專利名稱：多功能和多價(jià)的血管生成抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效作為多功能和多價(jià)的血管生成抑制劑的融合蛋白，其包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的多肽，以及包含寡聚化結(jié)構(gòu)域和具有功能活性的血管生成過程的抑制劑或調(diào)節(jié)物的多肽，其中所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和抑制劑或調(diào)節(jié)物被蛋白酶敏感區(qū)分開。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)所述融合蛋白的基因和載體構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
血管生成是導(dǎo)致器官或組織中從預(yù)先存在的血管形成新血管的生物學(xué)過程。血管生成起始于由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的蛋白酶造成的基底膜(basalmembrane)分解，由所述內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖所繼續(xù)，最終形成腔、基底膜和周圍細(xì)胞的包圍。
在健康成體中，在正常生理?xiàng)l件下不發(fā)生血管生成，例外為與雌性月經(jīng)周期和傷口愈合相關(guān)的現(xiàn)象。然而，血管生成過程的不平衡導(dǎo)致病理失調(diào)的發(fā)展，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、巴爾通氏體病(bartonellosis)、移植器官排斥、出血和眼部新血管形成(失明的最常見原因之一)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、新生血管性青光眼、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動脈阻塞、翼狀胬肉、紅變、角膜新血管形成、實(shí)體腫瘤、血管瘤和腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，以及其它。
血管生成還在腫瘤的漸進(jìn)生長和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。腫瘤必須持續(xù)刺激新毛細(xì)血管的發(fā)生才能夠生長。腫瘤中新產(chǎn)生的血管為惡性細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)并且在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移提供途徑。如果此血管生成活性可以被抑制或消除，那么盡管腫瘤存在，其也不能發(fā)展。
出于此原因，不同的研究小組正在尋找抑制血管生成的化合物(血管生成抑制劑或抗血管生成劑)，其作為治療劑治療和預(yù)防與血管生成過程一起發(fā)生的病理過程。
關(guān)于腫瘤，沒有新血管形成腫瘤將不能生長或轉(zhuǎn)移至另一器官的觀點(diǎn)已被接受，因此血管生成轉(zhuǎn)換成腫瘤發(fā)展的早期事件。已描述了干擾不同水平上的血管生成途徑的幾種抗血管生成策略阻斷生長因子活性；抑制細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白酶；直接引導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)；過度調(diào)節(jié)內(nèi)源抑制劑，等等。由于內(nèi)源血管生成抑制劑似乎是無毒的和非免疫原性劑，它們在癌癥治療中受到了特別的關(guān)注。已經(jīng)鑒定了至少10種內(nèi)源血管生成抑制劑
，其中最著名的是血管抑素(angiostatin)和內(nèi)皮抑素(endostatin)。
內(nèi)皮抑素(ES)是內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成抑制劑，并且已經(jīng)證明它們在動物模型中減少腫瘤生長。參與所述作用的機(jī)理還不清楚，盡管已經(jīng)提出它們參與細(xì)胞表面受體結(jié)合(整合素和硫酸類肝素、VEGFR-2)、金屬蛋白酶和ECM成分。ES衍生自膠原XV和XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域，從該結(jié)構(gòu)域其以三聚體的形式被蛋白水解釋放，并且它們被轉(zhuǎn)化稱為約20kDa的單體內(nèi)皮抑素。在NC1的N末端尾端有一約60個(gè)氨基酸殘基的三聚化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過含有不同蛋白酶敏感位點(diǎn)的柔性鉸鏈區(qū)與具有約180個(gè)氨基酸殘基的ES模塊相連，在蛋白水解后釋放內(nèi)皮抑素。
Boehm et al.[Nature，390404(1997)]描述了使用被移植了若干腫瘤(Lewis肺癌、纖維肉瘤和黑色素瘤)的小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。如果未使用ES治療小鼠，所述腫瘤生長快速，造成該動物的死亡。相反，小鼠在腫瘤發(fā)生后接受ES治療，觀察到腫瘤體積減小直至幾乎達(dá)到顯微鏡可查大小。對攜帶有腫瘤的小鼠進(jìn)行循環(huán)ES治療造成動物模型中腫瘤的完全消退。然而，ES的臨床試驗(yàn)未報(bào)道顯著的腫瘤生長抑制，并且很少觀察到腫瘤消退。不幸地，這不是孤立的例子，其它包括不同抗血管生成分子的臨床試驗(yàn)也讓人失望，無論在動物模型中的抗腫瘤作用是多么顯著。在本文中，組合若干抗血管生成抑制劑來治療人類癌癥似乎是合理的。或者，提高的生物學(xué)活性(ES+血管抑素)和針對腫瘤的作用[ES+RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)]可能潛在地增強(qiáng)腫瘤生長抑制。
另一方面，已經(jīng)在體內(nèi)和體外證實(shí)了具有抗血管生成活性的抗層粘連蛋白抗體(L36)的單鏈Fv(scFv)片斷的治療潛力。結(jié)果顯示與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的基質(zhì)的形態(tài)發(fā)生潛力的改變是防止體內(nèi)與腫瘤相關(guān)的血管形成的有效方法。
盡管直至目前的努力，依然需要開發(fā)有效用作治療劑的血管生成抑制劑化合物，所述治療劑治療或預(yù)防有血管生成發(fā)生的病理過程。
發(fā)明的簡要描述本發(fā)明涉及提供具有抗血管生成活性的化合物，其潛在地用作預(yù)防和/或治療有血管生成發(fā)生的病理過程的治療劑，所述病理過程例如銀屑病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病變、癌癥等等。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案基于融合蛋白，該融合蛋白潛在地用作多功能和多價(jià)的血管生成抑制劑，其包含(a)多肽，所述多肽包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的區(qū)域，以及(b)多肽，所述多肽包含寡聚化結(jié)構(gòu)域和具有功能活性的血管生成過程的抑制劑或調(diào)節(jié)物區(qū)域，其中所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和抑制劑或調(diào)節(jié)物區(qū)域被蛋白酶敏感區(qū)分開。
通過構(gòu)建幾種蛋白質(zhì)的嵌合物的方式來說明本發(fā)明。融合蛋白之一(參見實(shí)施例)包含抗層粘連蛋白抗體(L36)的單鏈Fv(scFv)片斷和膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域，NC1結(jié)構(gòu)域包含三聚體化結(jié)構(gòu)域和通過柔性鉸鏈肽結(jié)合的內(nèi)皮抑素(ES)，所述柔性鉸鏈肽含有蛋白酶敏感位點(diǎn)，在蛋白水解切割后釋放單體ES。在腫瘤周圍微環(huán)境中蛋白酶水平提高，因此所述融合蛋白原位釋放ES單體和scFv三聚體。通過遺傳修修飾的人細(xì)胞以功能活性形式分泌所述融合蛋白。完整形式的分子量約為210kDa，其表明，在生理?xiàng)l件下，單個(gè)亞基以非共價(jià)方式共價(jià)締合產(chǎn)生三聚體結(jié)構(gòu)。所述三聚體融合蛋白顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)生長因子遷移的能力，以及當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞生長在Matrigel底物上時(shí)，其發(fā)育成毛細(xì)血管型小管的能力。用幾種不同的蛋白酶類似地處理所述融合蛋白。數(shù)據(jù)顯示組織蛋白酶L、胰彈性蛋白酶和幾種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)產(chǎn)生ES型單體和三聚體抗體片斷(scFv)。當(dāng)所述融合蛋白由遺傳修飾的產(chǎn)MMP的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)而不是由遺傳修飾的不產(chǎn)MMP的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)，融合蛋白進(jìn)一步正確地加工。這些結(jié)果開辟了使用此類型融合蛋白的治療癌癥的新基因治療策略的途徑，此類型融合蛋白構(gòu)成了新一代血管生成抑制劑的部分，該抑制劑有效作為治療與所述血管生成不平衡相關(guān)的疾病的治療劑。
因此，本發(fā)明的一方面涉及基因構(gòu)建體，其包含可操作地連接的至少一個(gè)核酸序列(A)和核酸序列(B)，其中所述第一核酸序列(A)的3’末端與所述第二核酸序列(B)的5’末端相連，所述核酸序列(A)包含編碼識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的多肽的核酸序列，所述核酸序列(B)包含編碼特定多肽的核酸序列，所述特定多肽包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)。
另一方面，本發(fā)明涉及包含所述基因構(gòu)建體的表達(dá)盒(cassette)，可操作地與表達(dá)控制序列連接。
另一方面，本發(fā)明涉及包含所述基因構(gòu)建體或所述表達(dá)盒的重組載體。
另一方面，本發(fā)明涉及包含所述基因構(gòu)建體、或所述表達(dá)盒、或所述重組載體的宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及可通過表達(dá)包含在所述基因構(gòu)建體中的核酸序列而獲得的融合蛋白。所述融合蛋白通常含有多肽(A’)和多肽(B’)，多肽(A’)包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的區(qū)域，多肽(B’)包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)。
