專利名稱：多rna聚合酶ⅲ啟動(dòng)子表達(dá)構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的通用領(lǐng)域是新的重組DNA分子的使用方法和組合物，所述 重組DNA分子具有能有效地指導(dǎo)(在細(xì)胞、組織或生物體內(nèi))大量產(chǎn)生 小的、經(jīng)遺傳學(xué)加工的RNA分子的能力，所述RNA分子能用于抑制涉
及疾病或異常細(xì)胞功能的基因。具體地，本發(fā)明提供了用于利用適用于 人類治療性應(yīng)用的設(shè)計(jì)從單個(gè)重組DNA分子中同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)(2、 3、 4、 5或更多個(gè))不同的小RNA分子的方法。
背景技術(shù)：
最近，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了 RNAi或雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn) 象，其中與細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)的耙基因的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的dsRNA抑制了 靶基因的表達(dá)(見例如Fire等的1999年7月1日公開的WO 99/32619; 美國專利6,506,559:"雙鏈RNA的遺傳抑制"；Pachuk禾卩Satishchandran 的WO 00/63364:"用于抑制多核苷酸序列的功能的方法和組合物"；以 及2002年10月18日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/419,532 (2004年4月 29日公開的WO2004/035765:"雙鏈RNA結(jié)構(gòu)和構(gòu)建體、以及產(chǎn)生和使 用相同的雙鏈RNA的方法"))。雙鏈RNA (dsRNA)基因沉默提出了在 基于核酸的技術(shù)方面中的特別令人興奮的潛在應(yīng)用。雙鏈RNA已經(jīng)顯示
出能誘導(dǎo)多種不同生物體體內(nèi)的基因沉默?；虺聊梢酝ㄟ^不同的機(jī) 制發(fā)生，其中一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。在轉(zhuǎn)錄后基因沉默中，靶
基因座的轉(zhuǎn)錄是不受影響的，但是縮短了 RNA的半衰期。外源性RNA 已經(jīng)顯示出作用為植物和動(dòng)物(包括線蟲、錐蟲、昆蟲、和哺乳動(dòng)物)中 的PTGS的強(qiáng)誘導(dǎo)劑。轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的另一種機(jī) 制。在TGS中，基因轉(zhuǎn)錄受到了抑制。在PTGS中，沉默復(fù)合物裝置位 于細(xì)胞的細(xì)胞槳內(nèi)。在TGS中，效應(yīng)dsRNA在細(xì)胞的核部分是有表面 活性的。對(duì)于研究性的、治療性的、和預(yù)防性的適應(yīng)癥而言，利用dsRNA 介導(dǎo)的基因沉默的能力都是巨大的。靶mRNA降解的精確的序列特異性 以及與PTGS相關(guān)的系統(tǒng)性能都使得這個(gè)現(xiàn)象用于功能基因組和藥物開 發(fā)都是非常理想的。
目前一些用于利用dsRNA沉默脊椎動(dòng)物細(xì)胞的基因的方法造成了不 需要的非特異的細(xì)胞毒性或細(xì)胞死亡，因?yàn)閐sRNA介導(dǎo)的應(yīng)激應(yīng)答包括 白介素應(yīng)答。早期報(bào)道明確地提出了脊椎動(dòng)物中的dsRNA介導(dǎo)的毒性僅 僅與長度大于30bp的dsRNA有關(guān)，而與siRNA (21-23個(gè)bp的短的合成 的雙鏈dsRNA分子)或其它的小于30bp的雙鏈dsRNA無關(guān)。盡管早先 都接受這種觀點(diǎn)，但是最近的報(bào)道認(rèn)為外源性引入的siRNA分子也能發(fā) 生非特異的沉默效應(yīng)和其它的毒性，包括誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答途徑例如干 擾素應(yīng)答。但是，申請(qǐng)人已經(jīng)證實(shí)在不觸發(fā)dsRNA介導(dǎo)的毒性的條件下 可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)來自核酸表達(dá)構(gòu)建體的dsRNA分子，包括所報(bào)道的 能誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物細(xì)胞毒性的長dsRNA。見例如已公開的Satishchandran、 Pachuk、和Giordano的美國專利申請(qǐng)No. 2004/0152117。因此，長的和 短的dsRNA分子(包括dsRNA發(fā)夾分子)都可以用于哺乳動(dòng)物和其它脊 椎動(dòng)物，且不會(huì)誘導(dǎo)干擾素或其它dsRNA介導(dǎo)的應(yīng)激應(yīng)答，條件是dsRNA 分子是在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的，而不是外源性地引入到細(xì)胞內(nèi)的。但是， 仍存在著挑戰(zhàn)，實(shí)際完成這些dsRNA方法要求在細(xì)胞內(nèi)從dsRNA表達(dá) 構(gòu)建體中有效地產(chǎn)生并輸送dsRNA分子。對(duì)于RNAi應(yīng)用以及核酸在生物學(xué)活性的其它機(jī)制方面的用途，常 常需要從核酸表達(dá)構(gòu)建體中細(xì)胞內(nèi)地表達(dá)生物學(xué)活性核酸。這些方法的 有效性都依賴于在靶宿主細(xì)胞內(nèi)以治療相關(guān)的方式有效表達(dá)選定核酸的 能力，例如對(duì)體內(nèi)或體外的所需靶細(xì)胞為生物學(xué)活性的、無毒的形式， 以及在所需亞細(xì)胞部位中的有效量和持續(xù)時(shí)間。這都給難以轉(zhuǎn)染的和體
內(nèi)應(yīng)用的細(xì)胞帶來了特殊的挑戰(zhàn)，例如原代細(xì)胞、某些細(xì)胞株例如K5625 (一種人白血病細(xì)胞株)。在真核細(xì)胞內(nèi)，從核酸表達(dá)載體中細(xì)胞內(nèi)表達(dá)核 酸需要改良的表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)構(gòu)建體和方法。希望這些方法能用于提供 能夠?qū)崿F(xiàn)它們的各種生物功能中的任一功能的核酸，包括在體外樣品、 細(xì)胞培養(yǎng)物和完整動(dòng)物(例如脊椎動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物包括人)中產(chǎn)生所 需的多肽和/或所需的RNA效應(yīng)分子例如核酶、反義RNA、三鏈RNA、 禾口/或dsRNA。
從生物技術(shù)誕生的數(shù)十年來，已經(jīng)開發(fā)出了用于原核細(xì)胞和/或真核 細(xì)胞的大量的各種載體、表達(dá)構(gòu)建體、和表達(dá)系統(tǒng)，包括環(huán)型質(zhì)粒、線 型質(zhì)粒、質(zhì)體、病毒基因組、重組病毒基因組、人工染色體等。這些表 達(dá)系統(tǒng)在細(xì)菌培養(yǎng)物中的應(yīng)用使得這些重組蛋白例如干擾素(a)、干擾素 ((3)、促紅細(xì)胞產(chǎn)生素、VIII因子、人胰島素、t-PA、和人生長激素成為 了藥品庫的標(biāo)準(zhǔn)組成部分。
在生物技術(shù)和分子生物學(xué)領(lǐng)域己經(jīng)開發(fā)出的大量的各種表達(dá)載體和 表達(dá)系統(tǒng)中，有著在同一載體中含有多個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)。這種類型 的多啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)利用了含有在原核細(xì)胞內(nèi)或在真核細(xì)胞的同一亞細(xì) 胞區(qū)室內(nèi)具有活性的多個(gè)啟動(dòng)子(例如兩個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子)的載體。例 如，在本領(lǐng)域己經(jīng)開發(fā)出這種多啟動(dòng)子系統(tǒng)，以便容許在同一細(xì)胞的同 一區(qū)室內(nèi)表達(dá)超過一個(gè)的序列(例如兩個(gè)不同的序列或被設(shè)計(jì)成形成 dsRNA的有義和反義序列)，或者所述系統(tǒng)可以被用于在不同的細(xì)胞或生 物體(例如原核細(xì)胞和真核細(xì)胞)內(nèi)表達(dá)同一序列，或者被用于實(shí)現(xiàn)單個(gè) 可操縱地連接的序列的更有效的轉(zhuǎn)錄。常常看到的是，例如同一質(zhì)粒上
的多個(gè)RNA聚合酶II啟動(dòng)子或噬菌體啟動(dòng)子，例如兩個(gè)聚合酶II啟動(dòng)
子例如CMV和SV40,或者噬菌體T7啟動(dòng)子和噬菌體SP6啟動(dòng)子。
此外，這些多個(gè)啟動(dòng)子可以按任何數(shù)目的定向和構(gòu)型排列于載體內(nèi)。 例如，兩種啟動(dòng)子都可以指導(dǎo)載體的同一鏈或相反鏈的轉(zhuǎn)錄。如果定向 于同一鏈，它們則驅(qū)動(dòng)載體內(nèi)的同一方向上的轉(zhuǎn)錄。同樣地，多個(gè)啟動(dòng) 子可以被編碼于同一載體的相反鏈上，并且被彼此匯聚地或趨異地排列， 對(duì)于這種情況，在載體內(nèi)按相反的方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。此外，在本領(lǐng)域已經(jīng) 開發(fā)出各種術(shù)語來描述多個(gè)啟動(dòng)子在單個(gè)載體內(nèi)的相對(duì)位置。術(shù)語"串 聯(lián)的"已經(jīng)被用于描述所有啟動(dòng)子都位于所轉(zhuǎn)錄序列的5'末端并且所有 啟動(dòng)子都與所轉(zhuǎn)錄序列的5'末端可操縱地連接的多個(gè)啟動(dòng)子。串聯(lián)啟動(dòng) 子可以是相同的或不同的啟動(dòng)子。術(shù)語"側(cè)向的(flanking)"啟動(dòng)子描述 了多個(gè)啟動(dòng)子的定向，其中啟動(dòng)子位于所轉(zhuǎn)錄序列的5，和3'末端，這種 方式使得每種啟動(dòng)子(當(dāng)具有轉(zhuǎn)錄活性時(shí))都能轉(zhuǎn)錄所轉(zhuǎn)錄序列的其中 一條鏈的轉(zhuǎn)錄。側(cè)向啟動(dòng)子可以是相同的或不同的啟動(dòng)子，例如一組側(cè) 向于序列的5'和3'末端的噬菌體T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子是用于表達(dá)分離 的能形成雙鏈dsRNA的有義和反義鏈的常用方法(1999年7月1日公開 的Fire等的W099/32619)。
己經(jīng)描述了多個(gè)串聯(lián)啟動(dòng)子，例如在美國專利5,547,862中，描述了 包括位于兩個(gè)或兩個(gè)以上串聯(lián)啟動(dòng)子的下游的RNA轉(zhuǎn)錄序列的DNA載 體，所述啟動(dòng)子被不同的RNA聚合酶識(shí)別，并且每種都能啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn) 錄序列的表達(dá)。
在美國專利6,472,171中，描述了制備哺乳動(dòng)物膠原蛋白或前膠原的 方法，其利用包括相反定向的與一元或二元趨異異源啟動(dòng)子(singleordual, divergent heterologous promotor(s))可操縱地連接的兩個(gè)哺乳動(dòng)物膠原蛋 白基因的構(gòu)建體。驅(qū)動(dòng)兩個(gè)膠原蛋白基因的啟動(dòng)子可以是相同的啟動(dòng)子 或不同的啟動(dòng)子，以及可以被用于提供兩個(gè)膠原蛋白基因的協(xié)調(diào)的(優(yōu)選 地是同時(shí)的)表達(dá)。
美國專利6，117，651描述了含有串聯(lián)排列的并與編碼所需多肽的異
源核酸可操縱地連接的二元細(xì)菌啟動(dòng)子的表達(dá)載體。二元啟動(dòng)子包括第
一個(gè)源自tac相關(guān)性啟動(dòng)子(其本身是lac和trp啟動(dòng)子的組合)的組分， 以及第二個(gè)從編碼涉及半乳糖代謝的酶的細(xì)菌基因或操縱子中獲得的啟 動(dòng)子組分。二元細(xì)菌啟動(dòng)子系統(tǒng)協(xié)同作用，提供了原核細(xì)胞例如大腸桿 菌中的相連序列的高水平轉(zhuǎn)錄。
美國專利5,874,242描述了用于在真核和原核宿主細(xì)胞內(nèi)翻譯所插 入的編碼序列的載體。具體地，這些載體包括用于在原核和真核細(xì)胞內(nèi) 實(shí)現(xiàn)有效表達(dá)的雙功能啟動(dòng)子(在真核和原核細(xì)胞中都能發(fā)揮功能)或 二元啟動(dòng)子(在真核和原核細(xì)胞中分別發(fā)揮功能的啟動(dòng)子)。
本領(lǐng)域有著無數(shù)的其它實(shí)例，它們描述了關(guān)于用于同一載體的多個(gè) 啟動(dòng)子的內(nèi)容的變異。但是，對(duì)于人類的治療性應(yīng)用而言，仍然需要適 用于表達(dá)多個(gè)小RNA效應(yīng)分子(包括各種長度的多個(gè)dsRNA發(fā)夾例如 shRNAs、雙和多指dsRNA發(fā)夾、長dsRNA發(fā)夾等)的新型表達(dá)載體。 已知當(dāng)處于其中一細(xì)胞天然采用的用于表達(dá)正常存在的小RNA分子的 哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的控制之下時(shí)，載體指導(dǎo)的短RNA效應(yīng)分子(包括短發(fā) 夾dsRNA)的表達(dá)是最為有效的。這些啟動(dòng)子通常包括RNA聚合酶III 啟動(dòng)子家族。在文獻(xiàn)中還定義了三種主要的RNA聚合酶III啟動(dòng)子的亞 型l型、2型和3型。在編碼5s RNA (1型)、各種轉(zhuǎn)移RNA(2型)和 U6小核RNA (3型)的基因中都能找到各種類型啟動(dòng)子的原型化實(shí)例。 細(xì)胞也專用另一種啟動(dòng)子家族(經(jīng)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄的)轉(zhuǎn)錄小的結(jié)構(gòu) 性RNA，但是該家族的序列比RNA聚合酶III啟動(dòng)子有著更小的差異。 最后，RNA聚合酶II啟動(dòng)子被用于轉(zhuǎn)錄編碼蛋白的信使RNA分子，這 與如同上面所提及的小的結(jié)構(gòu)性和調(diào)節(jié)性RNA有所不同。本領(lǐng)域已知的 大多數(shù)啟動(dòng)子系統(tǒng)都利用RNA聚合酶II啟動(dòng)子，其對(duì)于產(chǎn)生小RNA并 非是最佳的。
本領(lǐng)域已經(jīng)描述了含有1個(gè)啟動(dòng)子的基于RNA聚合酶III啟動(dòng)子的載體(見，例如美國專利5，624，803， Noonberg等"In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom")。在Lee等的Nat. Biotechnol. 20:500-05 (2002)中可以找到關(guān)于基于U6的載體系統(tǒng)的描述。Yu等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-52 (2002)描述了包括T7和U6啟動(dòng)子的短雙鏈siRNA 的表達(dá)載體。Miyagishi和Taira的Nat. Biotechnol. 20:497-500 (2002)描 述了包括含有串聯(lián)的U6啟動(dòng)子的表達(dá)盒的短雙鏈siRNA的表達(dá)質(zhì)粒， 每個(gè)啟動(dòng)子都轉(zhuǎn)錄siRNA的有義或反義鏈，然后它們能退火形成雙鏈 siRNA。也描述了包括兩種這些基于U6的siRNA表達(dá)盒的表達(dá)質(zhì)粒。作 者認(rèn)為他們利用雙鏈siRNA表達(dá)盒是因?yàn)樗鼈兊姆€(wěn)定性與包括不穩(wěn)定回 文序列的產(chǎn)生莖環(huán)或發(fā)夾類型dsRNA的表達(dá)盒的穩(wěn)定性相當(dāng)。
為了使得短RNA表達(dá)載體系統(tǒng)能夠用于治療性應(yīng)用，其結(jié)構(gòu)和功能 就必須滿足一些標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于人體應(yīng)用，載體必須被設(shè)計(jì)成使得載體序列 和基因組序列之間以及載體本身內(nèi)出現(xiàn)的重組事件的可能性都被最小 化。載體和細(xì)胞基因組序列或載體本身內(nèi)的元件之間的序列相同的(或同 源的)區(qū)域使得這些事件成為可能。已經(jīng)開發(fā)出本發(fā)明的載體，以提供來 自多啟動(dòng)子的多個(gè)RNA表達(dá)盒(例如發(fā)夾dsRNA,包括以及雙指和/或 多指dsRNA表達(dá)盒)的用途。通過不同啟動(dòng)子元件的選擇，以及表達(dá)盒 在重組表達(dá)載體內(nèi)的間隔和定位可以進(jìn)行對(duì)這些多個(gè)RNAPol III啟動(dòng)子 載體的遺傳學(xué)加工，使得分子內(nèi)或分子間的重組事件的可能性最小化。 先前已經(jīng)描述了監(jiān)測(cè)這些重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性的檢測(cè)法(例如Focus 16:78, 1994, Gibco BRL Technical Bulletin (現(xiàn)在稱為Invitrogen公司))。令人驚訝 的是，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌發(fā)酵和真核細(xì)胞表達(dá)期間的質(zhì)粒穩(wěn)定性，盡管存 在著相同或相反定向的多個(gè)拷貝的回文的或發(fā)夾的序列，例如在多個(gè)(例 如2、 3、 4、 5)發(fā)夾dsRNA中所發(fā)現(xiàn)的，以及多個(gè)拷貝的聚合酶III啟 動(dòng)子序列，例如7SK及其變體。
本發(fā)明的多啟動(dòng)子部分是設(shè)計(jì)例如抗病毒藥物的關(guān)鍵性能，其中每
個(gè)啟動(dòng)子都控制獨(dú)立的RNA表達(dá)盒(例如shRNA表達(dá)盒)的表達(dá)，這是 因?yàn)椴《驹谌巳褐械囊约霸谒拗鲀?nèi)的短暫變異(由于突變事件)的性能。 例如，本發(fā)明的這個(gè)部分提供了用于往宿主脊椎動(dòng)物生物體的細(xì)胞或組 織內(nèi)輸送包括一些不同的dsRNA病毒抑制劑分子的多藥物療法的方法， 這樣使得病毒抑制水平是高的，并且可以使得病毒內(nèi)發(fā)生多個(gè)獨(dú)立的突 變事件以及造成dsRNA病毒復(fù)制抑制無效的可能性極小。

發(fā)明內(nèi)容
總體而言，本發(fā)明涉及新的核酸表達(dá)構(gòu)建體以及利用所述表達(dá)構(gòu)建 體制備生物學(xué)活性核酸(特別是短RNA效應(yīng)分子)的方法。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于表達(dá)短發(fā)夾RNA(shRNA)包括微RNA (miRNA)的方法和組合物，其中從同一載體內(nèi)的2、 3、 4、 5或更多個(gè)聚 合酶III啟動(dòng)子中同時(shí)產(chǎn)生這些分子的多個(gè)不同的形式。shRNA (短發(fā)夾 RNA)表示少于近400到500個(gè)核苷酸的RNA分子，優(yōu)選地少于100到 200個(gè)核苷酸，其中至少一串至少15到100個(gè)核苷酸(優(yōu)選地17到50 個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地19到29個(gè)核苷酸)與位于同一 RNA分子上的互補(bǔ) 序列形成堿基配對(duì)，以及其中所述序列和互補(bǔ)序列被至少約4到7個(gè)核 苷酸(優(yōu)選地約9到約15個(gè)核苷酸)的未配對(duì)區(qū)分離開，所述未配對(duì)區(qū) 形成了兩個(gè)堿基互補(bǔ)區(qū)所形成的莖結(jié)構(gòu)之上的單鏈環(huán)。ShRNA分子包括 至少一個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其包括約17到約100bp、約17到約50bp、約40 到約100bp、約18到約40bp;或從約19到約29bp的與所抑制的耙序列 同源和互補(bǔ)的雙鏈莖區(qū)；以及至少約4到7個(gè)核苷酸的、優(yōu)選地約9到 約15個(gè)核苷酸的未配對(duì)的環(huán)區(qū)，其形成了在兩個(gè)堿基互補(bǔ)區(qū)形成的莖結(jié) 構(gòu)之上的單鏈環(huán)。所包括的shRNA是二元的或雙指的和多指的發(fā)夾 dsRNA，其中RNA分子包括經(jīng)單鏈間隔區(qū)所分離開的兩個(gè)或兩個(gè)以上這 樣的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括多個(gè)RNA聚合酶III啟 動(dòng)子，優(yōu)選地包括人或哺乳動(dòng)物RNA聚合酶III啟動(dòng)子的載體組合物，
所述啟動(dòng)子控制與來自引起人體疾病的病毒的RNA序列同源的多個(gè)
shRNA分子的表達(dá)。多個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子可以是相同的或不同的 啟動(dòng)子。本發(fā)明提供了以遺傳學(xué)穩(wěn)定的模式往宿主細(xì)胞內(nèi)輸送治療量和 持久量的2、 3、 4、 5或更多個(gè)不同的抗病毒的dsRNA發(fā)夾分子的方法， 其抑制了利用2、 3、 4、 5、或更多個(gè)獨(dú)立的病毒序列元件的病毒復(fù)制， 且不觸發(fā)dsRNA應(yīng)激應(yīng)答。在一個(gè)方面，每個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子序 列與編碼不同的dsRNA發(fā)夾分子的序列可操縱地連接。在一個(gè)方面，所 述聚合酶III啟動(dòng)子中的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子都表達(dá)RNA轉(zhuǎn)錄物，其形成 了包括經(jīng)單鏈區(qū)分離的兩個(gè)或更多個(gè)shRNA (每種都包括一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)) 的雙指的或二元的dsRNA發(fā)夾分子。
