ser Asn Thr Asn Ala Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser Tyr130 135 140Arg Val Gly Asn Val Leu Asp Asp Asp Ser His Met Pro Gly Ser Cys145 150 155 160Asn Ile His Lys Pro Ile Thr Asn Ser Lys Pro Thr Arg Phe Leu165 170 17權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)合趨化因子和它們的類似物和/或提高TNFR的免疫調(diào)節(jié)性的病毒腫瘤壞死因子受體(vTNFR)CrmB或CrmD的C-末端結(jié)構(gòu)域(CTD)或來自痘病毒的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)以及它們的功能性同源物，包括它們的衍生物和片段。
2.一種用于阻斷趨化因子與它們的相應(yīng)細(xì)胞表面受體的結(jié)合和/或調(diào)節(jié)趨化因子生物學(xué)活性的vTNFR CrmB或CrmD的CTD或來自痘病毒的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)以及它們的功能性同源物，包括它們的衍生物、和片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的來自CrmB的CTD，其中所述來自CrmB的CTD包含SEQ ID N°26或SEQ ID N°28。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的來自CrmD的CTD，其中所述來自CrmD的CTD包含SEQ ID N°22或SEQ ID N°24。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的CTD同源物，其中所述CTD包含SEQ ID N°8、SEQ ID N°14、SEQ ID N°6、SEQ ID N°20、SEQ ID N°18或SEQ ID N°16，或者包含由基因V201、D12L、B6R或B21R編碼的蛋白質(zhì)中的任一個(gè)。
6.一種融合多肽，包含融合至相同來源或其他來源的根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD或CTD同源物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含融合至vTNFR的N-末端TNF結(jié)合結(jié)構(gòu)域的根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一個(gè)所述的CTD。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的融合多肽，其中所述TNFR是人類來源的。
9.一種多核苷酸，包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD或CTD同源物或根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的的融合多肽的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的多核苷酸，包含表達(dá)盒，其中所述序列表達(dá)自組織特異性或組成型啟動(dòng)子。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中所述序列形成病毒載體或表達(dá)質(zhì)粒的一部分。
12.一種用于在體內(nèi)結(jié)合趨化因子或趨化因子類似物的藥物組合物，包括分別根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD和/或CTD同源物；和/或根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的融合多肽；和/或根據(jù)權(quán)利要求10和11所述的表達(dá)盒和/或病毒載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，用于在體內(nèi)阻斷趨化因子與相應(yīng)的細(xì)胞表面趨化因子受體的結(jié)合或抑制趨化因子的生物學(xué)活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求12-13任一項(xiàng)所述的藥物組合物，用于產(chǎn)生抗炎作用。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其包含另外的免疫抑制劑或抗炎物質(zhì)。
16.一種檢測試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD和經(jīng)標(biāo)記或固定的反應(yīng)物，用于在體外檢測或測量趨化因子、趨化因子類似物或趨化因子受體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD或CTD同源物、和/或根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的融合多肽、和/或根據(jù)權(quán)利要求10和11任一項(xiàng)的表達(dá)盒和/或病毒載體分別在制備用于給予受治者以產(chǎn)生抗炎作用的藥物中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD或CTD同源物在制備用于給予受治者以結(jié)合存在于病毒或寄生蟲中的趨化因子類似物從而阻斷所述病毒或寄生蟲進(jìn)入細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
19.通過滅活或缺失根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD同源物的至少一個(gè)和/或vTNFR進(jìn)行的牛痘病毒疫苗的減毒。
20.用于治療由牛痘病毒疫苗接種引起的不良作用和/或由人類天花中天花病毒引起的病癥的藥物的應(yīng)用和制備，其是基于對CTD同源物或vTNFR的抗體的誘導(dǎo)，或者使用抑制根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD同源物或vTNFR的趨化因子結(jié)合活性的抗體或試劑。
21.一種檢測包含趨化因子或趨化因子類似物的方法，其是基于將可能包含所述待檢測物質(zhì)的樣品與包含根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的CTD或CTD同源物的試劑進(jìn)行接觸，由此結(jié)合所述趨化因子或趨化因子類似物。
全文摘要
病毒TNF受體和相關(guān)蛋白質(zhì)的趨化因子結(jié)合活性。本發(fā)明涉及病毒腫瘤壞死因子受體(vTNFR)CrmB或CrmD的C－末端結(jié)構(gòu)域(CTD)或來自痘病毒的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)，和它們的功能性同源物，包括衍生物和片段，用于結(jié)合趨化因子和它們的類似物、和/或提高TNFR的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)或阻斷趨化因子與其相應(yīng)的細(xì)胞表面受體的結(jié)合、和/或調(diào)節(jié)趨化因子生物學(xué)活性。
文檔編號C12N15/62GK101044158SQ200580036130
公開日2007年9月26日 申請日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月2日
發(fā)明者安東尼奧·阿爾卡米佩特霍, 阿里·阿萊霍赫貝格, 瑪麗亞貝戈尼亞·魯伊斯－阿爾蓋洛, 因·霍, 馬加里達(dá)·薩賴瓦, 維森特·P·史密斯 申請人:安東尼奧·阿爾卡米佩特霍