另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其或者包含所述融合蛋白和至少一種藥物可接受的賦形劑，或者包含包含本發(fā)明基因構(gòu)建體的載體或本發(fā)明的表達(dá)盒以及任選地包含，至少一種藥物可接受的賦形劑。
另一方面，本發(fā)明涉及所述融合蛋白、或所述基因構(gòu)建體、或所述表達(dá)盒或所述重組載體，在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物預(yù)防、治療、阻礙或最小化血管生成的發(fā)展。
另一方面，本發(fā)明涉及所述融合蛋白、或所述基因構(gòu)建體、或所述表達(dá)盒或所述重組載體，在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物治療和/或預(yù)防有血管生成發(fā)生的病理過程。
附圖的簡要描述

圖1是制圖表示，顯示不同濃度的scFv形式的重組單克隆抗體(L36)[抗層粘連蛋白單克隆抗體L36的單鏈Fv片斷]和二聚體Fc-ES融合蛋白(ES結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白的Fc片斷之間的融合蛋白)的單獨(dú)治療和聯(lián)合治療對毛細(xì)血管形態(tài)發(fā)生的作用。
圖2說明本發(fā)明提供的融合蛋白的生產(chǎn)及其蛋白水解加工。圖2A示意性地顯示基因α1(膠原XVIII)和NC1結(jié)構(gòu)域編碼序列。圖2B示意性地顯示包含連接肽、三聚體化結(jié)構(gòu)域、鉸鏈肽和ES結(jié)構(gòu)域的所述NC1結(jié)構(gòu)域。圖2C示意性地顯示由scFv形式的重組抗層粘連蛋白單克隆抗體(L36)和膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域形成的融合蛋白或嵌合體。圖2D顯示所述融合蛋白蛋白水解加工的結(jié)果，觀察到三聚體和單體ES抗體的形成。
圖3A示意性地顯示scFv形式的抗體的基因結(jié)構(gòu)，以及幾種含有(或不含有)ES結(jié)構(gòu)域編碼序列的基因構(gòu)建體。圖3B顯示純化的融合蛋白的Western印跡分析的結(jié)果；用抗myc單克隆抗體(mAb)和/或抗ES mAb進(jìn)行所述免疫印跡[泳道1L36scFv，泳道2L36scFv-NC1ES-，泳道3L36scFv-NC1ES+，泳道4NC1，泳道5ES]。
圖4A顯示scFv-NC1ES-在11,000rpm和20℃時(shí)的沉淀平衡梯度(1mg/ml在磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)中)?？招膱A代表數(shù)據(jù)，三條實(shí)線代表單體scFv(37,148Da)、二聚體(74,296Da)和三聚體(111,444Da)的理論梯度。在所述圖4A的上方嵌圖中，顯示融合蛋白L36scFv-NC1ES-(1mg/ml在PBS緩沖液中)在42,000rpm和20℃時(shí)的沉淀速率。圖4B是顯示固定在塑料支持物上的層粘連蛋白結(jié)合親和力的圖[在融合蛋白L36scFv-NC1ES-(三聚體)的情況下大于在L36scFv(單體)的情況下]。圖4C是顯示在典型Matrigel分析中，內(nèi)皮細(xì)胞分化(響應(yīng)不同的scFv或L36scFv-NC1ES-濃度)的劑量依賴調(diào)節(jié)的圖。每一個(gè)點(diǎn)代表兩個(gè)孔的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。圖4D顯示用不同蛋白酶(MMPs、豬胰彈性蛋白酶和組織蛋白酶L)處理融合蛋白L36scFv-NC1ES-的結(jié)果。
圖5顯示L36scFv-NC1ES+(圖5A)和NC1(圖5B)的沉淀速度的分布。圖5C顯示使用表明濃度的L36scFv-NC1ES+和NC1獲得的飽和曲線。圖5D是代表在典型Matrigel分析中，內(nèi)皮細(xì)胞分化(響應(yīng)L36scFv、L36scFv-NC1ES+、NC1或Fc-ES的不同濃度)的劑量依賴調(diào)節(jié)的圖。每一個(gè)點(diǎn)代表兩個(gè)孔的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。圖5E是顯示在HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞分析中通過L36scFv(L36)、NC1、L36scFv-NC1ES+或Fc-ES(ES)的調(diào)節(jié)[PBS被用作對照]。
圖6A顯示用不同蛋白酶(MMPs、豬胰彈性蛋白酶和組織蛋白酶L)處理L36scFv-NC1ES+的結(jié)果，而圖6B顯示對NC1進(jìn)行同樣處理的結(jié)果。如實(shí)施例中的描述(參見材料和方法部分)，將純化的蛋白與不同的蛋白酶一起孵育指明的時(shí)間，并且使用SDS-PAGE方法(圖6C)或者通過使用抗內(nèi)皮抑素mAb的Western印跡方法分析反應(yīng)混合物。在所述圖的左側(cè)指明分子量的遷移距離和NC1標(biāo)志物。圖6A和6B的空箭頭表明蛋白水解產(chǎn)物。
發(fā)明的詳細(xì)描述一方面，本發(fā)明涉及基因構(gòu)建體，下文稱為本發(fā)明的基因構(gòu)建體，其包含可操作地連接的至少a)第一核酸序列(A)，其包含編碼識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的多肽；以及b)第二核酸序列(B)，其包含編碼特定多肽的核酸序列，所述特定多肽包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)，其中，所述第一核酸序列(A)的3’末端與所述第二核酸序列(B)的5’末端相連。
所述核酸序列(A)包含編碼識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的多肽。參與血管生成過程的分子的說明性例子包括細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，血管生成因子，細(xì)胞膜受體等等。ECM蛋白包括膠原、蛋白聚糖、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、腱蛋白(tenascin)、巢蛋白和血小板反應(yīng)蛋白。在一特定實(shí)施方案中，所述參與血管生成過程的分子是層粘連蛋白，例如哺乳動物層粘連蛋白，例如大鼠、小鼠或人層粘連蛋白。血管生成因子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族等等。所述血管生成因子的受體例如VEGF受體2(VEGFR-2)、整合素等等，可同樣地被包括在參與血管生成的細(xì)胞膜受體中。
事實(shí)上包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的區(qū)域的任何多肽均可被用于本發(fā)明，例如抗體，例如單克隆或多克隆抗體，其識別參與血管生成過程的分子，或者例如含有識別所述參與血管生成過程的分子的抗體重組片斷，例如，其重組單鏈形式(單鏈Fv片斷或scFv)、雙功能的(雙價(jià)小分子抗體)、完全的(Fab+Fc)等等；盡管如此，在一特定實(shí)施方案中，核酸序列(A)編碼源自抗層粘連蛋白mAb L36的重組單鏈抗體(scFv)(實(shí)施例1)，其含有通過接頭與mAbL36的可變輕鏈區(qū)(VL)融合的單克隆抗體L36的可變重鏈區(qū)(VH)(圖2C)，其中VL編碼序列的3’末端與所述接頭編碼序列的5’末端相連，并且編碼所述接頭的核苷酸序列的3’末端與VL編碼序列的5’末端相連，所述接頭例如包含G4S序列的肽，所述mAb L36的可變輕鏈區(qū)(VL)序列已被Sanz L et al.描述[Cancer Immunology and Immunotherapy，2001Dec；50(10)557-65]。
mAb L36識別不同動物物種的層粘連蛋白，例如來自小鼠、大鼠、人等等，因?yàn)槠渑c在不同動物物種中非常保守的區(qū)域相互作用[Sanz Let al.EMBO J 2003，Vol.22(7)1508-1517]。
由于其特性，所述識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的多肽，例如抗體，以其任何形式(scFv、雙功能的或完全的)，可以識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域，并且可以將與所述多肽融合的抗血管生成多肽導(dǎo)向參與血管生成過程的分子，例如，ECM蛋白、血管生成因子、細(xì)胞膜受體等等，并且阻斷所述分子的功能活性區(qū)域。
所述核酸序列(B)包含編碼特定多肽的核苷酸序列，所述特定多肽包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域(i)和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域(ii)之間的蛋白酶敏感區(qū)。
寡聚化結(jié)構(gòu)域是使得寡聚體(例如，肽或蛋白的二聚體、三聚體、四聚體等等)能夠形成的結(jié)構(gòu)域。事實(shí)上，任何寡聚化結(jié)構(gòu)域，例如二聚體化、三聚體化或四聚體化結(jié)構(gòu)域等等，均可被用于本發(fā)明的實(shí)踐，所述寡聚化結(jié)構(gòu)域存在于不同的蛋白中，真核或原核來源，能夠被重組表達(dá)并且形成包含該蛋白的蛋白寡聚體。在一特定實(shí)施方案中，所述寡聚化結(jié)構(gòu)域是三聚體化結(jié)構(gòu)域，例如膠原XVIII或膠原XV的NC1結(jié)構(gòu)域的三聚體化結(jié)構(gòu)域。
血管生成過程中的功能活性區(qū)域包含血管生成過程中的任何具有功能活性的肽或蛋白，例如血管生成過程中的抑制物或調(diào)節(jié)物肽或蛋白。事實(shí)上，本發(fā)明可以使用任何血管生成過程中的具有功能活性的肽或蛋白；盡管如此，在一特定實(shí)施方案中，所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域包含哺乳動物內(nèi)皮抑素(ES)，例如存在于膠原XV或膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的ES。
蛋白酶敏感區(qū)存在于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域(i)和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域(ii)之間，并且包含對蛋白酶作用敏感的多肽序列。盡管對任何蛋白酶敏感的任何多肽序列都可被用于本發(fā)明中，實(shí)踐中所述蛋白酶是只在腫瘤周圍表達(dá)的蛋白酶是優(yōu)選的，其使得本發(fā)明的融合蛋白被“加工”，產(chǎn)生多肽三聚體分子，其能夠識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)。因此，在一特定實(shí)施方案中，所述蛋白酶敏感區(qū)包含存在于膠原XV或膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域中的鉸鏈區(qū)，該鉸鏈區(qū)位于三聚體化結(jié)構(gòu)域和所述NC1結(jié)構(gòu)域的ES結(jié)構(gòu)域或區(qū)之間，因?yàn)樗鰠^(qū)域?qū)χ辉谀[瘤周圍表達(dá)的蛋白酶的作用敏感。