在一個(gè)部分中，本發(fā)明涉及一種表達(dá)構(gòu)建體，其包括至少兩個(gè)不同 的RNA聚合酶III啟動(dòng)子，其中每個(gè)啟動(dòng)子與編碼RNA效應(yīng)分子的核酸 序列可操縱地連接。RNA效應(yīng)分子可以是任一相關(guān)的RNA，包括但不限 于shRNA、反義RNA、核酶RNA、形成三鏈的RNA、人工的高親和力 的RNA配體C適體)、短發(fā)夾雙鏈RNA、微RNA等。多個(gè)RNA效應(yīng)分 子可以相同或者不同；但是申請(qǐng)人用"至少兩個(gè)不同的RNA聚合酶III 啟動(dòng)子"表示啟動(dòng)子中至少有兩個(gè)是"不同的"啟動(dòng)子；至于不同的啟 動(dòng)子，申請(qǐng)人并不是指位于構(gòu)建體的不同部分中的同一啟動(dòng)子的兩個(gè)拷 貝。
在一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及如在圖4 (e)中所給出的新的聚合酶III 啟動(dòng)子序列。
序列說明
SEQ ID NO:l表示具有替代235-240位核苷酸而插入的Sal I限制性 位點(diǎn)的人7SK啟動(dòng)子的1-240位核苷酸。
SEQ ID NO:2表示具有替代376-381位核苷酸而插入的Sal I限制性 位點(diǎn)的人H1啟動(dòng)子的250-381位核苷酸。
SEQ ID NO:3表示具有替代330-335位核苷酸而插入的Sal I限制性 位點(diǎn)的人U6啟動(dòng)子的65-335位核苷酸。
SEQ ID NO:4表示具有替代245-250位核苷酸而插入的Sal I限制性 位點(diǎn)的人7SK啟動(dòng)子的1-250位核苷酸。
SEQ ID NO:5表示具有替代235-240位核苷酸而插入的Sal I限制性 位點(diǎn)以及添加于Sail限制性位點(diǎn)的3'端的4個(gè)腺嘌呤殘基的新的人7SK 啟動(dòng)子的1-244位核苷酸。
SEQ ID NO:6表示基于Hep-B的shRNA2791 。
SEQ ID NO:7表示基于Hep-B的shRNA1907。
SEQ IDNO:8表示基于Hep-B的shRNA1737。
SEQ ID NO:9表示基于Hep-B的shRNA799。
SEQ ID NO: 10表示基于Hep-B的shRNA1991。
SEQ ID NO: 11表示基于Hep-B的shRNA1943。


圖i是含有3個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子的三順反子質(zhì)粒載體的示意 圖，包括2個(gè)不同的原核RNA聚合酶III啟動(dòng)子，其控制3個(gè)不同的HBV 衍生的短發(fā)夾RNA分子的表達(dá)。7SK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)shRNA1737的表達(dá)， 一個(gè)U6啟動(dòng)子拷貝驅(qū)動(dòng)shRNA2791，以及第二個(gè)U6啟動(dòng)子拷貝驅(qū)動(dòng) shRNA1907的表達(dá)。在載體40中，7SK一1737轉(zhuǎn)錄單元被放置于與 U6一2791和U6—1907轉(zhuǎn)錄單元相同的功能方向上。在載體50中，7SK—1737 轉(zhuǎn)錄單元的方向是"逆向的"，使得轉(zhuǎn)錄的方向朝向U6—2791轉(zhuǎn)錄單元。
圖2是含有3個(gè)不同的真核細(xì)胞的RNA聚合酶III啟動(dòng)子的三順反 子質(zhì)粒載體的示意圖，其控制3個(gè)不同的HBV衍生的短發(fā)夾RNA分子 的表達(dá)。7SK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)shRNA1737的表達(dá)，U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)shRNA2791， 以及Hl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)shRNA1907的表達(dá)。在載體No.41中，7SK—1737轉(zhuǎn) 錄單元被放置于與U6—2791和HI—l卯7轉(zhuǎn)錄單元相同的功能方向上。在
載體No.51中，7SK—1737轉(zhuǎn)錄單元的方向是"逆向的"，使得轉(zhuǎn)錄的方 向朝向U6_2791轉(zhuǎn)錄單元。
圖3:結(jié)果顯示了通過表達(dá)三種不同的短dsRNA發(fā)夾分子的三順反 子構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染特異地降低了乙型肝炎的靶RNA水平。該檢測(cè)采用了合 成的RNA耙點(diǎn)，其融合了 HepB序列和功能性螢光素酶mRNA (詳細(xì)內(nèi) 容見文中的融合檢測(cè)法及合成構(gòu)建體)。
圖4a、 b、 c、 d、 e:分別用于本發(fā)明的三順反子構(gòu)建體的人7SK (GenBank⑧登記號(hào)X04992，堿基1-234 [a,e]，堿基1-244 [d])、人Hl (GenBank 登記號(hào)X16612，堿基250-375)和人U6 (GenBank 登記號(hào) M14486,堿基65-329)啟動(dòng)子的序列。用大寫顯示出了用于插入shRNA 序列的限制性位點(diǎn)(給出了SalI示例)。可以按需取代其它的限制性位點(diǎn) 序列。a和d中的7SK啟動(dòng)子分別代表來自堿基1-234和堿基1-244的天 然啟動(dòng)子，而e中的啟動(dòng)子是新的合成的改良啟動(dòng)子，其中用添加于限 制性位點(diǎn)的3'末端的4A殘基強(qiáng)化功能。
圖5:編碼本申請(qǐng)所述的載體所表達(dá)的基于HBV的shRNA的DNA 序列(從5，到3')。序列顯示出包括對(duì)應(yīng)于高度保守的HBV靶序列的21 個(gè)堿基(shRNA1907中的19個(gè)堿基)，緊接著的是編碼發(fā)夾的環(huán)部分的9 個(gè)堿基，再之后依次是21個(gè)堿基，它們是頭21個(gè)堿基的逆向互補(bǔ)物， 并據(jù)此通過與頭21個(gè)堿基的堿基配對(duì)形成了雙鏈莖區(qū)。沒有顯示出 dsRNA發(fā)夾分子中所具有的附加的5'和3'端序列從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游 的限制性位點(diǎn)序列或啟動(dòng)子序列中轉(zhuǎn)錄得到的5'前導(dǎo)核苷酸，以及多個(gè) 與靶序列非同源的3'末端的T (U)殘基，其在轉(zhuǎn)錄終止時(shí)被整合到了 RNA轉(zhuǎn)錄體內(nèi)。
圖6:相對(duì)于僅有復(fù)制子對(duì)照，計(jì)算出的三順反子構(gòu)建體在HBV復(fù) 制的細(xì)胞培養(yǎng)模型中抑制HBV表面抗原表達(dá)的抑制百分比(IC50值)的 表。
圖7:表示各種量的三順反子載體構(gòu)建體和HBV表面抗原表達(dá)抑制
之間的劑量應(yīng)答關(guān)系的圖表。7a)對(duì)測(cè)試載體40抑制HBVsAg的劑量應(yīng) 答和IC50值的測(cè)定。7b)對(duì)測(cè)試載體50抑制HBVsAg的劑量應(yīng)答和IC50 值的測(cè)定。
圖8: shRNA表達(dá)載體的分級(jí)系列，編號(hào)為從1到4，表示其中的聚 合酶III啟動(dòng)子/shRNA表達(dá)盒的數(shù)目。每個(gè)載體都含有如文中所述的原 核細(xì)胞的pUC衍生的復(fù)制起點(diǎn)和嵌合的卡那霉素耐藥基因。作為shRNA 命名的一部分，用4a或4A的命名表示載體4中的2種修飾的7SK啟動(dòng) 子(7SK-4A)。
圖9: pHB4載體的簡圖，其利用4個(gè)聚合酶III啟動(dòng)子表達(dá)4個(gè)短 dsRNA發(fā)夾分子，即U6、 7SK、和兩個(gè)拷貝的變體7SK-4A啟動(dòng)子。也 構(gòu)建出了五順反子載體pHB5，其利用5個(gè)聚合酶in啟動(dòng)子，包括4個(gè) 7SK啟動(dòng)子(即，3個(gè)變體7SK-4A啟動(dòng)子以及1個(gè)如圖4a所示的7SK 啟動(dòng)子)和一個(gè)U6啟動(dòng)子，表達(dá)5種不同的短dsRNA發(fā)夾分子，每種 發(fā)夾分子都包括與高度保守的HBV序列同源的和互補(bǔ)的雙鏈的莖區(qū)。
圖10:顯示了測(cè)試pHB4載體和單鏈shRNA表達(dá)載體抗螢光素酶報(bào) 告基因構(gòu)建體中所具有的HBV序列靶點(diǎn)的結(jié)果。對(duì)于pHB4載體，顯示 了 3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果，每個(gè)值包括3個(gè)轉(zhuǎn)染的雙份的平均值，其中每 個(gè)數(shù)值包括3個(gè)螢光素酶測(cè)定的雙份檢測(cè)值。所給出的數(shù)值是在存在載 體時(shí)所檢測(cè)到的光單位與單獨(dú)轉(zhuǎn)染報(bào)告基因構(gòu)建體所產(chǎn)生的光單位值的 比值，乘以100。用LipofectamineTM(Invitron公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，螢光素酶 檢測(cè)試劑購自Promega公司。
圖11:顯示出組合3個(gè)不同的啟動(dòng)子元件(U6、 7SK或7SK-4a)和 3個(gè)不同的HBVdsRNA發(fā)夾序列(1737、 1943、和799)對(duì)表達(dá)HBV復(fù) 制子的細(xì)胞表達(dá)HBV表面抗原(sAg)和e抗原(eAg)的影響的表。見 文中的sAg檢測(cè)描述。EAgELISA檢測(cè)與sAg檢測(cè)基本相似，不同之處 在于用eAg抗體取代sAg抗體。IC50值的單位為ng/ml。
圖12:顯示了 sAg和eAg抑制的IC50值隨著質(zhì)粒載體(對(duì)應(yīng)于圖8 所圖示的載體)中的啟動(dòng)子/HBV shRNA表達(dá)盒數(shù)目的增加(從1到4)
而逐步降低的表。
圖13:經(jīng)單個(gè)PolIII啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的單個(gè)RNA分子(雙指的和二元的 發(fā)夾構(gòu)建體)內(nèi)的兩個(gè)不同的shRNA區(qū)的表達(dá)。圖的上方顯示了短間隔 物和長間隔物形式的RNA的示例圖。表顯示了含有完整的HBV基因組 的螢光素酶報(bào)告基因以及僅含有1737或2791靶序列的報(bào)告基因的抑制 水平。發(fā)夾之間的短間隔物含有16nt，以及發(fā)夾之間的長間隔物含有42nt。 數(shù)據(jù)用每個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建體的光單位與僅轉(zhuǎn)染螢光素酶(無HBV序列) 報(bào)告基因構(gòu)建體的光單位值的比值，乘以100。在一個(gè)方面，本發(fā)明的表 達(dá)構(gòu)建體可以從在此所含的一個(gè)或多個(gè)聚合酶III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄單元中表達(dá) 出2、 3、或更多個(gè)的dsRNA發(fā)夾，如圖13所示的那樣。
圖14:在不存在(實(shí)心)或存在共注射的pHB斗載體時(shí)，從肝特異的 啟動(dòng)子載體中體內(nèi)表達(dá)HBV sAg，所述pHB4載體表達(dá)4個(gè)不同的HBV dsRNA發(fā)夾分子。數(shù)據(jù)是每組3只小鼠以及兩個(gè)雙份組的平均值(實(shí)驗(yàn)1 和實(shí)驗(yàn)2)。所給出的數(shù)值是sAg ELISA光密度值與螢光素酶光單位的比 值，即被標(biāo)準(zhǔn)化為共注射的螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒(見正文)。從肝細(xì)胞中測(cè) 定出螢光素酶值，其中在小鼠血清中進(jìn)行sAg檢測(cè)。
圖15:顯示出數(shù)百種可獲得的HBV分離株(見正文)中的序列保守 區(qū)的位點(diǎn)以及說明對(duì)應(yīng)于所選定的本申請(qǐng)所述的HBV dsRNA發(fā)夾靶點(diǎn) 序列和區(qū)域的位置的示意圖。示意圖描述了 HBV的同線轉(zhuǎn)錄物的性質(zhì)以 及說明了由每種轉(zhuǎn)錄物所制備得到的蛋白產(chǎn)物。因此，例如，可以看到 僅僅1737dsRNA發(fā)夾耙向于HBV X-蛋白，而例如799dsRNA發(fā)夾可以 抑制HBVeAg表達(dá)，但不能直接干擾HBV sAg表達(dá)。因此，通過同時(shí) 輸送不同的抗HBV的dsRNA分子的選擇方案，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體提 供了抗HBV的多藥物方案，這不僅造成了高水平的病毒抑制，也阻止了 病毒耐藥性的發(fā)生。
具體實(shí)施例方式
本申請(qǐng)人具體地將所引用的所有文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都并入到本申請(qǐng) 中。此外，當(dāng)數(shù)量、濃度或其它數(shù)值或參數(shù)被給出范圍、優(yōu)選范圍或上 限優(yōu)選數(shù)值和下限優(yōu)選數(shù)值的列表時(shí)，這應(yīng)該被理解為具體地公開了由 任一對(duì)任何范圍上限或優(yōu)選值與任何范圍下限或優(yōu)選值所形成的所有范 圍，無論范圍是否是被分開描述。在敘述數(shù)字?jǐn)?shù)值的范圍時(shí)，除非有其 它不同的說明，范圍打算包括所述范圍的終點(diǎn)，以及在此范圍內(nèi)的所有 整數(shù)和分?jǐn)?shù)。當(dāng)在定義范圍時(shí)，本發(fā)明的范圍并不打算限定于所述的具 體數(shù)值。
定義在本說明書中，根據(jù)本領(lǐng)域人員的常規(guī)理解使用下面的術(shù)語， 在此給出了更具體的定義。
"表達(dá)構(gòu)建體"表示被設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)錄相關(guān)RNA的任何雙鏈的DNA 或雙鏈的RNA，例如含有至少一個(gè)啟動(dòng)子的構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子可操縱 地連接于或者可以可操縱地連接于相關(guān)的下游基因、編碼區(qū)、或多核苷 酸序列(例如編碼多肽或蛋白的cDNA或基因組DNA片段，或RNA效 應(yīng)分子例如反義RNA、形成三鏈的RNA、核酶、人工選擇的高親和力的 RNA配體(適體)、雙鏈RNA例如包括莖環(huán)或發(fā)夾dsRNA的RNA分子、 或雙指的或多指的dsRNA或微RNA，或任何相關(guān)的RNA)。"表達(dá)構(gòu)建 體"包括包括一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的雙鏈DNA或RNA，其中一個(gè)或多個(gè) 啟動(dòng)子事實(shí)上并非是與所轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列可操縱地連接，取而代之 的是其被設(shè)計(jì)為能有效地插入啟動(dòng)子所轉(zhuǎn)錄的可操縱連接的多核苷酸序 列。往受體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化表達(dá)載體可以容許細(xì)胞表達(dá)表達(dá)載體所編 碼的RNA效應(yīng)分子、多肽或蛋白。表達(dá)構(gòu)建體可以是經(jīng)遺傳學(xué)加工的質(zhì) 粒、病毒、重組病毒、或源自例如噬菌體、腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn) 錄病毒、慢病毒、痘病毒或皰疹病毒、或者在下面的"表達(dá)載體"中所 述的其它實(shí)施方式中的人工染色體?？梢栽诨罴?xì)胞中復(fù)制表達(dá)構(gòu)建體， 或者可以人工合成表達(dá)構(gòu)建體。對(duì)于本申請(qǐng)的目的，術(shù)語"表達(dá)構(gòu)建體"、 "表達(dá)載體"、"載體"、和"質(zhì)粒"可以互換使用，以便說明本發(fā)明的應(yīng) 用是普遍的、舉例說明的意義，并不打算將本發(fā)明限定于特殊類型的表 達(dá)構(gòu)建體。
"表達(dá)載體"表示含有至少一個(gè)啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子 可操縱地連接于或者可以可操縱地連接于所轉(zhuǎn)錄的下游基因、編碼區(qū)、
或多核苷酸序列(例如編碼蛋白的cDNA或基因組DNA片段，任選地其 可操縱地連接于位于編碼區(qū)以外的序列、反義RNA編碼區(qū)、或位于編碼 區(qū)以外的RNA序列)。"表達(dá)構(gòu)建體"也是含有一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的DNA 構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子事實(shí)上并非是與所轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列 可操縱地連接，取而代之的是其被設(shè)計(jì)為能有效地插入到啟動(dòng)子所轉(zhuǎn)錄 的可操縱連接的多核苷酸序列。往受體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化表達(dá)載體可以 容許細(xì)胞表達(dá)表達(dá)載體所編碼的RNA。表達(dá)構(gòu)建體可以是經(jīng)遺傳學(xué)加工 的質(zhì)粒、病毒、重組病毒、或源自例如噬菌體、腺病毒、腺伴隨病毒、 逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、痘病毒或皰疹病毒的人工染色體。這些表達(dá)載體 可以包括來自細(xì)菌、病毒或噬菌體的序列。這些載體包括染色體的、附 加型的和病毒衍生的載體，例如源自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體 (episome)、酵母染色體元件、和病毒的載體。源自上面的組合，例如那 些源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件、粘粒和噬菌粒的載體。因此， 一個(gè)示例 性載體是雙鏈DNA噬菌體載體。另一個(gè)示例性載體是雙鏈DNA病毒載 體。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在此所述的表達(dá)載體、質(zhì)粒、和構(gòu)建體， 它們是被分離的和純化的，使得可以用于所有的各種應(yīng)用，例如用作用 于科學(xué)研究、用于人類和/或獸醫(yī)的治療性和/或預(yù)防性的藥物目的的試 劑。
在一些方面，兩種或兩種以上表達(dá)構(gòu)建體可以被用作單個(gè)組合物， 例如用作藥物組合物、或研究試劑。在一些方面，兩種或兩種以上表達(dá) 構(gòu)建體被用于協(xié)同使用的兩種或兩種以上組合物中，例如同時(shí)施用或在 彼此間隔數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)或數(shù)天的時(shí)間段內(nèi)施用所述組合物，例如在彼
此間隔1、 2、 3天內(nèi)或者甚至1周內(nèi)，只要所輸送到真核細(xì)胞內(nèi)的每種 構(gòu)建體的產(chǎn)物之間存在著一些功能的或生理的相互作用。表達(dá)構(gòu)建體共
同地包括至少2、 3、 4或更多個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子，在一些部分包 括至少2種不同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子，其中每個(gè)啟動(dòng)子都可操縱地 連接于或者可以可操縱地連接于編碼RNA效應(yīng)分子的核苷酸序列。在一 個(gè)方面，表達(dá)系統(tǒng)作用為提供具有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體的單個(gè)細(xì)胞， 所述包括至少兩種不同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子，其中每個(gè)啟動(dòng)子與編 碼RNA效應(yīng)物分子的核苷酸序列可操縱地連接。在一個(gè)方面，表達(dá)系統(tǒng) 可以是單個(gè)表達(dá)構(gòu)建體或兩個(gè)或兩個(gè)以上表達(dá)構(gòu)建體例如質(zhì)粒，其包括 兩個(gè)或兩個(gè)以上啟動(dòng)子，例如2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、或更多個(gè)啟動(dòng)子， 在一些部分其包括至少兩種不同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子，其中每個(gè)啟 動(dòng)子都是或者可以可操縱地連接于編碼RNA效應(yīng)物分子的核苷酸序列。 "核酸分子"或"多核苷酸"表示由稱作核苷酸的亞單位的線性序 列組成的聚合化合物；每個(gè)核苷酸都有3種組分 一個(gè)或多個(gè)與糖基(例 如五糖或六糖)連接的磷酸基團(tuán)，所述糖基依次與源自嘌呤(例如腺嘌呤 或鳥嘌呤)或源自嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、或尿嘧啶)的含氮堿基相連 接。核苷酸通過相鄰糖單位之間的磷酸鍵一起連接成多核苷酸。多核苷 酸分子可以是單鏈的，例如大多數(shù)天然存在的RNA(核糖核酸)分子，或 者可以是雙鏈的，例如大多數(shù)天然存在的DNA(脫氧核糖核酸)分子。在 雙鏈核酸分子中， 一條鏈的堿基與另一條鏈上的堿基以互補(bǔ)的方式相配 對(duì)。在DNA中，嘌呤堿基腺嘌呤(A)始終與嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)(或 者在RNA中為尿嘧啶(U))相配對(duì)；嘌呤堿基鳥嘌呤(C)始終與嘧啶堿 基胞嘧啶(G)相配對(duì)。每個(gè)堿基對(duì)都包括一個(gè)嘌呤和一個(gè)嘧啶。因?yàn)橐?條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配對(duì)，以及鳥 嘌呤始終與胞嘧啶配對(duì)，兩條鏈被認(rèn)為是彼此相互補(bǔ)的，以及從其互補(bǔ) 鏈的序列中可以推斷出鏈的序列。具體的天然存在的核酸分子包括基因 組脫氧核糖核酸(DNA)和基因組核糖核酸(RNA)，以及后者的一些不
