專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有更高水平的葡萄孢抗性的番茄植株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)番茄中的與灰色葡萄孢(Botrytiscinerea)抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法，涉及一種生產(chǎn)抗葡萄孢(Botrytis)的番茄植株的方法以及涉及由此獲得的抗葡萄孢的番茄植株及其部分。
背景技術(shù)：
：灰色葡萄孢是一種具有極為廣泛的宿主范圍的壞死營(yíng)養(yǎng)型的致病性真菌，其宿主范圍至少包括235種可能宿主。因?yàn)槠鋸V泛的宿主范圍以及因?yàn)槠溆绊懡?jīng)濟(jì)上重要的植物部分，灰色葡萄孢是多種商業(yè)種植農(nóng)作物的主要問(wèn)題。對(duì)于栽培者而言，真菌常常指的就是葡萄孢。種植的番茄(主要是番茄(Lycopersiconesculentum))也易感于葡萄孢感染，并且真菌常常感染番茄植株的莖、葉和果實(shí)。在加溫的溫室中，葡萄孢對(duì)莖的感染發(fā)生是特別普遍的。葡萄孢積極地殺死受感染的細(xì)胞，造成軟腐病、枯萎病、葉斑病、猝倒病和莖癌瘤。受感染的葉子被分生孢子柄和分生孢子所覆蓋，隨后出現(xiàn)萎陷和凋謝。真菌會(huì)從患病的葉子生長(zhǎng)到莖，并形成長(zhǎng)度為數(shù)毫米到數(shù)厘米的干燥的、淺褐色病變。也可以在莖上的修剪瘢痕處形成病變。莖病變也可以被灰霉覆蓋。在一些情況中，感染灶環(huán)繞莖并殺死植物。番茄植株的更老的、衰老的組織通常比年幼的組織更易受到葡萄孢的攻擊。為了預(yù)防溫室生長(zhǎng)的番茄發(fā)生葡萄孢，必須要嚴(yán)格地調(diào)節(jié)溫度和相對(duì)濕度。給植物供水但不弄濕葉子也很重要。對(duì)于田地生長(zhǎng)的植物而言，應(yīng)當(dāng)采用好的灌溉和除草。此外，必須保持高的植物養(yǎng)分水平。但是，這些預(yù)防措施并不能完全避免感染造成的相當(dāng)大的產(chǎn)量下降的發(fā)生。已經(jīng)有了用于控制溫室和田地生長(zhǎng)的番茄的葡萄孢的殺真菌劑。一些殺真菌劑的實(shí)例包括DowicideA和百菌清(chlorothalonil)，它們也可以被施用于收獲后的番茄果實(shí)。但是，已知葡萄孢已經(jīng)發(fā)展出了對(duì)一些常用殺真菌劑的耐藥性。另外，從經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的角度出發(fā)，應(yīng)用殺真菌劑都不是所希望的?，F(xiàn)在，需要表現(xiàn)出抗葡萄孢的商品化番茄變種。在一些番茄屬(Lycopersicon)的野生種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了對(duì)葡萄孢的部分抗性(Egashiraetal.2000；Nicotetal.2002；Urbasch1986)。但是，這些植物不能生成商品化的番茄農(nóng)作物。從WO02/085105中已知，多毛番茄(L.hirsutum)包括涉及對(duì)葡萄孢的部分抗性的基因組的10號(hào)染色體上的基因區(qū)。相信該遺傳物質(zhì)向所培育的番茄變種中的漸滲(introgression)能夠?yàn)樗嘤姆阎仓晏峁?duì)葡萄孢的部分抗性。但是，到目前為止，針對(duì)為番茄提供葡萄孢抗性的育種計(jì)劃還只有很有限的成功。這些差的結(jié)果的原因目前還不清楚。一方面，這可能是因?yàn)殛P(guān)于葡萄孢抗性的遺傳基礎(chǔ)和遺傳性方面的知識(shí)還很欠缺。另一方面，這可能是因?yàn)槿鄙俸线m的用于檢測(cè)在育種計(jì)劃中獲得的番茄植株中的葡萄孢抗性水平的生物檢測(cè)法。知識(shí)和方法的缺乏也使得在野生株和后代植株中選擇包括涉及葡萄孢抗性的基因的植株復(fù)雜化。本發(fā)明的目標(biāo)是提高旨在提供抗葡萄孢的商品化番茄變種的育種計(jì)劃的成功率。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為商品化番茄變種提供附加的和/或改良的葡萄孢抗性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于發(fā)現(xiàn)作為葡萄孢抗性來(lái)源的另外的野生型番茄株的方法以及用于發(fā)現(xiàn)這些植株的基因組中的涉及番茄中的葡萄孢抗性的另外的遺傳物質(zhì)的方法。這種另外的來(lái)源和另外的遺傳物質(zhì)可以用于拓寬用于生成所培育的番茄的抗葡萄孢的變種的基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將包括測(cè)定番茄植株中最初的和/或進(jìn)行性的葡萄孢感染參數(shù)的特殊的定量生物檢測(cè)法與分子標(biāo)記物檢測(cè)技術(shù)相組合，提供了一種用于檢測(cè)野生番茄株中的葡萄孢抗性的來(lái)源以及用于檢測(cè)這些植株基因組中的涉及番茄的改良的葡萄孢抗性的遺傳物質(zhì)的非常有利的方法。通過(guò)使用這種技術(shù)的組合，本發(fā)明者已經(jīng)成功地在兩系番茄野生親緣株(即多毛番茄LYC4/78(LycopersiconhirsutumLYC4/78)和小花番茄G1.1601(LycopersiconparviflorumG1.1601))中鑒定出了對(duì)葡萄孢的部分抗性。本發(fā)明人隨后已經(jīng)能夠通過(guò)雜交這些抗葡萄孢的野生型(供體)番茄系和無(wú)抗性的受體番茄植株的植株而生成抗葡萄孢的番茄植株。這些植株比包括如WO02/085105所述的多毛番茄的10號(hào)染色體上的與葡萄孢抗性相關(guān)的基因組區(qū)的植株表現(xiàn)出了更高水平的抗性。通過(guò)評(píng)價(jià)這些新生成雜種的分離群(F2群)中的對(duì)葡萄孢的抗性水平與存在供體植株的分子標(biāo)記物的相關(guān)性，本發(fā)明人已經(jīng)能夠在抗性野生番茄系中鑒定出與葡萄孢抗性相關(guān)的多個(gè)數(shù)量性狀基因座(QTL)，并據(jù)此確定出多個(gè)賦予抗性的DNA序列在基因組中的位置。因此，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)番茄的葡萄孢抗性是多基因遺傳的，其可能部分解釋了差的育種結(jié)果。該發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在被用于改良用于生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的方法。在下面的描述中，番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)被簡(jiǎn)寫(xiě)為葡萄孢抗性的QTL或與葡萄孢抗性相關(guān)的QTL。在兩個(gè)野生番茄系中，總共發(fā)現(xiàn)了6個(gè)新的葡萄孢抗性的QTL。這6個(gè)QTL中有4個(gè)與反映植物減少最初感染發(fā)生的能力的定量參數(shù)(此后稱(chēng)作發(fā)病率參數(shù))相關(guān)。這6個(gè)QTL中有2個(gè)與反映植物減慢感染進(jìn)程的能力的定量參數(shù)(此后稱(chēng)作病變生長(zhǎng)速率參數(shù))相關(guān)。通過(guò)生成遺傳連鎖圖，發(fā)現(xiàn)多毛番茄LYC4/78的1號(hào)染色體具有與降低葡萄孢感染誘導(dǎo)的病變生長(zhǎng)速率相關(guān)的QTL，而相同植物株的2號(hào)和4號(hào)染色體都具有與降低發(fā)病率相關(guān)的QTL。在小花番茄G1.1601中，發(fā)現(xiàn)降低病變生長(zhǎng)速率的QTL位于9號(hào)染色體，而兩個(gè)分開(kāi)的降低發(fā)病率的QTL被發(fā)現(xiàn)位于3號(hào)和4號(hào)染色體。如先前所報(bào)道的那樣，用這個(gè)方法不能檢測(cè)到10號(hào)染色體上的QTL。通過(guò)使用上面提及的定量生物檢測(cè)法，至此通過(guò)評(píng)價(jià)在研究中具有分離的QTL的BC2S1(自花傳粉的回交2代)后代的抗病性可以驗(yàn)證所測(cè)試的多毛番茄LYC4/78中的所有QTL。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及抗葡萄孢的番茄植株，其中當(dāng)用生物檢測(cè)法測(cè)定時(shí)，所述植株具有比易感對(duì)照植株低至少3倍的對(duì)灰色葡萄孢的易感性，所述生物檢測(cè)法是在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐條件下，在3周時(shí)間內(nèi)測(cè)定出成體植株中的灰色葡萄孢感染造成的莖病變的平均長(zhǎng)度。用在此所述的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐條件確定出在此作為抗性水平的測(cè)定值的3周時(shí)間內(nèi)的莖病變長(zhǎng)度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗葡萄孢的番茄植株的特征是所述植株的基因組包括至少一個(gè)QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分，所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)染色體上的QTL以及小花番茄G1.1601的3號(hào)、4號(hào)和9號(hào)染色體上的QTL組成的組，其中所述QTL或所述的其賦予葡萄孢抗性的部分并非是在其天然遺傳背景內(nèi)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)與番茄中的葡萄孢抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法。方法包括步驟雜交抗葡萄孢的供體番茄植株和無(wú)抗性的或部分抗性的(葡萄孢易感的)受體番茄植株；用感染量的葡萄孢接觸一株或多株后代植株；定量地確定出所述一株或多株后代植株中的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率；建立聯(lián)系在所述一株或多株后代植株中所觀察到的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率與存在所述供體番茄植株的染色體標(biāo)記物的遺傳連鎖圖；把所述圖上的與降低發(fā)病率和/或降低病變生長(zhǎng)速率相關(guān)的相鄰的標(biāo)記物分配給數(shù)量性狀基因座。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)用于檢測(cè)如上所列的本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL的方法獲得的QTL。這些QTL不同于現(xiàn)有技術(shù)的QTL。其一是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的QTL。此外，本發(fā)明的QTL比現(xiàn)有技術(shù)的那些QTL有著更多的信息，因?yàn)樗鼈冎甘玖伺c植株對(duì)抗疾病發(fā)生的能力相關(guān)的表征，或者與植株減慢疾病進(jìn)程的能力相關(guān)的表征。這些信息在育種計(jì)劃中是非常有價(jià)值的，因此其組合可以適當(dāng)?shù)靥岣呖剐裕玫乜刂瓶剐孕誀顝囊淮蛄硪淮_的遺傳(properinheritance)。本發(fā)明還涉及番茄中的葡萄孢抗性的QTL，所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)染色體上的QTL以及小花番茄G1.1601的3號(hào)、4號(hào)和9號(hào)染色體上的QTL組成的組。這些QTL位于先前與葡萄孢抗性無(wú)關(guān)的基因組的位點(diǎn)上。下面將更為詳細(xì)地描述這些QTL的細(xì)節(jié)。這些QTL所示的基因組位置上的等位基因是本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明的QTL可以是包括所述QTL或其賦予抗性部分的分離的、優(yōu)選雙鏈的核酸序列。例如可以從合適的供體植株的基因組中分離到的核酸序列的尺寸可以非常合適地是所述染色體上的1-100cM，優(yōu)選的是10-50cM遺傳距離。所述核酸可以包括至少50個(gè)、更優(yōu)選地至少500個(gè)、甚至更優(yōu)選地至少1000個(gè)、仍更優(yōu)選地至少5000個(gè)堿基對(duì)。核酸構(gòu)建體可以反過(guò)來(lái)包括一種或多種包括本發(fā)明的QTL或其賦予抗性部分的核酸序列，所述構(gòu)建體還可以包括位于所述一種或多種核酸序列側(cè)部的區(qū)域，所述區(qū)域能夠被整合到合適的載體內(nèi)，用于將所述的一種或多種核酸序列轉(zhuǎn)移到合適的葡萄孢易感的受體番茄植株內(nèi)。載體還可以包括合適的啟動(dòng)子區(qū)或其他調(diào)節(jié)序列。QTL也可以是存在于番茄植株基因組內(nèi)的形式。本發(fā)明的QTL優(yōu)選地包括至少一種標(biāo)記物、優(yōu)選地兩種、更優(yōu)選地3種、仍更優(yōu)選地4種、仍更優(yōu)選地4種以上與葡萄孢抗性相關(guān)的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物選自由表1和2的標(biāo)記物以及圖1、5和6所示的與所述QTL連鎖的標(biāo)記物組成的組。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)葡萄孢抗性的QTL的方法，包括檢測(cè)疑為抗葡萄孢的番茄植株中的至少一種標(biāo)記物，所述標(biāo)記物選自由表1和2的標(biāo)記物以及圖1、5和6所示的與與葡萄孢抗性相關(guān)的所述QTL連鎖的標(biāo)記物組成的組。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的方法。本方法包括步驟通過(guò)實(shí)施用于檢測(cè)本發(fā)明的葡萄孢抗性的數(shù)量性狀基因座(QTL)的任一方法檢測(cè)抗葡萄孢的供體番茄植株中的葡萄孢抗性的QTL；以及將包括至少一種所檢測(cè)到的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸從所述供體植株轉(zhuǎn)移到葡萄孢易感的受體番茄植株。通過(guò)雜交所述抗葡萄孢的供體番茄植株和葡萄孢易感的受體番茄植株生成子代植株，以及從子代植株中選出其基因組中包括從所述供體番茄植株漸滲的核酸的植株，可以非常合適地進(jìn)行包括至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸的轉(zhuǎn)移，其中所述漸滲的核酸包括至少一種本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分。用本發(fā)明的方法可以合適地檢測(cè)出所述漸滲的核酸內(nèi)存在至少一種本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分，在所述方法中，檢測(cè)至少一種選自由表1和2的標(biāo)記物以及如圖1、5和6所示的與與葡萄孢抗性相關(guān)的所述QTL連鎖的標(biāo)記物組成的組中的標(biāo)記物。優(yōu)選的選擇方法因此包括對(duì)所述漸滲的DNA的標(biāo)記物輔助性選擇(MAS)(例如參見(jiàn)Tanksleyetal.1998)，其中檢測(cè)子代植株中的一種或多種與所述QTL相關(guān)的標(biāo)記物。例如通過(guò)分離所述子代植株的遺傳物質(zhì)并用分子技術(shù)確定出其中一種或多種供體植株標(biāo)記物的存在就可以進(jìn)行MAS?；蛘?，在沒(méi)有預(yù)先分離遺傳物質(zhì)時(shí)，就可以使用分子標(biāo)記物檢測(cè)方法。任選地，除了標(biāo)記物檢測(cè)外，還可以進(jìn)行對(duì)葡萄孢抗性的表型測(cè)試，以便選擇出合適的植株。非常合適的測(cè)試因此是在此所述的定量生物檢測(cè)法，由此確定出參數(shù)例如發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率。確定存在抗性表型以及證實(shí)存在至少一種葡萄孢抗性的QTL的組合為包括至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸從供體植株轉(zhuǎn)移到受體植株的成功轉(zhuǎn)移提供了證據(jù)。在生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的方法的其他實(shí)施方式中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法(例如通過(guò)轉(zhuǎn)化)、通過(guò)原生質(zhì)體融合、通過(guò)雙單倍體技術(shù)或通過(guò)胚拯救都可以非常適當(dāng)?shù)貙?shí)現(xiàn)所示的核酸轉(zhuǎn)移。在生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的方法的優(yōu)選的實(shí)施方式中，供體植株是多毛番茄LYC4/78和/或小花番茄G1.1601以及從這些供體植株轉(zhuǎn)移到受體植株內(nèi)的核酸優(yōu)選地包括至少一種葡萄孢抗性的QTL，所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)染色體上的QTL以及小花番茄G1.101的3號(hào)、4號(hào)和9號(hào)染色體上的QTL或其賦予葡萄孢抗性部分組成的組。在生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，方法包括雜交所述抗葡萄孢的供體番茄植株和葡萄孢易感的受體番茄植株生成第一代子代植株；從第一代子代植株中選擇出其基因組中包括從所述供體番茄植株中漸滲的核酸的植株，其中所述漸滲的核酸包括至少一種QTL，優(yōu)選地2種，更優(yōu)選地2種以上本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分；雜交所述選出的子代植株與合適的商品化番茄系，生成第二代子代植株；從第二代子代植株物中選擇出其基因組中包括從所述第一代子代番茄植株中漸滲的核酸的植株，其中所述漸滲的核酸包括至少一種QTL，優(yōu)選地2種，更優(yōu)選地2種以上本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分；以及任選地生成了更多代的子代植株。所提及的在子代植株中被漸滲的優(yōu)選地2種、更優(yōu)選地2種以上葡萄孢抗性的QTL可以是發(fā)病率的QTL、病變生長(zhǎng)速率的QTL或這些類(lèi)型的組合。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的方法獲得的抗葡萄孢的番茄植株或其部分。仍在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及抗葡萄孢的番茄植株或其部分，在其基因組中包括至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性部分，其中所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)染色體上的QTL以及小花番茄G1.1601的3號(hào)、4號(hào)和9號(hào)染色體上的QTL組成的組，其中所述QTL或其所述賦予葡萄孢抗性的部分并不是處于其天然的遺傳背景內(nèi)。仍在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)抗葡萄孢的近交番茄植株的方法。方法包括步驟根據(jù)本發(fā)明的方法生成抗葡萄孢的番茄植株，自交所述植株，從所述自交的植株中獲得的種子生長(zhǎng)成新的植株；從所述新植株中鑒定出表現(xiàn)出葡萄孢抗性以及具有商業(yè)所需特性的植株；以及重復(fù)自交和選擇步驟，直到生成了表現(xiàn)出葡萄孢抗性以及具有商業(yè)所需特性的近交番茄植株。生產(chǎn)抗葡萄孢的近交番茄植株的方法還可以包括選擇表現(xiàn)出葡萄孢抗性以及具有商業(yè)所需特性的純合子的近交番茄植株的附加步驟。