專利名稱：來(lái)自干細(xì)胞的血小板的制作方法
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關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明待定。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞定義為能夠分化為許多其它分化細(xì)胞類型的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是來(lái)自胚胎的干細(xì)胞，能夠分化為成熟機(jī)體的大多數(shù)(如果不是全部)分化細(xì)胞類型。干細(xì)胞稱為多潛能，描述了這些細(xì)胞分化為許多細(xì)胞類型的能力。研究團(tuán)體非常感興趣的一類多潛能干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞，有時(shí)寫為hES或人ES細(xì)胞，即衍生自人胚胎來(lái)源的胚胎干細(xì)胞?？茖W(xué)研究對(duì)人胚胎干細(xì)胞很感興趣，因?yàn)檫@些細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中無(wú)限增殖，并能分化為其它細(xì)胞類型，因此能夠(至少在原理上)提供細(xì)胞和組織來(lái)替代衰竭或缺陷的人組織。培養(yǎng)物的人胚胎干細(xì)胞可能提供無(wú)限量的有助于人類健康科學(xué)研究和各種治療方案的遺傳穩(wěn)定性人細(xì)胞和組織。也考慮到，將來(lái)，可使人胚胎干細(xì)胞增殖和定向分化為特定譜系細(xì)胞，從而發(fā)育成為用于治療目的的移植或輸入人體的分化細(xì)胞或組織。
血小板是血液凝固所必需的血液組分。血小板是亞細(xì)胞血液組分，它沒有細(xì)胞核，但有細(xì)胞膜、受體、酶、顆粒和其它細(xì)胞成分，因此血液中血小板能夠?qū)θ舾梢蜃悠鸱磻?yīng)而引起血凝塊的形成。當(dāng)患者在戰(zhàn)場(chǎng)上發(fā)生大量外傷性失血、接觸化學(xué)品或受到高劑量輻射和發(fā)生各種其它醫(yī)學(xué)狀況，如血小板減少時(shí)，尤其是為治療白血病患者而清除骨髓后，需要進(jìn)行血小板輸入。血小板的儲(chǔ)存壽命短(FDA和AABB規(guī)定一般僅5天)導(dǎo)致戰(zhàn)場(chǎng)上和民用衛(wèi)生系統(tǒng)血小板短缺。
在目前出于醫(yī)學(xué)目的儲(chǔ)存的所有血液細(xì)胞組分中，血小板最脆弱。目前沒有臨床上可應(yīng)用的方法長(zhǎng)期儲(chǔ)存血小板。對(duì)于現(xiàn)代衛(wèi)生機(jī)構(gòu)而言，血小板儲(chǔ)存期為5天，留出測(cè)試和運(yùn)輸時(shí)間后，轉(zhuǎn)換成臨床儲(chǔ)存期為3-4天。許多血庫(kù)在保持血小板新鮮和儲(chǔ)存方面有后勤困難。向軍用戰(zhàn)地醫(yī)院可靠地提供血小板的困難甚至更大。
在體內(nèi)，血小板產(chǎn)生自稱為巨核細(xì)胞所形成的前體血小板加工。研究表明由成年小鼠和人的造血干細(xì)胞分化產(chǎn)生巨核細(xì)胞，但此分化的分子機(jī)制尚不明了。長(zhǎng)期培養(yǎng)成年動(dòng)物造血干細(xì)胞和巨核細(xì)胞很困難，這使得幾乎不可能對(duì)這些細(xì)胞的進(jìn)行純化和遺傳學(xué)操作。不存在天然的人巨核細(xì)胞cDNA文庫(kù)，沒有可用的正常巨核細(xì)胞的遺傳分布狀況。已證明小鼠胚胎干細(xì)胞在體外能分化產(chǎn)生血小板，但仍未證明這些血小板具有生物學(xué)功能。人和小鼠血小板差異顯著。與人血小板相比，小鼠血小板較小，并顯示有更為顯著的顆粒異質(zhì)性。人和小鼠巨核細(xì)胞釋放血小板的機(jī)制似乎顯著不同。
仍然明顯缺乏對(duì)血小板形成過(guò)程和血小板從巨核細(xì)胞出芽過(guò)程的理解。接受的論點(diǎn)是，諸因子的聯(lián)合作用，包括血漿和內(nèi)皮結(jié)合的膜因子、巨核細(xì)胞細(xì)胞骨架或細(xì)胞器重排和血流造成的剪切力，綜合導(dǎo)致成熟血小板從巨核細(xì)胞上形成的前體血小板結(jié)構(gòu)上分離下來(lái)。然而，此觀點(diǎn)未得到充分證明，血小板形成和從巨核細(xì)胞分離下來(lái)仍然是亟待揭示的研究領(lǐng)域。
