專利名稱：穩(wěn)定性和濾過(guò)性有包膜病毒制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療性活病毒和活病毒疫苗的制劑。
背景技術(shù)：
針對(duì)-20℃液體冷凍成活病毒疫苗的穩(wěn)定化，只報(bào)道過(guò)極有限的例子。而它們之中大部分都沒(méi)有使用經(jīng)純化的成活有包膜病毒(1、2、3、4、5)。使有包膜病毒在冷凍點(diǎn)以下的溫度穩(wěn)定的主要挑戰(zhàn)之一是防止結(jié)構(gòu)性和功能性成分(即蛋白質(zhì)、脂雙層和病毒基因組)在冷凍期間和保存階段的物理性破壞。已報(bào)道，蛋白質(zhì)易受到變性的影響(6)，而脂雙層在冷凍期間則易遭破壞(7)。已報(bào)道了幾種使脂雙層和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在冷凍期間和凍結(jié)狀態(tài)下穩(wěn)定的賦形劑(6、7)。這些賦形劑包括多羥基化合物、糖類、緩沖劑、氨基酸和聚合物。
使有包膜病毒在冷凍點(diǎn)以下溫度穩(wěn)定的主要任務(wù)是防止病毒的結(jié)構(gòu)性和功能性成分在冷凍期間和保存階段的物理性破壞。所述有包膜病毒成分包括1)脂雙層包被膜；2)病毒基因組編碼的蛋白；以及3)單鏈或雙鏈DNA或RNA基因組。
為確保保存期間的穩(wěn)定性，感染性病毒的保存物由于其復(fù)雜性而通常在超低溫(例如≤-60℃)保存。Gould，E.A.(“Methods for long-term VirusPreservation”，Molecular Biotechnology Vol.13，pp.57-66，1999)教導(dǎo)脂質(zhì)有包膜病毒在-60℃以下的超低溫很好地存活，但是“只有在病毒感染性的保持不是必需的情況下”，才能使用-20℃進(jìn)行保存。D.R.Harper描述了各種非有包膜病毒和有包膜病毒的保存條件(“Virology，編輯，D.R.Harper，BIOS Scientific Publishers Limited，Oxford，UK，1993)。在所有情況中，為保持感染力，病毒不是必須以液體形式保存在-70℃就是作為凍干物(lyophile)保存在4℃。新城疫病毒液體制劑的保存條件被特別提及為-70℃。
Yannarell等(“Stabilizing cold-adapted influenza virus vaccine undervarious storage conditions”，J.Virol.Meth.Vol.102，PP.15-25，2002)描述了用SPG在-20℃保存冷適應(yīng)性流感病毒疫苗的條件，SPG是蔗糖、磷酸鹽和谷氨酸鹽的混合物(0.218M蔗糖、0.0038M磷酸二氫鉀、0.0072M磷酸氫二鉀、0.0049M谷氨酸鉀)。制備于尿囊液中的鼻內(nèi)施用流感病毒用10倍SPG溶液稀釋。該混合液中蔗糖的終濃度為7.5％。磷酸鹽的存在并不能幫助穩(wěn)定NDV，而谷氨酸鹽阻礙除菌過(guò)濾，因此這兩種化合物不利于NDV制備和在-20℃保存。
胃腸外施用增加了額外的配制問(wèn)題。為安全起見(jiàn)，胃腸外用產(chǎn)品必須經(jīng)過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，這是因?yàn)閷?duì)于活病毒制備物來(lái)說(shuō)，最后除菌(terminal sterilization)是不可能的。新城疫病毒體為直徑大約0.1nm～0.5nm的多型但大致球形的粒子。經(jīng)0.2μm除菌過(guò)濾器過(guò)濾的NDV回收率具有制劑依賴性，并且是研發(fā)-20℃液體NDV制劑時(shí)需考慮的重要因素。
影響NDV通過(guò)0.2μm除菌過(guò)濾器的能力的因素包括病毒的直徑、過(guò)濾器孔徑以及NDV經(jīng)過(guò)濾器的吸附。NDV的表觀直徑受到下述因素影響1)制劑的張性；和2)NDV的表面電荷，它們可以影響不同緩沖劑存在下的蛋白或核酸在NDV表面的分子構(gòu)象和吸收。
