專利名稱：真菌調節(jié)子的鋅雙核簇家族轉錄因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼轉錄因子的多肽的核酸序列，和由所述核酸序列編碼的多肽。
本發(fā)明還涉及包含所述核酸序列的構建體、載體和宿主細胞。
此外，本發(fā)明涉及包括調節(jié)轉錄因子生產或功能的方法，并且涉及用于表達和生產目標蛋白質的宿主細胞，在所述宿主細胞中轉錄因子的生產或功能已經得到調節(jié)。
另外，本發(fā)明涉及目標蛋白質的體內生產方法。
背景技術：
和現有技術已知絲狀真菌具有產生廣泛的不同代謝物，且特別是具有各種工業(yè)化應用的分泌的酶的能力，所述工業(yè)化應用包括提供治療或用于焙烤工業(yè)。
在研發(fā)真菌轉化系統(tǒng)前，生產菌株的改進主要限于基于傳統(tǒng)誘變的策略，隨后篩選所需的表型或酶促活性，和選擇最佳生產者菌株。
在商業(yè)上，絲狀真菌目前成為廣泛使用的用于生產同源和異源蛋白質的宿主細胞系統(tǒng)，且迄今為止，已經成功地將幾種分子和遺傳手段用于優(yōu)化絲狀真菌作為細胞工廠，特別是那些來自曲霉屬(Aspergilli)的絲狀真菌。
在許多情況中，這些手段已經導致了同源和異源蛋白質的產率上升，并且基本上減少了大規(guī)模實施新的生產過程所需的時間。
然而，對改進的方法仍然存在需求。
絲狀真菌為纖維素分解酶和半纖維素分解酶的眾所周知的生產者。這些生物體的纖維素酶降解系統(tǒng)由三類酶組成，即內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases)和β-葡糖苷酶。木聚糖為半纖維素，即需要更復雜的一組酶用于其降解的非均質聚合物。這些廣泛被分類為木聚糖酶的酶包括內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、乙?；揪厶酋ッ?acetylxylan esterase)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(arabinofuranohydrolase)、β葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和對-香豆?；ッ?coumaroyl esterase)(方案1)。
曲霉屬和木霉屬(Trichoderma)物種纖維素降解酶和木聚糖降解酶的表達在轉錄水平上受到調節(jié)。然而，阻抑和誘導機制尚未得到完全闡明。
轉錄因子xlnR最初克隆自絲狀真菌黑曲霉(A.niger)，并且被鑒定為編碼木聚糖酶的基因的轉錄活化物(WO 97/00962)。實際上，已經證實它引發(fā)大量基因的轉錄，所述基因在若干真菌物種中參與纖維素和半纖維素的降解。基于其結構，將XlnR歸于真菌轉錄因子家族，該家族轉錄因子的DNA結合結構域由螯合兩個Zn原子的6個保守半胱氨酸殘基組成，即所謂的Zn雙核簇(Zn binuclear cluster)。
已經從各種曲霉屬(構巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、川地曲霉(A.kawachii)、塔賓曲霉(A.tubingensis)、黃曲霉(A.flavus))，以及從其它真菌，如Hepocrea jecorina(無性型瑞氏木霉(T.reesei))中克隆了XlnR同源物。此外，可以在許多公眾可進入的真菌基因組數據庫中發(fā)現類似的序列，諸如煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)、Magnaporthe grisea、Podospora anserina、Fusarium grameniarum。盡管不同物種之間的總體同源性在50-90％范圍內改變，但是它在DNA結合結構域中表現出接近100％的同一性，所述的DNA結合結構域包括在蛋白質N-末端部分上的6個半胱氨酸殘基的簇。特別地，由序列NQLRTK表示的第二與第三半胱氨酸之間的氨基酸殘基的一段序列為極其保守的。一般而言，該序列決定了Zn2Cys6雙核簇蛋白質的DNA結合特異性，就XlnR而言，該特異性可識別帶有共有核心5′GGCTAR 3′的關連DNA靶標(deVries和Visser，2001；Microbiol Mol Biol Reviews v65497-522)。因此，可以預計所有這些同源物均在涉及木聚糖降解的基因的轉錄調節(jié)中起作用。
最近以來，已經嘗試了幾種手段用來自絲狀真菌的重組宿主細胞改善目標蛋白質(POI)的生產。
文獻中記錄的用于改善分泌的同源和異源蛋白質的產率的最為直接的策略在于導入多個拷貝的目標結構基因(例如，參見Hessing等，1994)。然而，該手段并非始終導致目標基因的過量表達。真菌細胞中目標蛋白質的濃度也已經通過由強啟動子表達它而得到增加(Mathieu和Felenbok，1994；Nikolaev等，2002；Rose和van Zyl，2002。
黑曲霉中木聚糖分解(xylanolytic)和纖維素分解系統(tǒng)的轉錄和作為結果的總酶生產可以通過增加xlnR的基因拷貝數而得到促進(Gielkens等，1999)。相反，基因破壞使xlnR失活導致細胞外木聚糖分解基因的轉錄缺失。
另一種手段意旨通過使轉錄因子的結合位點突變來修飾目標基因的啟動子區(qū)域。米曲霉xynF1基因的啟動子活性通過突變兩個非典型的對一種序列的XlnR結合位點序列而得到成功地上調，該序列推定具有最高結合親和力，所述活性根據β-半乳糖苷酶活性監(jiān)測(Marui等，2003)。xynF1啟動子區(qū)域中攜帶三個典型XlnR結合序列的轉化體比那些帶有真正啟動子的轉化體產生2.8倍更多的酶。
碳代謝中涉及的許多基因受到由全局阻抑物(global repressor)CreA介導的碳阻抑。實際上，CreA在幾個水平上控制基因表達，并且可以阻抑結構和調節(jié)基因。相應啟動子中CreA結合位點的缺失或突變導致轉錄的部分脫抑制和蛋白質生產改善(Orejas等，1999)。在creA脫抑制的背景中獲得了進一步改善(Prathumpai等，2004)。
在曲霉屬中，D-木糖作為木聚糖分解基因誘導物起作用(de Vries等，1999；Gouka等，1996)。此外，木聚糖酶生產在生長在含L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中的瑞氏木霉(T.reesei)(Xiong等，2004)和變灰白青霉(Penicilliumcanescens)(Vavilova等，2003)中都表現出改善。
代謝控制分析和代謝途徑改造是菌株改進的其它有用方式。已經顯示在前兩個步驟上施加木糖代謝的流出控制(Prathumpai等，2003)。導致D-木糖減少的基因之一被破壞，導致木聚糖酶轉錄增加(Hasper等，2000)。
通過目標蛋白質與充分分泌的真菌蛋白質的C-末端融合，獲得異源蛋白質生產產率的最巨大改善(Ward等，1990，Contreras等，1991)。
此外，具有不需要的活性的基因，如蛋白酶的缺失，表現出在提高表達方面極為有用(Van den Hombergh等，1997)。
本發(fā)明的一個目的在于提供改進的方法以增加宿主細胞中目標蛋白質生產，其中代謝調節(jié)中涉及的轉錄因子的活性已經得到改變。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的轉錄因子PntR(表示戊糖調節(jié)子(pentose regulator))的鑒定，其為真菌調節(jié)子Zn雙核簇家族中的成員。
在本文中描述從構巢曲霉、塔賓曲霉和黑曲霉中克隆pntR基因，并且證明對該基因的破壞可損害戊糖代謝，且特別是L-阿拉伯糖代謝，導致XlnR調節(jié)的基因的轉錄提高，和L-阿拉伯糖誘導型基因的下調。作為結果，木聚糖酶和β-葡聚糖酶的生產改善了幾倍，而α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性稍微下降。
不希望受到任何特定理論的約束，經實驗觀察到在某些條件下(在L-阿拉伯糖代謝減少的真菌菌株中)，L-阿拉伯糖或其中間代謝物L-阿拉伯糖醇可以用作與D-木糖類似的XlnR表達的有效誘導物。XlnR水平升高導致XlnR調節(jié)的基因的表達增加。
可以將這類代謝受調節(jié)的菌株視為有希望的宿主，用于由XlnR控制的啟動子驅動的優(yōu)化的異源表達。
在一個寬泛的方面中，本發(fā)明提供了在宿主細胞中表達POI(目標蛋白質)的方法，所述POI的編碼序列處于由XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下，該方法包含在所述的宿主細胞中產生轉錄因子PntR的敲減。這類表達方法可以用于生產POI的生產方法中。
在一個寬泛的方面中，本發(fā)明進一步涉及生物體，諸如微生物，特別是真菌，其已經被修飾而具有轉錄因子PntR的敲減，以便能夠產生高水平的POI，所述POI的編碼序列處于由XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下。
本發(fā)明具有優(yōu)勢，因為它可以提供在絲狀真菌中產生目標蛋白質的改進的生產方法。
轉錄因子“PntR”特別意指來源于真菌且優(yōu)選絲狀真菌的pntR基因或蛋白質。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼PntR的核苷酸序列是可獲自真菌(盡管它實際上不一定獲自)的PntR序列，所述PntR為被選擇或靶向來在本發(fā)明宿主細胞中敲減的。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的真菌選自構巢曲霉、黑曲霉和塔賓曲霉。
來自可以靶向來敲減的真菌物種的其它合適的PntR基因包括那些來源于其它曲霉屬(米曲霉、川地曲霉、黃曲霉和煙曲霉)以及來自其它真菌的PntR基因，所述的其它真菌包括，但不限于隱球酵母屬(Cryctococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、鐮孢霉屬(Neurospora)、青霉屬、Piromyces、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)和木霉屬的菌株。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及分離的和/或純化的新PntR多肽或其功能片段，其中所述的PntR多肽可來源于真菌物種。本發(fā)明還提供了編碼所述PntR多肽的核酸序列。
注意到本發(fā)明提供了使用真菌生產系統(tǒng)體內生產蛋白質的改進方法。這類改進的方法迄今為止在本領域中尚未披露或提示。
本發(fā)明的方面在權利要求和下列說明中提供。
為便于參照，在適當的小節(jié)標題下討論本發(fā)明的這些和其它方面。然而，各小節(jié)中的教導不一定限于每一具體的小節(jié)。
作為本發(fā)明涉及使用，術語“產生(produce)”、“生產(producing)”、“產生的(produced)”、“可產生(producible)”、“生產(production)”與相應的術語“制備(prepare)”、“制備(preparing)”、“制備的(prepared)”，“制備(preparation)”、“產生的(generated)”、“產生(generation)”和“可制備的(preparable)”同義。
作為本發(fā)明涉及使用，術語“表達(expression)”、“表達(expresses)”、“表達的(expressed)”和“可表達的(expressable)”與相應的術語“轉錄(transcription)”、“轉錄(transcribes)”、“轉錄的(transcribed)”和“可轉錄的(transcribable)”同義。
作為本發(fā)明涉及使用，術語“轉化”和“轉染”意指將核酸序列導入宿主、宿主細胞、組織或器官的方法。
涉及可以用于本發(fā)明的核苷酸序列的其它方面包括包含本發(fā)明序列的構建體；包含用于本發(fā)明的序列的載體；包含用于本發(fā)明序列的質粒；包含用于本發(fā)明的序列的轉化的細胞；包含用于本發(fā)明的序列的轉化的組織；包含用于本發(fā)明的序列的轉化的器官；包含用于本發(fā)明的序列的轉化的宿主；包含用于本發(fā)明的序列的轉化的生物體。本發(fā)明還包括使用它們表達用于本發(fā)明的核苷酸序列的方法，諸如在宿主細胞中表達；包括用于轉化它們的方法。本發(fā)明進一步包括分離核苷酸序列，諸如從宿主細胞中分離它們的方法。
涉及用于本發(fā)明的氨基酸序列的其它方面包括編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的構建體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的載體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的質粒；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉化的細胞；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉化的組織；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉化的器官；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉化的宿主；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉化的生物體。本發(fā)明還包括使用它們用于純化用于本發(fā)明的氨基酸序列的方法，諸如在宿主細胞中表達；包括轉化它們且然后純化所述序列的方法。
附圖簡述方案1顯示絲狀真菌中阿拉伯木聚糖降解途徑的示意圖。


圖1.質粒pSFH1的圖譜。
圖2.質粒pPntRΔ-pyrG的圖譜。
圖3.典型構巢曲霉ΔpntR缺失體中的一種(ΔpntR1)與受體pyrG89argB2菌株(R)比較在MM上的生長試驗，用1％的如所示各碳源。
圖4.來自構巢曲霉ΔpntR轉化體的基因組DNA的DNA印跡分析，所述基因組DNA用ClaI限制酶消化。用pntR的5′片段探測印跡，并且在60℃使用1xSSC，0.1％SDS洗滌。
圖5.用10mM D-木糖或L-阿拉伯糖醇誘導后，受體(R)和ΔpntR1缺失體(D1)菌株的酶測定(上)和轉錄分析(下)。
圖6.來自構巢曲霉(N)、黑曲霉(402)和塔賓曲霉(1和10)菌株的基因組DNA的Southern印跡。
圖7.質粒pAN7-ΔPntR的圖譜。
圖8.在具有1％L-阿拉伯糖的CM和MM上用質粒pAN7-ΔPntR轉化的塔賓曲霉1M-7的生長試驗(左圖)，和缺失體Δ20和1M-7菌株的Southern印跡(右圖)。
圖9.塔賓曲霉1M-7受體和pntR缺失體D5和D20菌株在1％果糖+0.1％YE、1％果糖+0.1％YE+10mM L-阿拉伯糖和1％木糖+0.1％YE上生長后，木聚糖酶(Xln)、β-葡聚糖酶(Egl)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Abf)的活性。將20μl培養(yǎng)物樣品用于木聚糖酶和β-葡聚糖酶測定，而100μl用于α-阿拉伯呋喃糖苷酶。對木聚糖酶和β-葡聚糖酶而言，使反應進行10分鐘，而對α-阿拉伯呋喃糖苷酶而言，使反應進行60分鐘。以O.D.表示活性。
