專(zhuān)利名稱(chēng):淀粉加工的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明尤其涉及源自踝節(jié)菌屬的菌種(Talaromyces sp.)的葡糖淀粉酶和包含糖結(jié)合模塊(CBM)的酸性α-淀粉酶在包括將淀粉降解為葡萄糖的淀粉糖化方法中的用途。
背景技術(shù):
WO9928448A1中公開(kāi)了來(lái)自Talaromyces emersonii的熱穩(wěn)定的葡糖淀粉酶。與黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶相比,純化的酶顯示顯著增強(qiáng)的穩(wěn)定性和高3-4倍的比活性(specific activity)并且在pH 4.5和在70℃具有最適活性并因而看起來(lái)適用于葡萄糖生產(chǎn)的工業(yè)糖化。然而,在用Talaromycesemersonii葡糖淀粉酶工業(yè)糖化過(guò)程中葡萄糖的產(chǎn)量比黑曲霉葡糖淀粉酶的情況低1-2%,由此降低了用于產(chǎn)生高DX葡萄糖漿(high DX glucose syrup)和/或高果糖漿(high fructose syrup)的方法中的酶有用性(enzyme profitability)。
發(fā)明概要現(xiàn)在本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)令人吃驚的發(fā)現(xiàn),在使用踝節(jié)菌屬葡糖淀粉酶的糖化方法中,可通過(guò)添加包含糖結(jié)合域(CBM)的酸性α-淀粉酶達(dá)到高DX。
因此,本發(fā)明在第一個(gè)方面提供了用于糖化淀粉的方法,其包括將液化的淀粉底物與源自踝節(jié)菌屬的菌種的葡糖淀粉酶以及包含糖結(jié)合模塊(CBM)的酸性α-淀粉酶接觸。
在第二個(gè)方面,本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)淀粉水解物的方法,其包括(a)例如,通過(guò)噴射蒸煮(jet cooking),添加熱穩(wěn)定的α-淀粉酶來(lái)液化以及(b)隨后將液化的淀粉與包含CBM的酸性α-淀粉酶和源自踝節(jié)菌屬的菌種的葡糖淀粉酶接觸。
本發(fā)明提供所述兩個(gè)方面的其它實(shí)施方案,包括(a)方法,其中糖化后水解物的DX(游離葡萄糖%)達(dá)到的值為至少94.00%、至少94.50%、至少94.75%、至少95%、至少95.25%、至少95.5%、至少95.75%或甚至至少96%,(b)方法,其中將至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或優(yōu)選地至少99%的干固體淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性水解物,例如葡萄糖,(c)方法,其中葡糖淀粉酶是與SEQ ID NO1中所示氨基酸序列具有至少50%同源性的多肽,(d)方法,其中葡糖淀粉酶源自Talaromyces emersonii,(e)方法,其中包含CBM的酸性α-淀粉酶是野生型、變體和/或雜合體,(f)方法,其中包含CBM的酸性α-淀粉酶是有與選自下組的任何氨基酸序列具有至少50%同源性的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4,方法,其中包含CBM的酸性α-淀粉酶以0.05至1.0mg EP/g DS,更優(yōu)選0.1至0.5mgEP/g DS,甚至更優(yōu)選0.2至0.5mg EP/g淀粉的DS的量存在,(g)方法,其中包含CBM的酸性α-淀粉酶以10-10000 AFAU/kg的DS(kg of DS)的量,以500-2500 AFAU/kg的DS的量,或優(yōu)選以100-1000 AFAU/kg的DS,例如大約500 AFAU/kg DS的量存在,(h)方法,其中葡糖淀粉酶以0.001至2.0 AGU/gDS,優(yōu)選0.01至1.5 AGU/g DS,更優(yōu)選0.05至1.0 AGU/g DS,和最優(yōu)選0.01至0.5 AGU/g淀粉的DS的量存在,(i)方法,其中酸性α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的活性以至少0.1、至少0.2、至少0.25、至少0.3、至少0.35、至少0.40、至少0.50、至少0.60、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.85或甚至至少1.9 AFAU/AGU的比率存在,(j)方法,其中熱穩(wěn)定的α-淀粉酶是細(xì)菌α-淀粉酶,優(yōu)選源自芽孢桿菌屬的菌種(Bacillus sp.)中的種類(lèi),優(yōu)選源自地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenformis)的菌株,(k)方法,其還包括添加脫支酶(debranching enzyme),例如支鏈淀粉酶(pullulanase)或異淀粉酶(isoamylase),(1)方法,其還包括在60℃至75℃,優(yōu)選62℃至68℃,更優(yōu)選64℃至66℃,并且最優(yōu)選65℃的溫度糖化到至少95的DX,(m)方法,其還包括在64℃-72℃,優(yōu)選66℃-74℃,更優(yōu)選68℃-72℃,并且最優(yōu)選70℃的溫度糖化到至少95的DX。在具體實(shí)施方案中,所述方法進(jìn)一步包括將水解物和發(fā)酵生物接觸,所述發(fā)酵生物優(yōu)選產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的酵母,所述發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)選乙醇,其中將所述乙醇任選地回收。糖化和發(fā)酵可以作為同時(shí)糖化和發(fā)酵方法(SSF方法)進(jìn)行。