同的形式，例如信使RNA (mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)、和核糖體RNA (rRNA)、以及催化的RNA結(jié)構(gòu)例如核酶和調(diào)節(jié)RNA例如微RNA (miRNA)。也包括與不同的RNA分子互補(bǔ)的不同的DNA分子(cDNA)。 在"核酸分子"的定義中也包括合成DNA、或其與天然存在的RNA的 雜合體，以及DNA/RNA雜合體、和PNA分子(Gambari， Curr. Pharai. Des. 7:1839-62 (2001》。
可以理解，如果所需的核酸分子是RNA，在此所提供的序列中的胸 腺嘧啶(T)被U (尿嘧啶)取代。例如，shRNA2791、 shRNA1907和 shRNA1737在此被描述為DNA序列。對(duì)于本領(lǐng)域的一般人員顯而易見 的是，包括任一上面所提及的序列的RNA效應(yīng)分子都將具有U對(duì)T的 取代。
核酸通常具有兩個(gè)或兩個(gè)以上共價(jià)鍵連接的天然存在的或修飾的脫 氧核苷酸或核糖核苷酸的序列。修飾核酸包括例如肽核酸和具有非天然 堿基的核苷酸。
術(shù)語"可操縱地連接"指的是核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子、信號(hào) 序列、增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的陣列)和第二個(gè)核酸序列之間的功能 連接，其中當(dāng)合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄活化分子)與表達(dá)控制序列結(jié)合時(shí)， 表達(dá)控制序列影響著對(duì)應(yīng)于第二個(gè)序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。本發(fā)明 的包括兩個(gè)或兩個(gè)以上RNA聚合酶III啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體可以包括與 所述啟動(dòng)子中的一個(gè)、兩個(gè)或每個(gè)啟動(dòng)子可操縱地連接的編碼shRNA、 dsRNA發(fā)夾或微RNA的核酸序列，或者在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括2、 3、 4、 5、或多個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子表達(dá)盒的表達(dá)構(gòu)建體，所述啟動(dòng) 子被設(shè)計(jì)用于能被便利地插入到每個(gè)所轉(zhuǎn)錄的選定序列的表達(dá)盒內(nèi)，例 如利用適當(dāng)選定的例如包括選定的限制性位點(diǎn)的克隆位點(diǎn)。
在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或載體中，RNA聚合酶III啟動(dòng)子是"分離 的"，意思是它們不與其在它們的正常細(xì)胞環(huán)境中所可操縱地連接的基因 或RNA序列可操縱地連接，例如在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中，7SK啟動(dòng)子
不與7SK基因可操縱地連接，U6啟動(dòng)子不與U6基因可操縱地連接，以 及Hl啟動(dòng)子不與Hl基因可操縱地連接等等。
"啟動(dòng)子"表示足以指導(dǎo)可操縱地連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄的核酸序 列。該定義也包括那些足以使得啟動(dòng)子依賴性基因的表達(dá)是細(xì)胞類型特 異的、組織特異的或暫時(shí)特異的方式可控的或者由外在信號(hào)或試劑誘導(dǎo) 的轉(zhuǎn)錄控制元件(例如增強(qiáng)子)；在基因的5，或3'區(qū)或內(nèi)含子內(nèi)都可以找 到本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的這些元件。見例如，2005年6月16日公開 的Xu等的美國專利申請(qǐng)No. 2005/0130184 Al涉及利用聚合酶II增強(qiáng)子 元件的修飾的聚合酶III啟動(dòng)子；以及2005年6月16日公開的Xu等的 美國專利申請(qǐng)No. 2005/0130919 Al涉及可調(diào)控的聚合酶III和聚合酶II 啟動(dòng)子，在此通過引用將其內(nèi)容并入申請(qǐng)。令人希望的是，啟動(dòng)子與核 酸序列例如cDNA或基因序列、或編碼效應(yīng)物RNA的序列可操縱地連接， 據(jù)此使得能夠表達(dá)核酸序列，或者表達(dá)盒提供了啟動(dòng)子，往表達(dá)盒內(nèi)可 以便利地插入選定的所需轉(zhuǎn)錄的核酸序列。
"RNA聚合酶m啟動(dòng)子"或"RNAPol III啟動(dòng)子"或"聚合酶III 啟動(dòng)子"或"polIII啟動(dòng)子"表示在細(xì)胞內(nèi)的其天然背景下與RNA聚合 酶III連接或相互作用以轉(zhuǎn)錄與其可操縱地連接的基因的任何的無脊椎動(dòng) 物、脊椎動(dòng)物、或哺乳動(dòng)物例如人、鼠、豬、牛、靈長類動(dòng)物、猿猴等 的啟動(dòng)子，或者它的任何的在選定的宿主細(xì)胞內(nèi)與RNA聚合酶III相互 作用以轉(zhuǎn)錄可操縱地連接的核酸序列的變體(天然的或遺傳學(xué)加工的變 體)。U6啟動(dòng)子(例如人U6、鼠U6)、 Hl啟動(dòng)子、或7SK啟動(dòng)子表示與 RNA聚合酶III相互作用以分別轉(zhuǎn)錄其同源的RNA產(chǎn)物即U6 RNA、 HI RNA、或7SKRNA的任何的無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子
或者在自然界可以找到的多態(tài)變體或突變體。在一些應(yīng)用中所優(yōu)選的是 in型RNAPolin啟動(dòng)子，包括U6、 Hl、和7SK，其存在于5'側(cè)區(qū)，包 括TATA盒，并缺少內(nèi)在的啟動(dòng)子序列。po1 III 5S rRNA、tRNA或VARNA 基因具有內(nèi)在啟動(dòng)子。7SLRNAPolIII基因含有弱的內(nèi)在啟動(dòng)子以及位于
基因的5'側(cè)區(qū)的轉(zhuǎn)錄所必需的序列。RNAPolini啟動(dòng)子包括任何高等真
核細(xì)胞(包括任何的脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物)的含有天然的或?qū)嶒?yàn)室產(chǎn)生 的任何一種序列變異或變更的啟動(dòng)子，所述變異或變更保持或增強(qiáng)了但
沒有消除RNA聚合酶III與所述啟動(dòng)子的結(jié)合，所述啟動(dòng)子能轉(zhuǎn)錄與所
述啟動(dòng)子序列可操縱地連接的天然的或遺傳學(xué)加工的基因或核苷酸序
列。根據(jù)宿主細(xì)胞RNA聚合酶III的最佳結(jié)合力和轉(zhuǎn)錄，可以方便地選 擇出在用于特殊應(yīng)用的表達(dá)構(gòu)建體(例如用于表達(dá)RNA效應(yīng)物分子例如 抗魚、鳥或無脊椎動(dòng)物病毒的發(fā)夾dsRNA的構(gòu)建體)中所用的Polin啟 動(dòng)子，例如包括在被設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)錄多個(gè)抗禽類宿主細(xì)胞中的禽病毒例如 西尼羅病毒或禽流感病毒(H5N1)的發(fā)夾dsRNA的表達(dá)構(gòu)建體中的禽 pol III啟動(dòng)子，以及在被設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)錄多個(gè)抗人類宿主細(xì)胞中的禽病毒例 如西尼羅病毒或禽流感病毒(H5N1)的發(fā)夾dsRNA的表達(dá)構(gòu)建體中的替 代使用的人或其它哺乳動(dòng)物的pol III啟動(dòng)子。
"多聚合酶III啟動(dòng)子載體"或"多PolIII啟動(dòng)子表達(dá)構(gòu)建體"或相 似的表達(dá)式都表示含有至少兩個(gè)聚合酶III啟動(dòng)子的任何載體、質(zhì)粒或表
達(dá)構(gòu)建體。在一個(gè)方面，多聚合酶m啟動(dòng)子載體含有至少兩個(gè)不同的聚 合酶m啟動(dòng)子。"不同的"聚合酶m啟動(dòng)子表示任何兩個(gè)RNA聚合酶 m啟動(dòng)子，包括變體例如它的多態(tài)性和突變體，在具體的物種中，其將
驅(qū)動(dòng)不同的同源轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄，例如人7SK啟動(dòng)子、U6啟動(dòng)子和人H1
啟動(dòng)子，它們被認(rèn)為是三個(gè)"不同的"聚合酶m啟動(dòng)子。本申請(qǐng)也打算
將"不同的"聚合酶III啟動(dòng)子定義為來自不同物種的相應(yīng)的聚合酶III
啟動(dòng)子，例如人U6對(duì)鼠U6啟動(dòng)子將是不同的啟動(dòng)子；人m對(duì)鼠Hl 啟動(dòng)子將是不同的啟動(dòng)子，或者人7SK啟動(dòng)子和鼠7SK啟動(dòng)子將被認(rèn)為 是不同的啟動(dòng)子。因此，在圖4(a)、 4(d)、和4(e)中所述的各種7SK啟 動(dòng)子被認(rèn)為是"相同"啟動(dòng)子(即，7SK啟動(dòng)子)的變體。在一些方面， 在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中可以包含多個(gè)拷貝的"相同的"啟動(dòng)子，只要 也包括兩個(gè)"不同的"RNA聚合酶III啟動(dòng)子，例如三個(gè)7SK啟動(dòng)子(例
如7SK 256啟動(dòng)子、兩個(gè)7SK4A啟動(dòng)子)和1個(gè)H1啟動(dòng)子；或者4個(gè) 7SK啟動(dòng)子(7SK256啟動(dòng)子、3個(gè)7SK4A啟動(dòng)子)禾卩1個(gè)U6啟動(dòng)子。 在一些方面，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以含有多個(gè)拷貝的相同的聚合酶III 啟動(dòng)子，但沒有含有"不同的"聚合酶III啟動(dòng)子，例如3、 4、 5、 6、或 更多個(gè)7SK啟動(dòng)子，每個(gè)啟動(dòng)子與編碼shRNA的序列可操縱地連接。任
選地，在一些實(shí)施方式中，除了兩個(gè)或更多個(gè)聚合酶ni啟動(dòng)子之外，還
可以包括其它的啟動(dòng)子，例如一個(gè)或多個(gè)聚合酶I啟動(dòng)子和/或一個(gè)或多 個(gè)聚合酶II啟動(dòng)子、 一個(gè)或多個(gè)線粒體的啟動(dòng)子等。在一個(gè)方面，包括 多聚合酶III啟動(dòng)子(2、 3、 4、 5、或更多個(gè))的表達(dá)構(gòu)建體被遺傳學(xué)加 工成表達(dá)多個(gè)dsRNA發(fā)夾或shRNA，其中可以使用2、 3、 4、 5或更多 個(gè)拷貝的相同的PolIII啟動(dòng)子，無論是否包括"不同的"RNA聚合酶III 啟動(dòng)子。
在重組DNA和合成載體用于在真核細(xì)胞中表達(dá)RNA的一般實(shí)踐和 用途中，大多數(shù)遺傳學(xué)加工的努力均針對(duì)表達(dá)編碼蛋白的RNA分子。隨 著反義RNA的出現(xiàn)以及更最近出現(xiàn)的RNA干擾沉默基因的現(xiàn)象(通過 雙鏈RNA，簡寫成"dsRNA")，必須開發(fā)出適合于產(chǎn)生主要具有催化性 能的短的、非編碼蛋白的RNA分子的表達(dá)系統(tǒng)。這需要采用已經(jīng)被開發(fā) 出的用于產(chǎn)生天然的、小的RNA分子(例如核糖體RNA、剪接體RNA、 RNAseP結(jié)構(gòu)的RNA組分等)的一些類型的天然啟動(dòng)子，以及這些啟動(dòng) 子通常被分類為RNA聚合酶I和RNA聚合酶III ( "Pol III")啟動(dòng)子。 RNA聚合酶III啟動(dòng)子非常適合于表達(dá)這些短的RNA轉(zhuǎn)錄體，長度最長 達(dá)約400至lj 500個(gè)核苷酸。在RNAPolIII家族中，天然啟動(dòng)子還被亞分 類成在結(jié)構(gòu)上有所不同的3種亞型(1、 2、和3)，但是這也反映了對(duì)利 用其產(chǎn)物的亞細(xì)胞區(qū)室的專門化(specialization)。例如，U6基因編碼小 的核RNA，其在RNA剪接過程中在核內(nèi)發(fā)揮作用，而各種tRNA基因編 碼tRNA分子，其在蛋白合成過程中在細(xì)胞漿內(nèi)發(fā)揮作用。因此，本發(fā) 明的一個(gè)部分是含有包括一種或多種3型啟動(dòng)子的代表物(例如，U6、
Hl、 7SK以及其序列變體，例如在此所述的7SK 4A序列變體提供了短 RNA效應(yīng)物分子例如短dsRNA發(fā)夾分子的優(yōu)先表達(dá))和1型或2型亞型 的成員(例如各種tRNA基因啟動(dòng)子)的多個(gè)PoIIII啟動(dòng)子的載體的用途 和構(gòu)建。啟動(dòng)子的這些組合提供了用于調(diào)節(jié)shRNA和/或微RNA產(chǎn)物在 細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)分布(核對(duì)細(xì)胞漿)的方法。在一些文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了這種 定位的試驗(yàn)實(shí)例，例如lives et al.， Gene 171 :203-08 (1996); Kawasaki and Taira， Nucleic Acids Res. 31 :700-07 (2003);禾口 Boden et al.， Nucleic Adds Res. 31 :5033-38 (2003)。
本發(fā)明的更多方面涉及多個(gè)Pol III啟動(dòng)子的必要條件，其中載體被 設(shè)計(jì)成表達(dá)多個(gè)(至少2個(gè)但優(yōu)選地是3、 4、 5或更多個(gè))"RNA效應(yīng)物 分子"。適合于被RNA聚合酶III啟動(dòng)子所表達(dá)的RNA效應(yīng)物分子是長 度最長到約400到500個(gè)核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，包括但不限于反義 RNA、核酶RNA、發(fā)夾dsRNA、微RNA和雙鏈dsRNA分子。優(yōu)選的 RNA效應(yīng)物分子是短發(fā)夾dsRNA (shRNA)分子、形成三鏈的RNA、核 酶、人工選定的高親和力的RNA配體(適體)、雙鏈RNA，例如包括莖 環(huán)或發(fā)夾dsRNA的RNA分子、或雙指的或多指的dsRNA或微RNA， 或任一相關(guān)的短RNA。
"shRNA"或"短發(fā)夾RNA"或"dsRNA發(fā)夾"表示長度小于約400 到500個(gè)核苷酸的RNA分子，優(yōu)選地是長度小于100到200個(gè)核苷酸， 其中至少一串至少約15到100個(gè)核苷酸(優(yōu)選地為17到50個(gè)核苷酸， 更優(yōu)選地為19到29個(gè)核苷酸)與位于同一 RNA分子中的互補(bǔ)序列堿基 配對(duì)，其中所述序列和互補(bǔ)序列被至少約4到7個(gè)核苷酸(優(yōu)選地為9 到約15個(gè)核苷酸)的未配對(duì)區(qū)分離開，所述未匹配區(qū)在兩個(gè)堿基互補(bǔ)區(qū) 所形成的莖結(jié)構(gòu)上方形成了單鏈的環(huán)。ShRNA分子至少包括1個(gè)莖環(huán)結(jié) 構(gòu)，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)包括約17到約100bp、約17到約50bp、約40到約100bp、 約18到約40bp、從約19到約29bp的、與所抑制的靶序列同源的和互補(bǔ) 的雙鏈的莖區(qū)，以及至少約4到7個(gè)核苷酸，優(yōu)選地約9到約15個(gè)核苷
酸的未配對(duì)的環(huán)區(qū)，其在兩個(gè)堿基互補(bǔ)區(qū)所形成的莖結(jié)構(gòu)之上形成了單
鏈的環(huán)。所包括的shRNA是二元的或雙指的和多指的發(fā)夾dsRNA，其中 RNA分子包括兩個(gè)或兩個(gè)以上經(jīng)單鏈間隔區(qū)所分離開的這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)。 申請(qǐng)人:打算本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以表達(dá)多個(gè)拷貝的相同的短發(fā)夾RNA 分子和/或一種或多種(包括多個(gè)不同的)短發(fā)夾RNA分子。被認(rèn)為是彼此 "相同的"短發(fā)夾RNA分子是那些僅僅包括相同的雙鏈序列的短發(fā)夾 RNA分子，以及被認(rèn)為是彼此"不同的"短發(fā)夾RNA分子將包括不同 的序列，不論每個(gè)不同的雙鏈序列所靶向的序列是否位于相同的或不同 的基因內(nèi)，例如同一基因的啟動(dòng)子區(qū)和轉(zhuǎn)錄區(qū)(mRNA)的序列或者兩種 不同基因的序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，重組載體被遺傳學(xué)加工成編碼多個(gè)例 如3、 4、 5或更多個(gè)短發(fā)夾dsRNA，每個(gè)短發(fā)夾dsRNA都表達(dá)自不同的 包括聚合酶III啟動(dòng)子的表達(dá)盒，所含的一個(gè)或多個(gè)(包括全部的)啟動(dòng) 子彼此都可以不同。在本發(fā)明的一個(gè)方面，轉(zhuǎn)錄3、 4、 5或更多個(gè)不同 的shRNA分子(每個(gè)分子都包括與保守的HBV序列同源的和互補(bǔ)的雙 鏈的"莖"區(qū))的重組表達(dá)載體被用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)的復(fù)制， 每種shRNA分子的表達(dá)都處于Pol III啟動(dòng)子的控制之下，例如7SK、H1、 和U6，它們可以是相同的或不同的。在一個(gè)方面，本發(fā)明的重組表達(dá)載 體可以從一種或多種聚合酶III啟動(dòng)子衍生的轉(zhuǎn)錄單元中表達(dá)出一種或多 種雙指的或多指的dsRNA發(fā)夾分子以及從一種或多種聚合酶III啟動(dòng)子 衍生的轉(zhuǎn)錄單元中表達(dá)出一種或多種單個(gè)發(fā)夾dsRNA分子。要明白，在 任一從聚合酶III啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄出發(fā)夾dsRNA的本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中， 發(fā)夾dsRNA可以是單個(gè)發(fā)夾dsRNA，或者可以是如2004年4月29曰公 開的WO2004/035765所述的雙指的或多指的dsRNA發(fā)夾，或者可以是 如2004年2月5日公開的WO2004/011624所述的部分的或強(qiáng)制的(forced) 發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)。
"受抑制的耙序列"或"靶序列"表示宿主細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)任何機(jī)制以序列特異的方式被抑制的、下調(diào)的、調(diào)控的、阻抑的、或沉默的核苷酸 序列，所述機(jī)制包括反義抑制、核酶解離、適體抑制、和/或通過RNAi
或雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，通過在所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 合適的RNA效應(yīng)物分子。根據(jù)提供給宿主細(xì)胞的表達(dá)構(gòu)建體的性質(zhì)和質(zhì) 量、所產(chǎn)生的RNA效應(yīng)物分子的相同性、性質(zhì)和表達(dá)水平、施用后的時(shí) 間等，所實(shí)現(xiàn)的抑制、調(diào)控、或沉默的程度將有所不同，但是始終是明 顯的，例如耙基因表達(dá)CmRNA或蛋白水平)和域相關(guān)靶點(diǎn)或細(xì)胞的功 能的可檢測(cè)到的減低，或者例如病毒復(fù)制水平的減少等等，與未處理的 細(xì)胞相比較，本發(fā)明所能獲得的抑制程度大于10%、 33%、 75%、 90%、 95%或99%。受抑制的靶序列可以是受抑制或沉默的內(nèi)源序列，例如與 疾病或病變例如某些癌癥、亨廷登病或衰老相關(guān)的黃斑退行性變相關(guān)的 核苷酸序列，或者宿主細(xì)胞內(nèi)存在的病原體相關(guān)的核苷酸序列。在一個(gè) 方面，通過RNAi或雙鏈RNA (dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默可以抑制靶序列， 其中與細(xì)胞或生物體內(nèi)的靶基因中的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的dsRNA可以抑制靶 基因的表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)，其中靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄不受影響， 但是縮短了 RNA半衰期，和/或轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)，其中基因的轉(zhuǎn)錄 受到了抑制(見例如1999年7月1日公開的Fire等的W099/32619;美 國專利6,506,559:"雙鏈RNA的遺傳抑制";和WO00/63364:"用于抑 制多核苷酸序列的功能的方法和組合物"，PachukandSatishchandran;包 括在此定義的各種RNAi靶)。對(duì)于TGS誘導(dǎo)作用，選定的dsRNA靶序 列優(yōu)選地包括啟動(dòng)子序列、啟動(dòng)子序列的亞組、啟動(dòng)子序列/轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)序 列、或另一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)序列，任選地與可操縱地連接于DNA或RNA靶點(diǎn) 中的這些啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)區(qū)的序列的組合。對(duì)于PTGS的誘導(dǎo)作用，所選定 的dsRNA耙序列可以僅僅包括編碼和/或3'和/或5'UTR序列，或者可以 優(yōu)選地包括編碼和/或UTR序列和/或啟動(dòng)子序列的組合。在一個(gè)方面， 靶序列是病原體的序列例如病毒病原體，其感染宿主細(xì)胞例如無脊椎動(dòng) 物或脊椎動(dòng)物的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人類細(xì)胞。在