NDV在濾器膜上的吸附也會(huì)對(duì)病毒經(jīng)受除菌過(guò)濾器的能力產(chǎn)生重要影響。有些因素可以對(duì)NDV的表面性質(zhì)產(chǎn)生影響，因而影響NDV在過(guò)濾器上的吸附。這些因素包括1)pH，2)離子強(qiáng)度，3)表面相互作用，包括疏水性或范德華相互作用和離子相互作用，和4)諸如表面活性劑等表面活性物質(zhì)的存在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種使有包膜病毒在中度低溫保存下穩(wěn)定的方法，該方法包括制備包含濃度為106PFU/mL～1012PFU/mL的有包膜病毒以及非還原性糖類的水溶液。當(dāng)所述非還原性糖類是二糖時(shí)，其在溶液中的存在濃度為5％(w/v)～50％(w/v)；當(dāng)所述非還原性糖類是單糖時(shí)，其在溶液中的存在濃度為2.5％(w/v)～25％(w/v)。根據(jù)本發(fā)明，所用溶液具有大約250mOs或更高的滲透壓，并具有5～10的pH。
本發(fā)明基于以下意想不到的發(fā)現(xiàn)在含有非還原性糖類的水溶液中制備有包膜病毒是達(dá)到在中度低溫下除菌過(guò)濾和長(zhǎng)期穩(wěn)定性的有效方式。


圖1不同緩沖液中的NDV的濾過(guò)性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明使用的過(guò)渡性術(shù)語(yǔ)“包含”是開(kāi)放式的。使用該術(shù)語(yǔ)的權(quán)利要求可以含有除了在該權(quán)利要求中敘述的成分以外的其它成分，因此，例如，在權(quán)利要求中記載的治療策略還包括其他并未在這里特別記載的治療劑或治療性病毒劑量(只要該記載的要素或其等價(jià)物是存在的)。
本文使用的“NDV”是新城疫病毒的縮略語(yǔ)。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)病毒是新城疫病毒時(shí)，它可以是低毒力(緩發(fā)型)、中等毒力(中發(fā)型)或強(qiáng)毒力(速發(fā)型)。毒力水平根據(jù)胚平均死亡時(shí)間(MDT)測(cè)試確定(Alexander，“Chapter 27Newcastle Disease”；Laboratory Manual for the Isolation andIdentification of Avian Pathogens，第三版，Purchase等編輯(Kendall/Hunt，Iowa)，第117頁(yè))。根據(jù)MDT測(cè)試，將病毒分為弱毒力(MDT＞90小時(shí))；中等毒力(MDT為60～90小時(shí))；和強(qiáng)毒力(MDT＜60小時(shí))。
如本文所使用的，給定成分或雜質(zhì)的“基本上不包含”量意味著該化合物以百萬(wàn)分之十份或更少的濃度存在于溶液中。
考慮到噬斑形成單位測(cè)試的固有變化性，如果根據(jù)PFU/mL量的變化所測(cè)定的早期時(shí)間點(diǎn)和晚期時(shí)間點(diǎn)之間的感染性丟失少于50％，則認(rèn)為病毒在給定時(shí)間范圍是“穩(wěn)定的”。就本發(fā)明來(lái)說(shuō)，僅僅保持了個(gè)別病毒蛋白的酶活性而沒(méi)有同時(shí)保持其感染性并不認(rèn)為是保持了“穩(wěn)定性”。
本發(fā)明使用水溶液，這是因?yàn)樗诰S持液體制劑中的有包膜病毒的三維結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性中是必需的。
并不希望其中病毒被過(guò)度稀釋的溶液，這是因?yàn)橛邪げ《静粔蚍€(wěn)定，而在保存期間高病毒濃度看起來(lái)不會(huì)破壞穩(wěn)定性。在冷凍過(guò)程中，有包膜病毒將被濃縮至間質(zhì)區(qū)，在該間質(zhì)區(qū)狀態(tài)下，認(rèn)為有包膜病毒處于高度濃縮狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，有包膜病毒的濃度為106PFU/mL～1012PFU/mL，優(yōu)選為1×1010PFU/mL～7×1010PFU/mL。
利用根據(jù)本發(fā)明的水溶液能夠配制任何有包膜病毒。例如，可以使用副粘病毒，例如新城疫病毒。新城疫病毒的中等毒力株是目前優(yōu)選的。
為在中度低溫(例如-20℃)保護(hù)有包膜病毒免遭失活，要考慮兩個(gè)重要因素在液體狀態(tài)下的等滲性和防止在冷凍期間蛋白變性以及脂質(zhì)膜破壞。如果滲透壓遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于等滲點(diǎn)，則它可能引起病毒膜爆裂。高滲壓看起來(lái)并不會(huì)影響有包膜病毒在保存期間的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明，大約250mOs或更高的滲透壓是適宜的。優(yōu)選滲透壓為大約300mOs。當(dāng)溶液中糖類濃度大大低于10％(w/v)，有必要加入其他賦形劑以獲得所希望的滲透壓。