發(fā)明詳述在實(shí)施方案中,將本發(fā)明的方法應(yīng)用于從淀粉生產(chǎn)含有葡萄糖和/或含有果糖的糖漿。所述淀粉可以源自谷物(grain)或其它淀粉豐富的(starch rich)植物部分,優(yōu)選玉米(corn),小麥,大麥,稻,馬鈴薯。所述方法可以括連續(xù)的酶促步驟;(a)液化步驟然后是(b)糖化步驟以及任選地(c)(用于產(chǎn)生含有果糖的糖漿的)異構(gòu)(isomerization)步驟。在液化方法的過(guò)程中,優(yōu)選通過(guò)熱穩(wěn)定的α-淀粉酶(EC3.2.1.1),例如細(xì)菌熱穩(wěn)定的α-淀粉酶,例如地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(可由丹麥,Novozymes得到的TermamylTM或Liquozyme XTM),通常在5.5-6.2之間的pH值并且在95-160℃的溫度,在大約2小時(shí)的時(shí)間將淀粉(起初為含水介質(zhì)中的淀粉懸浮液的形式)降解成糊精(淀粉的寡糖和多糖片段)。在液化步驟之后和糖化步驟之前,可將介質(zhì)的pH降到4.5以下的值(例如大約pH 4.3),維持高溫(95℃以上),由此將液化α-淀粉酶的活性變性。
糖化過(guò)程中,將溫度通常降低到65℃以下,例如到60℃,并且在下列物質(zhì)存在下將糊精轉(zhuǎn)化成葡萄糖(D-葡萄糖)(a)依據(jù)本發(fā)明源自踝節(jié)菌屬(Talaromyces)的葡糖淀粉酶以及(b)包含CBM的酸性α-淀粉酶。在實(shí)施方案中可存在附加的酶,優(yōu)選脫支酶,例如異淀粉酶(EC3.2.1.68)和/或支鏈淀粉酶(EC3.2.1.41)。優(yōu)選糖化方法允許進(jìn)行24-72小時(shí)直到水解物的DX達(dá)到的值為至少94.00%、至少94.50%、至少94.75%、至少95%、至少95.25%、至少95.5%、至少95.75%或甚至至少96%。任選地,使用例如固定的“葡萄糖異構(gòu)酶”(木糖異構(gòu)酶,EC 5.3.1.5),將所得高DX葡萄糖漿轉(zhuǎn)化成高果糖漿。
比對(duì)和同一性出于本發(fā)明的目的,使用可用于蛋白質(zhì)和DNA比對(duì)的軟件Align,Needleman-Wunsch比對(duì)(即總體比對(duì)),進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和同一性分?jǐn)?shù)計(jì)算。缺省得分矩陣BLOSUM50和同一性矩陣分別用于蛋白質(zhì)和DNA比對(duì)。缺口中第一個(gè)殘基的罰分對(duì)蛋白質(zhì)為-12以及對(duì)DNA為-16,而缺口中另外的殘基的罰分對(duì)蛋白質(zhì)為-2以及對(duì)DNA為-4。Align來(lái)自FASTA程序包v20u6版本(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988),″Improved Tools for BiologicalSequence Analysis″,PNAS 852444-2448,以及W.R.Pearson(1990)″Rapidand Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA″,Methods inEnzymology,18363-98)。用于同一性測(cè)定的氨基酸序列相關(guān)部分是成熟多肽,即沒(méi)有信號(hào)肽。
酶葡糖淀粉酶本發(fā)明優(yōu)選的是源自踝節(jié)菌屬菌種的菌株的任何葡糖淀粉酶,并且具體是源自Talaromyces leycettanus如美國(guó)專(zhuān)利no.Re.32,153中公開(kāi)的葡糖淀粉酶,Talaromyces duponti和/或Talaromyces thermopile如美國(guó)專(zhuān)利no.4,587,215中公開(kāi)的葡糖淀粉酶,以及更優(yōu)選源自Talaromyces emersonii,以及最優(yōu)選源自菌株CBS 793.97和/或WO 99/28448中公開(kāi)為SEQ ID NO7以及本文公開(kāi)為SEQ ID NO1的葡糖淀粉酶。進(jìn)一步優(yōu)選的是葡糖淀粉酶,其具有與前述氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或甚至至少95%同一性的氨基酸序列。同Spirizyme Fuel一樣,商品化的踝節(jié)菌屬葡糖淀粉酶制劑由Novozymes A/S提供。
具有酸性α-淀粉酶活性并且包含CBM的酶優(yōu)選地CBM是淀粉結(jié)合域(SBD),并且優(yōu)選地酸性α-淀粉酶活性源自EC 3.2.1.1中的酸性α-淀粉酶。具有酸性α-淀粉酶活性并且包含本發(fā)明中使用的CBM的酶可以是雜合體酶或多肽可以是野生型酶,其已經(jīng)包含具有α-淀粉酶活性的催化模塊和糖結(jié)合模塊。本發(fā)明的方法中使用的多肽也可以是這種野生型酶的變體??梢酝ㄟ^(guò)編碼第一氨基酸序列的第一DNA序列和編碼第二氨基酸序列的第二DNA序列的融合產(chǎn)生雜合體,或可基于適合的CBM、接頭以及催化域的氨基酸序列的知識(shí)將雜合體作為完全合成的基因產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“雜合體酶(hybrid enzyme)”在本文用于表征多肽,即具有酸性α-淀粉酶活性并且包含CBM的酶,其包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列,所述第一氨基酸序列包含具有α-淀粉酶活性的催化模塊,所述第二氨基酸序列包含至少一種糖結(jié)合模塊,其中第一和第二源自不同的來(lái)源。將術(shù)語(yǔ)“來(lái)源”理解為,例如,但不限于親本多肽,例如酶,例如淀粉酶或葡糖淀粉酶,或包含適合的催化模塊和/或適合的CBM和/或適合的接頭的其它催化活性。CBM的親本多肽和酸性α-淀粉酶活性可以源自相同菌株,和/或相同菌種或它可以源自相同菌種的不同菌株或源自不同種的菌株。含有CBM的雜合體酶,以及其制備和純化的詳細(xì)描述,是本技術(shù)領(lǐng)域公知的[參見(jiàn),例如WO90/00609、WO 94/24158和WO 95/16782,以及Greenwood等Biotechnologyand Bioengineering 44(1994)pp.1295-1305]。
本發(fā)明優(yōu)選的是具有酸性α-淀粉酶活性和包含CBM的任何酶,其包括但不限于雜合體酶和野生型變體,其公開(kāi)在PCT/US2004/020499(NZ10490)中,以及在來(lái)自Novozymes A/S內(nèi)部號(hào)NZ10729與本申請(qǐng)同一天提交的丹麥專(zhuān)利申請(qǐng)中。更優(yōu)選的是具有酸性α-淀粉酶活性和包含CBM的酶,該酶具有如SEQ ID NO2(黑曲霉+CBM)、SEQ ID NO3(JA126)或SEQ ID NO4(JA129)公開(kāi)的氨基酸序列或具有酸性α-淀粉酶活性和包含CBM的任何酶,該酶具有的氨基酸序列與任何上述的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%或甚至至少95%同一性。
