專利名稱：增殖骨髓細(xì)胞群體的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于短期重建造血系統(tǒng)的組合物和方法，和其在用于治療與造血功能受損或缺失相關(guān)的病癥中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞移植(HSCT)是各種血液學(xué)惡性疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，在有些情況下是唯一能挽救患者的選擇。特別是當(dāng)疾病發(fā)展到化療也難以治療的階段。作為造血干細(xì)胞(HSCS)的典型來源有骨髓、外周血或者臍帶血，不過來自外周血的細(xì)胞顯示出更快的移植特性，而且可被對(duì)供體所做的用細(xì)胞因子G-CSF，GM-CSF或者細(xì)胞還原性藥物進(jìn)行的處理所動(dòng)員。臍帶血可容易地獲得，并且顯示較低的移植物對(duì)宿主疾病的發(fā)生率，但是它的特點(diǎn)是推遲植入(delayedengraftment)。在移植之前，給予受體可起到骨髓破壞劑量的化療和/或放療來處理所患的疾病，并且使受體適合供體HSC的植入。
通常，有兩種類型的造血干細(xì)胞移植自體同源移植和同種異體移植。自體同源移植涉及骨髓破壞處理后的受體自體細(xì)胞的輸入(infusion)。自體同源細(xì)胞移植使移植物對(duì)宿主疾病(graftversushost disease，GVHD)的風(fēng)險(xiǎn)降到最小，并且使并發(fā)癥減少。因?yàn)橐怨撬杵茐男运幬锘熐宄嗽谠煅杉?xì)胞制劑中的惡性細(xì)胞，如果疾病對(duì)化療不響應(yīng)，那么自體同源移植是有問題的。同種異體移植涉及供體干細(xì)胞的輸入，典型地用與受體主要組織相容性抗原(MHC)相匹配的供體。同型異體移植的優(yōu)點(diǎn)是伴隨發(fā)生的細(xì)胞介導(dǎo)的移植物對(duì)宿主反應(yīng)可能會(huì)發(fā)展至對(duì)抗惡性細(xì)胞。然而，匹配的不相關(guān)供體(metchedunrelated donor，MUD)移植也與強(qiáng)烈的移植物對(duì)宿主反應(yīng)有關(guān)，并且會(huì)導(dǎo)致較高的死亡率。
另外有幾種與骨髓破壞的治療和造血干細(xì)胞移植相關(guān)的并發(fā)癥，非常引人注意的是嗜中性白細(xì)胞減少癥和血小板減少癥，這兩種病癥都起源于造血功能受損和造血系統(tǒng)不能充足地補(bǔ)充與每種疾病相關(guān)的終極分化的骨髓細(xì)胞。嗜中性白細(xì)胞減少癥和血小板減少癥也可能起源于其他造血系統(tǒng)受損，例如無意暴露于致死劑量的離子輻射，遺傳性免疫缺陷，影響到骨髓的病毒感染以及代謝紊亂(例如，維生素缺乏)。
嗜中性白細(xì)胞減少癥的特征是不正常的低數(shù)量的白細(xì)胞，特別是嗜中性粒細(xì)胞，這種細(xì)胞壽命短，在外周血中代表了豐富的白細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞和其它多形核白細(xì)胞遷移到感染部位通過各種細(xì)胞因子的作用提供關(guān)鍵的免疫應(yīng)答來對(duì)抗感染性制劑。在移植后造血系統(tǒng)恢復(fù)所需的時(shí)期內(nèi)，移植受體只有低水平的循環(huán)中性粒細(xì)胞，并且對(duì)細(xì)菌和真菌感染很敏感，尤其是對(duì)常見微生物造成的偶發(fā)性感染，例如綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和煙曲霉菌(Aspergillus fumiga tus)很敏感。延長的嗜中性白細(xì)胞減少癥，尤其是那些由供體造血干細(xì)胞移植的推遲植入導(dǎo)致的減少癥，增加了感染的可能性和與之相關(guān)的高死亡率。
嗜中性白細(xì)胞減少癥的標(biāo)準(zhǔn)治療是施用G-CSF。這種細(xì)胞因子促進(jìn)粒細(xì)胞發(fā)育，并還能提高免疫效應(yīng)分子對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的應(yīng)答。G-CSF加速造血干細(xì)胞移植后的恢復(fù)，但是它可能對(duì)沒有進(jìn)行造血干細(xì)胞移植的接受高劑量化療的患者沒有效果，因?yàn)榛颊唧w內(nèi)只有低數(shù)量的應(yīng)答性造血干細(xì)胞。
另外的治療方法涉及用嗜中性粒細(xì)胞的輸入(粒細(xì)胞輸注)作為對(duì)抗感染的臨時(shí)措施。對(duì)供體用G-CSF或GM-CSF處理后，用白細(xì)胞去除術(shù)從外周血收集細(xì)胞，然后施用給受體以提高循環(huán)的嗜中性粒細(xì)胞的水平。(見，例如，Lin，Y-W等，J.Clin.Microbiol.41(10)4892-4893(2003))。用該方法處理的患者存活率增加，但是這種方法的臨床效率不確定，這也許是由于分化的嗜中性粒細(xì)胞在移植后壽命跨度短的緣故，或者是由于儲(chǔ)存對(duì)嗜中性粒細(xì)胞活性起了不良反應(yīng)(McCullough，J.等，Transfusion 23(1)20(1983))。而且，嗜中性粒細(xì)胞輸注(transfusion)的效率與施用的細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，有限的可得到的供體細(xì)胞通常來自相匹配的兄弟姐妹或者有血緣關(guān)系的父母親，無法儲(chǔ)存這些細(xì)胞可能限制了這種方法的廣泛應(yīng)用。
血小板減少癥是與骨髓譜系的另外一種終末分化細(xì)胞-巨核細(xì)胞相關(guān)的一種疾病，其特征是異常低水平的血小板。血小板對(duì)于血液凝固過程是必需的，并且是限制紅細(xì)胞漏出血管所需要的。低于正常水平的血小板導(dǎo)致出血的風(fēng)險(xiǎn)增加，而且當(dāng)血小板水平降低到一個(gè)臨界水平時(shí)可能導(dǎo)致自發(fā)性出血，血小板減少癥可能源于血小板生成受損和/或清除率增加。在造血干細(xì)胞移植中發(fā)生的血小板減少癥源于巨核細(xì)胞發(fā)育受損，并且會(huì)被造血干細(xì)胞的推遲植入、感染導(dǎo)致的并發(fā)癥和GVHD的發(fā)生所加強(qiáng)，與中性粒細(xì)胞減少癥一樣，為了最小化威脅生命的并發(fā)癥，在任何骨髓破壞性處理后對(duì)血小板減少癥的控制是很關(guān)鍵的。
血小板輸注是血小板減少癥的常規(guī)治療方法，并且該療法能有效地減少伴隨低水平血小板發(fā)生的嚴(yán)重的出血問題。用來自主要組織相容性抗原相匹配的供體的血小板能最小化針對(duì)供體血小板的任何不良的免疫反應(yīng)。然而，感染和血小板減少癥之間的關(guān)系提示中性粒細(xì)胞減少癥可能并發(fā)血小板減少癥，這種患者需要更頻繁的輸注。另外，用G-CSF治療中性粒細(xì)胞減少癥與血小板減少癥治療是沖突的，因?yàn)檠“宓募铀倨茐呐cG-CSF施用有關(guān)。
盡管用于中性粒細(xì)胞減少癥免疫保護(hù)性細(xì)胞的輸入以及用于血小板減少癥中血小板的輸注仍是用于治療這些病癥的有希望的方法，但是還是有希望增加保護(hù)的持續(xù)時(shí)間，而且對(duì)于中性粒細(xì)胞減少癥來說就是希望能獲得穩(wěn)定的細(xì)胞供應(yīng)以用于施用。而且，還希望通過能同時(shí)治療這兩種疾病而不是分別治療的方法提高對(duì)造血功能受損的這些并發(fā)癥的管理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了對(duì)源于造血功能受損引起的并發(fā)癥的治療有用的組合物和方法。造血功能不足的患者無法產(chǎn)生骨髓譜系的終未分化細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生大量威脅生命的病癥，其中最值得注意的是中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥。通過提供暫時(shí)的代替與這些病癥相關(guān)的細(xì)胞群體，能減輕或者防止由分化的骨髓細(xì)胞缺乏導(dǎo)致的并發(fā)癥，直到患者內(nèi)源性的或者重建的造血系統(tǒng)能夠再生為止。
相應(yīng)地，一方面，本發(fā)明提供了制備用于在哺乳動(dòng)物宿主中重建造血功能(reconstituting hemotopoiesis)的治療性骨髓祖細(xì)胞組合物(compositions of myeloid progenitor cells)的方法，該方法包括a)在合適的培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的起始細(xì)胞群體以增殖所述的細(xì)胞群體，并且增加在所述的群體中的骨髓祖細(xì)胞的數(shù)量；b)在藥理上可接受的培養(yǎng)基中重新懸浮所述的骨髓祖細(xì)胞，這種培養(yǎng)基適于對(duì)哺乳動(dòng)物施用。有利的是，如此處所闡明的，細(xì)胞的起始群體可能來源于同種異體供體或者更優(yōu)選地來源于多個(gè)同種異體供體，這使離體增殖的同種異體骨髓祖細(xì)胞獲自一個(gè)或者多個(gè)供體。供體彼此之間可能相關(guān)或不相關(guān)，并且在移植配置(transplantsetting)上與受體相關(guān)或不相關(guān)。
令人驚奇的是，如在這里進(jìn)一步闡明的，本發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明所增殖的骨髓祖細(xì)胞在增殖后能冷凍保存。并且在包括粒細(xì)胞/巨核細(xì)胞祖細(xì)胞的治療設(shè)定(therapeuttic setting)上能在造血功能的重建中保留它們的功能性，盡管已知造血干細(xì)胞能夠在冷凍保存后保持它們的功能性，見例如，美國專利號(hào)5004681，不過它們的進(jìn)一步分化的后代的冷凍保存并沒有一樣地成功，因此使得它們作為臨床上一種基于細(xì)胞的治療方法在實(shí)際實(shí)施中很復(fù)雜。這里提供的增殖的骨髓祖細(xì)胞具有這種優(yōu)點(diǎn)，并在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在重新懸浮和給患者施用之前冷凍保存。
用于增殖的起始細(xì)胞群體可以來自外周血，動(dòng)員的外周血，臍帶血，骨髓和/或已知的含有造血干細(xì)胞的其他器官，例如胎兒肝臟。當(dāng)細(xì)胞群體獲自一個(gè)來源或者分離的細(xì)胞，特別是當(dāng)一個(gè)富集的或者基本上純的群體(這種純是基于期望的細(xì)胞標(biāo)志物表型細(xì)胞群體可以是多種細(xì)胞的混合物，例如CD34+和/或CD90+和/或AC133+和/或ALDH+細(xì)胞)，優(yōu)選的是，起始細(xì)胞群體是基于細(xì)胞標(biāo)志物CD34+或CD90+的存在而被富集的造血干細(xì)胞，還有，更優(yōu)選的是，起始細(xì)胞群體是純化的造血干細(xì)胞，也就是既包含CD34+也包含CD90+的造血干細(xì)胞，尤其是用于人骨髓祖細(xì)胞的增殖。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞可以還具有細(xì)胞標(biāo)志物表型Linneg/low。
另一方面，本發(fā)明提供了治療性組合物，其中含有來自本發(fā)明的方法所增殖得到的骨髓祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性組合物包含或基本含在藥理上可接受的載體中的增殖的骨髓祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性組合物含有或基本上含有在冷凍保存的培養(yǎng)基中的增殖的骨髓祖細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，增殖的骨髓祖細(xì)胞是同種異體的，更優(yōu)選的是，增殖的骨髓祖細(xì)胞是同種異體骨髓祖細(xì)胞的混合物。該同種異體骨髓祖細(xì)胞的混合物可以包含至少部分在MHC上不匹配，其中MHC不匹配是在不同供體之間或者受體和供體之間的MHC的不匹配，或者是完全或者徹底的MHC不匹配。相應(yīng)地，這種同種異體細(xì)胞的混合物可以含有一部分在一些細(xì)胞之間的在MHC上的不匹配和在群體中的其他細(xì)胞之間的完全不匹配。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，進(jìn)行短期植入的祖細(xì)胞選擇在MHC上匹配或者部分不匹配(例如在骨髓譜系早期的祖細(xì)胞群體)的祖細(xì)胞和在MHC水平上部分或者全部不匹配的更分化的祖細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，同種異體骨髓祖細(xì)胞的混合物是分離的細(xì)胞的混合物。這些包括分離的CMP，分離的GMP，分離的MEP，或者它們的組合?；旌衔锏募?xì)胞可以獲自未增殖的祖細(xì)胞或者獲自這里描述的來自離體增殖的細(xì)胞培養(yǎng)物。對(duì)于同種異體增殖細(xì)胞的混合物，同種異體細(xì)胞的混和可發(fā)生在增殖之前或者之后。
另一方面，本發(fā)明提供了通過它們?cè)谂囵B(yǎng)中的離體增殖產(chǎn)生骨髓祖細(xì)胞的方法，在該方法中，能產(chǎn)生祖細(xì)胞的細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞(HSC)與含有細(xì)胞因子和生長因子的混合物的培養(yǎng)基接觸，所述混合物支持祖細(xì)胞的增殖，然后細(xì)胞在適合的條件下培養(yǎng)，以便于它們的增殖。適合離體增殖目的的細(xì)胞因子選自IL-1(即，IL-1B)，IL-3，IL-6，IL-11，G-CSF，GM-CSF以及它們的類似物。適合離體增殖目的的生長因子選自c-kit配體(SCF或者SF)、FLT-3配體(FL)、促血小板生成素(TPO)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)以及它們的類似物。此處使用的類似物包括各種各樣的細(xì)胞因子和生長因子的變體，這些變體具有它們天然存在的形式所特有的生物學(xué)活性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是化學(xué)上確定的(chemically-defined)培養(yǎng)基，沒有不確定(質(zhì)量或者數(shù)量上)的成分，包括基于細(xì)胞的增殖物質(zhì)，例如基質(zhì)細(xì)胞或者其它飼養(yǎng)細(xì)胞。很明顯，這些物質(zhì)的內(nèi)容可能是有問題的，問題來自生產(chǎn)和調(diào)節(jié)方面，化學(xué)上確定的能適當(dāng)增殖所期望的細(xì)胞類型的化學(xué)上確定的替代物的選擇和開發(fā)是本發(fā)明的另一顯著貢獻(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在它的基本組合物中的細(xì)胞因子和生長因子混合物具有干細(xì)胞因子(SCF)、FLT-3配體(FL)和紅細(xì)胞生成素(TPO)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞因子和生長因子混合物具有選自IL-3，IL-6，IL-11，G-CSF，GM-CSF及其組合的額外的細(xì)胞因子，特別是選自IL-3，IL-6，IL-11及其組合。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子和生長因子混和物含有成分SCF，F(xiàn)L，TPO和IL-3，而另一個(gè)實(shí)施方案中，混合物含有成分SCF，F(xiàn)L，TPO和IL-6。一種其它的細(xì)胞因子的組合是IL-6和IL-11，因此細(xì)胞因子和生長因子混合物含有成分SCF，F(xiàn)L，TPO，IL-6和IL-11。
細(xì)胞因子和生長因子的形式是它們的天然存在的產(chǎn)物、重組產(chǎn)物、變異體或者類似物，或者具有與天然存在的產(chǎn)物相似生物學(xué)活性的修飾形式。選擇對(duì)用于增殖的細(xì)胞有活性的細(xì)胞因子，因此它們的來源通常反映用于增殖的起始細(xì)胞的來源，盡管細(xì)胞因子形式和細(xì)胞起源的這種對(duì)應(yīng)性不要求嚴(yán)格，因?yàn)槎喾N細(xì)胞因子和生長因子各形式之間的交叉反應(yīng)都可以很容地測(cè)試。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中使用的細(xì)胞因子是重組(rhu)rhuIL-1，(例如rhuIL-1β)，rhuIL-3，rhuIL-6，rhuIL-11，rhuG-CSF，rhuGM-CSF或者它們的類似物。相似地，使用的生長因子是重組人rhuSCF，rhuFL，rhuTPO，rhuEPO及其類似物。
起始細(xì)胞的群體在支持骨髓祖細(xì)胞增殖的條件下培養(yǎng)以確定水平。根據(jù)本發(fā)明獲得的增殖的骨髓祖細(xì)胞通常包含常見的骨髓祖細(xì)胞(CMP)、粒細(xì)胞/巨嗜細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)和巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞系祖細(xì)胞(MEP)。因此，一方面，離體增殖的培養(yǎng)物包含增殖的CMP，其中CMP細(xì)胞群體被增殖了至少大約5倍，大約10倍，大約20倍，或者至少大約30倍。在最終的細(xì)胞培養(yǎng)物制備時(shí)(例如收獲細(xì)胞的時(shí)候)增殖的培養(yǎng)物包含CMP群體，至少占培養(yǎng)物中所有細(xì)胞的大約0.5％，至少大約1％，至少大約2％，至少大約5％和至少大約10％。
另一方面，離體增殖的培養(yǎng)物包含增殖的GMP，其中GMP細(xì)胞群體被增殖了至少10倍，約20倍，約40倍，更優(yōu)選至少約約80倍。在最終的細(xì)胞培養(yǎng)制備物中，增殖的培養(yǎng)物包含GMP群體，分別占培養(yǎng)物中總細(xì)胞的至少約10％，至少約20％，至少約30％和優(yōu)選至少約50％。培養(yǎng)物中MEP細(xì)胞群體被增殖了至少約0.1倍，約2倍，約5倍和至少約10倍。在最終細(xì)胞培養(yǎng)制備物中，增殖的培養(yǎng)物包含MEP細(xì)胞群體，其占培養(yǎng)物中總細(xì)胞的至少約0.5％，約1％，約2％和至少約5％。
總之，在最終細(xì)胞培養(yǎng)制備物中合并后的骨髓祖細(xì)胞總量占增殖的培養(yǎng)物中細(xì)胞總量的至少約25％，至少約40％，更優(yōu)選要高于約50％，更加優(yōu)選地要至少約60％或者70％，最優(yōu)選是至少占80％或者90％，理想的是占至少約95％。
離體增殖制備的細(xì)胞可以重新懸浮在藥理上可接受的載體中，并且可以直接使用，或者備選地可以經(jīng)過本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過各種細(xì)胞純化技術(shù)處理，例如流式細(xì)胞分選，磁力親和分離和免疫親和柱。增殖的培養(yǎng)物分離得到的細(xì)胞群體包括，分離的骨髓祖細(xì)胞，分離的CMP，分離的GMP和分離的MEP。更優(yōu)選的是，分離的細(xì)胞群體基本上是純的細(xì)胞群體。
這里描述的細(xì)胞在治療和非治療性情況下有多種用途。在治療性應(yīng)用中，這些細(xì)胞被用于治療造血功能受損或者缺失(ablated)的患者。細(xì)胞被注射入患者體內(nèi)，例如靜脈注射，用足夠多的量來提供治療效果，或者是預(yù)防性地施用以減輕與造血功能受損有關(guān)的副反應(yīng)癥狀的發(fā)生，或者來治療患有造血功能受損而引發(fā)的并發(fā)癥的患者在進(jìn)一步的方面，細(xì)胞被用于治療在造血干細(xì)胞移植情況下的患者，可能是移植的同時(shí)，也可能是之后。
中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥與造血功能受損有關(guān)，特別是患者接受骨髓破壞的治療，盡管在其他情形下也可能發(fā)生這種情況。這里描述的細(xì)胞可以用于這些情況的治療或者當(dāng)患者已經(jīng)患有這些病癥時(shí)作為預(yù)防性方法來減少這些情況的發(fā)生。在其他治療應(yīng)用中，治療形式的細(xì)胞包括增殖或者未增殖的骨髓祖細(xì)胞。既然中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥與特異的骨髓細(xì)胞類型缺乏相關(guān)，選擇的細(xì)胞群體可以為治療的特殊癥狀而特制。在一個(gè)實(shí)施方案中細(xì)胞是CMP，這可以對(duì)這兩種情況中的任何一種都有用，因?yàn)镃MP最終發(fā)育為中性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞。在中性粒細(xì)胞減少癥中，細(xì)胞可以是GMP，因?yàn)镚MP最終發(fā)育為中性粒細(xì)胞。在血小板減少癥中，細(xì)胞可以是MEP，因?yàn)镸EP最終發(fā)育為巨核細(xì)胞。細(xì)胞群體的組合在治療這些癥狀中的應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說是很明顯的，同樣也適用于上面所述的情況。分離的GMP和MEP的組合對(duì)于治療同時(shí)發(fā)生的中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥是很有用的。在組合中加入CMP應(yīng)該能提供更家持久的保護(hù)，這種保護(hù)來自CMP臨時(shí)性的植入和隨后產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞。如果中性粒細(xì)胞減少癥是治療的主要焦點(diǎn)其它的組合包括CMP和GMP，而如果治療的主要焦點(diǎn)是血小板減少癥時(shí)，組合就是CMP和MEP。
用本領(lǐng)域熟知的方法給藥細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過靜脈注射施用。細(xì)胞的給藥可以通過一次性單一給藥，也可以連續(xù)給藥。如果用連續(xù)給藥，每次給藥不同的細(xì)胞數(shù)量和/或者不同的細(xì)胞群體。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，第一次給藥的是一種細(xì)胞群體或者是細(xì)胞群體的組合，這樣提供了立即治療效果也提供了更加持久的效果(CMP+GMP+中性粒細(xì)胞)，第二次給藥包括能提供持久效果的細(xì)胞(例如CMP)，來延長第一次給藥的治療效果。這些和其他的策略對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很明顯的。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這里描述的骨髓祖細(xì)胞用于與治療與造血功能受損相關(guān)的疾病和/或者中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥并發(fā)癥的其它治療化合物聯(lián)合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，輔助性治療是用抗細(xì)菌，抗真菌或者抗病毒化合物以防止偶發(fā)性感染或者已經(jīng)在患者體內(nèi)發(fā)生的感染。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，輔助性治療采用治療性化合物來增強(qiáng)骨髓祖細(xì)胞在骨髓通路中的分化。這些輔助性治療具有誘導(dǎo)分化的效應(yīng)和動(dòng)員骨髓祖細(xì)胞的功能，所述的骨髓祖細(xì)胞可以是內(nèi)源性的或者作為治療的一部分給藥到患者體內(nèi)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，特別是治療或者預(yù)防嗜中性粒細(xì)胞減少癥中，在細(xì)胞給藥同時(shí)或者給藥后G-CSF或者GM-CSF也被給藥。另外一個(gè)輔助性治療涉及給藥EPO或者TPO。特別是作為血小板減少癥的輔助性治療，因?yàn)镋PO能誘導(dǎo)MEK分化為前成紅細(xì)胞和成熟的紅細(xì)胞，而TPO表現(xiàn)出可以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的生長和分化，和早期骨髓祖細(xì)胞胞成為巨核細(xì)胞和成熟的血小板。
最后一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含細(xì)胞因子和生長因子混合物、用于增殖的起始細(xì)胞、培養(yǎng)基和進(jìn)行離體培養(yǎng)所需的其他必需成分的試劑盒。提供了在治療用途中，例如中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥的治療中，指向細(xì)胞群體(增殖或者未增殖的)的使用的試劑盒。該試劑盒還包括(僅是舉例并非用于限制)緩沖液，標(biāo)簽，試劑和使用該試劑盒方法的說明書。


圖1是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖，(A)表示分選和分析的細(xì)胞群體。(B)表示來自培養(yǎng)中的HSC的骨髓祖細(xì)胞的衍生，培養(yǎng)的衍生的MP細(xì)胞可以新鮮或者冷凍保存使用。(C)使用骨髓祖細(xì)胞以保護(hù)患有嗜中性白血球減少癥的小鼠免受真菌感染。
圖2顯示來自培養(yǎng)的HSC的骨髓祖細(xì)胞的衍生。
圖3顯示用同種異源性培養(yǎng)-衍生的骨髓祖細(xì)胞對(duì)患有嗜中性白血球減少癥的小鼠的保護(hù)。
圖4顯示新鮮和冷凍保存的骨髓祖細(xì)胞的比較。
圖5顯示在小鼠中用骨髓祖細(xì)胞重建。
圖6顯示培養(yǎng)-衍生的骨髓祖細(xì)胞的保護(hù)作用的劑量響應(yīng)。
圖8顯示用混合的同種異體培養(yǎng)-衍生的骨髓祖細(xì)胞對(duì)患有嗜中性白細(xì)胞減少癥小鼠的保護(hù)。
圖9A顯示MHC完全不匹配的同種異體培養(yǎng)的祖細(xì)胞的輻射防護(hù)能力和可檢測(cè)的供體嵌合性(圖9B)。
圖10顯示致死劑量輻射的小鼠用新鮮和冷凍的MHC完全不匹配的同種異體骨髓祖細(xì)胞移植后30天的輻射防護(hù)。
圖11A-B顯示在7毫升AFC袋和瓶中的增殖數(shù)據(jù)。
圖12顯示來自人骨髓祖細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞和用生長因子處理的照片。
圖13顯示在7毫升AFC袋中人骨髓祖細(xì)胞的增殖數(shù)據(jù)。
圖14顯示在72毫升AFC袋中人骨髓祖細(xì)胞的增殖數(shù)據(jù)。
圖15顯示人骨髓祖細(xì)胞克隆形成。
圖16顯示為干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體進(jìn)行的人骨髓祖細(xì)胞培養(yǎng)物的FACS分析。
圖17顯示IL-3和IL-6單獨(dú)或者組合使用對(duì)人骨髓祖細(xì)胞的效果。
圖18顯示與IL-3，IL-6或者其組合-起培養(yǎng)的骨髓祖細(xì)胞的集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖19顯示與IL-3，IL-6或者其組合一起培養(yǎng)的骨髓祖細(xì)胞中的CFU的絕對(duì)數(shù)量。
圖20顯示人骨髓祖細(xì)胞對(duì)G-CSF的反應(yīng)性。
圖21概要地顯示了人骨髓祖細(xì)胞在體外對(duì)G-CSF的反應(yīng)。
圖22顯示在移植一周后人MP植入的小鼠骨髓和脾的FACS分析和它們對(duì)G-CSF的反應(yīng)。