發(fā)明概述本發(fā)明小結(jié)了產(chǎn)生人血小板的方法，其包括以下步驟在有利于人胚胎干細(xì)胞分化為造血譜系細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞；培養(yǎng)造血譜系細(xì)胞成為巨核細(xì)胞；培養(yǎng)巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板；和回收血小板。
本發(fā)明也小結(jié)了以治療有效量體外產(chǎn)生所需量的人血小板。
本發(fā)明特征是體外產(chǎn)生的血小板不會(huì)結(jié)合人血流中所遭遇的因子。
通過(guò)以下說(shuō)明書可以看出本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖
簡(jiǎn)要說(shuō)明無(wú)。
發(fā)明詳述本文考慮的是通過(guò)體外培養(yǎng)和從人胚胎干細(xì)胞開始分化的方法產(chǎn)生血小板。體外培養(yǎng)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞(hES細(xì)胞)產(chǎn)生巨核細(xì)胞，再培養(yǎng)這些巨核細(xì)胞產(chǎn)生有生物學(xué)功能的人血小板。認(rèn)為該方法可通過(guò)三個(gè)主要步驟完成。第一個(gè)主要步驟是使人ES細(xì)胞定向分化為造血細(xì)胞，進(jìn)而，可以幾種方式完成分化過(guò)程。本文詳細(xì)描述了使hES細(xì)胞分化為造血譜系細(xì)胞的兩種方法。在造血分化方法的一種技術(shù)中，采用目前已知的技術(shù)培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)以形成胚狀體(embryoid body，EB)。培養(yǎng)該胚狀體，使其開始分化為各種分化細(xì)胞類型，然后使胚狀體解聚；用巨核細(xì)胞前體選擇性培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液。借助時(shí)程cDNA微陣列分析的幫助，我們確定了最優(yōu)時(shí)機(jī)來(lái)收獲具有最高造血潛能的明確的造血細(xì)胞。已經(jīng)證明足以產(chǎn)生造血細(xì)胞的其它技術(shù)要求人ES細(xì)胞接觸基質(zhì)細(xì)胞，這種接觸能引起ES細(xì)胞優(yōu)先分化為造血譜系的細(xì)胞。這些方法任一的結(jié)果是將細(xì)胞，主要是ES細(xì)胞衍生的造血細(xì)胞培養(yǎng)至某種純度。我們特別優(yōu)選胚狀體方法，不僅因?yàn)樗鼪]有各種類型的飼細(xì)胞的污染，而且可用成分明確的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。在該方法的第二主要部分中，然后使這些造血細(xì)胞接觸含有生長(zhǎng)因子的巨核細(xì)胞形成選擇培養(yǎng)基，所述生長(zhǎng)因子能特異性促進(jìn)巨核細(xì)胞形成和成熟。最后，使這些成熟的巨核細(xì)胞接觸血小板形成培養(yǎng)基，以促進(jìn)體外血小板生產(chǎn)。在所有這些過(guò)程中，可避免采用動(dòng)物或人的血清和血漿。
血小板是從hES細(xì)胞產(chǎn)生人用生物產(chǎn)品的示范性靶點(diǎn)，因?yàn)檠“宀粩y帶染色體遺傳物質(zhì)?？烧J(rèn)為血小板是母體巨核細(xì)胞的胞質(zhì)片段。重要的是，血小板具有可導(dǎo)致粘附、凝集和顆粒分泌的細(xì)胞表面因子。由于血小板成熟過(guò)程和血小板從巨核細(xì)胞上脫落的過(guò)程都是了解甚少的過(guò)程，還不知道是否可從人ES細(xì)胞衍生的體外細(xì)胞培養(yǎng)物回收到有生物功能的血小板。本文揭示，可從這些細(xì)胞培養(yǎng)物回收有用量的血小板。
重要的是，本文也證明了經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)的人巨核細(xì)胞能形成血小板并使其脫落。由于對(duì)此過(guò)程有關(guān)的詳細(xì)生物學(xué)機(jī)制的知識(shí)不確定，目前還不了解此過(guò)程會(huì)否或可否在培養(yǎng)物中發(fā)生。本文結(jié)果證明該過(guò)程可發(fā)生并確實(shí)發(fā)生。