優(yōu)選地,酸性α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性以0.3-5.0 AFAU/AGU之間的比率存在。更優(yōu)選地,酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之間的比率為至少0.35、至少0.40、至少0.50、至少0.60、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.85或甚至至少1.9 AFAU/AGU。但是,酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之間比率應(yīng)該優(yōu)選地小于4.5、小于4.0、小于3.5、小于3.0、小于2.5或甚至小于2.25 AFAU/AGU。
方法材料與方法酸性α-淀粉酶活性測(cè)定當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時(shí),可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶單位)測(cè)量任何酸性α-淀粉酶的活性,其相對(duì)于酶標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。將1 AFAU定義為在如下提到的標(biāo)準(zhǔn)條件下,每小時(shí)降解5.260mg淀粉干物質(zhì)的酶量。
酸性α-淀粉酶,即,酸穩(wěn)定α-淀粉酶、內(nèi)-α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶,E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子內(nèi)部區(qū)域的α-1,4-糖苷鍵以形成具有不同鏈長(zhǎng)度的糊精和寡糖。與碘形成的顏色強(qiáng)度直接與淀粉濃度成正比例。使用反相比色法(reverse colorimetry),在指定的分析條件下,測(cè)定淀粉濃度的降低作為淀粉酶活性。
藍(lán)色/紫色t=23秒脫色標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物 可溶性淀粉,大約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽,大約0.03M碘(I2)0.03g/LCaCl2 1.85mMpH2.50±0.05溫育溫度 40℃反應(yīng)時(shí)間 23秒波長(zhǎng) 590nm酶濃度0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL更具體描述此分析方法的文件夾EB-SM-0259.02/01,可以根據(jù)向Novozymes A/S,Denmark要求而獲得,由此通過(guò)引用將該文件夾包括在本文中。
葡糖淀粉酶活性可以以淀粉葡糖苷酶單位(AGU)測(cè)量葡糖淀粉酶(AMG)活性。將AGU定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量,所述標(biāo)準(zhǔn)條件是37℃,pH 4.3,底物麥芽糖23.2mM,緩沖液醋酸鹽(acetate)0.1M,反應(yīng)時(shí)間5分鐘。
可以使用自動(dòng)分析器系統(tǒng)。將變旋酶(mutarotase)加到葡萄糖脫氫酶試劑中,以將存在的任何α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)變成β-D-葡萄糖。在上面提到的反應(yīng)中葡萄糖脫氫酶特異地與β-D-葡萄糖反應(yīng),形成NADH,將其在340nm使用光度計(jì)測(cè)定作為初始葡萄糖濃度(original glucose concentration)的量度。
AMG溫育底物 麥芽糖23.2mM緩沖液醋酸鹽0.1MpH4.30±0.05溫育溫度 37℃±1反應(yīng)時(shí)間 5分鐘酶工作范圍0.5-4.0AGU/mL
顏色反應(yīng)葡萄糖脫氫酶(GlucDH)430U/L變旋酶 9U/LNAD 0.21mM緩沖液 磷酸鹽0.12M;0.15M NaClpH 7.60±0.05溫育溫度37℃±1反應(yīng)時(shí)間5分鐘波長(zhǎng)340nm更具體描述此分析方法的文件夾(EB-SM-0131.02/01),可以根據(jù)向Novozymes A/S,Demmark要求而獲得,由此通過(guò)引用將該文件夾包括在本文中。
實(shí)施例1通過(guò)下述方法制備用于糖化的底物將DE 11麥芽糖糊精溶解在Milli-QTM水中,并將干固體物質(zhì)的含量(dry solid matter content)(DS)調(diào)整到30%,所述DE 11麥芽糖糊精是由用耐熱細(xì)菌α-淀粉酶(LIQUOZYME XTM,Novozymes A/S)液化的玉米淀粉制備的。在密閉的2ml玻璃瓶(vial)中,在60℃和初始pH 4.3,在持續(xù)攪拌下進(jìn)行糖化實(shí)驗(yàn)。使用如下的酶Talaromycesemersonii組合物(T-AMG)、野生型黑曲霉酸性α-淀粉酶以及JA001,所述JA001是具有與野生型黑曲霉酸性α-淀粉酶相同的催化域但也包含CBM的α-淀粉酶。
在設(shè)定的時(shí)間間隔取樣并將其在沸水中加熱15分鐘以使酶失活。冷卻后,將樣品稀釋到5%DS并過(guò)濾(Sartorius MINISARTTMNML 0.2μm),然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。葡萄糖水平作為總可溶性糖的百分比在下表1中給出。
該結(jié)果顯示,向Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶中添加黑曲霉酸性α-淀粉酶比單獨(dú)用AMG得到更高的葡萄糖產(chǎn)量。而當(dāng)將含有CBM的酸性α-淀粉酶變體加入T-AMG時(shí),看到了最大的效果。此外,使用含有CBM的酸性α-淀粉酶變體允許減少AMG水平并且仍保持高葡萄糖產(chǎn)量。
