專(zhuān)利名稱(chēng)：用于細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含多胺和植物和/或酵母衍生的水解物。本發(fā)明還涉及無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)工藝，其中細(xì)胞在培養(yǎng)基中不添加補(bǔ)充性動(dòng)物蛋白的條件下進(jìn)行培養(yǎng)、增殖和傳代。這些工藝適用于培養(yǎng)細(xì)胞，例如重組細(xì)胞或感染了病毒的細(xì)胞，以及用于通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)工藝來(lái)生產(chǎn)生物制品。
背景技術(shù)：
為培養(yǎng)細(xì)胞，特別是真核細(xì)胞，更具體地講是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，始終需要使用特定的培養(yǎng)基，以得到利于細(xì)胞有效生長(zhǎng)和生產(chǎn)預(yù)期蛋白質(zhì)或病毒所需要的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。為有效地生產(chǎn)生物制品例如病毒或重組蛋白，獲得最佳的細(xì)胞密度并且增加蛋白質(zhì)表達(dá)本身從而獲得最大的產(chǎn)率是很重要的。
細(xì)胞培養(yǎng)基配方中添加了某一范圍內(nèi)的添加劑，包括不確定的組分如胎牛血清(FCS)、幾種動(dòng)物衍生蛋白和/或牛源蛋白水解物。
通常，血清或血清衍生的物質(zhì)，如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素，可能包含能污染細(xì)胞培養(yǎng)物及由此獲得的生物制品的多余物質(zhì)。此外，必須對(duì)人血清衍生添加物進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)所有已知的能通過(guò)血清傳染的病毒包括肝炎和HIV。此外，牛血清及其衍生產(chǎn)品也有受到BSE(牛海綿狀腦病，瘋牛病)污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，所有血清衍生產(chǎn)品都可能被未知的成分污染。在細(xì)胞培養(yǎng)中血清或蛋白添加劑是來(lái)自于人或其它動(dòng)物源的情況下，特別在細(xì)胞用于生產(chǎn)人用藥物或疫苗情況下，存在許多問(wèn)題(例如不同批次的組合物品質(zhì)不同，以及被支原體、病毒或BSE污染的風(fēng)險(xiǎn))。
于是，人們進(jìn)行了許多的嘗試以提供不需要血清或其他動(dòng)物蛋白組合物的有效寄主系統(tǒng)和培養(yǎng)條件。簡(jiǎn)單的無(wú)血清培養(yǎng)基典型地包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、維生素、氨基酸的有機(jī)鹽或無(wú)機(jī)鹽、以及任意的添加劑組分以生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)性復(fù)合物。
已知大豆水解物適用于發(fā)酵工藝并能促進(jìn)許多需要復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)的生物、酵母和真菌的生長(zhǎng)。WO 96/26266描述了大豆粉的木瓜酶消化物是碳源和氮源，并且許多成分可用于組織培養(yǎng)。Franek等人(Biotechnology Progress(2000)16，688-692)描述了規(guī)定的大豆水解物多肽組分對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)率的促進(jìn)作用。
WO 96/15231公開(kāi)了一種用于脊椎動(dòng)物細(xì)胞的增殖和病毒生產(chǎn)工藝的無(wú)血清培養(yǎng)基，其包含合成的最低必需培養(yǎng)基和酵母提取物。WO 98/15614公開(kāi)了一種培養(yǎng)基配方，其由包含大米多肽和酵母提取物及其酶解物的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基、和/或用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的植物油脂構(gòu)成。WO 01/23527公開(kāi)了一種用于培養(yǎng)重組細(xì)胞的包含純化大豆水解物的培養(yǎng)基。WO00/03000公開(kāi)了一種培養(yǎng)基，其不僅包含大豆水解物和酵母提取物，而且需要含有重組體形式的動(dòng)物蛋白，如生長(zhǎng)因子。
EP-A-0 481 791描述了一種用于培養(yǎng)基因工程CHO細(xì)胞的生化定義的培養(yǎng)基，其不含從動(dòng)物源分離的蛋白質(zhì)、油脂和碳水化合物，但包含重組胰島素或胰島素類(lèi)似物、1％～0.025％w/v的木瓜酶解大豆蛋白胨以及腐胺。WO 98/08934描述了一種無(wú)血清真核細(xì)胞培養(yǎng)，其包含水解的大豆多肽(1-1000mg/L)、0.01～1mg/L的腐胺以及各種動(dòng)物源組分，包括白蛋白、胎球蛋白、各種激素和其他蛋白質(zhì)。在本文中，還應(yīng)注意到，已知腐胺以0.08mg/L的濃度包含于標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基如DMEM/Ham’s F12中。
然而，在本技術(shù)領(lǐng)域中已知的培養(yǎng)基通常營(yíng)養(yǎng)不足和/或必須補(bǔ)充動(dòng)物源蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑或重組體形式的蛋白質(zhì)，如胰島素、類(lèi)似生長(zhǎng)因子的胰島素或其他生長(zhǎng)因子。
因此，目前需要提高表達(dá)的重組蛋白質(zhì)或任何其他表達(dá)產(chǎn)品的產(chǎn)率、以及細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率，并提供完全不含動(dòng)物蛋白的最佳的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于生產(chǎn)生物制品，比如用作人用藥品或疫苗。
基于大豆蛋白胨提取物(也稱(chēng)為“大豆水解物”)，人們已開(kāi)發(fā)出不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。然而，商業(yè)提供的各批次大豆水解物的品質(zhì)差別很大，于是在重組蛋白質(zhì)或病毒產(chǎn)品的生產(chǎn)中，因使用的各批次大豆水解物的差異(“l(fā)ot-to-lot variation，批間偏差”)而導(dǎo)致較大的變化(變化因子可達(dá)到3)。此缺陷影響了細(xì)胞增殖以及各個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)。