因此在一特定和優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列(B)包含編碼哺乳動物膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域或哺乳動物膠原XV的NC1結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。如已知的，所述膠原XVIII(和膠原XV)的NC1結(jié)構(gòu)域包含三聚體化結(jié)構(gòu)域和由鉸鏈肽連接的ES結(jié)構(gòu)域(圖2B)。所述膠原XV和XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的序列已知；出于說明的目的，Sasaki etal.之前已經(jīng)公開了膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的序列[Sasaki et al.Structure，function and tissue forms of the C-terminal globular domain ofcollagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin(含有血管生成抑制劑內(nèi)皮抑素的膠原XVIII的C-末端球形結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)、功能和組織形式).EMBO J.1998Aug 3；17(15)4249-56]。實(shí)施例1描述獲得包含編碼小鼠膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的區(qū)域的核苷酸序列。
可以使用任何與膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域相似的其它結(jié)構(gòu)域來實(shí)踐本發(fā)明，所述結(jié)構(gòu)域包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)，優(yōu)選的，該區(qū)域?qū)υ谀[瘤周圍表達(dá)的蛋白酶敏感。
通常，核酸序列(A)不直接與核酸序列(B)融合，但是在由核酸序列(A)和(B)編碼的多肽之間引入柔性結(jié)合肽(或分隔肽)是優(yōu)選的。因此，如果需要，本發(fā)明的基因構(gòu)建體還可以額外含有第三核酸序列(C)，該核酸序列(C)含有編碼位于所述核酸序列(A)和(B)之間的柔性結(jié)合肽的核苷酸序列，其中所述核酸序列(C)的5’末端與所述核酸序列(A)的3’末端連接，并且所述核酸序列(C)的3’末端與所述核酸序列(B)的5’末端連接。優(yōu)選地，所述分隔肽(C)是具有結(jié)構(gòu)柔性的肽。事實(shí)上，可以使用具有結(jié)構(gòu)柔性的任何肽。以說明的方式，所述柔性多肽可以含有重復(fù)的氨基酸殘基，特別是Gly和Ser殘基，或者任何其它合適的氨基酸殘基重復(fù)。事實(shí)上，本發(fā)明中可以使用任何定義柔性結(jié)合肽的肽序列。柔性結(jié)合蛋白的說明性實(shí)例包括例如Gly-Ser-Pro-Gly(GSPG)或序列(Gly-Ser)4等序列。盡管如此，在一特定實(shí)施方案中，所述柔性結(jié)合蛋白包含序列Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser。因此，在一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因構(gòu)建體除所述核酸序列(A)和(B)外，還包含第三核酸序列(C)，該第三核酸序列(C)包含編碼肽Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser的核苷酸序列。
并且，為了輔助分離和純化通過本發(fā)明方法獲得的融合蛋白，本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以含有，如果需要的話，編碼能夠用于融合蛋白分離或純化目的的肽的核酸序列。因此，在一特定實(shí)施方案中，如果需要的話，本發(fā)明的基因構(gòu)建體包括核酸序列(D)，其含有編碼能夠用于分離或純化目的的肽的核酸序列，該序列被稱為標(biāo)簽肽。所述核酸序列(D)可以位于不改變?nèi)魏斡伤龊怂嵝蛄?A)和(B)表達(dá)的多肽的功能的任何位置。以說明的方式，可以將所述核酸序列(D)置于所述核酸序列(B)的3’末端的下游。事實(shí)上，可以使用任何能夠使得融合蛋白分離或純化的肽或肽序列，例如，多組氨酸序列、能夠被抗體識別的肽序列，例如標(biāo)簽肽等等，例如源自熱病毒的血凝素的表位或C-myc表位等等，所述抗體是可以用于通過免疫親和層析來純化得到的融合蛋白。
可以通過使用本領(lǐng)域公知的方法獲得本發(fā)明的基因構(gòu)建體[Sambrook et al.，″Molecular cloning，a Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)″，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，1989Vol1-3]。所述本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以包括可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，因此構(gòu)成表達(dá)盒，所述調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)編碼由核酸序列(A)和(B)編碼的多肽的核酸序列的表達(dá)。如本說明書中所用，表述“可操作地連接”指在表達(dá)控制或調(diào)節(jié)序列的控制下，在正確的開放閱讀框中表達(dá)由核酸序列(A)和(B)，及合適的條件下的(C)編碼的多肽。
因此，另一方面，本發(fā)明提供表達(dá)盒，其包含與表達(dá)控制序列可操作地連接的本發(fā)明的基因構(gòu)建體，所述表達(dá)控制序列是編碼本發(fā)明融合蛋白的核苷酸序列的表達(dá)控制序列，本發(fā)明融合蛋白的核苷酸序列包含(a)識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的多肽，以及(b)多肽，其包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)。控制序列是控制和調(diào)節(jié)所述融合蛋白的轉(zhuǎn)錄、合適時(shí)的翻譯的序列，并且其包括啟動子序列、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的序列、核糖體結(jié)合序列(RBS)和/或轉(zhuǎn)錄終止子序列。在一特定實(shí)施方案中，所述表達(dá)控制序列在諸如細(xì)菌等原核細(xì)胞和有機(jī)體中起作用，而在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)控制序列在真核細(xì)胞和有機(jī)體中起作用，例如昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等等。可以存在于本發(fā)明提供的表達(dá)盒中的啟動子的實(shí)例包括人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動子等等。
優(yōu)選地，所述表達(dá)盒還包含編碼使得能夠選擇被所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的動機(jī)或表型的標(biāo)志物或基因?？梢源嬖谟诒景l(fā)明表達(dá)盒中的所述標(biāo)志物的說明性例子包括抗生素抗性基因、毒性化合物抗性基因、以及一般地所有使得能夠選擇遺傳轉(zhuǎn)化植物的那些基因。
可以將本發(fā)明的基因構(gòu)建體或本發(fā)明提供的表達(dá)盒插入到合適的載體中。因此，另一方面，本發(fā)明涉及諸如表達(dá)載體的載體，其包含所述的本發(fā)明基因構(gòu)建體或所述的表達(dá)盒。載體的選擇依賴于隨后要向其引入所述載體的宿主細(xì)胞。以說明的方式，要向其中引入所述核酸序列的載體可以是質(zhì)?；蜉d體，當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，其被整合到所述細(xì)胞的基因組中或不整合?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法得到所述載體[Sambrok et al，1989，如上文所引用]。在一特定實(shí)施方案中，所述重組載體是用于轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞的載體。
可以使用所述載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染能夠被所述載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。因此，另一方面，本發(fā)明涉及被本發(fā)明提供的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的宿主細(xì)胞。因此，所述被轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞包含本發(fā)明的基因構(gòu)建體、或所述表達(dá)盒或本發(fā)明提供的載體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法得到轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞[Sambrok et al，1989，如上文所引用]。在一特定實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是已經(jīng)被合適載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的動物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的動物細(xì)胞能夠表達(dá)本發(fā)明提供的融合蛋白，因此所述載體可被用于在動物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明提供的融合蛋白。