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的方法所獲得的抗葡萄孢的近交番茄植株或其部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出葡萄孢抗性的雜種番茄植株或其部分，其中所述雜種番茄植株是通過(guò)雜交本發(fā)明的方法所獲得的抗葡萄孢的近交番茄植株和表現(xiàn)出商業(yè)所需特性的近交番茄植株獲得的。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的番茄植株的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。在這種組織培養(yǎng)物的優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞或所述細(xì)胞的原生質(zhì)體可以分離自選自由葉、花粉、胚、根、根尖、花藥、花、果實(shí)以及莖和種子組成的組中的組織。本發(fā)明還涉及選自由表1和2的標(biāo)記物和如圖1、5和6所示的標(biāo)記物組成的組中的標(biāo)記物用于檢測(cè)本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL和/或用于檢測(cè)抗葡萄孢的番茄植株的用途。本發(fā)明的方法所用的抗葡萄孢的供體番茄植株優(yōu)選地選自由櫻桃番茄(Lycopersiconcerasiforme)、奇士曼尼番茄(Lycopersiconcheesmanii)、智利番茄(Lycopersiconchilense)、克梅留斯基番茄(Lycopersiconchmielewskii)、普通番茄(Lycopersiconesculentum)、多毛番茄、小花番茄、潘那利番茄(Lycopersiconpennellii)、秘魯番茄(Lycopersiconperuvianum)、醋栗番茄(Lycopersiconpimpinellifolium)和類(lèi)番茄茄(SolanumLycopersicoides)組成的組，更優(yōu)選地，野生番茄株被用作供體植株。非常優(yōu)選的供體植株是多毛番茄和小花番茄，特別是多毛番茄LYC4/78和小花番茄G1.1601。本發(fā)明的方法所用的葡萄孢易感的受體番茄植株優(yōu)選地是普通番茄種的植株，更優(yōu)選地是具有商業(yè)所需特性的普通番茄品種或另一種商品化的番茄系。圖1顯示了源自多毛番茄LYC4/78的抗灰色葡萄孢的數(shù)量性狀基因座(QTL)的位置以及代表1號(hào)和2號(hào)染色體的連鎖圖。圖上的位置是以cM為單位。1號(hào)染色體上檢測(cè)到的QTL是病變生長(zhǎng)的QTL，2號(hào)染色體上檢測(cè)到的QTL是發(fā)病率的QTL。欄表示QTL間距?？蝻@示了LOD1間距，線表示LOD2間距。表1更詳細(xì)地描述了AFLP標(biāo)記物的代碼。所有所示的與QTL相關(guān)的標(biāo)記物都可以用作為本發(fā)明的各個(gè)部分中的標(biāo)記物。圖2顯示了開(kāi)發(fā)普通番茄x多毛番茄LYC4/78群的示意圖。BC4系與普通番茄栽培種Moneymaker回交，得到BC5系，有助于開(kāi)發(fā)出表現(xiàn)出這兩種主要效應(yīng)的QTL-NIL系，在F2群中可以鑒定出這兩種主要效應(yīng)。BC3和BC4系與普通番茄栽培種Moneymaker回交，以獲得回交近交系(BIL)群(見(jiàn)實(shí)施例3)。圖3顯示了兩種出現(xiàn)病變生長(zhǎng)(圖3B和3D)和發(fā)病率(圖3A和3C)分離的BC2S1群中的分離情況(群大小分別為60和47)。病變生長(zhǎng)是在x軸上，單位為mm(圖3B和3D)，刻度為0.5mm(2.75-3.25；3.25-3.75等)，發(fā)病率(圖3A和3C)的刻度為5％(12.5-17.5％；17.5-22.5％等)。Y軸上表示每種類(lèi)型的植株數(shù)目。分別用箭頭表示MM和Lyc4/78的平均親代數(shù)值。圖4顯示了普通番茄栽培種Moneymaker和小花番茄G1.1601雜交的結(jié)果。F2群中的關(guān)于發(fā)病率(圖4A)和病變生長(zhǎng)(圖4B)的分離情況(基于F3系的平均值)。發(fā)病率是在x軸上，單位是百分比(圖4A)以及刻度是5％(12.5-17.5％；17.5-22.5％等)。病變生長(zhǎng)是在x軸上，單位為mm(圖4B)和刻度為0.5mm(2.75-3.25；3.25-3.75等)。在y軸上，顯示了每種類(lèi)型的植株的數(shù)目。圖5顯示了如在此所述的小花番茄QTL的連鎖圖。QTL-3p位于標(biāo)記物P15M48-234、P18M50-167、TG599、P18M51-486、P22M50-151和P14M60-65所示的區(qū)域內(nèi)。QTL-4p位于標(biāo)記物P14M48-158和P14M48-34xCD(＝表2中的P14M48-349)所示的區(qū)域內(nèi)。QTL-9p位于標(biāo)記物TG10、P22M50-56、P14M48-56、P14M50-82、P14M50-204、P15M48-138(＝表2中的P15M48-137)、P14M50-174(＝表2中的P14M50-176)、P22M51-201、P15M48-54、TM2a、P22M51-165、P14M48-120、TG551、P15M48-15xCD(＝表2中的P15M48-155)所示的區(qū)域內(nèi)。圖6顯示了如在此所述的多毛番茄QTL的連鎖圖和QTL圖表。圖譜是對(duì)圖1的圖譜的更新，更清楚地顯示了基因組區(qū)。所示的與QTL相關(guān)的所有標(biāo)記物(那些從TG301到并包括C1上的TG460的標(biāo)記物；那些從TG145到并包括C2上的At5g64670的標(biāo)記物；以及那些從TG339到并包括C4上的T1405的標(biāo)記物)可以被用作本發(fā)明的各個(gè)部分中的標(biāo)記物。這個(gè)更新的版本提供了本發(fā)明的各個(gè)部分中的優(yōu)選實(shí)施方式的基礎(chǔ)。具體實(shí)施例方式定義在此提供的標(biāo)題并不作為對(duì)整體引用本說(shuō)明書(shū)所具有的本發(fā)明的各方面或?qū)嵤┓绞降南拗?。因此，通過(guò)整體地引用本說(shuō)明書(shū)能更充分地定義在下面所定義的術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)“葡萄孢”在此表示灰色葡萄孢，也稱(chēng)作灰霉或灰斑，這是一種常見(jiàn)于番茄的莖、葉和果實(shí)的疾病。一般認(rèn)為植物致病性真菌核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotiorum)具有與灰色葡萄孢相似的感染機(jī)制(Prinsetal.，2000)。盡管番茄的核盤(pán)菌感染在經(jīng)濟(jì)上遠(yuǎn)沒(méi)有灰色葡萄孢感染重要，但是兩種真菌都分泌一大類(lèi)蛋白酶、植物細(xì)胞壁降解酶、毒素以及草酸。已知這些因素中有一些因素在兩種真菌的感染策略中都起到了作用。因此，相信賦予葡萄孢抗性的機(jī)制和基因能同樣有效地提供抗核盤(pán)菌感染的抗性。因此，當(dāng)在此引用“葡萄孢抗性”時(shí)，這些抗性應(yīng)當(dāng)被理解為包括對(duì)核盤(pán)菌科(Sclerotiniaceae)的任何真菌的抗性，優(yōu)選地是對(duì)核盤(pán)菌和灰色葡萄孢的抗性，更優(yōu)選地是對(duì)灰色葡萄孢的抗性。術(shù)語(yǔ)“等位基因”在此表示任何一種或多種基因的可選擇形式，所有的等位基因都涉及至少一種性狀或特性。在二倍體細(xì)胞或生物體中，給定基因的兩種等位基因都占據(jù)著一對(duì)同源染色體上的相應(yīng)基因座。因?yàn)楸景l(fā)明涉及QTL，即可包括一種或多種基因以及調(diào)節(jié)序列的基因組區(qū)，在某些情況中，用“單倍型”(即染色體片段的等位基因)代替“等位基因”是更為準(zhǔn)確的，但是在這些情況中，術(shù)語(yǔ)“等位基因”應(yīng)當(dāng)被理解為包括術(shù)語(yǔ)“單倍型”?！盎颉痹诖吮欢x為由DNA序列組成的遺傳單位，所述DNA序列占據(jù)著染色體上的特殊位置以及含有生物體中的特殊特征或性狀的遺傳構(gòu)建體?！盎蜃痹诖吮欢x為給定基因所占據(jù)的給定物種的染色體上的位置。術(shù)語(yǔ)“雜合子的”在此表示當(dāng)不同的等位基因位于同源染色體上的相應(yīng)基因座時(shí)所存在的遺傳狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)“純合子的”在此表示當(dāng)相同的等位基因位于同源染色體的相應(yīng)基因座時(shí)的遺傳狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)“雜種”在此表示兩種遺傳學(xué)上不同的個(gè)體之間的雜交的任何子代，包括但不限定于兩種近交系之間的雜交。術(shù)語(yǔ)“近交”在此表示基本上純合子的個(gè)體或品系。在本申請(qǐng)中，“重組事件”被理解為表示有絲分裂交換。術(shù)語(yǔ)“漸滲”、“被漸滲的”和“漸滲的”表示天然的和人為的過(guò)程，其中通過(guò)雜交這些物種將一種物種、變種或栽培種的基因移動(dòng)到了另一種物種、變種或栽培種的基因組內(nèi)。任選地通過(guò)與輪回親代的回交可以實(shí)現(xiàn)這些過(guò)程?！斑z傳工程”、“轉(zhuǎn)化”和“遺傳修飾”在此都是表示分離的和克隆的基因向另一生物體的DNA(通常是染色體DNA或基因組)中的轉(zhuǎn)移的同義詞。術(shù)語(yǔ)“分子標(biāo)記物”在此表示在方法中用于顯示核酸序列的特征差異的指示物。這些指示物的實(shí)例是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記物、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記物、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、微衛(wèi)星標(biāo)記物(例如SSRs)、序列特征性擴(kuò)增區(qū)(SCAR)標(biāo)記物、裂解性擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記物或同工酶標(biāo)記物或在此所述的定義出特異的遺傳和染色體的位置的標(biāo)記物的組合。術(shù)語(yǔ)“抗”和“抗性”包括對(duì)感染的部分和完全的抗性。葡萄孢易感的番茄植株可以是無(wú)抗性的或者具有低水平的葡萄孢抗性。術(shù)語(yǔ)“植物部分”在此表示番茄植株的部分，包括單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞組織例如植物中的完整的植物細(xì)胞、從中可以再生成番茄植株的細(xì)胞團(tuán)和組織培養(yǎng)物。植株部分的實(shí)例包括，但不限定于花粉、胚珠、葉、胚、根、根尖、花藥、花、果實(shí)、莖、枝條、和種子的單個(gè)細(xì)胞和組織以及花粉、胚珠、葉、胚、根、根尖、花藥、花、果實(shí)、莖、枝條、接穗、根莖、種子、原生質(zhì)體、愈傷組織等。術(shù)語(yǔ)“群”在此表示共享有共同的遺傳衍生性植株的遺傳異源的植株庫(kù)。術(shù)語(yǔ)“番茄”在此表示番茄屬的任一植物、系或群，包括但不限定于櫻桃番茄、奇士曼尼番茄、智利番茄、克梅留斯基番茄、普通番茄(或番茄(或Solanumlycopersicum))、多毛番茄、小花番茄、潘那利番茄、秘魯番茄、醋栗番茄或類(lèi)番茄茄。盡管Linnaeus首先將現(xiàn)代番茄分類(lèi)成了茄屬，但是其科學(xué)名字多年來(lái)一直都是普通番茄(Lycopersiconesculentum)。同樣，現(xiàn)代番茄的野生親株已經(jīng)被分類(lèi)到了番茄屬內(nèi)，例如潘那利番茄、多毛番茄、秘魯番茄、智利番茄、小花番茄、克梅留斯基番茄、奇士曼尼番茄、櫻桃番茄和醋栗番茄。在過(guò)去的數(shù)年里，番茄研究者和植株學(xué)家對(duì)是否重新分類(lèi)這些物種的名字一直都有爭(zhēng)議。新提出的現(xiàn)代番茄的科學(xué)名字是番茄(Solanumlycopersicum)。同樣，可以改變野生物種的名字。L.pennellii可以變成Solanumpennellii，L.hirsutum可以變成S.habrochaites，L.peruvianum可以分為S.′N(xiāo)peruvianum′和S.′CallejondeHuayles′，S.peruvianum、和S.corneliomuelleri，L.parviflorum可以變成S.neorickii，L.chmielewskii可以變成S.chmielewskii，L.chilense可以變成S.chilense，L.cheesmaniae可以變成S.cheesmaniae或S.galapagense，以及L.pimpinellifolium可以變成S.pimpinellifolium(SolanaceaGenomeNetwork(2005)SpoonerandKnapp；http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanumnomenclature.html)。術(shù)語(yǔ)“變種”或“栽培種”在此表示一組相似的植株，它們的結(jié)構(gòu)或遺傳特點(diǎn)和/或性質(zhì)與同一物種內(nèi)的其他變種都可以區(qū)分。術(shù)語(yǔ)“QTL”在此表示本領(lǐng)域認(rèn)可的含義。術(shù)語(yǔ)“與番茄的灰色葡萄孢抗性相關(guān)的QTL”以及更短的術(shù)語(yǔ)“葡萄孢抗性的QTL”都表示位于番茄的特殊染色體上的與至少一個(gè)編碼葡萄孢抗性的基因或者至少一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)(即控制一種或多種涉及葡萄孢抗性的染色體區(qū)域)相關(guān)的區(qū)域?；虻谋硇捅磉_(dá)例如可以被視為降低病變生長(zhǎng)速率和/或降低發(fā)病率。QTL例如可以包括一種或多種其產(chǎn)物能賦予遺傳抗性的基因。或者，QTL例如可以包括其產(chǎn)物影響植物基因組上的其他基因座上的基因的表達(dá)并據(jù)此賦予葡萄孢抗性的調(diào)節(jié)基因或序列。通過(guò)用一種或多種分子基因組標(biāo)記物指示出其在相應(yīng)的野生番茄株的基因組中的遺傳位置可以確定出本發(fā)明的QTL。一種或多種標(biāo)記物反過(guò)來(lái)可以指示出特異的基因座。通常用相同染色體上的基因座之間的交換頻率測(cè)定出基因座之間的距離。兩個(gè)基因座離得越遠(yuǎn)，它們之間發(fā)生交換的可能性就更大。相反地，如果兩個(gè)基因座非常接近，它們之間發(fā)生交換的可能性就越小。通常1厘摩(cM)等于基因座(標(biāo)記物)之間的1％重組。當(dāng)用多個(gè)標(biāo)記物指示出QTL時(shí)，端點(diǎn)標(biāo)記物之間的遺傳距離是QTL尺寸的指示。術(shù)語(yǔ)“葡萄孢易感的受體番茄植株”在此表示接受從包括葡萄孢抗性的QTL的供體番茄植株中獲得的DNA的番茄植株。所述“葡萄孢易感的受體番茄植株”可以已經(jīng)包括或者沒(méi)有包括一種或多種葡萄孢抗性的QTL，在這種情況中該術(shù)語(yǔ)表示將要接受附加的QTL的植株。術(shù)語(yǔ)“天然的遺傳背景”在此表示QTL的初始遺傳背景。這種背景可以是例如抗葡萄孢的番茄野生株的基因組。例如，可以在多毛番茄LYC4/78的1、2和4號(hào)染色體以及小花番茄G1.1601的3、4和9號(hào)染色體的特殊位置上發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的QTL。作為一個(gè)實(shí)例，多毛番茄LYC4/78代表多毛番茄LYC4/78的1、2和4號(hào)染色體上的QTL的天然遺傳背景。多毛番茄LYC4/78也代表所述QTL的天然遺傳背景。相反地，涉及將包括QTL和其賦予抗性部分的DNA從多毛番茄LYC4/78的1號(hào)染色體轉(zhuǎn)移到另一種番茄物種的1號(hào)染色體的相同位置的方法將使得QTL或所述其賦予抗性部分不處于其天然的遺傳背景內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“發(fā)病率”在此被定義為反映植物減少感染發(fā)生的能力的參數(shù)，例如通過(guò)確定植株在與感染性病原體接觸后發(fā)生感染的情況可以測(cè)定出這個(gè)參數(shù)。術(shù)語(yǔ)“病變生長(zhǎng)的速率”和“病變生長(zhǎng)速率”在此被定義為反映植株減緩或減少感染進(jìn)程的能力的參數(shù)，例如通過(guò)確定出擴(kuò)展性病變的生長(zhǎng)速率可以測(cè)定出這個(gè)參數(shù)。術(shù)語(yǔ)“定量測(cè)定”在此被定義為測(cè)定或評(píng)價(jià)的方式，包括測(cè)量，特別是測(cè)量在數(shù)量和數(shù)目方面可被測(cè)定的部分。關(guān)于嚴(yán)重程度以及用更大、更多、更少、或相等或增加的或降低的幅度表示的測(cè)定都不在本術(shù)語(yǔ)“定量測(cè)定”的范圍之內(nèi)，所述術(shù)語(yǔ)最終表示存在用于測(cè)定絕對(duì)值的客觀計(jì)數(shù)機(jī)制。因此“定量測(cè)定發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率”優(yōu)選地包括測(cè)定植株和感染病原體之間所有可能的造成可測(cè)量病變的感染性接觸的百分比(評(píng)價(jià)發(fā)病率)，和/或測(cè)定出所述一種和多種病變的直徑、周長(zhǎng)、面積或體積在合適真菌生長(zhǎng)的條件下隨著時(shí)間的增長(zhǎng)(評(píng)價(jià)病變生長(zhǎng)的速率)。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐條件”、“標(biāo)準(zhǔn)溫室條件”和“標(biāo)準(zhǔn)條件”都表示例如為了確定出疾病抗性的表型特征的目的，作為標(biāo)準(zhǔn)的植株生長(zhǎng)或培育的光照、濕度、溫度等條件。例如對(duì)于溫室，這表示16h白晝、15-25℃。更一般性而言，該術(shù)語(yǔ)表示8到24h光照期(光合成光子通量(PPF)為50到1000μmolm-2s-1)的標(biāo)準(zhǔn)和參照的生長(zhǎng)條件，更優(yōu)選地是16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的光照方案、氣溫約為白天19℃和夜間15℃、水蒸汽壓缺乏約為4.4gm-3(對(duì)應(yīng)于相對(duì)濕度(RH)約為60-85％)、600-700ppmCO2和大氣O2濃度以及大氣壓(一般為1008hPa)?？梢栽诮o部逐滴地或者以噴霧或薄霧的形式施用水和養(yǎng)分。在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明了標(biāo)準(zhǔn)生物檢測(cè)法的試驗(yàn)條件例如莖病變長(zhǎng)度檢測(cè)、發(fā)病率和病變生長(zhǎng)速率測(cè)量。更詳細(xì)地，如實(shí)施例3.10和3.11中所述的進(jìn)行平均莖病變長(zhǎng)度檢測(cè)。番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的QTL的鑒定已知野生番茄種提供了疾病和昆蟲(chóng)抗性性狀的合適來(lái)源，已經(jīng)證實(shí)在野生番茄種的葉子中具有部分的灰色葡萄孢抗性(Urbasch，1986)。過(guò)去有兩種因素妨礙了灰色葡萄孢抗性的育種。首先，將部分抗性雜交到商品化育種系中只獲得了有限的成功。其次，缺少可靠的和可重復(fù)的疾病檢測(cè)法，所述方法使得能鑒定并定位出造成賦予抗性的遺傳物質(zhì)。Urbasch(Urbasch，1986)例如利用瓊脂栓用菌絲體感染葉子，其給真菌提供過(guò)量的養(yǎng)分，這強(qiáng)有力地實(shí)現(xiàn)了感染過(guò)程。其他研究者已經(jīng)使用了主觀的植株疾病指數(shù)，但這不適用于鑒定數(shù)量性狀基因座(QTL)所需的定量分析。相對(duì)好地研究了在實(shí)驗(yàn)室條件下番茄中的灰色葡萄孢感染(例如Benitoetal.