圖10.塔賓曲霉1M-7受體和pntR缺失體菌株D2、D3、D5、D10、D12、D20、D22在具有甜菜漿的復合培養(yǎng)基上生長后，木聚糖酶(Xln)、β-葡聚糖酶(Egl)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Abf)和β-半乳糖苷酶(Bgal)的活性。
圖11.絲狀真菌中阿拉伯木聚糖途徑的方案，和編碼PntR轉錄因子的基因缺失對代謝和XlnR調節(jié)的基因表達的影響。
圖12.來自不同曲霉屬物種的PntR同源物的序列比對。
圖13.質粒pExSlac2的圖譜。
圖14.在構巢曲霉對照(CLac1、CLac2)和攜帶pExSlac2表達質粒的pntRΔ1缺失體(DpntRLac1、DpntRLac2、DpntRLac3)菌株的培養(yǎng)基中測定的b-半乳糖苷酶的細胞外活性。非轉化的菌株(C)用作內源性活性的對照。使全部菌株在1％果糖+0.2％YE+10mM L-阿拉伯糖和1％木糖+0.2％YE上生長3天。將50ul培養(yǎng)物樣品用于酶促測定。使反應在30℃下進行10分鐘。以O.D.表示活性。
發(fā)明詳述本發(fā)明在第一個方面中提供了在宿主細胞中表達目標蛋白質(POI)的方法，所述的目標蛋白質(POI)的編碼序列處于由XlnR調控的啟動子的轉錄控制下，該方法包含在所述的宿主細胞中產生轉錄因子PntR的敲減。
所謂的術語″轉錄因子″意指具有轉錄調控活性的多肽。
合適的情況是，該方法提供了POI表達的增加，即與在未按照本發(fā)明修飾的宿主細胞中獲得的目標蛋白質的表達水平相比，目標蛋白質的表達水平增加。
XlnR調控大范圍的細胞外碳水化合物水解酶的轉錄，包括主要的木聚糖分解酶。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，目標蛋白質(POI)可以由天然XlnR調控的基因編碼。在曲霉屬中的天然XlnR調控的基因包括例如xlnA、B、C、D、xyrA、eglA、B、C、axhA、axeA、aguA、faeA、cbhA、B和aglB(de Vries和Visser，2001)。在另一個實施方案中，POI為異源蛋白質。
所謂的術語同源蛋白質，我們理解為POI，在宿主細胞的親代細胞中，其編碼序列天然處于由XlnR調控的啟動子的轉錄控制下。
所謂的術語同源蛋白質，我們理解為POI，在宿主細胞的親代細胞中，其編碼序列并非天然處于由XlnR調控的啟動子的轉錄控制下。這類POIs的實例包括親代細胞中不受由XlnR調控的啟動子控制的蛋白質，或來源于非宿主的親代細胞的生物體的蛋白質。
合適的情況是，POI為木聚糖分解(xylanolytic)酶，諸如木聚糖酶或內切葡聚糖酶。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，POI為異源蛋白質。這類目標POI包括，但不限于淀粉酶、氧化還原酶、脂酶、肌醇六磷酸酶、果膠分解或果膠修飾酶。
由XlnR調節(jié)的啟動子的實例為來自塔賓曲霉的木聚糖酶A、xlnA和內切葡聚糖酶A、eglA的啟動子。例如，xlnA啟動子的序列由Graaff等，1994(Mol.Microbiol，v12479-490)描述。
本文首次鑒定了轉錄因子PntR。PntR為真菌調節(jié)子的Zn雙核簇家族的成員。盡管本申請描述了在SEQ ID NOS1、3和5中所述的曲霉屬中PntR的基因序列，但是本發(fā)明的方法還引入了對相當于或同源于曲霉屬PntR的PntR的敲減。術語“相當于曲霉屬PntR”意指轉錄因子具有與曲霉屬PntR相同的序列，或具有與曲霉屬PntR 60％以上同一的序列。該方法進一步引入了對其它真菌物種，且特別是其它絲狀真菌物種中PntR同源物的敲減。
在一個優(yōu)選的實施方案中，轉錄因子PntR包含如SEQ ID NO2，4或6中任一中所述的氨基酸序列。
所謂“調節(jié)(modulate)轉錄因子PntR”或“破壞PntR表達”意指修飾，且特別是減少PntR表達或活性，以便產生所述轉錄因子的降低水平或零水平。特別地，PntR的修飾、調節(jié)、破壞或敲減(knock down)意指敲除(Knockout)技術，以便通過重組技術消除或減少特異性基因序列的表達。這類技術為本領域技術人員眾所周知的，并且包括通過基因沉默技術使選擇的基因產生功能喪失的技術，諸如同源重組、基因破壞，反義和siRNA技術。合適的技術在實施例部分中描述。
調節(jié)進一步涉及通過諸如顯性負性蛋白質表達方法在蛋白質水平上敲減轉錄因子功能。這類技術為本領域技術人員所熟悉。例如，可以通過導入編碼功能遭破壞的PntR的核酸序列，諸如，編碼PntR和缺乏編碼Zn2Cy6的區(qū)域的核酸序列，調節(jié)轉錄因子功能。合適的宿主細胞包括絲狀真菌細胞，包括曲霉屬、木霉屬和青霉屬(Penicillium)的物種。其它合適的宿主細胞包括擔子菌綱(basidiomycetes)、酵母和細菌。
在一個實施方案中，所述的方法進一步包含分離/純化所述的POI。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供了PntR轉錄因子。合適的情況是，所述的轉錄因子包含相當于曲霉屬PntR的氨基酸序列或其功能等效物。
所謂“曲霉屬PntR”意指來自曲霉屬物種的PntR。特別地，曲霉屬PntR意指來自構巢曲霉、黑曲霉和塔賓曲霉的PntR。其它曲霉屬物種包括米曲霉、川地曲霉、煙曲霉和黃曲霉。
來自真菌物種的可以靶向敲減的其它合適的PntR基因包括那些來源于其它真菌的基因，所述的其它真菌包括，但不限于隱球酵母屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、鐮孢霉屬、青霉屬、Piromyces、踝節(jié)菌屬、熱子囊菌屬和木霉屬的菌株。
術語“其功能等效物”意指與曲霉屬PntR具有相同功能特征的轉錄因子。
優(yōu)選本發(fā)明該方面的轉錄因子具有與曲霉屬PntR相同的氨基酸序列或至少75％同一(同源)的序列。
合適的情況是，轉錄因子包含如SEQ ID NO2，4或6中任一中所述的氨基酸序列，或與之具有至少75％同一性(同源性)的序列，或其有效片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了分離和/或純化的多肽，其具有如SEQ ID NO2，4或6中任一所述的氨基酸序列，或之具有至少75％同一性(同源性)的序列，或其有效片段。
本發(fā)明在另一個方面中提供了分離和/或純化的核酸分子，編碼曲霉屬PntR的PntR轉錄因子的核酸或核苷酸序列，或其同源物。合適的是，所述的分離和/或純化的核酸分子編碼多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO2、4或6中任一所示的氨基酸序列，或與之具有至少75％同一性(同源性)的序列，或其有效片段。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離和/或純化的核酸分子或包含核苷酸序列的序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO1、3或5中的任一相同或與之互補、或含有對SEQ ID NO1、3或5中任一的任一密碼子的合適密碼子取代，或包含與SEQ ID NO1、3或5中任一具有至少60％，65％，75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同源性的序列。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及如下所示的核苷酸序列和核苷酸序列的應用(a)如SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其為如SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段；(c)核苷酸序列，其為在SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的補體；(d)核苷酸序列，其為在SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段的補體；(e)能夠與SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；(f)能夠與SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段雜交的核苷酸序列；(g)核苷酸序列，其為能夠與SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列的補體；(h)核苷酸序列，其為能夠與SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段雜交的核苷酸序列的補體；(i)能夠與SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的補體雜交的核苷酸序列；(j)能夠與SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段的補體雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的核苷酸序列可以包含編碼SEQ ID No.2、4或6中任一或其變體、同源物或衍生物的序列。
本發(fā)明的核苷酸序列可以用于產生相應序列，這些序列用于敲減用于本發(fā)明方法的細胞中的PntR表達。特別地，本發(fā)明的核苷酸序列可以用于鑒定siRNA分子或反義分子，這些分子可以用于敲減PntR表達。此外，如果鑒定pntR基因外部的側翼區(qū)域，本發(fā)明的核苷酸序列可以是有用的，所述側翼區(qū)域可以用于通過諸如同源重組這類技術產生pntR敲除。這些和其它合適的方法為本領域技術人員熟知的。
本發(fā)明還提供了包含如本文所述的PntR或其同源物或衍生物的質粒或載體系統(tǒng)。優(yōu)選所述的質?；蜉d體系統(tǒng)包含SEQ ID No1、3或5中任一所述的核酸序列，或與之至少75％同源的序列，或其有效片段。合適的是，所述的質粒或載體系統(tǒng)為微生物中用于表達任一所述轉錄因子的表達載體，所述的轉錄因子由SEQ ID No1、3或5中任一所述的核酸序列或與之至少75％同源(同一)的序列編碼。合適的表達載體如本文所述。
在本發(fā)明的一個方面中提供了用本發(fā)明任何方面的核酸轉化或轉染的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供了分離的核酸分子，該核酸分子被排列(arranged)以敲減轉錄因子PntR的表達或功能。合適的核酸分子包括那些包含遭破壞的PntR編碼區(qū)域以用于同源重組手段的分子。用于產生這類構建體的方法為本領域技術人員所熟知。一種合適的方法和構建體在本文中示例。其它合適的核酸分子包括siRNA分子和反義構建體。
在本發(fā)明的另一個方面中提供了用核酸構建體轉化或轉染的宿主細胞，該核酸構建體被排列以敲減轉錄因子PntR的表達或功能。合適的情況是，PntR為如本文所述的曲霉屬PntR或其同源物或衍生物。在一個實施方案中，所述的核酸構建體包含用于同源重組手段的遭破壞的PntR編碼區(qū)域。
合適的情況是，所述的宿主細胞進一步包含核酸構建體，該構建體包含在受XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下的目標蛋白質(POI)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞為微生物，包括真菌。合適的真菌宿主細胞包括絲狀真菌，包括那些選自由曲霉屬、木霉屬和青霉屬組成的組的那些絲狀真菌。
在一個實施方案中，本發(fā)明該方面的宿主細胞具有L-阿拉伯糖代謝阻滯。
所謂“L-阿拉伯糖代謝阻滯”意指與未修飾的細胞相比，用核酸構建體轉化或轉染的宿主細胞具有較低的L-阿拉伯糖代謝水平，所述核酸構建體被排列以敲減轉錄因子PntR的表達或功能。用于檢測L-阿拉伯糖代謝阻滯的合適的方法如本文所述。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞表現出木聚糖酶活性增加。
所謂“木聚糖酶活性增加”意指與未修飾的細胞相比，用核酸構建體轉化或轉染的宿主細胞具有較高的木聚糖酶水平，所述核酸構建體被排列以敲減轉錄因子PntR的表達或功能。用于測定所述活性的合適的方法如本文所述。
在另一個實施方案中，所述的宿主細胞包含額外的修飾，諸如，例如所述的宿主細胞可以具有蛋白酶缺陷的背景。
本發(fā)明的另一個方面提供了轉錄因子PntR調節(jié)在制備宿主細胞用于增加目標蛋白質(POI)的表達中的用途，所述的目標蛋白質(POI)的編碼序列處于由XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下。
優(yōu)選的方面附帶權利要求和下列描述和實施例部分中提供了優(yōu)選的方面。
額外的優(yōu)點本發(fā)明具有優(yōu)點，因為它提供了用于合成各種目標蛋白質，且特別是用于合成細胞外木聚糖酶的改進的微生物學方法。
構巢曲霉和塔賓曲霉菌株中PntR的破壞損害L-阿拉伯糖代謝，導致XlnR-調節(jié)的基因轉錄提高和L-阿拉伯糖-誘導型基因的下調。作為結果，木聚糖酶和β-葡聚糖酶的生產改進了若干倍，而α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性稍微降低?？梢詫⑦@類代謝受調節(jié)的菌株視為用于優(yōu)化由受XlnR控制的啟動子驅動的異源表達的有希望的宿主。
使用這種改進的微生物學方法生產的木聚糖酶在食品工業(yè)中的各種應用中是有用的，諸如焙烤和飲料產品，它們還可以用于其它應用，諸如食品生產，乃至在造紙或紡織工業(yè)中用于紙張和織物漂白。
如本文所述，PntR敲除(缺失或破壞或任何功能喪失的突變)在含有糖甜菜的工業(yè)相關復合培養(yǎng)基上或有L-阿拉伯糖或L-阿拉伯糖醇存在下，導致XlnR-控制的基因包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-木糖苷酶顯著(3-5倍)增加。
本發(fā)明的方法能夠改善木聚糖酶的生產，并且一般還可以改善異源蛋白質表達。
絲狀真菌中的高水平蛋白酶通常限制了同源和異源蛋白質的高水平表達。通過使用蛋白酶缺陷菌株，曲霉屬中的蛋白質生產明顯改善。傳統(tǒng)和基因破壞技術已經產生了蛋白酶背景降低的菌株。在阻抑幾種蛋白酶表達的條件下觀察到了產物產率的進一步改善(Van den Hombergh等，1997)。在本發(fā)明中，最佳表達條件可以為所提供的碳源有限的那些條件，其中有利的是可以將pntR敲除與蛋白酶缺陷背景組合。
分離的一方面，優(yōu)選所述序列為分離的形式。術語″分離的″意指該序列至少基本上不含至少一種其它組分，而這種組分是與該序列天然相關聯的，如天然所發(fā)現的那樣。
純化的一方面，優(yōu)選所述序列為純化的形式。術語″純化的″意指該序列處于相對純的狀態(tài)-例如至少約90％純的，或至少約95％純的，或至少約98％純的。
核苷酸序列本發(fā)明的范圍包括編碼具有如本文所定義的特定特性的轉錄因子的核苷酸序列。
如本文所用的術語″核苷酸序列″指寡核苷酸序列、核酸或多核苷酸序列，及其變體，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因組或合成或重組起源的，其可以是雙鏈或單鏈的，不管代表有義鏈還是反義鏈。