該過(guò)程從hES細(xì)胞開始，hES細(xì)胞定義為培養(yǎng)中的未分化細(xì)胞。目前證明，可誘導(dǎo)hES細(xì)胞分化為主要是造血譜系細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。迄今為止的文獻(xiàn)中，已知有兩種不同技術(shù)能實(shí)現(xiàn)這種定向分化，也考慮了可能有效的其它技術(shù)。一種已知技術(shù)需要產(chǎn)生胚狀體，該胚狀體是具有三維結(jié)構(gòu)的hES細(xì)胞的聚集體，該結(jié)構(gòu)似乎有利于干細(xì)胞分化為定型的后代譜系?？捎眠x擇性方案分離這些能產(chǎn)生各種譜系分化細(xì)胞的胚狀體中的某譜系細(xì)胞，如造血譜系細(xì)胞。我們進(jìn)行的造血過(guò)程的詳細(xì)時(shí)程分析為我們提供了這些造血前體細(xì)胞的遺傳分布狀況，同時(shí)，我們優(yōu)化了我們的方案而得到最高產(chǎn)率。其它已知技術(shù)包括hES細(xì)胞與人或非人基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)。與基質(zhì)細(xì)胞的共同培養(yǎng)似乎也能誘導(dǎo)hES細(xì)胞主要產(chǎn)生造血細(xì)胞，但可能要對(duì)現(xiàn)有技術(shù)依據(jù)的某些培養(yǎng)條件尋求避免方法。
發(fā)現(xiàn)能提高各種造血譜系細(xì)胞產(chǎn)率的EB法中的中間步驟是使EB片段化。EB的特征之一是EB可生長(zhǎng)得很大，以致于超過(guò)培養(yǎng)基通過(guò)擴(kuò)散向中心細(xì)胞提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物的能力。結(jié)果可能是EB中心產(chǎn)生壞死區(qū)域，這也引起EB細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，通過(guò)物理方法將EB切塊使EB片段化，可以重啟EB的生長(zhǎng)，產(chǎn)生更多的分化細(xì)胞。我們了解，采用這種技術(shù)導(dǎo)致整個(gè)方法回收的血細(xì)胞數(shù)量顯著增加。可用各種機(jī)械裝置和系統(tǒng)進(jìn)行EB的片段化或切塊加工。
一旦造血譜系細(xì)胞產(chǎn)生后，培養(yǎng)細(xì)胞，以優(yōu)先產(chǎn)生巨核細(xì)胞。優(yōu)先產(chǎn)生巨核細(xì)胞的培養(yǎng)條件將提高培養(yǎng)物中巨核細(xì)胞相對(duì)于其它血液產(chǎn)品前體細(xì)胞的比例，但此方法不是絕對(duì)需要的。有利于產(chǎn)生未成熟和成熟的巨核細(xì)胞的條件包括用血小板生成素(TPO)、白介素3(IL3)、白介素6(IL6)和干細(xì)胞因子培養(yǎng)前體細(xì)胞培養(yǎng)物。如果存在bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，則可進(jìn)一步擴(kuò)增未成熟的巨核細(xì)胞。用此方法獲得的巨核細(xì)胞是CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD62P、CD38、弱CD45陽(yáng)性，但是HLA-DR、CD34、CD117陰性的細(xì)胞。正常的成熟巨核細(xì)胞這種免疫表型分布恒定。沒有顯著的CD45+細(xì)胞群說(shuō)明，白細(xì)胞污染非常少(如果存在)。
然后通過(guò)培養(yǎng)使巨核細(xì)胞形成和釋放血小板。雖然不完全了解引起血小板體內(nèi)釋放的確切機(jī)制，但可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)使母體巨核細(xì)胞釋放血小板。有四種因素可能非常重要，即剪切力、巨核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用、血漿因子、最后是巨核細(xì)胞中的分子機(jī)制?？赏ㄟ^(guò)物理操作培養(yǎng)容器例如振蕩、旋轉(zhuǎn)或類似方法激發(fā)對(duì)血液的剪切力。血漿蛋白和血小板受體激活的釋放作用可能是通過(guò)巨核細(xì)胞本身的激活，或者按需單獨(dú)添加其它因子。在某些先天性血小板異常如伯-索病和馮維樂布蘭德因子(VWF)病曾報(bào)導(dǎo)觀察到大的血小板。我們?cè)谝恍┡郀铙w衍生的血小板中觀察到一些相似的大血小板。