，1998)。對(duì)葉子的滴露接種以及隨后在適合溫度(15-20℃)下的孵育都造成了在接種部位上快速地(感染后16-24h(hpi))出現(xiàn)了壞死斑。感染在近48h內(nèi)都被暫時(shí)地限定于這個(gè)部位。從這個(gè)時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始，一定比例(通常是5-10％)的病變開(kāi)始擴(kuò)展。這種向外生長(zhǎng)被稱(chēng)作“擴(kuò)展性病變”，其是通過(guò)真菌生物量的增長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)的，并在隨后的48h內(nèi)造成了對(duì)完整小葉的建群。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用測(cè)量抗性的生物檢測(cè)法時(shí)可以鑒定出番茄中與葡萄孢抗性相關(guān)的特異QTL，所述生物檢測(cè)法定量地測(cè)量出番茄植株部分上(優(yōu)選地是分離的部分，更優(yōu)選地是莖節(jié)段)的感染進(jìn)程的速率和/或接觸感染性病原體之后成功實(shí)現(xiàn)感染的情況。驚奇地發(fā)現(xiàn)，抗葡萄孢的番茄植株的基因組上存在著多個(gè)葡萄孢抗性的QTL，而現(xiàn)有技術(shù)的方法只能進(jìn)行對(duì)單個(gè)葡萄孢抗性的QTL的試驗(yàn)性鑒定。此外，用這些方法發(fā)現(xiàn)的QTL位于先前與番茄植株的葡萄孢抗性無(wú)關(guān)的染色體上，以及QTL與各種表型的抗性表現(xiàn)有關(guān)。因此，本發(fā)明的方法提供了番茄中的葡萄孢抗性的遺傳基礎(chǔ)是多基因的新觀點(diǎn)。例如，發(fā)現(xiàn)存在于多毛番茄LYC4/78的2和4號(hào)染色體上的基因區(qū)造成了發(fā)病率的下降，而存在于1號(hào)染色體上的基因區(qū)至少部分造成了病變生長(zhǎng)速率的降低。發(fā)現(xiàn)與這些表型相關(guān)的相似的遺傳區(qū)也存在于小花番茄G1.1601，盡管這些基因區(qū)不一定都位于相同的染色體上。此外，還發(fā)現(xiàn)新的QTL區(qū)與比現(xiàn)有技術(shù)中在10號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)的QTL更高水平的抗性相關(guān)。因此，本發(fā)明的方法能揭示出能賦予植株比先前所能獲得的抗性水平更高的抗性水平的葡萄孢抗性的主要QTL。因此，本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它能夠發(fā)現(xiàn)與更高水平的葡萄孢抗性相關(guān)的QTL。用任何可用的方法例如通過(guò)使用本發(fā)明的方法和通過(guò)使用現(xiàn)有技術(shù)的傳統(tǒng)方法都可以確定出抗性水平。在下面的實(shí)施例中提供了對(duì)試驗(yàn)方案和條件的詳細(xì)的描述。一種本發(fā)明的用于檢測(cè)出與番茄的葡萄孢抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法或者稱(chēng)為用于鑒定或定位出數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法都需要得到(部分)抗葡萄孢的番茄植株。用本領(lǐng)域已知的任一方式以及通過(guò)利用任一用于確定出所述植株中存在所述(部分)抗性的方法都可以提供這種植株。提供(部分)抗葡萄孢的番茄植株(其還可以作為本發(fā)明的方法中的供體植株)使得能夠建立或提供染色體標(biāo)記物，優(yōu)選地是AFLP、CAPS和/或SCAR標(biāo)記物，最優(yōu)選地是CAPS和/或SCAR標(biāo)記物，至少是所述植株的一條染色體，但優(yōu)選地是所述植株的所有染色體。通過(guò)建立全長(zhǎng)所述染色體上的染色體標(biāo)記物文庫(kù)，可以有效地標(biāo)記出所述染色體的各個(gè)位點(diǎn)。這些方法在本領(lǐng)域是公知的，下面將更詳細(xì)地描述示例的方法。本發(fā)明的用于檢測(cè)番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法包括第一步是所述(部分)抗葡萄孢的供體番茄植株與無(wú)抗性的或葡萄孢易感的受體番茄植株雜交生成子代植株。隨后用感染量的葡萄孢接觸一種或多種子代植株。根據(jù)所測(cè)試的植株和真菌種的不同，所用的感染量可以有所不同。通常約1到10個(gè)所述真菌的分生孢子到500到5000個(gè)所述真菌的分生孢子是足夠量的。隨后的步驟包括定量測(cè)定出所述雜交生成的一種或多種子代植株中的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率。優(yōu)選地在多個(gè)子代植株中進(jìn)行所述的定量測(cè)定。子代植株優(yōu)選地是源自抗葡萄孢的供體番茄植株和無(wú)抗性的或葡萄孢易感的受體番茄植株之間的雜交的F2群的植株。優(yōu)選地，作為子代，使用分離的F2群，更優(yōu)選地，使用源自普通番茄栽培種Moneymaker和多毛番茄LYC4/78之間雜交的F2群。在實(shí)踐中，源自所述雜交的F1種子可以生長(zhǎng)成F1植株，在此之后單個(gè)F1植株自交生成F2種子，隨后用本發(fā)明的方法測(cè)定所述種子生成的F2植株的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率。同樣，F(xiàn)3系也可以用于抗性檢測(cè)。作為抗性生物檢測(cè)法的一部分，優(yōu)選地在此所述的莖節(jié)段或葉子上進(jìn)行一種或多種子代植株與感染量的葡萄孢接觸以及定量測(cè)定所述一種或多種子代植株的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率的步驟，優(yōu)選地在莖節(jié)段上進(jìn)行抗性生物檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解如下面所述的檢測(cè)的變異是可能的。基本上如下進(jìn)行莖節(jié)段上的抗性生物檢測(cè)首先，播種子代植株的種子并生成合適的高度近似為50cm的苗/植株。去除植株的莖頂部的5-10cm以及底部的5-10cm，剩下的30cm可以被切成5-6cm的相等節(jié)段。優(yōu)選地將莖節(jié)段垂直地放置于格子內(nèi)，莖底部放置于濕濾紙上。在接種之前，給莖節(jié)段適當(dāng)?shù)貒婌F水，以保證接種物在創(chuàng)傷表面的均勻播散。然后用灰色葡萄孢的分生孢子懸浮液接種每個(gè)莖節(jié)段。可以給每個(gè)莖節(jié)段的頂部施用合適量的接種物，例如1滴約5μl、包括近106分生孢子ml-1的接種物。然后在合適溫度約16℃、優(yōu)選地在暗處以及優(yōu)選地在高濕度(例如100％RH)下孵育莖節(jié)段。通過(guò)在接種后的不同時(shí)間間隔內(nèi)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腐爛癥狀的最大進(jìn)程量可以定量地測(cè)定出感染進(jìn)程。然后可以在多個(gè)合適的時(shí)間間隔例如感染后(hpi)96、120和144小時(shí)以定量的方式檢查莖的病變形成(發(fā)病率)和病變生長(zhǎng)。非常合適的參數(shù)包括例如用測(cè)徑器測(cè)量到的病變大小的測(cè)量值。為了校正季節(jié)或植物栽培所引起的變差，生物檢測(cè)的定量測(cè)量值可以涉及與易感對(duì)照或參照系的比較測(cè)量值。通過(guò)用擴(kuò)展性病變的總數(shù)除以接種物的總滴數(shù)可以合適地測(cè)定出發(fā)病率。然后用特殊基因型上的擴(kuò)展性病變的比例除以在對(duì)照或參照基因型中觀察到的擴(kuò)展性病變的比例，并用百分比表示。可替代地或者附加地，通過(guò)計(jì)算出合適時(shí)間內(nèi)(例如24h內(nèi))的病變大小的增加值(例如mm單位)可以測(cè)定出病變生長(zhǎng)速率?？梢詮亩糠治鲋袆h除非擴(kuò)展性病變的數(shù)據(jù)。然后可以任選地用病變生長(zhǎng)速率除以在對(duì)照或參照基因型中觀察到的病變生長(zhǎng)速率，并用百分比表示或者用絕對(duì)值表示(例如單位為毫米)。或者，通過(guò)利用如下的葉感染生物檢測(cè)可以篩選植株首先，播種番茄種子并生長(zhǎng)成苗/植株。對(duì)于每個(gè)單個(gè)植株，可以從主莖切下一片或兩片復(fù)葉，并將其轉(zhuǎn)移到預(yù)先浸濕的花卉泡沫(floristfoam)內(nèi)。然后將花卉泡沫放置于含有自來(lái)水的Petri皿內(nèi)，隨后將其放置于含有濕濾紙的經(jīng)噴霧濕化的容器內(nèi)。用本領(lǐng)域已知的方法例如如Benito等，1998年所述的方法可以制備出包括灰色葡萄孢的分生孢子的合適的接種物。然后，用灰色葡萄孢的分生孢子懸浮液通過(guò)向葉的上表面上滴上多滴例如6到10滴接種物(每滴2μl)接種復(fù)葉。然后關(guān)閉容器，并在合適溫度約15-20℃、優(yōu)選地在暗處以及優(yōu)選地在高濕度下孵育葉子。然后可以在多個(gè)合適的時(shí)間間隔例如感染后(hpi)96、120和144小時(shí)以如上述的用于莖生物檢測(cè)的定量方式檢查葉的發(fā)病率和病變生長(zhǎng)。本發(fā)明的用于檢測(cè)番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法還包括建立聯(lián)系在所述一種或多種子代植株中所觀察到的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率和存在染色體標(biāo)記物的遺傳連鎖圖，并將所述圖上的與降低發(fā)病率和/或降低病變生長(zhǎng)速率相關(guān)的相鄰的標(biāo)記物分配給數(shù)量性狀基因座的步驟。用本領(lǐng)域已知的任何方法都可以建立出聯(lián)系所述一種或多種子代植株中所觀察到的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率和存在供體番茄植株的染色體標(biāo)記物的遺傳連鎖圖。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于鑒定與抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)相關(guān)的分子標(biāo)記物以及在遺傳連鎖圖中基因定位(mapping)出這些標(biāo)記物的方法(見(jiàn)例如Baietal.，2003；Fooladetal.，2002；vanHeusdenetal.，1999)。利用這些軟件包例如JoinMap和MapQTL(見(jiàn)實(shí)施例)或者可以進(jìn)行變異分析的任一標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)包都可以合適地計(jì)算出葡萄孢抗性表型和標(biāo)記物基因型之間的相關(guān)性。分子標(biāo)記物可以被用于構(gòu)建遺傳連鎖圖并鑒定出葡萄孢抗性的數(shù)量性狀基因座(QTL)。下面將更詳細(xì)地描述合適類(lèi)型的分子標(biāo)記物以及獲得這些標(biāo)記物的方法。通過(guò)減少生物檢測(cè)中的實(shí)驗(yàn)變差和/或通過(guò)構(gòu)建完全回交近交群(BIL)還可以改進(jìn)本發(fā)明的用于檢測(cè)番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法。通過(guò)聯(lián)合本發(fā)明的方法使用這種BIL系，甚至可以更精確地評(píng)價(jià)出定量的灰色葡萄孢抗性，以及可以鑒定出附加的QTL。分子標(biāo)記物和QTL用分子標(biāo)記物顯現(xiàn)出核酸序列之間的差異。這種顯現(xiàn)作用可能取決于DNA-DNA雜交技術(shù)(RFLP)和/或是因?yàn)槔镁酆厦告湻磻?yīng)的技術(shù)(例如STS、微隨體、AFLP)。在基于這些親代基因型雜交的繪圖群(例如BC1、F2，見(jiàn)圖2)中，兩種親代基因型之間的所有差異都是分離的?？梢员容^不同標(biāo)記物的分離，并計(jì)算出重組頻率。不同染色體上的分子標(biāo)記物的重組頻率通常是50％。在位于相同染色體上的分子標(biāo)記物之間的重組頻率取決于標(biāo)記物之間的距離。低重組頻率對(duì)應(yīng)于染色體上的標(biāo)記物之間的低距離。對(duì)所有重組頻率的比較將形成分子標(biāo)記物在染色體上的最合乎邏輯的次序。在連鎖圖中可以描繪出這個(gè)最合乎邏輯的次序(Paterson，1996)。連鎖圖上的一組與降低發(fā)病率和/或降低病變生長(zhǎng)速率相關(guān)的鄰接的或相鄰的標(biāo)記物可以精確地突出QTL的位置。在鑒定出QTL之后，例如通過(guò)評(píng)價(jià)在研究中出現(xiàn)QTL分離的BC2S1后代中的葡萄孢抗性可以驗(yàn)證QTL效應(yīng)(抗性)。利用在此所述的莖或葉生物檢測(cè)可以合適地進(jìn)行葡萄孢抗性的評(píng)價(jià)。利用本發(fā)明的方法可獲得的抗葡萄孢抗性的QTL是本發(fā)明的一個(gè)方面。這些QTL的特征是，當(dāng)它們存在于植株內(nèi)時(shí)，它們是在所述植株與感染量的葡萄孢物質(zhì)接觸之后出現(xiàn)發(fā)病率降低和/或病變生長(zhǎng)速率降低的指示，可以提供任何形式的所述葡萄孢物質(zhì)，例如分生孢子或菌絲體的形式。本發(fā)明也涉及番茄中的抗葡萄孢抗性的QTL，其中所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1、2和4號(hào)染色體上的QTL以及小花番茄G1.1601的3、4、和9號(hào)染色體上的QTL組成的組。用表1和2所列的標(biāo)記物以及圖1、5和6所示的標(biāo)記物更為清楚地定義或指示出這些QTL。表1和圖1和6顯示了在源自普通番茄栽培種Moneymaker和多毛番茄LYC4/78雜交的F2群中找到的QTL。表2和圖5顯示了在源自普通番茄栽培種Moneymaker和小花番茄G1.1601雜交的F2群中找到的QTL。在兩個(gè)表中，用所列的AFLP標(biāo)記物顯示出了QTL所位于的基因組區(qū)。本發(fā)明的QTL包括DNA形式的能賦予番茄植株中的(部分)葡萄孢發(fā)病率或降低葡萄孢病變生長(zhǎng)速率的遺傳信息。本發(fā)明的遺傳信息例如可以包括基因或調(diào)節(jié)元件。表1在普通番茄栽培種Moneymakerx多毛番茄LYC4/78的雜交子代中找到的QTL以及相關(guān)的定量抗性信息。1標(biāo)記物命名例如P-GTM-CAT-412h，其中P和M是常用的PstI和MseI引物序列或通用引物(Vosetal.，1995；Baietal.2003)，加上如兩個(gè)數(shù)字?jǐn)U展碼所示的2個(gè)或3個(gè)額外的選擇堿基。412是所形成的多態(tài)性片段的堿基對(duì)的近似大小(給定大小±2個(gè)堿基對(duì))。大小通常地被四舍五入，但是也可以給出有小數(shù)的大小?？梢栽谄胀ǚ言耘喾NMoneymaker(e)或多毛番茄LYC4/78(h)中擴(kuò)增該片段。Bai等，2003詳細(xì)地描述了引物和連接子序列。2常常用代碼表示AFLP引物組合。對(duì)于P、M見(jiàn)標(biāo)記物命名。兩個(gè)數(shù)字?jǐn)U展碼如下14AT、15CA、18CT、22GT、48CAC、49CAG、50CAT、51CCA、60CTC、61CTG。3aa標(biāo)記物純合子的普通番茄；ab標(biāo)記物雜合子；bb標(biāo)記物純合子的野生親屬株多毛番茄LYC4/78。4用在實(shí)施例中詳細(xì)描述的方法測(cè)定出發(fā)病率和病變生長(zhǎng)。5CT128(見(jiàn)表25)是位于2號(hào)染色體上的Tanksley圖44cM位置處的標(biāo)記物(Tanksleyetal.1992)。6TG609(見(jiàn)表20)是位于4號(hào)染色體上的基于番茄(S.lycopersicum栽培種.VF36)x潘那利番茄LA716的F2群的Tomato-EXPEN1992組合圖38cM位置處的RFLP標(biāo)記物(Tanksleyetal.1992)。更為可靠地，QTL-1h所位于的基因組區(qū)是處于如圖6所示的標(biāo)記物TG301(表11)和TG460.61(表12)之間。因此，任一位于該區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記物以及任一依據(jù)可公開(kāi)獲得的信息已知其位于該區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記物都可以被用于評(píng)價(jià)植物的基因組內(nèi)是否存在QTL，可公開(kāi)獲得的信息包括例如共有序列圖Tomato-EXPEN1992(Tanksleyetal.，1992)、Tomato-EXHIR1997(BemacchiandTanksley，1997)、Tomato-EXPEN2000(Fultonetal.，2002)或Tomato-EXPIMP2001(GrandilloandTanksley，1996；Tanksleyetal.1996，Doganlaretal.2002)。圖6的欄顯示了最優(yōu)選的區(qū)域。最為可靠地，QTL-2h所位于的基因組區(qū)是處于如圖6所示的標(biāo)記物TG145(表15)和At5g64670(表19)之間。因此，任一位于該區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記物以及任一依據(jù)可公開(kāi)獲得的信息已知其位于該區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記物都可以被用于評(píng)價(jià)植物的基因組內(nèi)是否存在QTL。圖6的欄顯示了最優(yōu)選的區(qū)域。最為可靠地，QTL-4h所位于的基因組區(qū)是處于如圖6所示的標(biāo)記物TG609(表20)和C2Atlg74970(表24)之間。因此，任一位于該區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記物以及任一依據(jù)可公開(kāi)獲得的信息已知其位于該區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記物都可以被用于評(píng)價(jià)植物的基因組內(nèi)是否存在QTL。表2在普通番茄栽培種Moneymakerx小花番茄G1.1601雜交的子代中發(fā)現(xiàn)的QTL以及相關(guān)的數(shù)量抗性信息。1標(biāo)記物命名例如P-CAM-CAC-234p，其中P、M和E是常用的PstI、EcoRI和MseI引物序列或通用引物(Vosetal.，1995；Baietal.2003)，加上所示的2個(gè)或3個(gè)額外的選擇堿基。234是所形成的多態(tài)性片段的堿基對(duì)的近似大小(給定大小±2個(gè)堿基對(duì))。在普通番茄栽培種Moneymaker(e)或小花番茄G1.1601(p)內(nèi)擴(kuò)增該片段。Bai等，2003詳細(xì)地描述了引物和連接子序列。2常常用代碼表示AFLP引物組合。對(duì)于P、M見(jiàn)標(biāo)記物命名。3aa標(biāo)記物純合子的普通番茄；b-一個(gè)等位基因是野生親株(此處是小花番茄)，另一個(gè)等位基因可以是普通番茄或野生親株。最為可靠地，QTL-3p所位于的基因組區(qū)是由標(biāo)記物P15M48-234、P18M50-167、TG599、P18M51-486、P22M50-151和P14M60-65所示的區(qū)域。最為可靠地，QTL-4p所位于的基因組區(qū)是由標(biāo)記物P14M48-158和P14M48-34xCD(＝表2中的P14M48-349)所示的區(qū)域。最為可靠地，QTL-9p所位于的基因組區(qū)是由標(biāo)記物TG10、P22M50-56、P14M48-56、P14M50-82、P14M50-204、P15M48-138(＝表2中的P15M48-137)、P14M50-174(＝表2中的P14M50-176)、P22M51-201、P15M48-54、TM2a、P22M51-165、P14M48-120、TG551、P15M48-15xCD(＝表2中的P15M48-155)所示的區(qū)域。