其他可以影響穩(wěn)定性的重要因素是在冷凍和保存過(guò)程中結(jié)構(gòu)和功能性成分的破壞。非還原性糖類，特別是二糖，在保護(hù)有包膜病毒免遭冷凍過(guò)程中的失活方面最有效。無(wú)意于受到機(jī)制的限制，據(jù)信，通過(guò)防止蛋白三維結(jié)構(gòu)變性和脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)破壞而實(shí)現(xiàn)保護(hù)。非還原性糖類也可以用于調(diào)整最終制劑中的滲透壓。相反，還原性糖類(乳糖)并不顯示同樣的穩(wěn)定作用。任何非還原性糖類都能夠用于本發(fā)明的溶液中。當(dāng)糖類是二糖時(shí)，它以5％(w/v)～50％(w/v)的濃度存在于溶液中。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，二糖以7.5％(w/v)～15％(w/v)的濃度存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，二糖以10％(w/v)～20％(w/v)的濃度存在，更具體的濃度是大約10％(w/v)。合適的二糖的例子包括蔗糖或海藻糖。當(dāng)糖類是單糖時(shí)，它以2.5％(w/v)～25％(w/v)，優(yōu)選為4％(w/v)～7％(w/v)，更優(yōu)選為大約5％(w/v)的濃度存在于溶液中。
根據(jù)本發(fā)明，所述溶液可以進(jìn)一步選擇性包含濃度為0.1％(w/v)～5％(w/v)的賴氨酸(L-賴氨酸和D-賴氨酸是合適的)或精氨酸，或聯(lián)合濃度為0.1％(w/v)～5％(w/v)的賴氨酸和精氨酸。賴氨酸和/或精氨酸的濃度優(yōu)選為大約1％(w/v)。
病毒的穩(wěn)定性受到pH的影響。根據(jù)本發(fā)明，所述溶液的pH可為5～10，優(yōu)選6.5～9，更優(yōu)選為7～9，更具體為大約7.5。
許多化合物對(duì)穩(wěn)定性、濾過(guò)性或兩者具有負(fù)面影響，應(yīng)該使它們?cè)谌芤褐械拇嬖谧钚』?。為得到最佳穩(wěn)定性，根據(jù)本發(fā)明的溶液應(yīng)該基本上不包含還原劑(例如還原性糖類、半胱氨酸)或抗氧化劑(例如EDTA、抗壞血酸)。一些其他化合物有害性較小，因此，沒(méi)有必要完全排除。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的溶液包含最高達(dá)0.1％(w/v)氯化鈉；1％(w/v)葡聚糖；0.5％(w/v)甘露醇；0.1％(w/v)山梨醇；0.01％(w/v)吐溫；0.01％(w/v)谷氨酸鹽；0.5％(w/v)聚乙二醇；0.1mM氯化鈣；0.5％(w/v)磷脂酰膽堿；0.05％(w/v)甘氨酸；以及0.01％(w/v)磷酸鹽是可以接受的。而優(yōu)選所述溶液基本上不包含氯化鈉、葡聚糖、甘露醇、吐溫、谷氨酸鹽、聚乙二醇、氯化鈣、磷脂酰膽堿、甘氨酸和磷酸鹽。甘氨酸以及諸如谷氨酸鹽或磷酸鹽緩沖劑等帶負(fù)電荷緩沖劑不利于除菌過(guò)濾和回收。
當(dāng)所述溶液經(jīng)胃腸外施用時(shí)，其應(yīng)該是無(wú)菌的。對(duì)局部或口服施用來(lái)說(shuō)無(wú)菌狀態(tài)并不是關(guān)鍵的?？梢圆⑶覂?yōu)選在低溫保存前用藥物級(jí)除菌過(guò)濾器進(jìn)行除菌處理。除菌的優(yōu)選方法是用其規(guī)格大于有包膜病毒有效尺寸但小于細(xì)菌的過(guò)濾器進(jìn)行大小過(guò)濾。優(yōu)選0.2微米的除菌過(guò)濾器。通常溶液的粘性隨濃度而增加，這使得過(guò)濾NDV較困難。為在除菌過(guò)濾期間獲得優(yōu)異的病毒回收率，壓力優(yōu)選應(yīng)該保持在10～15psi(帕斯卡)。使用高粘性和低壓環(huán)境，過(guò)濾有包膜病毒非常困難。高粘性的問(wèn)題能夠在病毒的除菌過(guò)濾之后通過(guò)使用無(wú)菌混合而得到克服。為了避免高粘性，優(yōu)選不使用高濃度賦形劑。例如，葡聚糖、基于葡萄糖的聚合物會(huì)在最后的過(guò)濾期間影響病毒的過(guò)濾和回收。