圖23是在NOD/SCID小鼠中人培養(yǎng)衍生的骨髓祖細(xì)胞的FACS表型。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了生成對(duì)治療造血系統(tǒng)缺乏或者受損相關(guān)的病癥有用的細(xì)胞的方法，例如在骨髓破壞性治療和造血干細(xì)胞移植，惡性疾病的化療，或者是無意中暴露于高劑量的離子輻射之后發(fā)生的嗜中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥。這里描述的增殖細(xì)胞包含用確定的細(xì)胞因子和生長因子接觸起始干細(xì)胞群和祖細(xì)胞而產(chǎn)生的定型的骨髓祖細(xì)胞(MP)，以允許定型的骨髓祖細(xì)胞發(fā)育。在確定的培養(yǎng)條件下，骨髓祖細(xì)胞優(yōu)先增殖到確定的水平。增殖的細(xì)胞被作為整體使用，或者接受純化以提供據(jù)具有特定細(xì)胞標(biāo)志物表型和特征性分化潛能的分離的細(xì)胞。分離的細(xì)胞群體包括常見的骨髓祖細(xì)胞(CMP)，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)，巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞祖細(xì)胞(MEP)及其組合。這些定型的骨髓祖細(xì)胞輸入到免疫缺陷患者中導(dǎo)致短期灌輸和/或者產(chǎn)生骨髓譜系終末分化細(xì)胞。這樣就提供了暫時(shí)但不是持久的終末分化細(xì)胞的補(bǔ)充，特別是中性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞，因此補(bǔ)償了造血功能不足的時(shí)期。
在造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域，增殖技術(shù)主要指向增加用于移植和永久性恢復(fù)造血功能的造血干細(xì)胞的群體(Devine，S.M.等，骨髓移植31241-252(2003)；Henschler，R.等，Blood84(9)2898-2903(1994)；Bhatia，M.等，J.Exp.Med.186619-624(1997))。細(xì)胞因子和生長因子的組合通常用于試圖引起HSC的優(yōu)先增殖，同時(shí)限制它們分化成骨髓譜系和淋巴譜系的定型細(xì)胞。因?yàn)檩斎爰?xì)胞的植入特性和移植受體的存活與所輸入的HSC增長數(shù)量有關(guān)，所以在造血干細(xì)胞移植中增殖的HSC的數(shù)量尤其相關(guān)，尤其是當(dāng)供體和受體中存在MHC不匹配時(shí)(Ketterer N.等，Blood913148-3155(1998))。不期望在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的培養(yǎng)條件下，因?yàn)檫@樣就產(chǎn)生了較低數(shù)量的HSC。由于HSC具有自我更新能力，所以在一些情況下用長期的培養(yǎng)來選擇能自我補(bǔ)充的HSC群體(Piacibillo，W.等，Blood93(11)3736-3749(1999))。
與之相反，定型的骨髓祖細(xì)胞只有有限的或者沒有自我更新能力，因此適合HSC增殖的培養(yǎng)條件不適合增殖這些細(xì)胞。另一方面，不期望存在能促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞快速發(fā)育為終末分化細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞)的細(xì)胞因子，因?yàn)檫@樣增殖得到的細(xì)胞群體不可能提供骨髓分化途徑中起始階段發(fā)現(xiàn)的低分化的祖細(xì)胞所能提供的延長的保護(hù)。(Reichle，A.等，骨髓移植32299-305(2003)；Zimmerman，T.M.等，骨髓移植26505-510(2000)；Reiffers，J.等，Lancet 3541092-1093(1999))。因此，這里描述的增殖方法是限制HSC的產(chǎn)生，而增加MP的數(shù)量的，尤其是CMP和GMP細(xì)胞的數(shù)量。出現(xiàn)在增殖的細(xì)胞群體中的HSC主要是短期再增殖性造血干細(xì)胞(ST-HSC)，通常少于增殖細(xì)胞的10％，更優(yōu)選少于5％，典型的是在增殖細(xì)胞群體的2％-5％范圍內(nèi)。增殖的方法也適用于在自體同源或者同種異體移植情況下使用的細(xì)胞。
有利的是，為了進(jìn)一步增加可用于增殖和/或者治療的細(xì)胞數(shù)量，為了使之在廣泛的臨床應(yīng)用在商業(yè)上切實(shí)可行，這里描述的細(xì)胞群體優(yōu)先地包括同種異體骨髓祖細(xì)胞的混合物，典型地同種異體細(xì)胞是不能用于造血干細(xì)胞移植(HSCT)的，因?yàn)榭赡艿腉VHD和宿主對(duì)移植物反應(yīng)這兩種情況都能推遲HSC在移植受體中的植入。也就是，在MHC水平上具有完全或者部分匹配的單一供體通常被作為HSC的來源。不過不像在HSCT中，因?yàn)楸景l(fā)明的目的既不是永久地植入也不是利用這些分化細(xì)胞的輸入所產(chǎn)生的效果，所以在本發(fā)明中與宿主MHC不匹配的同種異體的定型的骨髓祖細(xì)胞的使用對(duì)于它們的治療效果不會(huì)有不利作用。因?yàn)槎ㄐ偷墓撬枳婕?xì)胞提供了對(duì)抗嗜中性粒細(xì)胞減少癥和/或血小板減少癥的臨時(shí)保護(hù)，所以HSC的缺失，特別是長期再增殖性的HSC的缺失，對(duì)治療效果也不是決定性的。同種異體骨髓細(xì)胞的混合物可以用增殖或者未增殖的細(xì)胞來制備。
定義 在該公開內(nèi)容的參考文獻(xiàn)中，在這里描述使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語除非特別說明，具有本領(lǐng)域中任何一個(gè)普通技術(shù)人員所通常理解的意思。相應(yīng)地，下列術(shù)語有下列意思。
“同種異體的(Allogeneic)”，指來自、起源于、或者是同一種屬的成員，其中成員之間在遺傳上相關(guān)或者不相關(guān)，但是遺傳上相似?！巴N異體移植”指細(xì)胞或者器官從供體移植到受體上，其中受體與供體屬于同一種屬。
“自體同源的(Autologous)”指獲自或者來自同一受試者或者患者?！白泽w同源移植”指收獲和再輸入或者移植患者自己的細(xì)胞或者器官，只使用或者補(bǔ)充使用自體細(xì)胞能消除或者減少很多細(xì)胞輸回到宿主的副作用，特別是外體對(duì)宿主的反應(yīng)。
“化學(xué)上確定的(Chemically-defined)”在這里是指知道化學(xué)成分的培養(yǎng)基，從定性和定量兩方面都是，沒有故意添加的不確定的補(bǔ)充物，不過即使這樣的培養(yǎng)基也可能在其成分里含有痕量的污染?；瘜W(xué)上確定的培養(yǎng)基必須沒有動(dòng)物血清、飼養(yǎng)細(xì)胞例如基質(zhì)細(xì)胞和衍生自基于細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，例如成纖維細(xì)胞等。
“定型的骨髓祖細(xì)胞(Committed myeloid progenitorcell)”或者“骨髓祖細(xì)胞”指多能的或者單能的祖細(xì)胞，最終能發(fā)育為骨髓譜系的任何終末分化細(xì)胞，但是不分化為淋巴譜系的細(xì)胞。因此，骨髓祖細(xì)胞指任何在骨髓譜系里的祖細(xì)胞。骨髓譜系的定型祖細(xì)胞不僅包括此處所定義的寡能的(oilgopotent)CMP、GMP和MEP，還包括單能的紅細(xì)胞祖細(xì)胞，巨核細(xì)胞祖細(xì)胞，粒細(xì)胞祖細(xì)胞和巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞。骨髓祖細(xì)胞不同的細(xì)胞群體與其他細(xì)胞的區(qū)別在于它們的分化潛能和存在一組有特征的細(xì)胞標(biāo)志物。
“定型淋巴祖細(xì)胞”或者“淋巴祖細(xì)胞”指寡能的或者單能的祖細(xì)胞，最終能夠發(fā)育成淋巴譜系的終末分化細(xì)胞，例如T細(xì)胞，B細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞或者淋巴樹突狀細(xì)胞，但是不發(fā)育成骨髓譜系的細(xì)胞。骨髓譜系的細(xì)胞，淋巴祖細(xì)胞不同細(xì)胞群體與其他細(xì)胞能通過分化潛能和一組有特征的細(xì)胞標(biāo)志物加以區(qū)分。
“普通的淋巴祖細(xì)胞”或者“CLP”指寡能細(xì)胞，這些細(xì)胞的特征是能產(chǎn)生B細(xì)胞祖細(xì)胞(BCP)，T細(xì)胞祖細(xì)胞(TCP)，NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。這些祖細(xì)胞只有很少或者沒有自我更新能力，但是能產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞和淋巴樹突狀細(xì)胞。
“普通的骨髓祖細(xì)胞”或者“CMP”指一些細(xì)胞，其特征是能產(chǎn)生粒細(xì)胞/單核細(xì)胞(GMP)祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞祖細(xì)胞(MEP)這些祖細(xì)胞只有很有限的或者沒有自我更新的能力，但是能產(chǎn)生骨髓樹突細(xì)胞，骨髓紅細(xì)胞，紅細(xì)胞，巨核細(xì)胞，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
“同基因系(Congenic)”指來自或者起源于或者是同一種屬的成員，其中成員間除了一個(gè)小遺傳區(qū)域外，在遺傳上是相同的，通常是單一遺傳(例如一個(gè)基因)。“同基因系移植”指從供體將細(xì)胞或者器官轉(zhuǎn)移給受體，這里供體和受體之間除了一個(gè)單一基因位點(diǎn)以外，在遺傳上是相同的。
“細(xì)胞因子”指在自然狀態(tài)下由細(xì)胞產(chǎn)生并影響產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞(自身)或者其他細(xì)胞的生理狀態(tài)的化合物或者成分(例如，自體免疫因子)。細(xì)胞因子還包括由重組或者合成加工產(chǎn)生的任何化合物或者成分，這些加工的產(chǎn)物與天然存在形式具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。淋巴因子指自然的，合成的或者由淋巴細(xì)胞天然產(chǎn)生的細(xì)胞因子的重組形式，包括IL-1，IL-3，IL-4，IL-6，IL-11等，但是不局限于此。
細(xì)胞的“增殖”指從一個(gè)起始群體的細(xì)胞增加一個(gè)特定細(xì)胞類型或者多個(gè)類型的細(xì)胞數(shù)量，所述細(xì)胞群體可以是不同的也可以是相同的。用于增殖的起始細(xì)胞不需要與增殖產(chǎn)生的細(xì)胞相同。例如，增殖的細(xì)胞可以產(chǎn)生自細(xì)胞起始群體的生長和分化。從術(shù)語增殖中排除的是用于表征細(xì)胞的分化潛能的有限稀釋實(shí)驗(yàn)。
“功能性的”細(xì)胞指細(xì)胞能執(zhí)行或者保留了與特定細(xì)胞類型相關(guān)的調(diào)節(jié)功能或者活性，所述的功能成活性可通過特定的功能實(shí)驗(yàn)來確定。例如，“功能性的GMP細(xì)胞”是能最終分化為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的祖細(xì)胞，而終分化的細(xì)胞功能是作為正常的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
“外體對(duì)宿主反應(yīng)”(Graft-versus-host response)或者“GVH”或者“GVHD”指當(dāng)不同MHC分類的淋巴細(xì)胞被導(dǎo)入到宿主體內(nèi)而發(fā)生的細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致供體淋巴細(xì)胞對(duì)抗宿主反應(yīng)。
“粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞”或者“GMP”指由通常的骨髓祖細(xì)胞衍生來的細(xì)胞，其特征是能產(chǎn)生粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，但是不能產(chǎn)生骨髓譜系的紅細(xì)胞或者巨核細(xì)胞。
“生長因子”指在自然狀態(tài)下能影響細(xì)胞增殖，細(xì)胞生存，和/或者分化的化合物或者成分。生長因子對(duì)細(xì)胞有確定的效應(yīng)，同時(shí)也可能影響其它生理過程，例如分泌，粘附，對(duì)外部刺激產(chǎn)生應(yīng)答等。盡管多種生長因子由細(xì)胞產(chǎn)生，這里所述的生長因子還包括由重組或者合成加工產(chǎn)生的化合物或者成分，這些加工的產(chǎn)物與天然存在的生長因子有相同或者相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。生長因子的例子包括表皮生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，促紅細(xì)胞生成素(EPO)和促血小板生成因子(TPO)，干細(xì)胞因子(SCF)和flt-3配體(FL)及其類似物。
“分離的”指從至少一種其他的產(chǎn)物、化合物、成分中分離到的產(chǎn)物、化合物或者成分，與其天然存在的狀態(tài)相關(guān)，不管是天然的還是合成的。
“造血干細(xì)胞”或者“HSC”指促克隆形成的、能自我更新的多能細(xì)胞，能最終分化成造血系統(tǒng)中的所有細(xì)胞類型，包括B細(xì)胞，T細(xì)胞，NK細(xì)胞，淋巴樹突狀細(xì)胞，骨髓樹突狀細(xì)胞，粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞。對(duì)于造血系統(tǒng)中的其他細(xì)胞，用一組特有的細(xì)胞標(biāo)志物來定義HSC。在HSC領(lǐng)域中的富集，指用基于單一細(xì)胞標(biāo)志物的出現(xiàn)來選擇的細(xì)胞群體，這些標(biāo)志物通常是CD34+，而“純化的”是指用HSC基于兩個(gè)或者更多個(gè)標(biāo)志物的選擇得到的一個(gè)細(xì)胞群體，優(yōu)先選擇CD34+CD90+。
“標(biāo)志物表型(Marker phenotyping)”，指鑒定細(xì)胞上的標(biāo)志物或者抗原的以確定它們的表型(例如分化狀態(tài)和/或細(xì)胞類型)。這可以用免疫表型分類法，該法用抗體來識(shí)別呈現(xiàn)在細(xì)胞上的抗原?？贵w可以是單克隆的也可以是多克隆的，但是通常選擇與其他細(xì)胞標(biāo)志交叉反應(yīng)最小的。需要理解的是確定的細(xì)胞分化或者表面標(biāo)志物對(duì)于衍生所述細(xì)胞的動(dòng)物種屬來說是唯一的，而其他細(xì)胞標(biāo)志物在種屬間是通用的。在種屬間確定相同細(xì)胞類型的這些標(biāo)志物被給予相同標(biāo)志物鑒定，盡管在種屬間在結(jié)構(gòu)上有差異(例如氨基酸序列)細(xì)胞標(biāo)志物包括細(xì)胞表面分子在特定的情況下也指細(xì)胞分(CD)化標(biāo)志物和基因表達(dá)標(biāo)志物?；虮磉_(dá)標(biāo)志物是一些能指示細(xì)胞類型或者分化狀態(tài)的表達(dá)基因。在某種程度上，基因表達(dá)譜將反應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)志物，盡管它們可能包括非細(xì)胞表面分子。
“巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞祖細(xì)胞”或者“MEP”指來自常見骨髓祖細(xì)胞的一類細(xì)胞，其特征是能產(chǎn)生紅細(xì)和巨核細(xì)胞，但是不能產(chǎn)生粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或者骨髓樹突狀細(xì)胞。
“錯(cuò)配的同種異體的”指來自或者起源于或者是同一種屬但是具有不同主要組織相容性抗原(MHC)(例如蛋白質(zhì))的成員，這由該行業(yè)使用的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試來決定，例如對(duì)MHC抗原確定的數(shù)量用血清學(xué)或者分子的分析。部分不匹配指成員之間被測(cè)的MHC抗原部分匹配，典型的是在供體與受體之間。例如，半匹配指在兩個(gè)成員之間，被測(cè)MHC抗原的50％顯示不同的MHC抗原類型，完全或者徹底不匹配指在兩個(gè)長遠(yuǎn)之間所有被測(cè)的MHC抗原不同。
“骨髓破壞性的(Myeloablative)”或者“骨髓破壞(myeloablation)”指造血系統(tǒng)的損壞或者破壞，特別是暴露于細(xì)胞毒劑或者輻射。骨髓破壞包括由高劑量毒劑導(dǎo)致的徹底的骨髓破壞，或者整體輻射破壞了造血系統(tǒng)。它也包括由非骨髓破壞性條件引起的不太徹底的骨髓破壞性狀態(tài)。因此非骨髓破壞性條件就成為治療手段，因?yàn)樗粡氐灼茐幕颊叩脑煅到y(tǒng)。
“嗜中性粒細(xì)胞減少癥”，指在外周血中中性粒細(xì)胞和其他多形核淋巴細(xì)胞低于正常數(shù)量。通常，嗜中性粒細(xì)胞減少癥的診斷是基于絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(ANC)，這是通過總白細(xì)胞數(shù)量乘以帶的百分比和中性粒細(xì)胞微分，臨床上異常的ANC是每毫升外周血少于1500個(gè)細(xì)胞。ANC為每毫升血中1000-1500時(shí)，中性粒細(xì)胞減少癥的嚴(yán)重程度被分為輕度，ANC為每毫升500-1000個(gè)細(xì)胞為中度，ANC為每毫升少于500個(gè)細(xì)胞為重度。
“自我更新”指一個(gè)細(xì)胞能分裂和產(chǎn)生至少一個(gè)與母細(xì)胞具有相同特征的子細(xì)胞。第二個(gè)子細(xì)胞可能進(jìn)入一個(gè)特定的分化途徑。例如，一個(gè)自我再生的造血干細(xì)胞分裂并形成一個(gè)子代干細(xì)胞和另一個(gè)在骨髓或者淋巴途徑中進(jìn)行分化的子細(xì)胞。定型祖細(xì)胞典型的失去了自我更新的能力，分裂后產(chǎn)生兩個(gè)呈現(xiàn)出更高分化表型(即限制性)的子細(xì)胞。
“短期再增殖干細(xì)胞”或者“ST-HSC”指具有有限的短期自我更新能力的干細(xì)胞，其特征時(shí)能分化為骨髓和淋巴譜系的細(xì)胞。ST-HSC與長期的再增殖(LT)的HSC不同之處在于它們?cè)倥囵B(yǎng)實(shí)驗(yàn)中有限長度的自我更新能力(例如，Christensen，J.L.和Weissman，I.L，美國國家科學(xué)院院刊(2001))。
指細(xì)胞的時(shí)候，“分選”指基于物理特性(例如elutriation或者基于大小的技術(shù))或者標(biāo)志物的出現(xiàn)(例如用標(biāo)記的抗體側(cè)面散射(SSC)或者前面散射(FSC)，或者熒光激活細(xì)胞篩選(FACS))，或者基于細(xì)胞標(biāo)志物出現(xiàn)的分析，例如不進(jìn)行分選的FACS；也包括免疫吸收技術(shù)，例如磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)。
“基本上純的細(xì)胞群體”指具有的特定標(biāo)準(zhǔn)物特征和分化潛能的細(xì)胞群體占總細(xì)胞群體的至少約50％，優(yōu)選地至少大約75％-80％，更優(yōu)選地至少大約85％-90％，并且最優(yōu)選地至少大約95％。因此，“基本上純的細(xì)胞群體”指一個(gè)群體的細(xì)胞包含少于大約50％，優(yōu)選地少于大約20-25％，更優(yōu)選地大約10-15％，最優(yōu)選地少于5％的細(xì)胞在指定的試驗(yàn)條件下不展示特異的分子標(biāo)志物特征和分化潛能。
“受試者(subject)”或者“患者”可以替換使用，除非特別指出，是指哺乳動(dòng)物例如人，非人靈長類，也可以是兔，大鼠，小鼠，山羊，豬和其他哺乳類。
“同系基因型的(Syngeneic)”指來自或者起源于或者是同一種屬的成員。它們?cè)谶z傳上是相同的，特別是對(duì)于抗原或者免疫學(xué)反應(yīng)。這些包括具有相配的MHC類型的相同的雙胞胎。因此，同系基因型移植指細(xì)胞或者器官從供體轉(zhuǎn)移給與供體在遺傳上相同的受體。
“血小板減少癥”指低于正常血小板數(shù)，通常少于大約100×109/升，這將導(dǎo)致凝血時(shí)間延長和自發(fā)性出血增加。尤其是當(dāng)血小板水平大約在10-50×109/升或者更低的時(shí)候。當(dāng)血小板從循環(huán)系統(tǒng)中丟失的速度大于巨核細(xì)胞補(bǔ)充的速度時(shí)，這種情況就發(fā)生血小板減少癥可能起源于血小板合成失敗和/或血小板降解速度增加。
“異種的(xenogeneic)”指來自或者起源于或者是不同種屬的成員，例如人和嚙齒類，人和豬等?！爱惙N移植”指細(xì)胞和器官從供體轉(zhuǎn)移到受體，這里受體與供體屬于不同種屬。
細(xì)胞類型和增殖細(xì)胞的來源 本申請(qǐng)所述的細(xì)胞類型是那些造血系統(tǒng)，尤其是造血干細(xì)胞和骨髓譜系細(xì)胞。這里描述的細(xì)胞將用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以理解為這些描述反映目前本領(lǐng)域里知識(shí)的狀態(tài)，本發(fā)明也不僅僅限于這里描述的表型標(biāo)志物。
造血干細(xì)胞(HSC)是多能的干細(xì)胞，能自我更新其特征是在允許的條件下能產(chǎn)生造血系統(tǒng)的所有類型的細(xì)胞。造血干細(xì)胞自我更新指HSC細(xì)胞能分裂和產(chǎn)生至少一個(gè)同樣有自我更新能力的子細(xì)胞和HSC分化潛能也就是說細(xì)胞分裂產(chǎn)生了額外的HSC。自我更新提供了未分化干細(xì)胞的連續(xù)來源來補(bǔ)充造血系統(tǒng)。對(duì)HSC有用的標(biāo)志物表型的鑒定是本領(lǐng)域所熟知的。對(duì)于人類HSC，細(xì)胞標(biāo)志物表型優(yōu)先地包括CD34+CD38-CD90(蘇氨酸1)+Lin-。對(duì)于小鼠HSC有代表性的細(xì)胞標(biāo)志物表型是Sca-1+CD90+(見例如，Spangrude，G.J.等，Science1661-673(1988))或者c-kit+Thy10Lin-Sca-1+(see，Uchida，N.等，J.Clin.Invest.101(5)961-966(1998))。其他HSC標(biāo)志物例如乙醛脫氫酶也可以發(fā)現(xiàn)有利的用途(見Storms等美國國家科學(xué)院院刊969118-23(1999)和AC133(見Yin等，血液905002-12(1997)。
HSC產(chǎn)生定型淋巴或者骨髓祖細(xì)胞。這里用的定型的骨髓祖細(xì)胞指能分化成任何一種骨髓譜系終末分化細(xì)胞的細(xì)胞群體。包括在骨髓祖細(xì)胞中的是常見的骨髓祖細(xì)胞(CMP)，其特征是只有有限的或者沒有自我更新的能力，但是能分裂形成粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)和巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞祖細(xì)胞(MEP)。不能自我更新的細(xì)胞指細(xì)胞分裂產(chǎn)生子細(xì)胞，子細(xì)胞沒有母細(xì)胞類型的分化潛能但是相反產(chǎn)生分化的子細(xì)胞。用于鑒定CMP的有用的這些標(biāo)志物表型包括被本領(lǐng)域熟知的那些。對(duì)于鼠起源的CMP細(xì)胞群體的特征是標(biāo)志物表型c-Kithigh(CD117)CD16lowCD34lowSca-1negLinneg進(jìn)一步的特征是標(biāo)志物表型FcrR10IL-7Rαneg(CD127)。鼠CMP細(xì)胞。群體的特征還有標(biāo)志物表達(dá)缺乏，包括B220，CD4，CD8，CD3，Ter119，Gr-1和Mac-1。對(duì)于人源的CMP細(xì)胞群體的特征是CD34+CD38+和進(jìn)一步的特征是標(biāo)志物表型CD123+(IL-3Rα)CD45RAneg。人CMP細(xì)胞群體的特征還有細(xì)胞標(biāo)志物CD3，CD4，CD7，CD8，CD10，CD11b，CD14，CD19，CD20，CD56，和CD234a的缺失。對(duì)各種骨髓祖細(xì)胞標(biāo)志物表型的描述，例如U.S.Patent Nos.6,465,247和6,761,883；Akashi，Nature 404193-197(2000)，所有出版物在這里作為參考文獻(xiàn)整體引入。
另外一種淋巴譜系的定型祖細(xì)胞是粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)。這個(gè)祖細(xì)胞群體的細(xì)胞的特征是能產(chǎn)生粒細(xì)胞(嗜堿性細(xì)胞，eisinophils和嗜中性粒細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞。與其定型祖細(xì)胞相似的是，GMP缺乏自我更新能力。鼠GMP的特征是標(biāo)志物表型c-Kithi(CD117)Sca-1negFcDRhi(CD16)IL-7RγnegCD34pos。鼠GMP也缺乏標(biāo)志物B220，CD4，CD8，CD3，Gr-1，Mac-1，和CD90的表達(dá)。人GMP的特征是標(biāo)志物表型CD34+CD38+CD123+CD45RA+。人GMP細(xì)胞群體的特征是缺乏標(biāo)志物CD3，CD4，CD7，CD8，CD10，CD11b，CD14，CD19，CD20，CD56和CD235a。
與討論相關(guān)的是，來自CMP的巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞系祖細(xì)胞(MEP)的特征是能分化成定型巨核細(xì)胞祖細(xì)胞和紅細(xì)胞祖細(xì)胞。成熟的巨核細(xì)胞是多倍體細(xì)胞是血小板形成的前提，這個(gè)發(fā)育過程受促血小板生成素的調(diào)節(jié)。紅細(xì)胞系細(xì)胞通過一個(gè)受促紅細(xì)胞生成素調(diào)節(jié)的過程由定型紅細(xì)胞系祖細(xì)胞生成，最終分化為成熟的紅細(xì)胞。鼠MEP的特征是細(xì)胞標(biāo)志物表型c-Kithi和IL-7RDneg和進(jìn)一步的特征是細(xì)胞標(biāo)志物表型FcGRlo和CD34low。鼠MEP細(xì)胞群體的特征也是缺乏標(biāo)志物B220，CD4，CD8，CD3，Gr-1和CD90。鼠MEP另外一個(gè)有代表性的標(biāo)志物表型是c-kithighSca-1negLinneg/lowCD16lowCD34low。人MEP的特征是細(xì)胞標(biāo)志物表型CD34+CD38+CD123negCD45RAneg。人MEP細(xì)胞群體的特征也是缺乏標(biāo)志物CD3，CD4，CD7，CD8，CD10，CD11b，CD14，CD19，CD20，CD56和CD235a。
在骨髓譜系中更加嚴(yán)格的祖細(xì)胞是粒細(xì)胞祖細(xì)胞，巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞，巨核細(xì)胞祖細(xì)胞和紅細(xì)胞祖細(xì)胞。粒細(xì)胞祖細(xì)胞的特征是能分化為終分化的粒細(xì)胞，包括嗜堿性細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。GP通常并不分化成骨髓譜系的其他細(xì)胞。關(guān)于巨核細(xì)胞祖細(xì)胞(MKP)，這些細(xì)胞的特征是能分化成終分化的巨核細(xì)胞而不是骨髓譜系的其他細(xì)胞(見例如WO 2004/024875)。
對(duì)于淋巴譜系，“定型淋巴祖細(xì)胞”指能分化成淋巴譜系的任何終末分化細(xì)胞。包含在淋巴譜系祖細(xì)胞中的是常見的淋巴祖細(xì)胞(CLP)，這是一個(gè)具有有限或者不具有自我更新能力的細(xì)胞群體，但是能進(jìn)行細(xì)胞分裂形成T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞，NK細(xì)胞和淋巴樹突細(xì)胞。用于鑒定CLP的標(biāo)志物表型為本領(lǐng)域所熟知的那些。對(duì)于小鼠CLP細(xì)胞，細(xì)胞群體的特征是出現(xiàn)在Kondo，M.等，Cell91661-672(1997)里描述的標(biāo)志物，而對(duì)于人類CLP可能會(huì)用CD34+CD38+CD10+IL7R+作為標(biāo)志物表型(Galy，A等，免疫，3459-473(1995)；Akashi，K.等，Int.J.Hematol.69(4)217-226(1999))，這里引入的出版物供參考。