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>淀粉加工<130>10735.204-WO<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>591<212>PRT<213>Talaromyces emersonii<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(591)<400>1Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala1 5 10 15Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala20 25 30Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro35 40 45Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr50 55 60Leu Val Asp Ala Phe Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile65 70 75 80Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro85 90 95Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val100 105 110Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly115 120 125Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile130 135 140Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val145 150 155 160Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe165 170 175Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val180 185 190Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn195 200 205His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe210 215 220Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly225 230 235 240Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His
245 250 255Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys260 265 270Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg275 280 285Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala290 295 300Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr305 310 315 320Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln325 330 335Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe340 345 350Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly355 360 365Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp370 375 380Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu385 390 395 400Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala405 410 415Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln420 425 430Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro435 440 445Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr450 455 460Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser465 470 475 480Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu485 490 495Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile500 505 510Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala515 520 525Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu530 535 540Pro Pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp545 550 555 560Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro565 570 575Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln580 585590<210>2<211>616<212>PRT<213>人工的<220>
<223>黑曲霉-CBM<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(616)<400>2Ala Glu Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe1 5 10 15Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asp Thr Gly Asp Gln20 25 30Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asn His Leu Asp Tyr35 40 45Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Thr Glu50 55 60Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His Gly Tyr Trp65 70 75 80Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr Ala Asp Asp85 90 95Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met Tyr Leu Met100 105 110Val Asp Val Val Pro Asn His Met Gly Tyr Ala Gly Asn Gly Asn Asp115 120 125Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser Tyr Phe His130 135 140Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met Val Gln Asp145 150 155 160Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu Asn Thr Thr165 170 175Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala Asp Leu Val180 185 190Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val Leu Glu Val195 200 205Glu Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Gln Glu Ala Ala Gly Val Tyr Cys210 215 220Val Gly Glu Val Asp Asn Gly Asn Pro Ala Leu Asp Cys Pro Tyr Gln225 230 235 240Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp Gln Leu Leu245 250 255Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu Tyr Asn Met260 265 270Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu Leu Gly Asn275 280 285Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser Tyr Thr Ser Asp290 295 300Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu Ser Asp Gly305 310 315 320Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ser Gly Gly Lys325 330 335Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr Asp Thr Ser340 345 350Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile Arg Lys Leu355 360 365Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn Asp Ala Phe370 375 380
Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Arg Lys Gly Thr Ser Gly Ser385 390 395 400Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly Ser Ser Tyr405 410 415Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr Lys Leu Ile420 425 430Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser Gly Asp Ile435 440 445Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Arg Val Leu Leu Pro Ala Ser450 455 460Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg Thr Thr Thr465 470 475 480Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ser Thr Ser Lys Ala Thr Thr Ser Ser Ser485 490 495Ser Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr Ser Ser Ser Cys Thr Ala Thr Ser500 505 510Thr Thr Leu Pro Ile Thr Phe Glu Glu Leu Val Thr Thr Thr Tyr Gly515 520 525Glu Glu Val Tyr Leu Ser Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Glu Trp Asp530 535 540Thr Ser Asp Ala Val Lys Leu Ser Ala Asp Asp Tyr Thr Ser Ser Asn545 550 555 560Pro Glu Trp Ser Val Thr Val Ser Leu Pro Val Gly Thr Thr Phe Glu565 570 575Tyr Lys Phe Ile Lys Val Asp Glu Gly Gly Ser Val Thr Trp Glu Ser580 585 590Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Glu Cys Gly Asn Gly Ser Gly595 600 605Glu Thr Val Val Asp Thr Trp Arg610 615<210>3<211>558<212>PRT<213>人工的<220>