所有在普通番茄栽培種Moneymakerx小花番茄G1.1601雜交的子代中發(fā)現(xiàn)的QTL的標(biāo)記物以及任一依據(jù)可公開(kāi)獲得的信息已知其位于該區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記物都可以被用于本發(fā)明的各個(gè)部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的QTL包括至少一種與所述QTL相連的表1或2的標(biāo)記物或如圖1、5或6所示的標(biāo)記物。因?yàn)槭沟媚苜x予葡萄孢抗性的QTL的核酸序列可能僅僅是所鑒定到的整個(gè)QTL的一部分，因此標(biāo)記物只指示出了遺傳區(qū)的連鎖遺傳性或者缺少這些遺傳區(qū)內(nèi)的所觀察到的重組。因此，要注意表1和2所列的標(biāo)記物以及圖1、5和6所示的標(biāo)記物都只指示出了特定番茄系的基因組中的本發(fā)明的QTL所處于的染色體區(qū)域，以及要注意這些標(biāo)記物并非必定能確定出QTL的界限或結(jié)構(gòu)。因此，包括基本的賦予抗性的核酸序列的QTL部分明顯地要比所列的特定QTL的相鄰標(biāo)記物所示的部分更小。該部分在此被稱(chēng)作QTL的“賦予抗性的部分”。因此，QTL的賦予抗性的部分不必一定要包括所有所述列舉的標(biāo)記物。其他的標(biāo)記物也可以用于指示各種QTL，只要這些標(biāo)記物遺傳上與QTL相連接，技術(shù)人員可以發(fā)現(xiàn)或使用與本發(fā)明的QTL類(lèi)似的QTL，但是其中不存在一種或多種與所述QTL相連的表1或2所列的標(biāo)記物或圖1、5或6所示的標(biāo)記物。通過(guò)使用分子標(biāo)記物技術(shù)，例如用一種或多種與所述QTL相連的表1或2所示的或圖1、5或6所示的QTL的標(biāo)記物，優(yōu)選地聯(lián)合抗性生物檢測(cè)可以鑒定出番茄中的抗葡萄孢抗性的QTL的賦予葡萄孢抗性部分。不包括本發(fā)明的QTL的賦予葡萄孢抗性的部分的番茄植株相對(duì)地易感于葡萄孢感染。本發(fā)明所提供的標(biāo)記物可以非常合適地應(yīng)用于檢測(cè)疑為抗葡萄孢的番茄植株中是否存在一種或多種本發(fā)明的QTL，且因此可以被用于涉及標(biāo)記物輔助性育種以及抗葡萄孢番茄植株的選擇的方法。優(yōu)選地，用至少一種與所述QTL相連的表1或2或圖1、5或6所示的QTL的標(biāo)記物進(jìn)行是否存在本發(fā)明的QTL的檢測(cè)。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)是否存在葡萄孢抗性的QTL的方法，包括檢測(cè)在疑為抗葡萄孢的番茄植株中是否存在所述QTL的核酸序列，用所述標(biāo)記物可以檢測(cè)出其的存在?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定出本發(fā)明的QTL的核酸序列。例如，通過(guò)對(duì)所述植株基因組的片段化以及選擇出具有一種或多種作為所述QTL的指示的標(biāo)記物的那些片段可以從抗葡萄孢的供體植株中分離出包括所述QTL或其賦予抗性部分的核酸序列。隨后或可替代地，作為所述QTL的指示的標(biāo)記物序列(或其部分)可以被用作PCR擴(kuò)增引物，以便從所述植株中獲得的基因組核酸樣品或基因組片段中擴(kuò)增出包括所述QTL的核酸序列。然后可以純化出所擴(kuò)增的片段，以便獲得分離的QTL。然好用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序方法可以獲得QTL的核苷酸序列和/或包含其中的任一附加的標(biāo)記物。本發(fā)明的方法因此涉及包括本發(fā)明的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的分離的核酸(優(yōu)選地是DNA)序列。因此，指示出各種在此所述的QTL的標(biāo)記物可以被用于從番茄中鑒定、分離和純化出編碼葡萄孢抗性的一種或多種基因。通過(guò)確定與所述QTL相關(guān)的一種或多種標(biāo)記物的核苷酸序列以及為所述標(biāo)記物序列設(shè)計(jì)出內(nèi)引物(所述引物可以用于進(jìn)一步地確定出所述標(biāo)記物序列外的QTL的序列)例如也可以分辨本發(fā)明的QTL的核苷酸序列。例如，通過(guò)在確定目標(biāo)植物的基因組中是否存在所述標(biāo)記物中所用的電泳凝膠中分離所述的標(biāo)記物以及例如用本領(lǐng)域公知的雙脫氧鏈終止法確定出所述標(biāo)記物的核苷酸序列可以獲得表1和表2的AFLP標(biāo)記物的核苷酸序列。在這種用于檢測(cè)疑為抗葡萄孢的番茄植株中是否存在QTL的方法的實(shí)施方式中，本發(fā)明也可以包括步驟為與所述QTL相連的標(biāo)記物的核酸序列提供在嚴(yán)格雜交條件下能夠與之雜交的寡核苷酸或多核苷酸，所述標(biāo)記物優(yōu)選地選自與所述QTL相連的表1和2以及圖1、5或6所示的標(biāo)記物；將所述寡核苷酸或多核苷酸與疑為抗葡萄孢的番茄植株的基因組核酸接觸，并確定出是否存在所述寡核苷酸或多核苷酸與所述基因組核酸的特異雜交。優(yōu)選地，在從所述疑為抗葡萄孢的番茄植株中獲得的核酸樣品中進(jìn)行所述的方法，盡管也可以采用原位雜交方法。同樣，在更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，一旦確定出QTL的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以設(shè)計(jì)出能夠在嚴(yán)格雜交條件下與所述QTL的核酸序列雜交的特異雜交探針或寡核苷酸，并且可以在用于檢測(cè)疑為抗葡萄孢的番茄植株中是否存在本發(fā)明的QTL的方法中使用這些雜交探針。短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”指的是探針或多核苷酸通常能與復(fù)雜的核酸混合物中的靶向子序列雜交但基本上不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴(lài)性的，在不同的情況下是有所不同的。更長(zhǎng)的序列將在更高的溫度下特異地雜交。在Tijssen(Thijssen，1993)中可以找到關(guān)于核酸雜交的充分指南。一般而言，所選定的嚴(yán)格條件比特定序列在給定離子強(qiáng)度和pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10℃。Tm是(在給定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度)其中50％的與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列平衡雜交的溫度(當(dāng)存在過(guò)量的靶序列時(shí)，在Tm時(shí)，50％的探針被平衡雜交)。嚴(yán)格條件將是其中鹽濃度小于約1.0M鈉離子(通常約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其他鹽濃度))、pH7.0到8.3以及短探針(例如10到50個(gè)核苷酸)的溫度至少是約30℃，長(zhǎng)探針(例如大于50個(gè)核苷酸)的溫度至少是約60℃的條件。通過(guò)加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺也可以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。對(duì)于選擇性的或特異的雜交，陽(yáng)性信號(hào)至少是背景信號(hào)的兩倍，優(yōu)選地是背景雜交信號(hào)的10倍。示例的嚴(yán)格雜交條件常常是50％甲酰胺、5xSSC、和1％SDS，在42℃下孵育；或5xSSC、1％SDS，在65℃下孵育；在0.2xSSC和0.1SDS，65℃下洗滌。對(duì)于PCR而言，約36℃的溫度通常是低嚴(yán)格的擴(kuò)增，盡管退火溫度根據(jù)引物長(zhǎng)度可以是在約32℃和48℃之間不等。在多種參考文獻(xiàn)例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，eds.Ausubel，etal.1995中都提供了用于確定雜交參數(shù)的附加指南。在此所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或所用的語(yǔ)法上的等同詞在此都表示至少兩個(gè)彼此共價(jià)連接在一起的核苷酸。寡核苷酸的長(zhǎng)度通常是從約7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、40、50或最多100個(gè)核苷酸。核酸和多核苷酸是任何長(zhǎng)度的聚合物，包括更長(zhǎng)的長(zhǎng)度例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000或10000個(gè)核苷酸等。本發(fā)明的核酸一般都含有磷酸二酯鍵，盡管在一些情況中，可以包括核酸類(lèi)似物，其可以具有其他的骨架，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯鍵(見(jiàn)Eckstein，1991)、和肽核酸骨架及連鍵。可以使用天然存在的核酸和類(lèi)似物的混合物。特別優(yōu)選的寡核苷酸的類(lèi)似物是肽核酸(PNA)。用轉(zhuǎn)基因方法生成抗葡萄孢的番茄植株根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，包括本發(fā)明的至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸(優(yōu)選地是DNA)序列可以用于生成抗葡萄孢的番茄植株。在這個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分用于生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的用途，所述用途包含往葡萄孢易感的受體番茄植株中引入包括所述QTL的核酸序列。如所述的那樣，所述核酸序列可以源自合適的抗葡萄孢的供體番茄植株。能夠提供包括至少一種此前所述的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸序列的兩種合適的抗葡萄孢的供體番茄植株是多毛番茄LYC4/78和小花番茄G1.1601。當(dāng)本發(fā)明描述如何可以鑒定出這種物質(zhì)時(shí)，其他表現(xiàn)出葡萄孢抗性以及包括一種或多種編碼葡萄孢抗性的相關(guān)番茄植株也可以用作抗葡萄孢的供體植株?？梢员挥糜跈z測(cè)葡萄孢抗性的其他番茄種株包括，但不限定于櫻桃番茄、奇士曼尼番茄、智利番茄、克梅留斯基番茄、普通番茄、多毛番茄、小花番茄、潘那利番茄、秘魯番茄、醋栗番茄和類(lèi)番茄茄。一旦在合適的供體番茄植株中鑒定出所述核酸序列，用任何可用的方法都可以將包括本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL或其賦予葡萄孢抗性部分的核酸序列轉(zhuǎn)移到合適的受體植株內(nèi)。例如，通過(guò)雜交抗葡萄孢的供體番茄植株和易感的受體番茄植株(例如通過(guò)漸滲)、通過(guò)轉(zhuǎn)化、通過(guò)原生質(zhì)體融合、通過(guò)雙單倍體技術(shù)或者通過(guò)胚拯救或任何其他的核酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)移所述核酸序列，任選地緊接著的是選擇包括QTL并表現(xiàn)出葡萄孢抗性的子代植株。對(duì)于轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)移方法，用本領(lǐng)域已知的方法可以從所述供體植株中分離出包括本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸序列，因此用轉(zhuǎn)基因方法例如配子中的載體方式或者任何其他合適的轉(zhuǎn)移元件例如經(jīng)所述核酸序列涂敷的沖擊顆粒的方式可以將分離的核酸序列轉(zhuǎn)移到受體植株中。植物轉(zhuǎn)化通常包含構(gòu)建出在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用的表達(dá)載體。在本發(fā)明中，這種載體包括本發(fā)明的葡萄孢抗性的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸序列，其中載體可以包括處于調(diào)節(jié)元件例如啟動(dòng)子的控制之下或者與之可操縱地連接的賦予葡萄孢抗性的基因。表達(dá)載體可以包含一種或多種這種可操縱地連接的基因/調(diào)節(jié)元件組合，只要組合中所含的至少一種基因編碼葡萄孢抗性。載體可以是質(zhì)粒形式，并且用本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化方法例如土壤桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以單獨(dú)使用或者與其他質(zhì)粒聯(lián)合使用所述質(zhì)粒，以便提供抗葡萄孢的轉(zhuǎn)基因植物。表達(dá)載體可以包含至少一種與調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)可操縱地連接的標(biāo)記物基因，其容許通過(guò)負(fù)選擇(通過(guò)抑制不含選擇性標(biāo)記物基因的細(xì)胞的生長(zhǎng))或者通過(guò)正選擇(通過(guò)篩選標(biāo)記物基因編碼的產(chǎn)物)回收含有標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于植物轉(zhuǎn)化的多種常用的選擇性標(biāo)記物基因在本領(lǐng)域是已知的，并包括例如編碼代謝性地解毒作為抗生素或除草劑的選擇性化學(xué)試劑的酶的基因，或者編碼對(duì)抑制物不敏感的改變的靶點(diǎn)的基因。一些正選擇方法在本領(lǐng)域是已知的，例如甘露糖選擇。同樣，可以用無(wú)標(biāo)記物轉(zhuǎn)化獲得沒(méi)有所提及的標(biāo)記物基因的植物，這種技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。一種用于向植物內(nèi)引入表達(dá)載體的方法是依據(jù)于土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(見(jiàn)例如Horschetal.，1985)。根癌土壤桿菌(A.Tumefaciens)和發(fā)根土壤桿菌(A.Rhizogenes)是遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物致病性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶造成植物的遺傳轉(zhuǎn)化的基因(見(jiàn)例如Kado，1991)。往植物組織中引入表達(dá)載體的方法包括用根癌土壤桿菌直接感染或共培養(yǎng)植物細(xì)胞(Horschetal.，1985)。GruberandCrosby，1993和Moloneyetal.，1989提供了用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的載體系統(tǒng)和方法，也見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利No.5,591,616。在GruberandCrosby，1993中可以找到對(duì)植物表達(dá)載體和報(bào)告子基因以及轉(zhuǎn)化方案的綜合描述以及對(duì)土壤桿菌載體系統(tǒng)及用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的方法的描述。例如Mikietal.，1993和Phillips，etal.，1988提供了培養(yǎng)植物組織的一般方法。分子克隆技術(shù)和合適表達(dá)載體的合適參考手冊(cè)是SambrookandRussell(2001)。另一種用于向植物內(nèi)引入表達(dá)載體的方法是依據(jù)于微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中微粒的表面攜帶有DNA。用沖擊裝置將表達(dá)載體引入到植物組織內(nèi)，所述沖擊裝置能將微粒加速到300到600m/s的速度，這足以穿透植物細(xì)胞壁和膜(見(jiàn)，Sanfordetal.，1987，1993；Sanford，1988，1990；Kleinetal.，1988，1992)。另一種用于向植物內(nèi)引入DNA的方法是通對(duì)靶細(xì)胞的超聲處理(見(jiàn)Zhangetal.，1991)?；蛘?，已經(jīng)用脂質(zhì)體或質(zhì)體融合向植物內(nèi)引入表達(dá)載體(見(jiàn)例如Deshayesetal.，1985和Christouetal.，1987)。也已經(jīng)報(bào)道了，用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚L-鳥(niǎo)氨酸使得DNA被直接攝入到原生質(zhì)體內(nèi)(見(jiàn)例如Hainetal.1985和Draperetal.，1982)。也已經(jīng)描述了對(duì)原生質(zhì)體和完整細(xì)胞及組織的電穿孔(D′Halluinetal.，1992和Laursenetal.，1994)。在轉(zhuǎn)化番茄靶組織之后，利用本領(lǐng)域目前公知的再生和選擇方法，上面所述的可選擇標(biāo)記物基因的表達(dá)容許優(yōu)先選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織和/或植物。表1或2的標(biāo)記物也可以用于此目的。用非轉(zhuǎn)基因方法生成抗葡萄孢的番茄植株在用于生成抗葡萄孢的番茄植株的另一個(gè)實(shí)施方式中，可以用原生質(zhì)體融合將核酸從供體植株轉(zhuǎn)移到受體植株內(nèi)。原生質(zhì)體融合是兩個(gè)或多個(gè)原生質(zhì)體(用酶處理去除了細(xì)胞壁的細(xì)胞)之間的一種可誘導(dǎo)的或自發(fā)的聯(lián)合(union)，以生成單個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)核的細(xì)胞。甚至用不能天然地品種間雜交的植物種類(lèi)所獲得的融合細(xì)胞可以被組織培養(yǎng)成為表現(xiàn)出所需的性狀組合的雜種植物。更具體地，可以從表現(xiàn)出抗葡萄孢感染的番茄植株或其他株系中獲得第一種原生質(zhì)體。例如可以使用多毛番茄LYC4/78的原生質(zhì)體?？梢詮牡诙N番茄或其他植物變種，優(yōu)選地是包括商業(yè)所需特性例如但不限定于疾病抗性、昆蟲(chóng)抗性、有價(jià)值的水果特性等的番茄系中獲得第二種原生質(zhì)體。然后用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)原生質(zhì)體融合方法融合原生質(zhì)體?；蛘?，在將包括本發(fā)明的一種或多種QTL的核酸從供體植物轉(zhuǎn)移到受體植物中可以采用胚拯救。胚拯救可以被用作從其中植物不能生成可育性種子的雜交中分離出胚的一種過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，植物的受精卵或不成熟種子被組織培養(yǎng)生成新的植株(Pierik，1999)。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的方法，包括步驟實(shí)施用于檢測(cè)如上所述的本發(fā)明的供體番茄植株中是否存在與灰色葡萄孢抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法，并將包括至少一種所檢測(cè)到的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸序列從所述供體植株轉(zhuǎn)移到葡萄孢易感的受體番茄植株。用先前在此所述的任何一種方法可以實(shí)施所述核酸序列的轉(zhuǎn)移。這種方法的優(yōu)選的實(shí)施方式包括通過(guò)雜交所述植株經(jīng)漸滲將所述核酸序列從抗葡萄孢的供體番茄植株轉(zhuǎn)移到葡萄孢易感的受體番茄植株內(nèi)。