下面的表1提供了優(yōu)選的鼠細(xì)胞表面標(biāo)志物的概述，這里表格中細(xì)胞顏色顯示了大致染色水平。白色顯示沒有染色，淺灰色顯示低水平的染色，深灰色顯示中度或者高度染色。
表1

Lin1CD3，CD4，CD5，CD8，B220，Gr-1，CD11b，TER119Lin2CD3，CD4，CD5，CD8，B220，Gr-1，CD90.1，CD127，TER119 下面的表2提供了優(yōu)選的人細(xì)胞標(biāo)志物的概述，這里表格中細(xì)胞顏色大致顯示了染色水平，白色表示沒有染色，淺灰表示低水平染色，深灰色表示中度或者高度染色。
表2

Lin1CD2，CD3，CD7，CD8，CD10，CD11b，CD14，CD19，CD56，CD235aLin2aCD2，CD3，CD4，CD7，CD8，CD10，CD11b，CD14，CD19，CD20，CD56，CD235aLin 2bCD10，CD11b，CD14，CD19，CD235a 大量的其他合適的細(xì)胞表面標(biāo)志物目前為熟練人員所熟知或者能及時(shí)地被定性或者鑒定，這些標(biāo)志物可以用于在這里描述的方法和組合物中，例如，最近基于mRNA表達(dá)的微陣列分析對(duì)于多種骨髓祖細(xì)胞群體鑒定出來幾個(gè)另外的鼠標(biāo)志物，見例如，Iwasaki-Arai，等J.Exp.Med.1971311-1322(2003)；Akashi，等Nature404193-197(2000)；Miyamoto，等Dev.Cell 3137-147(2002)；Traver，等Blood 98627-635(2001)；Akashi，等Blood101383-390(2003)；Terskikh，A.，等Blood10210294-101(2003)?；谕瑯宇愋偷膍RNA表達(dá)分析，另外的細(xì)胞表面標(biāo)志物例如CD110，CD114，CD116，CD117，CD127，和CD135可以用于人的分離的一個(gè)或者多個(gè)已經(jīng)鑒定的骨髓祖細(xì)胞亞群中，正如美國國家科學(xué)院院刊9911872-11877(2002)描述的那樣。
對(duì)于這里描述的方法，用于增殖的細(xì)胞可以是能最終分化為骨髓譜系的細(xì)胞例如粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，巨核細(xì)胞類紅細(xì)胞和/或骨髓樹突細(xì)胞。這些包括HSC和定型的骨髓祖細(xì)胞CMP，GMP和MEP，這些細(xì)胞具有相關(guān)特征，特別是分化潛能和上述的細(xì)胞標(biāo)志物特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于增殖的起始細(xì)胞包括具有標(biāo)志物表型CD34+的細(xì)胞。因?yàn)樵诓煌淖婕?xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)有CD34標(biāo)志物，用于增殖的起始細(xì)胞群體可以是表達(dá)CD34的祖細(xì)胞的混合物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是包括細(xì)胞標(biāo)志物表型Sca-1pos的細(xì)胞，這個(gè)細(xì)胞標(biāo)志物在小鼠和其他嚙齒類中發(fā)現(xiàn)。對(duì)Sca-1pos細(xì)胞的選擇也會(huì)導(dǎo)致展示該細(xì)胞標(biāo)志物表型的細(xì)胞的混和物，盡管它主要選擇HSC，因?yàn)樾∈蠖ㄐ偷墓撬枳婕?xì)胞是Sca-1neg。因此在增殖嚙齒類骨髓細(xì)胞的其他實(shí)施方案中使用細(xì)胞標(biāo)志物表型Linneg/low，這包括HSC，CMP和GMP。
在進(jìn)一步方面，用于增殖的起始細(xì)胞是分離的細(xì)胞，這包括分離的HSC，在所述的細(xì)胞因子和生長因子混合物存在時(shí)發(fā)育成CMPs，然后由CMP進(jìn)一步增殖成其他淋巴譜系祖細(xì)胞。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，用于增殖的起始細(xì)胞是CMP，其特有的分化潛能和上述的細(xì)胞標(biāo)志物表型。CMP可能具有有限的自我更新能力，因此能增殖用于為有限數(shù)量的細(xì)胞分裂產(chǎn)生額外的CMP，也能分化成GMP和MEP。
用于增殖的細(xì)胞有很多來源，包括骨髓外周血，臍血和含有造血和骨髓祖細(xì)胞的其他來源包括肝臟，尤其是胚胎肝臟。外周血和臍帶血是HSC和祖細(xì)胞的豐富來源，用本領(lǐng)域中熟知的和通常實(shí)踐的方法來獲得細(xì)胞。例如，在Sutherland等人的，骨髓加工和純化實(shí)用手冊(cè)(Gee，A.P.ed.)，CRC Press Inc.(1991))中描述了制備骨髓細(xì)胞的方法。臍帶血或者胎盤臍帶血通常是在胎盤脫離前或者脫離后通過擠壓臍帶靜脈來獲得的(見，例如，Turner，C。W.等，骨髓移植1089(1992)；Bertolini，F(xiàn).等，J.Hematother.429(1995))。HSC和骨髓祖細(xì)胞也可以通過白細(xì)胞去除法從外周血獲得，白細(xì)胞去除法是取自合適研究受試者的血液經(jīng)過連續(xù)離心(例如，Cobe BCT Spectra blood cell separators)來去除白細(xì)胞的過程，而其他血液成分能回到供體。另外一種分離程序是通過濃度變化的介質(zhì)離心，例如Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。
細(xì)胞來自具有造血系統(tǒng)的任何動(dòng)物種屬，正如這里通常描述的。優(yōu)選的是，適合的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，包括，舉例沒有限制，嚙齒類，兔，犬類，貓，豬，馬，牛，靈長類(例如人)等。用于增殖的細(xì)胞可能來自單個(gè)受試者，或者多個(gè)受試者，“多個(gè)”是指至少兩個(gè)(例如多于一個(gè))供體。當(dāng)細(xì)胞來自多個(gè)供體時(shí)，它們的關(guān)系可能是這里定義的同系基因型的，同種異體的，或者異種的。目前發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案被指向通過這里的增殖方法得到的同種異體骨髓祖細(xì)胞的混合物，正如下面進(jìn)一步的描述，同種異體細(xì)胞能被分別增殖，增殖后混合，或者增殖前混合，如下進(jìn)一步加以討論。
這里可以應(yīng)用的，干細(xì)胞和祖細(xì)胞可被通過事先向患者給予細(xì)胞因子或者藥物從骨髓動(dòng)員到外周血(見例如，Lapidot，T.等，Exp.Hematol.30973-981(2002))。能夠用于誘導(dǎo)動(dòng)員的細(xì)胞因子和趨化因子，舉例但不限于，粒細(xì)胞克隆刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞克隆刺激因子(GM-CSF)，促紅細(xì)胞生成素(Kiessinger，A.等，Exp.Hematol.23609-612(1995))如，干細(xì)胞因子(SCF)，AMD3100(AnorMed，Vancouver，Canada)，白細(xì)胞介素8(IL-8)以及這些因子的突變體(例如pegfilgastrim，darbopoietin)。細(xì)胞因子和趨化因子的組合，例如，G-CSF和SCF，或者GM-CSF和G-CSF，能協(xié)同作用促進(jìn)動(dòng)員和增加外周血中HSC和祖細(xì)胞的數(shù)量，尤其是對(duì)于單一細(xì)胞因子或者趨化因子不顯示有效動(dòng)員的患者(Morris，C.等，J.Haematol.120413-423(2003))。
使用誘導(dǎo)劑量(例如細(xì)胞還原劑的劑量)下的細(xì)胞破壞劑(cytoablative agent)還能動(dòng)員HSC和祖細(xì)胞，細(xì)胞破壞劑單獨(dú)或者與細(xì)胞因子組合都是有用的。當(dāng)患者接受骨髓破壞性治療時(shí)可以在高劑量的化療之前使用這種動(dòng)員模式。用于動(dòng)員的細(xì)胞還原性藥物，包括環(huán)磷酰氨，異環(huán)磷酰胺，依托泊苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷和卡鉑(Montillo，M.等，Leukemia 1857-62(2004)；Dasgupta，A.等，J.Lnfusional Chemother.612(1996)；Wright，D.E.等，Blood97(8)2278-2285(2001))。
用于增殖的細(xì)胞可以再接受進(jìn)一步的選擇和純化，包括陽性和陰性兩種選擇方法，以獲得基本上純的細(xì)胞群體。一方面，熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)，也叫流式細(xì)胞術(shù)被用于分選和分析不同細(xì)胞群體。具有HSC或者祖細(xì)胞群體特異細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞用能結(jié)合細(xì)胞標(biāo)志物的抗體通常是抗體的混合物進(jìn)行標(biāo)記。指向不同的標(biāo)志物的每個(gè)抗體與可被檢測(cè)的分子，特別是熒光染料綴合，這種染料能與綴合到其他抗體上的其他熒光區(qū)分開來。一束標(biāo)記的或者“染色的”細(xì)胞通過光源，激發(fā)了熒光物質(zhì)，來自被測(cè)細(xì)胞的發(fā)射光譜決定特定標(biāo)記抗體的存在。通過同時(shí)檢測(cè)不同熒光物質(zhì)，在本領(lǐng)域中也指多色熒光細(xì)胞分選呈現(xiàn)不同細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞能從群體里的其他細(xì)胞里鑒定和分離出來。其他FACS參數(shù)，包括，有限舉例如，側(cè)散光(SSC)，前散光(FSC)，活性染料(例如碘化丙啶)能基于細(xì)胞大小和活性選擇細(xì)胞。其中，U.S.專利號(hào)5,137,809，5,750,397，5,840,580；6,465,249；Manz，M.G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9911872-11877(2002)和Akashi，K.等，Nature 404(6774)193-197(2000))中描述了FACS分選和分析HSC和祖細(xì)胞。熒光激活的細(xì)胞分選例如在Shapiro，H.M.，Practical Flow Cytometry，4th Ed.，Wiley-Liss(2003)和Ormerod，M.G.，F(xiàn)low CytometryA PracticalApproach，3rd Ed.，Oxford University Press(2000)中描述了熒光激活的細(xì)胞分選的一般性指導(dǎo)。
分離起始細(xì)胞群體的另外一種方法是使用結(jié)合有與特異的細(xì)胞表面標(biāo)志物相互作用的抗體和配體的固體或者不溶性物質(zhì)，。在免疫吸附技術(shù)中，細(xì)胞與含有抗體的基質(zhì)(例如球珠柱子，瓶子，磁性顆粒)相接觸，然后除去的沒有結(jié)合的細(xì)胞。免疫吸附技術(shù)能規(guī)?；糜谥苯犹幚砼R床收集的大量細(xì)胞，合適的基質(zhì)，舉例但不限于，塑料，纖維素，葡聚糖，聚丙烯酰氨，瓊脂糖和本領(lǐng)域里知道的其他物質(zhì)(例如法瑪西亞葡聚糖6MB巨球珠)。當(dāng)使用包含磁性或者順磁性珠子的固體基質(zhì)時(shí)，結(jié)合于珠子上的細(xì)胞能用磁性分離子很容易地分離(Radbruch，A.，Cytometry 14(4)384-92(1993)；CD34+directisolation kit，Miltenyi Biotec，Bergisch，Gladbach，Germany)。親和層析細(xì)胞分離通常涉及將懸浮細(xì)胞通過表面固定有選擇性配體的支持物，配體與細(xì)胞表面特異性的靶分子相互作用，被捕獲在細(xì)胞基質(zhì)上。在柱子的通過緩沖液中加入洗脫試劑可以釋放結(jié)合的細(xì)胞。自由細(xì)胞被洗脫通過柱子并作為均一群體收集。很明顯對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，吸附技術(shù)不僅僅限于用特異性抗體的那些方法，也可以使用非特異性的吸附。例如，硅石吸附就是一個(gè)用于從細(xì)胞制備物中除去巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法。
FACS和大多數(shù)分批免疫吸附技術(shù)可用作陽性或者陰性篩選方法(見例如美國專利號(hào)5,877,299)。在陽性篩選中，用抗體標(biāo)記期望的細(xì)胞，從剩余的未標(biāo)記/不需要的細(xì)胞中分離出來。在陰性選擇中，不需要的細(xì)胞被標(biāo)記和除去。也可以用另外一種陰性選擇，就是用抗體/補(bǔ)充處理或者免疫毒性來除去不需要的細(xì)胞。
可以理解的是上述描述的細(xì)胞的純化方法還包括上述方法的組合。常見的組合可以包含能有效地除去大量的不需要的細(xì)胞和細(xì)胞材料的起始程序，例如白細(xì)胞清除術(shù)。第二步可以包括表達(dá)標(biāo)志物的細(xì)胞的分離，這個(gè)標(biāo)志物對(duì)于結(jié)合于基質(zhì)上的抗體免疫吸附的一個(gè)或者多個(gè)祖細(xì)胞群體來說很常見。例如，包含抗CD34抗體的磁性珠能結(jié)合和捕獲通常表達(dá)CD34抗原的HSC，CMP和GMP細(xì)胞。一個(gè)額外的步驟對(duì)于不同的細(xì)胞類型提供了更好的解決辦法，例如用抗一系列細(xì)胞標(biāo)志物的抗體進(jìn)FACS分選，這能得到基本上純的所需要的細(xì)胞群體。另外一種組合可能涉及先用結(jié)合抗CD34抗體的磁性珠的起始分離，然后加上一輪FACS純化。
測(cè)定細(xì)胞的分化潛能合干細(xì)胞和分離的祖細(xì)胞的類型通常是通過將細(xì)胞暴露于允許發(fā)育成各種終末分化細(xì)胞的條件之下。這些條件通常在培養(yǎng)基中包括細(xì)胞因子和生長因子的混合物，以允許骨髓或者淋巴譜系發(fā)育?？寺⌒纬膳囵B(yǎng)實(shí)驗(yàn)根據(jù)通過有限稀釋體外培養(yǎng)細(xì)胞，然后對(duì)連續(xù)發(fā)育而來的細(xì)胞類型進(jìn)行評(píng)價(jià)，如，常見的類型測(cè)試實(shí)驗(yàn)是在補(bǔ)充有細(xì)胞因子的甲基纖維素培養(yǎng)基上進(jìn)行的(例如MethoCult，Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada；Kennedy，M.等，Nature 386488-493(1997))。Manz等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 99(18)11872-11877(2002)；U.S.Patent No.6,465,249；和Akashi，K.等，Nature 404(6774)193-197(2000))描述了細(xì)胞因子和生長因子制劑允許造血途徑中的分化。細(xì)胞因子包括SCF，F(xiàn)LT-3配體，GM-CSF，IL-3，TPO，和EPO。另外一種體外實(shí)驗(yàn)是長期培養(yǎng)起始細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(LTC-IC)，通常使用基質(zhì)細(xì)胞來支持造血作用(見例如，Ploemacher，R.E.等，Blood.742755-2763(1989))和Sutherland，H.J.等，美國國家科學(xué)院院刊873745(1995))。
另外一種類型的適合于決定分離細(xì)胞的分化潛能實(shí)驗(yàn)是根據(jù)將細(xì)胞的體內(nèi)施用，將其施用到宿主動(dòng)物后對(duì)造血系統(tǒng)重新構(gòu)造的評(píng)價(jià)。受體是免疫妥協(xié)的或者免疫缺陷的，以此來限制排斥和使之接受同種異體或者異源性細(xì)胞移植。可用的這類動(dòng)物系統(tǒng)是NOD/SCID(Pflumio，F(xiàn).等，Blood 883731(1996)；Szilvassym S.J.等，″Hematopoietic Stem Cell Protocol，″in Methods in MolecularMedicine，Humana Press(2002)；Greiner，D.L.等，Stem Cells16(3)166-177(1998)；Piacibello，W.等，Blood 93(11)3736-3749(1999))or Rag2 deficient mouse(Shinkai，Y.等，Cell 68855-867(1992))。通過從骨髓、脾或者宿主動(dòng)物的血液中回收細(xì)胞來評(píng)價(jià)起源于輸入細(xì)胞的細(xì)胞和測(cè)定展示特異性細(xì)胞標(biāo)志物(例如，標(biāo)志物表型)的細(xì)胞的存在，通常是通過FACS分析。檢測(cè)移植細(xì)胞特異的標(biāo)志物可以對(duì)內(nèi)源細(xì)胞和移植細(xì)胞加以區(qū)分。例如，當(dāng)將人細(xì)胞移植到合適的免疫缺陷的小鼠中(見例如，Piacibello.W.等，supra)時(shí)，使用對(duì)細(xì)胞標(biāo)記的人形式(例如HLA抗原)特異的特異性抗體鑒定人類細(xì)胞。
用上述方法獲得的細(xì)胞的起始群體直接用于增殖或者冷凍以備他日之需。本領(lǐng)域中有很多培養(yǎng)基和凍存細(xì)胞的操作步驟。通常，凍存培養(yǎng)基將包含5％-10％的DMSO，10％-90％牛血清，和50％-90％培養(yǎng)基。有利于保存細(xì)胞的其他添加物包括，列舉但不限于，二糖例如海藻糖(Scheinkonig，C.等，骨髓移植。34(6)531-6(2004))，或者血漿體積擴(kuò)展劑，例如hetastarch(也就是，羥乙基淀粉代血漿)。在一些實(shí)施方案中，可以用等滲的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液。一個(gè)可參考的凍存成分有4％HAS的細(xì)胞培養(yǎng)基，7.5％二甲基亞砜(DMSO)，和2％的羥乙基淀粉。用于凍存的其他組合物和方法是眾所周知的，而且也在領(lǐng)域內(nèi)有所描述(見，如Broxmeyer，H.E.等，美國科學(xué)院院刊100(2)645-650(2003))。細(xì)胞被保存在低于-135℃的最終溫度下。
骨髓祖細(xì)胞的離體增殖
以上獲得的細(xì)胞的起始群體在包含細(xì)胞因子和生長因子混合物的培養(yǎng)基中離體增殖允許骨髓祖細(xì)胞增殖。在自然狀態(tài)下的細(xì)胞因子通常是由細(xì)胞產(chǎn)生的能調(diào)節(jié)細(xì)胞生理狀態(tài)的蛋白質(zhì)，不管細(xì)胞是另外的細(xì)胞還是產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞自身。淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子通常被描述為淋巴因子(IL)，但是這里定義為細(xì)胞因子。細(xì)胞因子通常通過細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的細(xì)胞上的細(xì)胞受體作用。與之類似，生長因子在其自然狀態(tài)下也是由細(xì)胞產(chǎn)生的化合物，影響細(xì)胞的增殖和分化，不管細(xì)胞是另外的細(xì)胞還是產(chǎn)生生長因子的細(xì)胞。像細(xì)胞因子一樣，生長因子通常通過受體作用于細(xì)胞。本公開內(nèi)容中的細(xì)胞因子和生長因子的參考，然而并不意味著絕對(duì)，因?yàn)槟承┘?xì)胞因子對(duì)增殖和分化作用與生長因子相似。因此這里僅僅描述特異的細(xì)胞因子和生長因子在本領(lǐng)域的狀態(tài)，并不意味著限制這個(gè)發(fā)明的范圍。
對(duì)于增殖的方法，選擇細(xì)胞因子和生長因子用于增殖定型的骨髓祖細(xì)胞的群體，例如CMP，GMP和MEP細(xì)胞。因?yàn)檫@些細(xì)胞具有有限的或者不具有自我更新的能力，選擇培養(yǎng)條件來支持細(xì)胞分裂發(fā)育成這些骨髓細(xì)胞，而限制或者最小化不屬于定型的骨髓祖細(xì)胞的其他類型細(xì)胞的增殖。
相應(yīng)地，用于作為增殖條件的細(xì)胞因子通常選擇自IL-1(Ae，IL-1β)，IL-3，IL-6，IL-11，G-CSF，CM-CSF及其類似物。細(xì)胞因子的形式是自然產(chǎn)生的產(chǎn)物，重組產(chǎn)物，突變體或者與天然存在的形式具有相似的生物活性的修飾形式，例如模擬肽。細(xì)胞因子也可以是選自一組融合蛋白或者工程化的細(xì)胞因子。合適的但不限于此的例子包括PIXY321(Curtis，B.M.，等Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A.1991 88.5809-5813)一個(gè)GM-CSF和IL-3，Epo-IL-3人工合成的混合物(Lu，L.，等Exp.Hematol.1995 23.1130-1134)，IL-2-IL-6(Zhao.C.，等干細(xì)胞1994.12.1130-1134)。
細(xì)胞因子的來源選擇能對(duì)用于增殖的細(xì)胞有活性的，由此通常反映了用于增殖的起始細(xì)胞的來源。例如，假如祖細(xì)胞是人源的，就用人形式的細(xì)胞因子，不論是天然的或者重組的。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中細(xì)胞因子是重組的人rhuIL-1，(i.e.，rhuIL-1β)，rhuIL-3，rhuIL-6，rhuIL-11，rhuG-CSF，rhuGM-CSF，及其類似物，然而細(xì)胞因子的形式與細(xì)胞的起源之間的關(guān)聯(lián)不需要嚴(yán)格限定。例如，人IL-6能在小鼠和大鼠細(xì)胞中起作用，盡管小鼠IL-6對(duì)人細(xì)胞沒有效應(yīng)。這種交叉反應(yīng)性對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是很明顯的，也很容易用已知的方法檢測(cè)。下面對(duì)特定的細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行描述，這反映了本領(lǐng)域的知識(shí)狀態(tài)。
IL-1是一組細(xì)胞因子，在急性炎癥中上調(diào)和下調(diào)(例如激活內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)、骨形成和重構(gòu)、胰島素分泌和發(fā)熱誘導(dǎo)中起重要作用。IL-1家族的細(xì)胞因子具有整體結(jié)構(gòu)上的相似性，包括一個(gè)偽三折軸的β片層(見例如，Priestle J.P.等，美國科學(xué)院院刊86，9667-71(1989))。與本發(fā)明的方法有關(guān)的是IL-1β，其通常是與IL-1α一起由巨噬細(xì)胞分泌的。這兩個(gè)拮抗者由前體蛋白(pro-IL-1α和pro-IL-1β)經(jīng)過酶水解得到，并通過結(jié)合IL-1受體發(fā)揮生理效應(yīng)。IL-β的氨基酸序列和對(duì)應(yīng)的核苷酸序列能通過各種來源獲得，包括，例如但不限于，鼠類(Telford，J.L.等，Nucleic Acids，Res.14(24)9955-9963(1986))；兔(Young PR和Sylvester D.，Protein Eng.2(7)545-51(1989))；rat(Accession No.NP 113700[gi13928692])；豬(Huether，M.J，等，Gene 129(2)285-289(1993))；牛(Leong S.R.，Nucleic Acids Res.169054-9054(1988))；貓(Daniel，S.L.等，Anim.Biotechnol.3117-121(1992))；馬(Howard，R.D.等，Am.J.Vet.Res.59704-711(1998))；人(March，C.J.等，Nature 315641(1985)；和重組人(Meyers，C.等，J.Biol.Chem.262(23)11176-11181(1987))。Boraschi，D.等，F(xiàn)rontiersin Bioscience 1270-308(1995))描述了IL-1β突變體。各種重組形式也可以購得(參見，例如，human IL-1β，Promega，Madison，WI，USA；murine IL-1β，Stem Cell Technologies，Vancouver，BC，Canada；和rat IL-1β，Chemicon Int.，Temacula，CA，USA).Gronenborn，A.M.等，Eur.J.Biochem.161(1)37-43(1986)；Antoni，Ge等，J.Immunol.137(10)3201-4(1986)；Palaszynski，E.W.，Biochem.Biophys.Res.Commun.147(1)204-11(1987)；和Huang，J.J.等，F(xiàn)EBS Lett.223(2)294-8(1987))中描述了IL-1β的突變體。
IL-3也叫multi-CSF，是一個(gè)由淋巴細(xì)胞，上皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞分泌的多譜系細(xì)胞因子/生長因子，能刺激各種血細(xì)胞和組織細(xì)胞的克隆性增殖和分化，尤其是粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分化和功能。被認(rèn)為是造血系統(tǒng)克隆刺激因子之一(見例如，Wagemaker，G.等，Biotherapy 2(4)337-45(1990))。已經(jīng)從各種生物中鑒定出IL-3的氨基酸序列和核酸序列，其中包括小鼠(Fung M.-C.等，Nature307233-237(1984))；大鼠(Cohen，D.R.等Nucleic Acids Res.143641-3658(1986)；綿羊(Mclnnes CJ.等，Gene 139289-290(1994))；牛(Mwangi S.M.等，Gene 162309-312(1995))；猩猩/猴(Burger H.等，Biochim.Biophys.Acta1217195-198(1994))；和人(Yang Y.-C.等，Cell 473-10(1986)；Otsuka T.等，J.Immunol.1402288-2295(1988)).Lopez，A.F.等，美國國家科學(xué)院院刊89(24)11842-6(1992)；Barry，S.C.等，J Bio.1 Chem.269(11)8488-92 (1994)；和Olins，P.O.等，J Biol Chem.270(40)23754-60(1995))中描述了各種IL-3的突變體。
IL-6被認(rèn)為是B-細(xì)胞刺激因子2(BSF-2)和干擾素β2，參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化成免疫球蛋白分泌細(xì)胞、骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤生長的誘導(dǎo)和神經(jīng)細(xì)胞分化。IL-6結(jié)合于IL-6受體上誘導(dǎo)包含GP130的多亞單位復(fù)合體的形成，GP130對(duì)于I型細(xì)胞因子受體超家族是常見的。IL-6看來具有包括四個(gè)螺旋束的共同結(jié)構(gòu)，螺旋面與受體相互作用。IL-6氨基酸序列和核酸序列已經(jīng)被鑒定，其中小鼠(Chiu，C.P.等，美國國家科學(xué)院院刊.85(19)7099-103(1988)；大鼠(Northemann，W.等，J.Biol.Chem.264(27)16072-82(1989)；兔(Perkins，H.D.等，Cytokine 12(6)555-65(2000))；綿羊(Ebrahimi，B.等，Cytokine.7(3)232-236(1995))；牛(Droogmans，L.等，DNA Seq.2(6)411-3(1992))；馬(Swiderski，C.E.等，Vet Immunol Immunopathol.77(3-4)213-20(2000))；和人(Hirano T.等，Nature 32473-76(1986)).Dagan，S.等，Protein Expr.Purif.3(4)290-4(1992)；Zhang，J.G.等，Eur JBiochem.207(3)903-13(1992)；和Skelly，S.M.等，J Biotechnol.34(1)79-86(1994)描述了IL-6突變體。Stoyan，T.等，Eur JBiochem.216(1)239-45(1993))；Orita，T.等，J Biochem(Tokyo)115(2)345-50(1994))描述了重組形式，重組形式也能購得。