盡管以前相信有包膜病毒的液體制劑只有在像-60℃或-70℃這樣的超低溫才是穩(wěn)定的，然而令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明配制的有包膜病毒在-20℃是長(zhǎng)期穩(wěn)定的。例如，根據(jù)本發(fā)明配制的有包膜病毒在-4℃～-30℃，優(yōu)選為-10℃～-30℃，更優(yōu)選為-15℃～-25℃，進(jìn)一步更優(yōu)選為-20℃是穩(wěn)定的。在-20℃左右保存是很方便的。在-20℃維持穩(wěn)定性的能力將使得治療性產(chǎn)物在醫(yī)院和藥房保存成為可能，這些地方通常具有-20℃的冷凍裝置，但通常不具備-70℃的冷凍裝置。而且，由于傳統(tǒng)的容器密封在-20℃比在-70℃維持更好的彈性，因此，通過(guò)-20℃的保存確保了無(wú)菌性的保持以及隨之的病人安全性。使用本發(fā)明的方法，有包膜病毒穩(wěn)定6個(gè)月、12個(gè)月、24個(gè)月或更長(zhǎng)。
通過(guò)參考下面的實(shí)施例，會(huì)更好地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例舉例說(shuō)明而不是限制本文所述的發(fā)明。在下面的實(shí)施例中，NDV是三重噬斑純化的MK107株，其是新城疫病毒的減毒(中等毒力)型，更充分的描述見(jiàn)國(guó)際專利公開(kāi)WO 00/62735，
公開(kāi)日為2000年10月26日(Pro-Virus，Inc.)。本文特此以參考的方式引用WO 00/62735的全部?jī)?nèi)容。
實(shí)施例將ML定義為pH8.0時(shí)5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)賴氨酸。
實(shí)施例1NDV在5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)賴氨酸溶液中的穩(wěn)定性NDV來(lái)源于經(jīng)三重噬斑純化的中等毒力新城疫病毒株Mass-MK107，并通過(guò)在10天大的雞胚(embronated chicken egg)尿囊液腔中接種病毒而制備。在36℃孵育2天后，冷凍該胚，并收獲尿囊液。所收獲的尿囊液經(jīng)5％(w/v)D-甘露醇和1％(w/v)L-賴氨酸、pH8.0緩沖液(ML)透析過(guò)濾，以及經(jīng)切向流過(guò)濾和尺寸排阻色譜法澄清和純化，至濃度為4E+10PFU/mL，將試樣等分并保存在-20℃。通過(guò)噬斑分析測(cè)定NDV滴度，用每毫升感染性NDV噬斑形成單位(PFU)量表示。為進(jìn)行該測(cè)定，將人HT1080纖維肉瘤細(xì)胞接種到組織培養(yǎng)板中，生長(zhǎng)至匯合成片。移走生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基洗滌單層細(xì)胞并加入0.5mL NDV樣品。在5％CO2、37℃條件下?lián)u動(dòng)平板孵育90min。如所述方法洗滌單層細(xì)胞，并將3mL半固體瓊脂培養(yǎng)基覆蓋到各孔上。將培養(yǎng)物在5％CO2、37℃條件下孵育48小時(shí)。用中性紅染色單層細(xì)胞，對(duì)噬斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，并測(cè)定病毒滴度，PFU/mL。結(jié)果(表I)顯示保存在-20℃的5％甘露醇/1％賴氨酸中的NDV并不穩(wěn)定，平均喪失了超過(guò)80％的活性。
穩(wěn)定性用相對(duì)于計(jì)時(shí)起點(diǎn)滴度的剩余滴度百分?jǐn)?shù)表示。
表I在-20℃、5％D-甘露醇(w/v)和1％賴氨酸(w/v)中配制的NDV的穩(wěn)定性

*NT未檢測(cè)實(shí)施例2NDV在10％(w/v)蔗糖溶液中的穩(wěn)定性通過(guò)實(shí)施例1描述的方法制備NDV，經(jīng)切向流過(guò)濾和尺寸排阻色譜法將緩沖液交換為10％(w/v)蔗糖溶液，將試樣等分并保存在-20℃。通過(guò)實(shí)施例1中所描述的噬斑分析法測(cè)定穩(wěn)定性。結(jié)果(表II)顯示保存在-20℃的10％蔗糖(w/v)中的NDV穩(wěn)定性最長(zhǎng)達(dá)24個(gè)月。
表IINDV在-20℃、10％(w/v)蔗糖制劑中的穩(wěn)定性

*NT未檢測(cè)實(shí)施例3NDV在含有其他賦形劑的10％(w/v)蔗糖溶液中的穩(wěn)定性如實(shí)施例1所描述的方法制備NDV，緩沖液經(jīng)切向流過(guò)濾和尺寸排阻色譜法交換為10％(w/v)蔗糖溶液。通過(guò)加入L-賴氨酸、L-甘氨酸、或L-谷氨酸至終濃度為1％(w/v)而制備含有氨基酸的10％(w/v)蔗糖中的NDV的單獨(dú)制劑。將所述制劑等分并保存在-20℃。通過(guò)實(shí)施例1中所描述的噬斑分析法測(cè)定穩(wěn)定性。結(jié)果(表III)顯示保存在-20℃的含有1％賴氨酸、1％甘氨酸或1％谷氨酸的10％(w/v)蔗糖中的NDV穩(wěn)定性最長(zhǎng)達(dá)14個(gè)月。