一個(gè)方面，靶序列是與選定宿主生物體中的慢性病相關(guān)的病毒病原體的
核酸序列，例如肝炎病毒，例如HBV、 HCV以及病毒例如HIV、 SIV等。 因?yàn)镽NA干擾以序列特異性的方式發(fā)揮作用，用作為藥物的RNAi 分子必須特異于其靶點(diǎn)。本領(lǐng)域已知的是，病毒基因組是可變的，以調(diào) 節(jié)對(duì)其環(huán)境變化的抗性。因此，為了用RNAi阻斷病毒基因組復(fù)制，需 要鑒定出病毒基因組中的保守的和獨(dú)特的區(qū)域。同樣重要的是，要保證 本發(fā)明的沉默作用所靶向的保守的病毒序列與任何天然存在的、正常發(fā) 揮功能的、宿主多核苷酸序列基本上不同源，使得dsRNA分子不會(huì)負(fù)向 地影響任何重要的、天然存在的、宿主多核苷酸序列的功能，當(dāng)用于本 發(fā)明的方法時(shí)。這些天然存在的功能的多核苷酸序列包括編碼所需蛋白 的序列以及非編碼的、但作為健康宿主生物體中的重要調(diào)節(jié)序列的序列。 通過引用2005年2月17日公開的WO2005/014806、和2004年12 月22日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/638,294 (用于基因沉默的保守的 HBV和HCV序列)、以及2004年9月24日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/613,065 (RNAi耙向于單鏈病毒的相反鏈的輔助中間物)將關(guān)于選擇 用于shRNA設(shè)計(jì)的HBV禾卩/或HCV序列的方法和組合物。多個(gè)shRNA 方法的主要治療優(yōu)點(diǎn)是重要的病原體例如HBV、 HCV、和HIV病毒在其 感染宿主或患者的過程中以及在整個(gè)人群中都進(jìn)行著突變。通過在基于 多個(gè)短發(fā)夾dsRNA的治療藥物中包括多個(gè)耙序列，使得病毒逃離多個(gè) shRNA的檢測(cè)和滅活的突變可能性事實(shí)上為零。
對(duì)于在同一表達(dá)載體或表達(dá)系統(tǒng)中包括多個(gè)啟動(dòng)子的情況，在載體 設(shè)計(jì)中必須結(jié)合遺傳學(xué)加工處理，以避免在使用多個(gè)啟動(dòng)子中會(huì)出現(xiàn)的 兩個(gè)類型的問題。用"轉(zhuǎn)錄干擾"舉例說明的 一個(gè)問題涉及同時(shí)轉(zhuǎn)錄DNA 質(zhì)粒模板上的多個(gè)位點(diǎn)的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)。第二個(gè)類型的問題涉及在同一 質(zhì)粒內(nèi)具有多個(gè)拷貝的同源序列元件可能發(fā)生的重組事件。已經(jīng)進(jìn)行了 對(duì)本發(fā)明組合物中的啟動(dòng)子元件的選擇和配置，以便最小化或消除每個(gè) 這些有害的可能性。下面提供了關(guān)于這些現(xiàn)象的更多的細(xì)節(jié)。DNA分子的轉(zhuǎn)錄會(huì)影響位于延伸鏈前面的以及剛剛轉(zhuǎn)錄的鏈后面的
模板DNA的超螺旋(Dunaway and Ostrander, Nature 361 :746-48 (1993); Krebs and Dunaway, Mol. Cell. Biol. 16:5821-5829 (1996))。這些超螺旋的 變化影響著整個(gè)質(zhì)粒。超螺旋的變化可以有害地影響著多個(gè)啟動(dòng)子的活 性，并且事實(shí)上能剝奪活性。這表示表達(dá)構(gòu)建體中的一個(gè)啟動(dòng)子的活性 可以負(fù)向地影響另一個(gè)啟動(dòng)子的活性，反之亦然。當(dāng)單個(gè)表達(dá)構(gòu)建體中 的多個(gè)啟動(dòng)子在同一區(qū)室中都有活性并且以相同的方向運(yùn)行時(shí)，這會(huì)造 成啟動(dòng)子阻塞或啟動(dòng)子干擾。當(dāng)啟動(dòng)子的位置彼此接近時(shí)(在數(shù)百個(gè)核苷 酸內(nèi))，會(huì)發(fā)生啟動(dòng)子干擾。 一個(gè)啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子和其它因子的集結(jié) 立體地妨礙了第二個(gè)啟動(dòng)子上的因子的集結(jié)。啟動(dòng)子阻塞對(duì)于其中終止 子沒有位于一個(gè)順反子的末端以及下一個(gè)啟動(dòng)子之前的系統(tǒng)是個(gè)特殊的 問題。因?yàn)镽NApolII沒有有效的終止系統(tǒng)，這對(duì)于多個(gè)RNApolII啟
動(dòng)子在同一表達(dá)構(gòu)建體中的應(yīng)用是個(gè)潛在的問題。當(dāng)一個(gè)順反子的轉(zhuǎn)錄 沒有在順反子的末端終止并且運(yùn)行通過第二個(gè)啟動(dòng)子，阻止了第二個(gè)啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始，這就發(fā)生了啟動(dòng)子阻塞。
當(dāng)在同一亞細(xì)胞的區(qū)室中都有活性的兩個(gè)活性啟動(dòng)子按匯聚方向彼 此面對(duì)時(shí)，就發(fā)生了轉(zhuǎn)錄干擾。當(dāng)上游啟動(dòng)子抑制了下游啟動(dòng)子時(shí)(兩種 啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)在同一分子上同時(shí)具有活性)，也會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄干擾。起始于上 游啟動(dòng)子的延伸轉(zhuǎn)錄抑制了下游啟動(dòng)子的起始，因?yàn)檠由燹D(zhuǎn)錄物妨礙了 下游啟動(dòng)子(Proudfoot, Nature 322:562-65 (1986))。 一個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄可
以干擾另一個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并造成轉(zhuǎn)錄的過早終止。
通過對(duì)質(zhì)粒載體內(nèi)的序列中的主要的同源串的序列特異性識(shí)別，可 以發(fā)生重組，如果將相同啟動(dòng)子或具有主要同源性的啟動(dòng)子的多個(gè)拷貝 整合到質(zhì)粒內(nèi)，就是上述的那種情況。這種重組事件可以負(fù)向地影響任 一基于質(zhì)粒的治療藥物的療效(例如通過使得質(zhì)?？刂圃适Чδ?， 并且對(duì)所述載體在人體治療中的安全性也具有負(fù)面后果。在質(zhì)粒載體的 細(xì)菌發(fā)酵過程中的重組提出了更多的問題。重組被認(rèn)為是編碼dsRNA發(fā)
夾的質(zhì)粒中的特殊問題，因?yàn)榇嬖谥菀装l(fā)生重組事件的反向重復(fù)或回
文序列。Miyagishi and Taira, Nat. Biotechnol. 19:497-500 (2002)。僅僅預(yù)期 在編碼2、 3、 4、 5或更多個(gè)發(fā)夾的質(zhì)?；蚱渌d體以及2、 3、 4或更多 個(gè)拷貝的同一啟動(dòng)子或彼此具有基本上同源性的啟動(dòng)子中增加了這種潛 在的問題。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了序列不相同的多個(gè)啟動(dòng)子 元件的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括多個(gè)啟動(dòng)子元件(其中2、 3或更多個(gè)啟動(dòng)子的序列可以是相同的)或同一啟動(dòng)子元件的變體序列 的表達(dá)構(gòu)建體，例如，如果需要，除了其它不同的RNAPolIII啟動(dòng)子外， 單個(gè)表達(dá)構(gòu)建體還可以使用2、 3或更多個(gè)7SK、和/或修飾的7SK啟動(dòng) 子序列，其中每個(gè)啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄選定的dsRNA發(fā)夾序列，它們可以是 相同的或不同的序列。令人驚訝的是，根據(jù)在此所述的可以制備和使用 包括2、 3、 4、或更多個(gè)聚合酶III啟動(dòng)子的質(zhì)粒表達(dá)構(gòu)建體，所述啟動(dòng) 子可以是序列和定向上相同的或不同的、轉(zhuǎn)錄2、3、4、5、或更多個(gè)dsRNA
發(fā)夾分子的啟動(dòng)子。
利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)可以構(gòu)建出 本發(fā)明的載體。產(chǎn)生這些構(gòu)建體需要三種主要類型的組分1)質(zhì)粒"骨 架"；2)啟動(dòng)子元件；和3)編碼相關(guān)RNA的核苷酸序列，例如短發(fā)夾 RNA序列元件。通過從細(xì)菌培養(yǎng)物中分離出質(zhì)粒DNA，載體骨架可以直 接源自保藏于保藏單位例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC， Manassas, VA, USA)的各種細(xì)菌菌株。同樣地，被設(shè)計(jì)用于多用途的重組DNA遺 傳學(xué)加工的質(zhì)粒骨架可以商品化地購自多個(gè)供應(yīng)商，例如Stratagene (San Diego， CA)、 New England Biolabs (Beverly, MA)、或Invitrogen (San Diego， CA)。質(zhì)粒包括基本元件1)細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)；2)細(xì)菌的抗生素耐藥標(biāo) 記物；和3)用于插入其它DNA元件的克隆位點(diǎn)。
用于本發(fā)明的RNA聚合酶啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，通過搜索公共序 列數(shù)據(jù)庫例如GenBank⑧可以獲得這些RNA聚合酶啟動(dòng)子。已發(fā)現(xiàn)的3 型PolIII啟動(dòng)子的實(shí)例包括那些稱作Hl、 7SK、 U6和MRP的啟動(dòng)子。
作為這些啟動(dòng)子和基因的一部分的變體形式即拷貝可以存在于這個(gè)數(shù)據(jù) 庫內(nèi)，并且可以在本發(fā)明中同樣地或更有效地發(fā)揮作用。例如，在本申 請(qǐng)中描述了本發(fā)明的組合物和方法所用的7SK啟動(dòng)子的可選擇的、合成
的變體形式(見圖4(a)、 (d)和(e))，相對(duì)于如GenBank⑧中所示的規(guī)范 的7SK啟動(dòng)子，其包括截短或延伸的長度和/或核苷酸取代。對(duì)于涉及在 哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)內(nèi)源性RNAIII聚合酶的應(yīng)用，人或其它哺乳動(dòng) 物3型RNAPoim聚合酶啟動(dòng)子是優(yōu)選的，例如人或小鼠7SK、 Hl、和 U6。對(duì)于涉及在非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞例如禽、魚、或無脊椎動(dòng)物宿主細(xì) 胞內(nèi)表達(dá)內(nèi)源性RNA III聚合酶的應(yīng)用，優(yōu)先選擇同源的RNA pol III啟
動(dòng)子，例如禽、魚等的啟動(dòng)子。
RNAPol III啟動(dòng)子特別適合于表達(dá)小的經(jīng)遺傳學(xué)加工的RNA轉(zhuǎn)錄物 的一個(gè)原因是RNA Pol III在DNA編碼鏈的一短串胸腺嘧啶殘基處可有 效并精確地發(fā)生終止，且不需要其它蛋白因子，T4和T5是酵母和哺乳 動(dòng)物體內(nèi)最短的Polin終止信號(hào)，比T5更長的寡(dT)終止子在哺乳動(dòng) 物體內(nèi)是非常罕見的。因此，本發(fā)明的多聚合酶III啟動(dòng)子表達(dá)構(gòu)建體將 包括合適的寡(dT)終止信號(hào)，即4、 5、 6或更多T的序列，其與DNA 編碼鏈中的每個(gè)RNAPol III啟動(dòng)子的3'端可操縱地連接。然后例如將編 碼經(jīng)遺傳學(xué)加工的RNA和所轉(zhuǎn)錄的RNA效應(yīng)物分子例如dsRNA發(fā)夾或 RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA序列插入到Pol III啟動(dòng)子和終止信號(hào)之間。
為了分離對(duì)應(yīng)于這些啟動(dòng)子元件的DNA，習(xí)慣從DNA保藏單位例 如ATCC或商業(yè)來源中獲得質(zhì)粒形式的所述序列的克隆拷貝。同樣，用 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生多個(gè)拷貝的啟動(dòng)子也是通用的和便利的，它們 通過僅僅使用小片段序列設(shè)計(jì)"PCR引物"以及酶學(xué)地?cái)U(kuò)增并物理地分 離出每個(gè)啟動(dòng)子的基本上純化的溶液。對(duì)于特殊的限制性酶的應(yīng)用以及 所述引物的合理設(shè)計(jì)，習(xí)慣插入(重組)這些啟動(dòng)子元件使之成為質(zhì)粒載 體的一部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員要明白，在實(shí)施將啟動(dòng)子插入到DNA 骨架質(zhì)粒的策略的過程中，也包括通常需要精確地插入更多的相關(guān)元件。
對(duì)于本發(fā)明，這些元件是短的DNA段(長度優(yōu)選地小于50、 60、 70、 80、 或100個(gè)堿基對(duì))，經(jīng)PCR或合成DNA聚合方法或者兩個(gè)DNA的組合 制備，并將編碼相關(guān)的RNA效應(yīng)物分子，例如在一些方面，包括約19 到29個(gè)核苷酸(約18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、或 29個(gè)核苷酸)的互補(bǔ)鏈的shRNA序列能夠雜交形成約19到29個(gè)堿基對(duì) 的dsRNA序列("莖")，其與所抑制的靶核酸區(qū)域基本上相同和互補(bǔ)， 所述靶核酸是細(xì)胞、病毒或病原體產(chǎn)生的DNA或RNA分子。對(duì)啟動(dòng)子 元件的克隆也可以包括在規(guī)范的啟動(dòng)子序列和編碼所表達(dá)的RNA分子的 序列之間引入限制性位點(diǎn)或其它插入的短序列。這些元件能夠修飾啟動(dòng) 子和/或所表達(dá)的RNA的功能，并且可以包括新的啟動(dòng)子序列，只要其 功能得到了保留或強(qiáng)化。例如，相對(duì)于圖4(a)中的啟動(dòng)子，具有限制性 位點(diǎn)的3'端的4個(gè)核苷酸延伸物插入的圖4(e)中的7SK啟動(dòng)子序列證實(shí) 比圖4(a)中的7SK元件(7SK 256)具有更強(qiáng)的功能。這個(gè)特殊的7SK 變體啟動(dòng)子利用了 4個(gè)插入的A殘基，但是同樣可以使用4個(gè)G殘基。
在組裝了重組DNA質(zhì)粒之后，細(xì)菌被用作生產(chǎn)大量終載體的"工 廠"。大腸桿菌常常被用于質(zhì)粒發(fā)酵，大腸桿菌被用于這個(gè)目的的一個(gè)優(yōu) 點(diǎn)是大腸桿菌菌株具有簡化的基因組，如在Blattner等公開的美國專利申 請(qǐng)No. 2005/0032225中所述的那樣，在此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)。 通過各種方法(在此統(tǒng)稱為"轉(zhuǎn)染")，可以將根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法以 這種方式生產(chǎn)的、分離的和純化的載體引入到活細(xì)胞內(nèi)。 一旦進(jìn)入到細(xì) 胞內(nèi)，啟動(dòng)子元件可以被進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞結(jié)構(gòu)所識(shí)別，并產(chǎn)生RNA 效應(yīng)物分子例如shRNA。
其它能被便利地用于增殖本發(fā)明的質(zhì)粒表達(dá)載體的細(xì)菌菌株包括大 腸桿菌GT116，其是從InvivoGen， SanDiego, CA商品化獲得的感受態(tài)細(xì) 胞。GT116是被特異地遺傳學(xué)加工成支持?jǐn)y帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的生 長的sbcCD缺陷的菌株，例如被遺傳學(xué)加工成表達(dá)一種或多種RNA效應(yīng) 物分子(發(fā)夾RNA)的本發(fā)明的質(zhì)粒。已知發(fā)夾結(jié)構(gòu)在大腸桿菌內(nèi)是不穩(wěn)定的，因?yàn)樗鼈儠?huì)被一種稱作SbcCD的能識(shí)別并解離發(fā)夾的蛋白復(fù)合 物所清除(Connelly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7969-74 (1998))。 在大腸桿菌GT116中，缺失了 sbcCD和sbcD基因，這提高了其用于克 隆具有發(fā)夾或其它含回文序列的結(jié)構(gòu)的功效。
各種化學(xué)和物理的方法都可以被用于將質(zhì)粒表達(dá)載體引入到細(xì)胞或 組織或活體生物體內(nèi)，照此，包括治療表達(dá)載體的組合物和可藥用載體 或劑型構(gòu)成了藥物組合物。對(duì)于作為藥物組合物的質(zhì)粒DNA的制備，這 些方法包括與陽離子的兩親性的局部麻醉劑例如布比卡因、帶正電荷的 核酸結(jié)合劑例如聚胺(例如精胺)或大量的脂質(zhì)體的或含脂質(zhì)的試劑 (促進(jìn)了 DNA更新通過細(xì)胞膜)的制劑。包括這些表達(dá)載體的藥物組合物 的其它組分包括試劑例如保證DNA載體在適用于藥物施用的均質(zhì)溶液 中的化學(xué)穩(wěn)定性和可溶性的緩沖劑和穩(wěn)定劑。
RNApol III啟動(dòng)子載體編碼RNA分子(它可以具有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含 子或不含內(nèi)含子以及可以具有polyA尾或不含polyA尾)，所述RNA是 在核內(nèi)制備的并主要保留于核內(nèi)。這些核dsRNA效應(yīng)物分子可以被用于 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)。但是， 一定百分比的所轉(zhuǎn)錄的dsRNA達(dá)到了 細(xì)胞漿內(nèi)，并因此誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。對(duì)于TGS誘導(dǎo)，dsRNA 需要含有啟動(dòng)子序列、啟動(dòng)子序列的亞組、啟動(dòng)子序列/轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)序 列、或其它的調(diào)節(jié)區(qū)序列(任選地與可操縱地連接于如下所述的DNA或 RNA耙點(diǎn)中的這種啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)區(qū)的序列的組合)，并保留于核內(nèi)。同樣， dsRNA可以只含有編碼序列和/或3'和/或5'UTR序列，或者可以含有編 碼和/或UTR序列和/或啟動(dòng)子序列的組合。這種"融合靶"dsRNA可以 含有例如編碼啟動(dòng)子序列和所連接的被靶向的基因序列的dsRNA，以同 時(shí)進(jìn)行TGS和PTGS，。被設(shè)計(jì)用于輸送多個(gè)短發(fā)夾dsRNA的本發(fā)明的 RNApol III表達(dá)構(gòu)建體非常適合于輸送一種或多種靶向dsRNA的啟動(dòng)子 禾口/或其它調(diào)節(jié)序列以及一種或多種靶向dsRNA的編碼區(qū)禾卩/或3，UTR和 /或5， UTR。也包括如在PCT/US2004/026999 (WO2005/040388)中所述的
一種或多種啟動(dòng)子，以產(chǎn)生本發(fā)明的多區(qū)室的表達(dá)系統(tǒng)，通過使用區(qū)室 特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，可以保證在所有的相關(guān)區(qū)室例如細(xì)胞漿、核、