IL-11屬于結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的IL-6組細(xì)胞因子，正如以上提到的，用跨膜糖蛋白gp130來發(fā)揮其生理活性。IL-11也被認(rèn)為是脂肪發(fā)生的抑制因子(AGIF)和oprelvekin。IL-11與其他細(xì)胞因子和生長因子協(xié)同作用，刺激干細(xì)胞增殖和分化成定型祖細(xì)胞、促進(jìn)巨核細(xì)胞發(fā)生和血栓形成。IL-11在體內(nèi)和體外有相反的效應(yīng)，在體內(nèi)它能促進(jìn)輸入，而在體外能維持干細(xì)胞的原始群體。作為1類細(xì)胞因子，IL-11也被認(rèn)為包含一個(gè)四螺旋束結(jié)構(gòu)，已經(jīng)鑒定了IL-11的氨基酸序列和核苷酸序列，其中有鼠(Morris，J.C.等，Exp.Hematol.241369(1996)；靈長類(Paul，S.R.等，美國國家科學(xué)院院刊.87(19)7512-6(1990)；和人(Ohsumi，J.等，F(xiàn)EBS Lett.28813(1991))Miyadai，K.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.60(3)541-2(1996)；Tacken，I.等，Eur J Biochem.265(2)645-55(1999))描述了IL-11的重組形式和突變體。
G-CSF或者粒細(xì)胞集落刺激因子能誘導(dǎo)骨髓產(chǎn)生粒細(xì)胞和促進(jìn)中性粒細(xì)胞祖細(xì)胞和成熟的中性粒細(xì)胞的存活，增殖，分化和功能。它由不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生，例如內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。盡管自然狀態(tài)下是作為糖蛋白，重組技術(shù)產(chǎn)生的G-CSF非糖蛋白形式具有完全活性。結(jié)構(gòu)上，G-CSF與1型細(xì)胞因子家族相關(guān)，因?yàn)樗嬖谝粋€(gè)四α螺旋束(Hill，C.等，Proc Natl Acad Sci USA 90(11)5167-71(1993)；Lovejoy，B.等，J Mol Biol.234(3)640-53(1993)。G-CSF的氨基酸和核苷酸序列已經(jīng)得到鑒定，其中有鼠類(Tsuchiya，M.等，Proc Natl Acad Sci USA.3(20)7633-7(1986)；大鼠(Han，S.W.等，Gene 175(1-2)101-4(1996))；牛(Heidari，M.和Kehrli，M.E.，Vet.Immunol.Immunopathol.73(2)183-91(2000)；綿羊(O′Brien，P.M.，DNA Seq.4(5)339-42(1994))；貓(Dunham，S.P.和Onions，D.E.，Cytokine 14(6)347-51(2001))；豬(Kulmburg，P.等，Gene 197(1-2)361-5(1997))；和人(Nagata，S.等，EMBO J.5575-581(1986)).Lu，H.S.等，Arch Biochem Biophys.268(1)81-92(1989)；Kuga，T.等，Biochem Biophys Res Commun.159(1)103-11(1989)中描述了G-CSF的重組形式和突變體；和Fujii，I.等，F(xiàn)EBS Lett.410(2-3)131-5(1997))，可商購得到商品名為filgrastim；lenograstim；pluripoietin，Neupogen，granulokine(Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)和granocyte(Rhone-Poulenc)的G-CSF。
GM-CSF或者粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子也叫集落刺激因子2，可刺激來自各種譜系的造血前體細(xì)胞的生長和分化，包括粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜曙紅細(xì)胞和紅細(xì)胞。它也是1型細(xì)胞因子家族的成員，具有一個(gè)四螺旋束結(jié)構(gòu)，通過結(jié)合粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體發(fā)揮自己的生理效應(yīng)。已知的GM-CSF的氨基酸和核苷酸序列包括，其中小鼠(Gough，N.M.等，Nature 309763-767(1984)；綿羊(Mclnnes，C.J.和Haig，M.C.K.，Gene 105275-279(1991)；牛(Maliszewski，C.R.，Mol.Immunol.25843-850(1988))；和人(Cantrell，M.A.等，美國國家科學(xué)院院刊826250-6254(1985)；Lee，F(xiàn).等，美國國家科學(xué)院院刊82(13)4360-4(1985))。DeLamarter，J.F.等，EMBO J.4(10)2575-81(1985)；Shanafelt A.B.和Kastelein，R.A.，美國國家科學(xué)院院刊.86(13)4872-6(1989)，描述了GM-CSF的重組形式和突變體，它們可以購得，其商品名為molgramostin和sargramostim。
用于增殖的生長因子選自干細(xì)胞因子(SCF或者SF)、FLT-3配體(FL)、促血小板生成素(TPO)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)及其類似物。與細(xì)胞因子一樣，生長因子形式可以是天然產(chǎn)物或者是與天然存在的因子具有相似生物學(xué)活性的重組形式。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，生長因子是重組的rhuSCF，rhuFL，rhuTPO，rhuEPO及其類似物與細(xì)胞因子選擇一樣，選擇對(duì)增殖的細(xì)胞有活性的生長因子，因此將大體上反映起始細(xì)胞的起源。如上所述這種關(guān)聯(lián)不需要嚴(yán)格。例如，大鼠和小鼠SCF對(duì)人細(xì)胞有活性，但是人蛋白對(duì)大鼠或者小鼠的活性就少很多。這種交叉反應(yīng)對(duì)于技術(shù)人員來說是很明顯的也很容易通過現(xiàn)有方法測(cè)定。特異的生長因子的結(jié)構(gòu)和功能可參考后面的描述，這體現(xiàn)本領(lǐng)域知識(shí)的狀態(tài)，但不意味著僅限于此。
SCF也叫c-kit配體，主細(xì)胞生長因子，或者Steelfactor，與其他細(xì)胞因子組合作用于多水平的造血體系來促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、分化粘附和功能性激活，它在骨髓譜系中尤其重要，尤其是在mast細(xì)胞的發(fā)育中，但是也作用于多能干細(xì)胞和祖細(xì)胞，巨核細(xì)胞和一些淋巴祖細(xì)胞。(Broudy，V.C.，血液90(4)1345-1364(1997))。SCF通過結(jié)合其受體C-KIT來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，天然存在的SCF由骨髓基質(zhì)細(xì)胞合成，可能是跨膜形式或者可溶性形式，都具有生物活性。SCF總體結(jié)構(gòu)具有一個(gè)反向平行的四螺旋束折疊(Zhang，Z.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(14)7732-7(2000))。已知的SCF的氨基酸和核苷酸序列包括，其中有小鼠(Lyman，S.D.等，Cell75(6)1157-67(1993))，大鼠(Martin，F(xiàn).H.等，Cell63(1)203-11(1990))；貓(Dunham，S.P.和Onions，D.E.，DNA Seq.6(4)233-7(1996)；綿羊(Mclnnes，C.J.等，Cytokine 11(4)249-56(1999))；犬(Shin，I.S.等，J Vet Sci.2(3)159-66(2001))；和人(Martin，F(xiàn).H.等，supra)。M.D.等，生物化學(xué)雜志.27111301(1996)；Lu，H.S.等，生物化學(xué)雜志27111309(1996)；Langley，K.E.等，Arch.Biochem.Biophys.29521(1992)；Lev，S.等，Mol Cell Biol.13(4)2224-34(1993)；和Langley，K.E.等，Arch.Biochem.Biophys.311(1)55-61(1994)描述了重組的SCF和突變體。
“FLT-3配體”，也叫“FL”或者“SL細(xì)胞因子”或者“FMS相關(guān)酪氨酸激酶3配體”是一個(gè)結(jié)合在flt-3受體(也叫“ACD135”或者“Af1k2”)上的因子，一個(gè)酪氨酸激酶受體分子，通常發(fā)現(xiàn)于造血干細(xì)胞和原始祖細(xì)胞，包括CD34+細(xì)胞。它與其他因子如CD117(c-kit)協(xié)同作用刺激造血干細(xì)胞體外增殖，在體內(nèi)刺激祖細(xì)胞的增殖和動(dòng)員(Lyman，S.D.和Williams，D.E.，Curr.Opin.Hematol.2(3)177-81(1995))。全長的FLT-3配體(包含一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)和可溶的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域都具有生物活性。(Lyman，S.D.等，Cell 751157(1993)；Lyman，S.D.等，血液832795(1994))。優(yōu)先選擇的是，F(xiàn)LT-3配體是可溶性形式的，包括全長細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列?？扇苄缘腇LT-3的結(jié)構(gòu)揭示了兩個(gè)短鏈螺旋束的存在，這與SCF和G-CSF相似。(Savvides，S.N.等，Nat.Struct.Biol.7(6)486-91(2000))。已經(jīng)鑒定了FL的氨基酸和核苷酸序列，其中，小鼠(Rosnet，O.等，Oncogene.6(9)1641-50(1991)；貓(Yang S.和Sim，G.K.，DNA Seq.11(1-2)163-6(2000)；狗(Yang，S.，supra)；和人(Rosnet，O.等，血液.82(4)1110-9(1993))。Sudo，Y.等，血液893186(1997)和McClanahan，T.等，血液883371-3382(1996))描述了FLT-3配體的重組形式和突變體。
“促血小板生成素”或者“TPO”也叫巨核細(xì)胞生長和分化因子(MGDF)或者c-Mpl配體刺激巨核細(xì)胞的增殖和分化，因而在體內(nèi)和體外增進(jìn)血小板的生成。(見，例如，Lok，S.等，Stem Cells12(6)586-98(1994))，TPO通過結(jié)合特異的由原癌基因c-mpl編碼的細(xì)胞表面受體來發(fā)揮效應(yīng)。與其他細(xì)胞因子和生長因子一樣，TPO也是以出現(xiàn)一個(gè)反平行的四螺旋束折疊為特征(Feese，M.D.等，美國國家科學(xué)院院刊.101(7)1816-21(2004))。已知的促血小板生成素氨基酸和核苷酸序列，其中小鼠(Lok.S.，Nature369(6481)565-568(1994))；大鼠(Ogami，K.等，Gene158(2)309-10(1995))；和人(Foster，D.C.等，美國國家科學(xué)院院刊 91(26)13023-13027(1994)；Bartley，T.D.等，Cell 77(7)1117-1124(1994))。Souryi，M.等，Cell 631137-1147(1990)；Gurney，A.L.等，血液85(4)981-8(1995)；Wada，T.等，BiochemBiophys Res Commun.213(3)1091-8(1995)；Park，H.等，J BiolChem.273(1)256-61(1998)；和Jagerschmidt，A.等，Biochem.J.333(Pt 3)729-34(1998)描述了TPO的重組形式和突變體。
促紅細(xì)胞生成素或者EPO通過刺激不成熟的紅細(xì)胞增殖和成熟來調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成和巨核細(xì)胞發(fā)育。(see，例如，F(xiàn)isher，J.W.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.216(3)358-69(1997))。它通過結(jié)合EPO受體發(fā)揮它的效應(yīng)。盡管EPO合成的最初地點(diǎn)是腎臟皮質(zhì)，肝臟和骨髓里的巨噬細(xì)胞也能合成低水平的EPO。EPO結(jié)構(gòu)上與TPO相似，也以存在一個(gè)四螺旋束的為特征(Feese，M.D.等，美國國家科學(xué)院院刊101(7)1816-21(2004))。EPO的氨基酸和核苷酸序列已知，其中，小鼠(Shoemaker，C.B.和Mitsock，L.D.等，Mol CellBiol.6(3)849-58(1986))；大鼠(Nagao，M.等，Biochim.Biophys.Acta.1171(1)99-102(1992))；綿羊(Fu，P.等，Mol CellEndocrinol.93(2)107-16(1993)；狗(Wen，D.等，血液82(5)1507-16(1993))；牛(Suliman，H.B.等，Gene171(2)275-80(1996))；兔((Vilalta A.等，Biochem Biophys Res Commun.284(3)823-7(2001))；豬(Wen，D.等，supra；David，R.B.等，Domest Anim.Endocrinol.20(2)137-47(2001)；猴(Lin，F(xiàn).K.等，Gene.4 4(2-3)201-9(1986；))；和人(Lin，F(xiàn).K.等，美國國家科學(xué)院院刊82(22)7580-7584(1985)；Gasson，J.C.等，Nature315(6022)768-71(1985))。Barbone，F(xiàn).P.等，Nephrol DialTransplant.14 Suppl 280-4(1999)；Boissel，J.P.等，生物化學(xué)雜志268(21)15983-93(1993)。描述了EPO的重組形式和突變體。EPO可以用商品名Epogen(Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)，Epogin(Chugai Pharmaceuticals，JAPAN)，Eprex(Janssen-Cilag，Saunderton，UK)，Recormon(Roche，Basel，Switzerland)和Procrit(Ortho Biotech.，Bridgewater，NJ，USA)購得。
這里使用的突變體包括在細(xì)胞因子或者生長因子序列中取代，缺失，插入氨基酸序列，而突變體保留了與每種細(xì)胞因子或者生長因子相關(guān)的生物學(xué)活性。一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基的可以被替換而保留生物學(xué)活性，通常涉及用一個(gè)同源氨基酸替換一個(gè)氨基酸，這里也指“保守替換”在一些情況下也可以做非保守替換。同源氨基酸基于側(cè)鏈的大小和極化的程度分類，包括小的非極性(例如半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸)和小極性(例如，絲氨酸、苷氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨)中度極性(例如，酪氨酸，組氨酸，色氨酸)，大非極性(例如苯丙氨酸，蛋氨酸，亮氨酸、異亮氨酸、擷氨酸)。同源氨基酸也可以分為不帶電極性R組(苷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬氨酸、谷氨酰氨)酸性氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸)和堿性氨基酸(賴氨酸，精氨酸和組氨酸)保守突變體的例子包括一個(gè)疏水殘基之間的替換，如異亮氨酸，擷氨酸，亮氨酸或者蛋氨酸一個(gè)極性氨基酸換成另外一個(gè)極性氨基酸的替換，例如精氨酸換成賴氨酸，谷氨酸換成天冬氨酸，或者谷氨酸換成天冬氨酸，一個(gè)羥基氨基酸絲氨酸或者蘇氨酸換成另一個(gè)。
1到20個(gè)殘基的缺失，盡管在有些情況下，缺失可能會(huì)更大，尤其是當(dāng)細(xì)胞因子或者生長因子有在物理上分開的結(jié)構(gòu)或者/和功能結(jié)構(gòu)域。例如，一個(gè)FL突變體是截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，如上所述，當(dāng)從包含跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列中分離出來時(shí)保留了生物活性。另外，可能在氨基端或者羧基端加上氨基酸，或者在氨基酸序列中插入結(jié)構(gòu)域，例如在一段肽區(qū)域中加入在細(xì)胞因子或者生長因子中出現(xiàn)的α螺旋和β折疊，每個(gè)細(xì)胞因子和生長因子的突變體對(duì)于本領(lǐng)域重的技術(shù)人員來說將是很明顯的，上面給出了有代表性的文獻(xiàn)。
細(xì)胞因子和生長因子組合物用于增殖定型的骨髓祖細(xì)胞而限制了HSC增殖和限制了骨髓譜系終末分化細(xì)胞的產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子和生長因子的混合物的基本成分是SCF，F(xiàn)L和TPO。這種細(xì)胞因子和生長因子的混合物允許HSC的有限增殖和允許HSC和其他祖細(xì)胞分化成MP，其中包括CMP，GMP和MEP。
在進(jìn)一步的方面，在基本成分中加入細(xì)胞因子，包括IL-3，IL-6或者IL-11，或者是它們的組合。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子和生長因子混合物的成分是SCF、FL、TPO和IL-3，一種能有效增殖人祖細(xì)胞的細(xì)胞因子混合物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子和生長因子的混合物的混合物成分是SCF、FL、TPO和IL-6，一種能有效增殖小鼠骨髓祖細(xì)胞的細(xì)胞因子混合物。然而在另外一個(gè)實(shí)施方案中細(xì)胞因子和生長因子混和的成分是SCF、FL、TPO、IL-6和IL-11。
在需要骨髓譜系的更多成熟細(xì)胞增進(jìn)立即保護(hù)來對(duì)抗中性粒細(xì)胞減少癥和/或血小板減少癥的情況下，在前述的細(xì)胞因子混合物中加入細(xì)胞因子G-CSF或者GM-CSF。在缺乏G-CSF或者GM-CSF培養(yǎng)基中生長的起始階段之后可以做這件事情，以允許更加原始的骨髓祖細(xì)胞在促進(jìn)分化成骨髓譜系中的進(jìn)一步的祖細(xì)胞之前增殖。
可以理解為以上不同的細(xì)胞因子和生長因子的混合物，可以用于有選擇性地增殖特異的祖細(xì)胞。如果細(xì)胞用于治療單一情況或者多種情況的組合(例如中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥)需要優(yōu)先增殖特定的細(xì)胞群體，需要持續(xù)的治療效果。例如，CMP的出現(xiàn)將對(duì)中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥提供延長的改善，因?yàn)镃MP能分化成粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞。另一方面，與CMP和MEP相比一個(gè)細(xì)胞群體有顯著比例的GMP，將提供中性粒細(xì)胞減少癥改善，但是對(duì)于血小板減少癥具有較少的治療效果，因?yàn)镚MP分化為粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞但是不分化成巨核細(xì)胞。與此相反的是，與CMP和GMP相比，一個(gè)細(xì)胞群體有顯著比例的MEP，將對(duì)血小板減少癥提供改善，但是對(duì)中性粒細(xì)胞減少癥只有較少的治療效果，因?yàn)镸EP分化為紅細(xì)胞和和巨核細(xì)胞但是不分化為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
在增殖培養(yǎng)基中細(xì)胞因子和生長因子的量足以支持骨髓祖細(xì)胞增殖的量到在細(xì)胞培養(yǎng)物中特異的水平。有代表性的實(shí)施方案，足以支持增殖的SCF的量，通常用至少大約1到大約1000ng/ml的量，優(yōu)先選擇大約50到大約100ng/ml。足以支持增殖的FL量，通常用至少大約1到大約1000ng/ml的量，優(yōu)先選擇大約30到大約100ng/ml。足以支持增殖的TPO的量，通常用至少大約0.5到大約500ng/ml，優(yōu)先選擇大約5到大約50ng/ml的量。足以支持增殖的IL-1的量，通常用大約1到大約100ng/ml的量，優(yōu)先選擇大約10到大約50ng/ml的量。足以支持增殖的IL-3的量，通常用至少大約1到大約100ng/ml，優(yōu)先選擇大約10到大約50ng/ml足以支持增殖的的IL-11的量，通常用至少大約1到大約100ng/ml，優(yōu)先選擇大約10到大約50ng/ml。足以支持增殖的G-CSF的量，通常用至少大約1到大約1000ng/ml，優(yōu)先選擇大約10到大約100ng/ml的量。足以用于支持增殖的GM-CSF的量，通常用至少大約1到大約100ng/ml，優(yōu)先選擇大約10到大約100ng/ml的量。當(dāng)使用足以支持增殖的EPO的量，通常至少大約1到大約30U/ml，優(yōu)先選擇大約3到大約10U/ml。作為一個(gè)一般性的指導(dǎo)，細(xì)胞因子和生長因子的混合物將加強(qiáng)骨髓祖細(xì)胞的生長，而限制造血細(xì)胞的增殖。
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上實(shí)行骨髓祖細(xì)胞的增殖，補(bǔ)充上述的細(xì)胞因子和生長因子的混合物，足以支持骨髓祖細(xì)胞的增殖?；A(chǔ)培養(yǎng)基將包括氨基酸，碳源(例如丙酮酸鹽，葡萄糖)維生素，血清蛋白(例如白蛋白)，無機(jī)鹽，而價(jià)陽離子，抗生素，緩沖液和其他優(yōu)選的能支持骨髓祖細(xì)胞增殖的確定的成分適合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如但不僅限于此，RPMI培養(yǎng)基，Iscove′s培養(yǎng)基，最少基本培養(yǎng)基，DulbeccosModified Eagles培養(yǎng)基，和其他本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)基。(見，如U.S.Patent No.6,733,746)。市售的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括，舉例但不限于，StemlineTM(Sigma Aldrich)，StemSpanTM(Stem Cell Technologies，溫哥華，加拿大)，StemproTM(Life Technologies，Gibco BRL，Gaithersburg，MD，美國)HPGMTM((Cambrex，Walkersville，MD，美國)，QBSFTM(Quality Biological，Gaithersburg，MD，美國)，X-VIVO(Cambrex Corp.，Walkersville，MD，美國)和MesencultTM(StemCell Technologies，溫哥華，加拿大)。這些形式和其他培養(yǎng)基對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說很明顯。
細(xì)胞的最初群體與細(xì)胞因子和生長因子的混合物在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接觸，培養(yǎng)用于增殖骨髓祖細(xì)胞的群體。增殖從大約2到大約14天，優(yōu)選的是大約4到大約10天，更優(yōu)選的是大約4到大約8天和/或者直到獲得指示的倍數(shù)增殖和特征性的細(xì)胞群體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，最終的細(xì)胞培養(yǎng)制備物以CMP細(xì)胞群體為特征至少被增殖了大約0.5倍，大約1倍，大約5倍，大約10倍，大約20倍，或者優(yōu)選的是至少大約30倍。在最終培養(yǎng)物中，骨髓細(xì)胞群體中包含的CMP將占培養(yǎng)物中總細(xì)胞數(shù)量的至少大約0.5％，至少大約1％，至少大約2％，至少大約5％，至少大約10％。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，最終細(xì)胞培養(yǎng)制備物以GMP細(xì)胞群體為特征倍增殖了至少大約10倍，大約20倍，大約40倍，優(yōu)選的是至少大約80倍。在最終培養(yǎng)物中，骨髓細(xì)胞群體包含的GMP將占培養(yǎng)物總細(xì)胞的至少大約10％，至少大約20％，至少大約30％和優(yōu)選的是至少大約50％。因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，被擴(kuò)增的細(xì)胞群體優(yōu)先富集GMP細(xì)胞。
然而在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，最終細(xì)胞培養(yǎng)制備物以MEP細(xì)胞群體為特征被擴(kuò)增了至少大約0.1倍，大約1倍，大約2倍，大約5倍，優(yōu)選的是大約10倍。在最終培養(yǎng)物中，骨髓細(xì)胞群體中包含的MEP將至少占培養(yǎng)物中總細(xì)胞的至少大約0.5％，大約1％，大約2％，優(yōu)選的是至少大約5％。
通常，在最終培養(yǎng)物中以HSC為特征的細(xì)胞增殖將被限制到少于大約25倍，優(yōu)選的是少于大約15倍，更優(yōu)選的是少于大約10倍，最優(yōu)選的是少于大約5倍。通常，HSC細(xì)胞的數(shù)量將少于培養(yǎng)物中骨髓祖細(xì)胞的總數(shù)(例如，CMP，GMP和MEP)。