涉及本發(fā)明的術語″核苷酸序列″或″核酸分子″包括基因組DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。優(yōu)選其指DNA，更優(yōu)選指編碼本發(fā)明的cDNA序列。
在優(yōu)選的實施方案中，當涉及和當被本發(fā)明的自身范圍所包括時，核苷酸序列并不包括處于天然環(huán)境之中、并與其天然相關聯的一個或多個序列相連的根據本發(fā)明的天然核苷酸序列，而所述天然相關聯的序列也處于其天然環(huán)境之中。為了方便參考，我們將把這種優(yōu)選的實施方案稱為“非天然核苷酸序列”。在這點上，術語″天然核苷酸序列″意指處于其天然環(huán)境之中的完整核苷酸序列，以及當它與天然相關聯的完整啟動子可操作性連接之時，所述啟動子也處于天然環(huán)境之中。不過，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列可以是其天然生物中表達后分離和/或純化的核苷酸序列產物。不過，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列優(yōu)選可以在其天然生物中由核苷酸序列所表達，但是其中所述核苷酸序列并不在該生物中與所述核苷酸序列天然相關聯的啟動子的控制之下。
核苷酸序列的制備一般，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列或用于本發(fā)明的核苷酸序列是利用重組DNA技術制備的(即，重組DNA)。不過，在本發(fā)明的備選實施方案中，可以利用本領域公知的化學方法全部或部分地合成核苷酸序列(參見Caruthers MH(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
由表達所述轉錄因子的任何細胞或生物可以鑒定和/或分離和/或純化出編碼具有如本文所定義的特定特性的轉錄因子或適于修飾的轉錄因子的核苷酸序列。本領域已知多種方法來鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列。舉例來說，一旦已經鑒定和/或分離和/或純化了合適的序列，就可以使用PCR擴增技術以制備更多序列。
作為進一步的舉例，利用來自產生所述轉錄因子的生物的染色體DNA或信使RNA可以構建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果已知該轉錄因子的氨基酸序列或該轉錄因子的部分氨基酸序列，可以合成標記的寡核苷酸探針并用來由基因組文庫鑒定編碼轉錄因子的克隆，所述文庫由所述生物制備?；蛘撸梢岳冒c另一種已知轉錄因子基因同源的序列的經標記的寡核苷酸探針來鑒定編碼轉錄因子的克隆。在后一種情況中，利用低嚴謹度的雜交和洗滌條件。
在又一個備選方案中，可以通過已確立的標準方法合成性制備編碼轉錄因子的核苷酸序列或用于本發(fā)明的方法的核苷酸序列，例如由BeucageS.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869所述的氨基磷酸酯(phosphoroamidite)方法，或由Matthes等，(1984)EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在氨基磷酸酯方法中，例如在自動DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火并克隆在合適的載體中。
核苷酸序列可以是混合的基因組和合成起源的，混合的合成和cDNA起源的，或混合的基因組和cDNA起源的，通過根據標準技術連接合成的、基因組的或cDNA起源(根據需要)的片段而制備。每一個連接的片段都對應于完整核苷酸序列的各部分。還可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)利用特定引物來制備DNA序列，例如在US 4,683,202或在Saiki R K等，(Science(1988)239，pp 487-491)中所述的。
由于遺傳密碼的簡并性，可以輕易地生產核苷酸序列，其中對于一些或所有由原始核苷酸序列編碼的氨基酸改變了三聯體密碼子用法，由此產生與原始核苷酸具有低同源性的核苷酸序列，但是其編碼與原始核苷酸序列所編碼的相同、或變體氨基酸序列。例如，對于大多數氨基酸來說，遺傳密碼的簡并性是在三聯體密碼子中的第三個位置上(擺動位置)(參考文獻見Stryer，Lubert，Biochemistry，Third Edition，Freeman Press，ISBN0-7167-1920-7)，因此，所有三聯體密碼子都在第三位置上發(fā)生“擺動”的核苷酸序列與原始核苷酸序列將具有大約66％的同一性，然而，改變的核苷酸序列將與原始核苷酸序列編碼相同或變異的一級氨基酸序列。
因此，本發(fā)明進一步涉及任何核苷酸序列，所述核苷酸序列對于編碼氨基酸的至少一個三聯體密碼子改變了三聯體密碼子用法，但是其編碼與原始核苷酸序列編碼的多肽序列相同、或變體的多肽序列。
另外，具體的生物一般對于用來編碼氨基酸的三聯體密碼子有所偏好。優(yōu)選的密碼子用法表是隨處可得的，并且可以用來制備密碼子優(yōu)化基因。常規(guī)使用這些密碼子優(yōu)化技術來優(yōu)化異源宿主中的轉基因表達。
分子進化一旦分離和/或純化了編碼轉錄因子的核苷酸序列，或鑒定了編碼推定的轉錄因子的核苷酸序列，就可以修飾選擇的核苷酸序列，以便產生基因破壞或功能喪失的突變體。例如，需要對序列進行突變，以便制備顯性負性轉錄因子或可選擇的功能喪失的突變體。
可以利用合成性寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸包含位于所需突變位點側翼的核苷酸序列。
在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中描述了合適的方法。在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了將突變引入編碼轉錄因子的核苷酸序列的另一種方法。
除了諸如上面所述的定點誘變之外，還可以例如利用商業(yè)試劑盒如來自Stratagene的GeneMorph PCR誘變試劑盒，或來自Clontech的DiversifyPCR隨機誘變試劑盒隨機引入突變。
獲得新序列的第三種方法是對非同一的核苷酸序列進行片段化，通過利用任一種限制性酶，或酶如DNA酶I，并重新組配編碼功能性蛋白質的完整核苷酸序列?；蛘呖梢允褂靡环N或多種非同一核苷酸序列并在完整核苷酸序列的組配過程中引入突變。
因而，有可能在體內或體外在核苷酸序列中產生多個定點或隨機突變，隨后通過各種方法篩選所編碼的多肽的所需功能性。
氨基酸序列本發(fā)明的范圍還包括具有如本文所定義的特定性質的轉錄因子的氨基酸序列。還提供了氨基酸序列，其基于本文所鑒定的轉錄因子，但被產生或修飾以便通過諸如顯性負性手段這類方法提供所表達的PntR的敲減。
如本文所用的，術語″氨基酸序列″與術語″多肽″和/或術語″蛋白質″同義。在一些情況下，術語″氨基酸序列″與術語″肽″同義。在一些情況下，術語″氨基酸序列″與術語″酶″或“轉錄因子”同義。
氨基酸序列可以由合適的來源制備/分離，或者其可以合成制備或者可以通過利用重組DNA技術來制備。
當涉及或者當被本發(fā)明的自身范圍所包括時，氨基酸序列優(yōu)選不是天然轉錄因子。在這一點上，術語″天然轉錄因子″意指在其天然環(huán)境下的完整轉錄因子，并且當其由天然核苷酸序列表達。
變體/同源物/衍生物本發(fā)明還包括轉錄因子的任何氨基酸序列或編碼這種轉錄因子的任何核苷酸序列的變體、同源物和衍生物的用途。
在這里，術語“同源物”意指與氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的實體。在這里，術語″同源性″可以等同于“同一性”。
在本文中，同源的氨基酸序列用來包括可以與所述序列至少75，80，81，85或90％同一，優(yōu)選至少95，96，97，98或99％同一的氨基酸序列。一般而言，同源物包含相同的功能區(qū)域等，例如與本主題氨基酸序列相同的功能區(qū)域。特別地，優(yōu)選同源物包含對轉錄因子活性而言必不可少的功能結構域，包括，例如那些對DNA識別和與轉錄機制相互作用而言必不可少的結構域。盡管同源性也可以用相似性(即具有類似化學特性/功能的氨基酸殘基)來考慮，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選用序列同一性表示同源性。
“功能片段”意指保留該多肽的特征性特性的多肽片段。在本發(fā)明的上下文中，PntR轉錄因子的功能片段是保留完整蛋白質的激活子能力的片段。
在本文中，同源的核苷酸序列用來包括可以與編碼本發(fā)明的轉錄因子的核苷酸序列(目標序列)至少60，65，75，80，81，85或90％同一，優(yōu)選至少95，96，97，98或99％同一的核苷酸序列。一般，同源物將包含與目標核苷酸序列編碼功能性位點等的序列相同的序列。盡管同源性也可以用相似性(即具有類似化學特性/功能的氨基酸殘基)來考慮，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選用序列同一性表示同源性。
對于氨基酸序列和核苷酸序列來說，可以通過肉眼，或者更常借助于易于得到的序列比較程序來進行同源性比較。這些商業(yè)上現有的計算機程序可以計算兩個或多個序列之間的％同源性。
％同源性可通過毗鄰序列來計算，即，將一個序列與另一個序列進行序列對比，并且一個序列中的每個氨基酸直接與另一個序列的相應氨基酸進行每次一個殘基的比較。這被稱為“無缺口的”序列對比。通常，所述無缺口的對比只在相對少量的殘基中進行。
盡管這是非常簡單且一致的方法，但是它沒有考慮到，例如，在除此之外相同的序列配對中，一個插入或缺失將導致隨后的氨基酸殘基被逐出序列對比，因此當進行整體排列時，將很可能導致％同源性的大幅度下降。因此，多數序列比較方法被設計成考慮到可能的插入和缺失而不會對整體同源性積分不適當地罰分，從而產生最佳的序列對比。這通過在序列對比中插入“缺口”來試圖最大化局部的同源性而實現。
但是，這些更復雜的方法對序列對比中出現的每個缺口指定了“缺口罰分”，這樣，對于相同數量的相同氨基酸，帶有盡可能少的缺口的序列對比——反映兩個比較序列之間的更高相關性-將比有較多缺口的序列獲得更高的積分。一般用“遠交缺口計分(Affine gap costs)”來給缺口的存在扣(charge)較多的計分，給缺口中每個隨后的殘基扣較少罰分。這是最普遍使用的缺口積分系統(tǒng)。高缺口罰分當然將產生具有較少缺口的最優(yōu)化的序列對比。多數序列對比程序允許修改缺口罰分。但是當使用這種軟件作序列比較時，優(yōu)選使用缺省值。例如，當使用GCG Wisconsin Bestfit包時，氨基酸序列的缺省缺口罰分是缺口為-12，每個延伸為-4。
因此最大％同源性的計算首先需要產生考慮到缺口罰分的最佳序列對比。用于進行這種比對的合適的計算機程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)?？梢赃M行序列比較的其他軟件的例子包括，但不局限于BLAST軟件包(參見Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第四版，第18章)，FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比較工具系列。BLAST和FASTA都可得到，用于脫機和聯機檢索(參見Ausubel等，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，第7-58到7-60頁)。
不過，對于一些應用，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種稱作BLAST2序列的新工具也可以用于比較蛋白和核苷酸序列(見FEMS MicrobiolLett 1999 174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
盡管最終同源性百分比可以根據同一性而測量，對比過程自身一般不以全或無成對比較為基礎。相反，通常使用按比例繪制的(scaled)相似性評分矩陣將得分分配到每個以化學相似性或進化距離為基礎而進行的成對比較。這種常用矩陣的一個例子是BLOSUM62矩陣，即BLAST程序系列的缺省矩陣。GCG Wisconsin程序一般用公共默認值或如果已提供，則使用自定義符號比較表(更詳細內容見用戶手冊)。對于一些應用，優(yōu)選將公共默認值用于GCG軟件包，或在使用其它軟件的情況下，使用缺省矩陣，如BLOSUM62。
或者，可以利用DNASISTM(Hitachi軟件)中的多重比對特征，基于類似于CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法來計算百分比同源性。
一旦軟件產生最優(yōu)對比，就有可能計算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。軟件一般作為序列比較的一部分進行此計算并產生以數字表示的結果。
序列也可以有氨基酸殘基的缺失、插入或取代，其產生沉默改變并導致產生功能等同物?？梢愿鶕被崽匦?如殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或雙親性)的相似而進行有意的氨基酸取代，所以將氨基酸以官能團分類在一起是有用的。氨基酸可以僅僅基于它們的側鏈特性而分類在一起。不過，包括突變數據等更加有用。由此衍生的氨基酸組有可能由于結構的原因而是保守的。這些組能夠以Venn圖表的形式描述(Livingstone C.D.和Barton GJ.(1993)″Protein sequence alignmentsastrategy for the hierarchical analysis of residue conservation″Compiit.ApplBiosci.9745-756)(Taylor W.R.(1986)″The classification of amino acidconservation″J.Theor.Biol.119；205-218)。例如根據下表可以制備保守性取代，所述表描述了普遍接受的氨基酸分類的Venn圖表。
本發(fā)明也包含可以發(fā)生的同源取代(這里用到的取代和替代都表示現有氨基酸殘基與備選殘基的交換)，即相似物取代相似物，如堿性取代堿性，酸性取代酸性，極性取代極性等等。也可發(fā)生非-同源取代，即從一類殘基取代為另一類，或者包括引入非天然氨基酸如鳥氨酸(以下簡稱Z)，二氨基丁酸鳥氨酸(以下簡稱B)，正亮氨酸鳥氨酸(以下簡稱O)，吡啶丙氨酸，噻吩丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
也可通過非天然氨基酸進行替代。
變體氨基酸序列可以包括可以插入序列的任意兩個氨基酸殘基之間的適當間隔子基團，包括烷基，例如甲基、乙基或丙基，以及氨基酸間隔子，如甘氨酸或β丙氨酸殘基。本領域的技術人員將容易理解變異的其它形式，其包括類肽形式的一種或更多氨基酸殘基的存在。為了免除懷疑，“類肽形式”用來指變體氨基酸殘基，其中α碳取代基是在殘基的氮原子上，而不是在α碳上。制備類肽形式的肽的方法是本領域中公知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