如果觀察到這種現(xiàn)象，則是因?yàn)槿鄙傺獫{因子如VWF引起前體血小板無(wú)效地收聚血小板，可通過(guò)僅加入VWF或加入含有VWF的血漿解決這一問(wèn)題。假定cGMP可促進(jìn)從新生巨核細(xì)胞形成血小板。cGMP可用一氧化氮激活。我們發(fā)現(xiàn)，加入一氧化氮釋放化合物GNSO可在2小時(shí)內(nèi)使巨核細(xì)胞快速片段化為小血小板樣顆粒。最后，此過(guò)程的副產(chǎn)物是相對(duì)純的內(nèi)皮細(xì)胞。我們通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定，內(nèi)皮細(xì)胞是否能幫助血小板脫落。通過(guò)所有這些技術(shù)，我們顯著提高血小板形成的效率和規(guī)律性。為了理解血小板的生物學(xué)機(jī)制，我們建立了3D實(shí)時(shí)熒光顯微術(shù)來(lái)記錄存在或不存在血漿時(shí)血小板的釋放。我們能夠記錄前體血小板的3D圖像，目前我們正在進(jìn)行時(shí)間推移研究，以更好地監(jiān)測(cè)此過(guò)程。
然后，收集和包裝血小板。在第12天巨核細(xì)胞分化末期，將非粘附性巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有3μM孔徑濾器的多孔板的上部孔中。在培養(yǎng)箱中孵育，溫和振蕩并加入GNSO。在下室中收集血小板(如果需要存在人血漿或生理濃度的VWF和纖維蛋白原)。依次離心純化從這種體外系統(tǒng)分離得到的血小板，重懸于檸檬酸鹽緩沖液，用作供體血小板。進(jìn)一步低速離心(3000g 30分鐘)收集的血小板，以分離其它碎片，然后通過(guò)合適孔徑的濾器過(guò)濾，以去除任何有核細(xì)胞。如此產(chǎn)生的含有血小板的產(chǎn)品特征是可將血小板濃縮至任何所需濃度?？蛇M(jìn)一步純化體外產(chǎn)生的血小板，成為無(wú)血清或無(wú)血漿的產(chǎn)品，以適合具體的臨床需要?？梢圆?yīng)該對(duì)所有容器進(jìn)行滅菌以降低細(xì)菌污染，這是常規(guī)來(lái)源供體血小板的共同問(wèn)題。
如此從體外細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的血小板不同于目前科學(xué)研究或醫(yī)療所用的血小板，因?yàn)檫@些血小板不曾接觸過(guò)血流。在生物體內(nèi)產(chǎn)生的血小板不能完全與血漿分離。結(jié)果是，目前醫(yī)用的包裝血小板常常攜帶少量白細(xì)胞和血漿污染物，這些污染物可在一些患者中引起輸血反應(yīng)。此體外系統(tǒng)從人ES細(xì)胞分化產(chǎn)生的血小板將不含白細(xì)胞，并且從未接觸過(guò)血清或血漿。如果培養(yǎng)或分離過(guò)程中加入過(guò)纖維蛋白原或VWF，此體外系統(tǒng)產(chǎn)生的血小板僅攜帶纖維蛋白原或VWF。
相關(guān)的問(wèn)題是，一些免疫球蛋白自發(fā)性地粘附于血小板。因此，從獻(xiàn)血員分離的血小板不可避免地?cái)y帶該獻(xiàn)血員的免疫球蛋白分子，這是產(chǎn)生副反應(yīng)的另一個(gè)可能的原因。在體外從ES細(xì)胞產(chǎn)生的血小板不曾接觸過(guò)IgG，因此不含它們?！錋BO″血型抗原也出現(xiàn)在血小板上，雖然很弱。仍不了解血小板輸注時(shí)偶然發(fā)生的ABO血型反應(yīng)是源自血小板或是源自血清污染物。血小板中不存在Rh因子。因此，此法產(chǎn)生的血小板更適合醫(yī)學(xué)和科學(xué)應(yīng)用，也不難與常規(guī)分離技術(shù)產(chǎn)生的血小板相區(qū)分。
實(shí)施例胚狀體的造血前體細(xì)胞胚狀體(EB)形成是用于研究小鼠和人ES細(xì)胞的造血分化的一種方法。然而，不像小鼠ES細(xì)胞那樣，人ES細(xì)胞的單細(xì)胞懸液不能有效形成胚狀體。但是，為了由人ES細(xì)胞形成胚狀體，用0.5mg/ml分散酶消化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上培養(yǎng)的人ES細(xì)胞的完整集落5分鐘，形成小細(xì)胞集落。然后在含血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基(20％FCS)中使這些細(xì)胞集落進(jìn)一步凝集。容易區(qū)分的細(xì)胞團(tuán)塊與不參與形成細(xì)胞團(tuán)塊而凋亡的單個(gè)細(xì)胞一起培養(yǎng)6天后，開始形成胚狀體。