可以使用本發(fā)明的基因構(gòu)建體生產(chǎn)融合蛋白，該融合蛋白包含(a)多肽(A’)，其包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的區(qū)域，和(b)多肽(B’)，其包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明提供的所述融合蛋白的方法，其包含在使得所述融合蛋白能夠產(chǎn)生的條件下生長本發(fā)明提供的細(xì)胞或有機(jī)體。優(yōu)化所述細(xì)胞或有機(jī)體培養(yǎng)的條件取決于所使用的細(xì)胞或有機(jī)體。如果需要，生產(chǎn)本發(fā)明提供的感興趣產(chǎn)物的方法還包括分離和純化所述融合蛋白。
另一方面，本發(fā)明涉及通過包含在本發(fā)明基因構(gòu)建體中的核酸序列的表達(dá)而獲得的融合蛋白。更具體地，本發(fā)明提供融合蛋白，其包含(a)多肽(A’)，其包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的區(qū)域，以及(b)多肽(B’)，其包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)。
參與血管生成過程的分子的說明性例子包括ECM蛋白、血管生成因子、細(xì)胞膜受體等等。ECM蛋白包括膠原、蛋白聚糖、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、腱蛋白、巢蛋白和血小板反應(yīng)蛋白。在一特定實(shí)施方案中，所述參與血管生成過程的分子是層粘連蛋白，例如哺乳動物層粘連蛋白，例如大鼠、小鼠或人層粘連蛋白。
事實(shí)上本發(fā)明可以使用包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的區(qū)域的任何多肽，例如識別參與血管生成過程的分子的諸如單克隆抗體的抗體，或者識別所述參與血管生成過程的分子的所述抗體的重組片斷，例如，識別參與血管生成過程的分子的抗體的單鏈Fv(scFv)片斷，或者識別參與血管生成過程的分子的雙特異性抗體或雙價(jià)小分子抗體，或者以其完全重組形式(Fab+Fc)；盡管如此，在一特定實(shí)施方案中，包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域的區(qū)域的所述核酸序列(A’)是源自抗層粘連蛋白mAb L36的重組scFv(實(shí)施例1)，其含有通過接頭與mAb L36的可變輕鏈區(qū)(VL)融合的單克隆抗體L36的可變重鏈區(qū)(VH)(圖2C)，其中VL編碼序列的3’末端與編碼所述接頭的序列的5’末端相連，并且編碼所述接頭的核苷酸序列的3’末端與VL編碼序列的5’末端相連，所述接頭例如包含G4S序列的肽，所述mAb L36的可變輕鏈區(qū)(VL)序列已被Sanz L etal.公開[Cancer Immunology and Immunotherapy，2001 Dec；50(10)557-65]。目前已知，mAb L36識別來自不同動物物種的層粘連蛋白，例如小鼠、大鼠、人等等，因?yàn)槠渑c在不同動物物種中非常保守的區(qū)域發(fā)生相互作用[Sanz L et al.EMBO J 2003，Vol.22(7)1508-1517]。
所述多肽(A’)識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)域，并且可以將與所述多肽融合的抗血管生成肽導(dǎo)向參與血管生成過程的分子，例如ECM蛋白、血管生成因子、細(xì)胞膜受體等等，并且阻斷所述分子的功能活性區(qū)域。
多肽(B’)包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)。如前所述，所述寡聚化結(jié)構(gòu)域事實(shí)上可以是能夠使得肽或蛋白的寡聚體形成的任何結(jié)構(gòu)域，并且該結(jié)構(gòu)域能夠被重組表達(dá)并且形成包含其的蛋白的蛋白寡聚體，所述寡聚體例如二聚體、三聚體、四聚體等等。盡管如此，在一特定實(shí)施方案中，所述寡聚化結(jié)構(gòu)域是三聚體化結(jié)構(gòu)域，例如哺乳動物膠原XVIII或膠原XV的NC1結(jié)構(gòu)域的三聚體化結(jié)構(gòu)域。
血管生成過程中的功能活性區(qū)域包含任何在血管生成過程中具有功能活性的肽或蛋白，例如血管生成過程的抑制物或調(diào)節(jié)物肽或蛋白。事實(shí)上，本發(fā)明可以使用任何在血管生成過程中具有功能活性的肽或蛋白；盡管如此，在一特定實(shí)施方案中，所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域包含哺乳動物內(nèi)皮抑素(ES)，例如存在于膠原XV或膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域中的ES。
蛋白酶敏感區(qū)存在于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域(i)和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域(ii)之間，并且包含對蛋白酶作用敏感的多肽序列。盡管事實(shí)上本發(fā)明可以使用對任何蛋白酶作用敏感的任何多肽序列，所述蛋白酶優(yōu)選為只在腫瘤周圍表達(dá)的蛋白酶，其使得本發(fā)明的融合蛋白被“加工”，產(chǎn)生在血管生成過程中具有功能活性的肽或蛋白的單體(例如ES)，以及能夠識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的多肽三聚體分子(例如scFv)。因此，在一特定實(shí)施方案中，所述蛋白酶敏感區(qū)包含存在于哺乳動物膠原XV或XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域中的鉸鏈區(qū)，該鉸鏈區(qū)位于三聚體化結(jié)構(gòu)域和所述NC1結(jié)構(gòu)域的ES結(jié)構(gòu)域或區(qū)之間，因?yàn)樗鰠^(qū)域?qū)χ辉谀[瘤周圍表達(dá)的蛋白酶的作用敏感。
如已知的，所述膠原XVIII(和膠原XV)的NC1結(jié)構(gòu)域包含三聚體化結(jié)構(gòu)域和由鉸鏈肽連接的ES結(jié)構(gòu)域(圖2B)。因此在一特定和優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含多肽(B’)，其包含膠原XV的NC1結(jié)構(gòu)域或膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域，所述NC1結(jié)構(gòu)域含有三聚體化結(jié)構(gòu)域和由所述NC1結(jié)構(gòu)域的鉸鏈肽連接的所述NC1結(jié)構(gòu)域的ES結(jié)構(gòu)域。所述膠原XV和XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的序列已知；以說明的方式，Sasaki et al.之前已經(jīng)公開了膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的序列[Sasaki et al.Structure，function and tissue forms of the C-terminalglobular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitorendostatin(含有血管生成抑制劑內(nèi)皮抑素的膠原XVIII的C-末端球形結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)、功能和組織形式).EMBO J.1998 Aug3；17(15)4249-56]。
因此，以說明的方式，在一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供融合蛋白，其包含(i)選自完整mAb L36、雙功能形式的mAb L36和重組scFv的多肽，該重組scFv含有通過柔性肽與mAb L36輕鏈(VL)的可變區(qū)融合的mAb L36重鏈(VH)的可變區(qū)；和(ii)包含哺乳動物膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的多肽(B’)。
然而，為了獲得多功能和多價(jià)的血管生成抑制劑的目的，可以將其它任何與哺乳動物膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)域用于本發(fā)明的實(shí)踐，所述結(jié)構(gòu)域包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)，優(yōu)選地，在腫瘤周圍表達(dá)的蛋白酶敏感區(qū)。
如果需要的話，本發(fā)明提供的融合蛋白還可以含有第三多肽(C’)和/或(b)肽(D’)，多肽(C’)含有位于所述多肽(A’)和(B’)之間的柔性結(jié)合肽的氨基酸序列，肽(D’)輔助融合蛋白的分離和純化。
如前所述，事實(shí)上所述多肽(C’)可以包含定義柔性結(jié)合肽的任何肽序列。柔性結(jié)合肽的說明性例子包括諸如序列Gly-Ser-Pro-Gly或序列(Gly-Ser)4等序列。盡管如此，在一特定實(shí)施方案中，所述柔性結(jié)合肽包含序列Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser。
為了輔助本發(fā)明融合蛋白的分離和純化，如果需要的話，本發(fā)明的融合蛋白可以類似地含有，能夠用于融合蛋白的分離或純化目的的肽(D’)，例如標(biāo)簽肽。所述肽(D’)可以位于融合蛋白中不改變多肽(A’)和(B’)功能的任何位置，例如，所述肽(D’)可以位于多肽(B’)之后。事實(shí)上，可以使用任何能夠使得融合蛋白分離或純化的肽或肽序列，例如，多組氨酸序列、能夠被抗體識別的肽序列，例如標(biāo)簽肽等等，例如源自熱病毒的血凝素的表位或C-myc表位等等，所述抗體是可以用于通過免疫親和層析來純化得到的融合蛋白的抗體，。
本發(fā)明提供的融合蛋白包含多肽(A’)和多肽(B’)，多肽(A’)包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的多肽，多肽(B’)包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)。作為此融合的結(jié)果和由于某些只在腫瘤周圍表達(dá)的蛋白酶的作用，所述融合蛋白被“加工”，產(chǎn)生在血管生成過程中具有功能活性的肽或蛋白質(zhì)的單體(例如ES)，和能夠識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的多肽三聚體分子(例如scFv)。由于幾種聯(lián)合途徑以聯(lián)合的方式攻擊血管生成過程，本發(fā)明因此提供多功能和多價(jià)的血管生成抑制劑化合物。
因此，由于其自身的特征，本發(fā)明的融合蛋白可以用于治療和/或預(yù)防血管生成過程的發(fā)展，并且因此，用于治療和/或預(yù)防有血管生成發(fā)展的病理過程。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明提供的融合蛋白和至少一種藥物可接受的賦形劑，或者包含含有本發(fā)明基因構(gòu)建體的載體或本發(fā)明的表達(dá)盒和任選至少一種藥物可接受的賦形劑。