用于本發(fā)明的核苷酸序列可以包括合成或修飾的核苷酸。寡核苷酸的許多不同類型的修飾是本領域已知的。這些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈，和/或在分子的3′和5′端添加吖啶或多聚賴氨酸鏈。為了本發(fā)明的目的，要理解在此所描述的核苷酸序列可以通過本領域已有的任何方法進行修飾?？梢赃M行這種修飾以便提高本發(fā)明的核苷酸序列的體內活性或壽命。
本發(fā)明還包括與本文給出的序列互補的核苷酸序列，或其任何衍生物、片段或其衍生物的用途。如果序列與其片段互補那么該序列可以用作探針來在其它生物等中鑒定類似的編碼序列。
可以以多種方式獲得與本發(fā)明的序列不具有100％同源性但是落在本發(fā)明范圍內的多核苷酸?？梢岳缤ㄟ^探測從許多個體，例如來自不同種群的個體制備的DNA文庫，來獲得本文所述的序列的其它變體。此外，可以獲得其它的同源物并且這樣的同源物及其片段通常能夠任選地與在本文的序列表中顯示的序列雜交。這樣的序列可以通過探測制備自其它物種的cDNA文庫或來自其它物種的基因組DNA文庫，并在中度至高嚴格條件下，用包含在后附的序列表中的任何一個序列的全部或部分的探針探測這些文庫來獲得。應用類似的考慮來獲得本發(fā)明的多肽或核苷酸序列的物種同源物和等位基因變體。
還可以使用簡并PCR來獲得變體和菌株/物種同源物，所述簡并PCR使用這樣的引物，所述引物被設計以靶向變體和同源物中的序列，所述序列編碼本發(fā)明的序列中的保守氨基酸序列。保守序列可以例如通過比對來自數種變體/同源物的氨基酸序列進行預期。序列比對可以使用本領域已知的計算機軟件來進行。例如，廣泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
在簡并PCR中使用的引物包含一個或多個簡并位點并且將在這樣的嚴格條件下使用，所述嚴格條件低于用針對已知序列的單序列引物克隆序列所使用的那些條件。
或者，這些多核苷酸可以通過被表征的序列的定點誘變來獲得。這在例如需要沉默密碼子序列變化以優(yōu)化特定宿主細胞的密碼子偏好的情況中可以是有用的，在所述特定宿主細胞中多核苷酸序列被表達?？赡苄枰渌男蛄凶兓砸胂拗菩悦缸R別位點，或改變由所述多核苷酸編碼的多肽的性質或功能。
可以使用本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)來產生引物，例如PCR引物，用于選擇性擴增反應的引物，探針例如，通過常規(guī)方式，使用放射性或非放射性標記標記以具有顯示性的標記，或者可以將所述多核苷酸克隆入載體中。這些引物、探針和其它片段的長度將至少為15，優(yōu)選至少20，例如至少25，30或40個核苷酸，并且也被本文所用的術語本發(fā)明的多核苷酸所包括。
可以重組性地，合成性地，或通過本領域技術人員已知的任何方法來生產根據本發(fā)明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探針。其還可以通過標準技術進行克隆。
通常，將通過合成方法來生產引物，包括一次一個核苷酸來逐步生產所需的核酸序列。利用自動技術實現此的技術可以輕易在現有技術中獲得。
一般將利用重組方法來生產較長的多核苷酸，例如利用PCR(聚合酶鏈式反應)克隆技術?？梢詫⒁镌O計成包含合適的限制性酶識別位點從而可以將擴增的DNA克隆入合適的克隆載體中。
生物學活性優(yōu)選所述變體序列等與本文所給出的序列至少同樣具有生物學活性。
如本文所用的“生物學活性”指一種序列，其具有與天然發(fā)生的序列相似的結構功能(但不必同等程度)，和/或相似的調控功能(但不必同等程度)，和/或相似的生化功能(但不必同等程度)。
雜交本發(fā)明還包括與本發(fā)明的序列互補的序列或可以與本發(fā)明的序列或其互補序列雜交的序列。
如本文所用的術語“雜交”應包括“使核酸鏈通過堿基配對與互補鏈結合的過程”，以及在聚合酶鏈式反應(PCR)技術中進行的擴增過程。
本發(fā)明還包含可以與這里所述序列，或其任意衍生物、片段或其衍生物互補的序列雜交的核苷酸序列的用途。
術語“變體”還包括可以與這里所述核苷酸序列雜交的序列互補的序列。
優(yōu)選，術語“變體”包括與可以在嚴謹條件下(如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})與此處呈現的核苷酸序列雜交的序列互補的序列。
更優(yōu)選，術語“變體”包括與可以在高嚴謹條件下(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})與此處呈現的核苷酸序列雜交的序列互補的序列。
本發(fā)明還涉及可以與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括本文給出序列的互補序列)。
本發(fā)明還涉及與可以與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括本文給出序列的互補序列)互補的核苷酸序列。
可以在中度到最大嚴謹度條件下與本文給出的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列也包括在本發(fā)明的范圍中。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明包含可以在嚴謹條件下(如50℃和0.2×SSC)與本發(fā)明的核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
在一個更優(yōu)選的方面，本發(fā)明包含可以在高嚴謹條件下(如65℃和0.1×SSC)與本發(fā)明的核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
調節(jié)蛋白質表達或功能的方法可以用合適的分子/試劑修飾PntR轉錄因子的功能活性，所述的分子/試劑直接或間接結合PntR蛋白質或編碼它的核酸。試劑可以為天然存在的分子，諸如肽類和蛋白質，例如特異性活化的蛋白激酶，或它們可以為代謝物，如糖類或多元醇類或其衍生物，或它們可以為合成分子。
調節(jié)PntR轉錄因子蛋白質的表達水平的方法包括例如使用反義技術。
反義構建體，即與有義核酸或mRNA互補的核酸構建體，優(yōu)選RNA，詳細描述在US 6,100,090(Monia等)和Neckers等，1992，Crit Rev Oncog3(1-2)175-231中，特別將這兩篇對比文件的教導引入作為參考。調節(jié)基因表達的其它方法為本領域技術人員所已知，并且包括顯性負性手段以及導入抑制基因表達或功能活性的肽類或小分子。
RNA干擾(RNAi)為由直接導入雙鏈RNA(dsRNA)誘導的轉錄后基因沉默(PTGS)的方法，并且已經作為在各種生物體中敲除特異性基因表達的有用工具。RNAi由Fire等在Nature 391806-811(1998)描述。其它PTGS方法是已知的并且包括例如導入轉基因或病毒。一般而言，在PTGS中，合成了沉默基因的轉錄物，但其未蓄積，因為它被快速降解。例如，在Ambion.com互聯網網站中，在目錄“/hottopics/”下、在文件“rnai”中描述了用于PTGS的方法，包括RNAi。
用于體外RNAi的合適的方法為本領域技術人員所公知。一種這類方法包括導入siRNA(小干擾RNA)。目前的模型表明這些21-23個核苷酸的dsRNAs可以誘導PTGS。例如，在上述Ambion網站中描述了用于設計有效siRNAs的方法。
定點誘變一旦分離和/或純化出編碼PntR轉錄因子的核苷酸序列，或鑒定出編碼推定的轉錄因子的核苷酸序列，可以預期使序列突變。例如，可以將遭破壞的PntR序列導入細胞以便通過同源重組破壞內源性PntR基因。本文描述了合適的構建體?；蛘?，可以使PntR序列突變，以便制備中斷天然表達的PntR的功能或表達的顯性負性蛋白質。
可以用合成寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有所需突變位點的側翼核苷酸序列。
適合的方法公開于Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中。另一種將突變引入編碼轉錄因子的核苷酸序列中的方法描述于Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。另一種方法描述于Sarkar和Sommer(Biotechniques(1990)，8，p404-407-“The megaprimermethod of site directed mutagenesis”)中。
重組的在一方面，用于本發(fā)明的序列是重組序列-即已經利用重組DNA技術制備的序列。
這些重組DNA技術是本領域普通技術人員能力范圍內的技術。這些技術在文獻，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring HarborLaboratory Press中進行了解釋。
合成的在一方面，用于本發(fā)明的序列是合成的序列-即已經通過體外化學或酶學合成制備的序列。其包括但不限于，用宿主生物偏好的密碼子用法制備的序列。
蛋白質的表達用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被并入重組可復制載體。該載體可以用于復制、和在相容性宿主中和/或由相容性宿主以酶的形式表達該核苷酸序列。
可以用控制序列例如調控序列控制表達。
表達載體術語“質?！薄ⅰ拜d體系統(tǒng)”或“表達載體”意指能夠體內或體外表達的構建體。在本發(fā)明的上下文中，這些構建體可以用來將編碼所述轉錄因子的基因導入宿主細胞中。適當地，其表達可被導入的基因可以稱作“可表達的轉基因”。
在另一個實施方案中，這些構建體可以用于將基因導入宿主細胞，所述基因在XlnR啟動子序列的控制下編碼目標蛋白質。
優(yōu)選，將表達載體摻入合適的宿主生物體的基因組。術語“摻入”優(yōu)選包括穩(wěn)定摻入基因組。
本文所述的核苷酸序列，包括本發(fā)明的核苷酸序列，可以存在于載體中，其中核苷酸序列被可操作性連接到調控序列上，所述調控序列能夠通過適當宿主生物體提供核苷酸序列的表達。
用于本發(fā)明的載體可以被轉化到下面所述的適當宿主細胞中，從而提供本發(fā)明多肽的表達。
載體例如質粒、粘?；蚴删w載體的選擇通常將取決于其將要導入的宿主細胞。
用于本發(fā)明的載體可以包含一種或多個可選擇的標記基因-如賦予抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。或者，可以通過共轉化來實現選擇(如WO91/17243中所述)。
可以體外使用載體，例如來生產RNA，或用來轉染、轉化、轉導或感染宿主細胞。
因而，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的核苷酸序列的方法，該方法是通過將本發(fā)明的核苷酸序列導入可復制的載體，將該載體導入相容的宿主細胞中，和在能夠帶來載體復制的條件下生長所述宿主細胞而進行的。
所述載體可以進一步包含能夠使載體在所研究的宿主細胞中復制的核苷酸序列。這些序列的實例為質粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMBl和pIJ702的復制起點。
調控序列在一些應用中，用于本發(fā)明的核苷酸序列可操作性地連接到調控序列上，所述調控序列能夠提供核苷酸序列的表達，如通過選定的宿主細胞的表達。例如，本發(fā)明包括這樣一種載體，其包含可操作性地連接到這種調控序列上的本發(fā)明的核苷酸序列，即所述載體是表達載體。
合適的是，就POI的表達而言，編碼POI的基因可操作地與啟動子序列連接，這能夠使該序列處于由XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下。合適的所述啟動子序列可以為xlnA或eglA啟動子序列。
術語“可操作性地連接”指一種毗連，其中所述組分的關系使得其以其所希望的方式發(fā)揮作用。以特定的方式連接“可操作性地連接”到編碼序列上的調控序列，從而在與控制序列相容的條件下實現編碼序列的表達。
術語“調控序列”包括啟動子和增強子和其它表達調控信號。
以本領域正常意義使用術語“啟動子”，例如RNA聚合酶結合位點。
還可以通過選擇異源調控區(qū)例如啟動子、分泌前導區(qū)和終止子區(qū)域來增加編碼本發(fā)明的POI的核苷酸序列的表達。
優(yōu)選，根據本發(fā)明的核苷酸序列可操縱地與至少一個啟動子連接。
指導核苷酸序列在細菌、真菌或酵母宿主中轉錄的合適的啟動子的實例是本領域眾所周知的。
構建體術語“構建體”-其與術語如“綴合物”、“彈夾”和“雜交體”同義-包括按照本發(fā)明使用的核苷酸序列。這樣的構建體可以直接或間接與啟動子連接。
間接連接的實例是在啟動子和本發(fā)明的核苷酸序列之間提供適合的間隔子基團，如內含子序列，如Sh1-內含子或ADH內含子。涉及本發(fā)明的術語“融合的”也是如此，其包括直接或間接連接。在一些情況中，該術語不包括核苷酸序列的天然組合，所述核苷酸序列編碼與野生型基因啟動子相關聯的蛋白質，并且當它們均處在天然環(huán)境中時。
所述構建體可以甚至包含或表達容許選擇遺傳構建體的標記。
對于一些應用而言，優(yōu)選地，本發(fā)明的構建體至少包含與啟動子可操縱連接的本發(fā)明的核苷酸序列。
宿主細胞涉及本發(fā)明的術語″宿主細胞″包括任何細胞，所述細胞包含如上所述的核苷酸序列或表達載體，并且用于重組生產具有如本文定義的特定性質的轉錄因子，或用于本發(fā)明的方法。
因此，本發(fā)明的另一個實施方案提供用表達本發(fā)明所述的轉錄因子的核苷酸序列轉化或轉染的宿主細胞。選擇細胞來與所述載體相容并且所述細胞可以例如是原核生物(例如細菌)、真菌、酵母或植物細胞。優(yōu)選地，所述宿主細胞不是人細胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了宿主細胞，所述宿主細胞由本發(fā)明方法產生，即包含編碼POI的基因，所述基因在由XlnR調節(jié)的啟動子轉錄控制下可操作地連接，其中所述的宿主細胞進一步包含PntR表達或活性的敲減。
合適的宿主生物體的實例為真菌細胞，包括絲狀真菌。
宿主細胞可以為蛋白酶缺乏或蛋白酶負型菌株，諸如曲霉屬的pep-或prt蛋白酶缺乏菌株(van den Hombergh，1997，Curr Genet Jul；32(1)73-81)。
可以修飾宿主細胞的基因型以便改善表達。
宿主細胞修飾的實例包括蛋白酶缺陷、碳分解代謝物脫阻抑、稀有tRNA′的補充和細胞質中還原電勢的改變以便促進二硫鍵形成。
生物體涉及本發(fā)明的術語″生物體″包括這樣的任何生物，所述生物可以包括編碼如在本發(fā)明中所述的轉錄因子的核苷酸序列和/或獲自其中產物，和/或其中當本發(fā)明的核苷酸序列存在于所述生物中時，啟動子可以容許根據本發(fā)明的核苷酸序列的表達。此外，術語“生物體”擴展至按照本發(fā)明方法產生的生物體，即被修飾以增高的水平表達POI。
合適的生物體可以包括真菌。其它合適的生物體可以包括酵母或植物細胞。
涉及本發(fā)明的術語″轉基因生物″可以包括這樣的任何生物，所述生物包括編碼如在本發(fā)明中所述的轉錄因子的核苷酸序列和/或獲自其中的產物，和/或其中啟動子可以容許根據本發(fā)明的核苷酸序列在所述生物中的表達。優(yōu)選地，將所述核苷酸序列摻入所述生物的基因組中。
術語″轉基因生物″不包括當它們在其天然啟動子控制下時，在它們天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列，所述天然啟動子也在其天然環(huán)境中。