培養(yǎng)12天后，胚狀體組裝成早期卵黃囊胚胎結(jié)構(gòu)。制作該胚狀體的切片隨后用CD34抗體免疫標(biāo)記該切片顯示有卵黃囊的組織學(xué)特征。發(fā)現(xiàn)非粘附性造血前體細(xì)胞存在于小血管和內(nèi)皮襯里的內(nèi)腔中，顯示這些細(xì)胞為CD34陽(yáng)性細(xì)胞。然后，用37℃胰蛋白酶消化(0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA)處理胚狀體。將約105含有原代造血前體細(xì)胞的胚狀體衍生細(xì)胞接種于甲基纖維素培養(yǎng)基(Stem Cell Inc.Canada)培養(yǎng)10-12天。然后通過(guò)天然紅色或用單克隆抗-CD41或CD61抗體作免疫標(biāo)記檢測(cè)紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞集落形成單位(CFU)。第12天該明確的造血前體細(xì)胞形成了巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞集落。此活性代表第一波原代和明確的造血過(guò)程。我們現(xiàn)在建立了不含動(dòng)物和人血清的無(wú)血清胚狀體培養(yǎng)體系。
胚狀體-衍生的巨核細(xì)胞前體的體外擴(kuò)增形成和培養(yǎng)胚狀體12天后，37℃用膠原酶(1mg/ml)處理30分鐘和用胰蛋白酶(0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA)消化5分鐘得到的細(xì)胞培養(yǎng)物制備單細(xì)胞懸液。將CD34+細(xì)胞與其它EB細(xì)胞分離，因?yàn)樗鼈兛赡芨蓴_造血過(guò)程。在血小板生成素(TPO)、白介素3(IL3)、白介素6(IL6)和干細(xì)胞因子(SCF)的存在下在聚-HEME表面上培養(yǎng)CD34+細(xì)胞，選擇的所有因子能特異性促進(jìn)巨核細(xì)胞分化和增殖。每106初始ES細(xì)胞獲得106個(gè)CD41+巨核細(xì)胞的產(chǎn)量(n＝6)。有趣的是，接種于膠原半固體基質(zhì)時(shí)，這些巨核細(xì)胞形成極長(zhǎng)的突起，其中珠樣結(jié)構(gòu)代表前體血小板。當(dāng)嘗試用成人造血干細(xì)胞或小鼠ES細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生巨核細(xì)胞時(shí)，沒有報(bào)道過(guò)這種長(zhǎng)結(jié)構(gòu)。檢測(cè)到鑒定為釋放的血小板的小CD41陽(yáng)性細(xì)胞片段接近巨核細(xì)胞(所產(chǎn)生的)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)這些巨核細(xì)胞是CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD38、CD45(弱)和CD62P陽(yáng)性，但是CD34、CD117和HLA-DR陰性的細(xì)胞。此表型特征與正常的人成熟巨核細(xì)胞一致。
在基質(zhì)層上人ES細(xì)胞分化為巨核細(xì)胞OP9基質(zhì)細(xì)胞系是由新生顱蓋op/op缺陷型小鼠建立的細(xì)胞系，用于支持小鼠造血。op/op小鼠的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)基因的編碼區(qū)中有一突變。用OP9系統(tǒng)使人ES細(xì)胞分化為造血譜系細(xì)胞的結(jié)果類似于通過(guò)胚狀體形成分化人ES細(xì)胞的方法，但基質(zhì)細(xì)胞法通?？僧a(chǎn)生較高產(chǎn)量的更成熟的前體細(xì)胞。簡(jiǎn)要說(shuō)，將人ES細(xì)胞接種于匯合的OP9基質(zhì)細(xì)胞，然后用補(bǔ)充有20％胎牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在六孔板中以每孔105個(gè)ES細(xì)胞或在10cm2培養(yǎng)皿中以8×105個(gè)細(xì)胞開始分化。培養(yǎng)6天后，ES細(xì)胞分化為造血祖細(xì)胞，細(xì)胞顯示為CD34+細(xì)胞表面標(biāo)記陽(yáng)性。