盡管因?yàn)閷?shí)際的原因而較少優(yōu)選，在一些情況下，會(huì)采用更不確定的包括飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基以接近發(fā)生造血作用的骨髓的微環(huán)境骨髓基細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞能產(chǎn)生支持發(fā)育的因子和在培養(yǎng)中維持造血細(xì)胞能用于骨髓祖細(xì)胞的增殖。也可以在營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)中添加上述的細(xì)胞因子和生長因子的混合物以促進(jìn)細(xì)胞增殖和特異的骨髓祖細(xì)胞發(fā)育?；跔I養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)在美國專利號(hào)5,879,940中有描述見Dexter，T.M.等，J.Cell Physiol.91335-344(1976)；Okubo，T.et.al.，Cell Structure and Function 25133-139(2000)；Shapiro，F(xiàn).等，J Hematother 5(6)655-62(1996))；Coutinho，L.H.等，″Clonal and long term bone marrow cultures using humanbone marrow，″in HaemotologyA Practical Approach，Testa，N.G.和Molineux，G.eds.，牛津大學(xué)，牛津，英國(1992)；引入的所有的出版物用作參考)。通常是，來自骨髓的單核細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(例如Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)直到基質(zhì)細(xì)胞形成。培養(yǎng)物然后接受輻射并與用于增殖的細(xì)胞群體一起播種。
Feugier，P.等，J Hematother Stem Cell Res 11(1)127-38(2002))描述了另外一種基于營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。這種技術(shù)用永生化的骨髓內(nèi)皮細(xì)胞修飾，來表達(dá)足以支持HSC和/或祖細(xì)胞生長的細(xì)胞因子和生長因子，將編碼特異細(xì)胞因子和生長因子的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到永生化的細(xì)胞系中，培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生能生成因子的內(nèi)皮細(xì)胞層。細(xì)胞然后接受輻射并且培養(yǎng)物與用于增殖的細(xì)胞一起播種。通常HSC和祖細(xì)胞在這種培養(yǎng)條件下弱貼壁或者不貼壁，這就允許增殖的細(xì)胞從內(nèi)皮細(xì)胞中洗出來。為了其中所述的目的，導(dǎo)入永生化細(xì)胞的細(xì)胞因子和生長因子的基因?qū)⒎磻?yīng)足以支持定型的骨髓祖細(xì)胞增殖的組合。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子基因選自那些編碼IL-1(例如IL-1β)，IL-3，IL-6，IL-11，G-CSF或者CM-CSF的基因。相似的是，生長因子基因選擇那些編碼SCF，F(xiàn)L，TPO和EPO的基因。
與上述相應(yīng)的是，在一個(gè)實(shí)施方案中，將包含編碼SCF，F(xiàn)L和TPO的表達(dá)載體導(dǎo)入營養(yǎng)細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中包含編碼另外的細(xì)胞因子，包括IL-3，IL-6或者IL-11的基因或者及其組合的基因的表達(dá)載體與生長因子組合一起使用。因此在一個(gè)實(shí)施方案中導(dǎo)入到營養(yǎng)細(xì)胞的基因編碼SCF，F(xiàn)L，TPO和IL-3。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，導(dǎo)入細(xì)胞的基因編碼SCF，F(xiàn)L，TPO和IL-6。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中基因編碼SCF，F(xiàn)L，TPO，IL-6和IL-11。選擇表達(dá)細(xì)胞因子和生長因子形式的基因序列，這些形式對(duì)用于增殖的細(xì)胞是有活性的，因此將通常反應(yīng)用于增殖的起始細(xì)胞的來源。例如，如果祖細(xì)胞是人源的，就用編碼人形式的細(xì)胞因子的核苷酸序列，當(dāng)用于增殖的細(xì)胞是鼠源的，則用編碼鼠或者其他嚙齒類形式的細(xì)胞因子的核苷酸序列。可以用的核苷酸序列包括那些本領(lǐng)域已知的的編碼重組形式或者突變體的序列。足以支持骨髓祖細(xì)胞增殖的各種其他的基因組合對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是明顯的。
用上述方法增殖的細(xì)胞不進(jìn)行純化可以使用，或者用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)分離成不同的細(xì)胞群體，例如免疫親和層析免疫吸附，流式細(xì)胞分選，或者其他上述的過程。優(yōu)選的是，用FACS分選或者免疫吸附。例如，一種FACS策略對(duì)于活細(xì)胞有初步選擇作用，這是基于特征性的前散光(細(xì)胞大小)和側(cè)散光(細(xì)胞密度)參數(shù)，對(duì)于骨髓祖細(xì)胞或者非骨髓細(xì)胞(例如Sca-1negc-kithi)的第二種選擇是細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。
分離的細(xì)胞群體可能包括分離的定型的骨髓祖細(xì)胞，分離的CMP，分離的GMP，分離的MEP，正如這里描述的。在一些情況下分離的非骨髓細(xì)胞群體通過從增殖培養(yǎng)物種除去定型骨髓細(xì)胞來制備。分離的細(xì)胞基本上是純的細(xì)胞群體，通常有至少大約50％，優(yōu)選的是至少大約75-80％，更優(yōu)選的是至少大約85-90％，最優(yōu)選的是至少大約95％的指明的細(xì)胞，這些細(xì)胞有特征性的細(xì)胞標(biāo)志物表型和分化潛能。
骨髓祖細(xì)胞的同種異體混合物
正如上面所討論的，為了提供足夠數(shù)量的細(xì)胞以用于治療能生產(chǎn)商業(yè)上可行的臨床產(chǎn)品，細(xì)胞群體優(yōu)選地是來自多個(gè)同種異體供體的同種異體骨髓祖細(xì)胞盡管存在對(duì)抗與受體MHC不匹配的治療細(xì)胞的免疫反應(yīng)的可能性目前的治療旨在提供臨時(shí)的保護(hù)，這與通過HSC的造血作用的重建提供的更為永久的保護(hù)相反。
顯著地，正如這里描述的，通過使用成熟淋巴細(xì)胞所沒有的分離的定型的骨髓祖細(xì)胞大大減少了GVHD的可能性。在一個(gè)實(shí)施方案中，這是通過在治療之前從增殖的細(xì)胞群體中除去這些細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。在一個(gè)可替換的優(yōu)選的實(shí)施方案中，這是通過從基本上純的CD34+CD90+HSC細(xì)胞群體開始來實(shí)現(xiàn)的。
同種異體細(xì)胞的混合物包括骨髓祖細(xì)胞的同種異體混合物分離的CMP混合物、分離的GMP混合物、分離的MEP混合物及其組合。對(duì)于移植受體的MHC來說，在混合物中的細(xì)胞可能是徹底匹配的異源，部分錯(cuò)配的同種異體或者徹底錯(cuò)配的同種異體細(xì)胞，可能來自相關(guān)的供體，通常是有同樣父系等位基因的兄弟姐妹或者是不相關(guān)的供體。決定MHC錯(cuò)配的程度將用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試。
例如，在人中至少有6種主要的MHC基因類別，在移植生物學(xué)種很重要。HLA-A，HLA-B，HLA-C編碼HLAI型蛋白質(zhì)，而HLA-DR，HLA-DQ，和HLA-DP編碼HLAII型蛋白質(zhì)。這兩類種的每一類基因是高度多態(tài)的，在人群種發(fā)現(xiàn)的大量的HLA等位基因或者突變體反映了這一情況。群體之間這些組的不同與對(duì)抗移植細(xì)胞的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度有關(guān)。確定MHC匹配程度的標(biāo)準(zhǔn)方法是檢測(cè)在HLA-B和HLA-DR，或者HLA-A，HLA-B和HLA-DR組內(nèi)的等位基因。因此在2個(gè)或者3個(gè)HLA組內(nèi)的測(cè)試分別由至少4，優(yōu)選地至少6個(gè)MHC抗原組成。
在血清學(xué)MHC測(cè)試中，抗每個(gè)HLA抗原類型的抗體與來自一個(gè)被測(cè)受試者(例如供體)的細(xì)胞反應(yīng)來確定與抗體反應(yīng)的一定MHC抗原的出現(xiàn)與否，這與其他被測(cè)受試者(例如受體)的反應(yīng)譜相比較?？贵w與MHC抗原的反應(yīng)通常通過與細(xì)胞一起孵育抗體來確定，然后加入補(bǔ)充物來誘導(dǎo)細(xì)胞裂解(例如淋巴細(xì)胞毒性測(cè)試)根據(jù)在反應(yīng)中裂解的細(xì)胞數(shù)量來測(cè)定反應(yīng)和評(píng)級(jí)(Mickelson，E.和Petersdorf，E.W.，Hematopoietic Cell Transplantation，Thomas，E.D.等eds.，pg 28-37，Blackwell Scientific，Malden，MA(1999)。其他基于細(xì)胞的方法包括用標(biāo)記的抗體的流式細(xì)胞術(shù)或者酶聯(lián)免疫技術(shù)
(ELISA)。
確定MHC類型的分子方法通常使用合成的探針和/或者引物來檢測(cè)編碼HLA蛋白質(zhì)的特異的基因序列，合成的寡核苷酸可以用于作為雜交探針來檢測(cè)與特定HLA類型相關(guān)的限制性片斷長度多態(tài)性(Vaughn，R.W.，Methods in Molecular BiologyMHC Protocols21045-60(2002))?；蛘撸梢杂靡镆栽鲋矵LA序列(例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者連接連反應(yīng))其產(chǎn)物可以通過直接DNA測(cè)序，限制性片斷長度多態(tài)性分析(RFLP)或者與一系列序列特異的寡核苷酸引物雜交來進(jìn)一步檢測(cè)(SSOP)。(Petersdorf，E.W.等，血液92(10)3515-20(1998)；Morishima，Y.等，Blood 99(11)4200-6(2002)；和Middleton，D.和Williams，F(xiàn).，Methods in MolecularBiologyMHC Protocols 21067-112(2002))。
“匹配的同種異體的”或者“不匹配的同種異源體”描述用于人MHC可以理解為對(duì)于各種動(dòng)物物種的MHC進(jìn)行相似的分析這些包括，舉例但不僅限于此，小鼠，大鼠(Gill，T.J.等，TransplantProc.27(2)1495-500(1995))，奶牛(Lewin，H.A，等，ImmunolRev.167145-58(1999)，狗(Wagner，J.L.等，J.Hered.90(1)35-8(1999))，貓(O′Brien，S.J.和Yuhki，N.，Immunol Rev.167133-44(1999))，豬(Chardon，P.等，Genet Sel Evol.32(2)109-28(2000))，馬(Kydd，J.等，Vet ImmunolImmunopathol.42(1)3-60(1994)，和靈長類(Heise，E.R.等，Genetica 73(1-2)53-68(1987))。
骨髓祖細(xì)胞的同種異體混合物可能在MHC上有各種程度的匹配，因此在一個(gè)實(shí)施方案中，臨時(shí)輸入和分化的祖細(xì)胞被從一個(gè)供體中分離出來，與用于提供更立即治療益處的細(xì)胞相比，這個(gè)供體與受體在MHC上具有更高匹配程度。例如CMP可能來自一個(gè)與受體的MHC徹底或者部分匹配的供體，而GMP和MEP可能來自不匹配的供體。其他組合對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說是很明顯的。
細(xì)胞的同種異體混合物可能用各種方式制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞來自不同的供體并在培養(yǎng)基中增殖之前混合。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，來自不同供體的骨髓祖細(xì)胞被分別增殖，在增殖之后混合以產(chǎn)生異源祖細(xì)胞的混合物。在另一方面，異源細(xì)胞的混合物通過從不同供體獲得由骨髓祖細(xì)胞制備而來的未增殖細(xì)胞，在輸入受體之前混合細(xì)胞。是否使用增殖的或者不增殖的細(xì)胞，這在這里的實(shí)施方案中有顯示，異源的骨髓祖細(xì)胞在保護(hù)造血作用受損的哺乳動(dòng)物受試者免受潛在致死的中性粒細(xì)胞減少癥和/或者血小板減少癥是有效的。
凍存骨髓祖細(xì)胞
令人奇怪的是，正像這里第一次顯示的那樣，這里描述的增殖的細(xì)胞群體能凍存以備將來使用并仍然能保持它們的功能。如上所述，在本領(lǐng)域中有很多培養(yǎng)基和方法用于冷凍細(xì)胞。通常細(xì)胞被濃縮，懸浮于加有冷凍保護(hù)劑和/或穩(wěn)定劑培養(yǎng)基中，冷凍并保存在0℃或者零度以下。在有的實(shí)施方案中，細(xì)胞被保存在-70℃或者更低例如-80℃或者液氮中或者液氮的蒸汽相中?？梢詫⒓?xì)胞保存在本領(lǐng)域中已知的任何冷凍保護(hù)劑中。例如冷凍保護(hù)劑可以是二甲基亞砜(DMSO)或者甘油。在一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基包括大約5-10％的DMSO，10-90％血清白蛋白，和50-90％的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，凍存培養(yǎng)基將包含7.5％的DMSO，大約42.5％的血清白蛋白，和大約50％的培養(yǎng)基?？梢詫⒓?xì)胞保存在本領(lǐng)域中已知的任何穩(wěn)定劑中。例如，穩(wěn)定劑可以是甲基纖維素或者血清。
在冷凍之前，將細(xì)胞分到幾個(gè)分開的容器中以創(chuàng)建細(xì)胞庫。這些細(xì)胞可以保存在，例如玻璃或者塑料的小管或者試管或者袋子中。將來當(dāng)需要使用細(xì)胞的時(shí)候，從細(xì)胞庫中選擇一部分凍存的細(xì)胞(來自一個(gè)或者多個(gè)容器)融解并使用。
治療
用這里描述的方法制備的細(xì)胞用于治療各種與疾病導(dǎo)致的造血缺陷有關(guān)的疾病或者骨髓破壞性治療。這里使用的治療指治療或者預(yù)防疾病的處理或者對(duì)疾病，不適或者不想要的情況的抑制性措施。治療包括以合適的形式在疾病癥狀發(fā)生之前或者/和在臨床表現(xiàn)或者疾病或情況的其他表現(xiàn)之后給予患者細(xì)胞來減少疾病的嚴(yán)重性，遏制疾病的發(fā)展或者消滅疾病。阻止疾病包括拖延或者推遲不適或者疾病癥狀的發(fā)生，優(yōu)選的是在那些對(duì)該疾病有增加的易感性的患者。
適合用這里描述的細(xì)胞治療的病癥包括中性粒細(xì)胞減少癥，一種以循環(huán)的中性粒細(xì)胞減少位特征的病癥和血小板減少癥，一種以在外周血中有低于正常水平的血小板為特征的癥狀。這兩種情況可能是獲得性或者遺傳性的疾病的結(jié)果。
有缺陷的造血干細(xì)胞發(fā)育已知產(chǎn)生低的中性粒數(shù)量其中包括，網(wǎng)狀細(xì)胞發(fā)育不全，F(xiàn)anconis′s氏貧血，Chediak-Higashi綜合癥和循環(huán)性中性粒細(xì)胞減少癥。對(duì)于血小板減少癥低的血小板水平出現(xiàn)于，其中Wiskott-Aldrich綜合癥，半徑減少的血小板減少癥(TAR)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡。中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥的獲得性形式發(fā)生于相似的情況下例如有血液系統(tǒng)惡性疾病、維生素缺乏、暴露于離子輻射、病毒感染(例如單核血球增多癥，CMV，HIV，等)、和各種細(xì)胞毒性藥物處理后。
為了本目的，可以預(yù)防性使用這些細(xì)胞來減少中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥的發(fā)生，和它們的相關(guān)并發(fā)癥。尤其是減輕用骨髓破壞性試劑治療的患者或者接受HSCT的患者種偶發(fā)性病原體的感染，在移植的情況下，骨髓細(xì)胞與干細(xì)胞移植同時(shí)使用或者移植后使用直到受體擁有HSC或者HSC開始恢復(fù)造血功能并足夠提升中性粒和血小板的水平。骨髓祖細(xì)胞的輸入增加了治療患者體內(nèi)的中性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞的數(shù)量。因此在中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥期間提供了臨時(shí)但是需要的保護(hù)。骨髓祖細(xì)胞群體的使用，與更加分化的中性粒細(xì)胞和血小板相比，提供了持續(xù)的保護(hù)，因?yàn)楣撬枳婕?xì)胞臨時(shí)的輸入和它們?cè)隗w內(nèi)的分化。
進(jìn)一步，包括CMP，GMP，和MEP混合物的細(xì)胞比任何一種單一細(xì)胞群體的輸入能產(chǎn)生更廣的治療效果。這來自于在細(xì)胞群體中更加分化的祖細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞和/或者血小板水平產(chǎn)生的快速效應(yīng)，而更加原始的定型的骨髓祖細(xì)胞隨著時(shí)間推移輸入和發(fā)育，在分化的細(xì)胞變少后來提供需要的中性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞。用包括祖細(xì)胞混合物的細(xì)胞群體來輸入可能對(duì)于已經(jīng)患有中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥的患者來說是適合的，而輸入分離的細(xì)胞群體可能適合于中性粒細(xì)胞和血小板水平還沒有降到臨界水平的患者的預(yù)防，需要指出的是治療可能提供一個(gè)在外周血細(xì)胞數(shù)量或者ANC上能檢測(cè)到的增加，這個(gè)增加并不是成功的暫時(shí)的輸入或者效率的可靠的指示。因此其他測(cè)量方法，例如感染率減少和/或者生存率的增加可以用于確定治療的效果。
達(dá)到治療效果所需的細(xì)胞數(shù)量通過經(jīng)驗(yàn)和為特定目的制定的傳統(tǒng)程序來確定。通常，為治療目的的細(xì)胞輸入，給予藥理上有效的細(xì)胞劑量。藥理上有限的數(shù)量或者藥理上有效的劑量是足以產(chǎn)生所需生理效應(yīng)的數(shù)量，或者能達(dá)到所需結(jié)果的數(shù)量，特別是用于治療不適或者疾病情況，包括減少或者消除一種或者多種癥狀或者不適或者疾病的表現(xiàn)作為例子，給患有中性粒細(xì)胞減少癥的患者輸入細(xì)胞不僅對(duì)當(dāng)下面的情況被根除或者改善時(shí)提供治療好處，而且對(duì)當(dāng)患者報(bào)告與疾病相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性或者持續(xù)性減輕時(shí)也提供治療好處。治療好處還包括阻止或者減慢下列疾病或者不適的發(fā)展，不管改進(jìn)是否實(shí)現(xiàn)。藥理上有效的劑量，正如上面定義的那樣，也將適用于與細(xì)胞一起用的化合物，這在下面會(huì)做進(jìn)一步的描述。
用于輸入的細(xì)胞包括增殖后沒有純化的細(xì)胞群體或者分離的細(xì)胞群體，這些群體具有確定的細(xì)胞標(biāo)志物表型和特有的分化潛能，如上所述。增殖的細(xì)胞來自單一受試者而對(duì)于受體來說細(xì)胞是自體的或者異源的。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，治療細(xì)胞包括分離的定型的骨髓祖細(xì)胞。在另外一個(gè)實(shí)施方案中細(xì)胞包括分離的CMP，分離的GMP，分離的MEP，或者其組合物。在其他實(shí)施方案中，用于輸入的細(xì)胞包括如這里描述的那樣制備的非骨髓細(xì)胞。
需要理解的是直接從供體受試者分離而沒有在培養(yǎng)中增殖的細(xì)胞可以像增殖的細(xì)胞一樣用于同樣的治療目的。優(yōu)選的是分離的細(xì)胞是基本上純的細(xì)胞群體。這些未增殖的細(xì)胞可能是自體的，這里用于輸入的細(xì)胞獲得自受體，例如用細(xì)胞緩釋劑處理之前。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未增殖的細(xì)胞是受體的異源性細(xì)胞，這里細(xì)胞與受體的MHC具有徹底匹配或者部分匹配的或者完全不匹配。如上所述，分離的未增殖細(xì)胞優(yōu)選地來自不同供體，以提供同種異體骨髓細(xì)胞的混合物。
將細(xì)胞移植到合適的宿主中通常本領(lǐng)域中通常使用的方法完成。優(yōu)選的輸入方法是靜脈輸入。輸入細(xì)胞的數(shù)量將考慮的因素例如性別，年齡，體重，疾病或者不適的類型不適的階段，需要的細(xì)胞在細(xì)胞群體中的比例(例如細(xì)胞群體的純度)和能產(chǎn)生治療好處所學(xué)的數(shù)量。通常輸入的增殖后的細(xì)胞從每千克大約1×104到大約1×105個(gè)細(xì)胞，從每千克大約1×105到大約10×106個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選的是每千克體重1×106到大約5×106個(gè)細(xì)胞，或者需要的化更多。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是在藥理上可接受的載體中大約1×109到5×109個(gè)細(xì)胞?？梢砸淮涡暂斎爰?xì)胞或者通過連續(xù)輸入超過一個(gè)確定的時(shí)間段以產(chǎn)生治療效果，當(dāng)治療涉及連續(xù)輸入時(shí)可能會(huì)輸入不同的細(xì)胞群體。一個(gè)在藥理上可接受的載體，正如下面進(jìn)一步描述的那樣，可能被用于將細(xì)胞輸入到患者體內(nèi)。這些將通常包括，例如緩沖鹽(例如磷酸緩沖鹽)或者不加補(bǔ)充物的基本細(xì)胞培養(yǎng)基或者是本領(lǐng)域已知的其他培養(yǎng)基。
輔助治療
可以用細(xì)胞，增殖的或者未增殖的進(jìn)行很多輔助性治療，如上所述。對(duì)于治療中性粒細(xì)胞減少癥和相關(guān)情況，增殖的細(xì)胞與其他試劑和化合物組合使用，這些試劑和化合物能夠增強(qiáng)輸入細(xì)胞的治療效應(yīng)或者由中性粒細(xì)胞減少癥引起的治療并發(fā)癥，一方面，輔助治療包括，其中，抗真菌藥物，抗細(xì)菌藥物，抗病毒藥物。這些藥物的使用也適用于血小板減少癥，或者預(yù)防以減少感染的發(fā)生，或者對(duì)付即將發(fā)生的能導(dǎo)致血小板破壞的感染。
一方面，輔助性地給予的藥物是抗真菌藥物。真菌感染是患中性粒細(xì)胞減少癥患者的主要死因之一，是接受骨髓破壞性治療和HSCT的患者的顯著問題。推遲輸入的受體患有GVHD的患者通常中性粒細(xì)胞減少癥延長。因此，真菌感染的風(fēng)險(xiǎn)很高。真菌感染的類型多變，其中包括，假絲酵母病(例如，克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、白色假絲酵母、熱帶假絲酵母)曲霉菌病((例如，煙曲霉菌、黃曲霉菌)，毛霉菌病(例如rhizobium、arrhizus、absidia corymbifera、rhizomucor pusillus)，隱球菌病，莢膜組織胞漿菌和粗球孢子菌。
用于輔助治療的抗真菌藥物通常是合成的抗真菌藥物。這種類型的一個(gè)有用的抗真菌藥物是來自多烯大環(huán)內(nèi)酯物抗生素的兩性霉素B，各種形式的兩性霉素B均可獲得，包括與脫氧膽酸鹽形成化合物，與膽甾醇磺酸鹽形成的膠體狀懸浮物，包裹在由大豆蛋黃素制成的脂質(zhì)體中，膽固醇和DSPG(distearoylphosphatidylglycerol)。本領(lǐng)域知道的其他形式。
另一種抗真菌藥物是氟胞嘧啶，是一種氟化嘌呤嘧啶。氟胞嘧啶被真菌脫氨產(chǎn)生5-氟尿嘧啶，一種抗代謝和DNA合成移植劑。氟胞嘧啶通常用于感染隱球菌和假絲酵母盡管也單獨(dú)使用，氟胞嘧啶通常用于與兩性霉素B組合使用。
咪唑類和三唑類代表了一個(gè)廣范圍的基于唑類的抗真菌藥物。
據(jù)信咪唑和三唑類抑制固醇14-β-去甲基酶，導(dǎo)致麥角固醇合成受損和基于細(xì)胞膜活性的紊亂，例如電荷轉(zhuǎn)運(yùn)?；谶蝾惖目拐婢苡行?duì)抗特定類型的念球菌，例如白色假絲酵母，光滑念珠菌和新型假絲酵母。列舉的適合系統(tǒng)給藥的唑類抗真菌藥物包括，其中，酮康唑、依他康唑、氟康唑、宜康唑、伏立康唑和特康唑。
除真菌感染外，患有中性粒細(xì)胞減少癥的患者也易患多種細(xì)菌病原體感染，接受骨髓破壞性治療和HSCT的患者具有高細(xì)菌感染率，包括格蘭氏陽性菌(例如鏈球菌和金黃色葡萄球菌和格蘭氏陰性菌(例如大腸桿菌和假單胞菌)Septecemia是一種常發(fā)生的情況。另外，輸入推遲和對(duì)抗包裹的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的恢復(fù)受損例如肺炎鏈球菌或者嗜血桿菌流感增加了患有GVHD的移植受體的死亡率。
輔助性抗細(xì)菌治療能用任何已知的適用于特定細(xì)菌病原體的抗生素。這些包括廣譜抗生素和更加靶向性的抗菌化合物。各種類型的抗菌藥物適合于增殖的祖細(xì)胞，包括，舉例但不僅限于，喹諾酮類和氟喹諾酮類，β-內(nèi)酰氨抗生素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、和各種它們的cogeners。有代表性的喹諾酮類化合物包括環(huán)丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星、洛美沙星、和莫西沙星。有代表性的β-內(nèi)酰胺抗生素包括青霉素(例如青霉素G、青霉素V)、氨卞青霉素、羧芐青霉素、甲氧西林，青霉烯類、和頭孢霉素(例如，先鋒霉素、頭孢孟多、頭孢克洛、頭孢尼西、頭孢替坦、頭孢塞肟、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢吡肟)。有代表性的氨基糖苷類包括新霉素，鏈霉素，卡那霉素，慶大霉素，托普霉素，氨丁卡霉素，乙基西梭霉素。有代表性的大環(huán)內(nèi)酯物包含紅霉素，克拉霉素和阿齊霉素。其他抗生素對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說是很明顯的。
在重度骨髓抑制的患者和HSCT中病毒感染也是問題。通常，病毒感染危險(xiǎn)增加來源于骨髓破壞性治療帶來的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫受損，很多這樣的感染由存在于血清陽性患者或來自血清陽性供體的細(xì)胞中的潛伏病毒激活引起。常見的病毒包括，其中巨細(xì)胞病毒，單純皰疹病毒，帶狀皰疹病毒，皰疹病毒-6、埃-巴二氏病毒，腺病毒等。作為細(xì)胞輸入的輔助治療，選擇的抗病毒化合物是那些適合于患者常見病毒的化合物。有用的抗病毒化合物包括，舉例但不僅限于此如，無環(huán)鳥苷、西多福韋、更昔洛韋、碘苷、噴昔洛韋、纈更昔洛韋、伐昔洛韋、阿糖腺苷、金剛烷胺、金剛乙胺、扎那米韋、福米韋生、咪喹莫特、和利巴韋林。對(duì)抗反轉(zhuǎn)錄病毒的療法包括，其中核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(例如齊多夫定、去羥肌苷、司他夫定、扎西他濱、lamividudine)，非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(例如nevirapine、efavirenz、delvirudine)和蛋白酶抑制劑(例如saquinivir、茚地那韋、利托那韋、奈非那韋、安瑞那韋和利托那韋)。
抗真菌，抗細(xì)菌和抗病毒藥物可以用做預(yù)防措施以減少感染的發(fā)生，或者在疾病出現(xiàn)時(shí)使用。預(yù)防通常用于免疫抑制患者中常見的真菌感染和血清陽性患者中的病毒感染或者血清陽性移植供體。相應(yīng)地，用于治療目的的實(shí)施方案包括組合增殖的或者分離的骨髓祖細(xì)胞和抗真菌，抗細(xì)菌和抗病毒化合物。