因此，本發(fā)明的轉基因生物包括這樣的生物，所述生物包含編碼如本發(fā)明所述的轉錄因子的核苷酸序列，根據本發(fā)明的構建體，根據本發(fā)明的載體，根據本發(fā)明的質粒，根據本發(fā)明的細胞，根據本發(fā)明的組織，或其產物中的任何一種，或其組合。
例如，所述轉基因生物還可以包括在異源啟動子控制下編碼本發(fā)明的轉錄因子的核苷酸序列。
宿主細胞/生物體的轉化如上所述，宿主生物體可以為真核生物體，并且特別是真菌。特別優(yōu)選絲狀真菌。合適的這類宿主的實例包括屬于Thermomyces、支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、鏈孢霉屬、木霉屬等屬的任何成員可以使用本領域中公知的各種方法轉化絲狀真菌細胞-諸如包括原生質體形成和轉化原生質體，隨后按照公知的方式使細胞壁再生的方法。曲霉屬作為宿主微生物的應用描述在EP 0 238 023中。有關轉化絲狀真菌的技術還綜述在US-A-5741665中，該文獻中描述了用于轉化絲狀真菌的標準技術，并且培養(yǎng)真菌為本領域眾所周知的。例如，Davis和de Serres，MethodsEnzymol(1971)17A79-143中發(fā)現了作為應用于粗糙鏈孢霉(N.crassa)的技術的廣泛綜述。有關轉化絲狀真菌的額外教導綜述在US-A-5674707中。
在一個方面中，所述的宿主生物體屬于曲霉屬，諸如黑曲霉。
用于真菌中轉化的合適的標記包括，但不限于編碼鳥氨酸氨甲酰轉移酶、argB和乳清酸核苷-5′-一磷酸脫羧酶、pyrG的抗性基因。
還可以通過下列教導制備本發(fā)明的轉基因曲霉屬，例如Turner G.1994(用于遺傳操作的載體Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam1994.pp.641-666)。還可以使用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的轉化轉化絲狀真菌(Gouka等，1999，Nat.Biotech)。絲狀真菌中的基因表達綜述在Punt等(2002)Trends Biotechnol 2002 May；20(5)200-6，Archer &Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)273-306中。
培養(yǎng)和生產用本發(fā)明的核苷酸序列轉化的宿主細胞可以在有益于POI的產生并有利于POI從所述細胞和/或培養(yǎng)基中回收的條件下培養(yǎng)。
因此，本發(fā)明提供了表達POI的方法，它可以是生產所述POI的方法的一部分，并且進一步包含分離和/或純化所述的POI。
用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以為適合于使所述宿主細胞生長并且獲得酶的表達的任何常規(guī)培養(yǎng)基。
可以在細胞表面上展示用重組細胞生產的蛋白質。
POI可以從宿主細胞中分泌并且可以便利地使用眾所周知的操作步驟從培養(yǎng)基中回收。
分泌可以希望使POI從表達宿主中分泌到其中POI可能更易于回收的培養(yǎng)基中。根據本發(fā)明，分泌前導序列可以基于期望的表達宿主進行選擇。雜交體信號序列也可以用于本發(fā)明的背景中。
異源分泌前導序列的典型實例是從真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-例如來自曲霉菌的18和24個氨基酸的形式)，α-因子基因(酵母，例如，酵母屬(Saccharomyces)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)和漢森氏酵母屬(Hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)起源的那些。
作為實例，在大腸桿菌中的異源蛋白質的分泌在Methods Enzymol(1990)182132-43中進行綜述。
檢測用于檢測和測量氨基酸序列的表達的各種方法是本領域眾所周知的。實例包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，放射免疫測定法(RIA)和熒光激活的細胞分選術(FACS)。
廣泛種類的標記和綴合技術是本領域那些技術人員已知的并且可以用在多種核酸和氨基酸測試中。
許多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)，和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供用于這些步驟的商業(yè)試劑盒和方法。
適合的報告分子或標記包括那些放射性核素，酶，熒光，化學發(fā)光，或顯色劑以及底物，輔因子，抑制劑，磁性顆粒等。教導這些標記的應用的專利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如在US-A-4,816,567中所顯示產生重組免疫球蛋白。
融合蛋白可以將根據本發(fā)明使用的氨基酸序列和根據本發(fā)明產生的POI作為融合蛋白進行制備，從而例如有助于提取和純化。融合蛋白配偶體的實例包括谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA結合和/或轉錄激活結構域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶體和目標蛋白序列之間可以方便地包括蛋白水解剪切位點，從而容許去除融合蛋白序列。
優(yōu)選地，融合蛋白不會干擾蛋白質序列的活性，雖然在一個實施方案中顯性負性轉錄因子手段是優(yōu)選的。
已經在Curr Opin Biotechnol(1995)6(5)501-6中綜述了在大腸桿菌中的基因融合表達系統(tǒng)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，氨基酸序列可以連接于異源序列以編碼融合蛋白。例如，為了篩選能夠影響物質活性的試劑的肽庫，編碼表達由商購抗體識別的異源表位的嵌合物質可以是有用的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，例如，為改善異源蛋白質生產產率，使POI的C-末端與充分分泌的真菌蛋白質，諸如葡糖淀粉酶、木聚糖酶或內切葡聚糖酶或其部分融合。
例如，還可以使用肽文庫以顯性負性手段中修飾PntR。
其它序列還可以結合一個或多個另外的目標蛋白質(POI)或目標核苷酸序列(NOI)來使用根據本發(fā)明應用的序列。
POIs的非限制性實例包括木聚糖或纖維素代謝中涉及的蛋白質或酶或其組合。其它合適的POIs包括，但不限于肌醇六磷酸酶、脂酶、淀粉酶或哺乳動物目標蛋白質，諸如人抗體、組織纖溶酶原激活物和白細胞介素。NOI甚至可以為那些序列中任一的反義序列。
其它序列也可以有利于分泌或增加分泌的POI的產率。這類序列可以編碼伴侶蛋白，例如作為UK專利申請9821198.0中所述的黑曲霉cypB基因的產物。
可以改造編碼POI的NOI，以便因許多原因而改變其活性，包括，但不限于改變其表達產物的加工和/或表達的改變。作為另一個實例，還可以修飾NOI以便優(yōu)化特定宿主細胞中的表達。需要其它序列改變以便引入限制酶識別位點。
編碼POI的NOI可以在其中包括合成或修飾的核苷酸-諸如甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈。
可以修飾編碼POI的NOI以便增加胞內穩(wěn)定性和半衰期。可能的修飾包括，但不限于在分子的5′和/或3′末端添加側翼序列或使用分子主鏈內硫代磷酸酯或2′O-甲基，而不是磷酸二酯酶鍵。
抗體本發(fā)明的一個方面涉及與SEQ ID No.2、4或6中任一的氨基酸具有免疫反應性的氨基酸。
可以通過標準技術，諸如用本發(fā)明的物質進行免疫或通過使用噬菌體展示文庫產生抗體。
出于本發(fā)明的目的，除非相反地指出，術語“抗體”包括，但不限于，多克隆，單克隆，嵌合的，單鏈，Fab片段，通過Fab表達文庫產生的片段及其模擬物。這些片段包括完整抗體的片段，其保留它們對于目標物質，Fv，F(ab′)和F(ab′)2片段，以及單鏈抗體(scFv)，融合蛋白和包括抗體的抗原結合位點的其它合成蛋白質的結合活性。此外，抗體及其片段可以是人源化抗體。中和抗體，即，抑制物質多肽的生物活性的那些，對于診斷和治療是尤其優(yōu)選的。
如果需要多克隆抗體，用本發(fā)明的序列(或包含其免疫表位的序列)免疫選定的哺乳動物(例如，小鼠，兔，山羊，馬等)。根據宿主的物種，可以使用各種佐劑來增加免疫應答。
收集來自被免疫的動物的血清，并根據已知的方法對其進行處理。如果包含針對本發(fā)明的序列(或包含其免疫表位的序列)的多克隆抗體的血清包含針對其它抗原的抗體，可以通過免疫親和層析來純化多克隆抗體。用于產生和加工多克隆抗血清的技術是本領域已知的。為了可以制備這些抗體，本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽或其片段，其半抗原化(haptenise)成另一種多肽來在動物或人中用作免疫原。
針對本發(fā)明的序列(或包含其免疫表位的序列)的單克隆抗體還可以由本領域技術人員容易地制備，并且包括，但不限于，雜交瘤技術Koehler和Milstein(1975Nature 256495-497)，人B-細胞雜交瘤技術(Kosbor等，(1983)Inmunol Today 472；Cote等，(1983)Proc Natl Acad Sci802026-2030)和EBV-雜交瘤技術(Cole等，(1985)Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan Rickman Liss Inc，pp 77-96)。
此外，可以使用為產生“嵌合抗體”所開發(fā)的技術，剪接小鼠抗體基因與人抗體基因從而獲得具有適合的抗原特異性和生物活性的分子(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 816851-6855；Neuberger等，(1984)Nature312604-608；Takeda等，(1985)Nature 314452-454)。
或者，可以將對于生產單鏈抗體所述的技術(美國專利號4，946，779)進行改進以產生物質特異性單鏈抗體。
還可以產生包含對于所述物質的特異性結合位點的抗體片段。例如，這樣的片段包括，但不限于，可以通過用胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab′)2片段和可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵產生的Fab片段?；蛘撸梢詷嫿‵ab表達文庫以容許快速和容易地鑒定具有需要的特異性的單克隆Fab片段。(Huse WD等，(1989)Science 2561275-1281)。
通過將PntR-特異性抗體導入真菌以便掩蔽其功能，抗體可以用于改變PntR的功能。
大規(guī)模應用在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法用于大規(guī)模應用。特別地，本發(fā)明的方法可以用于大規(guī)模生產酶，諸如用于工業(yè)化應用的木聚糖酶。目標POI可以為人抗體(Ward等2004 Appl Envirom Microbiol v 702567-2576)、乳鐵蛋白(Ward等，1991基因，v 122219-223)、生長激素、白細胞介素6、超氧化物岐化酶(Davies R.W.″Molecular industrial Mycologysystems and applications for filamentous fungi″(S.A.Leong和R.M.Berka，eds.)，pp.45-58.Morris-Bekker，New York-Basel-Hong Kong，1991)。
PntR序列的應用如上所述，在不同物種中鑒定轉錄阻抑物PntR能夠產生修飾的細胞，在所述細胞中敲減了PntR表達，使得處于XlnR啟動子控制下的基因表達增加。因此，PntR序列可以用于鑒定敲減表達的合適方式。
因此，本發(fā)明進一步涉及編碼PntR的核苷酸序列在生產載體或系統(tǒng)以敲減或敲除PntR表達中的應用。例如，在本文實施例部分中描述了合適的載體，，并且包括用于基因破壞的同源重組的系統(tǒng)。優(yōu)選這類構建體導入了缺乏Zn2Cys6雙核簇的PntR變體。
此外，本發(fā)明涉及這類表達載體或系統(tǒng)在生產宿主細胞中的應用，所述的宿主細胞具有與天然水平相比較低水平的PntR表達，并且進一步包含在XlnR啟動子控制下編碼POI的基因。這類宿主細胞用于蛋白質生產。
因此，本發(fā)明進一步提供了在XlnR調節(jié)下表達POI的宿主細胞以便產生用于制造食品的POI。
食品可以將所述化合物用作食品，或用在食品的制備中。在此處，術語“食品”以廣泛意義使用，并且包括用于人的食品和食物以及用于動物的食物(即飼料)。在優(yōu)選的方面，所述食品用于人類食用。
根據使用和/或應用的模式和/或施用的模式，食品可以以溶液的形式或作為固體形式存在。
食品組分和添加劑POI可以用作食品組分。
本文所用的術語“食品組分”包括制品，其為或可以加入到功能性食品或膳食中，并且包括制品，所述制品可以以低水平在廣泛種類的產品中使用，所述產品需要例如酸化或乳化。
食品組分可以為溶液或固體形式-取決于使用和/或應用方式和/或施用方式。
化合物可以為食品添加劑，或可以加入到食品添加劑中。
功能食品和營養(yǎng)藥POI可以為功能性食品，或可以加入到功能性食品中。
本文所用的術語“功能性食品”意指食品，所述食品不僅能夠提供營養(yǎng)作用和/或味道上的滿足，而且能夠將額外的有益作用遞送給消費者。
盡管對功能性食品尚無法律意義上的定義，但是關注該領域的大部分社會團體均認為它們?yōu)樽鳛榫哂刑囟ū＝∽饔枚N售的食品。
食物產品通過本發(fā)明改進的方法生產的酶或POI可以用于制備食物產品，諸如下列中的一種或多種糖果產品；乳制品；肉類產品；禽類產品；魚制品；和焙烤產品。
在某些方面中，優(yōu)選膳食為焙烤產品-諸如面包、丹麥酥皮餅(Danishpastry)、餅干(biscuit)或小甜餅(cookies)。
本發(fā)明還提供了制備食品或食品組分的方法，該方法包含將通過本發(fā)明方法生產的POI與另一種食品組分混合。該制備方法或食品組分也為本發(fā)明的另一個方面。
造紙工業(yè)木聚糖酶，包括在XlnR控制下的那些木聚糖酶，可以用于紙張漂白。此外，其它POI，諸如內切葡聚糖酶，可以用于紡織品應用。
藥物例如，POI，諸如抗體，可以用于藥物。例如，參見Ward等，2004。