為了分化為巨核細(xì)胞，在第6天用胰蛋白酶處理細(xì)胞(0.05％胰蛋白酶/0.53mMEDTA，37℃/5％CO2)5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到含10ng/ml TPO的相同培養(yǎng)基中的新鮮匯合OP9細(xì)胞上傳代。再培養(yǎng)8天后，目測(cè)觀察到開始出現(xiàn)巨核細(xì)胞。通過(guò)CD41免疫染色確認(rèn)，培養(yǎng)物上清中約30％細(xì)胞是巨核細(xì)胞。這些巨核細(xì)胞是多核細(xì)胞，但沒有胚狀體-衍生巨核細(xì)胞中觀察到的顯著的長(zhǎng)突起。認(rèn)為這些巨核細(xì)胞是確定的巨核細(xì)胞很像成人巨核細(xì)胞。有趣的是，在培養(yǎng)期間，沒有血小板形成的跡象，這與鼠系統(tǒng)很不相同?？赡躉P9細(xì)胞可促進(jìn)和支持巨核細(xì)胞的分化和增殖，但不能支持血小板形成。這說(shuō)明，小鼠和人的血小板形成機(jī)制不同，即使巨核細(xì)胞分化和增殖的一些機(jī)制相似。
巨核細(xì)胞增殖、成熟和純化上述方法產(chǎn)生的前體巨核細(xì)胞顯示能夠增殖，甚至移植入受者成年小鼠。該方法的下一個(gè)步驟是，我們采用bFGF進(jìn)一步增殖不成熟的巨核細(xì)胞，同時(shí)阻止巨核細(xì)胞成熟。預(yù)計(jì)各巨核細(xì)胞可產(chǎn)生2000個(gè)血小板，106個(gè)人ES細(xì)胞(一個(gè)6孔板)會(huì)產(chǎn)生106個(gè)巨核細(xì)胞，隨后產(chǎn)生約2×109個(gè)血小板，這代表約1/20個(gè)血小板單位(每單位＞5.5×1010個(gè)血小板)。因此，以此預(yù)計(jì)效率，制備1單位人血小板將需要20個(gè)T75培養(yǎng)瓶的人ES細(xì)胞。此產(chǎn)量在經(jīng)濟(jì)上可能有或沒有吸引力，但這顯然在一個(gè)技術(shù)人員可以提供的范圍內(nèi)。
定向分化的其它技術(shù)胚狀體系統(tǒng)產(chǎn)生造血干細(xì)胞的效率低于所需效率，這是由于大部分細(xì)胞是卵黃囊細(xì)胞。然而，此系統(tǒng)優(yōu)于OP9共培養(yǎng)系統(tǒng)，因?yàn)榕郀铙w系統(tǒng)沒有鼠蛋白污染。通過(guò)我們的數(shù)據(jù)，我們相信與用基質(zhì)細(xì)胞的共同培養(yǎng)系統(tǒng)相反，EB系統(tǒng)的造血分化仍最好。為了得到更確定的造血細(xì)胞并使該方法更有效率，我們計(jì)劃延長(zhǎng)EB培養(yǎng)。我們嘗試用機(jī)械方法使EB分解或片段化成較小片段，并且繼續(xù)培養(yǎng)，希望這種微環(huán)境將繼續(xù)支持血島分化。我們的初步觀察提示，分解后的EB可以存活并繼續(xù)生長(zhǎng)。這是第一次嘗試在EB系統(tǒng)中進(jìn)行分化。即使沒有形成明確的血島，也可實(shí)現(xiàn)血島數(shù)量的顯著增加。也測(cè)試了在EB培養(yǎng)物中加入生長(zhǎng)因子如VEGF和SCF。
促進(jìn)血小板釋放和成熟雖然我們已經(jīng)在多種系統(tǒng)，包括膠原基質(zhì)、OP9和聚HEME中觀察到血小板形成，但我們想要更好地理解血小板釋放的機(jī)制，以便優(yōu)化該方法。為了實(shí)現(xiàn)血小板形成，我們?cè)赥PO、人血漿、人冷沉淀蛋白質(zhì)和一氧化氮的存在下培養(yǎng)103～104個(gè)成熟巨核細(xì)胞。用抗-CD41抗體標(biāo)記血小板，并用流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)。通過(guò)顯微術(shù)包括電子顯微鏡術(shù)檢測(cè)血小板形狀。真正的血小板應(yīng)該是扁圓形，無(wú)突起或粘附于其它血小板。(出現(xiàn))較大或連接的血小板說(shuō)明所用的不是僅支持前體血小板形成的最優(yōu)條件。據(jù)證明，胞外基質(zhì)如纖維蛋白原和纖連蛋白能促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖和成熟。我們采用纖維蛋白原和纖連蛋白包被的平板培養(yǎng)巨核細(xì)胞，以測(cè)定它們對(duì)巨核細(xì)胞增殖和分化的影響。