血小板減少癥和相關(guān)情況的另外一種輔助治療包括輸入血小板作為臨時(shí)措施來恢復(fù)血小板數(shù)量到安全水平，輸入進(jìn)行到輸入的細(xì)胞恢復(fù)血小板產(chǎn)生。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，輔助性給予的藥物是細(xì)胞因子或者生長因子，這些因子能促進(jìn)分化和終分化的骨髓細(xì)胞動(dòng)員。尤其是粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞樣細(xì)胞。為了增進(jìn)粒細(xì)胞發(fā)育，可以用細(xì)胞因子C-CSF和GM-CSF。G-CSF能有效加速輸入和HSCT中中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生。在另外一個(gè)實(shí)施方案中細(xì)胞因子或者生長因子是促血小板生成素。輸入TPO能促進(jìn)移植祖細(xì)胞的輸入和促進(jìn)巨核細(xì)胞和血小板的發(fā)育(Fox，N等，J.Clin.Invest.110389-394(2002)；Akahori，.H.等，Stem Cells 14(6)678-689(1996))。
多種載體和賦形劑給藥途徑可以用于輔助性治療。這對(duì)于本領(lǐng)域中技術(shù)人員是明顯的。代表性的公式化技術(shù)被教授，其中，治療藥物科學(xué)和實(shí)踐，第19版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)和藥學(xué)賦形劑手冊(cè)，第三版，Kibbe，A.H.ed.，華盛頓特區(qū)，美國藥學(xué)學(xué)會(huì)(2000)；因此以它們的完全形式插入供參考。
藥物成分通常包含一個(gè)藥學(xué)上可接受的載體，一個(gè)藥理上有效數(shù)量的化合物或者其混合物或者是它們合適的鹽。藥物成分的形式可以是粉末、顆粒溶液、混懸劑、氣霧劑、固體、丸劑、片劑、膠囊、凝膠、局部用乳劑、栓劑、透皮的藥膏和本領(lǐng)域已知的其他形式。
這里使用的藥學(xué)上可接受的載體包括在形成藥物成分中任何標(biāo)準(zhǔn)的為本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員知道的藥學(xué)上可接受的載體。因此，化合物從它們本身來說，例如作為藥學(xué)上可接受的鹽出現(xiàn)，或者作為耦合物，可以制備為藥學(xué)上可接受的稀釋藥形式，例如，鹽、磷酸鹽緩沖液(PBS)、無水乙醇、或者葡萄糖溶液、甘露醇、葡聚糖、丙二醇、油(例如植物油、動(dòng)物油、合成油等)，微晶纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、硬酯酸鎂、磷酸鈣、膠、聚山梨醇酯80等在合適的賦形體中以油的形式。
藥物成份通常進(jìn)一步包括一種或者多種緩沖液(例如中性緩沖鹽或者磷酸緩沖鹽)，碳水化合物(例如，葡萄糖，甘露糖，蔗糖或者葡聚糖)，甘露醇，蛋白質(zhì)，多肽或者氨基酸，例如苷氨酸，抗氧化劑(例如抗壞血酸，焦亞硫酸鈉，丁基羥基甲苯，丁基羥基苯甲醚等)抑菌劑，螯合劑例如EDTA或者谷胱苷肽，能形成等滲，低滲或者與受體血液微弱低滲的溶質(zhì)、懸浮劑，增稠劑，保護(hù)劑，增味劑，甜味劑和合適的顏色成分。
在成分中可能使用本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知的任何合適的載體。載體的類型通常依賴于輸入的模式而變化。可以為為任何合適的給藥方式形成治療成分例如包括，口，鼻，粘膜，直腸，陰道，局部，靜脈，腹膜內(nèi)的，皮層內(nèi)的，皮下和肌肉注射。
對(duì)于注射給藥，可以將成分以可注射劑量的溶于生理上可接受的稀釋液中的物質(zhì)的溶液或者懸浮液與藥物載體給藥。載體可以是無菌液體例如無菌的自來水熱源、油、鹽、甘油、聚乙二醇或者乙醇。另外，輔助物質(zhì)，例如加濕或者乳化劑、表面活性劑、pH緩沖液物質(zhì)等可以出現(xiàn)在成分里。藥物組分的成分是那些石油、動(dòng)物、蔬菜或者合成來源的，例如花生油的無水成分、大豆油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯和十四烷酸異丙酯。
這里描述的藥物成分可能出現(xiàn)在單劑或者多劑容器中，例如密封的安瓶或者小管。這種容器通常用一些方法密封以保持無菌和制劑直到使用時(shí)穩(wěn)定。通常，形成物可以以懸浮液或者溶液或者或者乳狀液儲(chǔ)存于油的或者無水的容器中，如上所述?；蛘?，藥物成分可以儲(chǔ)存在凍干條件下，這樣只需要在使用前加入無菌液體載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供的藥物成分包括凍存于一個(gè)合適的凍存培養(yǎng)基中的患者增殖的骨髓祖細(xì)胞，如果需要輸入患者體內(nèi)則融解和懸浮細(xì)胞。
輸入宿主的數(shù)量依賴于給藥的是什么，給藥的目的，例如預(yù)防或者治療，宿主的狀態(tài)，給藥的方式，給藥的數(shù)量、給藥的間隔等因素而變動(dòng)。這些可以由本領(lǐng)域中的技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定?？赡芤鶕?jù)治療反應(yīng)的程度做調(diào)整。確定合適的劑量需要考慮的因子包括，但不僅僅限于受試者的大小和體重，年齡和性別，癥狀的嚴(yán)重性，疾病的階段，傳遞藥物的方式，藥物的半衰期和藥物的有效性。要考慮的疾病的階段包括疾病是極性的還是慢性的，復(fù)發(fā)還是緩和階段和疾病的進(jìn)程。
為治療上有效的總量確定劑量和給藥的時(shí)間是本領(lǐng)域中的普通人所熟練掌握的。例如，可以從細(xì)胞培養(yǎng)或者其他體外實(shí)驗(yàn)來估計(jì)起始有效劑量，在動(dòng)物模型中建立了劑量以產(chǎn)生循環(huán)濃度或者組織濃度，包括用細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)確定的IC50。
另外，通常通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和/或者實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來確定毒性或者治療效果通常通過確定LD50(被測(cè)群體50％的致死劑量)和ED50(對(duì)被測(cè)群體50％的治療有效性)，在標(biāo)準(zhǔn)的參考工作里可以發(fā)現(xiàn)指導(dǎo)，例如Goodman & Gilman′s治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)，第十版。(Hardman，J.G.等，eds.)McGraw-Hill，紐約，NY(2001)。
這項(xiàng)發(fā)明的目的，選擇給藥的方法依賴于被治療的情況，受試者抗體的形式和藥物組成。很多途徑可以做到治療組分的輸入，包括但不限于、皮下、靜脈、腹腔內(nèi)、肌肉和可能直接注射到特定的器官，例如，脾或者骨髓，盡管優(yōu)選系統(tǒng)的注射。藥物組分的輸入可以通過單一途徑，或者經(jīng)常是多種途徑。
可以每天輸入成分一次，或每天幾次，或者一天多次，這取決于，其中，治療的跡象和開藥方內(nèi)科醫(yī)生的判斷。
試劑盒
這里描述的成分的其他實(shí)施方案是試劑盒，包括增殖或者/和分離的骨髓祖細(xì)胞，細(xì)胞因子和生長因子(例如，G-CSF，GM-CSF，TPO)和/或者輔助形的治療化合物。試劑盒通常伴有商標(biāo)，包括任何文字或者記錄材料，可以是電子或者計(jì)算機(jī)可讀形式的(例如，盤，光盤，記憶芯片或者磁帶)提供了試劑盒內(nèi)容使用的指導(dǎo)或者其他信息。
實(shí)施例實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)方法
由小鼠制備HSC細(xì)胞。為了獲得小鼠骨髓細(xì)胞，麻醉動(dòng)物，取出股骨/脛骨，去除肌肉。用缽和杵將骨頭研磨成漿，骨髓用尼龍篩過濾，然后用1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。細(xì)胞懸浮于1ml的ACK溶液(0.3M NH4Cl，0.2M KHCO3，MiliQ過濾水)中，冰上放置3-4分鐘，然后加滿染色介質(zhì)(包含2％FCS和2mM EDTA的HANKs鹽緩沖液，w/o鈣，w/o鎂，w/o酚紅)洗滌，離心、過濾細(xì)胞，懸浮于染色介質(zhì)中，加入小鼠IgG(1∶50稀釋1mg/ml儲(chǔ)液，Sigma，StLouis MO)。冰上孵育10-15分鐘后，與按照終體積為100μl體積/小鼠染色介質(zhì)中的10ul體積/小鼠的CD117微珠(Miltenyi Biotech，Auburn CA)混合，冰上孵育25分鐘。洗滌細(xì)胞，以每只小鼠～1ml的終體積懸浮于染色介質(zhì)中，然后通過尼龍篩子過濾。根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)用預(yù)先設(shè)定的程序以AutoMACs(Miltenyi，Auburn，CA)富集細(xì)胞。
富集后，細(xì)胞以1×108/ml懸浮于染色介質(zhì)中，以合適的濃度加入下列直接綴合的抗體(eBioscience，San Diego，CA)Sca-1別藻藍(lán)蛋白(APC)，c-kit R-藻紅蛋白-cyanine 7 tandem(PE-Cy7)，Thy-1.1異硫氰酸熒光素(FITC)，譜系(CD3，CD4，CD5，CD8，B220，mac-1，Gr-1和Ter119)R-藻紅蛋白(PE)。
冰上孵育細(xì)胞25分鐘，洗滌，離心重新懸浮在染色介質(zhì)中。加入碘化丙啶(PI)以排除死細(xì)胞。通過FACS分離小鼠KTLS-HSC，c-kithighThylowSca-1poslineageneg。
細(xì)胞培養(yǎng)和增殖。從BA(H2kb)小鼠中篩選Linneg/LowKTLS-HSC，并以每孔500ul包含下列細(xì)胞因子和生長因子組合的無血清培養(yǎng)基c-KitL，F(xiàn)L，TPO和IL-6(X-Vivo15基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CambrexBioscience，MD)；penstrep(100x)，glutamax(100x)，2-mercaptoethanol(5×10-5M)，c-KitL(50ng/ml)，F(xiàn)L(30ng/ml)，TPO(5ng/ml)，和IL-6(10ng/ml)(Biosource，Camarillo，CA和R&D Systems，Minneapolis，MN)。將細(xì)胞以每孔10000個(gè)細(xì)胞種于24孔板中。培養(yǎng)細(xì)胞7天以獲得MPc(培養(yǎng)衍生的MP)，在第二天每孔加500ul培養(yǎng)基，第4天的時(shí)候用新鮮培養(yǎng)基置換一半的培養(yǎng)基。第5天，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到6孔板里，加入1ml新鮮培養(yǎng)基。第7天，收集培養(yǎng)的細(xì)胞取出兩小份細(xì)胞分析。細(xì)胞等份與30000個(gè)珠子混合并染色以分析MP(CMP/GMP/MEP)和HSC含量。另外，用苔盼蘭染色并在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。分析結(jié)果為計(jì)算增殖倍數(shù)和HSC和MP(CMP/GMP/MEP)總細(xì)胞數(shù)提供信息。
分析體外培養(yǎng)物以確定骨髓細(xì)胞的類型。通過在1ml染色培養(yǎng)基(SM)中加入4-5滴珠子(Spherotech，Libertyville，IL)來制備6.7μM珠子的懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板和苔盼蘭(1∶10稀釋)對(duì)珠子計(jì)數(shù)。當(dāng)使用該懸浮液歷時(shí)多天時(shí)，將珠子以每毫升＞2×106個(gè)珠子/ml的濃度儲(chǔ)存并在使用前每天計(jì)數(shù)，用移液器向每個(gè)孔中將要分析的細(xì)胞加入20K珠子。在將珠子加入孔前在每個(gè)樣品之間渦旋珠子懸浮液，如果孔要被分成多個(gè)樣品，例如3個(gè)樣品，加入合適數(shù)量的珠子(即，對(duì)于正常樣品＝60K/孔，3×20K個(gè)珠子)，因此每個(gè)樣品將大約有20K個(gè)珠子的終點(diǎn)量用于分析。
用IL7R染色在增殖細(xì)胞群體中的小HSC。每個(gè)孔中移出細(xì)胞，洗滌，然后轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的圓錐形的FACS管中。每分鐘1100轉(zhuǎn)，離心細(xì)胞5分鐘，除去上清。加入50ul的封閉抗體(大鼠IgG和小鼠IgG1∶50)，孵育10分鐘，然后向每個(gè)管中加入50-100μl的CD117-生物素(2倍濃度的)。然后在冰上避光孵育20分鐘，用2-3ml的SM洗滌，離心，用50-100ul的下列合適濃度的抗體溶液重新懸浮(eBioscience，圣地亞哥，加利福尼亞州)鏈霉親和素瀑布藍(lán)(Molecular Probes，Eugene，OR)，Sca-1別藻藍(lán)蛋白(APC)，Thy-1.1異硫氰酸熒光素(FITC)，IL-7RD R-藻紅蛋白(PE)和B220，Mac-1，GR-1 R-藻紅蛋白-cyanine 7 tandem(PE-Cy7)。接著在冰上孵育25分鐘，洗滌細(xì)胞，離心并在包含PI的染色培養(yǎng)基中懸浮。用FACS分析細(xì)胞中的HSC。
染色增殖的細(xì)胞群體中的mHSC，不用IL7R染色。從每個(gè)孔中移出細(xì)胞，洗滌然后轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的圓錐形的FACS管中，在1100轉(zhuǎn)/分鐘離心細(xì)胞5分鐘，除去上清。加入50μl封閉抗體(大鼠IgG和小鼠IgG1∶50)然后加入50-100μl抗體溶液，用合適濃度的下列抗體(eBioscience，San Diego，CA)Sca-1別藻藍(lán)蛋白(APC)，Thy-1.1異硫氰酸熒光素(FITC)，c-kit藻紅蛋白-cyanine 7tandem(PE-Cy7)，B220，Mac-1，GR-1 R-藻紅蛋白。接著冰上孵育25分鐘，洗滌細(xì)胞，離心，用包含PI的染色培養(yǎng)基懸浮。用FACS分析細(xì)胞中的HSC。
染色在培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群體中的骨髓祖細(xì)胞用如上所述的染HSC細(xì)胞的方法制備細(xì)胞。在用50ul的封閉抗體孵育后(大鼠IgG和小鼠IgG 1∶50)，向每管中加入50-100ul的CD-117生物素(2倍濃度)，接著在冰上避光孵育20分鐘。用2-3ml SM洗滌細(xì)胞，離心，然后用50-100μl的合適濃度的抗體溶液懸浮鏈霉親和素瀑布藍(lán)(Molecular Probes，Eugene，OR)，sca-1別藻藍(lán)蛋白(APC)，CD34異硫氰酸熒光素(FITC)，2.4G2(FcDR)R-藻紅蛋白，和B220，Mac-1，GR-1藻紅蛋白-cyanine 7 tandem(PE-Cy7)。(eBioscience，SanDiego，CA)。像HSC分析那樣制備細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。
染色培養(yǎng)的增殖的細(xì)胞以確定成熟的祖細(xì)胞群體亞組用如上所述的方法處理細(xì)胞。用封閉抗體孵育以后，向每管中加入50-100ul的CD3生物素，CD4生物素，和CD8生物素(2倍濃度的)在冰上避光孵育20分鐘。用2-3ml染色培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，離心然后用50-100ul抗體溶液懸浮細(xì)胞鏈霉親和素瀑布藍(lán)(MolecularProbes，Eugene，OR)，B220(FITC)，Ter119 R-藻紅蛋白(PE)和Mac-1，GR-1 R-藻紅蛋白-cyanine 7 tandem(PE-Cy7)(eBioscience，San Diego，CA))。在冰上孵育25分鐘后，用如前所述的方法制備細(xì)胞做FACS分析。
小鼠骨髓祖細(xì)胞分離-譜系排除。用上面所述的方法處理股骨和脛骨，用1ml染色介質(zhì)懸浮細(xì)胞。加入用于封閉的大鼠和小時(shí)免疫球蛋白IgG(1∶50)，將混合物在冰上孵育10-15分鐘，計(jì)數(shù)細(xì)胞并以每毫升染色介質(zhì)中培養(yǎng)108個(gè)細(xì)胞，染色介質(zhì)中具有預(yù)先確定稀釋倍數(shù)的下列生物素標(biāo)記的抗體D3，CD4，CD5，CD8，CD127，Ter119，Thy-1.1，和GR-1。在冰上孵育細(xì)胞25分鐘，洗滌，離心，然后以每只小鼠40ul鏈霉生物素珠子的量懸浮細(xì)胞。(Miltenyi，Auburn，CA)。加入染色介質(zhì)到終濃度到每只小鼠100D1，冰上孵育20分鐘，洗滌細(xì)胞兩次然后以每毫升染色介質(zhì)含108個(gè)細(xì)胞懸浮細(xì)胞，然后通過尼龍膜過濾。用AutoMacs(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)排除譜系陽性細(xì)胞，因?yàn)槊總€(gè)生產(chǎn)商的說明書用敏感的排除方式。計(jì)數(shù)后，以每毫升包括適合濃度的下列抗體的染色介質(zhì)中1×108個(gè)細(xì)胞懸浮細(xì)胞streptavidin藻紅蛋白-cyanine 5 tandem(PE-Cy5)，Sca-1別藻藍(lán)蛋白(APC)，CD34異硫氰酸熒光素(FITC)，2.4G2 R-藻紅蛋白(PE)和c-kit R-藻紅蛋白-cyanine 7 tandem(PE-Cy7)(Pharmingen and eBioscience，San Diego，CA)。細(xì)胞與抗體在冰上孵育25分鐘后洗滌，離心并用包含PI的染色介質(zhì)懸浮。使用下列FACS分選策略CMP是基于lineageneg/loc-kitposSca-1negCD34pos2.4G2low分選的；GMP是基于lineageneg/loc-kitposSca-1negCD34pos2.4G2pos分選的；和MEP是基于lineageneg/loc-kitposSca-1negCD34low2.4G2low分選的。
煙曲霉分生孢子的生長和嫁接和真菌負(fù)荷分析將凍存的孢子儲(chǔ)備物中的一環(huán)孢子放在薩布羅葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)皿的中間，密封培養(yǎng)皿在37℃孵育2-3天，定期檢查任何污染的標(biāo)志。2-3天后在培養(yǎng)皿上形成一層黑色孢子。用5ml包含0.05％Tween80的PBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿，輕輕刮培養(yǎng)皿直到孢子分散到溶液中。用無菌的金屬網(wǎng)過濾分生孢子懸浮物制備孢子儲(chǔ)備物以除去菌絲。溶液因?yàn)殒咦佣屎谏Ｃ亢辽心馨ǘ噙_(dá)108個(gè)分生孢子。孢子種儲(chǔ)存于4℃。為了測(cè)定孢子滴度，在SDA培養(yǎng)皿上用PBS/Tween80進(jìn)行系列稀釋。過夜孵育之后，檢查培養(yǎng)皿上的克隆數(shù)。為了長期保存孢子，一體積的收獲的孢子儲(chǔ)存物與一體積的50％甘油混合并儲(chǔ)存于-80℃。
用每毫升包含1000個(gè)分生孢子的孢子溶液將孢子注射入小鼠(像在薩布羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)皿上稀釋一樣)工作孢子溶液(100μl)通過尾靜脈注射法注射到感興趣的小鼠中，在預(yù)防研究中一般是在致死輻射和HSC和/或者M(jìn)P重建后8天。給藥后，100μl小份的剩余孢子溶液被涂在薩布羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)皿上，在37℃下孵育。第二天計(jì)數(shù)克隆以證實(shí)在注射中有要求數(shù)量的活性分生孢子。
真菌負(fù)荷分析。用吸入異氟烷麻醉后，通過尾靜脈注射曲霉菌。處死小鼠收集肺供檢查。在薩布羅葡聚糖瓊脂培養(yǎng)皿上培養(yǎng)肺以檢測(cè)真菌的生長。
篩選重建的小鼠以確定供體細(xì)胞的存在。通過室溫下在0.5ml 5mM EDTA PBS中收集大約10-15滴血以篩選用mHSC和/或mMP移植的小鼠的供體細(xì)胞群體，在PBS中加入1毫升葡聚糖-500，混合，并在37℃孵育30-45分鐘。大多數(shù)紅細(xì)胞將沉淀下來，產(chǎn)生的上清液轉(zhuǎn)移到新管中，用離心收集細(xì)胞(1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)，紅細(xì)胞用1.0ml的1xACK在冰上裂解5-6分鐘，然后洗滌和在1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。如果沉淀塊仍然是紅色的，重復(fù)洗滌步驟。在50ul管中用大鼠免疫球蛋白和小鼠免疫球蛋白(1∶50)在冰上封閉細(xì)胞10-15分鐘。加入合適濃度的生物素標(biāo)記的Mac-1和GR-1(eBioscience，San Diego，CA)在冰上避光孵育20分鐘。洗滌細(xì)胞，在1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。以合適的濃度加入下列抗體鏈霉親和素瀑布藍(lán)(Molecular Probes，Eugene，OR)，CD45.1別藻藍(lán)蛋白(APC)，CD45.2異硫氰酸熒光素(FITC)，B220 R-藻紅蛋白cyanine tandom(PE-Cy7)和CD3，CD4，CD8 R-藻紅蛋白(PE)(eBioscience，San Diego，CA)在冰上孵育25分鐘后，細(xì)胞經(jīng)洗滌，離心，并用包含PI的SM懸浮。用FACS分析細(xì)胞。
用H2標(biāo)志物為供體細(xì)胞篩選重建小鼠。室溫下大約10-15滴血被收集在0.5ml 5mM EDTA的PBS中，加入包含1毫升2％的葡聚糖-500(室溫)的PBS，混合物在37℃孵育30-45分鐘。大多數(shù)紅細(xì)胞將固定下來。上清被轉(zhuǎn)移到新管中，用離心收集細(xì)胞(1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)。用1.0毫升的1xACK(0.3M NH4Cl，0.2M KHCO3)在冰上裂解紅細(xì)胞5-6分鐘，洗滌并再1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。如果沉淀塊仍然是紅色的，重復(fù)第4-5步。在50ul管中用大鼠和小鼠免疫球蛋白(1∶50)冰上封閉抗體10-15分鐘。細(xì)胞用下列抗體染色20分鐘Mac-1和GR-1藻紅蛋白-cyanine 7 tandem(PE-Cy7)，B220別藻藍(lán)蛋白(APC)，CD3，CD4和CD8生物素(eBioscience，San Diego，CA)。
另外的抗體用于標(biāo)記MHC標(biāo)志物決定于用于移植的配對(duì)使用的小鼠。H2Kd-PE(Balb/c)和H2Kb-FITC(C57/B6)或H2Db-PE(C57/B6)和H2Dk-Fitc(AKR)。1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘制備細(xì)胞，然后用鏈霉親和素瀑布藍(lán)(Molecular Probes，Eugene，OR)染色。在冰上孵育20分鐘后，細(xì)胞經(jīng)洗滌，1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，然后用PI染色。用FACS分析細(xì)胞。
實(shí)施例2.離體凍存增殖的同種異體髓系祖細(xì)胞可保護(hù)白細(xì)胞降低癥小鼠免受致死性真菌感染。
本研究著眼于兩方面HSC(造血干細(xì)胞)在離體條件下是否可以增殖產(chǎn)生大量功能性髓系祖細(xì)胞，以及相比于從BM(骨髓)中分離的髓系祖細(xì)胞，前者是否可以保護(hù)白細(xì)胞降低癥小鼠免受致命真菌感染。同時(shí)，研究證明了凍存髓系祖細(xì)胞活性不會(huì)喪失。
規(guī)范的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見圖1。圖1A所示的是分離分析的細(xì)胞群，不同的組合標(biāo)志物區(qū)分造血干細(xì)胞(HSC)和祖細(xì)胞。以CD117+，CD90.1lo，Linneg/lo，Sca-1+作為HSC組合標(biāo)志物。CD117+，Linneg/lo，Sca-1neg/lo可作為混合髓系祖細(xì)胞群的標(biāo)志物，而CD16/CD34表達(dá)譜可區(qū)分其中的CMP，GMP和MEP亞群。圖1.B所示的是由HSC培養(yǎng)產(chǎn)生髓系祖細(xì)胞。髓系祖細(xì)胞克隆(MP)可即時(shí)使用或凍存。圖1.C所示的是使用髓系祖細(xì)胞保護(hù)白細(xì)胞減低癥小鼠免受真菌感染。每組實(shí)驗(yàn)中使用不同的相關(guān)參數(shù)，包括所用的克隆株，感染真菌的時(shí)間和使用的細(xì)胞數(shù)。代表性實(shí)驗(yàn)采用BALB/c宿主小鼠和C57BL/Ka MP供體小鼠。
小鼠C57BL/6Ka，Thy-1.1，CD45.2小鼠由ReasearchAnimal Facility of Stem Cell Inc，Palo Alto，CA培育。BALB/c小鼠購于Charles River Laboratories。使用的供體小鼠和宿主小鼠分別是6-8周齡和8-16周齡。
Cs輻射器輻射受體小鼠。輻射BALB/c宿主小鼠兩次，間隔至少3小時(shí)，總劑量為9.2Gy。所有小鼠在輻射期間喂養(yǎng)酸化水，四周后，喂養(yǎng)抗體液(106U/L硫酸多粘菌素B和1.1g/L硫酸鋅霉素)以降低可能的感染。
感染真菌。使用臨床上隔離的煙曲霉感染小鼠(BitMansour A，等，血液100，4660-4667)。煙曲霉種于沙氏葡萄糖瓊脂(BD Biosciences，Cockeysville，MD)，37℃培養(yǎng)48小時(shí)以上。然后用10ml PBS+0.05％Tween80沖洗菌臺(tái)收集分生孢子，溫和地刮下孢子液并過濾去除菌絲，收集的孢子液置于4℃。接著將孢子液梯度稀釋鋪板以鑒定孢子濃度。宿主小鼠尾靜脈注射溶有100-200個(gè)煙曲霉分生孢子的鹽水150μl。
流式細(xì)胞術(shù)。分別從股骨和脛骨提取骨髓，氯化銨裂解紅細(xì)胞后收集KTLS HSC。將制得的細(xì)胞懸浮液通過自動(dòng)磁性細(xì)胞分選器和CD117微珠(Miltenyi Biotec)以收集CD117+細(xì)胞。濃縮的細(xì)胞進(jìn)行以下標(biāo)記CD117PE-Cy7(2B8)，CD90.1FITC(HIS51)，LinPE(CD3(145-2C11))，CD4(L3T4)，CD5(53-7.3)，CD8(53-6.7)，CD19(ID3)，B220(RA3-6B2)，CD11b(M1/70)，Gr-1(8C5)TER119(TER119)，Sca-1APC(D7)(EBioscience，San Diego，CA)。然后用Becton和Dickinson的流式細(xì)胞分選術(shù)(FACSAria)對(duì)CD117+，CD90.1lo，Linneg/lo，Sca-1+細(xì)胞進(jìn)行雙選(分別保證產(chǎn)量和純度)。從CD90.2種系(如BALB/c)分離CD90染色陰性的HSC作為KLS細(xì)胞。
骨髓衍生的髓系祖細(xì)胞，即CMP，GMP和MEP的混合亞細(xì)胞群，是從濃縮骨髓中的CD117+細(xì)胞分選得到的(如前所述)。標(biāo)記這些細(xì)胞后，分選得到CD117+，Linneg/lo，Sca-1neg陽性的細(xì)胞。