和核仁中都表達(dá)這種"融合耙"序列。對(duì)于PTGS， dsRNA含有源自RNA (例如mRNA的編碼序列或UTR序列)的序列，以及并非一定要含有啟 動(dòng)子序列。另外，通過包括能夠進(jìn)行細(xì)胞漿轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(例如線粒體啟 動(dòng)子)或者通過包括能形成更有效的細(xì)胞漿輸送RNA的載體，例如通過 包括CTE (組成型輸送元件)例如Mason-Pfizer猴病毒或的CTE或另一 種猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的輸送元件都可以誘導(dǎo)更有效的PTGS，見例如美國專 利5,585,263和美國專利5,880,276。如果需要，利用在此所述的方法和本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)通過這些載體的組合可以同時(shí)誘導(dǎo)PTGS 禾口 TGS。
其它的表達(dá)控制序列包括合適的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)、終止序列(例如作為聚合 酶III終止子的4或5個(gè)Ts的序列)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列、有效的RNA 加工信號(hào)例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信號(hào)、穩(wěn)定細(xì)胞漿mRNA的信 號(hào)、增強(qiáng)翻譯效率的序列(例如Kozak共有序列)、增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性的序 列、以及如果需要還包括增強(qiáng)所編碼產(chǎn)物的的序列。
要知道，在此所述的任一載體或任何其它的標(biāo)準(zhǔn)載體都可以用于產(chǎn) 生任一所需的本發(fā)明的生物學(xué)活性的核酸結(jié)構(gòu)例如dsRNA、包括微RNA、 mRNA(如果需要，翻譯成多肽)、反義RNA和核酶RNA，以及都可以用 于本發(fā)明。
增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方法
為了增強(qiáng)RNA pol II在核內(nèi)所轉(zhuǎn)錄的dsRNA的PTGS ，可以往dsRNA 中加入一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子和/或多聚腺苷酸化信號(hào)，以便使得能加工處理 所轉(zhuǎn)錄的RNA。這種加工處理是合意的，因?yàn)榧艚雍投嗪塑账岫即龠M(jìn)了 其從核向細(xì)胞漿的輸送。另外，多聚腺苷酸化穩(wěn)定了RNApolII轉(zhuǎn)錄物。 這些相同的策略可以被用于表達(dá)將被翻譯成蛋白的功能性mRNA。在一
些實(shí)施方式中，原核細(xì)胞的抗生素耐藥基因例如Zeomycin表達(dá)盒位于內(nèi) 含子內(nèi)。其它示例性的原核選擇標(biāo)記物包括其它的抗生素耐藥基因例如 卡那霉素包括美國專利5,851,804的嵌合的卡那霉素耐藥基因、四環(huán)素和 氨節(jié)青霉素。Zeomycin基因是處于原核啟動(dòng)子的調(diào)控之下，以及位于起 始ATG上游的約10個(gè)堿基對(duì)內(nèi)的Shine-Dalgarno序列的存在保證了 Zeomycin在宿主細(xì)菌中的翻譯。同樣，Zeomycin表達(dá)盒可以被放置于所 插入的發(fā)夾的反向重復(fù)序列之間(即位于與待沉默的靶核酸基本上相同 的有義和反義序列之間)的任一位置。
盡管在細(xì)菌中增殖載體時(shí)通常用DNA重組方法從DNA中缺失反向 重復(fù)序列，但是少數(shù)細(xì)菌可以具有重組途徑中的突變，以容許細(xì)菌穩(wěn)定 地保持具反向重復(fù)序列的DNA。為了篩選出這些少見的細(xì)菌，往培養(yǎng)物 中加入Zeomycin選擇。能夠清除反向重復(fù)序列的非所需的細(xì)菌被殺死， 因?yàn)閆eomycin表達(dá)盒在重組過程中也被缺失。僅僅所需的具有完整 Zeomycin表達(dá)盒的細(xì)菌可以在選擇中存活。
在從所選的細(xì)菌中分離出DNA并將其插入到用于表達(dá)RNA的真核 細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物)或動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)體內(nèi)之后，剪 接了 RNA轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子。如果Zeomycin表達(dá)盒位于內(nèi)含子內(nèi)，通 過RNA剪接去除該表達(dá)盒。在無效的剪接事件中，沒有表達(dá)Zeomycin 表達(dá)盒，因?yàn)椴淮嬖谟糜谵D(zhuǎn)錄和翻譯該基因的原核細(xì)胞信號(hào)?？股啬?藥性表達(dá)盒的清除對(duì)于涉及短dsRNA分子的應(yīng)用是需要的，因?yàn)楸磉_(dá)盒 的去除縮小了 dsRNA分子的大小。Zeomycin表達(dá)盒也可以位于內(nèi)含子的 兩側(cè)而不是內(nèi)含子內(nèi)。在這種情況中，在剪接了內(nèi)含子之后仍保留有 Zeomycin表達(dá)盒，其能被用于參與發(fā)夾的環(huán)結(jié)構(gòu)。在核內(nèi)制備出這些RNA pol II轉(zhuǎn)錄物，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到了細(xì)胞漿內(nèi)，在此它們可以實(shí)現(xiàn)PTGS。但 是， 一些RNA分子仍保留于核內(nèi)。這些核RNA分子可以實(shí)現(xiàn)TGS。對(duì) 于TGS應(yīng)用，所編碼的dsRNA優(yōu)選地含有啟動(dòng)子序列或啟動(dòng)子序列的 亞組、優(yōu)選地包括啟動(dòng)子/轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)序列。為了更有效地將RNA保留于
核內(nèi)，可以去除內(nèi)含子和/或多聚腺苷酸化信號(hào)。
對(duì)于細(xì)胞漿和核定位的另一種策略是使用"上游的"或內(nèi)在的RNA pol III啟動(dòng)子(見，例如Gene regulation: A Eukaryotic Perspective, 3th ed.， David Latchman (Ed.) Stanley Thornes: Cheltenham, UK, 1998)。這些啟動(dòng)子 形成了核轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄物，其中一些被轉(zhuǎn)運(yùn)出來，而另一些仍保留于 核內(nèi)，因此可以被用于PTGS和TGS。通過使用匯聚的啟動(dòng)子或者通過
使用兩個(gè)載體或兩個(gè)順反子系統(tǒng)，可以用這些啟動(dòng)子產(chǎn)生發(fā)夾，包括如 在2004年2月5日公開的WO 2004/011624中所述的部分的和強(qiáng)制的發(fā) 夾結(jié)構(gòu)、或雙鏈RNA。 一個(gè)啟動(dòng)子指導(dǎo)有義鏈的合成，另一個(gè)啟動(dòng)子指 導(dǎo)反義鏈的合成，通常來自兩個(gè)不同的基因序列的拷貝。這些啟動(dòng)子所 轉(zhuǎn)錄的RNA的長度一般被限定于數(shù)倍個(gè)核苷酸(例如250到500個(gè)核苷 酸)。另外，在這些載體中，可以用轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)實(shí)施有效的轉(zhuǎn)錄終止。
在Sambrook J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.)， Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y" 2000中 可以找到本申請(qǐng)所需的多數(shù)命名法和常用的實(shí)驗(yàn)室方法。手冊(cè)在此后被 稱作"Sambrook etal"。
用于克隆、DNA分離、擴(kuò)增和純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)、用于涉及DNA連 接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以及各種分離 技術(shù)對(duì)于本分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的并常常使用的，例如在 下面的參考文獻(xiàn)中所述的，在此通過引用將其并入本申請(qǐng)?jiān)贏usubelet al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology. Green Publishing, Inc., and Wiley and Sons, New York, N.Y; Sambrook et al. (above); Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning. Cod Spring Harbor Laboratory, Plainview， New York; Wu (ed.) (1993) Meth. Enzvmol. 218, Part I; Wu (ed.) (1979) Meth. Enzvmol. 68; Wu et al, (eds.) (1983) Meth. Enzvmol. 100 and 101; Grossman and Moldave (eds.) Meth. Enzvmol. 65; Miller (ed.) (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,New York; Old and Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation. University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology; Glover (ed.) (1985) DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization. IRL Press, Oxford, UK; 禾卩 Setlow and Hollaender (1979) Genetic Engineering: Principles and Methods. Vols. 1-4, Plenum Press, New York中描述多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在Pachuk等的美國專利申 請(qǐng)No. 6， 143,527" Chain reaction cloning using a bridging oligonucleotide and DNAligase"中描述了在此所采用的被稱作"鏈反應(yīng)克隆"的特別有用的 技術(shù)。所采用的簡寫和命名在本領(lǐng)域被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的，并且常常被在此 所引用的科學(xué)雜志所使用。
藥物組合物
本發(fā)明的多RNA聚合酶III啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)可以被優(yōu)選地用于在此 所述的各種藥物應(yīng)用。在各個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物包括約lng到約 20mg的核酸例如RNA、 DNA、質(zhì)粒、病毒載體、重組病毒、或其混合 物，其提供了所需量的核酸分子(與靶核酸同源和互補(bǔ)的dsRNA，mRNA、 微RNA、反義RNA、三鏈形成的RNA等)。在一些實(shí)施方式中，組合物 含有約10ng到約10mg核酸、約O.lmg到約500mg、約lmg到約350mg、 約25mg到約250mg、或約lOOmg核酸。臨床藥物領(lǐng)域的技術(shù)人員通過 常規(guī)試驗(yàn)就可以容易地達(dá)成這些給藥方案。
合適的載體包括但不限于鹽、緩沖鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇及 其組合。組合物應(yīng)該適合于給藥模式，可以是例如丸劑、片劑、膠囊、 噴霧劑、粉末或液體的形式。在一些實(shí)施方式中，藥物組合物含有一種 或多種適合于所選定的給藥途徑和模式的可藥用的添加物?？梢酝ㄟ^不 受限制的腸外途徑例如靜脈內(nèi)(IV)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)(IM)、皮下(SC)、 皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)以及局部、口服、和通過輸送途徑例如鼻內(nèi)、吸入、
直腸、陰道、頰粘膜和舌下途徑施用這些組合物。在一些實(shí)施方式中， 可以制備本發(fā)明的藥物組合物，以便給脊椎動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物包括人、 犬、貓、牛、馬、豬)對(duì)象施用液體(包括無菌的、無致熱原的注射用液 體)、乳劑、粉末、氣霧劑、片劑、膠囊、腸溶片劑、或栓劑形式的藥物 組合物。
可以如在此所述的制備藥物組合物，例如包括DNA質(zhì)粒構(gòu)建體在2、
3、 4、或更多個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子的控制之下表達(dá)2、 3、 4、或更多 個(gè)與例如來自靶病原體(例如病毒例如HBV、 HCV、 HIV、 HPV、天花 病毒)的一種或多種基因的序列、或者與另一種病原體或者人類、獸醫(yī)學(xué) 和農(nóng)業(yè)相關(guān)的其它核酸序列相關(guān)的序列例如炭疽病毒的人細(xì)胞受體序 列、或者與哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物或無脊椎動(dòng)物疾病或病變例如亨廷登病 或VEGF相關(guān)的其它基因序列，或者與黃斑變性或被遺傳學(xué)加工用于治 療人、馬或禽宿主細(xì)胞的禽流感病毒或西尼羅病毒序列相關(guān)的其它基因 序歹U)基本上同源的短發(fā)夾dsRNA分子。表達(dá)構(gòu)建體可以包括附加的啟 動(dòng)子序列，例如噬菌體T7啟動(dòng)子，其中它對(duì)于共輸送或共表達(dá)同源啟動(dòng) 子是必需的。例如，在合適啟動(dòng)子例如RNA聚合酶II啟動(dòng)子例如hCMV、 猿猴CMV或SV40的控制之下，可以從相同的或另一個(gè)質(zhì)粒中共輸送及 表達(dá)T7RNA聚合酶。在一些實(shí)施方式中，同一個(gè)或另一個(gè)構(gòu)建體同時(shí) 表達(dá)耙基因(例如靶天花基因)以及與靶天花基因同源的dsRNA。用合 適于特殊給藥途徑的藥物載體制備藥物組合物。對(duì)于IM、 SC、 IV、腹腔 內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)或其它腸外給藥途徑，常常使用無菌的、無毒的、無致 熱原的液體溶液例如注射用無菌水以及任選的各種濃度的鹽例如NaCl和 /或葡萄糖(例如氯化鈉注射液、林格液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化 鈉注射液、和/或乳酸林格注射液)。任選地，也使用藥物領(lǐng)域人員已知的 其它可藥用的合適的添加劑、防腐劑或緩沖劑。對(duì)于注射用的單劑量瓶， 根據(jù)藥物領(lǐng)域的技術(shù)人員所確定的那樣，劑量可以有所不同，但是通常 含有5mcg到500mcg之間的活性構(gòu)建體。如果有必要，可以施用明顯更
大的劑量，且不具有毒性，例如最大到5到10mg。
本發(fā)明的藥物組合物以及用于本發(fā)明的藥物組合物可以包括可藥用 的賦形劑或載體。術(shù)語"可藥用載體"在此表示無毒的、惰性固體的、 半固體的或液體的填充劑、稀釋劑、膠囊材料或任何形式的劑型輔助物。 可以用作可藥用載體的材料的一些實(shí)例是糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖、 淀粉例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉、纖維素及其衍生物例如纖維素鈉、乙
基纖維素和乙酸纖維素、西黃蓍膠粉、麥芽、凝膠、滑石粉；根據(jù)劑型 的不同，組合物中也可以具有賦形劑例如可可脂和栓劑石臘；油例如花 生油、棉子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；甘油例如 丙二醇；酯例如油酸乙酯、和月桂酸乙酯；瓊脂；去污劑例如Tween80; 緩沖劑例如氫氧化鎂和氫氧化鋁、海藻酸、無致熱原水、等滲鹽、林格 液、乙醇和磷酸緩沖液以及其它無毒的可配伍的潤滑劑例如月桂硫酸鈉 和硬脂酸鎂；以及著色劑、釋放劑、涂層劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、 防腐劑和抗氧化劑。
例如通過經(jīng)留菌濾器的過濾、或者通過將滅菌劑結(jié)合于無菌固體組 合物形式中都可以將可注射劑型滅菌，其中無菌固體組合物可以在使用 之前將其溶解或分散于無菌水或其它無菌的可注射介質(zhì)內(nèi)。
用于直腸或陰道施用的組合物優(yōu)選地是栓劑，通過混合表達(dá)構(gòu)建體 和合適的無刺激的賦形劑或載體例如可可脂、聚乙二醇、或栓劑石臘可 以制備所述組合物，其在室溫下為固體，但是在體溫下為液體，因此可 以在直腸或陰道腔內(nèi)熔化，并釋放出微粒。
用于口服施用的固體劑量形式包括膠囊、片劑、丸劑、粉末和膠囊。 在這些固體劑量形式中，表達(dá)構(gòu)建體可以與至少一種惰性的、可藥用的 賦形劑或載體例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或a)填充劑或膨脹劑例如淀 粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)結(jié)合劑例如羧甲基纖維素、 海藻酸鹽、凝膠、聚乙烯吡硌酮、蔗糖和阿拉伯膠；c)濕潤劑例如甘油； d)崩解劑例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽、 和碳酸鈉；e)溶液阻滯劑例如石臘油；f)吸收加速劑例如季銨類化合物; g)例如十六醇和單硬脂酸甘油；h)吸收劑例如高嶺土和皂土；以及i)潤
滑劑例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂硫酸鈉、 及其混合物混合。對(duì)于膠囊、片劑和丸劑而言，劑量形式也可以包括緩 沖劑。
用于局部或經(jīng)皮施用的本發(fā)明的藥物組合物的劑型包括軟膏、糊劑、 乳膏、洗劑、凝膠、粉末、溶液、噴霧劑、吸入劑或片劑。在無菌條件 下，混合表達(dá)構(gòu)建體和可藥用載體以及任何需要的防腐劑或可能需要的 緩沖液。眼科制劑、滴耳劑和滴眼劑也被包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
經(jīng)皮的片劑具有給機(jī)體提供可控制的化合物輸送的附加優(yōu)點(diǎn)。通過 將表達(dá)構(gòu)建體溶解或分散于合適的介質(zhì)中可以制備這些劑型。也可以用 吸收增強(qiáng)劑增加化合物跨越皮膚的流動(dòng)。通過提供可控速膜或通過將表 達(dá)構(gòu)建體分散于聚合物基質(zhì)或凝膠中都可以控制速度。
施用表達(dá)構(gòu)建體的所需方法
可以給宿主細(xì)胞/組織/生物體施用制劑于藥物載體的且沒有任何轉(zhuǎn)
染促進(jìn)劑的"裸"DNA、 RNA或DNA/RNA的本發(fā)明的DNA禾口/或RNA 構(gòu)建體。如RNA禾tV或DNA輸送領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，利用例如 RNA和/或DNA輸送領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些多核苷酸轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑可以 實(shí)現(xiàn)更有效的輸送。下面是示例性試劑陽離子兩親化合物包括局部麻 醉劑例如布比卡因、陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體或脂質(zhì)顆粒、多聚陽離子例如 聚賴氨酸、分支的、三維的多聚陽離子例如樹突聚體、碳水化合物、去 污劑、或表面活性劑包括苯甲基銨表面活性劑例如氯化苯甲烴鉸 (benzylkonium chloride)。在美國專利5，593，972、 5,703,055、 5，739，118、 5,837,533、 5,962,482、 6，127，170、和6，379,965、以及2003年11月13曰 公開的國際專利申請(qǐng)Nos. WO03/093449 (多功能分子復(fù)合物和油冰陽離 子兩親性乳劑)、和1999年5月6日公開的W099/21591 (用于輸送遺傳
物質(zhì)的組合物和方法)中描述了這些促進(jìn)劑或本發(fā)明所用的共用試劑的 非排除性的實(shí)例；在此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)。美國專利
5,824,538、 5,643,771、和5,877,159 (在此通過引用將其并入本申請(qǐng))描述 了對(duì)非多核苷酸組合物的組合物的輸送，例如轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞或含有本 發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)菌。