測(cè)試血小板血小板在對(duì)凝血酶、ADP和膠原反應(yīng)時(shí)發(fā)生凝集。用凝集計(jì)(Chrono-logCorporation，www.chronolog.com)測(cè)定體外產(chǎn)生的血小板對(duì)不同刺激反應(yīng)時(shí)凝集的能力。從上清中收獲血小板并計(jì)數(shù)。用PBS洗滌106/ml個(gè)血小板，并重懸于人血漿。加入不同濃度的凝血酶、ADP和膠原，將凝集動(dòng)力學(xué)與天然人血小板作比較。我們測(cè)試用0.5U/ml凝血酶可激活所產(chǎn)生的″血小板″和成熟的巨核細(xì)胞，它們表面表達(dá)α-顆粒釋放的間接標(biāo)記物CD62P。我們正在通過(guò)以下方法測(cè)試血小板的功能致密核心顆粒釋放。先用緩沖液A(120mmol/L谷氨酸鈉，5mmol/L谷氨酸鉀，20mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，2.5mmoL EDTA，2.5mmol/L EGTA，3.15mmol/LMgCl2和1mmol/L DTT)配制的[3H]5-HT(5-羥色胺)標(biāo)記106個(gè)培養(yǎng)的人血小板等份。用緩沖液A洗滌血小板，然后用1單位凝血酶活化。將樣品放在冰上4分鐘終止該反應(yīng)，然后13,000g離心1分鐘。收集上清，進(jìn)行如下測(cè)定。通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定[3H]5-HT的釋放。也可用能同時(shí)測(cè)定凝集和致密核心顆粒的ATP分泌的光照凝集計(jì)(ChronologCorporation)評(píng)價(jià)致密核心顆粒釋放的動(dòng)力學(xué)。
α-顆粒分泌通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)用藻紅蛋白-偶聯(lián)的抗-CD62抗體AC 1.2(BectonDickinson)測(cè)定P-選擇素表達(dá)監(jiān)測(cè)此試驗(yàn)。一般將2.5μl固定血小板(109/ml)加入97.5μl抗體溶液中。15分鐘后，用1ml含有0.35％BSA的Tyrode緩沖液稀釋樣品并分析?？捎?jì)算P-選擇素表達(dá)增加的百分?jǐn)?shù)，并與人天然血小板作比較。
溶酶體釋放按照Holmsen和Dangelmaier所述方法測(cè)定氨基己糖苷酶?；旌?ml檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，pH4.5和2.5ml10mmol/L底物(P-硝基苯基-N-乙酰-D-氨基葡糖苷)，分成等份(100μL)加入96孔板，加入5μL反應(yīng)上清。37℃孵育18小時(shí)后，加入60μL 0.08N NaOH以終止該反應(yīng)。在裝有405-nm濾光片的ELISA平板閱讀器上讀出吸光值。
用這些測(cè)試確立了由人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的血小板的生物學(xué)活性。該體外血小板產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生的血小板在功能上類似于人體的正常血小板。然而，體外產(chǎn)生和成熟時(shí)，所產(chǎn)生的血小板不難與血液產(chǎn)生的人血小板相區(qū)分，因?yàn)榇朔椒óa(chǎn)生的血小板從未接觸，至少在產(chǎn)生過(guò)程中從未接觸過(guò)人血。因此，此血小板不會(huì)粘附有正常血清因子，如纖維蛋白原、血凝因子V和VWF，而通常情況下，血小板在體內(nèi)釋放入血流后，會(huì)捕獲這些因子。這是假設(shè)沒有將顯著量的這些因子加入培養(yǎng)物中，但有的情況下可能加入VWF以促進(jìn)血小板分離，當(dāng)然在輸送給患者后，這種血小板會(huì)立即從受者血流中捕獲這些因子。
序列表無(wú)。
(按照條約第19條的修改)1.一種產(chǎn)生人血小板的方法，所述方法包括以下步驟(a)在有利于人胚胎干細(xì)胞分化為造血譜系細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞；(b)將所述造血譜系細(xì)胞培養(yǎng)為巨核細(xì)胞；(c)培養(yǎng)所述巨核細(xì)胞以產(chǎn)生血小板；和(d)回收從所述巨核細(xì)胞分離的血小板。