于是，人們需要完全不含動(dòng)物蛋白且克服了至少一個(gè)上述問(wèn)題的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其不包含任何添加的補(bǔ)充性動(dòng)物源蛋白質(zhì)和/或重組動(dòng)物蛋白，這使得細(xì)胞有效地生長(zhǎng)，特別是使單位細(xì)胞以表達(dá)量恒定的品質(zhì)來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，以及一種用于有效地表達(dá)重組蛋白的無(wú)動(dòng)物蛋白的方法。
本發(fā)明的另一目的是減少植物和/或酵母衍生水解物，從而克服對(duì)預(yù)期的重組體或病毒產(chǎn)品生產(chǎn)產(chǎn)率產(chǎn)生不利影響的抑制作用。我們意外地發(fā)現(xiàn)水解物是導(dǎo)致產(chǎn)品中出現(xiàn)批間偏差的原因。
根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基包含至少一種多胺和植物和/或酵母衍生水解物，其中多胺優(yōu)選來(lái)源于非蛋白質(zhì)水解物源。
我們意外地發(fā)現(xiàn)，將至少一種多胺，特別是腐胺，添加到無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中，產(chǎn)生了有益的效果，它不僅促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)，而且特別是促進(jìn)了單位細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)，尤其是單位細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)表達(dá)。
此外，根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基使得無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞穩(wěn)定地生長(zhǎng)，并提高預(yù)期產(chǎn)品特別是靶蛋白比如重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，不依賴(lài)于蛋白質(zhì)水解物，特別是植物的水解物品質(zhì)或批次變化。用多胺和植物和/或酵母衍生水解物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行特定的補(bǔ)充，將協(xié)同性地起到提高細(xì)胞生長(zhǎng)率、細(xì)胞比產(chǎn)率以及最終細(xì)胞密度的作用。
于是，與本技術(shù)領(lǐng)域中已知的培養(yǎng)基相比，根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基有利于重組蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基能夠減小少添加到給定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)水解物的量。


圖1是用于比較培養(yǎng)細(xì)胞用培養(yǎng)基的函數(shù)(A)和(B)的示意圖，(A)中所示為GD8/6細(xì)胞的FVlll-CoA容量產(chǎn)率(volumetric FVlll-CoA productivity，表示為[U/L/D]＝FVIII CoA單位/每升反應(yīng)器容積/每天)，(B)中所示為GD8/6細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率(μ，表示為[d-1]＝1/天)，培養(yǎng)基中添加了不同批次(K119-1、K138-1、M022963、M024423、M022453)的大豆水解物(0.4％(w/v))。
圖2所示為表格，用于比較在具有不同大豆水解物濃度的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的GD8/6細(xì)胞的FVIII-CoA容量產(chǎn)率。
圖3是用于比較(A)不含腐胺的條件下與(B)含1mg/L的腐胺二鹽酸鹽的條件下GD8/6細(xì)胞的FVlll-CoA容量產(chǎn)率的示意圖，F(xiàn)Vlll-CoA容量產(chǎn)率為培養(yǎng)細(xì)胞用培養(yǎng)基的函數(shù)，培養(yǎng)基中添加5種不同批次(K119-1、K138-1、M022963、M024423、M022453)的大豆水解物(0.25％(w/v))。
圖4是用于比較(A)不含腐胺的條件下與(B)含1mg/L的腐胺二鹽酸鹽的條件下GD8/6細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率的示意圖，比生長(zhǎng)速率為培養(yǎng)細(xì)胞用培養(yǎng)基的函數(shù)，培養(yǎng)基中添加5種不同批次(K119-1、K138-1、M022963、M024423、M022453)的大豆水解物(0.25％(w/v))。
圖5是示意表，用于比較在具有5種不同挑選批次(K119-1、K138-1、M022963、M024423、M022453)的大豆水解物(0.4％(w/v)或0.25％(w/v))的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的GD8/6細(xì)胞的FVIII-CoA容量產(chǎn)率(QP[U/L/D])和比生長(zhǎng)速率(μ[d-1])以及它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差與在具有相同的大豆水解物(0.25％(w/v))、含1mg/L的腐胺二鹽酸鹽及不含腐胺二鹽酸鹽的培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)量。
圖6是示意表，用于說(shuō)明來(lái)自不同廠商的大豆水解物(在細(xì)胞培養(yǎng)基中為0.4％(w/v))中的平均腐胺濃度。
圖7是示意表，用于比較僅含大豆水解物(0.4％(w/v))與含大豆水解物(0.25％(w/v))和1.8mg/L的腐胺二鹽酸鹽對(duì)分泌單克隆抗體的ARH77細(xì)胞中的容量產(chǎn)率(volumetricproductivity)(用QP表示，[mg IgG1/每升反應(yīng)器體積/每天])和細(xì)胞的比產(chǎn)率(qp[μg IgG1/106個(gè)細(xì)胞/天])的影響。
圖8是示意圖，用于比較僅含大豆水解物(0.25％(w/v))與含大豆水解物(0.25％(w/v))和1mg/L腐胺(1.8mg/L的腐胺二鹽酸鹽)對(duì)重組BHK細(xì)胞的紅細(xì)胞生成素(EPO)比產(chǎn)率(EPO產(chǎn)品(單位)/葡萄糖消耗量(g))的影響。