表IIINDV在-20℃、含有氨基酸的10％(w/v)蔗糖中的穩(wěn)定性

實(shí)施例4NDV在其他緩沖溶液中的穩(wěn)定性如實(shí)施例1所描述的方法制備NDV。將各份NDV樣品用緩沖液交換成包含以下的不同制劑5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)L-賴氨酸/2％(w/v)明膠水解物、10％(w/v)海藻糖/1％(w/v)L-賴氨酸、5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)賴氨酸中的200mM乙酸鈉和5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)賴氨酸中的2％人血清白蛋白(HSA)，將試樣等分并保存在-20℃。通過(guò)實(shí)施例1中所描述的噬斑分析法測(cè)定穩(wěn)定性。將2％(w/v)明膠水解物加入到于5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)L-賴氨酸中制備的NDV中，比于甘露醇/L-賴氨酸制劑(參見(jiàn)實(shí)施例1)中制備的NDV具有明顯改進(jìn)的穩(wěn)定性。而加入2％HAS具有更適中的保護(hù)水平。
表IVNDA制劑在-20℃，于含有明膠水解物、HAS、乙酸鈉和海藻糖的緩沖液中的穩(wěn)定性

實(shí)施例5NDV在-20℃、葡聚糖緩沖液中的穩(wěn)定性如實(shí)施例1所描述的方法制備NDV。將各份NDV樣品用緩沖液交換成包含以下的不同制劑0.9％(w/v)NaCl/5％(w/v)葡聚糖和10％(w/v)海藻糖/20％(w/v)葡聚糖。當(dāng)將NDV保存在-20℃時(shí)，發(fā)現(xiàn)葡聚糖給NDV提供了適中水平的保護(hù)(表V)。
表VNDV在-20℃、葡聚糖緩沖液中的穩(wěn)定性

實(shí)施例6NDV在其他緩沖溶液中的穩(wěn)定性通過(guò)實(shí)施例1描述的方法純化NDV，將緩沖液交換為不同緩沖液(參見(jiàn)實(shí)施例4和5)，將試樣等分并保存在-20℃。通過(guò)實(shí)施例1中所描述的噬斑分析法測(cè)定穩(wěn)定性。結(jié)果(表VI)顯示當(dāng)保存在-20℃時(shí)，在如表VI中描述的這些緩沖液中制備的NDV是不穩(wěn)定的。
將該頁(yè)其余部分故意留為空白表VI以下緩沖液中的NDV在-20℃顯示較差的穩(wěn)定性

*NT未檢測(cè)實(shí)施例7對(duì)在甘露醇中制備的NDV的除菌過(guò)濾如實(shí)施例1所述制備在5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)賴氨酸中的NDV。一部分經(jīng)透析過(guò)濾(如何)至5％(w/v)甘露醇中。將葡聚糖加入到NDV ML的另一部分以制備在含有10％(w/v)葡聚糖的ML中的NDV樣品。在15psi，將大約30mL各樣品依次通過(guò)0.45μm SartobranTM預(yù)過(guò)濾器和0.22μm SartobranTM過(guò)濾器以測(cè)試這些樣品經(jīng)受除菌過(guò)濾的能力。先用ML緩沖液預(yù)潤(rùn)濕過(guò)濾器。收集各樣品的濾出液并如實(shí)施例1所描述通過(guò)噬斑測(cè)定法對(duì)其進(jìn)行分析以測(cè)定所回收的病毒噬斑活性(PFU)總量。在ML緩沖液或在5％(w/v)甘露醇中制備的NDV可以被容易地濾過(guò)，而在含有10％(w/v)葡聚糖的ML緩沖液中制備的NDV略微有點(diǎn)不能通過(guò)過(guò)濾器(表VII)。
表VII針對(duì)含有甘露醇/賴氨酸/葡聚糖的NDV的過(guò)濾研究小結(jié)