在一些實(shí)施方式中，將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體與一種或多種陽離子脂 質(zhì)或陽離子兩親性分子進(jìn)行復(fù)合，例如在美國專利4,897,355 (Eppstein 等1987年10月29日提交)、美國專利5，264，618 (Feigner等，1991年4 月16日提交)、或美國專利5,459,127 (Feigner等1993年9月16日提交) 中所述的組合物。在其它實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建體與脂質(zhì)體/脂質(zhì)體組合 物進(jìn)行復(fù)合，所述脂質(zhì)體/脂質(zhì)體組合物包括陽離子脂質(zhì)以及任選地包括 另一種組分例如中性脂質(zhì)(見，例如美國專利5，279,833 (Rose)、美國專 利5,283,185 (Epand)、和美國專利5,932,241 (Gorman))。在其它實(shí)施方 式中，表達(dá)構(gòu)建體與美國專利5,837,533、 6,127,170、和6,379,965 (Boutin) 的多功能分子復(fù)合物，或者優(yōu)選地與2002年5月6日提交的美國臨時(shí)申 請(qǐng)序歹ij No. 60/378,191 (2003年11月13日公幵的WO03/093449, Satishchandran)中的多功能分子復(fù)合物或油/水兩親性乳劑進(jìn)行復(fù)合，在 此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)。后一申請(qǐng)描述了包括核酸的組合物、 包括膽固醇或脂肪酸的內(nèi)體裂解性精胺(endosomolytic spermine),以及 包括細(xì)胞表面分子的配體的靶向精胺。組合物的正電荷對(duì)負(fù)電荷的比例 是在01.到2.0之間，優(yōu)選地在0.5和1.5之間；內(nèi)體裂解性精胺組成了至 少20%組合物中的含精胺分子；以及靶向精胺組成了至少10%組合物中 的含精胺分子。優(yōu)選地，正電荷對(duì)負(fù)電荷的比值是在0.8到1.2之間，例 如0.8到0.9之間。靶向精胺被設(shè)計(jì)用于將組合物定位特殊的細(xì)胞或相關(guān) 組織內(nèi)。內(nèi)體裂解性精胺破壞了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡，并在內(nèi)吞作用的過程中將 組合物裝入內(nèi)部，促進(jìn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡釋放出核酸并釋放到細(xì)胞的細(xì)胞漿 或核內(nèi)。這種靶向精胺/內(nèi)體裂解性精胺的混合物的用法不僅實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)
染，還增強(qiáng)了表達(dá)。
可以如2003年11月13日公開的WO03/093449所述的，將本發(fā)明 的DNA表達(dá)構(gòu)建體與35%甘露糖基精胺和65%膽固醇精胺的混合物復(fù) 合，當(dāng)給小鼠IV施用時(shí)，通過甘露糖受體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫細(xì)胞例如巨噬 細(xì)胞的靶向轉(zhuǎn)染。通過IV注射包括如上所述的與(例如35%/65%比值的) 乳糖精胺(單或三乳糖酰基)和膽固醇精胺的混合物相復(fù)合的DNA或 RNA表達(dá)載體(精胺對(duì)DNA的投料配比為0.8)的組合物可以完成肝細(xì) 胞的體內(nèi)靶向轉(zhuǎn)染，以輸送抗HBV禾口/或HCV的dsRNA。這些化合物特 別適合于藥物應(yīng)用，并且可以被容易地制劑于合適的無菌的、無致熱原 的載體中，例如用于注射、用于腸外施用例如IV (包括IV輸注)、IM、 SC和用于腹腔內(nèi)施用、以及用于經(jīng)吸入肺部輸送的霧化劑型的緩沖液。 在某些特殊的劑型中，本發(fā)明的DNA表達(dá)構(gòu)建體可以與內(nèi)體裂解性精胺 例如膽固醇精胺單獨(dú)地復(fù)合，而不與靶向精胺復(fù)合； 一些施用途徑例如 腹腔內(nèi)注射或輸注可以實(shí)現(xiàn)有效的肝輸送以及轉(zhuǎn)染本發(fā)明的DNA構(gòu)建 體，和表達(dá)RNA效應(yīng)物分子例如有效地抗HBV和/或HCV的多dsRNA 發(fā)夾。
本發(fā)明的DNA表達(dá)載體也可以被配制成用于體內(nèi)口服或腸外例如 靜脈內(nèi)輸送的微乳劑，如在2003年11月13日公開的WO03/093449中 所述的那樣，在此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)。制劑優(yōu)選地包括兩親 性化合物例如局部麻醉的布比卡因、膽固醇精胺、氯化苯甲烴銨 (benzalkonkim chloride)、或辛烷基精胺。小鼠中的體內(nèi)試驗(yàn)說明口服施用 造成了肝內(nèi)的顯著輸送。靜脈內(nèi)施用微乳劑造成了具有大毛細(xì)血管床的 器官例如肺、肝、脾和腎臟的轉(zhuǎn)染。
在其它的實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建體與藥物和分子生物學(xué)領(lǐng)域的一般 人員所設(shè)計(jì)出的任何其它的組合物復(fù)合。在一些實(shí)施方式中，構(gòu)建體或 載體沒有與陽離子脂質(zhì)復(fù)合。
通過多種方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染，所述方法包括但不限于
脂染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微注射、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、
病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒輸送、電穿孔、或基因槍(Biolistic)轉(zhuǎn)化法。表達(dá)構(gòu)建 體(DNA)可以是裸DNA或局部麻醉劑復(fù)合的DNA (Pachuk et al., Biochim.Biophvs. Acta 1468:20-30(2000))。優(yōu)選地，真核細(xì)胞例如脊椎動(dòng) 物(例如哺乳動(dòng)物)是體內(nèi)的或者是僅僅已經(jīng)被培養(yǎng)少數(shù)幾代(少于例 如直接來自ATCC的細(xì)胞株的30代)的細(xì)胞，或者是原代細(xì)胞。
所需的細(xì)胞
仍在本發(fā)明的任一部分的實(shí)施方式中，細(xì)胞是真核植物細(xì)胞或動(dòng)物 細(xì)胞。優(yōu)選地，動(dòng)物細(xì)胞是無脊椎動(dòng)物或脊椎動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 例如人類細(xì)胞)。細(xì)胞可以是體外的或體內(nèi)的。細(xì)胞可以是分化的或未分 化的、配子、胚胎細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、體細(xì)胞例如癌癥細(xì)胞、成體或 體細(xì)胞干細(xì)胞、免疫系統(tǒng)的細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞包括平滑肌或 心肌細(xì)胞、產(chǎn)激素細(xì)胞、血細(xì)胞、肝細(xì)胞、和脂肪細(xì)胞等。在一些實(shí)施 方式中，參與基因沉默的一種或多種蛋白例如Dicer或Argonaut在細(xì)胞 或動(dòng)物內(nèi)被過度表達(dá)或激活，以增加基因表達(dá)的抑制量。
引入哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)
雖然通常認(rèn)為包含哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)對(duì)于人藥物應(yīng)用并非是必需 的，但是因?yàn)槠渌膽?yīng)用例如非臨床研究，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以引 入人或哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)使得DNA質(zhì)粒在核定位之后可以被 復(fù)制并因此強(qiáng)化表達(dá)的水平和表達(dá)的持續(xù)時(shí)間。優(yōu)點(diǎn)是更多的質(zhì)粒被用 于了核轉(zhuǎn)錄以及因此制備出了更多的效應(yīng)物(例如更多的反義、mRNA、 dsRNA發(fā)夾、微RNA和/或更多的dsRNA雙鏈)。許多起點(diǎn)都是物種特 異性的，并且在一些哺乳動(dòng)物物種但非所有物種中發(fā)揮作用。例如，SV40 T復(fù)制起點(diǎn)(例如來自Clontech的質(zhì)粒pDsRedi-Mito，美國專利5,624,820) 在小鼠中是有功能的，但在人體內(nèi)卻沒有功能。因此該起點(diǎn)被用于在小
鼠中使用或研究的載體。其它能被用于人體應(yīng)用的其它起點(diǎn)是那些起點(diǎn)
例如Epstein-Barr核抗原(EBNA)起點(diǎn)(例如來自Qiagen的質(zhì)粒 pSES.Tk和pSES.B)。含有這些元件的DNA載體是商品化可獲得的，并 且用標(biāo)準(zhǔn)方法通過分離含有起點(diǎn)的限制性片段或者通過PCR擴(kuò)增起點(diǎn)都 可以獲得編碼起點(diǎn)的DNA片段。這些載體的限制性圖譜和序列是可以公 開獲得的，并使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能擴(kuò)增這些序列或分離出合適的 限制性片段。這些載體在表達(dá)合適的輔助因子例如SV40 TAg和EBNA 的細(xì)胞的核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。可以容易地完成這些因子的表達(dá)，因?yàn)橐恍┖?有相應(yīng)復(fù)制起點(diǎn)的商品化可獲得的載體(例如Qiagen的pSES.Tk和 pSES.B)也表達(dá)SV40Tag或EBNA。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地將 含有復(fù)制起點(diǎn)的這些DNA分子克隆到相關(guān)載體內(nèi)(例如表達(dá)dsRNA例 如發(fā)夾或雙鏈體RNA的載體)。然后與表達(dá)EBNA或Tag的載體一起共 轉(zhuǎn)染、注射或施用這些載體，使得能夠分別復(fù)制帶有EBNA或Tag復(fù)制 起點(diǎn)的質(zhì)粒。同樣，利用標(biāo)準(zhǔn)方法可以將編碼EBNA或Tag的基因克隆 到被設(shè)計(jì)用于在相關(guān)細(xì)胞、動(dòng)物或生物體內(nèi)工作的任一其它的表達(dá)載體 內(nèi)。也可以將編碼EBNA或Tag的基因克隆到帶有復(fù)制起點(diǎn)的同一載體 內(nèi)。合適的復(fù)制起點(diǎn)是但不限于Tag和EBNA,例如REPLICor公司 (Montreal, Quebec)已經(jīng)鑒定出36個(gè)堿基對(duì)的哺乳動(dòng)物起點(diǎn)共有序列， 其容許所連接的DNA序列的復(fù)制(如BioWorld Today. August 16, 1999, Volume 10， No. 157所綜述的那樣)。該序列不需要共表達(dá)輔助序列就可以 進(jìn)行復(fù)制。
本發(fā)明的范圍也包括試劑盒，其包括含有本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的組 合物；這些試劑盒可以包括包括多個(gè)Pol III啟動(dòng)子并被設(shè)計(jì)用于預(yù)備編 碼所轉(zhuǎn)錄的RNA效應(yīng)物分子的序列的插入，或者被設(shè)計(jì)用于多個(gè)Pol III 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒的預(yù)備插入(例如通過放置于經(jīng)合適選擇的限制性 位點(diǎn)的表達(dá)載體內(nèi))的本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體，以及可以任選地包括介質(zhì)、 溶液和其它有助于表達(dá)構(gòu)建體的穩(wěn)定、輸送、使用便利或效率的組合物。
利用包括編碼多個(gè)dsRNA發(fā)夾的多個(gè)RNA聚合酶m啟動(dòng)子的表達(dá)載體
治療乙型肝炎
病毒性肝炎是一種主要的世界性的健康難題，因?yàn)槟壳斑€沒有有效 的治療方法。已經(jīng)獲得了預(yù)防人乙型肝炎病毒的疫苗，但沒有獲得預(yù)防 人丙型肝炎病毒的疫苗，乙型或丙型肝炎病毒例如人乙型肝炎病毒
(HBV)或人丙型肝炎病毒(HCV)的感染經(jīng)常造成慢性病毒性肝病。
針對(duì)丙型肝炎的藥物治療包括利巴韋林和干擾素都只是部分有效。 估計(jì)75-85%的感染患者都將發(fā)生慢性感染，預(yù)計(jì)70%慢性感染患者會(huì)發(fā) 生慢性肝病包括肝細(xì)胞肝癌。慢性HCV相關(guān)性肝病是肝移植的主要適應(yīng) 癥。
盡管在1982年已經(jīng)獲得了人乙型肝炎病毒疫苗，但是估計(jì)全世界有 350萬人慢性感染了 HBV。雖然美國的每年新發(fā)感染數(shù)目已經(jīng)從80年代 的平均260,000例下降到了 2001年的約78,000例，但是估計(jì)仍有125萬 乙型肝炎病毒攜帶者，其定義是患者體內(nèi)的乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)陽性超過6個(gè)月。這些HBV攜帶者具有增加了的發(fā)生肝硬化、 肝功能失代償和肝細(xì)胞肝癌的危險(xiǎn)。盡管大多數(shù)攜帶者都不發(fā)生慢性乙 型肝炎的肝臟并發(fā)癥，但是15%到40%患者在其生命周期內(nèi)會(huì)發(fā)生嚴(yán)重 的后遺癥，15-25%慢性感染者死于慢性肝病。因此，迫切需要對(duì)患有HBV 和/或HCV感染(特別是慢性感染)的患者有效的治療性藥物，估計(jì)這些 患者加在一起占有全世界肝病總數(shù)的75%。能有效地抗HCV的預(yù)防性方 法和藥物也是極為需要的。
雖然HBV和HCV是基于dsRNA的治療(RNAi)的非常有希望的病
毒靶點(diǎn)，但是病毒的可變性和突變性以及病毒的高轉(zhuǎn)錄率都使得HBV和 HCV是任何治療性和/或預(yù)防性方法的非常有挑戰(zhàn)性的靶點(diǎn)。為了用 RNAi阻斷病毒基因組復(fù)制，需要鑒定出病毒基因組中的保守的和獨(dú)特的 區(qū)域。同時(shí)，為了避免毒性，被選定用于基因沉默的任何序列都是人類
基因組所缺少的也是非常重要的。在2005年2月17日公開的 WO2005/014806以及在2004年12月22日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列 No. 60/638,294 "Conserved HBV and HCV Sequences Useful for Gene Silencing"中都描述了適合用作本發(fā)明的多聚合酶III啟動(dòng)子構(gòu)建體所表 達(dá)的dsRNA發(fā)夾的保守的HBV和HCV序列，在此通過引用將其內(nèi)容并 入本申請(qǐng)。
盡管存在著各種小分子藥物，例如已知這些病毒的復(fù)制酶的藥物， 但是這些藥物一般不能治愈該疾病，常常僅僅是臨時(shí)減輕，因?yàn)?)藥物 不能破壞病毒核酸基因組，它能基序復(fù)制和減產(chǎn)生病毒蛋白；和2)藥物 隨著時(shí)間變得無效，因?yàn)椴《净蚪M突變并產(chǎn)生了抗抑制劑的變體復(fù)制 酶。
HBV屬于肝DNA病毒屬。HBV基因組是近似3200個(gè)堿基對(duì)的疏 松環(huán)狀的、部分雙鏈的DNA。具有4個(gè)部分重疊的編碼被膜(前S/S)、 核心(前核心/核心)、聚合酶和X蛋白的開放閱讀框。前S/S開放閱讀框 編碼大(L)、中(M)和小(S)表面糖蛋白。前核心/核心開放閱讀框被翻 譯成了前核心多肽，其被修飾成了可溶性蛋白乙型肝炎病毒e抗原 (HbeAg)和核殼體蛋白乙型肝炎病毒核心抗原。已經(jīng)顯示出核心啟動(dòng)子 和前核心區(qū)內(nèi)的突變減少或剝奪了 HbeAg的產(chǎn)生。聚合酶蛋白作用為逆 轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶。X蛋白是強(qiáng)的反式作用因子，可以在肝癌的發(fā)生 中發(fā)揮作用。
HBV復(fù)制循環(huán)開始于病毒與肝細(xì)胞的粘附。在肝細(xì)胞的核內(nèi)，完成 了正鏈HBVDNA的合成，病毒基因組被轉(zhuǎn)化成了共價(jià)閉合的環(huán)形DNA (cccDNA)。至今已經(jīng)檢驗(yàn)過的大多數(shù)藥物都cccDNA都只有很小的作用 或沒有作用，這造成了停止抗病毒治療后的血清HBVDNA的快速復(fù)現(xiàn)。 治療慢性乙型肝炎的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV復(fù)制和/或HBV抗原表達(dá)的持久 抑制以及緩解肝病。
當(dāng)被輸送到受病毒感染的細(xì)胞內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的多聚合酶m表達(dá)載體
具有直接破壞病毒核酸產(chǎn)物的獨(dú)特能力。此外，這些多聚合酶載體(表達(dá) 多個(gè)靶向于病毒基因組的不同部分的不同的抑制性短發(fā)夾dsRNA)的設(shè) 計(jì)和意向的固有的和整體的性能是同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)不同的病毒拮抗劑。拮
抗劑(shRNA)靶向于病毒基因組內(nèi)的不同的基因組序列。這些拮抗劑中
的一種可能足以殺滅病毒，但是其它的拮抗劑作為"后備"機(jī)制，使得
如果病毒序列發(fā)生突變使得一種拮抗劑無效時(shí)，還有2、 3、 4或更多種 其它的拮抗劑。另外，通過靶向于病毒基因組中的多個(gè)位點(diǎn)，可以同時(shí) 攻擊在疾病病理中發(fā)揮不同作用的病毒的不同的DNA或RNA產(chǎn)物。
對(duì)于乙型肝炎，例如在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明使用4、 5或更多個(gè) 包括如2004年12月22日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列No. 60/638,294中所 述的高度保守的HBV序列的shRNA分子(例如圖5中稱作"799"、 "1卯7"、 "2791"、 "1737"、 "1991"、 "1943")。可以選擇在此描述其它 的保守HBV序列，包括例如19到29個(gè)核苷酸的序列，其包括所有的或 部分的"799"、 "1907"、 "2791"、 "1737"、 "1991"、或"1943"，將其包 含于本發(fā)明的多聚合酶III表達(dá)載體所表達(dá)的dsRNA發(fā)夾內(nèi)。因?yàn)镠BV 基因表達(dá)和重疊轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性能，容許其靶向于多個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄物以及病 毒的復(fù)制模板，這將干擾超過一種的病毒蛋白的復(fù)制和表達(dá)。其中一種 shRNA分子"1737"可以獨(dú)特地滅活編碼稱作X蛋白(HbX)的產(chǎn)物的 RNA。在生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中有著很強(qiáng)的證據(jù)，說明X蛋白在肝癌的發(fā)生和/ 或維持中發(fā)揮作用。因?yàn)槟芤欢ǔ潭壬弦种撇《緩?fù)制的現(xiàn)有藥物不能清 除含有病毒基因組的整體或其它殘余拷貝或一部分的細(xì)胞，這些藥物不 能終止HbX的產(chǎn)生，甚至在已經(jīng)"治愈"了感染性HBV的患者體內(nèi)， 因此不能直接降低靜止HbX介導(dǎo)的任一癌癥的發(fā)生率。本發(fā)明的多個(gè)抗 HBV dsRNA發(fā)夾表達(dá)構(gòu)建體可以攻擊病毒的復(fù)制以及所有病毒蛋白的 表達(dá)， 一些蛋白引起了造成肝炎的炎癥損傷，相信另一些蛋白例如HbX 通過特殊的但還沒有完全清楚的機(jī)制觸發(fā)了肝細(xì)胞癌。要知道在此所述 的原理可以用于設(shè)計(jì)本發(fā)明的構(gòu)建體，其被特定地用于治療這些"感染
后"患者，其表達(dá)抗Hbx和任何其它的殘余的HBV抗原的dsRNA。
實(shí)施例
下面的實(shí)施例進(jìn)一步地說明了本發(fā)明。要知道，雖然這些實(shí)施方式 說明了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，但這些實(shí)施方式是以舉例說明為目的 而給出的。對(duì)于上面的討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確 定出本發(fā)明的優(yōu)選的特征，因此本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需脫離本發(fā)明的 精神和范圍，即可以對(duì)本發(fā)明作出各種變化和修飾，使得其適合于各種 用途和條件。
多Poiin啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建和描述
利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，含有細(xì)菌的抗生素選擇標(biāo)記物和復(fù)制起 點(diǎn)的質(zhì)粒被選定作為用于插入下面的具體啟動(dòng)子/shRNA組合的起點(diǎn)。通 過首先組合廣泛可獲得的pUC18載體(Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-19 (1985), erratum in Gene 114:81-83 (1992))的近似lkb片段(在 氨芐青霉素耐藥基因和多克隆位點(diǎn)之間含有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn))和如在美 國專利5,851,804中所述的嵌合的卡那霉素耐藥基因制備質(zhì)粒。各種從供 應(yīng)商例如Invitrogen、 Clontech、 Stratagene等獲得的商品化可獲得的質(zhì)粒 載體可以被用作載體元件的其它來源，或者取代申請(qǐng)人的載體作為原材 料，以產(chǎn)生下面所述載體的功能等價(jià)的變體。用于用源序列裝配載體的 方法包括限制性酶消化、凝膠電泳、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))、DNA測(cè)序、 酶連接、和如Pachuk等的美國專利6,143，527"Chain reaction cloning using a bridging oligonucleotide and DNA ligase"所述的"鏈反應(yīng)克隆"、和其它 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的和常見的方法。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)生多啟動(dòng)子構(gòu)建體之前制備單個(gè)Pol III啟動(dòng)子載體 構(gòu)建體是方便的。通過次序步驟地連接上面的復(fù)制起點(diǎn)限制性片段(ori) 與嵌合的卡那霉素耐藥基因，然后與所需的Pol III啟動(dòng)子/shRNA表達(dá)盒