圖9是示意表，用于比較在較寬濃度范圍(0～18mg/L)內(nèi)腐胺、鳥(niǎo)氨酸以及精胺對(duì)在BAV培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GD8/6細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(μ絕對(duì)值，μ相對(duì)值)和細(xì)胞比產(chǎn)率(Qp絕對(duì)值，Qp相對(duì)值)的影響，該BAV培養(yǎng)基包含0.0％的大豆水解物并不含胺類(lèi)、或者包含0.25％低濃度的大豆水解物并添加有上述濃度范圍的多胺。BAV-SP 0.25％是指包含0.25％大豆水解物的BAV培養(yǎng)基，BAV-SP 0.4％是指包含0.4％大豆水解物的BAV培養(yǎng)基，BAV w/o大豆不含多胺是指既不含大豆水解物也不含多胺的BAV培養(yǎng)基。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一方面涉及一種無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含至少一種多胺和植物和/或酵母衍生水解物，水解物的濃度被充分地降低從而避免水解物潛在的抑制作用。
術(shù)語(yǔ)“多胺”是指任何由碳、氮、以及氫構(gòu)成，并包含兩個(gè)或多個(gè)氨基基團(tuán)的有機(jī)化合物組。例如，該化合物組包括選自于由尸胺、腐胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺、以及鳥(niǎo)氨酸所構(gòu)成的物質(zhì)組中的分子。
除非另有說(shuō)明，否則本文中的濃度值是指游離堿形式的組分。
在無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，存在于培養(yǎng)基中的多胺的濃度范圍為約0.5mg/L～約30mg/L，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.5mg/L～約20mg/L，更進(jìn)一步優(yōu)選為約0.5mg/L～約10mg/L，更優(yōu)選為約2mg/L～約8mg/L，最優(yōu)選為約2mg/L～約5mg/L。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中植物和/或酵母衍生蛋白質(zhì)水解物的總濃度為約0.05％～約5％(w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.05％～約2％(w/v)，更進(jìn)一步優(yōu)選為約0.05％～約1％(w/v)，更優(yōu)選為約0.05％～約0.5％(w/v)，最優(yōu)選為約0.05％～約0.25％(w/v)；即，如果培養(yǎng)基包含植物和酵母衍生蛋白質(zhì)水解物，那么總濃度通過(guò)培養(yǎng)基中包含的各個(gè)蛋白質(zhì)水解物組分的濃度值相加來(lái)計(jì)算。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基”是指不包含來(lái)源于更高級(jí)多細(xì)胞非植物真核生物的蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)組分的培養(yǎng)基。要避免包含的典型蛋白質(zhì)是在血清和血清衍生物中發(fā)現(xiàn)的那些蛋白質(zhì)，例如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和其他生長(zhǎng)因子。無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基也不含任何純化的動(dòng)物衍生產(chǎn)品和重組體動(dòng)物衍生產(chǎn)品、以及蛋白質(zhì)消化物及其提取物或油脂提取物或其純化組分。動(dòng)物蛋白和蛋白質(zhì)組分不同于從植物例如大豆、以及低級(jí)真核生物中獲得的非動(dòng)物蛋白、小分子多肽和低聚肽(通常為10～30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度)，其中低級(jí)真核生物例如是能包含在根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中的酵母。
根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基可以基于任何基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如技術(shù)人員熟知的DMEM、Ham′s F12、Medium199、McCoy或RPMI?；A(chǔ)培養(yǎng)基可以包含許多成分，包括氨基酸、維生素、有機(jī)鹽和無(wú)機(jī)鹽、碳源、以一定含量存在的維持細(xì)胞培養(yǎng)的各種為本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的成分。培養(yǎng)基可以包含輔助性物質(zhì)，比如碳酸氫鈉類(lèi)的緩沖劑、抗氧化劑、抗機(jī)械剪切的穩(wěn)定劑、或蛋白酶抑制劑。視需要，可以添加作為消泡劑的非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇和聚丙二醇的混合物(例如Pluronic F68，SERVA)。
根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基中使用的多胺可以選自于由尸胺、腐胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺、鳥(niǎo)氨酸、以及它們的組合所構(gòu)成的物質(zhì)組。最優(yōu)選無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基中包含鳥(niǎo)氨酸、腐胺和精胺。
在無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基的優(yōu)選實(shí)施方式中，多胺調(diào)控DNA與RNA的合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞膜穩(wěn)定化、和/或抗氧化的DNA保護(hù)。腐胺、亞精胺、精胺、以及鳥(niǎo)氨酸是顯示這些功能的多胺例子。多胺的另一例子是尸胺。
在根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，多胺來(lái)源于非蛋白質(zhì)水解物源。