因此通過(guò)利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)可以適當(dāng)?shù)貙?shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)移。利用標(biāo)記物輔助性育種(MAS)將QTL優(yōu)選地漸滲到商品化的番茄變種內(nèi)。標(biāo)記物輔助性育種或標(biāo)記物輔助性選擇都包含使用一種或多種分子標(biāo)記物鑒定并選擇出含有編碼所需性狀的一種或多種基因的子代植株。在本實(shí)例中，這種鑒定和選擇是依據(jù)于對(duì)本發(fā)明的QTL的選擇或標(biāo)記物輔助性選擇。MAS也可以用于開(kāi)發(fā)具有相關(guān)QTL的近同基因系(NIL)，容許更為詳細(xì)的研究每種QTL效應(yīng)，它也是一種用于開(kāi)發(fā)回交近交系(BIL)群的有效方法(見(jiàn)例如Nesbittetal.，2001；vanBerlooetal.，2001)。根據(jù)本優(yōu)選實(shí)施方式開(kāi)發(fā)出的番茄植株可以有利地衍生出受體植株的大多數(shù)性狀以及衍生出供體植株的葡萄孢抗性。因?yàn)楝F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)灰色葡萄孢抗性是多基因遺傳的，所以優(yōu)選地用合適的轉(zhuǎn)移方法向單個(gè)受體植株中插入至少2種、優(yōu)選地3種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分，即在受體植株的基因組中堆積有多個(gè)QTL。相信兩種或多種本發(fā)明的QTL的堆積可以造成葡萄孢抗性的增加。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，用任一方法都可以實(shí)現(xiàn)堆積，例如通過(guò)用包括多個(gè)本發(fā)明的QTL的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植株。同樣，雜交的每種親代植株中都可以存在至少一種QTL，使得在所形成的雜種中含有至少兩種QTL。通過(guò)堆積這些抗性性狀，可以獲得高度抗性的植株。這些植株是本發(fā)明的高度優(yōu)選的實(shí)施方式。如上面所簡(jiǎn)單討論的那樣，可以用傳統(tǒng)育種技術(shù)將編碼葡萄孢抗性的核酸序列漸滲到葡萄孢易感的受體番茄植株內(nèi)。在一個(gè)方法中，其指的是譜系育種，表現(xiàn)出葡萄孢抗性并包括編碼葡萄孢抗性的核酸序列的供體番茄植株與優(yōu)選地表現(xiàn)出商業(yè)所需特性例如但不限定于疾病抗性、昆蟲(chóng)抗性、有價(jià)值的水果特性等的葡萄孢易感的受體番茄植株雜交。然后所形成的植株群(表示F1雜種)自花授粉并收獲種子(F2種子)。篩選由F2種子所生長(zhǎng)成的F2植株的葡萄孢抗性?？梢杂枚喾N不同的方法篩選群。首先，可以用傳統(tǒng)疾病篩選法篩選群。這些疾病篩選法在本領(lǐng)域是已知的。優(yōu)選地，使用定量的莖或葉感染生物檢測(cè)，優(yōu)選地在如上面更詳細(xì)描述的本發(fā)明的方法中都使用莖生物檢測(cè)，應(yīng)用實(shí)施例。其次，利用一種或多種此前所述的分子標(biāo)記物可以實(shí)施標(biāo)記物輔助性選擇，以便鑒定出那些包括編碼葡萄孢抗性的核酸序列的后代。也可以使用其他方法，即上面的用于檢測(cè)是否存在QTL的方法。也可以用標(biāo)記物輔助性選擇驗(yàn)證從定量生物檢測(cè)中得到的結(jié)果，因此可以聯(lián)合應(yīng)用一些方法?？蛊咸焰叩姆阎仓旰头N子本發(fā)明的抗葡萄孢的番茄植株的特征是具有高水平的抗性。這被定義為是比在易感對(duì)照植株中所觀察到的抗性更高的抗性水平。事實(shí)上，本發(fā)明的植株具有比任一目前已知的商品化的番茄變種(即具有商業(yè)所需特性的變種)更高的抗性水平。當(dāng)用生物檢測(cè)法測(cè)量時(shí)，本發(fā)明的植株對(duì)灰色葡萄孢的易感性至少比易感對(duì)照植株低3倍，在生物檢測(cè)中，如實(shí)施例3.10和3.11更詳細(xì)描述的那樣，在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐條件下，在3周時(shí)間內(nèi)測(cè)量成體植株的灰色葡萄孢感染所造成的莖病變的平均長(zhǎng)度。本發(fā)明的植株通常具有抗性水平，在設(shè)計(jì)為基于這些表征測(cè)定抗性的抗性生物檢測(cè)中，所述抗性水平造成在利用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐條件下接種后3周的成體植株的灰色葡萄孢病變的平均莖病變長(zhǎng)度小于3.2cm。更常見(jiàn)地，本發(fā)明的植株顯示出平均莖病變長(zhǎng)度小于2.9cm。本發(fā)明的一些植株甚至顯示出平均莖病變長(zhǎng)度為2.0cm。考慮到所述數(shù)值表示包括2cm最初接種傷口的病變長(zhǎng)度，因此推論在本發(fā)明的植株中觀察到了高水平抗性，對(duì)于一些QTL而言，甚至觀察到了完全抗性。與之相比，易感對(duì)照植株顯示出在相同條件下的平均的平均莖病變長(zhǎng)度是從約3.6cm到約6.0cm，平均值為4.85cm(見(jiàn)表10)。同樣作為對(duì)比，在相同條件下，多毛番茄LA1777(含有WO02/085105的葡萄孢部分抗性來(lái)源的QTL-10)顯示出平均莖病變長(zhǎng)度約為4.3cm。總而言之，在上面所示的抗性生物檢測(cè)中，本發(fā)明的植株顯示出其莖病變通常不到易感對(duì)照植株的凈長(zhǎng)度的約30％(0.9/2.85×100％)，通常小于部分抗性多毛番茄LA1777的凈長(zhǎng)度的約40％(0.9/2.3×100％)。因此，當(dāng)用生物檢測(cè)測(cè)量時(shí)，本發(fā)明的植株具有對(duì)灰色葡萄孢的易感性比易感對(duì)照植株低3倍，或者是小于易感對(duì)照植株的1/3。反過(guò)來(lái)說(shuō)，如在此所定義的以及如所述的生物檢測(cè)所確定的那樣，本發(fā)明的植株的抗性比易感對(duì)照植株高出3倍以上。對(duì)于一些QTL或者QTL的組合(例如QTL-1h和QTL-3p+QTL-4p或QTL-9p+QTL-4p的組合)，觀察到了完全抗性(見(jiàn)表10)。易感對(duì)照植株被定義為對(duì)灰色葡萄孢感染顯示出正常易感性或無(wú)抗性的植株。易感對(duì)照植株的實(shí)例是雜種普通番茄栽培種″Tradiro″和普通番茄栽培種″Moneyberg″(DeRuiterSeedsCV，博格圣利克，荷蘭)。通過(guò)本發(fā)明的方法所獲得的抗葡萄孢的番茄植株或其部分也是本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及抗葡萄孢的番茄植株或其部分，其基因組內(nèi)包括至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分，所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1、2和4號(hào)染色體上的QTL和小花番茄G1.1601的染色體3、4和9上的QTL組成的組，其中所述QTL或其所述賦予葡萄孢抗性的部分并非處于其天然的遺傳背景內(nèi)。本發(fā)明的抗葡萄孢的植株可以是任一遺傳類(lèi)型，例如近交、雜種、單倍體、二倍體、單性結(jié)實(shí)或轉(zhuǎn)基因類(lèi)型。此外，本發(fā)明的植株可以是抗性性狀的雜合子或純合子，優(yōu)選地是純合子。盡管本發(fā)明的QTL以及通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的這些QTL以及其賦予葡萄孢抗性的部分可以被轉(zhuǎn)移到任何植株內(nèi)，以便提供抗葡萄孢的植株，本發(fā)明的方法和植株優(yōu)選地涉及茄科植物，更優(yōu)選地是番茄。利用輪回選擇和回交、自交和/或二倍體或任何其他用于制備親代系的技術(shù)可以開(kāi)發(fā)出近交的抗葡萄孢的番茄株系。在選擇和回交方法中，通過(guò)輪回親本和第一種供體植株(其不同于輪回親本，在此叫做“非輪回親本”)雜交可以將葡萄孢抗性漸滲到靶向受體植株內(nèi)(其叫做輪回親本)。輪回親本是無(wú)抗性的或具有低水平的葡萄孢抗性并且具有商業(yè)所需特性例如但不限定于疾病抗性、昆蟲(chóng)抗性、有價(jià)值的水果特性等的植株。非輪回親本表現(xiàn)出葡萄孢抗性，并包括編碼葡萄孢抗性的核酸序列。非輪回親本可以是與輪回親本雜交可育的任一植物變種或近交系。輪回親本和非輪回親本之間的雜交生成的后代可以與輪回親本回交。然后篩選所形成的植物群?？梢杂枚喾N不同的方式篩選群。例如，可以用如先前所述的莖定量生物檢測(cè)篩選群。然后選擇出包括編碼葡萄孢抗性所必需的核酸序列和具有商業(yè)所需特性的表現(xiàn)出葡萄孢抗表型的F1雜種植株，自交，并選擇數(shù)代，以便容許番茄植株逐漸成為近交系?？梢赃M(jìn)行這個(gè)持續(xù)自交和選擇的過(guò)程2到5代或更多代。這種育種和選擇的結(jié)果是生成了具有遺傳上同源的與葡萄孢抗性相關(guān)的基因以及其他與商業(yè)相關(guān)性狀的基因的系?？梢岳靡环N或多種在此前所述的分子標(biāo)記物、雜交探針或多核苷酸而不是利用生物檢測(cè)的表型病變篩選法來(lái)進(jìn)行MAS，以便鑒定出那些包括編碼葡萄孢抗性的核酸序列的后代。同樣地，可以用MAS驗(yàn)證從定量生物檢測(cè)中獲得的結(jié)果。一旦做出了合適的選擇，重復(fù)該過(guò)程。與輪回親本回交以及選擇葡萄孢抗性的過(guò)程被重復(fù)近5代或更多代。該過(guò)程所形成的后代是一種或多種編碼葡萄孢抗性的基因的雜合子。然后最后回交代被自交，以便提供葡萄孢抗性的純合子的純育種后代。在附加的雜交中，可以使用在此所述的抗葡萄孢的近交番茄系，以生成抗葡萄孢的雜種植株。例如，本發(fā)明的第一種抗葡萄孢的近交番茄植株可以與第二種具有商業(yè)所需性狀例如但不限定于疾病抗性、昆蟲(chóng)抗性、有價(jià)值的水果特性等的近交番茄植株雜交。這第二種近交番茄系可以是或者可以不是抗葡萄孢的。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種生產(chǎn)種子的方法，所述種子能生長(zhǎng)成抗葡萄孢的番茄植株。在一個(gè)實(shí)施方式中，本方法包括步驟提供本發(fā)明的抗葡萄孢的番茄植株，所述抗葡萄孢的植株與普通番茄植株雜交，并收集所述雜交生成的種子，當(dāng)播種所述種子時(shí)，其能生成抗葡萄孢的番茄植株。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本方法包括步驟提供本發(fā)明的抗葡萄孢的番茄植株，所述抗葡萄孢的植株與普通番茄植株雜交，收集所述雜交生成的種子，所述種子再生成植株，用在此所述的任一方法選擇抗葡萄孢的植株，自交所選擇的植株足夠多的世代，以獲得在植株中固定有賦予葡萄孢抗性的等位基因的植株，將所由此生成的植株與具有所需表型性狀的普通番茄植株回交足夠多的世代，以獲得具有葡萄孢抗性和所需表型形狀的普通番茄植株，以及收集末次回交形成的植株所生成的種子，當(dāng)播種所述種子時(shí)，生長(zhǎng)成抗葡萄孢的番茄植株。通過(guò)舉例說(shuō)明的方式，而不是限制的方式，現(xiàn)在給出了本發(fā)明的實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1鑒定抗灰色葡萄孢植株的方法1.1引言本實(shí)施例描述了開(kāi)發(fā)用于評(píng)價(jià)野生番茄基因型庫(kù)的灰色葡萄孢抗性的定量生物檢測(cè)法。在野生番茄種中，已經(jīng)報(bào)道了抗灰色葡萄孢的部分抗性，但是這些報(bào)道多數(shù)都是描述性的和定性的。對(duì)部分抗性基因型的鑒定將提供向商品化的育種系中漸滲抗性以便獲得具有可控制的抗性水平的株系的前景。可重復(fù)的、客觀的和定量的檢測(cè)的可得性以及對(duì)具有遺傳上確定的(部分的)灰霉抗性的基因型的鑒定打開(kāi)了培育番茄變種的抗性育種的途徑。本實(shí)施例描述了定量疾病檢測(cè)。本檢測(cè)被用于葉(葉接種檢測(cè))和莖節(jié)段(莖接種檢測(cè))。測(cè)定了疾病易感性的兩個(gè)參數(shù)。第一個(gè)參數(shù)是發(fā)病率(DI)，即造成擴(kuò)展性病變的接種滴的比例。如果原發(fā)灰色葡萄孢病變?cè)谔囟ㄋ拗骰蛐蜕蠑U(kuò)展(部分)失敗是植物的遺傳性狀，這種性狀是重要的，因?yàn)樗苯酉拗屏宿r(nóng)作物上的病灶數(shù)目。第二個(gè)測(cè)試參數(shù)是24h內(nèi)的病變生長(zhǎng)速率(病變生長(zhǎng)，LG)。從原發(fā)接種點(diǎn)擴(kuò)展出的病變顯示出在一定時(shí)間內(nèi)以均勻的速度(mm/天)傳播，直到病變達(dá)到了葉的邊緣或莖節(jié)段的底部末端。本檢測(cè)使得能夠定量出灰色葡萄孢感染的發(fā)生(發(fā)病率)和發(fā)展(病變生長(zhǎng))，形成了兩組數(shù)量性狀數(shù)據(jù)?？梢杂迷摍z測(cè)篩選番茄種庫(kù)(此后也稱(chēng)作“株”)是否存在抗性。1.2植物表3列出了所測(cè)試的植物基因型。表3測(cè)試番茄屬基因型的列表。1DRSDeRuiter種子(博格圣利克，荷蘭)；WUPPWPlantkundigProefcentrumWageningen(瓦格寧根大學(xué)，瓦格寧根，荷蘭)；LoPB植株育種實(shí)驗(yàn)室(瓦格寧根大學(xué)，瓦格寧根，荷蘭)；MPIZKMaxPlanckInstitutfürZüchtungsforschunganKulturpflanze(科隆，德國(guó))；TGRC加州大學(xué)戴維斯分校番茄遺傳資源中心，加州戴維斯，USA)；IPKInstitutfǜrPflanzengenetikundKulturpflanzenforschung(Gatersleben，德國(guó))。2Y表示在特定檢測(cè)中測(cè)試的基因型；S表示作為易感參照對(duì)照的基因型。3之前發(fā)表的抗灰色葡萄孢的抗性。植物生長(zhǎng)在最低溫度為15℃的溫室的12cm盆的盆栽土壤內(nèi)。從10月到3月給予人工的鈉燈光(16h/天)。在發(fā)芽后5-7天時(shí)，加入10mlFeNaEDTA溶液(3.5g/l)，之后在3天后加入10ml微量營(yíng)養(yǎng)素溶液(0.286g/lH3BO3、0.1558g/lMnSO4.H2O、0.008g/lCuO4.H2O、0.022g/lZnSO4、0.00196(NH4)6Mo7O24.4H2O)。從發(fā)芽開(kāi)始后2周起，每周加入5mlHoagland溶液(5mMCa(NO3)2、5mMKNO3、2mMMgSO4、1mMKH2PO4)。1.3葉檢測(cè)根據(jù)Benito(1998)制備出灰色葡萄孢B05.10的接種物。對(duì)于每一單個(gè)的植株而言，用鋒利的剃刀刀片從主莖中分割下1片或兩片被完全拉伸的復(fù)葉，并將其轉(zhuǎn)移到預(yù)先濕化的花卉泡沫內(nèi)?；ɑ芘菽环胖糜诤凶詠?lái)水的Petri皿內(nèi)，隨后放置于含有濕濾紙的噴霧浸濕的容器內(nèi)。然后通過(guò)仔細(xì)地向葉的上表面上滴上總共6到10滴接種物(2μl)用灰色葡萄孢的分生孢子懸浮液接種復(fù)葉。用噴霧浸濕的塞子密閉容器，并在15℃、暗處、100％RH下孵育，基本上如Benito等，1998描述的那樣。表4的數(shù)據(jù)來(lái)自測(cè)試，其中復(fù)葉被分成四個(gè)小葉以及其中用10滴(每滴2μl，含有2000個(gè)分生孢子)接種物接種每個(gè)小葉。數(shù)天內(nèi)監(jiān)測(cè)進(jìn)展性擴(kuò)展性病變的比例(發(fā)病率)和病變生長(zhǎng)速率。為了校正季節(jié)或植物培育所引起的變差，每個(gè)試驗(yàn)中的特定基因型的發(fā)病率都與在相同試驗(yàn)中測(cè)試的Moneymaker的發(fā)病率相比較。用測(cè)徑器在感染后96、120和144小時(shí)測(cè)量病變大小。用擴(kuò)展性病變的總數(shù)除以接種滴數(shù)的總數(shù)可以測(cè)定出發(fā)病率。通過(guò)計(jì)算出病變大小在24h內(nèi)的增長(zhǎng)(單位為mm)可以測(cè)定出病變生長(zhǎng)速率。從定量分析中刪除非擴(kuò)展性病變的數(shù)據(jù)。表4給出了葉檢測(cè)的結(jié)果。表4經(jīng)灰色葡萄孢接種的番茄株的葉子的發(fā)病率(DI，％)和病變生長(zhǎng)速率(LG，mm/天±標(biāo)準(zhǔn)差)。在1999年和2000年的所示的不同周內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。1.4莖檢測(cè)(標(biāo)準(zhǔn)化步驟)如下進(jìn)行莖檢測(cè)去除近50cm高植株的莖的頂部5到10cm和底部5到10cm，剩下的30cm被切成5-6cm的相等節(jié)段。每個(gè)莖節(jié)段都被垂直放置于格子內(nèi)，莖基放置于濕濾紙上。在接種之前，用自來(lái)水噴霧莖節(jié)段，以便保證接種物在傷口表面上的均勻播散。如葉檢測(cè)所述的那樣制備出接種物。向每個(gè)莖節(jié)段的頂部上施用一滴含有近106分生孢子·ml-1的5μl接種物。在15±2℃下、暗處、100％相對(duì)濕度進(jìn)行接種。通過(guò)在接種后的不同時(shí)間間隔內(nèi)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腐爛癥狀的最大進(jìn)展可以測(cè)定出感染進(jìn)程。對(duì)于每個(gè)基因型而言，計(jì)算出受感染的莖段的百分比。用具有擴(kuò)展性病變的莖節(jié)段的總數(shù)除以被接種的節(jié)段總數(shù)測(cè)定出發(fā)病率。通過(guò)計(jì)算出病變大小在24h內(nèi)的增長(zhǎng)測(cè)定出病變生長(zhǎng)速率，由此從分析中刪除了非擴(kuò)展性病變的數(shù)據(jù)。表5給出了莖檢測(cè)的結(jié)果。表5經(jīng)灰色葡萄孢接種的番茄株的莖節(jié)段的發(fā)病率(DI，％)和病變生長(zhǎng)速率(LG，mm/天±標(biāo)準(zhǔn)差)。在1999年和2000年的所示的不同周內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。1.5結(jié)果測(cè)定出每種基因型在數(shù)天內(nèi)的分離的莖感染試驗(yàn)中的發(fā)病率和病變生長(zhǎng)，通常是從感染后2到4天開(kāi)始。在這些試驗(yàn)中，作為參照的普通番茄栽培種Moneymaker)的發(fā)病率在15到78％之間波動(dòng)。表4顯示了14種基因型的結(jié)果，其中用每葉40個(gè)接種斑(每小葉10個(gè))接種源自至少5種單個(gè)植株的分離的復(fù)葉。這14種基因型中的發(fā)病率應(yīng)當(dāng)與在相同試驗(yàn)/周中測(cè)定到的對(duì)照系普通番茄栽培種Moneymaker的發(fā)病率相比較。除了基因型82/2577和83/2896(兩種都是普通番茄種)外，測(cè)試基因型在所有試驗(yàn)中都顯示出了比Moneymaker更低的發(fā)病率。在三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中，基因型G1.1556、G1.1560和G1.1601都顯示出低發(fā)病率，范圍是從0到21％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示基因型78/1604、91/4311、96/4326、G1.1556、GI1558、G1.1560、G1.1601、LA716和LYC4/78中的發(fā)病率都明顯低于對(duì)照品系普通番茄栽培種Moneymaker中的發(fā)病率(p＜0.05)。但是，因?yàn)榘l(fā)病率在試驗(yàn)/周之間的波動(dòng)(15-78％)，周之間的較大變差以及在分離的葉檢測(cè)中觀察到的一些差異實(shí)際上可能不是非常強(qiáng)的。