在一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的至少一種本發(fā)明提供的融合蛋白。如本說明書中所用，表述“治療有效量”指經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生期望效果的本發(fā)明融合蛋白的量，并且通常在其它原因中，由所述融合蛋白自身的特征和要得到的治療效果來決定。
在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的藥物組合物是意欲用于基因治療的組合物，其包含含有本發(fā)明基因構(gòu)建體或本發(fā)明表達(dá)盒的本發(fā)明提供的病毒或非病毒載體。以說明的方式，所述載體可以是諸如基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等的病毒載體，或者非病毒的，例如DNA-脂質(zhì)體、DNA-聚合物、DNA-聚合物-脂質(zhì)體復(fù)合體等等[參見″NonviralVectors for Gene Therapy(用于基因治療的非病毒載體)″，edited byHuang，Hung and Wagner，Academic Press(1999)]?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法將所述包含本發(fā)明基因構(gòu)建體或所述表達(dá)盒的載體直接給予人或動物?；蛘咚鲚d體可被用于離體(ex vivo)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，并且隨后將它們移植到人或動物體內(nèi)以獲得期望的治療效果，所述細(xì)胞例如哺乳動物細(xì)胞，包括人細(xì)胞。
可以通過任何適合的給藥方法給予本發(fā)明的藥物組合物，例如口服或腸胃外給藥?？梢杂糜谥苽浔景l(fā)明提供的藥物組合物的賦形劑依賴于，在其它因素中，所述藥物組合物的給藥方法?？梢栽赥ratado deFarmacia Galenica，C.Fauli i Trillo，Luzan 5，S.A.de Ediciones，1993中找到不同活性成分給藥方法、要使用的賦形劑和生產(chǎn)它們的過程的綜述。
另一方面，本發(fā)明類似地涉及本發(fā)明提供的融合蛋白、或本發(fā)明的基因構(gòu)建體或本發(fā)明提供的表達(dá)盒或本發(fā)明提供的重組載體在制備預(yù)防、治療、阻礙或最小化血管生成發(fā)展的藥物組合物中的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明提供的融合蛋白、或本發(fā)明的基因構(gòu)建體或本發(fā)明提供的表達(dá)盒或本發(fā)明提供的重組載體在制備治療和/或預(yù)防有血管生成的病理過程的藥物組合物中的用途。有血管生成的病理過程的說明性、非限制性的例子包括癌癥、血管瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、巴爾通氏體病、移植器官排斥、出血、眼部新血管形成(失明的最常見原因之一)、視網(wǎng)膜病變(糖尿病性或早期視網(wǎng)膜病變等)、黃斑變性、新生血管性青光眼、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動脈阻塞、翼狀胬肉、紅變或角膜新血管形成。在一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白、本發(fā)明的基因構(gòu)建體、本發(fā)明提供的表達(dá)盒或本發(fā)明提供的重組載體在治療癌癥中尤其有用，包括治療實(shí)體腫瘤和腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。
以下實(shí)施例可用于說明本發(fā)明，但不應(yīng)被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1設(shè)計(jì)、表達(dá)和由抗體片斷和膠原XVIII寡聚物組成的血管生成抑制劑制備了能夠表達(dá)以下產(chǎn)物的幾種基因構(gòu)建體(圖3A)-抗層粘連蛋白單克隆抗體L36(L36scFv)的單鏈Fv片斷，-稱為L36scFv-NC1ES-的融合蛋白，其由通過柔性連接肽(接頭)與小鼠膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域中存在的三聚體化結(jié)構(gòu)域(殘基10至60)融合的L36scFv組成。
-稱為L36scFv-NC1ES+的融合蛋白，其由通過所述接頭與小鼠膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域(殘基10至325)融合的L36scFv組成。
-小鼠膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域(殘基10至315)(NC1)，以及-來自小鼠膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的內(nèi)皮抑素(殘基130至315)，其以三聚體形式被蛋白水解釋放，隨后該三聚體被轉(zhuǎn)化成為約20kDa的單體ES(圖2A和圖2B)。
出于輔助蛋白的免疫檢測的目的，制備的基因構(gòu)建體還含有編碼標(biāo)簽的序列，特別是編碼his6myc的序列，所述標(biāo)簽被連接到不同蛋白的C-末端尾端。
所述基因構(gòu)建體被克隆到哺乳動物表達(dá)載體中，處于含有人制瘤素M信號序列的人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動子的控制之下[Sanz L et alGene Therapy(2002)151049]。ES(位置130-315)和小鼠NC1(1-315)的表達(dá)載體被用作對照。
所述重組蛋白被用于Matrigel中的毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)分析以及細(xì)胞遷移分析，目的為評價(jià)其作為抗血管生成劑的潛力。
I.材料和方法細(xì)胞和培養(yǎng)條件在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)液(DMEM)(Life Technologies，Gaithersburg，MD，U.S.A.)中培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞(人腎上皮；ATCC CRL-1573)，HT-1080細(xì)胞(人纖維肉瘤；ATCCCCL-121)和B16-F10細(xì)胞(小鼠黑素瘤；ATCC CRL-6475)。
由B.Gimenez博士(Instituto de Investigaciones Biomedicas，Madrid，Spain)提供的原代人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞被培養(yǎng)在含有10％FBS、50μg/ml來自牛垂體的內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充物(ECGS)和100μg/ml肝素(Sigma Biosciences，St.Louis，MO，U.S.A.)的Ham′s F12K培養(yǎng)液(Life Technologies)中。
由E.W.Ades博士(Center for Disease Control，Atlanta，GA，U.S.A.)提供的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC-1(Ades EW et al.，1992，Journal ofInvestigative Dermatology，99683-690)被培養(yǎng)在含有10％FBS、10ng/ml EGF(內(nèi)皮生長因子)和1mg/ml氫化可的松(Sigma Biosciences)的MCBD 131培養(yǎng)液(Lif Technologies)中。
表達(dá)載體構(gòu)建從由B.Olsen博士(Harvard Medical School，Boston，MA，U.S.A.)提供的來自小鼠的α1克隆mc3b(膠原XVIII)[Oh et al.Genomics.1994Feb；19(3)494-9]中使用引物對1和2(參見表1，其含有用于載體構(gòu)建體以及隨后證實(shí)載體序列的不同引物的序列)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增NC1結(jié)構(gòu)域的序列，NC1結(jié)構(gòu)域的序列含有編碼連接肽、三聚體化結(jié)構(gòu)域、鉸鏈肽和ES結(jié)構(gòu)域的序列(圖2B)。
表1寡核苷酸序列序號序列(5’-3’)1.ATTCAGATCTTGGGCAGGTGAGGAT2.TTCATGACCTCTTTCTCCAAAGCGGCCGCTAAACTAT3. ATATAGCGCGGCCGCGAATTCAGATCTTGGGCAGGTGAGGAT4. TAGAAGGCACAGTCGAGG5. TCTGGCTCCAAGTCTGGC6. AATTCAGGCGCCGGTGGATCTGGTGGCTCCTCTGGCTCAGACGGAGCGTCGGGTTCGCGA7. GATCTCGCGAACCCGACGCTCCGTCTGAGCCAGAGGAGCCACCAGATCCACCGGCGCCTG8. CGATACA9. GATCTGTAT10. CCTAGATCTTGCTCATACTCATCAGGACTTTCAG11. GTCCTAGGTGCGGCCGCGAAT12. ATAGTTTAGCGGCCGCCTCATTGCCCGTGCCTCTCAG用引物對2和3(表1)再次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，并且用NotI切割得到的PCR產(chǎn)物，連接到質(zhì)粒pCR3.1-L36[Sanz L et al Gene Therapy(2002)151049]的NotI位點(diǎn)上，以得到質(zhì)粒pCR3.1-L36-NC1。使用引物4和5(表1)檢查序列。
為制備稱為L36scFv-NCES+(圖3A)的基因構(gòu)建體，用“柔性肽連接體”(“柔性接頭”)Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser[LEGAGGSGGSSGSDGASGS](圖2B和2C)替換連接膠原三螺旋體與NC1三聚體化結(jié)構(gòu)域的“連接肽”，其負(fù)責(zé)從母體膠原XVIII釋放NC1結(jié)構(gòu)域，所述替換的目的是防止可能的L36scFv的氨基末端的NC1結(jié)構(gòu)域的切除，因所述“肽連接體”對不同金屬蛋白酶(MMPs)的作用敏感。因此，含有編碼所述“柔性連接肽”(“柔性接頭”)的寡核苷酸對(引物6和7)(表1)被連接到pCR3.1-L36-NC1的EcoRI-BglII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pCR3.1-L36-linker-NC1。