在無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，存在于培養(yǎng)基中的多胺濃度范圍為約0.5mg/L～約30mg/L，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.5mg/L～約20mg/L，更進(jìn)一步優(yōu)選為約0.5mg/L～約10mg/L，更優(yōu)選為約2mg/L～約8mg/L，最優(yōu)選為約2mg/L～約5mg/L，存在于培養(yǎng)基中的植物和/或酵母衍生蛋白質(zhì)水解物的濃度范圍為約0.05％～約5％(w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.05％～約2％(w/v)，更進(jìn)一步優(yōu)選為約0.05％～約1％(w/v)，更優(yōu)選為約0.05％～約0.5％(w/v)，最優(yōu)選為約0.05％～約0.25％(w/v)。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的植物衍生蛋白質(zhì)水解物選自于由谷類(lèi)水解物和/或大豆水解物所構(gòu)成的物質(zhì)組。大豆水解物可以是高度純化的大豆水解物、純化的大豆水解物或粗制大豆水解物。
術(shù)語(yǔ)“水解物”包括任何植物的酶解物或酵母提取物。水解物可以進(jìn)一步被酶消化，例如用木瓜酶消化，并且/或通過(guò)自溶、熱分解和/或質(zhì)壁分離來(lái)形成。根據(jù)本發(fā)明使用的水解物還可來(lái)自商品，比如購(gòu)自Quest International、Norwich、NY、OrganoTechnie、S.A.France、德國(guó)的Deutsche Hefewerke有限公司、或DMV Intl.Delhi、NY中的HyPep 1510、Hy-Soy、Hy酵母412u和Hi酵母444。酵母提取物和大豆水解物來(lái)源也已在WO 98/15614、WO00/03000、WO 01/23527和US 5,741,705中被公開(kāi)。
由于雜質(zhì)會(huì)影響有效地培養(yǎng)細(xì)胞，故優(yōu)選對(duì)粗制成分進(jìn)行純化來(lái)獲得水解物。通過(guò)超濾或葡聚糖凝膠層析，例如用葡聚糖凝膠25或葡聚糖凝膠G10或等效材料、離子交換層析、親和層析、空間排阻層析或反相層析進(jìn)行純化。組分包含規(guī)定分子量的水解物，其分子量?jī)?yōu)選高達(dá)約1000道爾頓，更進(jìn)一步優(yōu)選高達(dá)到約500道爾頓，最優(yōu)選高達(dá)約350道爾頓。優(yōu)選至少90％的水解物的分子量高達(dá)約1000道爾頓。水解物的平均分子量?jī)?yōu)選在約220～約375道爾頓之間。水解物的pH值應(yīng)在約6.5～約7.5的范圍內(nèi)。優(yōu)選氮的總含量在約5％～約15％之間，優(yōu)選灰分含量高達(dá)約20％。優(yōu)選游離的氨基酸含量在約5％～約30％之間。優(yōu)選內(nèi)毒素的含量低于約500U/g。
本發(fā)明還提供一種方法，其將至少一種多胺添加到包含植物和/或酵母衍生蛋白水解物的無(wú)動(dòng)物蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基中，從而提高培養(yǎng)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)率。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，存在于培養(yǎng)基中的多胺總濃度范圍為約0.5mg/L～約30mg/L，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.5mg/L～約20mg/L，更進(jìn)一步優(yōu)選為約0.5mg/L～約10mg/L，更優(yōu)選為約2mg/L～約8mg/L，最優(yōu)選為約2mg/L～約5mg/L。優(yōu)選多胺選自于由尸胺、腐胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺、鳥(niǎo)氨酸、以及它們的組合所構(gòu)成的物質(zhì)組。優(yōu)選存在于培養(yǎng)基中的植物和/或酵母衍生蛋白質(zhì)水解物的濃度范圍為約0.05％～約5％(w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.05％～約2％(w/v)，更進(jìn)一步優(yōu)選為約0.05％～約1％(w/v)，更優(yōu)選為約0.05％～約0.5％(w/v)，最優(yōu)選為約0.05％～約0.25％(w/v)。
本發(fā)明還涉及一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括下述步驟(a)提供根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，以及(b)使培養(yǎng)基中的細(xì)胞增殖以形成細(xì)胞培養(yǎng)物。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基包含至少一種多胺和植物和/或酵母衍生水解物。優(yōu)選多胺來(lái)源于非蛋白質(zhì)水解物源。
本發(fā)明不限于任何類(lèi)型的細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，使用的細(xì)胞是，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞。細(xì)胞可以是，例如干細(xì)胞或重組基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞、或用于生產(chǎn)病毒產(chǎn)品的病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞還可以是，例如不進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生有益蛋白質(zhì)的細(xì)胞，例如產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，該細(xì)胞可以通過(guò)病毒例如埃-巴氏病毒(Epstein Barr Virus)感染的感染而轉(zhuǎn)變成無(wú)限增殖的狀態(tài)。細(xì)胞還可以是，例如初級(jí)細(xì)胞比如雞胚細(xì)胞、或初級(jí)細(xì)胞系。優(yōu)選細(xì)胞用于體外生產(chǎn)病毒。在優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞可以是BSC細(xì)胞、LLC-MK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、RK細(xì)胞、TCMK-1細(xì)胞、LLCPK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、LLC-RK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、CHO細(xì)胞、NS-1細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、BHK細(xì)胞、293細(xì)胞、RK細(xì)胞、以及雞胚細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，使用的細(xì)胞可以通過(guò)選自于由本領(lǐng)域中眾所周知的分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)、以及恒化培養(yǎng)所構(gòu)成的方法組中的方法來(lái)培養(yǎng)。