組織培養(yǎng)。從骨髓中分離出10,000個(gè)Linneg/loKTLS HSC，鋪于24孔板，加入0.5ml X-vivo15(Cambrex)。其中含有1％青霉素/鏈霉素(Biosource)，1％谷氨酰胺(Invitrogen)和50ng/mlc-KitL，5ng/ml Tpo，10ng/ml IL-6(Biosource)，30ng/ml Flt3L(R&D Systems)。所有生長因子都是鼠源重組產(chǎn)物。每隔一天添加培養(yǎng)基，培養(yǎng)第4天更換一半的培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞另鋪于一個(gè)六孔板。培養(yǎng)第7天體系體積可達(dá)到2ml，細(xì)胞量達(dá)到2-7×106個(gè)。然后分析其中的成熟祖細(xì)胞(方法如前所述)，這批細(xì)胞可即時(shí)使用或用含7.5％DMSO，42.5％FBS和50％Xvivo15的溶液凍存。若選用凍存過的細(xì)胞，則在注入輻射小鼠之前，需要通過臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)控，以確保凍融過程不會(huì)影響祖細(xì)胞圖譜。
HSC離體增殖成為功能性髓系祖細(xì)胞。要實(shí)現(xiàn)臨床治療，就需要大量的髓系祖細(xì)胞。高度純化KTLS HSC，然后置于無血清X-vivo15培液中培養(yǎng)，HSC同時(shí)添加生長因子。然后組合KitL，F(xiàn)lt3L，Tpo和IL-6誘導(dǎo)HSC快速增值和緩慢分化。經(jīng)過一個(gè)周期(一個(gè)星期)，C57BL/Ka衍生HSC細(xì)胞量平均增殖500倍。7天末對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，表明其中包含了的一群重要細(xì)胞，其細(xì)胞表面不僅帶有HSC表型，還帶有多種的髓系祖細(xì)胞(CMP，GMP和MEP)表型(如圖2 B)。圖2B所示的是C57BL/Ka衍生HSC細(xì)胞平均增殖的數(shù)量，其它HSC細(xì)胞株(AKR，F(xiàn)VB和SJL)也有相似程度的增殖。移植實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)5天的HSC在移植后仍大量存活；但C57BL/Ka HSC培養(yǎng)7天移植后，只有少量功能性HSC存活。
帶有CD117+Linneg/lo標(biāo)志物的祖細(xì)胞亞群平均增殖的數(shù)量約是KTLS-HSC的100倍。與直接從骨髓中分離純化的方法相比，離體培養(yǎng)明顯能得到更多的髓系祖細(xì)胞(MP)。此外，利用甲基纖維素平板培養(yǎng)單種細(xì)胞，不同分子表型鑒定的祖細(xì)胞亞群具有預(yù)期的譜系分化潛能(數(shù)據(jù)未提供)。
除了已被確定的多種髓系祖細(xì)胞，培養(yǎng)體系中還包含更分化的細(xì)胞，如少量相對(duì)成熟的巨核細(xì)胞。如圖2A所示，大多數(shù)帶有髓性來源特征的細(xì)胞，并未達(dá)到終末分化，仍保留著干細(xì)胞和祖細(xì)胞這類原始細(xì)胞的特征。圖2A顯示了培養(yǎng)7天的細(xì)胞經(jīng)MGG(伊紅美藍(lán)/姬姆薩)染色制成免疫細(xì)胞化學(xué)離心涂片，可以看出大多數(shù)細(xì)胞未成熟，帶有髓性特征，只有極少數(shù)量的相對(duì)成熟的巨核細(xì)胞。圖2B顯示了無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后由表面標(biāo)記譜確定的HSC衍生的不同類型的祖細(xì)胞。
離體增殖的髓系祖細(xì)胞保護(hù)同種異體的白細(xì)胞降低癥小鼠免受致命曲霉的感染，骨髓來源的髓系祖細(xì)胞也有這個(gè)作用。這說明培養(yǎng)的髓系祖細(xì)胞在保護(hù)病理小鼠免受真菌感染方面與骨髓來源的髓系祖細(xì)胞相似。
將經(jīng)過致死性輻射的小鼠(BALB/c，CD90.2，CD45.2，H-2d)進(jìn)行重建，輸入200個(gè)同系基因型的BALB/c HSC(CD117+，Linneg/lo，Sca-1neg，KLS)和8×104個(gè)骨髓MP(從C57BL/Ka，H-2b骨髓中分選出的CD117+，Linneg/lo，Sca-1neg細(xì)胞)，后者也可以替換成5×105個(gè)離體培養(yǎng)的MP細(xì)胞。7天后，通過尾靜脈注射，打入150個(gè)臨床上分離的煙曲霉分生孢子來感染小鼠。設(shè)立重復(fù)組，每組15只小鼠(數(shù)據(jù)未提供)。如圖3匯總的數(shù)據(jù)顯示，2/15只輻射對(duì)照組小鼠存活時(shí)間超過30天，證明所使用的致死性輻射劑量較低。在第0天注射200KLS HSC的輻射后小鼠(HSC-拯救組)可以被全部拯救，但注射150A煙曲霉分生孢子后，這些只有17/44只小鼠存活下來。與之相反，接受骨髓MP的小鼠面對(duì)真菌感染有34/45(76％)的存活率；接受培養(yǎng)的衍生的MP細(xì)胞的小鼠面對(duì)真菌感染有32/45(71％)的存活率。當(dāng)與單獨(dú)用造血干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組相比時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(logrank)的結(jié)果表明骨髓MP實(shí)驗(yàn)組(p＜0.0001)和培養(yǎng)的衍生的MP實(shí)驗(yàn)組(p值＝0.0014)有顯著的保護(hù)作用。但在接受骨髓MP實(shí)驗(yàn)組和培養(yǎng)的衍生的MP實(shí)驗(yàn)組的30天存活率兩者之間并無顯著差異(p＝0.5164)。因此，離體增殖的髓系祖細(xì)胞和骨髓衍生的祖細(xì)胞都可以保護(hù)白細(xì)胞降低癥小鼠免受致死性曲霉的感染。
凍存的離體增殖的同種異體髓系祖細(xì)胞可保護(hù)白細(xì)胞降低癥小鼠免受曲霉侵染。與輸注成熟的粒細(xì)胞相比，髓系祖細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于可以在使用前凍存。當(dāng)需要時(shí)，冷凍MP細(xì)胞能夠作為種子并且解凍。
本研究是基于使用標(biāo)準(zhǔn)化的鼠類MP真菌感染實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下在補(bǔ)充有KitL，F(xiàn)lt3L，Tpo和IL-6的Xvivo15中培養(yǎng)C57BL/Ka HSC7天。第0天，宿主小鼠(BALB/c)接受致死性輻射(2×4.4Gy，分成每次4小時(shí))，并在同一天注射5×105個(gè)來自培養(yǎng)物的MP細(xì)胞和200個(gè)BALB/c的HSC(KLS)。第7天，靜脈注射150個(gè)煙曲霉分生孢子。每天觀察小鼠，并測(cè)定30天存活情況。
這里提到的實(shí)驗(yàn)不同之處在于(i)MP在不同的環(huán)境中培養(yǎng)，(ii)早期的培養(yǎng)物冷凍并保存于液氮中，(iii)將新鮮的MP和冷凍的MP進(jìn)行比較，(iv)在冷凍之前和解凍之后對(duì)MP的組合物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。
小鼠細(xì)胞可冷凍于無血清或有的混合含有血清的凍存培養(yǎng)基中。對(duì)于全部研究實(shí)驗(yàn)均使用含有血清的凍存培養(yǎng)基。含有血清的混合物(總共150ml)，含37.5ml血清和22.5ml DMSO。
1.沉淀細(xì)胞2.在無血清培養(yǎng)基(IMDM或Xvivo)中重新懸浮細(xì)胞3.準(zhǔn)備裝有冰和水的金屬碗4.將裝有懸浮細(xì)胞的試管插入冰水中，邊從上慢慢滴加等體積的凍存混合液邊溫和地混勻。
5.將混合物移至瓶中，置于-80℃過夜6.將瓶移至-180℃長期保存。
解凍培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞1.將瓶(vial)置于37℃水浴中，直到內(nèi)容物大部分融解。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基(IMDM或Xvivo)中重新懸浮2.將細(xì)胞緩慢移至含有DNAse的瓶中，取出少量對(duì)初始瓶中的細(xì)胞量進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3.逐滴加入10ml培養(yǎng)基(IMDM/DMEM+10％NCS)，并小心振蕩搖動(dòng)管以使培養(yǎng)基和細(xì)胞緩慢混合。
4.將細(xì)胞離心下去，將細(xì)胞重懸于染色培養(yǎng)基(HBSS/2％NCS)中。
5.計(jì)數(shù)。


MP培養(yǎng)。從帶CD117-標(biāo)記的BS中分選出帶CD117+CD90.1lowLinneg/lowSca-1+標(biāo)志物的HSC。HSC分離直接通過c-kit微珠分離。采集股骨和脛骨，去除肌肉組織。用研磨棒和研缽搗碎，尼龍膜過濾，每管5只鼠的量(10條腿骨和10只手臂)。1200rpm離心5分鐘。在冰上用1mlACK重懸細(xì)胞～3-4分鐘。用染色培養(yǎng)基沖洗。離心。計(jì)數(shù)。用約～50-60μl染色培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，過濾，洗滌管頂，過濾得到40-50ul，加入兔IgG(1∶50)+鼠IgG(1∶50)保持10-15分鐘。去掉10ul BM，進(jìn)行染色。每只鼠的量加入10μl1鼠antic-kit微珠(CD117)，(lot#5040428046)。注意如果有肱骨，則對(duì)應(yīng)12μl1微珠/鼠的量。在冰上孵育25分鐘。洗滌兩次。重懸細(xì)胞，并經(jīng)尼龍膜過濾，終體積約為～0.5-1.0ml/鼠，洗滌管頂過濾又得到0.5ml。用自動(dòng)磁性細(xì)胞分選器濃縮細(xì)胞。另外也可以將3-4ml的染色培養(yǎng)基過Midi柱來濃縮。經(jīng)尼龍過濾網(wǎng)過濾后上柱。重復(fù)過柱三次，(柱體積不能超過10只鼠的量)。用5-10ml染色培養(yǎng)基洗柱。用磁鐵分開柱與細(xì)胞，重復(fù)兩次。(注意10只鼠相當(dāng)于midi，五只鼠相當(dāng)于mini)。計(jì)數(shù)。離心。以1×108個(gè)細(xì)胞/ml將細(xì)胞懸浮于含抗體的染色培養(yǎng)基中。
抗體 Lot# 滴度c-kit(2B8)生物素 E0002251∶400 0re-kit(2B8)PE-Cy7 E0091581∶400Sca-1 APC E0078711∶200Thy-1.1 FITC E0081241∶400譜系PETer 119E0050151∶400CD3E0092881∶100CD5E0045261∶1600CD8E0092711∶200B220 E0070261∶800CD4E0087891∶3200Mac-1 E0058581∶6400GR-1 E0087231∶3200
冰上孵育25分鐘，洗滌，離心。若使用c-kitbio，細(xì)胞懸浮于SM(1×108個(gè)細(xì)胞/ml)。在冰上用streptavidin Cy7-PE(Lot#E006330)1∶800染色25分鐘，洗滌，離心，懸浮于染色培養(yǎng)基中已加PI(1∶1000)。流式細(xì)胞分選前先過濾。根據(jù)顏色選擇管子。
抗體 Lot# 滴度B220-PE Cy7E0091421∶400B220-Bio E0046921∶800Cascade-Blue 65A1-1 1∶400B220-PEE0070261∶400B220-FITC E0059651∶200B220-APC E0115111∶200B220-Cy5PE E0045921∶800PI1∶1000無染色
BM完全染色離心細(xì)胞。懸浮于100ul SM中(已加抗體)。冰上孵育25分鐘。洗滌，離心。(若使用2B8-biotin，則懸浮于100ul(107個(gè)細(xì)胞/100μl)，并用streptavidin Cy7-PE1∶800冰上染色25分鐘)。洗滌，離心，重懸于SM(以1∶1000加入P1)，流式細(xì)胞分選前過濾。
大約3×104個(gè)HSC用于培養(yǎng)產(chǎn)生MP。以含有Xvivo15+2ME+Pen/Strep+50ng/ml KitL+30ng/ml Flt3L+5ng/mlTpo+10ng/ml IL-6的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，具體如下。
大規(guī)模培養(yǎng)HSC得到髓系祖細(xì)胞從骨髓中提取Linneg/lowKTLS-HSC，鋪于有Xvivoi5的孔中，每孔500μl。Xvivoi5中另加Pen/Strep，谷胺酰胺(Glutamax)，β-巰基乙醇以及KitL，F(xiàn)lt-3L，Tpo，IL-6。細(xì)胞培養(yǎng)7天，收集MPC(培養(yǎng)得到的MP)。C57BL/Ka細(xì)胞的增殖程度比總增殖程度高200-700倍，其中10-35％的細(xì)胞帶有CD117+Lin-標(biāo)記。分離細(xì)胞兩次，第一次注重產(chǎn)量，第二次注重純度。從100000個(gè)細(xì)胞中分選，最初可以得到約300000個(gè)細(xì)胞。在24孔板中，10000個(gè)KTLS-HSC直接從500μl培養(yǎng)基中分離。無菌水添加到板上外圍的孔中以防止過度蒸發(fā)。第二天，每孔加入2,500μl的新鮮培養(yǎng)基。第4天，吸去一半的培養(yǎng)基(500μl)(用移液槍從上端吸，避免吸走細(xì)胞)。懸浮細(xì)胞(用P1000上下吹打)，然后移至六孔板，孔中含有500μl新鮮培養(yǎng)液。之前的孔用500μl新鮮培養(yǎng)基沖洗并移至對(duì)應(yīng)的同一孔。總體積達(dá)到1.5ml每孔。忽略仍遺留的細(xì)胞。第六天，添加500μl新鮮培養(yǎng)基。第7天，收集細(xì)胞分析。另外，細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)計(jì)數(shù)，以估計(jì)增殖倍數(shù)和HSC，MP(CMP/GMP/MEP)細(xì)胞的總數(shù)量。
細(xì)胞增殖HSC中使用的試劑X-vivo15(Cambrex Bioscience 04-744Q)，并添加青霉素/鏈霉素(100x)BiosourceInternational Inc，谷氨酰胺(100x)Invitrogen，β-巰基乙醇(1000x)Sigma Aldrich Fluka公司，生長因子。
培養(yǎng)100,000個(gè)細(xì)胞(500ul/孔)使用的培養(yǎng)基的配方是5ml完全Xvivo工作液，5μl1L6，2.5μlTPO，10μlKiiL，6μlFlt3L。100ml完全Xvivo工作液中包含100μlβ-巰基乙醇，1MLPen/Strep，1ML谷氨酰胺。
培養(yǎng)7天，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。簡(jiǎn)述如下在1ml染色培養(yǎng)基(SM)中加入4-5個(gè)spherotck(6.7uM)珠分析HSC/MP。珠與臺(tái)盼藍(lán)1∶10稀釋，用血球計(jì)數(shù)計(jì)計(jì)數(shù)。珠必須達(dá)到一定濃度(大于2×106珠/ml)。分析前對(duì)珠計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本加入30000個(gè)珠。移小量的細(xì)胞到分析管。用rIgG(1∶50)和mIgG(1∶50)在冰上封閉10min。裝MP的管中加入CD117-BIOTIN(1∶200)。在冰上避光孵育20分鐘。準(zhǔn)備HSC和MP各自的抗體混合液。HSC的抗體混合液是Ckit cy7-pE于1∶400，Sca-1 APC于1∶200，Thy-1.1 FITC于1∶200，B220 PE于1∶800，Mac-1 PE于1∶800和GR-1 PE于1∶800。MP的抗體混合液是SA-cascade blue于1∶400，Sca-1 APC于1∶200，CD34 FITC于1∶25，2.4G2于1∶50，B220 Cy7-PE于1∶800，GR-1 Cy7-PE于1∶800。用2ml sm洗滌管子，1100rpm離心5分鐘。管子與抗體混合液在冰上避光孵育20分鐘。重復(fù)洗滌和離心。用PI培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞(PI培養(yǎng)基(1∶1000)10ml種子液10μlPI10ml sm)。
簡(jiǎn)言之，流式細(xì)胞術(shù)分析HSC，CMP，GMP，MEP和更多的成熟細(xì)胞(CD11b+，Gr-1+，Ter119+)。制作細(xì)胞離心涂片，用MGG染色。注射需要大約3x7.5×107的培養(yǎng)細(xì)胞，包括新鮮的(1x)和凍存的(2x)。
冰凍MP。MP由HSC培養(yǎng)而來。冰凍之前用流式細(xì)胞儀分析。另外，帶單一CD117+Lin-標(biāo)志物的細(xì)胞鋪于Terasaki板，用前述的MP培養(yǎng)基(Xvivo+KitL，F(xiàn)lt3L，TPO和IL-6)。一周后確認(rèn)細(xì)胞形成集落的比率。冰凍細(xì)胞的步驟如下細(xì)胞在凍存培養(yǎng)基中冷凍，該培養(yǎng)基不含血清或含有混合物的血清。本實(shí)驗(yàn)中使用的是含血清的凍存培養(yǎng)基。配方是(共159ml)37.5ml血清，90ml羥乙基淀粉，22.5ml DMSO。將細(xì)胞團(tuán)聚后再懸浮于無血清培養(yǎng)基(IMDM或者Xvivo)中。準(zhǔn)備一金屬器具裝上冰水。將裝有懸浮細(xì)胞的管子置于冰水中，從上緩慢滴加等體積的凍存培養(yǎng)基，同時(shí)溫和混勻。將混合物移入小瓶中，-80℃過夜。之后放入-180℃長期保存。
解凍MP。解凍MP如下將儲(chǔ)藏瓶置于37℃水浴中，直到內(nèi)容物基本融解。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基(IMDM或Xvivo)中重新懸浮。將細(xì)胞緩慢移至有DNAse的瓶中，取出少量計(jì)數(shù)。逐滴加入10ml培養(yǎng)基(IMDM/DMEM+10％NCS)，并小心振蕩混勻。約以1ml/分鐘的速度滴加。離心取下層，將細(xì)胞重懸于染色培養(yǎng)基(HBSS/2％NCS)中。將“靜息”細(xì)胞置于室溫半小時(shí)。對(duì)染色細(xì)胞或板上細(xì)胞計(jì)數(shù)。
本實(shí)驗(yàn)中，解凍的細(xì)胞放置約1h，然后用(i)臺(tái)盼藍(lán)/血球計(jì)數(shù)計(jì)和(ii)P1流式細(xì)胞儀來評(píng)價(jià)其細(xì)胞活性。另外，CD117+Lin-MPc鋪板培養(yǎng)。
分離BALB/c HSC。從5只BALB/c小鼠中提取CD117+Linneg/lowSca-1posHSC。實(shí)驗(yàn)需要10,000個(gè)HSC(每個(gè)宿主小鼠需要200個(gè)HSC)。分離的5BALB/c HSC和培養(yǎng)的BS混合培養(yǎng)。直到BAMP達(dá)到理想比率，輸入輻射的5BALB/c的小鼠。
真菌注射。第7天，小鼠尾靜脈注射150個(gè)煙曲霉分生孢子，注射前用沙氏葡萄糖瓊脂來確定活孢子數(shù)。同時(shí)確定孢子的濃度。每只小鼠注射150μl的注射液(無菌1xPBS+0.05％tween+分生孢子)。注射液置于冰上，注射前漩渦振蕩。用注射器往SDA板注入150μl，37℃孵育。第二天，計(jì)數(shù)集落數(shù)以確定注射的分生孢子數(shù)。
如上所述，將HSC鋪板培養(yǎng)，證實(shí)培養(yǎng)的髓系祖細(xì)胞能保護(hù)白細(xì)胞降低癥小鼠免受煙曲霉侵染。7天后，收集細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。然后將細(xì)胞凍存在液氮?dú)庀?，如前所述。至少?天后，用37℃水浴將凍存瓶快速解凍，用培養(yǎng)基洗滌兩次。一部分用于流式細(xì)胞術(shù)分析，一部分輸入輻射的同種異體的宿主小鼠體內(nèi)。圖4A比較了新鮮MP和凍存過的MP輸入病理小鼠體內(nèi)后小鼠的生存相關(guān)數(shù)據(jù)。輻射后的小鼠在7天后輸入200個(gè)同系基因型HSC和500000同源異種的培養(yǎng)MP重塑。這里可以用新鮮MP或已凍存過的MP。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(每組15只小鼠)，在接受500000新鮮MP細(xì)胞和只接受HSC之間，其生存效果具有顯著差異(p＝0.009，t-test)。在另外3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中(每組15只小鼠)，使用500,000凍存過的MP，和HSC組相比，結(jié)論也是如此(p＝0.0329)。而在新鮮MP組和凍存過的MP組之間沒有顯著差異(p＝0.7205)，并且兩個(gè)HSC組之間沒有顯著差異(p＝0.5058)。圖4B比較了冷凍前和解凍后MP細(xì)胞CD117 Lin染色譜，結(jié)果顯示冷凍解凍過程并不影響CD117和Lin染色譜。通過分析其標(biāo)志物也可以得到這個(gè)結(jié)果(數(shù)據(jù)未提供)。
髓系祖細(xì)胞重建通常導(dǎo)致短期移植。圖5顯示的是將培養(yǎng)5天(2.25×105個(gè)細(xì)胞/鼠)或培養(yǎng)7天(8×105個(gè)細(xì)胞/鼠)或直接從骨髓中提取的髓系祖細(xì)胞(4×104個(gè)細(xì)胞/鼠)輸入小鼠體內(nèi)，四周后外周血中同系基因型MP的水平即移植水平。如圖5所示，飼養(yǎng)小鼠一月后，只有極少M(fèi)P衍生細(xì)胞(5％)存留在循環(huán)血液中。MP衍生細(xì)胞逐漸消失，8周后比4周后更少(數(shù)據(jù)未提供)。存留的細(xì)胞大部分是B淋巴細(xì)胞。相比之下，將HSC在誘導(dǎo)產(chǎn)生MP的環(huán)境下培養(yǎng)5天再移植，則在重塑形式上表現(xiàn)出巨大差異。在這種情況下，培養(yǎng)4周，大多數(shù)循環(huán)細(xì)胞是MP衍生細(xì)胞，其中包括三種髓系祖細(xì)胞，骨髓樣細(xì)胞，B細(xì)胞和T細(xì)胞，因此可以說功能性HSC成功重塑移植體。8周后，MP衍生細(xì)胞的數(shù)量還是顯著下降，表明移植的HSC主受制于ST-HSC。培養(yǎng)8天的細(xì)胞，與純化的髓系祖細(xì)胞相似，表現(xiàn)出移植效應(yīng)。只能看到極少的MP衍生細(xì)胞，大多數(shù)是生存期較長的B細(xì)胞。因此，供體小鼠來源的細(xì)胞的數(shù)量和類型與培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)，并且培養(yǎng)7天會(huì)使后面輸入宿主小鼠8周后，只能檢測(cè)到極少的MP衍生細(xì)胞。
圖6顯示了培養(yǎng)的髓系祖細(xì)胞劑量反應(yīng)的保護(hù)作用。結(jié)合10個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)提供的數(shù)據(jù)?？偧?xì)胞數(shù)量(圖6A)或者M(jìn)P中的CD117+Lin-細(xì)胞(圖6B)作為劑量作圖。相關(guān)實(shí)驗(yàn)如圖5。BALB/c小鼠接受致死性輻射，并在感染煙曲霉分生孢子7天后，輸入BALB/cHSC和C57BL/Ka MP。
培養(yǎng)的髓系祖細(xì)胞很快具有有效的保護(hù)作用。圖7顯示了15個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)組在接受了致死性輻射后用200個(gè)同型基因型HSC和250000或者500000個(gè)培養(yǎng)MP重塑，然后分別在不同的時(shí)間點(diǎn)注射真菌，得到一批生存數(shù)據(jù)，并將其整理。圖7顯示受體小鼠在接受輻射后的最初兩天是能夠抵抗真菌感染。到第三天，小鼠則對(duì)其感染完全敏感。
混合的同種異體髓系祖細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)是用于確定混合的同種異體MP(i)與單獨(dú)的供體MP(ii)對(duì)受體小鼠最有相同程度的保護(hù)作用。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了混合的MP以及凍存的部分具有相關(guān)的臨床的治療價(jià)值。
本研究基于標(biāo)準(zhǔn)的MP真菌實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)是用Xvivo15工作液(包含KitL，F(xiàn)lt3L，Tpo和IL-6)培養(yǎng)C57BL/Ka HSC7天。第0天宿主小鼠(BALB/c)接受致死性輻射(2x4.4Gy，每次4h)，并在同一天輸入5×105個(gè)培養(yǎng)的MP細(xì)胞和200BALB/c HSC(KLS)。第7天，靜脈注射150個(gè)煙曲霉分生孢子到小鼠體內(nèi)。每天觀察小鼠狀況，并記錄30天存活情況。
在此提及的實(shí)驗(yàn)與之前的不同之處在于(i)從BS中分選HSC并加以培養(yǎng)。選擇BA，AKR，F(xiàn)VB和SJL小鼠，(ii)這里已給出減少的MP的數(shù)量，(iii)輻射后，短期內(nèi)快速注射真菌。

宿主BALB/c，H-2d，CD90.2，CD45.2(Charles RiversLaboratories)。需要約56只小鼠，其中有51只宿主小鼠和5只HSC供體小鼠。MP的株系有C57BL/Ka，H-2b，CD90.1，CD45.1(BS.BA，bredin house)；MPC AKR，H-2k，CD90.1，CD45.2(CRL)；MPc SJL，H-2s，CD90.2，CD45.1(CRL)；MPc FVB，H-2q，CD90.1，CD45.2(CRL)。每個(gè)株系大約要5-10只小鼠，才足以產(chǎn)生的8-10×1O4個(gè)HSC，另外需要更多的BS.BA細(xì)胞。
MP培養(yǎng)。從濃縮了CD117-標(biāo)志細(xì)胞的Bs.BA中分選CDll7+CD90.1lowLinneg/lowSca-1+HSC。使用的如前所述的AKR，F(xiàn)VB骨髓。SJL HSC細(xì)胞是帶有CD117+Linneg/lowSca-1+標(biāo)志物的細(xì)胞。大約需要3×104HSC細(xì)胞培養(yǎng)MP。細(xì)胞置于特定的培養(yǎng)基(Xvivo15+2ME+Pen/Strep+50ng/ml KitL+30ng/ml Flt3L+5ng/ml Tpo+10ng/mlIL-6)中培養(yǎng)7天，如前所述。7天后，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取部分細(xì)胞進(jìn)行分析，如流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)HSC，CMP，GMP，MEP和其他成熟細(xì)胞(CD11b+，Gr-1+，Ter119+)。制備細(xì)胞離心涂片，用MGG染色。細(xì)胞注射量大約需要1.5×107個(gè)。剩余的細(xì)胞凍存起來，以備將來使用。
分選BALB/c HSC。從5BALB/c小鼠體內(nèi)分選帶有CD117+Linneg/lowSca-1pos標(biāo)志物的HSC。至少需要10,000個(gè)HSC，每個(gè)受體小鼠需要200個(gè)HSC。分選出的BALB/c HSC與培養(yǎng)得到的BS混合在一起。BA MP保持在理想的比率，用于注射輻射BALB/c小鼠。
真菌注射。通過尾靜脈注射向小鼠體內(nèi)導(dǎo)入150個(gè)煙曲霉分生孢子，如前所述。注射的方式和前面不同。通常是第7天，但這里選擇第4天感染小鼠。其它過程，包括用沙氏葡萄糖瓊脂來確定注射的分生孢子數(shù)量，剩余照舊。
圖8顯示混合的同種異體的培養(yǎng)MP對(duì)白細(xì)胞降低癥小鼠的保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)中使用的4個(gè)株系的MP細(xì)胞，它們的主要抗原和次要抗原不同。解凍的3個(gè)株系(C57BL/Ka，AKR和FVB)混合，一半的細(xì)胞量就能起到保護(hù)的作用，但重建效果不持久(數(shù)據(jù)未提供)。
各種同種異體培養(yǎng)來源的祖細(xì)胞具有防輻射的功能。本實(shí)驗(yàn)是用AKR MP供體和C57/B6Ka受體?？梢灾苯訌墓撬柚刑崛P，也可以從培養(yǎng)體系中提取HSC。在X-Vivo培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基中是含有KitL，F(xiàn)lt3L，TPO和IL-6。之后，用流式細(xì)胞術(shù)確定其c-kit+祖細(xì)胞的比率。用于移植的量需要達(dá)到200000或500000個(gè)c-kit+lineage-細(xì)胞。圖9A顯示的是輻射小鼠移植MHC不同的同種異體MP后30天的輻射防護(hù)數(shù)據(jù)。并未檢測(cè)到存活的小鼠出現(xiàn)供體嵌合狀態(tài)(圖9B)。