實(shí)施例8含有賴氨酸/磷酸鹽/NaCl的NDV甘露醇緩沖液的除菌過(guò)濾如實(shí)施例1所述制備NDV，將其交換成如圖1所述的緩沖液，并如實(shí)施例7所述對(duì)其經(jīng)受除菌過(guò)濾的能力進(jìn)行測(cè)試。用在制劑中使用的緩沖液預(yù)潤(rùn)濕過(guò)濾器。針對(duì)每一制劑，收集經(jīng)過(guò)過(guò)濾器的NDV緩沖液的體積并計(jì)算累計(jì)體積。在5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)賴氨酸中制備的NDV很好地濾過(guò)。在324mOs NaCl中制備的NDV稍微濾過(guò)，而當(dāng)在含有1％(w/v)L-賴氨酸、20mm磷酸鹽的5％(w/v)甘露醇或在含有0.9％NaCl或20mM磷酸鹽的5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)賴氨酸中制備NDV時(shí)，NDV不能很好地除菌濾過(guò)。
實(shí)施例9在含有10％(w/v)蔗糖或10％(w/v)海藻糖的緩沖液中制備的NDV的除菌過(guò)濾如實(shí)施例1所述制備NDV樣品并將其透析過(guò)濾到10％(w/v)蔗糖或10％(w/v)海藻糖中。由這些溶液，通過(guò)添加各自成分而制備含有10％(w/v)蔗糖/1％L-賴氨酸、10％(w/v)蔗糖/1％L-賴氨酸/10％(w/v)葡聚糖以及10％(w/v)海藻糖/1％L-賴氨酸的NDV額外樣品。如實(shí)施例6所述對(duì)樣品就它們經(jīng)受除菌過(guò)濾的能力進(jìn)行測(cè)試。在10％(w/v)蔗糖、10％(w/v)蔗糖/1％(w/v)L-賴氨酸或10％(w/v)海藻糖中制備的NDV以非常好的回收率除菌濾過(guò)。在10％(w/v)海藻糖/1％(w/v)L-賴氨酸中制備的NDV以合理的回收率除菌濾過(guò)，而在10％(w/v)蔗糖/1％(w/v)L-賴氨酸/10％(w/v)葡聚糖中制備的NDV除菌濾過(guò)效果差(表VIII)。
表VIII針對(duì)含有蔗糖/海藻糖/賴氨酸/葡聚糖的NDV的過(guò)濾研究小結(jié)

實(shí)施例10在含有1％L-賴氨酸、1％L-谷氨酸鹽或1％L-甘氨酸的10％蔗糖中制備的NDV的除菌過(guò)濾如實(shí)施例1所述制備NDV樣品，并將其透析過(guò)濾到10％(w/v)蔗糖中。該物質(zhì)被分為四份。將L-賴氨酸、L-谷氨酸鹽或L-甘氨酸加入到其中三份中的每一份以制備含有10％(w/v)蔗糖和1％(w/v)L-賴氨酸、L-谷氨酸鹽或L-甘氨酸的樣品。如實(shí)施例6所述對(duì)這些樣品就它們經(jīng)受除菌過(guò)濾的能力進(jìn)行測(cè)試。在10％(w/v)蔗糖或在含有1％L-賴氨酸的10％(w/v)蔗糖中制備的NDV很容易地濾過(guò)，而在含有1％(w/v)L-谷氨酸鹽或甘氨酸的10％(w/v)蔗糖中制備的NDV有微量濾過(guò)(表IX)。
表IX含有蔗糖/賴氨酸/谷氨酸/甘氨酸的NDV的過(guò)濾研究小結(jié)

實(shí)施例1110％蔗糖/賴氨酸中的NDV在不同pH下的穩(wěn)定性如實(shí)施例1所述的方法制備NDV，并且將緩沖液交換成10％(w/v)蔗糖。通過(guò)加入調(diào)節(jié)了pH的蔗糖/賴氨酸緩沖液(不同pH)來(lái)制備處于不同pH的NDV/10％蔗糖溶液的測(cè)試樣品并將其保存在-20℃。通過(guò)如實(shí)施例1描述的噬斑分析法測(cè)試樣品穩(wěn)定性。結(jié)果顯示NDV/10％蔗糖溶液在pH7.3到pH8.8范圍內(nèi)比較低pH更加穩(wěn)定。
表X在10％蔗糖(w/v)/1％賴氨酸(w/v)中配制的NDV在-20℃和不同pH下的穩(wěn)定性

TNTC數(shù)目太多以至不能計(jì)數(shù)實(shí)施例12NDV在不同蔗糖濃度下的穩(wěn)定性如實(shí)施例1所述的方法制備NDV，并且將緩沖液交換成10％(w/v)蔗糖。通過(guò)加入不同濃度的蔗糖或加入注射用水而制備在蔗糖溶液不同濃度下的NDV的測(cè)試樣品或并將其保存在-20℃。將各制劑的終滴度調(diào)整為大約2E10。通過(guò)如實(shí)施例1描述的噬斑分析法測(cè)試樣品穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在10％～20％(w/v)蔗糖中制備的病毒比在較低濃度的蔗糖中制備的病毒更穩(wěn)定。
表XI蔗糖濃度對(duì)-20℃時(shí)NDV穩(wěn)定性的影響

背景技術(shù)：
的引用文獻(xiàn)目錄1.Protocol“Methods for Long Term Virus Preservation”，E.A.Gould，Molecular Biotechnology，Vol 13，1999，pp 57-66；2.T.Barrett等，“Growth，Purification and Titration of Influenza Viruses”in VirologyA practical Approach，編輯B.W.J.Mahy；Raven PressBooks，1985，Ch.6，pp.119-146；