本發(fā)明還涉及一種用于表達(dá)靶蛋白比如異源蛋白或同源蛋白或重組蛋白的方法，其包括下述步驟a)提供在根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)物；以及b)將包含編碼靶蛋白的序列的核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞中；c)選取帶有核酸序列的細(xì)胞；以及d)選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)靶蛋白。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基包含至少一種多胺和植物和/或酵母衍生水解物。優(yōu)選多胺來(lái)源于非蛋白質(zhì)水解物源。
包含編碼靶蛋白的序列的核酸序列可以是載體。載體可以是病毒或質(zhì)粒。編碼靶蛋白的序列可以是特定的基因或其生物功能部分。在優(yōu)選實(shí)施方式中，靶蛋白至少是凝血因子如因子VIII(Factor VIII)中的生物活性部分、或至少是包含在紅細(xì)胞和血管生成素比如紅細(xì)胞生成素中的蛋白質(zhì)中生物活性部分，或者是單克隆抗體。
優(yōu)選核酸還包含適于調(diào)控靶蛋白表達(dá)的其他序列，例如本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的作為增強(qiáng)子的啟動(dòng)子序列、TATA盒(TATA boxes)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、多接頭、限制性位點(diǎn)、多A序列(poly-A-sequences)、蛋白質(zhì)加工序列、選擇性標(biāo)記等。
最優(yōu)選的是用于表達(dá)各個(gè)產(chǎn)品的重組載體轉(zhuǎn)化的下述細(xì)胞系用于生產(chǎn)重組凝血因子VIII的CHO細(xì)胞、用于生產(chǎn)重組紅細(xì)胞生成素的BHK細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的埃-巴氏病毒、用于生產(chǎn)人源抗體的無(wú)限增殖化的人B細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)病毒或病毒中一部分的方法，其包括下述步驟a)提供在根據(jù)本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)物；以及b)用病毒感染細(xì)胞；c)選取病毒感染的細(xì)胞；以及d)培養(yǎng)細(xì)胞以繁殖病毒。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基包含至少一種多胺和植物和/或酵母衍生水解物。進(jìn)一步優(yōu)選多胺來(lái)源于非蛋白質(zhì)水解物源。
根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的病毒可以是任何致病病毒，哺乳動(dòng)物病毒，優(yōu)選人的病毒，例如用于天花疫苗的牛痘病毒或減毒的牛痘病毒、冠狀病毒，優(yōu)選例如用于制造SARS疫苗的SARS病毒，正粘病毒，優(yōu)選例如用于制造流感疫苗的流感病毒，副粘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感A或B病毒、羅斯河病毒(Ross River virus)、黃病毒，優(yōu)選例如用于制造各種疫苗的西尼羅病毒(WestNile virus)或FSME病毒(即蜱傳腦炎病毒)、細(xì)小核糖核酸病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒或腺病毒。
病毒可以是野生型病毒、減毒病毒、重排病毒(reassortant virus)或重組病毒或其組合體，例如減毒與重組病毒。此外，可以使用傳染性核酸克隆代替使用實(shí)際的病毒體使細(xì)胞受病毒感染。還可以使用裂解病毒體。
用于表達(dá)蛋白質(zhì)或制造病毒的方法可以用于生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫組合物。
用于制造病毒的方法中所使用的細(xì)胞可以選自于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、以及酵母細(xì)胞所構(gòu)成的物質(zhì)組。優(yōu)選細(xì)胞通過(guò)選自于由分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)、以及恒化培養(yǎng)所構(gòu)成的方法組中的方法來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。
優(yōu)選用于制造病毒或病毒中一部分的帶病毒細(xì)胞的組合物是Vero細(xì)胞/減毒牛痘、Vero細(xì)胞/牛痘、Vero細(xì)胞/甲型肝炎、Vero細(xì)胞/流感病毒、Vero細(xì)胞/西尼羅病毒、Vero細(xì)胞/SARS病毒、雞胚細(xì)胞/FSME病毒。
本發(fā)明還涉及一種用本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)靶蛋白的方法。
根據(jù)下述實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。
實(shí)施例實(shí)施例1(BAV培養(yǎng)基)
用添加了無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素及其它組分(Life technologies，32500 Powder)的DMEM/HAM’s F12(1∶1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)制備無(wú)動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。還添加了L-谷氨酰胺(600mg/L)、抗壞血酸(20μM)、乙醇胺(25μM)、Synperonic(SERVA)(0.25g/L)、亞硒酸鈉(50nM)。此外，向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了必需氨基酸。此外，添加了濃度在0.0％～1.0％范圍內(nèi)變化的大豆水解物(來(lái)自Quest Technologies公司，紐約或DMV國(guó)際公司，紐約)以及濃度變化的多胺(0～10mg/L)(圖1～9)。
實(shí)施例2