連接，產(chǎn)生了用于表達(dá)單個(gè)短發(fā)夾RNA(shRNA)的基本的單啟動(dòng)子RNA polin載體。通過連接啟動(dòng)子與包括從商業(yè)定制的、被制備成合成的、雙 鏈的寡核苷酸的相關(guān)shRNA的短片段(近50到60bp)。構(gòu)建作為多啟動(dòng) 子載體的前體的單啟動(dòng)子載體的目的實(shí)現(xiàn)了數(shù)個(gè)有益的方面。首先，這 容許在檢測(cè)目標(biāo)啟動(dòng)子/shRNA對(duì)或元件的方法不會(huì)受到干擾的情況下 對(duì)每個(gè)啟動(dòng)子/shRNA對(duì)進(jìn)行功能驗(yàn)證。其次，這容許利用測(cè)序引物對(duì)每 個(gè)表達(dá)盒的全部或一部分進(jìn)行DNA測(cè)序，否則所述引物在多啟動(dòng)子載體 中將具有多個(gè)退火位點(diǎn)，使得這種情況下的測(cè)序是不可能的。第三，通 過故意設(shè)計(jì)出對(duì)于每個(gè)啟動(dòng)子元件而言是獨(dú)特的克隆限制性位點(diǎn)對(duì)，可 以有效地動(dòng)員經(jīng)驗(yàn)證的單啟動(dòng)子表達(dá)盒，用于克隆到任何數(shù)量的初始的 多啟動(dòng)子載體內(nèi)。
在確定出單啟動(dòng)子載體的的表達(dá)水平和基因沉默作用之后，按逐步 構(gòu)建的方式從單啟動(dòng)子載體啟動(dòng)子/shRNA盒構(gòu)建出含有2、 3、 4、或5
個(gè)啟動(dòng)子的多啟動(dòng)子載體，每個(gè)啟動(dòng)子都驅(qū)動(dòng)不同shRNA的表達(dá)。因此， 表達(dá)shRNA的有效的單啟動(dòng)子構(gòu)建體被修飾成添加了第二個(gè)啟動(dòng)子 -shRNA盒。通過產(chǎn)生數(shù)個(gè)可選擇的兩啟動(dòng)子質(zhì)粒的2-啟動(dòng)子形式經(jīng)驗(yàn)地 選擇出第二個(gè)盒(見圖8)相對(duì)于第一個(gè)盒的位置(第一個(gè)和第二個(gè)盒的 相對(duì)位置隨著其它載體元件有所不同，以及隨著每個(gè)盒相對(duì)于轉(zhuǎn)錄方向 的定位而有所不同)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員要知道，當(dāng)嘗試組合2個(gè)盒以 實(shí)現(xiàn)單載體內(nèi)的最佳表達(dá)時(shí)，環(huán)型載體周圍的位置以及盒的"后向"或 "前向"轉(zhuǎn)錄方向可以有所不同，以產(chǎn)生多達(dá)8種不同的變體，所有變 體都含有相同的元件。此外，當(dāng)嘗試在這個(gè)載體內(nèi)從不同啟動(dòng)子中表達(dá) 兩個(gè)不同的shRNA元件時(shí)，shRNA序列與兩個(gè)啟動(dòng)子中的每種啟動(dòng)子的 不同組合可以產(chǎn)生所述載體的16種不同的變體，所有變體仍都含有相同 的元件，但是元件的排列有所不同。申請(qǐng)人已經(jīng)觀察到這些不同的構(gòu)型 可以造成每種shRNA的表觀表達(dá)水平的顯著變異。然而，對(duì)于表達(dá)具有 有效的基因沉默作用的多效應(yīng)物RNA (特別是shRNA)的目的，本發(fā)明
的多聚合酶III啟動(dòng)子構(gòu)建體證實(shí)不需要過度的試驗(yàn)就能完成對(duì)這些元件 的相對(duì)最佳構(gòu)型的有效選擇。
就本發(fā)明而言，優(yōu)選地從一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體有效地產(chǎn)生至少3、 4、 5、
或更多個(gè)不同的RNA效應(yīng)物分子(例如shRNA分子)。前面對(duì)2-啟動(dòng)子 載體的描述因此意味著提供了對(duì)遺傳學(xué)加工所述構(gòu)建體時(shí)的組合可能性 的簡單例舉。鑒于并非所有的排列都同樣地發(fā)揮作用，且如果要系統(tǒng)地 評(píng)價(jià)所有可能的排列，則產(chǎn)生具有超過3個(gè)shRNA盒的載體需要測(cè)試大 量的載體排列，因此申請(qǐng)人尋求建立一種策略(方案、公式、方法、系列 步驟)，可以用其實(shí)用地獲得多polIII啟動(dòng)子表達(dá)構(gòu)建體，其中按強(qiáng)到所 有元件都獨(dú)立地以及協(xié)調(diào)地實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因沉默的方式表達(dá) 所有的shRNA元件。按反復(fù)的方式添加啟動(dòng)子盒這種逐步的方法，其涉 及僅僅產(chǎn)生多啟動(dòng)子載體的所有可能排列的一部分，且將在下面的實(shí)施 例中進(jìn)一步地說明，申請(qǐng)人己經(jīng)證實(shí)，這是一種實(shí)現(xiàn)從這些多啟動(dòng)子載 體中同時(shí)強(qiáng)表達(dá)shRNA的可靠的、可重復(fù)的和有效的方法。這不同于普 遍的認(rèn)識(shí)，即認(rèn)為因?yàn)?啟動(dòng)子之間的)轉(zhuǎn)錄干擾問題，多啟動(dòng)子元件的 這種程度的組合是不能維持的，且由于啟動(dòng)子之間的重復(fù)元件以及 shRNA元件內(nèi)的反向重復(fù)元件，在細(xì)菌內(nèi)維持這些質(zhì)粒的問題會(huì)加重這 種轉(zhuǎn)錄干擾。
Pol III啟動(dòng)子的選擇
實(shí)施例1:用于產(chǎn)生減少乙型肝炎病毒RNA產(chǎn)生和復(fù)制的shRNA的基于 三順反子RNA聚合酶III的表達(dá)構(gòu)建體
構(gòu)建出一系列質(zhì)粒，以便在3個(gè)分離的RNA聚合酶III啟動(dòng)子的控 制之下表達(dá)3種不同的革E向于乙型肝炎病毒的shRNA。在載體的多克隆 位點(diǎn)中，彼此鄰近地放入U(xiǎn)6和7SK啟動(dòng)子/shRNA盒，同時(shí)用遠(yuǎn)處的克 隆位點(diǎn)(鄰近于卡那霉素耐藥基因)置入第三個(gè)啟動(dòng)子序列(U6啟動(dòng)子 的第二個(gè)拷貝或HI啟動(dòng)子)。利用通過在啟動(dòng)子的3'末端和shRNA序列
的起點(diǎn)之間引入6nt加工處理過的方便的限制性位點(diǎn)例如Sal I或Hind III 可以將每個(gè)shRNA元件的5'端與每個(gè)啟動(dòng)子的3'端相連接。圖4給出了 每個(gè)啟動(dòng)子元件的序列。圖5顯示了源自HBV保守區(qū)、并被置入于稱作 2791、 1907和1737的三順反子載體內(nèi)的三個(gè)shRNA序列。每個(gè)shRNA 都開始于21bp的HBV序列，隨后是9個(gè)堿基的環(huán)元件(AGAGAACTT)， 緊接著的是21bp序列，其是頭21bp的反向互補(bǔ)物。每個(gè)啟動(dòng)子盒在其3， 末端都含有作為轉(zhuǎn)錄終止子的一串5個(gè)胸腺嘧啶核苷。因此，含有dsRNA 發(fā)夾的預(yù)定轉(zhuǎn)錄物實(shí)際上都含有附加的5，和3'序列由6個(gè)堿基(例如 Sal I或Hind III或其它所選的識(shí)別序列)組成的5'前導(dǎo)序列，之后是 dsRNA發(fā)夾序列、之后是短的3'末端的U束，通常是在轉(zhuǎn)錄終止吋所結(jié) 合的2(1、 2、 3、或4個(gè))U殘基。選擇Sal I或Hind III是因?yàn)楸憷脑?因，要知道可以取代使用任何數(shù)目的其它限制性位點(diǎn)，優(yōu)選地是6或8 個(gè)切割點(diǎn)(例如Aat II、 Acc65 I、 Acl I、 Afl II、 Agel、 Apa I、 ApaL I、 Ascl、 Asel、 AsiSI、 AvrII、 BamHI、 Bcl I、 BfrB I、 Bgl II、 BmgB I、 BseYI、 BsiWI、 BspDI、 BspEI、 BspHI、 BsrB I、 BsrGI、 BssHII、 BssS I、 BstBI、 BstZ171、 Clal、 Dral、 Eagl、 EcoRI、 EcoRV、 Fsel、 Fspl、 Hind III、 Hpal、 Kasl、 Kpnl、 Mfel、 Mlul、 Msc I、 Nael、 Narl、 Nco I、 Ndel、 NgoMIV、 Nhe I、 Notl、 Nrul、 Nsi I、 Pacl、 PaeR7 I、 Pmel、 Pmll、 Pstl、 Pvul、 PvuII、 Sacl、 Sac II、 Sal I、 Sbfl、 Sca I、 Sfo I、 Smal、 SnaBI、 Spel、 Sphl、 Ssp I、 Stul、 Swal、 Tli I、 Xbal、 Xho I、 Xma I;優(yōu)選地是Avr I (CCTAGG)、 BamH I (GGATCC)、 EcoR I (GAATTC)、 Hind III (AAGCTT)、 Kpn I (GGTACC)、 Nde I (CATATG)、 Not I (GCGGCCGC)、 Pst I (CTGCAG)、 Sal I (GTCGAC)、或Xba I (TCTAGA))，其中dsRNA發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物將包括不同的5'前導(dǎo)序列。dsRNA 發(fā)夾側(cè)面的5'和3'轉(zhuǎn)錄序列的長度和組成的差異沒有表現(xiàn)出會(huì)負(fù)向地影 響dsRNA發(fā)夾實(shí)施dsRNA介導(dǎo)性基因沉默的能力，這說明不同于合成 的dsRNA雙鏈，內(nèi)源性表達(dá)的dsRNA發(fā)夾構(gòu)建體是有效的，盡管這些
構(gòu)建體在很多方面都有所不同，例如約19-29bp之間的dsRNA "莖"的 長度、單鏈環(huán)的長度和組成、是否存在附加的短的5'和/或3'序列。雖然 選擇的耙序列明顯代表的是大量不同的HBV分離株(株)內(nèi)的那些相同 的序列，但是因?yàn)閰⒄盏哪康?，shRNA可以被定位回到HBV分離株 AYW，這樣的話shRNA2791含有起始于AYW分離株(GenBank 編號(hào) V01460)的2791位點(diǎn)的21bp序列，而shRNA1907，相應(yīng)地起始于 GenBank 參照序列的1卯7位點(diǎn)，等等，唯獨(dú)shRNA799不同，其包括 起始于位點(diǎn)779并延伸通過799的序列。對(duì)于保守HBV和HCV序列的 選擇，見例如2005年2月17日公開的WO2005/014806、以及2004年 12月22日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/638,294"ConservedHBVandHCV Sequences Usefol for Gene Silendng"。對(duì)于在在此所述的所表達(dá)的dsRNA 發(fā)夾中的應(yīng)用，可以選擇優(yōu)選地具有19到29個(gè)核苷酸的HBV革E序列， 例如18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、或29個(gè)連續(xù)的保 守核苷酸。在本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)l中，質(zhì)粒載體含有一個(gè)拷貝的7SK啟動(dòng) 子和2個(gè)拷貝的U6啟動(dòng)子。在實(shí)驗(yàn)2中，載體使用3個(gè)不同的RNA聚 合酶III啟動(dòng)子(除了 7SK和U6啟動(dòng)子之外，還有H1啟動(dòng)子)。在兩個(gè) 實(shí)驗(yàn)中，使用了每個(gè)質(zhì)粒的更多的變體，其中保留了7SK啟動(dòng)子的定位。 實(shí)驗(yàn)在此使用了基本的7SK啟動(dòng)子(圖4A)，但是在標(biāo)注為7SK啟動(dòng)子 的地方可以被7SK啟動(dòng)子的兩個(gè)變體(稱作7SK-e和7SK-4A)的序列所 取代(分別為圖4d和4e)。因此，本實(shí)施例所用的載體組含有4個(gè)不同的 質(zhì)粒，并在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中檢測(cè)了所有4種載體降低HBV RNA表達(dá)的 作用，其中在轉(zhuǎn)染組織培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生了HBVRNA。第一個(gè)系統(tǒng)采用無 關(guān)的質(zhì)粒構(gòu)建體組，其被用于產(chǎn)生與編碼螢光素酶蛋白的mRNA相連的 合成的HBV RNA分子(融合構(gòu)建體)。通過測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的螢光 素酶酶活性的量可以檢測(cè)出用于評(píng)估的質(zhì)粒載體降低HBV RNA融合構(gòu) 建體的表達(dá)的能力。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，用克隆的HBV共轉(zhuǎn)染HBV復(fù) 制子模型以及用于評(píng)估的質(zhì)粒載體。通過測(cè)定HBV表面抗原(HBV sAg)
檢測(cè)出質(zhì)粒載體抑制HBV復(fù)制和功能的能力。
用螢光素酶融合檢測(cè)法評(píng)估載體:為了評(píng)估每個(gè)載體抑制HBVRNA 序列表達(dá)的能力，用一系列載體("Luc-融合"載體)共轉(zhuǎn)染人橫紋肌肉 瘤(RD)細(xì)胞，所述載體編碼附加于螢光素酶的完整編碼序列的3'末端 的HBV RNA片段。在2004年9月10日公開的WO2004/076629" Methods and Constructs for Evaluation of RNAi Targets and Effector Molecules"中己 經(jīng)描述了用于制備這些載體的方法以及其在融合檢測(cè)法中的用途。在這 些實(shí)驗(yàn)中使用了如下的5種不同的luc-融合載體Luc-AYW含有HBV的 AYW株的完整的基因組序列；Luc是不含HBV序列的陰性對(duì)照載體； 以及Luc-2791、Luc-1907和Luc-1737都分別是與含有shRNA序列2791、 1907、和1737的耙點(diǎn)的短HBV(近似200個(gè)bp)片段融合的螢光素酶基 因。
對(duì)于共轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞種植到6孔板內(nèi)，使得它們?cè)谵D(zhuǎn)染時(shí)能達(dá)到約 80-卯％的融合。根據(jù)廠家的指導(dǎo)說明，用LipofectamhieTM聚陽離子脂質(zhì)/ 中性脂質(zhì)體制劑(Invitrogen)進(jìn)行所有的轉(zhuǎn)染。在本實(shí)驗(yàn)中，用200ng 每種Luc-融合質(zhì)粒和800ng實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48個(gè)小時(shí)時(shí)， 收集并裂解細(xì)胞，用Bright-Glo⑧螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega Inc., Madison， WI)測(cè)定出螢光素酶活性。螢光素酶活性用每mg總蛋白的相對(duì) 光單位(RLU)表示。
圖3給出了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如通過比較不含HBV序列的質(zhì)粒與 HBV-luc融合質(zhì)粒(Luc-awy)所產(chǎn)生的螢光素酶活性所證實(shí)的那樣，雖 然所有4種形式的shRNA三順反子載體都顯示出顯著地降低了 HBV RNA表達(dá)，但是并非所有的shRNA-啟動(dòng)子盒都在載體的所有啟動(dòng)子構(gòu) 型中發(fā)揮作用。僅僅在eiRNA載體41中，所有的三種shRNA都能沉默 螢光素酶融合構(gòu)建體中的它們的同源的測(cè)試序列。在對(duì)載體40與50、以 及41與51的比較中注意到，通過逆轉(zhuǎn)盒的定向可以恢復(fù)至少一種啟動(dòng) 子-shRNA盒的功能；但是，如在載體50中所見的，1737shRNA功能的
恢復(fù)伴隨著2791shRNA功能的喪失。不需要測(cè)試載體元件的所有可能的
排列和組合就可以獲得載體41所例舉的成功產(chǎn)物通過使用3種不同的
啟動(dòng)子以及反復(fù)變化一個(gè)或多個(gè)盒的定向指導(dǎo)獲得所需的結(jié)果，就能達(dá) 到目的。結(jié)果中要注意到，沒有在評(píng)估每種載體構(gòu)建體的相對(duì)能力的條
件下進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，即沒有考慮到每種shRNA產(chǎn)物的固有的能力以及其
產(chǎn)生速度。事實(shí)上，螢光素酶活性值被所有載體都減少到了相似的程度，
無論它們表達(dá)所有的3種shRNA或者僅僅表達(dá)2種。雖然如此，載體41 比其它所示的載體更大程度地具體化了本發(fā)明，其通過整合多核酸靶序 列使得抗病毒藥物更為優(yōu)越(避免逃逸突變體)。
在HBV復(fù)制子模型中評(píng)估載體:在本組實(shí)驗(yàn)中，用pHBV2 (—種 HBV的感染性分子克隆)和所評(píng)估的單個(gè)效應(yīng)物RNA構(gòu)建體一起共轉(zhuǎn) 染Huh7細(xì)胞(源自人肝細(xì)胞株)。用于轉(zhuǎn)染的總DNA是2.5pg，其包括 50ngpHBV2、可變量的測(cè)試構(gòu)建體(如圖6所示)以及可變量的惰性的、 "填充"DNA質(zhì)粒(pGL3， Pi觀ega Corp， Madison, WI)(使得所用轉(zhuǎn)化 中的量多為2.5pg)。在轉(zhuǎn)染后5到6天，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，并用Auszyme Monoclonal試劑盒(Abbott Laboratories, Inc生產(chǎn))檢測(cè)出分泌到培養(yǎng)基 中的HBV表面抗原(sAg)的量。sAg的量已經(jīng)被接受為是HBV感染細(xì) 胞中的病毒復(fù)制和病毒轉(zhuǎn)錄的間接檢測(cè)。進(jìn)行兩組試驗(yàn)，每組都包括不 同量的shRNA表達(dá)載體40和50的多次轉(zhuǎn)染。對(duì)照轉(zhuǎn)染只包括HBV復(fù) 制子，不含有測(cè)試載體，提供了沒有載體40和50時(shí)的sAg分泌量的測(cè) 定值。通過取存在測(cè)試質(zhì)粒時(shí)的sAg表達(dá)量與對(duì)照(僅有HBV復(fù)制子) 轉(zhuǎn)染時(shí)的sAg表達(dá)水平的比值可以計(jì)算出簡單的"抑制百分比"。通過進(jìn) 一步的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)化以及數(shù)據(jù)的圖解說明，構(gòu)建劑量-應(yīng)答抑制曲線和計(jì)算 IC50值(抑制50%表面抗原分泌時(shí)的載體濃度)是有可能的，其反過來 是比較不同測(cè)試載體在多個(gè)試驗(yàn)中的療效的工具。利用EnzFitter軟件 Biosoft， Ferguson, MO， USA)產(chǎn)生曲線、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和IC50值。
圖6和7顯示出了這些試驗(yàn)的結(jié)果。值得注意的是，中等劑量的測(cè)
試載體(25ng)獲得了對(duì)sAg表達(dá)的近100M的抑制。此外，非常少的劑 量lng就足以顯著地降低sAg表達(dá)(約30到40%)。圖7給出了對(duì)這些質(zhì) 粒的劑量應(yīng)答的更為詳細(xì)的分析，其中明顯的是中等劑量的測(cè)試載體獲 得了抑制作用的飽和狀態(tài)，以及IC50值(獲得50%抑制作用時(shí)的載體濃 度)近似為5ng。
實(shí)施例2:用于產(chǎn)生減少乙型肝炎病毒RNA產(chǎn)生和復(fù)制的shRNA的基于 四個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體
圖9是含有4個(gè)聚合酶ffl啟動(dòng)子-shRNA盒的載體pHB4的示意圖。 圖中的標(biāo)記說明了啟動(dòng)子名稱、相連的shRNA(靶向于HBV基因組)和 每個(gè)盒的轉(zhuǎn)錄方向。如上所述的，利用逐步添加shRNA盒的重復(fù)方法構(gòu) 建出載體。圖10中的數(shù)據(jù)(與實(shí)施例1所用的基本相似的螢光素酶檢測(cè) 法)說明所有4種啟動(dòng)子/shRNA盒對(duì)于沉默提供有載體和可檢測(cè)底物 (實(shí)施例1中的螢光素酶融合構(gòu)建體，現(xiàn)在包括shRNA-799構(gòu)建體)的細(xì) 胞內(nèi)的靶序列都是有活性的。圖10中的表顯示了 pHB4和陽性對(duì)照的三 個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)，同時(shí)給出了單個(gè)發(fā)夾載體的結(jié)果。圖12的數(shù)據(jù)顯示相同 的構(gòu)建體能沉默經(jīng)測(cè)試載體和HBV復(fù)制子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)的HBV基因表 達(dá)，IC50測(cè)定值如實(shí)施例l所示的那樣。圖12總結(jié)了試驗(yàn)的結(jié)果，其中 評(píng)估了各個(gè)載體(如圖8所示的從1到4種shRNA)在不同輸入濃度的 載體時(shí)復(fù)制細(xì)胞培養(yǎng)物的能力和活性。首先，在僅接受HBV復(fù)制子的細(xì) 胞中，用ELISA免疫檢測(cè)法測(cè)定了HBV抗原(表面抗原"sAg"或"e" 抗原"eAg")的產(chǎn)生。對(duì)于一些測(cè)試輸入量(濃度)的每種載體，將其 所產(chǎn)生的EUSA抗原量與沒有測(cè)試載體時(shí)產(chǎn)生的水平進(jìn)行比較。將與沒 有提供載體的細(xì)胞相比較，其中所產(chǎn)生的抗原減少了 50%的載體濃度被 定義為IC50(獲得50。/。抑制的抑制濃度)。IC50值越低，說明試劑或藥物 越強(qiáng)。圖顯示當(dāng)從1啟動(dòng)子/shRNA盒載體增加到含有4個(gè)啟動(dòng)子/shRNA 盒的pHB4實(shí)例時(shí)，IC50值顯著下降。應(yīng)當(dāng)注意到，IC50值也受到了每