3.Virology Lab Fax編輯D.R.Harper；Bios Scientific PublishersLimited，1993；4.Lowrence D.Gelb，“Varicella-Zoster Virus”，Virology；編輯B.N.Fields；Raven Press，1985，Ch.28，pp.591-626；5.Stabilizing cold-adapted influenza virus vaccine under various storageconditionsD.A.Yannarell等；Journal of Virological Methods；10215-25，2002；6.Separation of Freezing-and Drying-induced denaturation ofLyophilized Proteins using Stress-Specific Stabilization，Prestrelski等，Archives of Biochemistry and Biophysics，Vol.303，No.2，1993年6月，pp.465-473；7.Trehalose expression confers desiccation tolerance on human cells，N.Guo等，Nature Biotechnology，Vol.18，2000年2月，pp.168-171。
權(quán)利要求
1.一種使有包膜病毒在中度低溫保存中穩(wěn)定的方法，該方法包括制備基本上由以下物質(zhì)組成的水溶液濃度為106PFU/mL～1012PFU/mL的有包膜病毒；和非還原性糖類，其中所述糖類是二糖并以5％(w/v)～50％(w/v)的濃度存在于所述溶液中或是單糖并以2.5％(w/v)～25％(w/v)的濃度存在于所述溶液中；其中所述溶液具有大約250mOs或更高的滲透壓；和具有5～10的pH。
2.一種使有包膜病毒在中度低溫保存中穩(wěn)定的方法，該方法包括制備基本上由以下物質(zhì)組成的水溶液濃度為106PFU/mL～1012PFU/mL的有包膜病毒；非還原性糖類，其中所述糖類是二糖并以5％(w/v)～50％(w/v)的濃度存在于所述溶液中或是單糖并以2.5％(w/v)～25％(w/v)的濃度存在于所述溶液中；和氨基酸，該氨基酸選自濃度為0.1％(w/v)～5％(w/v)的賴氨酸或精氨酸或選自聯(lián)合濃度為0.1％(w/v)～5％(w/v)的賴氨酸和精氨酸；其中所述溶液具有大約250mOs或更高的滲透壓；和具有5～10的pH。
3.一種使有包膜病毒在中度低溫保存中穩(wěn)定的方法，該方法包括制備包含以下物質(zhì)的水溶液濃度為106PFU/mL～1012PFU/mL的有包膜病毒；和非還原性糖類，其中所述糖類是二糖并以5％(w/v)～50％(w/v)的濃度存在于所述溶液中或是單糖并以2.5％(w/v)～25％(w/v)的濃度存在于所述溶液中；其中所述溶液具有大約250mOs或更高的滲透壓；具有5～10的pH；和基本上不包含還原劑或抗氧化劑，和包含少于0.1％(w/v)氯化鈉；1％(w/v)葡聚糖；0.5％(w/v)甘露醇；0.1％(w/v)山梨醇；0.01％(w/v)吐溫；0.01％(w/v)谷氨酸鹽；0.5％(w/v)聚乙二醇；0.1mM氯化鈣；0.5％(w/v)磷脂酰膽堿；0.05％(w/v)甘氨酸；和0.01％(w/v)磷酸鹽。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述溶液基本上不包含氯化鈉、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、吐溫、谷氨酸鹽、聚乙二醇、氯化鈣、磷脂酰膽堿、甘氨酸和磷酸鹽。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述溶液進(jìn)一步包含氨基酸，該氨基酸選自濃度為0.1％(w/v)～5％(w/v)的賴氨酸或精氨酸或選自聯(lián)合濃度為0.1％(w/v)～5％(w/v)的賴氨酸和精氨酸。
6.如權(quán)利要求2或5所述的方法，其中所述賴氨酸和/或精氨酸的濃度為大約1％(w/v)。
7.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述保存溫度為-30℃～-10℃。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述保存溫度為大約-20℃。