重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物(如穩(wěn)定表達(dá)因子VIII的CHO細(xì)胞即GD8/6細(xì)胞)在10升生物反應(yīng)器中用恒化培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)條件恒定地保持為37℃、20％的氧飽和度以及pH 7.0～7.1。恒定地向培養(yǎng)物中補(bǔ)加添加了實(shí)施例1中限定的0.1～1.0％大豆水解物和/或0～1mg/L腐胺二鹽酸鹽的BAV培養(yǎng)基(參照?qǐng)D1～5)。
在37℃、不控制pH和pO2值的條件下，采用分批重復(fù)補(bǔ)料的方式，用GD8/6細(xì)胞在有效容積為200ml的Techne公司的轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。向培養(yǎng)物中補(bǔ)加實(shí)施例1中限定的未添加水解物和多胺的BAV培養(yǎng)基、或補(bǔ)加添加了0.1～0.4％大豆水解物和/或0～18mg/L腐胺二鹽酸鹽、鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽、精胺四鹽酸鹽(等同于0～10mg/L不帶鹽酸基的多胺)的BAV培養(yǎng)基(參照?qǐng)D9)。
實(shí)施例3(參照?qǐng)D1～5、7、以及9)
通過(guò)用Schrfe等人描述的CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Biotechnologie in LaborPraxis 101096-1103(1988))計(jì)數(shù)，或者通過(guò)在用NucleoCounter(Chemometec公司，得克薩斯)計(jì)數(shù)并緊接著進(jìn)行檸檬酸提取和細(xì)胞核熒光染色，來(lái)確定懸浮細(xì)胞或固定化細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。根據(jù)在一定的時(shí)間間隔(t)內(nèi)，恒化培養(yǎng)中懸浮細(xì)胞處于穩(wěn)定期時(shí)的細(xì)胞密度(Xt)和/或稀釋率(D)的增加來(lái)計(jì)算比生長(zhǎng)速率(μ)μ＝D+ln(Xt/X0)/t實(shí)施例4
凝血因子VIII(FVIII)的活性(參照?qǐng)D1～5和9)通過(guò)顯色試驗(yàn)(Chromogenic公司，瑞典)來(lái)測(cè)量。紅細(xì)胞生成素的活性(參照?qǐng)D8)與單克隆抗體的滴度(參照?qǐng)D7)通過(guò)ELISA測(cè)試系統(tǒng)來(lái)測(cè)量。
根據(jù)每天每升反應(yīng)器體積內(nèi)產(chǎn)生的活度單位量或抗原滴度的數(shù)值(U/L/d或mg/L/d)來(lái)計(jì)算各個(gè)生產(chǎn)體系的容量產(chǎn)率。
細(xì)胞的比產(chǎn)率定義為每日每一定量的細(xì)胞所產(chǎn)蛋白質(zhì)的單位含量(U或μg)(參照?qǐng)D7和9)，或者為單位細(xì)胞消耗的D-葡萄糖所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的單位含量(U)(參照?qǐng)D9)。
實(shí)施例5
用含0.4％(w/v)不同批次大豆水解產(chǎn)物的BAV培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)GD8/6細(xì)胞。不同批次之間的FVIII容量產(chǎn)率在約600～1800U/L/d范圍內(nèi)變化，比生長(zhǎng)速率在0.35～0.52μ[d-1]范圍內(nèi)變化(比較圖1)。這說(shuō)明0.4％濃度的各批次大豆水解物不能使GD8/6細(xì)胞恒定地生長(zhǎng)，這可能是由于包含在大豆水解物中的抑制物質(zhì)影響了比生長(zhǎng)速率(μ)之故。
實(shí)施例6
用包含不同濃度(在0.15～1.0％w/v的范圍內(nèi))的批次為M022257的大豆水解物的BAV培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)GD8/6細(xì)胞。FVI1I容量產(chǎn)率在500U/L/d～1100U/L/d范圍內(nèi)變化，于是在0.4％(w/v)的大豆水解物濃度下達(dá)到1100U/L/d的最佳產(chǎn)率(參照?qǐng)D2)。
實(shí)施例7
分別用如實(shí)施例5中描述的包含0.25％(w/v)的5種不同批次大豆水解物的BAV培養(yǎng)基(圖3A和4A)、和包含相同批次的0.25％(w/v)大豆水解物并補(bǔ)充添加了1mg/L腐胺二鹽酸鹽的BAV培養(yǎng)基(圖3B和4B)來(lái)培養(yǎng)GD8/6細(xì)胞。在包含0.25％(w/v)不同批次大豆水解物的BAV培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞，其FVIII容量產(chǎn)率在1700U/L/d～500U/L/d范圍內(nèi)變化(圖3A)。比生長(zhǎng)速率在0.58～0.24μ[d-1]范圍內(nèi)變化，這說(shuō)明大豆水解物濃度的降低并沒(méi)有提高細(xì)胞的生長(zhǎng)率，或使細(xì)胞的生長(zhǎng)率更穩(wěn)定(圖4A)。
相反，當(dāng)在包含0.25％(w/v)大豆水解物的BAV培養(yǎng)基中添加1mg/L的腐胺二鹽酸鹽時(shí)，觀察到在其內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞中，其FVIII容量產(chǎn)率(圖3B)和比生長(zhǎng)速率(圖4B)在相同批次的大豆水解物之間發(fā)生較小的變化。添加1 mg/L的腐胺二鹽酸鹽基本上補(bǔ)償了因大豆水解物濃度從0.4％(w/v)降低到0.25％(w/v)而導(dǎo)致的多胺的減小。由此可以推斷，不是因?yàn)槎喟窛舛缺旧?，而是因?yàn)樘砑佣喟放c降低大豆水解物濃度的組合效應(yīng)才導(dǎo)致了使生長(zhǎng)率和產(chǎn)率降低的抑制物質(zhì)的減少(見(jiàn)實(shí)施例5)。此外，添加腐胺還導(dǎo)致FVIII因細(xì)胞的FVIII比產(chǎn)率的增加而具有非正比增加的容量產(chǎn)率(圖5)。
于是，向無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加腐胺不僅促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)率，而且還降低了為獲得相同細(xì)胞生長(zhǎng)率而包含在培養(yǎng)基中的植物水解物含量。于是，培養(yǎng)基更少受到植物水解物品質(zhì)的批間偏差的影響，從而使細(xì)胞的培養(yǎng)條件總體上得到改善。
實(shí)施例8