新鮮的和凍存祖細(xì)胞系比較輻射防護(hù)能力比較。使用AKRMP供體和C57/B6Ka受體，MP來源與離體培養(yǎng)的HSC。將MP置于X-Vivo培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基中同時(shí)含有KitL，F(xiàn)lt3L，TPO和IL-6。之后，收集細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)分析其c-kit+祖細(xì)胞的比率。輸入小鼠體內(nèi)的細(xì)胞可以是新鮮的也可以是凍存過的。移植的細(xì)胞量要達(dá)到200000個(gè)c-kit+lineage-細(xì)胞。圖10顯示輻射小鼠移植MHC不同的同種異體MP后30天的輻射防護(hù)數(shù)據(jù)。凍存過的MP和收獲時(shí)的MP可以達(dá)到同樣的防護(hù)效果。
實(shí)施例3在培養(yǎng)瓶或者袋中骨髓祖細(xì)胞從人造血干細(xì)胞的起始。
人hpHSC(來自動(dòng)員外周血(MPB)的CD34+CD90+細(xì)胞)取自健康的志愿者。用Baxter Isolex從MPB中富集CD34+細(xì)胞。CD34富集的細(xì)胞用改良的常規(guī)的BD FACS aria的Dakocytomation MoFlo進(jìn)一步染色和分選以獲得CD34+CD90+細(xì)胞(“hpHSC”)。使用的細(xì)胞可以是新鮮的或者凍存后的，或者是經(jīng)Isolex CD34富集的或者在MoFlo上經(jīng)CD34+CD90+篩選。
人細(xì)胞冷凍。細(xì)胞可以被冷凍在凍存培養(yǎng)基中即無血清或者包含血清的混合物。對(duì)于所有研究實(shí)驗(yàn)，我們用包含血清的凍存培養(yǎng)基。包含血清的混合物(共150毫升)。37.5毫升血清，90毫升羥乙基淀粉，22.5毫升DMSO。沉淀細(xì)胞并用物血清培養(yǎng)基(IMDM orXvivo)懸浮細(xì)胞。準(zhǔn)備一個(gè)盛有冰水混合物的金屬碗。將裝有懸浮細(xì)胞的管子放在冰水里，緩慢從懸浮細(xì)胞上方滴入等體積的凍存混合物，同時(shí)輕輕混合管子。吸出管中的混合物冰將冷凍裝置置于-80度過夜，并將管轉(zhuǎn)移到-180度長期保存。
人細(xì)胞的融化。在37℃水浴中溫?zé)峁茏?，直到管子里的?nèi)容物大部分融化。用無血清培養(yǎng)基(IMDM or Xvivo)懸浮細(xì)胞。緩慢吸出小管中的細(xì)胞包括DNAse取出一小份來做起始細(xì)胞計(jì)數(shù)。向細(xì)胞中逐滴加入10毫升培養(yǎng)基(IMDM/DMEM etc with 10％NCS)同時(shí)輕輕晃動(dòng)小管以允許培養(yǎng)基和細(xì)胞緩慢混合。以大約每分鐘1毫升的速度加培養(yǎng)基。將細(xì)胞離心下來并用染色培養(yǎng)基(HBSS/2％NCS)懸浮細(xì)胞，在室溫下將細(xì)胞靜置半小時(shí)。染色或者計(jì)數(shù)或者相應(yīng)地鋪細(xì)胞。
除非說明，否則在孔，瓶或者袋子里用Xvivo15+1％青霉素/鏈霉素，1％Glutamax和100ng/ml KITL，100ng/ml FLT3L，50ng/ml TPO和10ng/ml IL-3培養(yǎng)hpHSC。基于細(xì)胞因子的混合物是rhKITL 100ng/ml(Amgen)母液100μg/ml；rhTPO 50ng/ml(Biosource)母液10μg/ml；rhFLT3L 100ng/ml(Amgen)母液100μg/ml；rhIL-310ng/ml(Biosource)母液10μg/ml。在有些情況下，測(cè)定了下列細(xì)胞因子的副作用。rhIL-610ng/ml，rhIL-1110ng/ml，rhGM-CSF 10ng/ml，rhG-CSF100ng/ml。包括細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)(苔盼蘭)和通常是在第5，8，和11天，流式細(xì)胞術(shù)。(CD34，CD90，CD45RA，CD123，CD15，CD33，CD41。CD19)。
袋用7毫升Vuelife袋(American Fluoroseal，catalog#1PF-0007)，32毫升(#2P-0032)或者72毫升(#2P-0072)。
袋子的處理用標(biāo)準(zhǔn)注意事項(xiàng)操作人細(xì)胞。袋子有一個(gè)(7毫升袋)或者兩個(gè)口用于填滿和抽出樣品?？谟衛(wèi)uer鎖允許樣品線和注射器接觸。7毫升袋一旦充滿大約4毫升以上壓力就足夠大，一旦打開就會(huì)泄漏，在打開luer鎖之前需要緊緊關(guān)住。用注射填充袋子或者加入更多培養(yǎng)基，重力作用流不足。大袋子很容易用重力作用流填滿，當(dāng)用常規(guī)的移液器加培養(yǎng)基或者細(xì)胞時(shí)，沒有活塞的注射器可以作為漏斗連接。這些袋子在打開鎖之前沒有必要夾緊，只需要向上拿。
培養(yǎng)袋子通常培養(yǎng)在Sanyo培養(yǎng)箱里，37℃，5％CO2，和1-20％的氧氣。培養(yǎng)箱充分潮濕，盡管對(duì)于用袋子培養(yǎng)來說并不必須。袋子是透氣的，但是不透水。細(xì)胞濃度通常是每毫升105，(范圍每毫升106個(gè)細(xì)胞到每毫升104個(gè)細(xì)胞)。可以將袋子放在petri盤中(直徑15厘米，能盛7或者30毫升的袋子)或者方盤里(大袋)，這樣便于操作和保持無菌。
取樣常規(guī)細(xì)胞樣品能用1毫升注射器從裝備有l(wèi)uer鎖的袋子中吸出混合袋子的內(nèi)容物(細(xì)胞傾向于在折痕出聚集，見上圖中的灰色沉淀)，如果需要(7毫升袋)則夾緊并從口上除去塞子，連接1毫升注射器并倒轉(zhuǎn)袋子(注射器向下)。除去夾子，如果有的話。抽吸注射器幾次以混合在連接管內(nèi)的細(xì)胞。排空注射器(塞子始終向下)，倒轉(zhuǎn)袋子(注射器向上)。讓空氣向上走并封閉樣品口的硬塑料管(即使部分充滿它)，然后吸入樣品到管子里。整個(gè)樣品管包含大約0.2毫升。如果需要的話重新夾緊并除去注射器并蓋好蓋子。
在7毫升袋子里在包含GF的培養(yǎng)基里有2毫升細(xì)胞，第三或者四天的時(shí)候加入培養(yǎng)基(2-3毫升)以補(bǔ)充培養(yǎng)基。在一些實(shí)驗(yàn)中，在7 2毫升袋子里在大約4×106個(gè)細(xì)胞在2 0毫升培養(yǎng)基中(細(xì)胞濃度是每毫升2×105個(gè)細(xì)胞)。一旦細(xì)胞濃度達(dá)到每毫升106個(gè)(大約在第4天)稀釋細(xì)胞，以保持細(xì)胞濃度在每毫升3×105到2×106之間。在第4天和第6天加入培養(yǎng)基(到總量7 2毫升)在第8天收獲和凍細(xì)胞。細(xì)胞在8天的時(shí)間里增殖到了大約1.5×108個(gè)。計(jì)劃表可以開始在15毫升中有3百萬個(gè)細(xì)胞，在第4天加入15毫升培養(yǎng)基，在第6天加入40毫升培養(yǎng)基。
分析用上述的方法除去細(xì)胞樣品。通常在第5，8和12天對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行全面分析。這包括流式細(xì)胞分析，在甲基纖維素和伊紅美藍(lán)/姬姆薩染色的細(xì)胞涂片中在35毫米培養(yǎng)皿中鋪500個(gè)細(xì)胞。每天用血球計(jì)數(shù)板和苔盼蘭計(jì)數(shù)細(xì)胞。
增殖數(shù)據(jù)來自5個(gè)獨(dú)立的供體。圖11顯示了來自1319號(hào)供體的袋子和瓶子的增殖數(shù)據(jù)。圖11A顯示了總增殖，圖11B顯示了來自供體的細(xì)胞(CD34+CD90+)的細(xì)胞密度數(shù)據(jù)，在同樣的培養(yǎng)基/生長因子(Xvivo15補(bǔ)以Glutamax，PenStrep，KITL，F(xiàn)LT3L，TPO和IL-3)中培養(yǎng)，在不同的袋子和培養(yǎng)瓶中以不同的濃度培養(yǎng)細(xì)胞。起始濃度在每毫升1×105和1×106之間都是在7毫升AFC袋子中。破折號(hào)線意味著沒有再接受培養(yǎng)基的培養(yǎng)。但是隨后看能達(dá)到什么樣的最大濃度。在AFC袋子中生長的培養(yǎng)物和在組織培養(yǎng)瓶中生長的培養(yǎng)物的增值率相似，一部分細(xì)胞松散地貼在塑料培養(yǎng)瓶壁上。聚四氟乙烯袋子就不適這樣。生長在培養(yǎng)瓶和袋子中1319號(hào)供體培養(yǎng)物在種細(xì)胞后第8天的細(xì)胞的相差顯微圖顯示，在袋子里的細(xì)胞傾向于聚集增加。這就解釋了更大的表觀密度(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
圖12是來自人MP培養(yǎng)的細(xì)胞用生長因子處理的圖。供體1319號(hào)，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)8天(Xvivo15+PenStrep，Glutamax，100ng/ml KITL，100ng/ml FLT3L，50ng/ml TPO和10ng/ml IL-3，轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶種用不同的生長因子(100ng/ml KITL，20ng/ml IL-3和300ng/ml G-CSF)。圖12顯示在轉(zhuǎn)移后在不同的時(shí)間點(diǎn)(4到19天)。粒細(xì)胞峰出現(xiàn)在第12天，到第19天時(shí)，只有巨噬細(xì)胞出現(xiàn)。人MP培養(yǎng)物能分化成多形態(tài)成熟的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞。
從供體1198和1202種在袋子種的增殖數(shù)據(jù)。來自這兩個(gè)供體的細(xì)胞經(jīng)過Isolex富集用Dakocytomation MoFlo和凍存后篩選hpHSC表型(CD34+CD90+)，細(xì)胞解凍后被種到7毫升AFC袋子中，如圖所示培養(yǎng)基Xvivo15補(bǔ)以Glutamax，PenStrep，KITL，F(xiàn)LT3L，TPO和IL-3。圖13A顯示總增殖和圖13B顯示細(xì)胞密度數(shù)據(jù)。開放標(biāo)志顯示同時(shí)種在較大袋子里的細(xì)胞(見下)。以每毫升2×104種的細(xì)胞和以每毫升2×105種的細(xì)胞之間沒有明顯區(qū)別，或者種在7毫升AFC袋子里和在72毫升袋子里的細(xì)胞也沒有明顯區(qū)別。
來自供體1176，1198，1202在袋中和供體1207在72毫升AFC袋的增殖數(shù)據(jù)。來自這四個(gè)供體的細(xì)胞經(jīng)過Isolex富集，用Dakocytomation MoFlo選擇hpHSC表型(CD34+CD90+)，并在分選后凍存。細(xì)胞被融解并按指示種在72毫升AFC袋中。培養(yǎng)基Xvivo15補(bǔ)以Glutamax，PenStrep，KITL，F(xiàn)LT3L，TPO和IL-3。圖14A顯示總增殖，和圖14B顯示細(xì)胞的細(xì)胞密度數(shù)據(jù)。起始種植體積在20毫升種大約4×106各細(xì)胞，每個(gè)袋子培養(yǎng)物終體積70毫升，在四個(gè)袋子中共種植了15.6×106個(gè)細(xì)胞，8天后收獲(和凍存)細(xì)胞總數(shù)為6.14×108個(gè)，平均增殖40倍(范圍是30-60倍)。
7.4實(shí)施例4.人骨髓祖細(xì)胞克隆形成和在體外對(duì)G-CSF的反應(yīng)
人骨髓祖細(xì)胞培養(yǎng)始于2×106個(gè)純化的人HSC(融化的hpHSC)，培養(yǎng)在裝有無血的ExVivo-15和SCF，F(xiàn)lt3L，TPO，IL-3靜態(tài)的AFC袋子中，如上所述，在第5，8，11，13和15天收集MP細(xì)胞并分三份種于甲基纖維素中以評(píng)價(jià)它們?cè)隗w外形成克隆的潛能。圖15A顯示種植效率(獲得的克隆數(shù)/種的細(xì)胞數(shù))分成不同類型的克隆(E紅細(xì)胞；M巨噬細(xì)胞；G粒細(xì)胞；GM混合的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞；GEM混合的骨髓/紅細(xì)胞系)，指示在培養(yǎng)物中有多少祖細(xì)胞。
圖15B顯示CFU總數(shù)量的增加(克隆形成單位)。這等于種植效率乘以總細(xì)胞數(shù)。盡管CFU的相對(duì)數(shù)量因?yàn)榭偧?xì)胞數(shù)相對(duì)強(qiáng)的增加而下降，但是CFU還是隨著時(shí)間而增加。
培養(yǎng)的MP的FACS分析和干/祖細(xì)胞群體隨時(shí)間的改變?nèi)鐖D16所示。圖顯示的是活著的和譜系陰性細(xì)胞的預(yù)分門(pregated)，第0天的起始群體是CD34+CD90+(右上門)和這個(gè)群體隨時(shí)間下降，骨髓祖細(xì)胞主要在CD34+CD90-門(左上)，另外的數(shù)據(jù)顯示CD34low/-細(xì)胞形成克隆(盡管程度低)因此也對(duì)總的祖細(xì)胞庫有貢獻(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。經(jīng)時(shí)測(cè)定了CD34+CD90-細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量對(duì)相對(duì)種植效率(數(shù)據(jù)未顯示)以測(cè)定CD34+細(xì)胞％和CFUs的相關(guān)性。密切相關(guān)性(數(shù)據(jù)未顯示)提示CD34 FACS染色可以用作在培養(yǎng)物中祖細(xì)胞數(shù)量的一個(gè)指征。
圖17顯示了IL-3和IL-6單獨(dú)或者組合對(duì)人MP細(xì)胞的效果，圖17A顯示了細(xì)胞密度和每毫升中的細(xì)胞計(jì)數(shù)，圖17B顯示了總細(xì)胞數(shù)量。在包含SCF/Flt3L/TPO和IL-3或者IL-6(10-20ng/ml)被單獨(dú)或者組合加入(10-20ng/ml)的Xvivo中培養(yǎng)人細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示IL-3在培養(yǎng)中作為增殖因子。
圖18顯示與IL-3，IL-6或者二者組合培養(yǎng)的MP細(xì)胞的集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖47A(第5天)，圖47A(第8天)，和圖47C(第11天)顯示加入IL-6增加CFU的數(shù)量，有助于維持MP細(xì)胞的祖細(xì)胞潛能。
圖19顯示CFU在含有IL-3，IL-6或者是二者的組合的MP培養(yǎng)物中的絕對(duì)數(shù)量，比較來自對(duì)IL-3和/或IL-6的反應(yīng)的MP的CFU總數(shù)量。IL-3的增殖效應(yīng)和IL-6的維持祖細(xì)胞的效應(yīng)，這兩個(gè)細(xì)胞因子組合增加了在培養(yǎng)物中起始細(xì)胞的克隆數(shù)。
在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)5(圖20A)或者8天(圖21B)MP，在第5或者8天向培養(yǎng)基中加入300ng/ml的G-CSF(在曲線上的零天)MP，隨著時(shí)間的過去監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長并與沒有接受G-CSF(w/o)的培養(yǎng)比較。數(shù)據(jù)顯示當(dāng)在培養(yǎng)的晚期階段加入后，經(jīng)過一段時(shí)間G-CSF可以增加細(xì)胞數(shù)量。它還顯示我們的MP對(duì)G-CSF反應(yīng)有可能指向粒細(xì)胞/中性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞，并且提示G-CSF與MP組合移植能增加在患者體內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)量。
圖21是概要地顯示了在體內(nèi)人MP細(xì)胞對(duì)G-CSF的反應(yīng)性。概要地顯示MP移植到NOD/SCID小鼠中移植實(shí)驗(yàn)的第8天以評(píng)價(jià)它們移植的潛能，發(fā)育潛能和在體內(nèi)對(duì)G-CSF的反應(yīng)。
圖22是骨髓和脾的FACS分析以尋找移植后一周人MP的輸入和它們對(duì)G-CSF的反應(yīng)。用抗人CD45抗體染色樣品來檢測(cè)供體細(xì)胞，對(duì)沒有或者有G-CSF的每種組織顯示的是兩個(gè)獨(dú)立的樣品，骨髓顯示最高程度的重建，這能夠通過注射G-CSF而增加。
圖23是在NOD/SCID小鼠中人MP衍生細(xì)胞的FACS表型圖。顯示的是在活的或者h(yuǎn)uCD45+細(xì)胞預(yù)分門。CD33是早期骨髓細(xì)胞的標(biāo)志物，大多數(shù)或者人細(xì)胞是CD33+細(xì)胞，顯示大多數(shù)細(xì)胞定型于那個(gè)譜系，CD14和CD15染更加成熟的骨髓細(xì)胞，不均一染色顯示定型和成熟成為骨髓譜系。同時(shí)未檢測(cè)到人B細(xì)胞(CD19)或者T細(xì)胞(CD3，未顯示)。
前面對(duì)于本發(fā)明的特定實(shí)施方案的描述用于說明和描述目的。他們并不旨在排除或者限制發(fā)明于所公開的精確的形式，顯然可以根據(jù)上述教導(dǎo)得到很多改良和變化改變的啟示。選擇和描述的實(shí)施方案是為了最好地解釋發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，因而使得本領(lǐng)域中的其他技術(shù)人員能最好地利用發(fā)明和有各種改良的各種實(shí)施方案，這些方案適用于所設(shè)想的具體用途。
所有專利、專利應(yīng)用、出版物和這里引用的參考文獻(xiàn)被清楚地插入以供參考到同樣的程度，就像每個(gè)單獨(dú)的出版物或者專利應(yīng)用被特別地和單獨(dú)地指示插入以供參考。
權(quán)利要求
1.制備用于在哺乳動(dòng)物宿主中暫時(shí)重建造血功能的治療性組合物的方法，包括a)在包含細(xì)胞因子和生長因子混合物的培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)包括造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群體以增殖所述細(xì)胞群體中的骨髓祖細(xì)胞，和b)在適合于對(duì)哺乳動(dòng)物宿主施用的藥學(xué)上可接受的培養(yǎng)基中重新懸浮所述骨髓祖細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在所述重新懸浮步驟之前凍存所述增殖的骨髓祖細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述起始細(xì)胞群體以前被凍存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述起始細(xì)胞群體是富集的造血干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述起始細(xì)胞群體是純化的造血干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述純化的造血干細(xì)胞是分離的CD34+CD90+細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述造血干細(xì)胞來自同種異體供體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述造血干細(xì)胞來自多個(gè)同種異體供體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中同種異體供體彼此之間在MHC上至少部分不匹配。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中同種異體供體彼此之間在MHC上全部不匹配。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基是化學(xué)上確定的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，在該方法中細(xì)胞因子和生長因子混合物含有SCF、FL和TPO成分。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，在該方法中細(xì)胞因子和生長因子混合物含有選自IL-3、IL-6或者IL-11或者其組合的額外的因子。
14.根據(jù)權(quán)利要求1 2的方法，在該方法中細(xì)胞因子和生長因子混合物含有SCF、FL、TPO和IL-3成分。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的骨髓祖細(xì)胞在所述重新懸浮步驟前分離自增殖的細(xì)胞群體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，該方法中分離的骨髓祖細(xì)胞是普通的骨髓祖細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，該方法中分離的骨髓祖細(xì)胞是粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，該方法中分離的骨髓祖細(xì)胞是巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞祖細(xì)胞。
19.制備包括基本上純的非骨髓細(xì)胞群體的治療性組合物的方法，所述方法包括通過根據(jù)權(quán)利要求1的方法增殖骨髓祖細(xì)胞，從增殖的細(xì)胞群體中去除所述骨髓祖細(xì)胞，和在適于對(duì)哺乳動(dòng)物宿主施用的在藥學(xué)上可接受的培養(yǎng)基中重新懸浮剩下的非骨髓細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中分離的非骨髓細(xì)胞包含短期造血干細(xì)胞。
21.治療性組合物，包含通過權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法獲得的增殖的骨髓祖細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的治療性組合物，其中所述骨髓祖細(xì)胞包含至少增殖培養(yǎng)物中的總細(xì)胞的大約75％。
23.權(quán)利要求21的治療性組合物，其中所述骨髓祖細(xì)胞包含至少增殖培養(yǎng)物中的總細(xì)胞的大約85％。
24.權(quán)利要求21的治療性組合物，其中所述骨髓祖細(xì)胞包含至少增殖培養(yǎng)物中的總細(xì)胞的大約95％。
25.權(quán)利要求21的治療性組合物，其中細(xì)胞是人細(xì)胞。
26.治療性組合物，含有離體增殖的骨髓祖細(xì)胞，其中所述骨髓祖細(xì)胞是同種異體骨髓祖細(xì)胞的混合物。
27.權(quán)利要求26的治療性組合物，其中所述增殖的骨髓祖細(xì)胞被凍存于凍存培養(yǎng)基中。
28.權(quán)利要求26的治療性組合物，其中所述增殖的骨髓祖細(xì)胞懸浮于藥學(xué)上可接受的載體中。
29.權(quán)利要求26的治療性組合物，其中同種異體骨髓祖細(xì)胞在MHC上至少部分不匹配。
30.權(quán)利要求26的治療性組合物，其中同種異體骨髓祖細(xì)胞在MHC上完全不匹配。
31.權(quán)利要求26的治療性組合物，其中同種異體骨髓祖細(xì)胞是分離的普通骨髓祖細(xì)胞。
32.權(quán)利要求26的治療性組合物，其中同種異體骨髓祖細(xì)胞是分離的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞。
33.權(quán)利要求26的治療性組合物，其中同種異體骨髓祖細(xì)胞是分離的巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞祖細(xì)胞。
34.治療患有造血功能受損的人類患者的方法，包括向所述患者施用權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的治療性組合物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，進(jìn)一步包括共施用分離的HSC細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，進(jìn)一步包括向所述患者施用抗病毒化合物、抗真菌化合物、抗細(xì)菌化合物、細(xì)胞因子或者生長因子中的至少一種。
37.根據(jù)權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述人類患者正在接受造血干細(xì)胞(HSC)移植。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中在HSC移植后施用增殖的骨髓祖細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中施用增殖的骨髓祖細(xì)胞與HSC移植同時(shí)進(jìn)行。
40.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述人類患者患有中性粒細(xì)胞減少癥。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述增殖的骨髓祖細(xì)胞被與用于治療與中性粒細(xì)胞減少癥相關(guān)的并發(fā)癥的治療性組合物一起施用。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中治療性組合物包含抗病毒化合物、抗真菌化合物和抗細(xì)菌化合物中的至少一種。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中治療性組合物包含G-CSF。
44.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中治療性組合物包含GM-CSF。
45.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述人類患者患有血小板減少癥。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述增殖的骨髓祖細(xì)胞輔助性地與用于治療與血小板減少癥相關(guān)的并發(fā)癥的治療性組合物一起施用。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中治療性組合物含有抗病毒化合物、抗真菌化合物和抗細(xì)菌化合物中的至少一種。
48.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中治療性組合物含有血小板制劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中治療性組合物含有EPO。
全文摘要
本發(fā)明涉及增殖骨髓祖細(xì)胞的方法，所述方法通過在含有細(xì)胞因子和生長因子混合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)起始群體的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞因子和生長因子促進(jìn)骨髓祖細(xì)胞的生長和增殖。該增殖的細(xì)胞群體提供了用于作為治療患有因?yàn)榻邮芄撬杵茐闹委熀驮煅杉?xì)胞移植而發(fā)生嗜中性白細(xì)胞減少癥和/或血小板減少癥的患者的治療制劑的細(xì)胞來源。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101087874SQ200580044715
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2005年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月25日
發(fā)明者T·C·方, A·G·W·多門, J·L·克里斯坦森 申請(qǐng)人:塞勒蘭特治療公司