一般重組DNA方法技術除非另作陳述，否則，本發(fā)明使用常規(guī)的化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學技術，它們屬于本領域技術人員的能力范圍。這類技術在文獻中解釋。例如，參見J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，ColdSpring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；CurrentProtocols in Molecular Biology，ch.9，13，和16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation and SequencingEssential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach，Irl Press；and，D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of EnzymologyDNA Structure Part ASynthesis和Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，AcademicPress。將這些常用教科書各自引入作為參考。
實施例現在在下列非限制性實施例中進一步例示本發(fā)明。
1.真菌菌株和生長條件。構巢曲霉菌株pyrG89 argB2獲自Prof.C.Scazzocchio(Institut de Genetique et Microbiologie，Orsay，France)。黑曲霉N402菌株(cspAl)獲自TNO Nutrition and Food Research Institute(Netherlands).塔賓曲霉1M-7、4M-147和10M-61菌株來自Danisco collection of cultures。將菌株維持在基本培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基上。
基本培養(yǎng)基(MM)含有(每1l)1g NaNO3，1.5g of KH2PO4，0.5g of KCl，0.5g MgSO4和50ml按照Vishniac和Santer，1957的微量元素(10g EDTA，4.4g ZnSO4x7H2O，1g MnCl2x4H2O，0.32g CoCl2x5H2O，0.22g(NH4)6Mo7O24x4H2O，1.47g CaCl2x2H2O，1g FeSO4x7H2O)。除非另作陳述，否則1％果糖用作碳源。就營養(yǎng)缺陷型菌株而言，根據需要添加必要的補充劑10mM尿苷和2.5mM精氨酸。就完全培養(yǎng)基(CM)而言，給完全培養(yǎng)基補充10g果糖、2g胨、1.5g酪蛋白氨基酸、1g酵母提取物和無菌過濾的10ml 100x維生素溶液(50mg硫胺素HCl，10mg生物素，100mg煙酸，200mg泛酸Ca，50mg吡哆醇HCl，100mg核黃素，500mg對氨基苯甲酸(Cove，1966)。在高壓滅菌前，調整培養(yǎng)基的pH，對塔賓曲霉而言，調整至5.5；對黑曲霉而言，調整至6；對構巢曲霉而言，調整至6.5。就固體培養(yǎng)基而言，將瓊脂加入至3％。給液體培養(yǎng)物接種106個孢子/ml并且以180-220rpm在旋轉搖動器上孵育。在37℃培養(yǎng)構巢曲霉，而在32℃培養(yǎng)塔賓曲霉和黑曲霉菌株。所有發(fā)酵均在燒瓶中進行。
就DNA制備而言，使真菌菌株在CM上生長過夜，并且將菌絲體樣品收集在漏斗上并且冷凍在液氮中。
2.構巢曲霉pntR基因的克隆和缺失載體pPntRΔ-pyrG的構建。通過PCR從構巢曲霉基因組DNA擴增含有來自構巢曲霉毗連群1.7(http//www.broad.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus/index.html毗連群位置23984-26497bp)的推定的XlnR同源物的區(qū)域。為了從菌絲體樣品中提取DNA，將冷凍在液氮中的0.2g生物量研磨成粉末并且重新懸浮于0，8ml提取緩沖液中0.2M Tris-HCl，pH 8.0，1％SDS，1mM EDTA。在冰上孵育10-20分鐘后，通過標準酚-氯仿提取方法分離DNA，并且在使用乙醇沉淀后，將其重新懸浮于100-200μl H2O，隨后在37℃用50μgRNAse A(Qiagen)處理15分鐘。將約50-100ng基因組DNA進一步用于PCR擴增。所有PCR反應均使用Expand High Fidelity PCR Amplification System(Roche)在50μl總體積中進行。該反應體系含有5μl 10x延伸緩沖液、3.5個單位的Taq和Pfu DNA聚合酶混合物、200μM dNTP混合物、50ng DNA模板和40pmol下列序列的每種引物R1.7T40 5′GCGGGGAGCATAATATATACAGGTCCAGTT 3′和R1.7B3795 5′TGAATCTCGTCTTGGGAAGGATTCAAGATG 3′。
使用下列程序進行擴增94℃3分鐘；94°45秒、56℃1分鐘和72℃3分鐘，30個循環(huán)。使用在72℃10分鐘的額外的延伸循環(huán)。在凝膠上純化3.75kb PCR產物并且克隆入pCR-Blunt II載體(Invitrogen)，產生質粒pSFH1(圖1)。該片段包括分別具有0.75和0.5kb的5′和3′側翼區(qū)的推定的ORF(參見SEQ ID NO1)?？梢詫⒕幋a區(qū)翻譯成單一ORF而不含任何終止密碼子。然而，在構巢曲霉數據庫中，注釋該序列含有一個內含子，該內含子不會打斷ORF?？梢酝ㄟ^計算機分析預測該推定的內含子，因為此前沒有有關pntRcDNA的實驗數據。
圖1.質粒pSFH1的圖譜M13正向(5′GTAAAACGGCCAG 3′)和反向(5′CAGGAAACAGCTATGAC 3′)引物用于檢查序列的可靠性和克隆的插入片段的取向。在ABI 3100序列分析儀(Applied Biosystems)上，使用BigDyeTerminator V3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和500ng模板與3.2pmol引物進行DNA測序。
在第二步驟時，在相似條件下，使用下列提供的引物組合，通過PCR擴增部分重疊pntR序列的3.4kb上游基因組片段R1.7T Spe 603 5′GGACTAGTGCAGGATGATCGCATCGACAATTATATAAG3′R1.7B Nde 40085′AAAGTCTGGAAGGAATCAGGGAAAAGCAAG 3′。
用限制酶SpeI和NdeI切割純化的PCR產物。注意在擴增過程中引入SpeI位點。用相同的酶消化2-3μg上述pSFH1質粒，使用Gel ExtractionKit(Qiagen)從瓊脂糖凝膠上洗脫載體，并且使用Rapid Ligation Kit(Roche)與PCR產物連接。將連接混合物用于轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞(Invitrogen)。在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上選擇轉化體。用限制酶NdeI和BstZ171切割2μg所得載體，并且用DNA聚合酶I的Klenow片段填入(fill-in)以產生平端。然后將其用于插入包含煙曲霉pyrG基因的1.9kb片段，所述片段通過EcoRV切割分離自pCDA21質粒(Chaveroche等，2000)。通過EcoRI和KpnI消化檢查插入片段的取向。用于缺失構巢曲霉基因組中的pntR基因的內源性拷貝的pPntRΔ-pyrG質粒的圖示在圖2中提供。在缺失構建體中，pyrG基因替代了ATG密碼子上游5′側翼序列的214bp和編碼部分的301bp，包括Zn2Cys6雙核簇，由此使序列的剩余部分失活(如果被表達的話)。
圖2表示質粒pPntRΔ-pyrG的圖譜。
3.構巢曲霉中pntR的敲除。為了缺失內源性pntR基因，用7.7kb長的線性片段將構巢曲霉受體菌株pyrG89argB2轉化成尿苷原養(yǎng)型，所述片段是通過用限制酶EcoRV消化10μgpPntRΔ-pyrG質粒后分離的。用GelExtraction Kit(Qiagen)從瓊脂糖凝膠純化的約1-3μg片段被用于轉化。使用真菌轉化的標準方法(Tilburn等，1983)。簡言之，在25℃下使受體菌株生長在含有1％葡萄糖和補充劑的400ml MM中過夜。收集菌絲體，用水洗滌并且將1g重新懸浮于用10mM磷酸鈉，pH 5.8緩沖的10ml 1.2M MgSO4溶液中。在30℃和緩慢攪拌下用40-50mg/ml非純化的Glucanex(Laffort，France)處理菌絲體。2-3小時孵育后，在顯微鏡檢查后監(jiān)測到足夠數量的原生質體時，用相同的緩沖液稀釋消化菌絲體，并且通過在其上覆蓋用100mM Tris，pH 7.5緩沖的0.6M D-山梨糖醇并離心而分離原生質體。用含有10mM Tris，pH 7.5和10mM CaCl2(STC)的1.2M山梨糖醇溶液將從界面上采集的原生質體洗滌2次，并且在107-108/ml濃度下重新懸浮于STC中。將200μg原生質體溶液與1-3μgDNA片段和含有10mM Tris，pH 7.5和10mM CaCl2的50μl 60％PEG 6000溶液一起冰上孵育20分鐘。在添加額外0.5ml相同PEG溶液后，將該混合物在室溫下放置5分鐘，并且在含有1M蔗糖和精氨酸作為補充劑的MM上鋪板。針對尿苷原養(yǎng)型選擇轉化體。在37℃下孵育3天后，獲得約100-150個轉化體并且分析。如所示的(圖3)，在含有1％的各碳源的MM測試平板上進行對pntR缺失體的最初步篩選。在62個測試的候選物中，有10個在L-阿拉伯糖上的生長嚴重受損，并且在D-半乳糖上的生長輕度延緩(圖3)。在含有0.1％果糖與10mM L-阿拉伯糖和10μg/ml 4-甲基-傘形酮酰(umbelliferyl)-β-D-木糖苷作為底物的MM上進一步測試它們β-木糖苷酶活性的改善。在254nm下所有均表現出強的熒光，而受體菌株則不顯現。
圖3表示在如所示的1％的各碳源的MM上，與受體pyrG89 argB2菌株(R)相比，典型構巢曲霉ΔpntR缺失體之一(ΔpntR1)的生長試驗結果。
為了檢查天然pntR基因座是否得到破壞，通過Southern印跡分析分析幾種轉化體(Sambrook等，1989)。用50U限制酶 ClaI(Biolabs)將如上所述從不同轉化體中分離的5-10μg基因組DNA切割3小時，并且在TBE緩沖液中在0.7％瓊脂糖凝膠上分離。將消化的樣品轉至尼龍膜(Amersham)上并且與P32-放射性標記的pntR基因的DNA片段雜交。通過用EcoRI切割pSFH1質粒并且洗脫0.94kb長的片段分離該片段。使用Random PrimingKit(Stratagen)，用50μCi P32-dCTP標記50ng片段。正如圖4中觀察到的，轉化體ΔpntR1、ΔpntR2、ΔpntR3、ΔpntR4僅含有pntR基因的不同大小的一條帶，而pntR11則除此之外還含有野生型拷貝。上部的帶的大小相當于插入pyrG基因后預計的大小。選擇敲除菌株pntR1用于進一步研究。
圖4顯示來自用ClaI限制酶消化的構巢曲霉ΔpntR轉化體的基因組DNA的Southern印跡分析。用pntR的5′片段探測印跡，并且在60℃下用1xSSC，0.1％SDS洗滌。
4.pntR缺失對構巢曲霉產生的細胞外糖酶(carbohydrolases)表達水平的作用。為了測試推定的XlnR同源物PntR是否影響構巢曲霉中木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的表達，在用D-木糖或L-阿拉伯糖醇誘導時檢查ΔpntR1缺失體的相應活性。由于這一目的，所以首先使構巢曲霉培養(yǎng)物預先在CM上生長16小時，用H2O洗滌并且將1g濕菌絲體轉入含有如所示的0.1％果糖與10mM終濃度的誘導糖(D-木糖或L-阿拉伯糖)或多元醇(L-阿拉伯糖醇)的100ml MM中。將不含誘導物的培養(yǎng)物用于監(jiān)測表達的基礎水平。在轉移后9和24小時測定細胞外活性。在40℃下測定木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性，而在30℃下測定β-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性。在所有試驗中，將培養(yǎng)物樣品的等分試樣(20-200μl)加入到pH 5.0的30mM乙酸鈉緩沖液中，再加上底物，得到終體積1ml。將一片XylazymeT-XYZ1000(Megazyme)、一片β-Glucazyme(Megazyme)、0.2mg對-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷和1mg鄰-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(Sigma)分別用作木聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶的底物。將酶促反應孵育不同時間，并且通過添加9ml 0.2M Tris-堿(就木聚糖酶和β-葡聚糖酶而言)或0.5ml 1M Na2CO3(就α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶而言)終止反應。分別在590、405或420nm處測定反應混合物的光密度。除非另作陳述，否則以相對O.D.單位表示活性。
正如圖5中所觀察到的，在用L-阿拉伯糖醇誘導時ΔpntR1缺失體對D-木糖的絕對木聚糖酶活性高于受體菌株20倍。在受體菌株中，對L-阿拉伯糖醇的木聚糖酶水平可以忽略不計。在L-阿拉伯糖上觀察到類似的，但較低的作用(未顯示，但進行了實驗)。與此相似的是，在木聚糖酶過量表達后，α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性稍微降低?？梢酝贫梢杂肔-阿拉伯糖代謝的改變解釋觀察到的現象(推定導致中間代謝物、L-阿拉伯糖醇或其的細胞內濃度升高)。這導致XlnR的活化能力較高，且結果是在其控制下的基因，諸如木聚糖酶的更有效轉錄活化，正如通過RNA印跡分析所評價的。PntR顯然正面影響α-阿拉伯呋喃糖苷酶以及負責L-阿拉伯糖代謝的酶。
圖5表示在用10mM D-木糖或L-阿拉伯糖醇誘導后，受體(R)和ΔpntR1缺失體(D1)菌株的酶測定(上)和轉錄分析(下)。在轉移后9小時取用于木聚糖酶測定和RNA分離的樣品，而在轉移后24小時進行α-阿拉伯呋喃糖苷酶測定。為了進行木聚糖酶測定，在反應中使用100μl培養(yǎng)液，將其孵育10分鐘。就α-阿拉伯呋喃糖苷酶而言，加入200μl至得到1ml終體積并且將反應體系孵育60分鐘。在RNA印跡中每個泳道上加載約10μg總RNA并且與三種木聚糖酶來源的探針雜交。將acnA(γ-肌動蛋白)探針用作內部對照以便校準加載的RNA的量。使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)，按照供應商的推薦從菌絲體樣品中分離總RNAs，用乙二醛使其變性并且如Sambrook等(1989)所述在1％瓊脂糖凝膠上分離。如上所述，使用下列基因特異性引物通過PCR從基因組DNA擴增木聚糖酶探針XlnA T675 5′AATCTCTCCTAGTTCTCTGTTGCGCTGC 3′和XlnA B1380 5′TACTCTGGTACCCCTCCGTTGCAACAAT 3′；XlnB T651 5′ATGGTCTCCTTCTCATCCCTTCTCCT 3′和XlnB B1354 5′CGGTAATAGAAGCAGATCCACTGCTC 3′；XlnC T1053 5′TGATCTTTTTGTCGCGGCCGGCAAAT 3′和XlnC B1876 5′TGGCGTAGCTCGCAGAGTCCAGGCTAAT 3′.