圖5包括對(duì)圖1、2和4所示實(shí)施例的統(tǒng)計(jì)分析分別用包含0.4％(w/v)大豆水解物、或0.25％(w/v)大豆水解物、或0.25％(w/v)的大豆水解物和1mg/L的腐胺二鹽酸鹽的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)GD816細(xì)胞。根據(jù)選擇的五個(gè)批次的大豆水解物(K119-1、K138-1、M022963、M024423、M022453)來(lái)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。具有0.25％(w/v)大豆水解物的容量產(chǎn)率和細(xì)胞的FVIII比產(chǎn)率及比生長(zhǎng)速率低于具有0.4％(w/v)大豆水解物的對(duì)應(yīng)項(xiàng)，這證實(shí)了圖2中描述的最佳條件。然而，在包含0.25％(w/v)大豆水解物和1mg/L腐胺二鹽酸鹽的細(xì)胞培養(yǎng)基中，容量產(chǎn)率和細(xì)胞的FVlll比產(chǎn)率及比生長(zhǎng)速率得到提高。此外，由5種不同批次大豆水解物中計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯降低(參照?qǐng)D5，[QP[U/L/D]＝容量產(chǎn)率；qp[mU/106個(gè)細(xì)胞/天]＝細(xì)胞的比產(chǎn)率)。
實(shí)施例9
實(shí)施例7和8表明腐胺是一種促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，更具體地講是促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)的活性化合物。于是，用HPLC方法定量地分析來(lái)自2個(gè)不同供應(yīng)商(Quest和DMV)的不同批次大豆水解物中的腐胺濃度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。當(dāng)大豆水解物以0.4％(w/v)的濃度添加到培養(yǎng)基時(shí)，用來(lái)自兩個(gè)供應(yīng)商的大豆水解物制備的細(xì)胞培養(yǎng)基中腐胺的濃度約為2.3mg/L(參照?qǐng)D6)。
實(shí)施例10
在將ARH77細(xì)胞(穩(wěn)定地表達(dá)hIgG的人類(lèi)淋巴母細(xì)胞的細(xì)胞系)固定于大孔隙微載體上后，于37℃、pH7.0～7.2以及pO2為20％～80％的空氣飽和狀態(tài)下，在裝有包含0.4％(w/v)大豆水解物或0.25％(w/v)大豆水解物和1.8 mg/L的腐胺二鹽酸鹽的BAV培養(yǎng)基的80L的攪拌槽式生物反應(yīng)器中，用灌流培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)用于表示各個(gè)培養(yǎng)基配方相對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定狀態(tài)的數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算數(shù)值平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在添加了0.4％(w/v)大豆水解物的BAV培養(yǎng)基中的hIgG容量產(chǎn)率/細(xì)胞比產(chǎn)率低于在添加了0.25％(w/v)大豆水解物和1.8mg/L腐胺二鹽酸鹽的BAV培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)量。該實(shí)驗(yàn)表明，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基組合物還能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的單克隆抗體表達(dá)。此外，特定的培養(yǎng)基組合物還可用于灌流培養(yǎng)(參照?qǐng)D7)。
實(shí)施例11
重組BHK細(xì)胞在包含5％(v/v)胎牛血清的培養(yǎng)基中聚集生長(zhǎng)。用無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，接著在添加了0.25％(w/v)大豆水解物或0.25％(w/v)大豆水解物和1.8mg/L腐胺二鹽酸鹽的BAV培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天(圖8)。由于在此實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，故在三天后對(duì)葡萄糖消耗率(g/L)進(jìn)行測(cè)量，從而確認(rèn)在培養(yǎng)體系中的等同生物量。EPO活性(mU/ml)與三天后的葡萄糖消耗量(g/L)相關(guān)。相對(duì)于僅添加0.25％(w/v)大豆蛋白胨的培養(yǎng)基，添加腐胺使EPO產(chǎn)率增加了16％。該實(shí)驗(yàn)還表明，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基組合物能夠促進(jìn)不同的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。
實(shí)施例12
為證實(shí)在更寬濃度范圍內(nèi)腐胺、鳥(niǎo)氨酸和精胺(0～18mg/L等同于0～10mg/L不帶鹽酸基的多胺)的特定作用，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)在包含0.25％和0.4％不含多胺的大豆水解物的BAV培養(yǎng)基中、以及包含減小濃度的0.25％大豆水解物且具有上述濃度范圍的多胺的BAV培養(yǎng)基中，將G08/6細(xì)胞以1～1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml的速率在Techne公司的轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)。與沒(méi)有添加多胺的具有0.25％大豆水解物、或具有增加濃度的0.4％大豆水解物的培養(yǎng)基配方相比，在研究的濃度范圍內(nèi)的所有三種多胺均導(dǎo)致了細(xì)胞的比產(chǎn)率(表示為mU/106個(gè)細(xì)胞/天)明顯增加。細(xì)胞比產(chǎn)率的增加顯然與增加的比生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān)，這證實(shí)了多胺對(duì)GD8/6細(xì)胞的重組FVIII表達(dá)速率具有特定的影響(圖9)。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含至少一種多胺和至少一種來(lái)源于由植物和酵母所構(gòu)成組中的蛋白質(zhì)水解物。
2.如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多胺以約0.5mg/L～約10mg/L的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