通過從質(zhì)粒pCR3.1-L36-linker-NC 1(含有全部L36scFv)除去ClaI-BglII片斷并且插入含有NruI位點(diǎn)的寡核苷酸對(引物8和9)(表1)構(gòu)建質(zhì)粒pCR3.1-NC1。
為了構(gòu)建質(zhì)粒pCR3.1-ES，從質(zhì)粒pCR3.1-NC1用引物對2和10(表1)擴(kuò)增鼠內(nèi)皮抑素(ES)模塊(NC1結(jié)構(gòu)域的殘基130至315)[Sasakiet al.Structure，function and tissue forms of the C-terminal globulardomain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin(含有血管生成抑制劑內(nèi)皮抑素的膠原XVIII的C-末端球形結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)、功能和組織形式).EMBO J.1998Aug 3；17(15)4249-56]。將經(jīng)BglII/NotI切割的PCR片斷連接到經(jīng)BglII/NotI消化的質(zhì)粒pCR3.1-NC1中。使用引物4(表1)檢查序列。
用引物對11和12(表1)從質(zhì)粒pCR3.1-NC1擴(kuò)增存在于NC1結(jié)構(gòu)域中的三聚體化結(jié)構(gòu)域[Sasaki et al.Structure，function and tissue formsof the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing theangiogenesis inhibitor endostatin(含有血管生成抑制劑內(nèi)皮抑素的膠原XVIII的C-末端球形結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)、功能和組織形式).EMBO J.1998Aug 3；17(15)4249-56]。經(jīng)NotI消化的PCR片段被連接到經(jīng)NotI消化的質(zhì)粒pCR3.1-L36中，以得到質(zhì)粒pCR3.1-L36-Trimer。使用引物4(表1)檢查序列。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用基于lipofectamine(Life Technologies)的系統(tǒng)用合適的表達(dá)載體(pCR3.1、pCR3.1-L36、pCR3.1-L36-Trimer、pCR3.1-ES、pCR3.1-NC1或pCR3.1-L36-linker-NC1)轉(zhuǎn)染HEK-293，HT-1080和B16-F10細(xì)胞。為了制備穩(wěn)定的細(xì)胞株，在含有0.5mg/ml、0.6mg/ml或3mg/ml G-418(Life Technologies)的DMEM中選擇轉(zhuǎn)染的HEK-293、HT-1080和B16-F10細(xì)胞。在使用溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑(MTT，Promega)的分析中連續(xù)4天每日分析經(jīng)不同載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的母體腫瘤細(xì)胞的增殖。通過SDS-PAGE[Sanz L et al.Gene Therapy(2002)151049]，ELISA[Sanz L. et al Gene Therapy(2002)151049]和使用抗myc(Life Technologies)或抗內(nèi)皮抑素(Upstate Biotechnology，LakePlacid，NY，U.S.A.)的mAbs(單克隆抗體)的Western印跡(免疫印跡)方法分析短時(shí)間和穩(wěn)定的細(xì)胞群的上清液以確定蛋白的表達(dá)。
重組蛋白的表達(dá)和純化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞被用在無血清的條件培養(yǎng)液中。向培養(yǎng)液中加入蛋白酶(抑肽酶、烏苯美司(bestatin)、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素A和E-64)抑制劑(Sigma Biosciences)的組合物(“雞尾酒”)以減少蛋白水解。用10,000MWCO Vaflow 50過濾器(Vivascience AG，Germany)濃縮(x10)培養(yǎng)液(約1L)，用PBS(磷酸緩沖鹽水)透析，pH 7.4并且上樣到1mL HisTrap HP柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上。含有ES的蛋白被再次在1mL HiTrap Heparin HP柱(Amersham Biosciences)上純化。用線性梯度的0.1-2.0NaCl進(jìn)行洗脫。用PBS透析純化的蛋白并且將其儲存在-20℃。ES Fc-結(jié)構(gòu)域(Fc-ES)融合蛋白[Cuo CJ et al.J Cell Biol.20011521233]由K.Javaherian博士(Boston Children′s Hospital，Boston，MA，U.S.A.)提供。所述Fc-ES融合蛋白是二聚體融合蛋白(在ES結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白的Fc片段之間)，并且阻斷毛細(xì)血管形態(tài)生成。
分析離心在20℃、在裝備有UV-可視光學(xué)系統(tǒng)的Optima XL-A分析超離心機(jī)(Beckman-Coulter Inc.)中使用具有Epon炭的3mm雙部分中心件的An50Ti轉(zhuǎn)子進(jìn)行離心實(shí)驗(yàn)。在三個(gè)連續(xù)的速度(5,000、6,000和11,000rpm)在短柱(23μl)中分析低速下的沉降平衡，并且在280nm波長處取得平衡的圖像(20小時(shí)后)。關(guān)注實(shí)驗(yàn)中可溶形式的蛋白質(zhì)物質(zhì)的保留。沉降速度對照實(shí)驗(yàn)在45小時(shí)的時(shí)間間隔中未顯示任何聚集。高速離心(42,000rpm下5小時(shí))后測量參考信號。使用EQASSOC程序得到由完整細(xì)胞的表觀重量表示的平均分子量[Minton，A.P.(1994)in ModernAnalytical Ultracentrifugation(現(xiàn)代分析超離心)(Schuster，T.，and Laue，T.，eds)，pp.81-93，Birkhauser Boston，Inc.，Cambridge，MA]。在42,000rpm下進(jìn)行沉降速率實(shí)驗(yàn)，并且在280nm處取得吸光度圖像。使用如SEDFIT程序中執(zhí)行的連續(xù)分布c(s)Lamm方程模型來計(jì)算沉降系數(shù)[P.Schuck.Size-Distribution Analysis of Macromolecules by SedimentationVelocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling(通過沉降速度超離心和Lamm方程建模的大分子尺寸分布分析).BiophysicalJournal 78(2000)，pp.1606-1619]。根據(jù)慣常條件校正這些實(shí)驗(yàn)沉降值以使用SEDNTERP程序得到對應(yīng)的s20，w[T.M.Laue，B.D.Shah，T.M.Ridgeway and S.L. Pelletier，Computer-aided interpretation of analyticalsedimentation data for proteins(蛋白質(zhì)分析沉降數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)輔助解釋).InS.E.Harding，AJ.Rowe and J.C.Horton，Editors，AnalyticalUltracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science(生物化學(xué)和聚合物科學(xué)中的超離心)，Royal Society of Chemistry，Cambridge，UK(1992)，pp.90-125]。使用SEDFIT程序的附加流體力學(xué)分析(即，摩擦系數(shù)比例的計(jì)算)以得到c(M)分布[P.Schuck.Size-Distribution Analysisof Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation andLamm Equation Modeling(通過沉降速度超離心和Lamm方程建模的大分子尺寸分布分析).Biophysical Journal 78(2000)，pp.1606-1619]。
在分析膠上的過濾層析在室溫下通過使用Superdex 200 10/300GL柱的AKTA FPLC系統(tǒng)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。以0.5-1.0mg/mL的濃度注入PBS中的不同重組蛋白(L36scFv、L36scFv-NC1ES-、L36scFv-NC1ES+和NC1)樣品各0.1mL，并且以流速0.5ml/min分離。使用高和低分子量標(biāo)志物(Amersham)校正該柱。洗脫體積與排除體積的比和標(biāo)志物的分子量被設(shè)置成指數(shù)曲線，使用該曲線來計(jì)算樣品的分子量。
蛋白酶從Oncogene Research Products(San Diego，CA，U.S.A.)得到人MMP-1和MMP-9基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，從Calbiochem(San Diego，CA，U.S.A.)得到人MMPs，MMP-3、MMP-8和MMP-14(MT1-MMP)。從Calbiochem得到人組織蛋白酶L和豬胰彈性蛋白酶。
蛋白水解加工將濃度為0.6μM的重組蛋白L36scFv-NC1ES-、L36scFv-NC1ES+和NC1在37℃下與以下成分一起孵育10分鐘-10nM人組織蛋白酶L，在50mM醋酸鈉、pH 5.5、硫蘇糖醇(DTT)2mM、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)中(用于人組織蛋白酶L的處理)；-25nM豬胰彈性蛋白酶在50mM醋酸鈉、pH 6.0中(用于豬彈性蛋白酶的處理)；和-25nM金屬蛋白酶，在50mM Tris-HCl、pH 7.5、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.05％Brij-35、50μM ZnSO4中(用于使用金屬蛋白酶的處理)。
然后將等分試樣在還原條件下、在十二烷基硫酸鈉存在下、在12％的聚丙烯酰胺膠(SDS-PAGE)中電泳。用硝酸銀(Sigma BioScience)將膠染色，或者使用小鼠抗ES mAb進(jìn)行Western印跡。