<223>具有接頭和來(lái)自A.rolfsii的SBD的Rhizomucor pusillus淀粉酶<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(558)<400>3Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly Lys Arg Ala Thr Ser Asp1 5 10 15Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr Asp Arg Phe Gly20 25 30Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu Ser Asn Tyr Cys35 40 45Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp Tyr Ile Ser Gly50 55 60
Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro Lys Asn Ser Asp65 70 75 80Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr Gln Leu Asn Ser85 90 95Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile Gln Ala Ala His100 105 110Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala Asn His Ala Gly115 120 125Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asp Ala Ser Leu130 135 140Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp Gln Thr Ser Ile Glu145 150 155 160Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp Thr Glu Asn Ser165 170 175Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly Trp Val Gly Asn180 185 190Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys His Ile Arg Lys195 200 205Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val Phe Ala Thr Gly210 215 220Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro Tyr Gln Lys Tyr225 230 235 240Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala Leu Asn Asp Val245 250 255Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser Glu Met Leu Gly260 265 270Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu Thr Thr Phe Val275 280 285Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln Ser Asp Lys Ala290 295 300Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly Glu Gly Ile Pro305 310 315 320Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe SerGly Gly Ala Asp Pro325 330335Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Ser Ser Asp340 345 350Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg Met Lys Ser Asn355 360 365Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn Ala Tyr Ala Phe370 375 380Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr Gly Ser Gly Ser385 390 395 400Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe Asp Ser Gly Ala405 410 415Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr Val Ser Ser Asp420 425 430Glv Thr Val Thr Phe Ash Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Ile Phe Thr435 440 445Ser Ala Gly Ala Thr Ser Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Val Glu Val450 455 460Thr Phe Asp Val Tyr Ala Thr Thr Val Tyr Gly Gln Asn Ile Tyr Ile465 470 475 480Thr Gly Asp Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Thr Pro Ala Asn Gly Val
485 490 495Ala Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ala Thr Ile Ala Leu500 505 510Pro Ala Asp Thr Thr Ile Gln Tyr Lys Tyr Val Asn Ile Asp Gly Ser515 520 525Thr Val Ile Trp Glu Asp Ala Ile Ser Asn Arg Glu Ile Thr Thr Pro530 535 540Ala Ser Gly Thr Tyr Thr Glu Lys Asp Thr Trp Asp Glu Ser545 550 555<210>4<211>574<212>PRT<213>人工的<220>