由pSF5質粒的2.5kb BamHI-KpnI片段制備acnA探針(Fidel等，1988)。在55℃下用1xSSC，0.1％SDS洗滌印跡。
此外，我們測定了細胞內L-阿拉伯糖和D-木糖還原酶以及L-阿拉伯糖醇和D-木糖醇脫氫酶的活性并且監(jiān)測其轉錄。
5.從黑曲霉克隆pntR同源物。來自構巢曲霉的pntR基因的結構部分和來自煙曲霉數據庫的等同序列進行序列對比后設計引物，使用引物對黑曲霉402基因組DNA進行PCR擴增來克隆pntR同源序列。使用下列引物PntR1.7 T104 5′GTGACTCTTGTCATGCTCGCCGCGTTCGATGCGAC3′和PntR1.7B65935′AGAGCCAACCCGGTTCCCTTCCTTGTCCAC 3′。
PCR條件與如上所述的相同，但退火溫度為54℃，且擴增時間為2分鐘。按照供應商(Invitrogen)的說明將獲得的PCR產物克隆入pCR 4 TOPO載體。將用于轉化的感受態(tài)大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen)在含有100mg/ml氨芐西林的LB平板上鋪板以便選擇合適的構建體。將最終的質粒pPntR-AN14用作模板以便對基因組插入片段進行測序。從反向和正向引物以及基因特異性引物PntR 1201 5′TGGAGTCGAGCTTGCCTCGAAAGC 3′；和PntR B1500 5′CAGGAAGAAGCCGAAGATAGAG 3′建立2.3kb的推定的黑曲霉pntR基因的部分序列。
SEQ ID NO3顯示了序列。注意缺乏編碼N-末端DNA結合結構域和COOH-末端的部分。與構巢曲霉相反，位置1063-1115bp的一個推定內含子打斷來自黑曲霉的pntR同源物的ORF，內含子的位置根據在其5′和3′邊界上發(fā)現的保守序列的性質預測。盡管序列對比顯示在兩種基因之間69％的同一性，但是在交叉雜交時它們在DNA印跡上未得到明顯的信號(圖6)。然而，塔賓曲霉基因組含有與黑曲霉極為相似的pntR相關序列。
圖6顯示來自構巢曲霉(N)、黑曲霉(402)和塔賓曲霉(1和10)菌株的基因組DNAs的Southern印跡。如所示的用不同的限制酶將5-10μg DNAs消化至完全，在0.7％瓊脂糖凝膠上分離，轉至尼龍膜(Amersham)并且與構巢曲霉或黑曲霉pntR探針雜交。將來自質粒pSFH1的3kb長Spel-PstI片段用作構巢曲霉探針，而將來自質粒pPntR-AN14的2.3kb EcoRI片段用作黑曲霉探針。兩種探針均主要覆蓋相應pntR基因的結構部分。在55℃下用2xSSC和0.1％SDS洗滌印跡。
6.從塔賓曲霉克隆pntR基因。從相應的基因組文庫克隆來自塔賓曲霉4M-147菌株的pntR同源序列。為了形成這類文庫，如上所述分離黑曲霉4M-147基因組DNA，并且用Tsp509I(New England BioLabs)部分消化10μgDNA。使用Gel Extraction Kit(Qiagen)從0.7％瓊脂糖凝膠純化約5-10kb大小的片段。使用2個Weiss單位的T4DNA連接酶(Roche)以5μl總體積將100ng片段連入1μg EcoRI消化的和脫磷酸化的ZAP II載體(Stratagene)中。按照供應商的推薦將2μl連接混合物包裝入Gigapack II包裝提取物(Stratagene)。使用大腸桿菌XL1-Blue菌株作為宿主在一級文庫(primary libray)中獲得總計約6.5×105獨立個的空斑形成單位。如手冊(Stratagene)中所示擴增2.5×105pfu而得到3×108pfu/ml的滴度，其中約6％不含插入片段。
在初級篩選中測試的3-5×104pfu中，有20-25個在與含有黑曲霉pntR基因的pPntR-AN14質粒的P32-標記的2.3kb EcoRI片段進行濾膜雜交時產生陽性信號。將其中的5個純化成單個噬斑，并且使用Rapid Excision Kit(Stratagene)分離相應的噬菌粒DNA。使用正向和反向引物以及pntR基因特異性引物PntR1.7B1785′AGAGCCATTTGGAACTGGGCCAGACCCTGC 3′建立插入片段的序列。
最終，使用下列寡核苷酸對攜帶具有最長的5′和3′側翼區(qū)的完整塔賓曲霉pntR基因的克隆之一，pPntR-AT12，進行部分測序PntR At T15′GGCTAAGGACCGGTTCTTTCGC 3′；PntR At B15′GCCGATGGCCTGCGGATGCG 3′；寡核苷酸PntR 1201和PntR B1500的序列如前述部分中所示。
總之，測定了3914bp的序列，其包括以上游485bp和下游878bp為側翼的pntR基因的完整結構部分(參見SEQ ID NO5)。與黑曲霉相似，塔賓曲霉pntR基因的編碼區(qū)被一個內含子打斷，啟動子的相對位置在基因內是保守的。為了檢查塔賓曲霉中的pntR缺失是否對木聚糖酶生產具有與在構巢曲霉中相似的有益作用，破化相應的基因。
7.塔賓曲霉1M-7菌株中pntR基因的破壞。與pntR部分缺失的構巢曲霉相反，通過插入大腸桿菌的hph基因從而賦予真菌細胞潮霉素B抗性打斷塔賓曲霉中pntR基因的內源性拷貝。通過將缺乏N-和C-末端的塔賓曲霉pntR編碼區(qū)的部分克隆入質粒pAN7-1制備破壞構建體。該載體中攜帶在gpdA啟動子控制下的潮霉素B抗性基因(Punt和van den Hondel，1992)。在這種情況中，pntR片段內的同源重組將導致pntR的兩個破壞的拷貝。一個在3′末端截短，另一個在5′末端截短。
由于這一目的，借助于下列引物通過PCR擴增631bp-2803bp的pntR片段PntR T631 5′ATCGAGCCTTTCCCAGATCTCGCTGCCTTCGCAG 3′和PntR BSal 5′CGCTTGTCGACGCAGCCGCTCTACAATCAGCAAGAGAAG3′。
在退火溫度56℃、延伸時間2分鐘下，使用20ng質粒pPntR-AT12作為模板進行PCR反應。用限制酶SalI和BglII(各10個單位)消化純化的PCR產物(0.5μg)，限制酶SalI和BglII的限制位點在擴增過程中被引入兩個末端。然后將所述的PCR產物克隆入用XhoI和BglII切割的pAN7-1載體。這些消化消除了部分gpdA啟動子，然而該啟動子仍然保持了功能。將0.2μg洗脫的載體和0.3μg的插入片段在含有10μl 2x連接緩沖液(Roche)的20μl總體積中與3個Weiss單位的T4 DNA連接酶連接。將連接反應轉化入在含有100μg/ml氨芐西林的LB平板上鋪板的大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞(Invitrogen)。破壞構建體pAN7-ΔPntR的圖示在下文中提供(圖7)。
圖7顯示質粒pAN7-ΔPntR的圖譜。
該質粒用于轉化塔賓曲霉1M-7菌株。轉化條件如下所示與用于構巢曲霉的那些條件相似，只是稍有改變。使1M-7菌株在CM上生長過夜，并且在用50mg/ml Glucanex(Laffort)處理菌絲體后，用5-10μg質粒pAN7-ΔPntR轉化收集的原生質體。在含有1M蔗糖和100μg/ml潮霉素B的MM上選擇轉化體?？傆嫬@得了300-400個抗性菌落。并且如通過在1％L-阿拉伯糖的平板生長試驗所判定的，在分析的70個轉化體中，有25個呈陽性(圖8)。未生長的轉化體(測試15個)在含有0.1％果糖與10mM L-阿拉伯糖和10μg/ml 4-甲基-傘形酮酰-β-D-木糖苷的MM平板上表現出強熒光，表明β-木糖苷酶的上調。通過Southern印跡分析幾個轉化體的塔賓曲霉1M-7基因組中天然pntR基因座的破壞。雜交的典型模式如圖8中所示。使用50單位的NcoI將來自受體和轉化體Δ2和Δ20的5μg DNAs切割完全，并且用pntR基因的631bp-2803bp的P32-標記的PCR片段探測，正如預計的，與來自受體樣品的單一條帶相反，在Southern印跡上觀察到因塔賓曲霉pntR基因座上pAN7-ΔPntR質粒整合產生的兩個條帶。
圖8表示用質粒pAN7-ΔPntR轉化的塔賓曲霉1M-7在含有1％L-阿拉伯糖的CM和MM上的生長試驗結果(左側)，和缺失體Δ20和1M-7菌株的Southern印跡(右側)。用NcoI消化DNA，并且如所示的用pntR片段探測。顯示了破壞質粒pAN7-ΔPntR的同源整合方案。
8.塔賓曲霉ΔpntR缺失體菌株中木聚糖酶和β-葡聚糖酶生產的改善。為了檢查pntR破壞對蛋白質生產的作用，在不同生長條件下培養(yǎng)塔賓曲霉，并且測定培養(yǎng)液中許多細胞外蛋白質的酶促活性。在第一組實驗中，將塔賓曲霉菌株在含有1％果糖和0.1％酵母提取物的含有或不含有10mML-阿拉伯糖的MM上培養(yǎng)40小時。相似地，使它們在1％木糖和0.1％酵母提取物上生長。將純粹含有果糖的培養(yǎng)基視為中性的未誘導的條件，而L-阿拉伯糖或D-木糖誘導細胞外活性。在生長過程中蓄積的生物量對所有菌株而言近似相等。如對構巢曲霉那樣測定活性，不同之處在于在0.2M磷酸Na-0.1M檸檬酸緩沖液，pH 3.5中檢測木聚糖酶。
正如圖9中所示，木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性在含有L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基上增加。實際上，木聚糖酶活性的絕對值高于木糖誘導條件5倍。同時，α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性下降了將近3倍?？傊@些結果表明塔賓曲霉和構巢曲霉中敲除pntR基因在L-阿拉伯糖誘導條件下產生了完全相同的表型和木聚糖酶和其它XlnR調節(jié)的基因，如β-木糖苷酶和β-葡聚糖酶表達水平的改善。此外，L-阿拉伯聚糖降解復合物的活性不明顯，這有益于工業(yè)化應用中使用的木聚糖酶制品。
圖9表示塔賓曲霉1M-7受體和pntR缺失體D5和D20菌株在1％果糖+0.1％YE、1％果糖+0.1％YE+10mM L-阿拉伯糖和1％木糖+0.1％YE上生長后，木聚糖酶(Xln)、β-葡聚糖酶(Egl)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Abf)的活性。將20μl培養(yǎng)物樣品用于木聚糖酶和β-葡聚糖酶測定，而100μl用于α-阿拉伯呋喃糖苷酶測定。對木聚糖酶和β-葡聚糖酶而言，使反應進行10分鐘，并且對α-阿拉伯呋喃糖苷酶而言，使反應進行60分鐘。以O.D.表示活性。
在另一實驗中，在含有3％甜菜漿、3％麩皮和0.17％(NH4)2SO4，pH 3.5的工業(yè)化使用的復合培養(yǎng)基上將塔賓曲霉菌株發(fā)酵4-6天。在發(fā)酵后，測定培養(yǎng)液樣品中的活性(圖10)。木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性再次增加了2-3倍，而α-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶稍微下降。這些條件與在低廉培養(yǎng)基上從木聚糖酶或任何其它強XlnR-調節(jié)的啟動子工業(yè)化生產木聚糖酶或異源蛋白質相關。
圖10顯示塔賓曲霉1M-7受體和pntR缺失體菌株D2、D3、D5、D10、D12、D20、D22在含有甜菜漿的復合培養(yǎng)基上生長后，木聚糖酶(Xln)、β-葡聚糖酶(Egl)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Abf)和β-半乳糖苷酶(Bgal)的活性。將0.5μl培養(yǎng)物樣品用于木聚糖酶和β-葡聚糖酶測定，而將25μl用于α-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶。對所有酶促測定而言，使反應進行10分鐘。以O.D.表示活性。
9.編碼PntR轉錄因子的基因缺失對代謝和XlnR調節(jié)的基因表達的作用圖11顯示絲狀真菌中阿拉伯木聚糖的途徑示意圖，和編碼PntR轉錄因子的基因缺失對代謝和XlnR調節(jié)的基因表達的作用。