Matrigel中的管形成分析對于毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)(CLS)形成分析，在預(yù)先冷凍的72-孔Terasaki板(Nunc，Roskilde，Denmark)上制備基于Matrigel的膜基質(zhì)(BectonDickinson，Bedford，MA，U.S.A.)，2μl/孔，然后在37℃下固化30分鐘。在10μl補(bǔ)充有0.5％FBS的合適培養(yǎng)液中接種3×103ECs(HMEC-I或HUVEC)，所述培養(yǎng)液位于凝膠化的基質(zhì)上。調(diào)整每孔中培養(yǎng)液的總體積至25μl，與此同時(shí)，制備細(xì)胞并且在用5％CO2潤濕的氣氛下在37℃下孵育16小時(shí)。通過在鋪板細(xì)胞時(shí)向經(jīng)Matrigel包被的板中加入15μl純化的重組蛋白來確定分析重組蛋白(L36scFv、L36scFv-NC1ES-、L36scFv-NC1ES+、NC1和ES)對管形成的抑制作用，所述重組蛋白根據(jù)使用的細(xì)胞株(HMEC-1或HUVEC)在適合的培養(yǎng)液中被稀釋至不同濃度(圖5D)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行。
數(shù)字圖像分析使用SPOT照相機(jī)(Diagnostics Instruments，Inc.)從Axiovert 100顯微鏡(Carl Zeiss，Germany)得到每一個(gè)孔的數(shù)字圖像，并且儲存為328×256像素8位灰度的BMP圖像。使用基于Matlab 5.3的新的AD軟件處理圖像[Sanz，L.et al.Microvasc Res.2002May；63(3)335]。
細(xì)胞遷移分析對于EC遷移研究，用無血清的培養(yǎng)液中的濃度為1.25μg/ml的Matrigel在4℃下過夜包被具有孔尺寸3.0μm和直徑6.5mm的聚對苯二甲酸乙二醇酯過濾器插入物(Becton Dickinson)。在20μg/ml純化的蛋白(L36scFv、L36scFv-NC1ES-、ES、NC1和L36scFv-NC1ES+)存在下、5％CO2潤濕的氣氛中、37℃下、在無血清的培養(yǎng)液中預(yù)孵育HUVEC細(xì)胞(1.5×105)30分鐘，然后將其轉(zhuǎn)移至上部區(qū)室中。向底部區(qū)室中加入含有血清的培養(yǎng)液600μl。16小時(shí)后，用PBS中的1％戊二醛固定細(xì)胞，然后用0.1％結(jié)晶紫染色并且在顯微鏡下觀察。
II.結(jié)果在內(nèi)皮管形成分析中內(nèi)皮抑素和抗層粘連蛋白抗體(L36)的scFv的聯(lián)合作用已經(jīng)證明寡聚ES調(diào)節(jié)依賴細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)形態(tài)發(fā)生[Cuo CJ et al.J Cell Biol.2001 1521233]。在將細(xì)胞鋪板至Matrigel上的時(shí)候，用Fc-ES形式的二體ES處理顯著抑制向管狀結(jié)構(gòu)的裝配，保持EC分散并且顯示與塑料上細(xì)胞相似的形態(tài)。這些形態(tài)變化與當(dāng)用L36scFv處理EC培養(yǎng)物時(shí)觀察到的類似(圖1)。
融合蛋白L36scFv-ES的設(shè)計(jì)和表達(dá)ES源自膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域，其以三體形式被蛋白水解釋放并且隨后轉(zhuǎn)化成約20kDa的單體ES(圖2A和2B)。構(gòu)建了表達(dá)不同蛋白的不同嵌合基因。
在一特定實(shí)施方案中，構(gòu)建了稱為L36scFv-NC1ES+的嵌合基因，由融合到小鼠膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域(殘基10至315)的抗層粘連蛋白mAb L36的scFv構(gòu)成(圖2C和3A)。在膠原XVIII的NC1N-末端尾端，存在約60個(gè)氨基酸殘基的三具體化結(jié)構(gòu)域，通過約70個(gè)氨基酸殘基的柔性鉸鏈區(qū)，大約與約180個(gè)氨基酸殘基的ES模塊連接，該鉸鏈區(qū)約含有對蛋白酶敏感的若干位點(diǎn)，蛋白酶在蛋白水解切割后釋放單體ES(圖2B)。連接膠原三螺旋和NC1三聚體化結(jié)構(gòu)域的“連接肽”對不同MMPs的作用敏感，其負(fù)責(zé)從母體膠原XVIII釋放NC1結(jié)構(gòu)域。因此，為防止L36的氨基末端的NC1結(jié)構(gòu)域的可能切割，用17個(gè)氨基酸的“柔性接頭”替換所述“連接肽”(圖2B和2C)。
類似地，在另一特定實(shí)施方案中，構(gòu)建了稱為L36scFv-NC1ES-的嵌合基因，其比前一個(gè)基因短，含有L36scFv的編碼序列、所述柔性接頭以及僅含有NC1的三聚體化結(jié)構(gòu)域(圖3A)。
his6myc標(biāo)簽被連接到融合蛋白的C-末端尾端以輔助免疫檢測。
將基因構(gòu)建體克隆至適合的哺乳動物載體中，處于含有人制瘤素M的主要序列的hCMV啟動子的控制之下。ES(位置130-315)和小鼠NC1(1-315)的表達(dá)載體被用作對照(圖3A)。
在HEK 293細(xì)胞中建立穩(wěn)定細(xì)胞株，并且純化條件培養(yǎng)液的融合蛋白。Western印跡分析顯示純化蛋白的遷移模式與預(yù)測分子量的一致(圖3B)[泳道1L36scFv，泳道2L36scFv-NC1ES-、泳道3L36scFv-NC1ES+、泳道4NC1、和泳道5ES]。
在還原條件下，抗myc mAb 9E10產(chǎn)生具有分子量(MW)明顯為26、36、67.5和22kDa的單條帶(圖3B)，其分別對應(yīng)單體L36scFv、三體L36scFv、L36scFv-NC1和單體ES的計(jì)算MW 28.8、37.6、65.6和23.8kDa。在使用含有NC1結(jié)構(gòu)域的蛋白的Western印跡分析中，mAb 9E10識別對應(yīng)單體ES的約24kDa的單一條帶和對應(yīng)未加工蛋白的39-44kDa的雙條帶(圖3B)。雙條帶中的兩條條帶在使用抗ESmAb(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY 12946，USA)的Western印跡中均為陽性。雙條帶可能由于翻譯后修飾或內(nèi)部蛋白折疊作用。
抗ES mAb還顯影出24kDa條帶和具有分子量明顯約23kDa的另外的條帶，其可能對應(yīng)未標(biāo)記的ES型單體(圖3B)。通過使用L36scFv-NC1Es+蛋白的Western印跡分析，抗ES mAb識別67.5kDa的未加工的融合和未被mAb 9E10檢測到的24kDa條帶，其對應(yīng)加工的ES結(jié)構(gòu)域(圖3B)。當(dāng)用抗ES mAb顯影時(shí)，純化的ES顯示為22-23kDa的雙條帶(圖3B)。
融合蛋白L36scFv-NC1Es-的表征通過膠過濾的分析層析方法和使用相同樣品的分析離心實(shí)驗(yàn)來評價(jià)不同融合蛋白的寡聚化狀態(tài)。通過IMAC(固化的金屬親和層析)純化融合蛋白L36scFv-NC1ES-，該融合蛋白被以基本上單一的峰(總面積的90％)從膠過濾柱洗脫，洗脫體積對應(yīng)分子量109kDa，表明該蛋白是三聚體。沉降速率也顯示質(zhì)量為112kDa的主要單一峰，并且沉降平衡經(jīng)驗(yàn)導(dǎo)致可以調(diào)整為三聚體物質(zhì)但不可以調(diào)整為單體或二聚體的質(zhì)量分布(圖4A)。作為整體，這些結(jié)果顯示融合蛋白L36scFv-NC1ES-的三聚體性質(zhì)，該性質(zhì)是由NC1三聚體化結(jié)構(gòu)域給予的特性，因?yàn)槿缒z過濾和沉降速率實(shí)驗(yàn)所顯示，L36scFv在相同條件下是單體(數(shù)據(jù)未顯示)。三聚體L36scFv(L36scFv-NC1ES-)對固化在塑料上的層粘連蛋白更強(qiáng)的結(jié)合親和力，并且在阻斷EC在Matrigel底物上的分化中比單體更有效的多(圖4B和4C)。
為了實(shí)驗(yàn)的目的，有必要在蛋白酶存在下保持融合蛋白L36scFv-NC1ES-穩(wěn)定且有功能。因此，測定在與已知活性酶摩爾濃度的各種蛋白酶一起孵育后其功能性。蛋白酶包括幾種類型蛋白酶的代表，即，半胱氨酸蛋白酶家族的組織蛋白酶L；金屬蛋白酶家族的MMP-1，MMP-3；MMP-8；MMP-9、MMP-14，以及絲氨酸蛋白酶家族的胰彈性蛋白酶。如圖4D所示，在大部分測試蛋白酶的存在下，三聚體L36scFv(L36scFv-NC1ES-)未被切割。MMP-14部分切割三聚體(L36scFv-NC1ES-)，但是盡管在反應(yīng)4小時(shí)后，通過ELISA依然檢測到功能活性的抗體，只有組織蛋白酶L完全降解融合蛋白L36scFv-NC1ES-。
融合蛋白L36scFv-NC1Es+的表征排阻層析顯示純化的融合蛋白L36scFv-NC1ES+以分子量約210kDa的主要峰和表觀分子量約117kDa的另一峰洗脫，分子量約210kDa的峰與三聚體一致，分子量約117kDa的峰可能對應(yīng)缺失ES的部分的片斷(圖5A)。沉降速率也鑒別出分子量181kDa和83kDa的兩種。
重組NC1蛋白以分子量約123kDa的主要峰和其它較小峰洗脫，主要峰對應(yīng)三聚體種類，較小峰中的一個(gè)具有分子量19kDa，對應(yīng)ES單體(圖5B)。通過沉降速率實(shí)驗(yàn)鑒別出具有分子量116kDa的主要種類。這些數(shù)據(jù)表明重組NC1蛋白主要是三聚體，但是是異源的，這有可能由于降解，此結(jié)果與在重組NC1蛋白中觀察到類似異源性的其它研究者得到的結(jié)果一致[Sasaki T.et al.EMBO J.1998174249-56]。
如所預(yù)期的，融合蛋白L36scFv-NC1ES+顯示對固化在塑料上的層粘連蛋白的結(jié)合親和力稍微高于對重組NC1蛋白的結(jié)合親和力(圖5C)。以相同方式，所述融合蛋白L36scFv-NC1ES+(雙特異性的)在阻斷Matrigel底物上的EC分化中比重組NC1蛋白(單特異性的)更有效的多(圖5D)。
圖5E包括EC遷移分析的結(jié)果，并且顯示在L36scFv-NC1ES+的存在下，HUVEC細(xì)胞的遷移小于在存在其它分析重組蛋白(L36scFv和NC1)時(shí)所達(dá)到的，并且與重組ES時(shí)所達(dá)到的處于同一數(shù)量級。融合蛋白L36scFv-NC1ES+的蛋白水解加工。單體ES和多聚體scFv的產(chǎn)生。
為了通過幾種蛋白酶來研究ES產(chǎn)生，孵育融合蛋白L36scFv-NC1ES+，并且通過使用抗ES mAb(Upstate Biotechnology，LakePlacid，NY 12946，USA)的Western印跡來分析反應(yīng)混合物。用五種分析MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-8、MMP-9和MMP-14)處理融合蛋白，在加工蛋白L36scFv-NC1ES+的有效性中觀察到所述MMPs之間的顯著不同，MMP-3和MMP-14是最有效的。在4小時(shí)內(nèi)觀察到融合蛋白L36scFv-NC1ES+的完全加工。主要累積產(chǎn)物是包含20和25kDa之間分子量的多肽(圖6A)。MMP-3、MMP-8、MMP-9和MMP-14產(chǎn)生的ES片斷在4小時(shí)后累積，表明所述MMPs不能降解它們。如圖6A所示，彈性蛋白酶和組織蛋白酶L不僅從融合蛋白L36scFv-NC1ES+產(chǎn)生ES型片斷，并且這些酶還快速降解這些片斷，在4小時(shí)孵育后只有少量的ES保留。該蛋白水解加工模式與在未修飾的鼠NC1蛋白中觀察到的幾乎相同(圖6B)。結(jié)果表明向含有識別NC1結(jié)構(gòu)域的表位的位點(diǎn)的抗體片斷的N-末端尾端的添加，不干擾融合蛋白被蛋白酶的蛋白水解加工，也不干擾ES產(chǎn)生，所述抗體片斷例如scFv。