個(gè)ShRNA分子的相對(duì)能力和轉(zhuǎn)錄水平的影響，它不會(huì)僅僅反映出與載體 濃度的簡單關(guān)系，其事實(shí)上反映了四種藥物進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)出四種所編
碼的dsRNA分子之后的所作所為。換句話說，增加的效力不僅反映出了 載體所產(chǎn)生的更大數(shù)目的總shRNA轉(zhuǎn)錄物，也反映出了每個(gè)shRNA經(jīng) 降解耙向的病毒RNA分子實(shí)現(xiàn)sAg或eAg產(chǎn)生的減少的單個(gè)的效力。 結(jié)合圖12的IC50數(shù)據(jù)以及圖10的螢光素酶報(bào)告基因數(shù)據(jù)，shRNA盒的 漸增的添加顯然增加了載體的表觀數(shù)量上的效力，此外還通過抑制HBV 耙的4個(gè)不同的位點(diǎn)增加了抗HBV靶的藥物活性。但是，重要的是要認(rèn) 識(shí)到本發(fā)明的多聚合酶m表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)多個(gè)單個(gè)的抗病毒的dsRNA 發(fā)夾分子的能力本身就是非常有價(jià)值的，而不僅僅是因?yàn)橄嚓P(guān)的"效力" 的增加。雖然抗病毒的效率水平是高的，但是每個(gè)添加的dsRNA分子所 獲得的漸增量的病毒抑制的增加不入本發(fā)明的構(gòu)建體所實(shí)現(xiàn)的能力重 要，其實(shí)際上是多藥方案，其固有的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)病毒耐藥性發(fā)生的高抗性。
實(shí)施例3:其中單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)含有短RNA的2-發(fā)夾(雙指)的多RNA
聚合酶m啟動(dòng)子載體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，包括多Pol III啟動(dòng)子載體，從單個(gè) 啟動(dòng)子表達(dá)超過1個(gè)的shRNA效應(yīng)物分子是有可能的，因此增加了 RNA 序列，靶向于更節(jié)約的啟動(dòng)子元件是有可能的。例如，僅僅用2個(gè)Poini 啟動(dòng)子就能用本發(fā)明表達(dá)3個(gè)shRNA分子；僅僅用3個(gè)Pol III啟動(dòng)子就 可以表達(dá)4、 5、或6個(gè)shRNA分子；用4個(gè)PolIII啟動(dòng)子就可以表達(dá)5、 6、 7、或8個(gè)shRNA分子等。通過產(chǎn)生U6啟動(dòng)子載體在此驗(yàn)證了 "雙 發(fā)夾"或"雙指"dsRNA的表達(dá)，在U6啟動(dòng)子載體中，用短間隔元件 連接兩個(gè)耙向于HBV的shRNA編碼序列(圖5)，產(chǎn)生了含有兩個(gè)活性 shRNA元件的更長的RNA分子(用長間隔物的總長度近似為140個(gè)核苷 酸，用短間隔物近似為60個(gè)核苷酸)，在此包括1737和2791序歹ij。在本 試驗(yàn)中使用了如在實(shí)施例1中所述的螢光素酶融合靶點(diǎn)，圖13的下方顯
示了結(jié)果。在螢光素酶融合檢測(cè)法中，兩種形式的雙發(fā)夾構(gòu)建體都能有 效地介導(dǎo)兩種靶序列的顯著降解。間隔序列在這些構(gòu)建體中的作用表面 上是將形成發(fā)夾的序列分離成兩個(gè)不同的區(qū)，并有助于單鏈核糖核酸內(nèi) 切酶的降解。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道大量的各種長度和序列的間隔物 都容許形成合適的雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)二元的靶序列降解。但是，也要明
白一定長度和組成的間隔序列本身就能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)并且能于shRNA側(cè)
面的序列堿基配對(duì)，這可能會(huì)干擾二元發(fā)夾分子的功能。
實(shí)施例4:與藥物制劑組合的DNA載體介導(dǎo)了小鼠肝臟內(nèi)的攝取和基因 表達(dá)。
通過將在此所述的用于沉默HBV基因表達(dá)的多啟動(dòng)子發(fā)明的注射液 與產(chǎn)生HBV表面抗原RNA和蛋白的DNA載體一起直接注射到小鼠的 血流內(nèi)，證實(shí)了所述多啟動(dòng)子發(fā)明的作為藥物試劑的重要適應(yīng)癥。在這 些試驗(yàn)中，經(jīng)流動(dòng)尾部靜脈注射將pHB4載體(見圖9)與在肝臟內(nèi)特異 地表達(dá)HBV表面抗原的sAg質(zhì)粒(該質(zhì)粒在白蛋白啟動(dòng)子的控制下表達(dá) sAg，并源自如Chisari et al. J. Virol. 60:880-87 (1986)所述的質(zhì)粒 pAlb-hGH) —起輸送到小鼠內(nèi)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常都用流動(dòng)尾部 靜脈注射使得外來試劑快速地灌注活體動(dòng)物體內(nèi)的肝臟組織。因此在此 模型中，肝細(xì)胞分泌sAg，因此在注射DNA4天之后測(cè)定小鼠血漿中的 sAg水平。共注射第三個(gè)表達(dá)受CMV啟動(dòng)子控制的螢光素酶的載體，使 得標(biāo)準(zhǔn)化sAg數(shù)值對(duì)肝臟螢光素酶，并據(jù)此控制肝臟內(nèi)的總DNA攝取和 DNA表達(dá)。圖14顯示了這個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果。用兩組小鼠進(jìn)行共注射，并 分別產(chǎn)生了血漿sAg值為0.07和0.08OD單位。因?yàn)閟Ag表達(dá)載體的單 獨(dú)引入(沒有shRNApHB4載體)產(chǎn)生了平均值為0.47OD單位，因此顯 而易見的是，pHB4在體內(nèi)顯著地沉默了 sAg。
實(shí)施例5:7SK啟動(dòng)子/shRNA連接序列的變更顯著地增加了 shRNA表達(dá)
載體的效力。
雖然已經(jīng)報(bào)道人7SK啟動(dòng)子的功能主要依賴于"上游"序列(轉(zhuǎn)錄 起點(diǎn)的5'序列)，但是位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)下游的核苷酸序列也能調(diào)控啟動(dòng)子的
功能(見Sandrock and Benecke， Gene Expr. 8:105-14 (1999)和Koper-Emde et al., Biol. Chem. 385:791-94 (2004))。申請(qǐng)人已經(jīng)觀察到，甚至在 RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)和靶序列的起點(diǎn)之間插入了一些并非對(duì)應(yīng)于靶 序列的附加核苷酸，靶向于用于基因沉默的序列的dsRNA發(fā)夾分子仍是 有功能的。這容許保持其中加入了限制性位點(diǎn)或間隔元件的Pol III啟動(dòng) 子/shRNA盒的改良功能。申請(qǐng)人已經(jīng)產(chǎn)生了新的7SK啟動(dòng)子元件(圖 4e)，其利用天然啟動(dòng)子的頭234個(gè)堿基，隨后是含有SalI限制性位點(diǎn)識(shí) 別序列的10個(gè)合成堿基(或者另外的6個(gè)核苷酸，優(yōu)選地包括限制性位 點(diǎn)識(shí)別序列)和4個(gè)A殘基。新的啟動(dòng)子序列元件稱作7SK4a，主要插 入了被轉(zhuǎn)錄的并因此附加于圖5所示的shRNA分子的5'末端的序列 GTCGACAAAA。如圖11所示，在三個(gè)不同的啟動(dòng)子背景中測(cè)試了三種 shRNA序列(1737、 1943、和799)對(duì)HBV抗原表達(dá)的沉默作用U6啟 動(dòng)子(圖4c)、 7SK啟動(dòng)子(4a)和7SK4a啟動(dòng)子(4e)。用先前實(shí)施例所 述的對(duì)sAg和eAg清除的IC50值評(píng)價(jià)了 9種構(gòu)建體的效力。對(duì)于所測(cè)試 的所有3種shRNA，7SK4a構(gòu)型比其它兩種啟動(dòng)子得到了顯著更低的IC50值。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)構(gòu)建體，其包括至少兩個(gè)不同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子，其中每個(gè)啟動(dòng)子與編碼至少一種RNA效應(yīng)物分子的核酸序列可操縱地連接。
2. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述至少兩個(gè)不同的RNA聚合 酶III啟動(dòng)子是病毒或真核細(xì)胞來源的。
3. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述至少兩個(gè)不同的RNA聚合 酶III啟動(dòng)子獨(dú)立地選自1型RNA聚合酶III啟動(dòng)子、2型RNA聚合酶 III啟動(dòng)子、和3型RNA聚合酶III啟動(dòng)子(包括Hl、 7SK、 U6和MRP)。
4. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述至少一種RNA效應(yīng)物分子 是短發(fā)夾RNA。
5. 權(quán)利要求4的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述短發(fā)夾RNA包括選自SEQ IDNO:6、 SEQIDNO:7、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:9、 SEQ ID NO: 10、 和SEQIDNO:ll的核酸序列，其中用U取代T。
6. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包括3到8個(gè) RNA聚合酶III啟動(dòng)子。
7. 權(quán)利要求6的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包括4個(gè)RNA 聚合酶III啟動(dòng)子。
8. 權(quán)利要求7的表達(dá)構(gòu)建體，其包括7SK和U6啟動(dòng)子。
9. 權(quán)利要求6的表達(dá)構(gòu)建體，其中RNA聚合酶III啟動(dòng)子選自HI 、 7SK、禾卩U6。
10. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述至少一種RNA效應(yīng)物分子 能夠調(diào)控靶基因的表達(dá)。
11. 權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述靶基因是病毒基因。
12. 權(quán)利要求ll的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述病毒基因是HBV或HCV 基因。
13. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述RNA聚合酶III啟動(dòng)子中 的至少兩個(gè)與編碼不同RNA效應(yīng)物分子的序列可操縱地連接。
14. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中每個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子與 編碼相同的RNA效應(yīng)物分子的核酸序列可操縱地連接。
15. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中相同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子 的拷貝不超過2個(gè)。
16. 權(quán)利要求15的表達(dá)構(gòu)建體，其中相同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子 的拷貝不超過l個(gè)。
17. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的RNA聚合酶III啟動(dòng)子 中的至少一個(gè)包括SEQ ID NO:5。
18. 權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的RNA聚合酶III啟動(dòng)子 中的至少一個(gè)包括SEQ ID NO:5，不同之處在于241到244位核苷酸包括gggg。
19. 一種分離的核酸序列，其包括SEQIDNO:5。
20. 權(quán)利要求19的分離的核酸序列，其包括SEQIDNO:5，不同之 處在于241到244位核苷酸包括gggg。
21. 權(quán)利要求19的分離的核酸序列，其包括SEQIDNO:5，不同之 處在于開始于235位核苷酸的Sal I限制性位點(diǎn)被選自由Aat II、 Acc65 I、 Acll、 AflII、 Agel、 Apal、 ApaLI、 Ascl、 Asel、 AsiSI、 AvrII、 BamH I、 Bcll、 BfrBI、 BglII、 BmgB I、 BseYI、 BsiWI、 BspDI、 BspE I、 BspH I、 BsrBI、 BsrGI、 BssHII、 BssSI、 BstB I、 BstZ17 I、 Clal、 Dral、 Eag I、 EcoRI、 EcoRV、 Fsel、 Fspl、 Hind III、 Hpal、 Kas I、 Kpn I、 Mfe I、 Mlul、 Mscl、 Nael、 Narl、 Nco I、 Nde I、 NgoMIV、 Nhe I、 Notl、 NmI、 Nsil、 Pacl、 PaeR71、 Pmel、 Pml I、 Pstl、 Pvul、 PvuII、 Sacl、 SacII、 Sbfl、 Scal、 Sfol、 Smal、 SnaB I、 Spel、 Sphl、 Sspl、 Stul、 Swa I、 Tlil、 Xbal、 Xhol、和XmaI組成的組中的限制性位點(diǎn)取代。
22. 7SK聚合酶III啟動(dòng)子核酸序列，其中所述序列在其3'末端包括 aaaa或gggg。
23. —種表達(dá)構(gòu)建體，其包括兩個(gè)或兩個(gè)以上RNA聚合酶III啟動(dòng) 子，其中所述RNA聚合酶III啟動(dòng)子中的至少兩個(gè)與編碼短發(fā)夾RNA分 子的核酸序列可操縱地連接。
24. 權(quán)利要求23的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述RNA聚合酶III啟動(dòng)子中 的至少兩個(gè)與編碼相同的短發(fā)夾RNA分子的核酸序列可操縱地連接。
25. 權(quán)利要求23的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述RNA聚合酶III啟動(dòng)子中 的至少兩個(gè)與編碼不同的短發(fā)夾RNA分子的核酸序列可操縱地連接。
26. 權(quán)利要求23、 24或25的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述RNA聚合酶III 啟動(dòng)子中的至少兩個(gè)是相同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子。
27. 權(quán)利要求23、 24或25的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以 上RNA聚合酶III啟動(dòng)子包括至少兩種不同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子。
28. 權(quán)利要求23的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上RNA聚 合酶III啟動(dòng)子包括3型RNA聚合酶III啟動(dòng)子。
29. 權(quán)利要求23的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述RNA聚合酶m啟動(dòng)子中 的至少一個(gè)與編碼短發(fā)夾RNA分子的序列可操縱地連接，所述短發(fā)夾 RNA分子是雙指的或多指的dsRNA發(fā)夾。
30. 權(quán)利要求23的表達(dá)構(gòu)建體，其中RNA聚合酶III啟動(dòng)子選自 Hl、 7SK和U6。
31. 權(quán)利要求23的表達(dá)構(gòu)建體，其能夠調(diào)控靶基因的表達(dá)。
32. 權(quán)利要求31的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述靶基因是病毒基因。
33. 權(quán)利要求32的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述病毒基因是HBV或HCV 基因。
34. —種用于治療需要降低靶基因活性的哺乳動(dòng)物的方法，包括給 有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包 括至少兩個(gè)不同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子，其中每個(gè)啟動(dòng)子與編碼至少 一個(gè)能夠降低靶基因的表達(dá)的RNA效應(yīng)物分子的核酸序列可操縱地連 接。
35. —種用于治療需要降低靶基因活性的哺乳動(dòng)物的方法，包括給 有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包 括兩個(gè)或兩個(gè)以上RNA聚合酶啟動(dòng)子，其中所述RNA聚合酶III啟動(dòng)子 中的至少兩個(gè)與編碼能夠降低耙基因的表達(dá)的短發(fā)夾RNA分子的核酸序 列可操縱地連接。
36. 權(quán)利要求34或35的方法，其中所述靶基因是病毒基因。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述病毒基因是HBV或HCV基因。
38. 權(quán)利要求34或35的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
39. —種調(diào)控至少一種靶基因的表達(dá)的方法，包括用包括兩個(gè)或兩 個(gè)以上RNA聚合酶III啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染包括所述至少一種靶基 因的宿主細(xì)胞，其中所述RNA聚合酶m啟動(dòng)子中的至少兩個(gè)與編碼能 夠調(diào)節(jié)所述至少一個(gè)靶基因的表達(dá)的短發(fā)夾RNA分子的核酸序列可操縱 地連接。
40. —種調(diào)控至少一種靶基因的表達(dá)的方法，包括用包括至少兩個(gè) 不同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染包括所述至少一種靶基 因的宿主細(xì)胞，其中每個(gè)啟動(dòng)子與編碼至少一種能夠調(diào)節(jié)所述至少一個(gè) 靶基因的表達(dá)的RNA效應(yīng)物分子的核酸序列可操縱地連接。
41. 權(quán)利要求39或40的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
42. 權(quán)利要求39或40的方法，其中所述至少一個(gè)靶基因是病毒基因。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述病毒基因是HBV或HCV基因。
44. 一種產(chǎn)生用于調(diào)控至少一個(gè)靶基因的表達(dá)構(gòu)建體的方法，包括(a) 產(chǎn)生至少兩種表達(dá)構(gòu)建體，其中每一種表達(dá)構(gòu)建體包括一個(gè)與編 碼至少一種RNA效應(yīng)物分子的核酸序列可操縱地連接的RNA聚合酶III 啟動(dòng)子；(b) 測(cè)定步驟(a)的每一種表達(dá)構(gòu)建體調(diào)控至少一個(gè)靶基因的表達(dá) 的功能性；和(c)根據(jù)步驟(b)的測(cè)定值，產(chǎn)生包括至少兩個(gè)不同的RNA聚合酶 III啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體，其中每個(gè)啟動(dòng)子與編碼至少一種RNA效應(yīng)物分 子的核酸序列可操縱地連接。
45. 權(quán)利要求44的方法，其中通過向所述表達(dá)構(gòu)建體中反復(fù)添加 RNA聚合酶III啟動(dòng)子/RNA效應(yīng)物分子盒產(chǎn)生步驟(c)的表達(dá)構(gòu)建體。
46. —種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1或23的表達(dá)構(gòu)建體。
全文摘要
本發(fā)明公開了包括至少兩個(gè)不同的RNA聚合酶III啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體，其中每個(gè)啟動(dòng)子與編碼RNA效應(yīng)物分子的核酸序列可操縱地連接。本發(fā)明還提供包括與編碼短發(fā)夾RNA分子的序列可操縱地連接的多個(gè)聚合酶III啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體，所述短發(fā)夾RNA分子可以包括單指和/或多指。所提供的構(gòu)建體能用于體內(nèi)輸送能有效地實(shí)施基因沉默的RNA分子，所述基因包括病毒基因包括HBV和HCV。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101189343SQ200580036240
公開日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2005年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者丹尼爾·E.·麥卡魯斯, 凱瑟琳·J.·帕丘克, 錢德拉塞卡爾·薩蒂什錢德拉恩, 馬丁·D.·西格 申請(qǐng)人:紐克利奧尼克斯公司