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)促進(jìn)胚狀體的形成、然后從所述胚狀體選擇性回收造血細(xì)胞實(shí)施步驟(a)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)將所述人胚胎干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)實(shí)施步驟(a)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)用含有血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素11和干細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(a)的細(xì)胞實(shí)施步驟(b)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述巨核細(xì)胞對(duì)CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD38、CD45(弱)和CD62P呈陽(yáng)性，但對(duì)CD34、CD117和HLA-DR呈陰性。
6.一種用權(quán)利要求1所述方法產(chǎn)生的人血小板。
7.如權(quán)利要求8所述的人血小板，其特征在于，所述血小板不含免疫球蛋白分子。
8.一種體外培養(yǎng)產(chǎn)生的人血小板，所述血小板具有啟動(dòng)凝集的生物活性，所述血小板基本不含血液抗原和血清成分。
9.一種人血小板等分部分，其包含未粘附免疫球蛋白的功能性人血小板。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生人血小板的方法，所述方法包括以下步驟(a)在有利于人胚胎干細(xì)胞分化為造血譜系細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞；(b)將所述造血譜系細(xì)胞培養(yǎng)為巨核細(xì)胞；(c)培養(yǎng)所述巨核細(xì)胞以產(chǎn)生血小板；和(d)回收從所述巨核細(xì)胞分離的血小板。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)促進(jìn)胚狀體的形成、然后從所述胚狀體選擇性回收造血細(xì)胞實(shí)施步驟(a)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)將所述人胚胎干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)實(shí)施步驟(a)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)用含有血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素11和干細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(a)的細(xì)胞實(shí)施步驟(b)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述巨核細(xì)胞對(duì)CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD38、CD45(弱)和CD62P呈陽(yáng)性，但對(duì)CD34、CD117和HLA-DR呈陰性。
6.一種用權(quán)利要求1所述方法產(chǎn)生的人血小板。
7.如權(quán)利要求8所述的人血小板，其特征在于，所述血小板不含免疫球蛋白分子。
8.一種體外培養(yǎng)產(chǎn)生的人血小板，所述血小板具有啟動(dòng)凝集的生物活性，所述血小板基本不含血液抗原、白細(xì)胞和血清成分。
9.一種人血小板等分部分，其包含未粘附免疫球蛋白的功能性人血小板。
全文摘要
誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞先分化為造血譜系細(xì)胞，然后分化為巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板。適當(dāng)?shù)伢w外培養(yǎng)巨核細(xì)胞導(dǎo)致血小板產(chǎn)生和脫落。使得可能第一次在體外產(chǎn)生許多患者需要的人血因子。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101052710SQ200580037818
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月1日
發(fā)明者J·A·托馬森, D·陳 申請(qǐng)人:威斯康星校友研究基金會(huì)