出于研究蛋白酶產(chǎn)生抗體片斷(L36scFv)的有效性的目的，在還原條件下對反應(yīng)混合物進(jìn)行SDS-PAGE，并且用硝酸銀染色。如圖6C所示，產(chǎn)生ES的最有效蛋白酶是MMP-14，其還產(chǎn)生L36scFv。產(chǎn)生的L36scFv和ES穩(wěn)定并且在4小時(shí)后累積，表明在這些實(shí)驗(yàn)條件下，蛋白酶不能降解它們。三聚體L36scFv的密度和ES的密度之間的關(guān)系表明融合蛋白L36scFv-NC1ES+的平衡加工。使用其它MMPs觀察到類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
權(quán)利要求
1.基因構(gòu)建體，至少包含可操作地連接的a)第一核酸序列(A)，其包含編碼識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的多肽的核酸序列；和b)第二核酸序列(B)，其包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)，其中所述第一核酸序列(A)的3’末端與所述第二核酸序列(B)的5’末端相連。
2.如權(quán)利要求1所述的基因構(gòu)建體，其中所述參與血管生成過程的分子是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白、血管生成因子或細(xì)胞膜受體。
3.如權(quán)利要求2所述的基因構(gòu)建體，其中所述參與血管生成過程的分子是哺乳動物層粘連蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的基因構(gòu)建體，其中所述層粘連蛋白是大鼠、小鼠或人層粘連蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述的基因構(gòu)建體，其中所述包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的區(qū)域的多肽是識別所述參與血管生成過程的分子的抗體、識別所述參與血管生成過程的分子的抗體的單鏈Fv片斷(scFv)或者識別所述參與血管生成過程的分子的雙特異性抗體或雙價(jià)小分子抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的基因構(gòu)建體，其中所述參與血管生成過程的分子是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白、血管生成因子或細(xì)胞膜受體。
7.如權(quán)利要求5所述的基因構(gòu)建體，其中所述包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的區(qū)域的多肽是識別哺乳動物層粘連蛋白，優(yōu)選大鼠、小鼠或人層粘連蛋白的抗體的scFv。
8.如權(quán)利要求1所述的基因構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列(B)包含編碼哺乳動物膠原XV的NC1結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或者編碼哺乳動物膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，含有對應(yīng)所述NC1結(jié)構(gòu)域的三聚體化結(jié)構(gòu)域和內(nèi)皮抑素(ES)的核苷酸序列，以及編碼所述NC1結(jié)構(gòu)域的鉸鏈肽的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求1所述的基因構(gòu)建體，除所述核酸序列(A)和(B)外其還包含第三核酸序列(C)，所述第三核酸序列(C)含有編碼柔性結(jié)合蛋白的核苷酸序列，其中所述第三核酸序列(C)的5′末端與所述第一核酸序列(A)的3′末端連接。
10.表達(dá)盒，其包含與表達(dá)控制序列可操作地連接的權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體。
11.重組載體，其包含權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體，或者權(quán)利要求10所述的表達(dá)盒。
12.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體，或者權(quán)利要求10所述的表達(dá)盒，或者權(quán)利要求11所述的重組載體。
13.通過包含在權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體中的核酸序列的表達(dá)獲得的融合蛋白。
14.融合蛋白，其包含a)多肽(A’)，其包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的區(qū)域；和b)多肽(B’)，其包含(i)寡聚化結(jié)構(gòu)域，(ii)血管生成過程中的功能活性區(qū)域，和(iii)位于所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和所述血管生成過程中的功能活性區(qū)域之間的蛋白酶敏感區(qū)。
15.如權(quán)利要求14所述的融合蛋白，其中所述參與血管生成過程的分子是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白、血管生成因子或細(xì)胞膜受體。
16.如權(quán)利要求15所述的融合蛋白，其中所述參與血管生成過程的分子是哺乳動物層粘連蛋白，優(yōu)選大鼠、小鼠或人層粘連蛋白。
17.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其中所述多肽包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的區(qū)域，是識別所述參與血管生成過程的分子的抗體、識別所述參與血管生成過程的分子的抗體的單鏈Fv片斷(scFv)或者識別所述參與血管生成過程的分子的雙特異性抗體或雙價(jià)小分子抗體。
18.如權(quán)利要求17所述的融合蛋白，其中所述參與血管生成過程的分子是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白、血管生成因子或細(xì)胞膜受體，優(yōu)選哺乳動物層粘連蛋白，更優(yōu)選大鼠、小鼠或人層粘連蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的融合蛋白，其中所述多肽(A’)是識別哺乳動物層粘連蛋白的抗體的scFv，所述哺乳動物層粘連蛋白優(yōu)選大鼠、小鼠或人層粘連蛋白。
20.如權(quán)利要求14所述的融合蛋白，其中所述多肽(B’)包含哺乳動物膠原XV的NC1結(jié)構(gòu)域或者哺乳動物膠原XVIII的NC1結(jié)構(gòu)域。
21.如權(quán)利要求14所述的融合蛋白，其包含位于所述多肽(A’)和(B’)之間的第三多肽(C’)，所述第三多肽(C’)包含柔性結(jié)合肽的氨基酸序列。
22.獲得權(quán)利要求13-21中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白的方法，所述方法包含在使得所述融合蛋白能夠產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，并且如果需要的話，分離和純化所述融合蛋白。
23.藥物組合物，其包含權(quán)利要求13-21中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白和至少一種藥物可接受的賦形劑。
24.藥物組合物，其包含包含如權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體的載體或者如權(quán)利要求10所述的表達(dá)盒，以及至少一種藥物可接受的賦形劑。
25.權(quán)利要求13-21中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白、權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體、或者權(quán)利要求10所述的表達(dá)盒、或者權(quán)利要求11所述的載體在制備預(yù)防、治療、阻止或最小化血管生成發(fā)展的藥物組合物中的用途。
26.權(quán)利要求13-21中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白、權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體、或者權(quán)利要求10所述的表達(dá)盒、或者權(quán)利要求11所述的載體在制備治療或預(yù)防有血管生成發(fā)生的病理過程的藥物組合物中的用途。
27.如權(quán)利要求26所述的用途，其中所述有血管生成發(fā)生的病理過程包括癌癥、血管瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、巴爾通氏體病、移植器官排斥、出血、眼部新血管形成、視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、新生血管性青光眼、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動脈阻塞、翼狀胬肉、紅變或角膜新血管形成。
全文摘要
由融合蛋白構(gòu)成的多功能和多價(jià)的血管生成抑制劑，該融合蛋白包含識別和阻斷參與血管生成過程的分子的功能活性區(qū)的多肽，以及包含寡聚化結(jié)構(gòu)域和具有功能活性的血管生成過程的抑制劑或調(diào)節(jié)物的多肽，其中所述寡聚化結(jié)構(gòu)域和抑制劑或調(diào)節(jié)物被蛋白酶敏感區(qū)分開。所述抑制劑適用于治療和預(yù)防有血管生成過程發(fā)生的病理過程，例如癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或銀屑病。
文檔編號C12N15/62GK101065486SQ200580038123
公開日2007年10月31日 申請日期2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月2日
發(fā)明者路易斯·阿爾瓦雷斯巴利納, 維克特·哈維爾·桑切斯-阿雷瓦洛洛沃, 安赫爾·奎斯塔馬丁內(nèi)斯, 勞拉·桑斯阿爾科維爾, 胡安·瓦爾加斯努內(nèi), 馬爾塔·孔特格勞 申請人:馬德里自治大學(xué)