<223>Meripilus giganteus淀粉酶和A.rolfsii SBD的雜合體<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(574)<400>4Arg Pro Thr Val Phe Asp Ala Gly Ala Asp Ala His Ser Leu His Ala1 5 10 15Arg Ala Pro Ser Gly Ser Lys Asp Val Ile Ile Gln Met Phe Glu Trp20 25 30Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Glu Cys Thr Asn Phe Ile Gly Pro Ala35 40 45Gly Tyr Gly Phe Val Gln Val Ser Pro Pro Gln Glu Thr Ile Gln Gly50 55 60Ala Gln Trp Trp Thr Asp Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Thr Leu Thr Gly65 70 75 80Lys Arg Gly Asp Arg Ser Gln Phe Ala Asn Met Ile Thr Thr Cys His85 90 95Ala Ala Gly Val Gly Val Ile Val Asp Thr Ile Trp Asn His Met Ala100 105 110Gly Val Asp Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Ser Ser Phe Thr His Tyr115 120 125Asn Tyr Pro Gly Ile Tyr Gln Asn Gln Asp Phe His His Cys Gly Leu130 135 140Glu Pro Gly Asp Asp Ile Val Asn Tyr Asp Asn Ala Val Glu Val Gln145 150 155 160Thr Cys Glu Leu Val Asn Leu Ala Asp Leu Ala Thr Asp Thr Glu Tyr165 170 175Val Arg Gly Arg Leu Ala Gln Tyr Gly Asn Asp Leu Leu Ser Leu Gly180 185 190Ala Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Ser Lys His Ile Pro Val Gly Asp195 200 205Ile Ala Asn Ile Leu Ser Arg Leu Ser Arg Ser Val Tyr Ile Thr Gln210 215 220Glu Val Ile Phe Gly Ala Gly Glu Pro Ile Thr Pro Asn Gln Tyr Thr
225 230 235 240Gly Asn Gly Asp Val Gln Glu Phe Arg Tyr Thr Ser Ala Leu Lys Asp245 250 255Ala Phe Leu Ser Ser Gly Ile Ser Asn Leu Gln Asp Phe Glu Asn Arg260 265 270Gly Trp Val Pro Gly Ser Gly Ala Asn Val Phe Val Val Asn His Asp275280285Thr Glu Arg Asn Gly Ala Ser Leu Asn Asn Asn Ser Pro Ser Asn Thr290 295 300Tyr Val Thr Ala Thr Ile Phe Ser Leu Ala His Pro Tyr Gly Thr Pro305 310 315 320Thr Ile Leu Ser Ser Tyr Asp Gly Phe Thr Asn Thr Asp Ala Gly Ala325 330 335Pro Asn Asn Asn Val Gly Thr Cys Ser Thr Ser Gly Gly Ala Asn Gly340 345 350Trp Leu Cys Gln His Arg Trp Thr Ala Ile Ala Gly Met Val Gly Phe355 360 365Arg Asn Asn Val Gly Ser Ala Ala Leu Asn Asn Trp Gln Ala Pro Gln370 375 380Ser Gln Gln Ile Ala Phe Gly Arg Gly Ala Leu Gly Phe Val Ala Ile385 390 395 400Asn Asn Ala Asp Ser Ala Trp Ser Thr Thr Phe Thr Thr Ser Leu Pro405 410 415Asp Gly Ser Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Lys Ala Ser Gly Ser Ser420 425 430Cys Thr Gly Ser Ser Phe Thr Val Ser Gly Gly Lys Leu Thr Ala Thr435 440 445Val Pro Ala Arg Ser Ala Ile Ala Val His Thr Gly Gln Lys Gly Ser450 455 460Gly Gly Gly Ala Thr Ser Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Val Glu Val465 470 475 480Thr Phe Asp Val Tyr Ala Thr Thr Val Tyr Gly Gln Asn Ile Tyr Ile485490 495Thr Gly Asp Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Thr Pro Ala Asn Gly Val500 505 510Ala Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ala Thr Ile Ala Leu515 520 525Pro Ala Asp Thr Thr Ile Gln Tyr Lys Tyr Val Asn Ile Asp Gly Ser530 535 540Thr Val Ile Trp Glu Asp Ala Ile Ser Asn Arg Glu Ile Thr Thr Pro545 550 555 560Ala Ser Gly Thr Tyr Thr Glu Lys Asp Thr Trp Asp Glu Ser565 570
權(quán)利要求