在這些抗性基因型中(其發(fā)病率要明顯低于Moneymaker參照)，成功擴(kuò)展的病變常常以與Moneymaker相似的速率擴(kuò)展(例如96/4326、G1.1560、LA716)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相反的情況，即沒(méi)有一個(gè)基因型雖然表現(xiàn)出與Moneymaker相似的發(fā)病率，卻表現(xiàn)出比Moneymaker更慢的病變生長(zhǎng)速率。表4也給出了關(guān)于每種基因型的擴(kuò)展性病變?cè)?4小時(shí)內(nèi)(在感染后48和72小時(shí)之間)的平均生長(zhǎng)速率的數(shù)據(jù)。絕大多數(shù)基因型的病變生長(zhǎng)速率處于與Moneymaker相同的范圍內(nèi)。5種株(91/4311、160/79、G1.1556、G1.1601和LYC4/78)顯示出了更慢的病變生長(zhǎng)速率，其與普通番茄栽培種Moneymaker的病變生長(zhǎng)速率有著顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在不同季節(jié)進(jìn)行的試驗(yàn)之間的可重復(fù)性方面，莖節(jié)段感染檢測(cè)(表5)顯示出比葉檢測(cè)更強(qiáng)。盡管莖節(jié)段(每個(gè)植株5-8個(gè)節(jié)段)的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)目遠(yuǎn)小于葉檢測(cè)的數(shù)目(每個(gè)復(fù)葉40個(gè)接種滴，每個(gè)植株測(cè)試1或2片葉子)，但是莖節(jié)段檢測(cè)的試驗(yàn)之間的變異性通常更低。莖檢測(cè)中的對(duì)照基因型普通番茄栽培種Moneymaker的發(fā)病率范圍是從52％到95％。17種基因型(表5)的發(fā)病率應(yīng)當(dāng)與在相同試驗(yàn)/周中測(cè)定到的對(duì)照品系普通番茄栽培種Moneymaker)的發(fā)病率相比較。絕大多數(shù)基因型都顯示出了與對(duì)照系Moneymaker相似范圍內(nèi)的發(fā)病率。基因型G1.1556(29％和41％)和G1.1560(28％和7％)都顯示出了發(fā)病率的降低。僅僅G1.1560與對(duì)照有著統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p＜0.05)。莖檢測(cè)中的對(duì)照基因型普通番茄栽培種Moneymaker)的病變生長(zhǎng)速率(表5)范圍是從5.4到9.2mm/天。很多基因型都顯示出了與對(duì)照相似范圍內(nèi)的病變生長(zhǎng)速率。但是，在89/3793、G1.1601、LYC4/78、T566-81株中，病變生長(zhǎng)速率與對(duì)照栽培種.Moneymaker有著統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p＜0.01)。對(duì)于在莖節(jié)段檢測(cè)中被標(biāo)定(rated)為部分抗性的多種基因型而言，對(duì)在溫室Rockwool上生長(zhǎng)的全部植株進(jìn)行定量檢測(cè)。目的是評(píng)價(jià)在實(shí)驗(yàn)室條件下的莖節(jié)段中表現(xiàn)出抗性的基因型是否真的在半商品化的耕作系統(tǒng)中具有比對(duì)照系更高的抗性。植株無(wú)序地生長(zhǎng)于Rockwool排內(nèi)，用經(jīng)孢子形成階段的灰色葡萄孢嚴(yán)重感染的柑橘類(lèi)果實(shí)填充溫室的隔室。通過(guò)每天用自來(lái)水噴霧地板兩次以及保持門(mén)窗關(guān)閉，保持溫室隔室處于高濕度。以規(guī)律間隔，在所有植株上制造修剪傷口，并隨著時(shí)間監(jiān)測(cè)灰霉的發(fā)生情況。鑒定出多種表現(xiàn)出兩種參數(shù)都出現(xiàn)重度降低的野生番茄株，因此提供了向普通番茄內(nèi)漸滲兩種機(jī)制上可能是獨(dú)立的部分抗性的可能來(lái)源。實(shí)施例2對(duì)種間番茄雜交(普通番茄栽培種Moneymakerx小花番茄G1.1601)中的灰色葡萄孢抗性的QTL基因定位2.1引言如實(shí)施例1所示的，篩選一組不同來(lái)源的番茄株對(duì)真菌病原體灰色葡萄孢的抗性。在莖檢測(cè)中，小花番茄G1.1601株顯示出較低的發(fā)病率以及較慢的病變生長(zhǎng)(見(jiàn)上面的表4和5)。在莖檢測(cè)中，評(píng)價(jià)由130個(gè)F2衍生的F3群組成的源自小花番茄G.1601和普通番茄栽培種Moneymaker之間雜交的分離群對(duì)灰色葡萄孢的抗性。用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記物構(gòu)建出連鎖圖，并進(jìn)行數(shù)量性狀基因座分析。檢測(cè)QTL的發(fā)病率和病變生長(zhǎng)。2.2植物材料在鑒定出抗性株小花番茄G1.1601之后，用與該株作為基礎(chǔ)親本(Huang，2001)的分離群進(jìn)行進(jìn)一步的分析。分離群是由130個(gè)F2衍生的F3群組成。2.3疾病評(píng)價(jià)從130個(gè)F3群的每個(gè)群中，栽培出5個(gè)苗，并進(jìn)行如實(shí)施例1所述(見(jiàn)1.4)的莖檢測(cè)。因?yàn)楝F(xiàn)實(shí)的原因，完整的測(cè)量組被分成(隨機(jī)地)了13個(gè)相等大小的部分。每周測(cè)量由50株植物組成的一個(gè)部分。用大組的易感Moneymaker對(duì)照植株校正周之間的環(huán)境差異。因?yàn)楝F(xiàn)實(shí)的原因，本試驗(yàn)沒(méi)有包含小花番茄G1.1601。如實(shí)施例1所示的進(jìn)行測(cè)量。在接種后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(感染后96和120小時(shí))記錄下感染的進(jìn)程。以這種方式如實(shí)施例1所述的那樣測(cè)定出發(fā)病率(定義為在最后一次觀察時(shí)刻顯示出疾病癥狀的被接種莖部分的百分比)和病變生長(zhǎng)(定義為在24小時(shí)內(nèi)病變發(fā)展橫過(guò)番茄莖的平均速率)。圖4顯示了測(cè)量值的分布情況。分布表明正常的、數(shù)量性狀特征，因此適用于QTL基因定位方法。2.4分子標(biāo)記物未得到F2葉材料，因此收集12株源自130個(gè)F2衍生群的每個(gè)群的F3植株的葉子，并用于DNA分離。根據(jù)Vos等(1995)的方法，利用一組10個(gè)Pst/Mse引物組合進(jìn)行AFLP測(cè)定。2.5連鎖分析和QTL基因定位因?yàn)锳FLP標(biāo)記物的顯性性質(zhì)，因此分別計(jì)算出父本(小花番茄)和母本(普通番茄)的連鎖群。利用JoinMap軟件包(3.0版，PlantResearchInternational，瓦格寧根，荷蘭)分析標(biāo)記物數(shù)據(jù)并計(jì)算出遺傳連鎖圖。按不同的對(duì)數(shù)可能性(LOD)閾值形成連鎖群。用Kosambi函數(shù)(Kosambi，1944)將重組率轉(zhuǎn)化成圖距。利用程序MapChart(PlantResearchInternational)將JoinMap的輸出值轉(zhuǎn)化成連鎖圖以及QTL曲線的圖解格式。利用MapQTL(4.0版，KyazmaB.V.，瓦格寧根，荷蘭)通過(guò)間隔基因定位(IM)和多QTL基因定位(MQM)(Jansen，1993，1994)分析表型數(shù)據(jù)并計(jì)算出QTL。所計(jì)算出的F2群的表型數(shù)據(jù)來(lái)自F3系內(nèi)的所有植株的疾病檢測(cè)的平均值。用反正弦轉(zhuǎn)換將發(fā)病率數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。用間隔基因定位算法計(jì)算出QTL。對(duì)于130個(gè)F3群中的每一個(gè)而言，利用MapQTL對(duì)標(biāo)記物和疾病數(shù)據(jù)的組合數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL分析。進(jìn)行第一輪間隔基因定位，并鑒定出LOD譜中的峰值。直接用所有源自一種或其他親本的標(biāo)記物計(jì)算出獨(dú)立的連鎖圖?？偣灿?92個(gè)AFLP標(biāo)記物被放置于父本和母本連鎖圖上。單獨(dú)地用雄性和雌性連鎖圖進(jìn)行QTL基因定位。確定出3種QTL(見(jiàn)表6)。表6基于非整合圖的QTL基因定位結(jié)果的概述。aa是完整染色體區(qū)域純合的普通番茄。b-是QTL區(qū)域雜合的或純合的小花番茄。具有所有三個(gè)QTL區(qū)域雜合的或純合的小花番茄(b-)的11個(gè)植株的平均葡萄孢抗性反映出40％的發(fā)病率以及每天5.0mm的病變生長(zhǎng)。僅僅1個(gè)植株是所有三個(gè)QTL區(qū)域純合的普通番茄，其發(fā)病率為72％，病變生長(zhǎng)為每天7.2mm。5個(gè)植株是3種QTL中的兩種QTL純合的普通番茄，其平均發(fā)病率為67％以及病變生長(zhǎng)為每天5.8mm(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。該實(shí)施例顯示出遺傳來(lái)源例如小花番茄G1.1601可以被用于增加番茄中的葡萄孢抗性?？梢澡b定出一些發(fā)病率和病變生長(zhǎng)的QTL(表6)?？梢栽诟鼮橄冗M(jìn)的育種材料例如回交系中驗(yàn)證這些QTL。表7顯示了對(duì)普通番茄栽培種Moneymaker和小花番茄G.1601之間雜交所形成的各種F3系的疾病抗性試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果。清楚地顯示出在這個(gè)試驗(yàn)中所用的BChirs5參照系表現(xiàn)出比所列的小花番茄(Lparv)系更高的抗性水平。但是，也證實(shí)小花番茄QTL存在QTL效應(yīng)。表7在接種后3周的小花番茄G.1601株成體植株中的灰色葡萄孢病變的平均莖病變長(zhǎng)度。*)用黑體字表示參照系Tradiro是一種雜種，依照栽培者的經(jīng)驗(yàn)其易感于葡萄孢；依照栽培者的經(jīng)驗(yàn)，Durintha是一種具有部分抗性的雜種。Moneyberg和Moneymaker是相似類(lèi)型的易感系；GT是具有TMV抗性的Moneyberg；BChris5是多毛番茄LYC4/78漸滲形成的回交系，包括病變生長(zhǎng)的多毛番茄QTL-1h。(+)雜合子或純合子的存在；(-)不存在；n.d.未測(cè)定。實(shí)施例3對(duì)種間番茄群(普通番茄栽培種Moneymakerx多毛番茄LYC4/78株)中的對(duì)灰色葡萄孢的部分抗性的基因定位在這個(gè)實(shí)施例中，給出了兩個(gè)源自多毛番茄LYC4/78的賦予對(duì)灰色葡萄孢的部分抗性的QTL基因座。通過(guò)評(píng)價(jià)兩種其中這兩個(gè)QTL基因座之一分別為分離狀態(tài)的BC2S1群中的對(duì)灰色葡萄孢的抗性水平對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。3.1植物材料多毛番茄LYC4/78(此后稱(chēng)作LYC4/78)的種子來(lái)自位于德國(guó)Gatersleben的植物遺傳學(xué)與農(nóng)作物研究所內(nèi)的基因庫(kù)。普通番茄栽培種Moneymaker(此后稱(chēng)作Moneymaker)的種子來(lái)自荷蘭博格圣利克DeRuiterSeeds栽培種的種子庫(kù)。進(jìn)行Moneymaker和LYC4/78之間的種間雜交生成F1種子。F1種子生長(zhǎng)成為F1植株。播種源自一種F1植株的自交的F2種子，獲得174個(gè)個(gè)體的F2群。通過(guò)與作為輪回親本和雌性親本的Moneymaker回交兩輪生成59個(gè)個(gè)體的BC2(回交2)群。利用MAS選擇出其中含有兩種已鑒定出的QTL中的一種QTL的BC2、BC3、和BC4基因型，一些BC2自交生成BC2S1種子(見(jiàn)圖2)。生成兩個(gè)BC2S1群其中60個(gè)BC2S1個(gè)體的BC2S1群出現(xiàn)發(fā)病率的QTL的分離；另一47個(gè)BC2S1個(gè)體的BC2S1群出現(xiàn)病變生長(zhǎng)的QTL的分離。3.2莖檢測(cè)根據(jù)Benito(1998)制備出灰色葡萄孢B05.10的接種物。如實(shí)施例1所示的進(jìn)行莖檢測(cè)。3.3DNA分離和標(biāo)記物分析根據(jù)Steward和Via(1993)的方案，用溴化十六烷基三甲胺(CTAB)從兩種幼葉(rollerup，卷葉)中分離出基因組DNA，其中用1mlmicronic管(MicronicBV，萊利斯塔德，荷蘭)調(diào)整后用于高通量DNA分離，以及用Retsch300mm振蕩器(RetschBV，Ochten，荷蘭)最大速度地磨碎。對(duì)F2、BC2、BC3、BC4和BC2S1群進(jìn)行AFLP分析(Vosetal.，1995)，主要依照Myburg發(fā)表的方法(Myburgetal.2001)在LI-COR4200DNA測(cè)序儀上進(jìn)行AFLP片段的測(cè)序。用IRD700或IRD800熒光標(biāo)記標(biāo)記選擇性Pst引物。用AFLP-QuantarPro軟件包(KeygeneBV，瓦格寧根，荷蘭)對(duì)AFLP凝膠圖像進(jìn)行評(píng)分(Score)。用下面的10種引物組合和接頭序列進(jìn)行基因分型P14M48、P14M49、P14M50、P14M60、P14M61、P15M48、P18M50、P18M51、P22M50和P22M51，如Bai等(2003)所示。3.4F2群的表型分析觀察到了不同葡萄孢檢測(cè)之間的發(fā)病率差異(見(jiàn)實(shí)施例1，見(jiàn)上)。因此，對(duì)源自MoneymakerxLYC4/78之間的雜交的F2群的174個(gè)個(gè)體中的172個(gè)個(gè)體進(jìn)行7次獨(dú)立的連續(xù)的莖疾病檢測(cè)。這造成了對(duì)幾乎每種F2基因型的疾病生物檢測(cè)的至少5次獨(dú)立評(píng)價(jià)。在每個(gè)單個(gè)的疾病生物檢測(cè)中，6個(gè)莖節(jié)段用于病變生長(zhǎng)的計(jì)算。F2群的發(fā)病率和病變生長(zhǎng)的平均值顯示出了正常分布(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。Moneymaker的平均發(fā)病率是59％，病變生長(zhǎng)是9.2mm/天。F2群中的平均發(fā)病率范圍是在10％和97％之間，群的平均發(fā)病率是48％。病變生長(zhǎng)范圍是在3.3mm/天和11.5mm/天之間，平均值是7.8mm/天。每個(gè)單個(gè)試驗(yàn)的平均發(fā)病率范圍是從31％到73％，而平均病變生長(zhǎng)范圍是從6.2到7.9mm/天(表8)。只有在6個(gè)莖段中至少有一個(gè)出現(xiàn)感染時(shí)，才能計(jì)算病變生長(zhǎng)。因此，更高的發(fā)病率才可以觀察到能提供信息的病變生長(zhǎng)的基因型數(shù)目的增加。例如，在低的平均發(fā)病率(31％)時(shí)，僅僅52％的基因型能為病變生長(zhǎng)提供信息。表8實(shí)施例3.4的7個(gè)試驗(yàn)的平均發(fā)病率和平均病變生長(zhǎng)。根據(jù)發(fā)病率百分比排出了周的平均值。3.5分子標(biāo)記物和遺傳連鎖圖計(jì)算出源自MoneymakerxLYC4/78雜交的F2群(n＝174)的遺傳連鎖圖。用10種引物組合得到F2群中的218種擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記物?？偣灿?9種標(biāo)記物(31.7％)可以被容易地評(píng)分為共顯性的，因此容許計(jì)算出整合的F2遺傳連鎖圖。對(duì)BC2、BC3和BC2S1基因型進(jìn)行的標(biāo)記物分析容許添加附加的145個(gè)AFLP標(biāo)記物。因?yàn)镕2凝膠的復(fù)雜性，這145個(gè)附加的AFLP標(biāo)記物中總共有102種標(biāo)記物先前沒(méi)有被評(píng)分?？偟倪z傳連鎖圖是由14個(gè)連鎖群的315個(gè)AFLP標(biāo)記物組成，總長(zhǎng)度為958cM。因?yàn)榉N內(nèi)的共遷移的AFLP標(biāo)記物通常是等位基因特異的，與其他AFLP連鎖圖的共線性被用于將連鎖群分配到染色體。一些Moneymaker特異性AFLP標(biāo)記物與已發(fā)表的遺傳連鎖圖是相同的(Haanstraetal.1999；Baietal.2003)，因此一些連鎖群可以被分配到染色體，包括具有已鑒定出的QTL的連鎖群。為了改進(jìn)QTL間隔內(nèi)的連鎖圖，依據(jù)已發(fā)表的普通番茄x潘那利番茄圖(Tanksleyetal.1992；Haanstraetal.1999)將診斷性CAPS標(biāo)記物加入到這些區(qū)域內(nèi)。3.6連鎖分析和QTL基因定位如實(shí)施例2所示的分析標(biāo)記物數(shù)據(jù)以及計(jì)算出遺傳連鎖圖。F2連鎖圖的總長(zhǎng)為958cM，其比其他已發(fā)表的種間番茄圖短，它們的遺傳長(zhǎng)度范圍是從1200到1400cM(Fooladetal.2002；Haanstraetal.1999；Tanksleyetal.1992)。用從回交和BC2S1群中獲得的AFLP標(biāo)記物數(shù)據(jù)評(píng)分出附加的AFLP標(biāo)記物。盡管46％以上的標(biāo)記物都被放置于連鎖圖上，但是遺傳連鎖圖的長(zhǎng)度沒(méi)有增加。原因是因?yàn)樗玫臄?shù)據(jù)來(lái)自于一些小的亞家族，因此不能為計(jì)算遺傳距離提供信息，但是通過(guò)觀察圖解的基因型(VanBerloo，1999)有可能估計(jì)出位置。3.7F2群的QTL基因定位通過(guò)間隔基因定位(IM，見(jiàn)實(shí)施例2)的方法，用表型和標(biāo)記物數(shù)據(jù)鑒定出QTL。IM被應(yīng)用于從單個(gè)重復(fù)中獲得的數(shù)據(jù)以及重復(fù)的平均值。發(fā)病率對(duì)那些平均發(fā)病率小于50％的單個(gè)疾病測(cè)試以及從所有疾病測(cè)試中獲得的平均數(shù)據(jù)(表8)進(jìn)行F2群的發(fā)病率的間隔基因定位。在間隔基因定位方法中，所有測(cè)試的平均數(shù)據(jù)給出了發(fā)病率的單個(gè)顯著的QTL(基因組寬可信度水平的似然比(LOD)分值必須高于3.4，P＜0.05)。該QTL的LOD分值為4.5，并解釋了13％的總表型變異(表9)。造成抗性的等位基因源自抗性親本LYC4/78。在所有4種情況中，每個(gè)單個(gè)試驗(yàn)中的QTL基因定位給出了相同的QTL區(qū)。在每個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中，偶然觀察到了其他的“次要QTL”。病變生長(zhǎng)在那些具有高發(fā)病率的疾病測(cè)試中，可以最好地測(cè)量病變生長(zhǎng)。對(duì)于QTL基因定位而言，使用了所有7個(gè)疾病測(cè)試的平均值，并鑒定出了超過(guò)閾值(基因組寬可信度水平的LOD為3.4，P＜0.05)的一種灰色葡萄孢病變生長(zhǎng)的QTL。該QTL的LOD分值為4.2，并解釋了12％的總表型變異(表9)。陽(yáng)性效應(yīng)源自抗性親本LYC4/78。舉例說(shuō)明了進(jìn)行多個(gè)疾病測(cè)試的必要性，因?yàn)樵趦H僅一次單次重復(fù)中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)閾值的LOD值。表9對(duì)所計(jì)算出的對(duì)植株(純合子Moneymaker(A)、雜合子(H)或純合子LYC4/78(B))的效應(yīng)的估計(jì)。用間隔基因定位方法計(jì)算出F2群的分值，同時(shí)用Kruskal-Wallis分析計(jì)算出BC2S1群的分值。aND＝未測(cè)定3.8用生物檢測(cè)驗(yàn)證QTLMoneymakerxLYC4/78雜交的F1植株與Moneymaker回交兩次，用AFLP標(biāo)記物篩選59株后代植株是否存在兩種鑒定出的QTL區(qū)(一種是關(guān)于發(fā)病率以及另一種是關(guān)于病變生長(zhǎng))。