3.如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多胺選自于由尸胺、腐胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺、鳥(niǎo)氨酸、及其組合所構(gòu)成的組。
4.如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多胺是濃度為約0.5mg/L～約10mg/L的腐胺，所述蛋白質(zhì)水解物是濃度為約0.05％(w/v)～約5％(w/v)的大豆水解物。
5.如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多胺來(lái)源于非蛋白質(zhì)水解物源。
6.如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多胺以約0.5mg/L～30mg/L的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
7.如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中所有所述蛋白質(zhì)水解物的總濃度為約0.05％(w/v)～約5％(w/v)。
8.如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述蛋白質(zhì)水解物來(lái)源于選自于由谷物和大豆所構(gòu)成的組中的植物。
9.一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括下述步驟(a)提供如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，以及(b)在所述培養(yǎng)基中使細(xì)胞增殖以形成細(xì)胞培養(yǎng)物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞選自于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、以及酵母細(xì)胞所構(gòu)成的細(xì)胞組。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，通過(guò)選自于由分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)、以及恒化培養(yǎng)所構(gòu)成的方法組中的方法來(lái)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
12.一種用于表達(dá)靶蛋白的方法，其包括下述步驟a)提供在如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的所述細(xì)胞的培養(yǎng)物；b)將包含用于編碼所述靶蛋白的序列的核酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞；c)選取帶有所述核酸序列的細(xì)胞；以及d)選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)所述靶蛋白。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞選自于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、以及酵母細(xì)胞所構(gòu)成的細(xì)胞組。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞/靶蛋白組合選自于由CHO細(xì)胞/凝血因子VIII、BHK細(xì)胞/紅細(xì)胞生成素、轉(zhuǎn)化埃-巴氏病毒、無(wú)限增殖化人B細(xì)胞/人源抗體所構(gòu)成的組合組。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，通過(guò)選自于由分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)、以及恒化培養(yǎng)所構(gòu)成的方法組中的方法來(lái)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
16.一種用于生產(chǎn)病毒的方法，其包括如下步驟a)提供在如權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)物；b)用病毒感染所述細(xì)胞；c)選取受所述病毒感染的細(xì)胞；以及d)培養(yǎng)所述細(xì)胞以繁殖病毒。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞選自于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、以及酵母細(xì)胞所構(gòu)成的細(xì)胞組。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞/病毒組合選自于由Vero細(xì)胞/減毒牛痘、Vero細(xì)胞/牛痘、Vero細(xì)胞/甲型肝炎、Vero細(xì)胞/流感病毒、Vero細(xì)胞/西尼羅病毒、Vero細(xì)胞/SARS病毒、以及雞胚細(xì)胞/FSME病毒所構(gòu)成的組合組。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，通過(guò)選自于由分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)、以及恒化培養(yǎng)所構(gòu)成的方法組中的方法來(lái)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及無(wú)動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含多胺和植物和/或酵母衍生水解物。本發(fā)明還涉及無(wú)動(dòng)物蛋白培養(yǎng)的工藝，其中細(xì)胞在該培養(yǎng)基中于不添加補(bǔ)充性動(dòng)物蛋白的條件下進(jìn)行培養(yǎng)、增殖和傳代。這些工藝適用于培養(yǎng)細(xì)胞，例如重組細(xì)胞或感染了病毒的細(xì)胞，并且適用于通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)工藝來(lái)生產(chǎn)生物制品。
文檔編號(hào)C12N7/02GK101065480SQ200580036744
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者利奧波德·格里爾博格, 曼弗雷德·賴(lài)特爾, 沃爾夫?qū)っ商? 弗里德里?！ざ酄柤{ 申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際公司, 巴克斯特保健股份有限公司