1.用于糖化淀粉的方法,其包括將液化的淀粉底物與源自踝節(jié)菌屬的菌種的葡糖淀粉酶和包括糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶接觸。
2.用于產(chǎn)生淀粉水解物的方法,包括;a)液化,例如通過(guò)噴射蒸煮,并添加熱穩(wěn)定的α-淀粉酶,以及;b)隨后將液化的淀粉與以下物質(zhì)接觸;i)包含糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶,以及;ii)源自踝節(jié)菌屬的菌種的葡糖淀粉酶。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法,其中糖化后水解物的DX達(dá)到的值為至少94.00%、至少94.5%、至少94.75%、至少95%、至少95.25%、至少95.5%、至少95.75%或甚至至少96%。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法,將其中至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的干固體淀粉轉(zhuǎn)化成可溶性水解物,例如葡萄糖。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法,其中所述葡糖淀粉酶是與SEQ ID NO1中所示氨基酸序列具有至少50%同源性的多肽。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法,其中所述葡糖淀粉酶源自Talaromycesemersonii。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法,其中所述包含糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶是野生型、變體和/或雜合體。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法,其中所述包含糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶是多肽,所述多肽與選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的任何氨基酸序列具有至少50%的同源性。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法,其中所述包含糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶以0.05-1.0mg EP/g DS,更優(yōu)選0.1-0.5mg EP/g DS,甚至更優(yōu)選0.2-0.5mg EP/g淀粉的DS的量存在。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法,其中所述包含糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶以10-10000 AFAU/kg的DS的量,以500-2500 AFAU/kg的DS的量,或更優(yōu)選以100-1000 AFAU/kg的DS的量,例如大約500 AFAU/kg DS的量存在。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法,其中所述葡糖淀粉酶以0.001至2.0AGU/g DS,優(yōu)選0.01至1.5 AGU/g DS,更優(yōu)選0.05至1.0 AGU/g DS,并且最優(yōu)選0.01-0.5 AGU/g DS的淀粉的量存在。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法,其中酸性α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的活性以至少0.1、至少0.2、至少0.25、至少0.3、至少0.35、至少0.40、至少0.50、至少0.60、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.85或甚至至少1.9 AFAU/AGU的比率存在。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法,其中所述熱穩(wěn)定的α-淀粉酶是細(xì)菌α-淀粉酶,優(yōu)選源自芽孢桿屬的菌種中的種類(lèi),優(yōu)選源自地衣芽孢桿菌的菌株。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法,還包括添加脫支酶,例如支鏈淀粉酶或異淀粉酶。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法,包括在60℃-75℃,優(yōu)選62℃-68℃,更優(yōu)選64℃-66℃,并且最優(yōu)選65℃的溫度糖化到至少95的DX。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法,包括在64℃-72℃,優(yōu)選66℃-74℃,更優(yōu)選68℃-72℃,并且最優(yōu)選70℃的溫度糖化到至少95的DX。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法,進(jìn)一步包括將水解物和發(fā)酵生物接觸,所述發(fā)酵生物優(yōu)選產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的酵母,所述發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)選乙醇,其中將所述乙醇任選地回收。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法,其中可以將糖化和發(fā)酵作為同時(shí)糖化和發(fā)酵方法(SSF方法)進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明尤其涉及源自踝節(jié)菌屬的菌種的葡糖淀粉酶和包含糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶在淀粉糖化方法中的用途,在所述淀粉糖化方法中將淀粉降解成葡萄糖。
文檔編號(hào)C12P19/20GK101087888SQ200580044300
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者安德斯·維克索-尼爾森, 斯文·佩德森 申請(qǐng)人:諾維信公司