AcE表示水解阿拉伯木聚糖上的各種側鏈基團所必需的所有輔助酶。XDC和ADC表示由絲狀真菌產生的細胞外酶的木聚糖和L-阿拉伯聚糖降解復合物。其中特別指定木聚糖酶(xlnA、xlnB和xlnC)和L-阿拉伯呋喃糖苷酶(abfA和abfB)。XlnD編碼β-D-木糖苷酶且Mst表示單糖轉運蛋白。木糖還原步驟可能由一種已知的還原酶XyrA以外的其它酶施加?？赡馨ǖ诙N推定的木糖誘導的還原酶XyrB，或尚未知的阿拉伯糖還原酶(ArrA)。至少在瑞氏木霉(T.reesei)中，可以用木糖醇脫氫酶(XdhA)和L-阿拉伯糖醇脫氫酶(LadA)轉化木糖醇。然而，L-阿拉伯糖醇僅由LadA氧化。
PntR的破壞(用交叉十字表示)導致包括ladA在內的其靶基因基礎水平的轉錄，導致LadA酶促活性下降(用向下的箭頭表示)，由此停止下游代謝流程。這導致細胞內L-阿拉伯糖醇庫增加，細胞內L-阿拉伯糖醇直接或間接活化XlnR，而XlnR介導xlnA和其它基因的轉錄。
10.pntR基因的一級結構的分析及其來自不同曲霉屬的推定的氨基酸序列對迄今為止可得到的真菌數據庫的分析顯示，發(fā)現pntR主要存在于曲霉屬物種中。對4種曲霉屬物種的pntR編碼區(qū)的核苷酸比較顯示58％的同一性。除構巢曲霉外，來自其它物種的pntR含有一個內含子。在蛋白質水平上，同源性甚至更高(70％)(參見圖12)。序列對比顯示來自構巢曲霉和煙曲霉的蛋白質比黑曲霉和塔賓曲霉彼此在進化上更接近。DNA結合結構域且尤其是在C-末端部分內的同源性接近100％。DNA結合結構域決定了這種轉錄因子的特異性?；谂cXlnR的DNA結合基序的比較，可以預計PntR識別其它DNA靶標。保守C-末端區(qū)的功能是未知的，但該部分與XlnR最為相似?？梢酝茰y它涉及類似的功能，例如，與誘導物的相互作用或響應誘導物存在的分子內相互作用，因為證實這兩種因子都被L-阿拉伯糖醇活化。對Zn2Cys6蛋白質家族真菌調節(jié)子而言典型的另一保守區(qū)域定位(map)至492-503位氨基酸，該區(qū)域包括一段序列EEHREERRRTWW。使用VectorNTI 9程序包進行所有DNA和蛋白質分析和比較。
11.分泌的b-半乳糖苷酶LacA在塔賓曲霉xlnA啟動子下控制下在構巢曲霉中的異源表達。
為了測定pntR缺失是否異源蛋白質的提高表達提供適當的背景，我們使用編碼分泌的b-半乳糖苷酶的黑曲霉lacA基因作為報道標記。由于這一目的，構建表達載體，其中l(wèi)acA表達受塔賓曲霉1M-7xlnA啟動子和終止子區(qū)域控制。為了有效分泌，使xlnA信號序列與lacA編碼區(qū)進行框內融合。即使用相應引物LacA T1315′CTAGTCTAGAGCCCTGTTGCAGAAATACGTCACTTGGGATG3′；LacA B3031 5′TCCGCTCGAGCTAGTATGCACCCTTCCGCTTCTTGTACTT3′，通過PCR從黑曲霉402基因組DNA擴增3kb lacA基因。
PCR擴增程序與實施例2中所述相同。純化的PCR產物在擴增過程中在兩個末端上引入的XbaI和XhoI限制位點上切割，這兩個位點是在擴增過程中在兩個末端上引入的，并且使用標準操作步驟克隆入pExpressS1表達載體的相應位點。該載體含有1.1kb啟動子區(qū)域、編碼信號肽的序列、和由多接頭分隔的塔賓曲霉1M-7xlnA基因的0.78kb終止子區(qū)域。最終表達質粒pExSlac2的示意圖如圖13中所示。
將10-15mkg pExSlac2與0.5-2mkg攜帶構巢曲霉argB基因的pILJ16(Johnstone等，1985)共轉染入對照構巢曲霉菌株pyrG89 argB2 pPyrG)和缺失體ΔpntR1菌株(pyrG89 argB2pntRΔ::pyrG)。如實施例3中所述進行轉化，但針對精氨酸原養(yǎng)型在MM平板上選擇轉化體。在含有20mM D-木糖和0.005％Xgal的MM平板上篩選隨機挑取的轉化體的b-半乳糖苷酶活性。形成強烈顏色的那些轉化體在液體培養(yǎng)物中進一步測試。整合了pExSlac2彈夾的構巢曲霉轉化體生長在含有1％果糖與10mM L-阿拉伯糖和0.2％酵母提取物或1％木糖和0.2％酵母提取物的MM上72小時。在生長過程中蓄積的生物量對所有菌株而言近似相等。使用鄰-硝基苯基-β-D-半乳糖苷作為底物，如實施例4中所述測定培養(yǎng)基中b-半乳糖苷酶活性。
正如圖14中所觀察到的，在兩種生長條件下，b-半乳糖苷酶的內源性水平在對照構巢曲霉菌株中保持忽略不計。正如預計的，在對照菌株中，lacA僅由D-木糖誘導，而pntR缺失則除此之外還產生由L-阿拉伯糖引起的顯著誘導。不同表達載體拷貝數或其整合位點可以解釋轉化體之間活性水平的變異。本實施例表明pntR敲除顯著(3-5倍)改善了異源宿主構巢曲霉中由異源塔賓曲霉1M-7xlnA啟動子驅動的黑曲霉b-半乳糖苷酶的L-阿拉伯糖特異性表達。
圖14描繪了構巢曲霉對照(CLac1、CLac2)和攜帶pExSlac2表達質粒的pntRΔ1缺失體(DpntRLac1、DpntRLac2、DpntRLac3)菌株在培養(yǎng)基中測定的細胞外b-半乳糖苷酶活性。將非轉化的菌株(C)用作內源性活性的對照。使所有菌株在1％果糖+0.2％YE+10mM L-阿拉伯糖和1％木糖+0.2％YE上生長3天。將50ul培養(yǎng)物樣品用于酶促測定。在30℃下使反應進行10分鐘。以O.D.表示活性。
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將上述說明書中提及的所有公開文獻和所述公開文獻中引述的參考文獻引入本文作為參考。本領域技術人員顯然可以在不脫離本發(fā)明范圍和實質的情況下對本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)進行各種修改和變型。盡管結合具體的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但是應理解所請求保護的本發(fā)明不應過度限于這類具體的實施方案。實際上，分子生物學或相關領域技術人員顯然可以對用于實施本發(fā)明的所述方式進行各種變型，指定它們屬于下列權利要求的范圍。
權利要求
1.編碼PntR轉錄因子的分離的核酸序列，所述核酸序列包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO1、3或5中的任一序列相同、互補、或包含取代SEQ ID NO1，3或5中的任何密碼子的任何合適的密碼子取代，或包含與SEQ ID NO1、3或5中的任一序列具有至少60％序列同源性的序列。
2.權利要求1的分離的核酸序列，其編碼PntR轉錄因子多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO2，4或6中的任一序列所示的氨基酸序列，或與其具有至少75％同一性的序列，或其有效片段。
3.權利要求2的分離的核酸序列，所述序列獲自曲霉屬、木霉屬或青霉屬細胞。
4.權利要求3的分離的核酸序列，所述序列獲自曲霉屬細胞。
5.包含權利要求1-4中任一項的核酸序列的質粒或表達載體系統(tǒng)。
6.用權利要求5的質?；虮磉_載體系統(tǒng)轉化或轉染的宿主細胞。
7.一種多肽，其包含對應于曲霉屬PntR的氨基酸序列或其功能等效物。
8.權利要求7的多肽，其具有與曲霉屬PntR的序列相同的氨基酸序列或與曲霉屬PntR的序列至少75％相同的序列。
9.權利要求7或8的多肽，包含如SEQ ID NO2、4或6中任一序列所示的氨基酸序列或與其具有至少75％同一性的序列或其有效片段。
10.被排列來敲減轉錄因子PntR的表達或功能的核酸構建體。
11.權利要求10的核酸構建體，其包含編碼功能上受到破壞的PntR的核酸序列。
12.權利要求11的核酸構建體，其包含編碼PntR并且缺乏編碼Zn2Cy6區(qū)域的核酸序列。
13.權利要求10的核酸構建體，其包含權利要求1-4中任一項的核酸序列的全部或片段。
14.包含權利要求10-13中任一項的核酸構建體的質?；蜉d體系統(tǒng)。
15.破壞細胞中PntR表達的方法，包含將權利要求10-13中任一項所述的核酸構建體或權利要求14中所述的質?；蜉d體系統(tǒng)導入所述細胞。
16.用核酸構建體轉化或轉染的宿主細胞，所述核酸構建體被排列來敲減權利要求10-13中任一項所述的轉錄因子PntR、或權利要求14所述的質粒或載體系統(tǒng)的表達或功能。
17.權利要求16的宿主細胞，其進一步包含核酸構建體，所述核酸構建體包含目標蛋白質(POI)的編碼序列，所述編碼序列在由XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下。
18.權利要求16或權利要求17的宿主細胞，其中該宿主細胞選自曲霉屬、木霉屬和青霉屬組成的組。
19.能夠產生細胞外木聚糖酶的權利要求16-18中任一項的宿主細胞。
20.權利要求16-19中任一項的宿主細胞，其中所述細胞為蛋白酶缺陷的。
21.權利要求16-20中任一項的宿主細胞，其中所述細胞具有L-阿拉伯糖代謝阻滯。
22.權利要求16-21中任一項的宿主細胞，其中所述細胞表現出木聚糖酶活性增加。
23.權利要求16-22中任一項的宿主細胞，其中所述細胞對于POI的生產是有用的。
24.在宿主細胞中表達POI的方法，所述POI的編碼序列處于由XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下，所述方法包含調控所述宿主細胞中的轉錄因子PntR。
25.權利要求24的方法，包含下列步驟提供PntR缺陷的宿主細胞，所述宿主細胞包含在XlnR轉錄控制下的編碼POI的基因，并且在合適的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
26.權利要求24-25中任一項的方法，其中PntR具有如SEQ ID NO1、3或5中任一所給出的核酸序列或與之具有大于60％同一性的序列。
27.權利要求24和26中任一項的方法，包含使用權利要求16-23中任一項的宿主細胞。
28.權利要求24-27中任一項的方法，其中POI為同源蛋白質。
29.權利要求24-27中任一項的方法，其中POI為異源蛋白質。
30.權利要求24-29中任一項的方法，其中宿主細胞為絲狀真菌細胞，并且優(yōu)選曲霉屬、木霉屬或青霉屬的菌種。
31.權利要求24-30中任一項的方法，其中所述表達POI的方法為生產所述POI的方法的組成部分，并且進一步包含分離/純化所述的POI。
32.生產POI的方法，包含在宿主細胞中表達POI，所述POI的編碼序列處于由XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下，所述方法包含在所述宿主細胞中調控轉錄因子PntR。
33.轉錄因子PntR的調控在制備宿主細胞以增加目標蛋白質(POI)的表達中的用途，所述POI的編碼序列處于由XlnR調節(jié)的啟動子的轉錄控制下。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼PntR轉錄因子的分離的核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO1、3或5相同、互補、或包含對SEQ ID NO1，3或5的任何密碼子的任何合適密碼子取代的核苷酸序列，或包含與SEQ ID NO1，3或5中的任何一個具有至少60％序列同源性的序列，以及相應的多肽、載體系統(tǒng)和包含它們的宿主細胞。特別地，本發(fā)明涉及獲自曲霉屬、木霉屬或青霉屬細胞的序列。本發(fā)明進一步涉及破壞細胞中PntR表達的方法和在宿主細胞中表達或生產POI的方法，在所述宿主細胞中PntR表達已經受到破壞。
文檔編號C12N15/63GK101056889SQ200580038425
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月10日 優(yōu)先權日2004年11月11日
發(fā)明者艾戈·尼古萊夫, 蘇珊·M·馬德里德 申請人:丹尼斯科公司