篩選出具有兩種鑒定出的QTL的其中一種QTL雜合子的植株，自交得到兩個(gè)BC2S1群。對(duì)每個(gè)BC2S1基因型進(jìn)行總共4個(gè)疾病生物檢測(cè)。用SPSS分析兩個(gè)BC2S1亞群的數(shù)據(jù)，顯示出了病變生長(zhǎng)是正態(tài)分布，但是由于觀察到了一些亞型(subclass)，因此發(fā)病率不是正態(tài)分布(圖2)。用如上面3.3部分中所述的用于F2群的引物相同的10種引物組合對(duì)所有BC2S1植株進(jìn)行AFLP基因分型。出現(xiàn)病變生長(zhǎng)基因座分離的群中的平均病變生長(zhǎng)是5.3mm/天，而在其他群中觀察到的平均病變生長(zhǎng)是6.3mm/天。沒(méi)有單個(gè)植株具有與抗性親代LY4/78一樣慢的病變生長(zhǎng)。但是，對(duì)于發(fā)病率而言，觀察到了具有比抗性親代LYC4/78更低的發(fā)病率的植株。兩個(gè)BC2S1群的平均發(fā)病率是相同的(57-59％)。在BC2S1群中驗(yàn)證了每種QTL的陽(yáng)性效應(yīng)。發(fā)病率的QTL降低了感染機(jī)會(huì)17％(親代變異的46％)，病變生長(zhǎng)的QTL使得真菌生長(zhǎng)減慢了1.3mm/天(親代變異的33％)。表8給出了與從F2群獲得的數(shù)據(jù)的比較。用兩種QTL的效應(yīng)只能解釋一部分變異。鑒定出了一些附加的(“次要的”)QTL基因座。在分析從F2和BC2S1基因型獲得的疾病測(cè)試數(shù)據(jù)的過(guò)程中，鑒定出了一種主要的發(fā)病率的QTL(QTL-2h)。除了該QTL外，鑒定出了發(fā)病率的其他的“推定的”QTL基因座。利用這個(gè)信息，選出輔助因素對(duì)F2數(shù)據(jù)組進(jìn)行限制性“多QTL基因定位”(MQM)方法。在這個(gè)分析中，鑒定出一種附加的“次要的”發(fā)病率的QTL基因座(QTL-4h)。當(dāng)其分值低于LOD的顯著閾值3.4時(shí)，QTL被稱(chēng)作“次要的”QTL。但是，相信其效應(yīng)是真實(shí)的QTL效應(yīng)。QTL-4h位于4號(hào)染色體上，其降低了發(fā)病率(見(jiàn)表1)。QTL的LOD積分為2.9，其與下面的AFLP標(biāo)記物匹配P18M51-169.5e、P18M51-305.4h、P14M60-262.9e、和P14M61-292.7h。該基因座的陽(yáng)性效應(yīng)源自抗性親本多毛番茄。在F2和BC2S1群中都鑒定了陽(yáng)性效應(yīng)。最初在缺少Q(mào)TL-2h分離的BC2S1群中鑒定到該QTL，其也與AFLP標(biāo)記物P14M48-345e、P14M48-177e、和P18M50-147e相匹配。對(duì)于位于2號(hào)染色體和4號(hào)染色體上的基因座，在BC2S1群和F2群中都評(píng)價(jià)了與該區(qū)域共顯性的CAPS標(biāo)記物的分離情況。2號(hào)染色體上的CAPS標(biāo)記物AT4G30930與2號(hào)染色體上的QTL緊密相連，而對(duì)于4號(hào)染色體，分析了一組在該染色體上均勻分布的10個(gè)CAPS標(biāo)記物的分離數(shù)據(jù)。對(duì)包括CAPS標(biāo)記物AT4G30930和4號(hào)染色體上的CAPS標(biāo)記物TG609的ANOVA分析顯示出CAPS標(biāo)記物TG609與性狀發(fā)病率顯著相關(guān)。為了驗(yàn)證每個(gè)“次要”QTL的效應(yīng)，可以開(kāi)發(fā)含有QTL效應(yīng)的區(qū)域的近同基因系(NIL)。與此平行地，可以開(kāi)發(fā)出普通番茄栽培種.Moneymaker遺傳背景中的多毛番茄LYC4/78的回交近交系(BIL)群。3.9疾病檢測(cè)和QTL基因定位的結(jié)論用于測(cè)量對(duì)灰色葡萄孢的抗性的生物檢測(cè)已經(jīng)被證實(shí)是一種有價(jià)值的工具。但是，仍然有大量的和未知的變異表現(xiàn)出能影響感染過(guò)程的發(fā)生。通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)化方法和通過(guò)進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立的復(fù)制可以將大的非遺傳的變異最小化。通過(guò)引起莖的生理?xiàng)l件的不同的周與周之間的溫室條件變化(白晝長(zhǎng)度、日照時(shí)間和溫度)可以引起變異。真菌接種物制備中的小變異也可以在感染過(guò)程的變異中發(fā)揮作用。另一個(gè)觀察是通過(guò)莖段所放置的花盆(tray)內(nèi)的微小氣候也可以影響疾病的發(fā)生。10個(gè)不同的試驗(yàn)花盆被用于BC2S1生物檢測(cè)。用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析補(bǔ)償試驗(yàn)之間和試驗(yàn)內(nèi)的變差。盡管具有更適中的疾病發(fā)病率的試驗(yàn)提供的信息更多，但具有最高平均發(fā)病率的試驗(yàn)為測(cè)量病變生長(zhǎng)提供了最多的信息。發(fā)病率和病變生長(zhǎng)是獨(dú)立的性狀，因?yàn)闆](méi)有觀察到兩種性狀之間的線性相關(guān)性。鑒定出F2中的番茄的抗灰色葡萄孢抗性的數(shù)量性狀基因座。在BC2S1群中驗(yàn)證了這些鑒定出的QTL，并分別解釋了發(fā)病率和病變生長(zhǎng)的46％和33％的親代變異。這些結(jié)果說(shuō)明在最初的F2基因定位群中沒(méi)有檢測(cè)到所有的賦予灰色葡萄孢抗性的QTL。在兩種BC2S1群中，發(fā)現(xiàn)了比抗性親代LYC4/78更高抗性水平的植株。這表明在BC2S1群中存在著附加的分離的抗性基因座?？剐缘母郊臃蛛x是令人驚訝的，因?yàn)橐呀?jīng)預(yù)測(cè)兩種BC2S1群的大部分基因組都是純合子的Moneymaker。3.10驗(yàn)證單個(gè)QTL在溫室條件下的效應(yīng)。用圖2所示的方法將含有上面所述的兩種QTL之一的植株放置于普通番茄背景內(nèi)。將BC2S2系放置于溫室的土壤內(nèi)，在荷蘭的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐條件下栽培。在3個(gè)月后，通過(guò)將含有葡萄孢的瓊脂盤(pán)放置于主莖的傷口上接種植株。隨后用Parafilm閉合傷口。在接種后3周，測(cè)量莖病變長(zhǎng)度(單位為cm)(細(xì)節(jié)見(jiàn)下)。結(jié)果列于表10。含有病變生長(zhǎng)的QTL的系清楚地表現(xiàn)出病變大小的極大縮小。表10在接種后3周時(shí)的多毛番茄LYC4/78和多毛番茄LA1777成體植株中的灰色葡萄孢病變的平均莖病變長(zhǎng)度。***)a，b，c和d是重復(fù)，其中每個(gè)重復(fù)代表5個(gè)植株，e和f是重復(fù)，其中每個(gè)重復(fù)代表3個(gè)植株；GT是抗TMV的Moneyberg；Durintha是栽培者判斷為具有部分抗性的雜種；Tradiro是栽培者判斷為易感于葡萄孢的雜種；BChirs表示多毛番茄LYC4/78漸滲形成的回交系；LA1777是野生種株多毛番茄LA1777；BCchrs10表示具有多毛番茄LA1777的10號(hào)染色體的漸滲的回交系；parv表示小花番茄漸滲形成的系。3.11多毛番茄LYC4/78QTL賦予的葡萄孢抗性水平要高于10號(hào)染色體上的小花番茄LA1777QTL賦予的抗性水平。將含有在此所述的多毛番茄LYC4/78QTL的植株中的抗性水平與多毛番茄LA1777、含有10號(hào)染色體上的部分葡萄孢抗性的QTL的WO02/085105來(lái)源、以及源自10號(hào)染色體漸滲的漸滲系的抗性水平相比較。將各系放置于溫室的土壤內(nèi)，在荷蘭的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐條件下栽培。在3個(gè)月后，通過(guò)將含有葡萄孢的0.5×0.5cm瓊脂盤(pán)放置于主莖的2cm長(zhǎng)的垂直莖傷口上接種植株。隨后用Parafilm閉合傷口。在接種后3周，測(cè)量出從病變頂部到病變底部的莖病變長(zhǎng)度(有真菌生長(zhǎng)斑點(diǎn)的變色組織的長(zhǎng)度)(單位為cm)。結(jié)果列于表10。觀察到含有多毛番茄LYC4/78的QTL的系顯示出比LA1777來(lái)源和IL系更高水平的葡萄孢抗性。另外，將含有4號(hào)染色體上的任一種發(fā)病率的QTL和9號(hào)染色體上的病變生長(zhǎng)的QTL組合(系68)或含有3號(hào)染色體和4號(hào)染色體上的發(fā)病率的QTL組合(系78)的小花番茄系與LA1777來(lái)源和IL系進(jìn)行比較。前系顯示出更少的莖上的病變生長(zhǎng)，因此比源自LA1777的品系表現(xiàn)出更高水平的葡萄孢抗性(見(jiàn)表10)。當(dāng)記錄到2.0cm的病變長(zhǎng)度時(shí)，只能測(cè)量到原始傷口，并沒(méi)有觀察到真菌生長(zhǎng)，其表明了高水平的抗性。因此，2cm長(zhǎng)的莖病變長(zhǎng)度說(shuō)明缺少凈生長(zhǎng)。在此所用的標(biāo)記物下面的表格提供了關(guān)于在各種連鎖圖中所示的以及表示為與本發(fā)明的QTL的相關(guān)性的各種RFLP和COS-II標(biāo)記物的詳細(xì)信息。信息直接復(fù)制于康奈爾大學(xué)2005年10月7日版本的SOL基因組網(wǎng)絡(luò)(SGN)數(shù)據(jù)庫(kù)。表11TG301RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG301插入物大小750載體pGEM4Z切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列TTGTAACTTACTAAATTAAGAGCTCAGGATGAACAGAACACGAATTATTAGTTCATATTAAGCAAGAAACTTAAAAAACTTCACCTTCTCCAACATACTCTACAACAAACTCTTTTGTCTTGATATCTTCATCTGCCACAATCCCAGTGCCACATTTCTCAGTCTGCACGTTATGAGTCAACAAAACTTTAGTTTTTTAGATGATTATTGCTTGGTTTTCAAAAGAAACGAAAATAAGAAGAATACAAAATAACCAACATTTCTTTACTTCTTCACCAGATACACAACTGAATTAAATGCAAAAATAGATATGAAAAATGTTACCAGCCTGCACTTTTGATGCAGATTGTACTTGTTTGCAATTGAAAAGTGTCGAATGGTCATTTTTGGTAAAAACTGATGAATGTGGTATTTTGAGAAAGGATTTATGACGGTCCTTTTGCTTAATTATCCCTCTTATAAACGTTAGTAAAGGC反向序列TATTCTGAATCTGGAAAATTGTTCTGCCAATTTCTTTGACCAACCAGACAATACCCTTTTAATCTAAGACCCTAATTACAAGGTTACTGACAATCACTTTTGACACCAATGTCTTTGATAAAGCACTGTTAAAATTTTCAGATGTGCTTTAATACTCTGCATCCTTTTTAGGAACTCTTTTGTCTACTTTCACTTTTTAAAAGAAAGAACTTAAGGAGAGGACATACTTATTATTTTTGCATTTTCTATATCAAGTAAAGTGAGAAGACTTCCATTAATTTGCATCCAGCGGATGCTAATGGCTACAACATAGCTACTTTAAGCAAATAGGTGATTTGATCAAGATTCTTTACGTTTTCAAGATCACAGCAACAAAAAGGGTTCCTTAAAAACCTAGCCTTTACTAACGTTTATAAGAGGGATAATTAAGCAAAAGGACCGTCATAAATCCTTTCTCAAAATACCACATTCATCAGTTTTTACCA表12TG460RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG460插入物大小2000載體pGEM4Z切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列CCTTAGTTTTGAAATCTTTAAGTAGCAATTAGTAATCGGTAGCTCTCCAGTATGAAAAGTTCATAATCACTTGGTGGATCTCTTATTATTTGCATCATTTGTGTGCAATAGGCATAAGAGGTAGTCATTTCACAATGCCTCTGAAATGTGTGCATTGACATTTGAGAACACTTGAGGATGGGATACACTCTCTGTCATCAGGAACTACTTAGGTGACAAATAGATGTGAAGATTCACGGCATAGTGTCTTTTGATCCATATCATAACCAGAAAGTGAGTATCCCCATTTCTCACATTAGCTATATGAAGGAAGAAAGGGAAAACAAAGGAAAGCGCTACCCTTATTCGTCGAAAGCTAGCCTTCATGATAAACCAAATGAAATTAGAAAAATTTAAGAACTTTGCTATAGCTTCAAAGAAATCTTTTAGATTCTTGTTTACAAAGTTTTGCTGATCTTTCTTACAT反向序列TTATGATGCTCAAAATTTCTTATTTTAGACAGACTCGAAATGTGACTATTCCAGAGAAAAATAAACAAGATCCCTCGGGACACTGAACCTGAGAACAGGTTCAAATTCCCTACTGTACCCCAACAGACAAAGGGAAGAGAGAGCTATCAGTTTCTCTTTGGTTTGAGAAAAAACATAATAGTATGGAGTGTACCAGATGCTTCAGGATTTCAGACATGTTCTGACTTGTTACCTAATGTATTTGATTTCATAGTATAAATCTTAGGTGTTCTGCTTGACTAGAAGTATGGAAAGTCATTCTTGTCAGTAGTCAGTCTTGAGATATAAGATATAATTTGATATACATCTAAATAGATCTTGGATTCATTAGATAAGTTCAACAAGCATGGGTCAATAAGCACATTGATCAATTACAGGATGTAGAATAACTTTGCTTATTGTGAAATCCTCAAAAATGAATGATGCAGGCAAGAAGTGCAAATTACC表13TG55RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG55插入物大小1800載體pUC切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列TGGATTCAGTGTGAAGAAAGGGGACATGGTGAGTTACCTACCATATGCAATGGGAAGAATGAAATTTATATGGGGCGATGATGCAGAAGAATATACACCGGAGAGATGGCTTGATGGGGACGGTTTCTTCAGGCAATACAATCCCTTCAAATTTACAGCTTTCCAGGGTGTTTTGAAGCTCATCATAAGCTTTGATTATCATTTTGTTAAAGCCTTGAACGCAAGTCTATACTTAACTTGCCTAGAGCTATGTACTGTCGACATATGATCAATTAACTAAGCACATTCTTTTGTTAATAAAACAGGCAGGGCCAAGGATTTGCTTGGGAAAGGAGTTTGCTTATAGGCAAATGAAGATATTCTCTGCTGTTTTATTACATCACTTCGTTTTCAAGCTGAGTGATGACAACAAGGCTACCAACTACAGGACAATGATTACTCTTCACATTGATGGGGGATT反向序列GATCCAAAATATGCTTTTCTGATGACCCTTACCAGATGGATTCAGTGTGAAGAAAGGGGACATGGTGAGTTACCTACCATATGCAATGGGAAGAATGAAATTTATATGGGGTGATGATGCAGAAGAATATAAACCGGAGAGATGGCTTGATGGGGACGGTTTCTTCAGGCAAGAGAATCCCTTCAAATTTACAGCTTTCCAGGTTGTTTTAAAGCTCATCATAAGCTTTGATTATCATTTTGTTAAAGCCTTGAACGCGAGTCTATACTTAACTTGCCTAGTGCTATGTACTGTCGTCATATGATCAATTAACTAAGCACATTCTTTTGTTAATAAAACAGGCAGGGCCAAGGATTTGCTTGGGAAAGGAGTTTGCTTATAGGCAAATGAAGATATTCTCTGCTGTTTTATTACATCACTTTGTTTTCAAGTTGAGTGATGACAACAAGGCTACCAACTACAGGACAATGATTACTCTTCACATTGATGGGGGATTGCATGTTCGTGTCTTTAGTA表14TG59RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG59插入物大小3500載體pUC切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列TCGACCTGCAGATATTTCATAAAAGAATGCCCCCTGAAGCAGTTGATTTGGTGTCGAGGCTTCTCCAATATTCTCCAACTCTACGCTGCACTGCTGTAAGTAAAAAGTTTTCTTCTCAATTATCAAGTATTTAGGATATTCTGGTAGTTTCCCATTTTACCCATCATTCAAACATGGTGTTCCATTTTTGTTATGTTTCAATATGCGAGTTCTCATTGATTGTCCTTTTAGCACTTCTGTTTTCCGGGGATATTGAGAACATTTTGTGTTTATTGACAGTTGGAAGCATGTGCACACCCTTTCTTTGATTCTTTAAGGGAACCAAATGCTTGCTTGCCAAATGGGCGACCTCTGCCTCCCCTATTCAACTTTTCACCTCAAGGTGAGCTTCAGTCTAGCTTTCTCCTTTTATTTCACATGATTTGATACGTCAAT反向序列AGTTGGGAATTATATCCTGTTCAGTAGACAAATTACCCAACCAGAATATACGTACCTGAATGTTCATGTGATAGATAAGTCCATACTAGTACTTCTGTCTTGTGAATATCTGTGTGTTGCCTTGTGAGTAAGGATATTCATTGCTCCAATGCAAAACCATTATGTCATTGTCTTAGGGAGCTTTCTGTTGTTTGTATGGCATGAAAAGTTAATCCTAAAAGAAAGGTAAAGTAAAGGTGCATCCTAGGTTAGTATAATGTTCTGAAGGCAAAGATGTTTTTCTTTTGATTTAAACTTATGTTTTTTTTTCTTTGATTCCGTCTCCTTCCCTAATAGCAAAAACTGGGAAGTTGAAACTACGTTATAACTGGACAACCTCATAAATGAAAAAGATGGTAAATAATGCCATTTCTGGGGTGGGGTAATTTTCCTTAGATGAGTGTGATACTGTTGTACCTGTTGCTTGAACTCCTAAGTTTCCTCATTTTCTTCCTTTTTGTTTATGCTAAATGCCGTGTGTACTGTG表15TG145RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG145插入物大小2480載體pGEM4Z切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列ATGGGCTATGCTTGGTGCTCTTGGATGTGTCTTCCCTGAGCTATTGGCCCGTAATGGTGTCAAGTTCGGTGAGGCTGTGTGGTTCAAGGCTGGATCCCAGATCTTCAGCGAGGGTGGACTTGATTACTTGGGCAACCCAAGCTTGGTCCATGCACAAAGCATCTTGGCCATCTGGGCTTGCCAAGTTGTGTTGATGGGAGCCGTTGAGGGATACCGCATTGCTGGTGGACCTCTTGGTGAGGTTGTCGACCCACTCTACCCCGGTGGCAGCTTCGACCCATTAGGCCTTGCTGAAGACCCGGAGGCATTTGCTGAGCTTAAGGTTAAGGAGATCAAGAACGGCAGACTTGCTATGTTCTCTATGTTTGGGTTCTTTGTTCAGGCCATTGTTACCGGAAAGGGTCCATTGGAGAACCTCGCTGACCACCTT反向序列