9.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒是副粘病毒。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述病毒是新城疫病毒。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述病毒是新城疫病毒的中等毒力株。
12.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒濃度為1×1010PFU/mL～7×1010PFU/mL。
13.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述二糖濃度為7.5％(w/v)～15％(w/v)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述二糖濃度為大約10％(w/v)～大約20％(w/v)。
15.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述糖類是蔗糖。
16.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述糖類是海藻糖。
17.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述單糖濃度為4％(w/v)～7％(w/v)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述單糖濃度為大約5％(w/v)。
19.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述滲透壓為大約300mOs。
20.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述pH為7～9。
21.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶液是無(wú)菌的。
22.一種保持有包膜病毒穩(wěn)定性的方法，該方法包括將權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的溶液維持在中度低溫。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述溫度為-30℃～-10℃。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述溫度為大約-20℃。
25.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其中所述有包膜病毒是新城疫病毒，并且所述糖類是濃度為大約10％(w/v)～大約20％(w/v)的蔗糖。
26.如權(quán)利要求2或5所述的方法，其中所述有包膜病毒是新城疫病毒，并且所述糖類是濃度為大約10％(w/v)～大約20％(w/v)的蔗糖，且所述氨基酸是濃度為大約1％(w/v)的賴氨酸。
27.一種保持有包膜病毒穩(wěn)定性的方法，該方法包括將權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的溶液保存在中度低溫。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述溫度為-30℃～-10℃。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述溫度為大約-20℃。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述溶液在所述溫度維持6個(gè)月以上。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述溶液在所述溫度維持12個(gè)月以上。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述溶液在所述溫度維持24個(gè)月以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定性和濾過(guò)性有包膜病毒制劑，更具體地說(shuō)，配制了用于在中度低溫(例如－20℃)保存的有包膜病毒(例如新城疫病毒(NDV))。該制劑是包含以下物質(zhì)的水溶液濃度為10
文檔編號(hào)C12N7/02GK101052714SQ200580037889
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者陳哲芬, 張仲文, 杰弗里·A·米勒 申請(qǐng)人:威爾斯達(dá)特生物制劑公司