GGAGACAACCTTGCATGCCAGCAGTGGATCACCTCGAGTCCACGGTTCTTGGCAAAGGTTTCTGGATCTGCTGAAAGTCCAGCGGTGTCCCACCCGTAGTCACCAGGGAATTCACCATTCAAGTAGCTAGGGGACTCACCAGAGAATGGACCCAAGTACTTAACACGGTCAGGGCCATACCATGGGCTGCTAGATGGGGCTGACTTTGCGACAGCCTTTCTCATAGTGATCCTTCCATTTCCTGTGATTTCTGAGGCAGATGGTAAGAGTTTCACTGCTTGTCCAGCAAAAGAAGGGGAAGAAAGAGCCATTGTAGCAGCTGCCATGGTGTTTATATCAAGAGAAATGTAAGTGTTTGATGGTATGAGATATTGTTGAAGTTGGCTGTAATGAGATGAAGTTACAAGGAATTAATTCACCATATATATAGGGAGTAATTAAGAGGGAAAGAGTCCAAATTATCTAATGATATCTATATCTA表16CT128RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)CT128插入物大小700載體pBLUESC切割位點(diǎn)EcoR1抗藥性AMP正向序列CTTTTTTTTTTTTTCAACACAAACAAAATTTCATTATATTGTCAGGTAGCACACTACATCTTTACACTGTCATCAAACGACCAGAGACTTGAGAACGTTTTAAGAGATTCATTTTCCGGGGACAAAGTTTGTGGCGAAAGCCCAGGCATTGTTGTTTACGGGGTCTGCAAGGTGGTCAGCAAGGTTCTCCAATGGACCCTTTCCGGTGACAATAGCTTGAACAAAGAATCCAAACATAGAGAACATAGCAAGTCTACCGTTCTTGATCTCCTTTACCTTGAGCTCAGCAAATGCCTCTGGGTCTTCAGCAAGGCCTAATGGGTCGAAGCTGCCACCAGGGTAGAGTGGGTCGACAACCTCACCAAGAGGTCCACCAGCAATACGGTATCCCTCAACAGCTCCCATCAACACAACTTGGCAAGCCCAGATGGCCAAGATGCTTTGTGCATGGACCAAGCTTGGGTTGCCCAAGTAGTCAA反向序列CTGGTGATTACGGGTGGGATACCGCTGGACTTTCAGCAGACCCTGAAACTTTTGCCAAGAACCGTGAACTTGAGGTGATCCACTGCAGATGGGCTATGCTTGGTGCTCTTGGATGTGTCTTCCCTGAGCTCTTGGCCCGTAATGGTGTCAAGTTCGGTGAGGCTGTGTGGTTCAAGGCCGGATCCCAGATCTTCAGTGAAGGTGGACTTGACTACTTGGGCAACCCAAGCTTGGTCCATGCACAAAGCATCTTGGCCATCTGGGCTTGCCAAGTTGTGTTGATGGGAGCTGTTGAGGGATACCGTATTGCTGGTGGGACCTCTTGGTGAGGTTGTCGACCCACTCTACCCTGGTGGCAGCTTCGACCCATTAGGCCTTGCTGAAGACCCAGAGGCATTTGCTGAGCTCAAGGTAAAGGAGATCAAGAACGGTAGACTTGCTATGTTCTCTATGTTTGGATTCTTTGTTCAAGCTATTGTCACCGGAAAGGGTCCA表17C2_At4g30930COS-II標(biāo)記物基因定位試驗(yàn)圖Tomato-EXPEN2000前向引物(5&apos；-3&apos；)ATCATACCTTCTCTCTCCAAACCC反向引物(5&apos；-3&apos；)TCGCCATTGCTCACTTTAAACTG溫度55℃Mg+2濃度1.5mMPCR產(chǎn)物大小LA716700LA925700消化條帶大小(用DpnII)LA716380+220LA925340+220基因定位圖染色體偏移置信度Tomato-EXPFN2000263.5I表18C2_At2g18030COS-II標(biāo)記物基因定位試驗(yàn)圖Tomato-EXPEN2000前向引物(5&apos；-3&apos；)TTGGGCGACCACGCTGAATC反向引物(5&apos；-3&apos；)TTACCCACATCAGGACCTTGCC溫度55℃Mg+2濃度1.5mMPCR產(chǎn)物大小LA7161300LA9251200消化條帶大小(用擴(kuò)增子差異)LA7161300LA9251200基因定位圖染色體偏移置信度Tomato-EXPEN2000283.1I表19C2_At5g64670COS-II標(biāo)記物基因定位試驗(yàn)圖Tomato-EXPEN2000前向引物(5&apos；-3&apos；)TGATAAATGCTGGGAAGATTGACTC反向引物(5&apos；-3&apos；)ATCAACCTGGCTCCATCTTCTATTTG溫度55℃Mg+2濃度1.5mMPCR產(chǎn)物大小LA716200LA925220消化條帶大小(用擴(kuò)增子差異)LA716200LA925220基因定位圖染色體偏移置信度Tomato-EXPEN2000276CF(LOD3)表20TG609RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG609插入物大小1900載體pGEM4Z切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列GAGACAGCTTGCATGCCTGCAGAGGTGATAAATTCACCAAGGTTTCATATTTAGGAAACAAGAAAATTAAAAGATCATTAACACAGATGAAAGGATATGACTAGGAGGCAATGACTGATCTTTGACTATCAAATACTTCTCAGGGAAACAATGTGAATGGGCTTTTACATGCAGAGATATTGATTGTGATCATGTTGAAGAACTTAGGAAACATGAAATTAAATGATCATTAACACTGATGCAAGGATATGCCAAGTAGGCAAGCAAATTAAGGTTGAACATAAATGTCTGTGATCTTTGACTATCAAATATCTTCTCAGAAAAAAAAATGTGAATGCTCATTTACATGCAGAGATGGCTATTGTGATCATGTGGCTCAGCCTTGAGTCTATATTGAGGTGCAGACAACATAGTCCCTAACCACATGTGTGATCAAGCAACTTTTTTGATGTCCACAGGGTTATAAGTAGGCAACATTTAAGCAAGAAAAAACACAGGATCACTATTGAGTCAGCTGCTGTTGCCTGT反向序列GGAGACAAGCTTGCATGCCTGCAGAGGTGATAAATTCACCAAGGTTTCATATTTAGGAAACAAGAAAATTAAAAGATCATTAACACAGATGAAAGGATATGACTAGTAGGCAATGACTGATCTTTGACTATCAAATACTTCTCAGGGAAACAATGTGAATGGGCTTTTACATGCAGAGATATTGATTGTGATCATGTTGAAGAACTTAGGAAACATGAAATTAAATGATCATTAACACTGATGCAAGGATATGCCAAGTAGGCAAGCAAATTAAGGTTGAACATAAATGTCTGTGATCTTTGACTATCAAATATCTTCTCAGAAAAAAAAATGTGAATGCTCATTTACATGCAGAGATGGCTATTGTGATCATGTGGCTCAGCCTTGAGTCTATATTGAGGTGCAGACAACATAGTCCCTAACCACATGTGTGATCAAGCAACTTTTTTGATGTCCACAGGTTTATAAGTAGGCAACATTTAAGCAAGAAAAAACACAGGATCACTATTGAGTCAGCTGCTGTTGCCTGTTACTGAG表21TG62RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG62插入物大小1800載體pUC切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列CAAAATGCTTCAGCTACTGGCTAAATGAAGTATGTTCTCAACATATTCACAAGCTTCTGTCTTCGAAGCTCAAGAAGTGTCGGTATTATCTGAATTAAATAGTAAAGCAAAGAGATGGTTTTATGTTTCTTAAGCAGCATTTCTTAGCTTAACGGCCCTCCAGATATATGGTGGACAAAATAGAATCCATTAGATATAACAAATGGGATTAGTATAATGATCTTTTACTTTGTTAGATGATCATACTAACAGATTGCAAGTTAATCATATCCAACATATTCTGTAGATATTTCACATTGGCTAGCATGAGGAAAGGTCATGTAGGAAATTGAATAGAGTTCAATTTTGGGAAAAGTTGCATTGAAGAAGGTAACTTCAACAAACGTGTGAAAAAATCACATTTGAGTTGCCCGCTCACCATCGTGATTCCAGTACGAACTACTCAAAAATTTACTTTTGAGCCTTAAACATCATTTTAAGCCTTGAAAAGCTGCTTTTGAAAAGATCTAAGCAAGAT反向序列GGAGAATATTGTCACTCTATCAGATAGTTCAAAACTATCGGAGAATGAAATGGTCAATTCTTCTCACAAGATATTCATGCCTAGTTGCAGTGTCCGAATTAACATAACATGCTCAATTTTCATATCTTGCAGCAAAATTTATCATTGAAACTCTCTGAGATGGAAACAGAGAACAAAGACCATATTGGAAAGCTTCAATCAGACATGCAGAAAAAGGAAGATGAGATTCATGTTTTACGCAAGGAAATTGACAATTACACGGAAACAGTGGATTCACTGGAGAAGCATGTTACAGAGATTAACAATAAATTGGAGGAGAAAGATCAGCTTGTTCAGGAACTTCAGGACAAGGAGAAGCAGTTGGAAGCTGACAGAGAAAAGGTTTTTACTACGGATACTTTTAGTTCTACAAATTCTATTATAACCAATACAATGTGTTCAAGTGACTAGTGTTTTGCACCTTGTTGCAGATTCAGGCATCTTTGCTTGCTGCTGAAAGCAAGCTCACAGAATCCAAAAAGCAGTATGATCAGATGT表22TG555RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG555插入物大小1600載體pGEM4Z切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列AATTCGGAGCTCACTGCTTCTAATCCTCAGTGAGACTTATTTTCTACATATTAAACAATAAGAAATTTACGAAGGAATATTATAGACTGAATTCCTTGGTGACAAGTATCAAGACATCTTGACCAAGTTTAAAGTTTTGTAGTGGCAGTTCTTTTAAGCTTTACTTGTGTGAGGTAGACATCAAGGAAGATAAGTAGCAGCTACTCTTCACGGAGCAGCCCATAGGACACTCAAATTCACTATTGCGAGGGTCAATCTACCAATTTATGGAACGATACCAGTAAAGTCATTTTTATGTAAACATCAGACAGCTTTTGACTAAGCAGAGACATGAATAAGTTCTATTTGTTAGAAGTCGAAGAGACAAATAAGTTAATTTCACCTATGCTATAAAAGAGGACTCTTATAGTTATAAATACAGTACATTTTATTAAGGGTTCTAATTGTTGACTATGATAGCAAGCATGCCGTACTAATT反向序列ACATTTTGAGGAAGACAGGAGTTATGTATCGCCATCTGGTGTGCTCCAAGAACATGACAGATATAAAAGACCGCGGGGTGCACCAGAGAAATGTTGCATTGGAGCATATTGAACATCATAGGCTCAATGGAATTGTTTACTTTGCAGATGATGATAATATCTACTCACTTGAGTTGTTTGAGAGCATTAGATCGATCAAGTAAGTTGAGATTCATCAGTCTTGTTTACATGACTTGTCTTTGTTTTGTCCTGCTGTGAGCATGTTCAGGATGATGTTATGTGCTTTATGTAGATGTTCAAGTCGATAATAGTGAATAGTCTAGAGCTATTTCACATATATTACAACTTCACTAACAAATTCTTTTCCTGGTGTCCTCGGTTCATCACTCTTCATAGTTATAAGAATAACAGTTGTAGATTAGACCACTGGTCGTGTGATTTTTGGACTTAATTATTATCTCAATTCTTCCTCAAAATAGCAGTCCTTAGATTAGAAGCTGAGG表23CT50RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)CT50插入物大小1600載體pBLUESC切割位點(diǎn)EcoR1抗藥性AMP正向序列CTTTTTTTTTTTTTTTATATATTGTGGTATAGATTATTATATAATAACAAGGTGAATTAACATGAGAAATGAATAATTGTCACATTCTTGTTCTGTCCATTTTCCAGTAGCGGCTAGTTGGAAAATTTGTTGTAACATGTAACACAGGCTGTCCACATTCTACTCCAGAGAGAAAGTTGGTAAGTAGTGGGGGCAAAAGATAGAGACCCCAATAGCTATCAATTCACTTTGTTGACAATCAAGATTTGAGAAAAAAGATCAAAACTTTACCAACTTAGATAGCTCCATAATCAACTGTAGGTACAATTCTTTAGTGAAATTGCGGCGTTCATCTTCTGGGGACGAAGAGTAAGTAGACAATCAATTGTCTTGTAGAACTTGGGCTTTACCATTTTCCCTAGGACATAAGCTCTTGATCGAAGCTTGAAGTTTAATTTTAGTGGCACTGGTAATG反向序列TTTTTTTTTTTTTTTAGCCAAAATGCATACAAAAACTGATTCAGAAGATACGAGCTTGGCTCCTTCGTCGCCGGACAATAGAGGGCCGACGGCGTATTACGTTCAGAGTCCGTCACGTGATTCTCACGATGGCGAGAAGACAACGACGTCGTTTCACTCTACTCCTGTTATCAGTCCCATGGGTTCTCCTCCTCACTCTCACTCATCCGTCGGCCGTCACTCCCGTGATTCCTCTTCCTCCAGATTCTCCGGCTCCCTCAAGCCTGGATCTCAGAAGATTTTACCCGACGCCGCCGGAGGCGTCGGCGGCCGTCACCACCGCAAAGGGCAGAAGCCCTGGAAGGAATGTGATGTTATTTGAGGAAGAAGGACTACTTGAAGATGATAGATCCAGTAAATCTCTTCCACGTCGTTGCTATGTCCTTGCTTTTTGTTGTTGGTTTCTTCGTCCTTTTCTCCTTCTTTGCTCTCATCCTTTGGGGTGCTAGTCGACCTC表24C2_Atlg74970COS-II標(biāo)記物基因定位試驗(yàn)圖Tomato-EXPEN2000前向引物(5&apos；-3&apos；)TCATCATCAACTATCGTGATGCTAAG反向引物(5&apos；-3&apos；)ACGCTTGCGAGCCTTCTTGAGAC溫度55℃Mg+2濃度1.5mMPCR產(chǎn)物大小LA7161000LA9251000消化條帶大小(用AluI)LA716550LA925850基因定位圖染色體偏移置信度Tomato-EXPEN20004109.7I表25CT128RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)CT128插入物大小700載體pBLUESC切割位點(diǎn)EcoR1抗藥性AMP正向序列CTTTTTTTTTTTTTCAACACAAACAAAATTTCATTATATTGTCAGGTAGCACACTACATCTTTACACTGTCATCAAACGACCAGAGACTTGAGAACGTTTTAAGAGATTCATTTTCCGGGGACAAAGTTTGTGGCGAAAGCCCAGGCATTGTTGTTTACGGGGTCTGCAAGGTGGTCAGCAAGGTTCTCCAATGGACCCTTTCCGGTGACAATAGCTTGAACAAAGAATCCAAACATAGAGAACATAGCAAGTCTACCGTTCTTGATCTCCTTTACCTTGAGCTCAGCAAATGCCTCTGGGTCTTCAGCAAGGCCTAATGGGTCGAAGCTGCCACCAGGGTAGAGTGGGTCGACAACCTCACCAAGAGGTCCACCAGCAATACGGTATCCCTCAACAGCTCCCATCAACACAACTTGGCAAGCCCAGATGGCCAAGATGCTTTGTGCATGGACCAAGCTTGGGTTGCCCAAGTAGTCAA反向序列CTGGTGATTACGGGTGGGATACCGCTGGACTTTCAGCAGACCCTGAAACTTTTGCCAAGAACCGTGAACTTGAGGTGATCCACTGCAGATGGGCTATGCTTGGTGCTCTTGGATGTGTCTTCCCTGAGCTCTTGGCCCGTAATGGTGTCAAGTTCGGTGAGGCTGTGTGGTTCAAGGCCGGATCCCAGATCTTCAGTGAAGGTGGACTTGACTACTTGGGCAACCCAAGCTTGGTCCATGCACAAAGCATCTTGGCCATCTGGGCTTGCCAAGTTGTGTTGATGGGAGCTGTTGAGGGATACCGTATTGCTGGTGGGACCTCTTGGTGAGGTTGTCGACCCACTCTACCCTGGTGGCAGCTTCGACCCATTAGGCCTTGCTGAAGACCCAGAGGCATTTGCTGAGCTCAAGGTAAAGGAGATCAAGAACGGTAGACTTGCTATGTTCTCTATGTTTGGATTCTTTGTTCAAGCTATTGTCACCGGAAAGGGTCCA表26TG599RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG599插入物大小700載體pGEM4Z切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列TGCTTTGAGACAGATGTCTCTCATTAAGTGACTGAAGCTTTCTTCTAGTTGGCTAGCATATTCATTTTCAGCATATAATCTGTATCATGAACAAAATTGCGACAGTATTGAATTTTTATTGTTGAATAGTCTTTTTATTATCCCCGAAGTTGAGGGTGGAACTTACATTTTCTGTTGATCCTTGCTTGCTGTTTTTGTAAACAAAAAAGCGTCACCCATTATTTTTCTTTTATTCTTTCTAGGTTGGGACTAAGATTTTTTGAAATGAGAAAGGTATTCGCTACCTTGAGGGCTGTGGTTGAAGTGATGGAGTATCTGAGCAAAGATGCAGCTCCTGATGGTGTGGGAAGGCTTATAAAGGAGGAGGGAGTATTTCCTTTCATTTCTTTGTATTTCCGTGTGTGTATAGTCCGGAACTGGTTCCCTACTTATGAATTCTTTCATGGTTTGGTCAATTGAGAAGGATCAAGAAATCTGATGCTACTTTATCATGGGAACTT反向序列GCTTGCATGCCTGCAGAGTGGTCATACAATAAAAGGTAAAAATCAACATTCTTACCTCTGGAAAGAAACCAATAGCATTGGTCAATGATGCTGCCTCTAGAGGAACAATATTGTATGGTGCAAGTTCCCCTGATAAAGTAGCATCAGATTTCTTGATCCTTCTCAACTGACCAAACCATGAAAGAATTCATAAGTAGGGAACCAGTTCCGGACTATACACACACGGAAATACAAAGAAATGAAAGGAAATACTACCTCCTCCTTTATAAGCCTTCCCACACCATCAGGAGCTGCATCTTTGCTCAGATACTCCATCACTTCAACCACAGCCCTCAAGGTAGCGAATACCTTTCTCATTTCAAAAAATCTTAGTCCCAACCTAGAAAGAATAAAAGAAAAATAATGGGTGACGCTTTTTTGTTTACAAAAACAGCAAGCAAGGATCAACAGAAAATCTAAGTTCCACCCTCAACTTCGGGGATAATAAAAAGACTATTCAACAATAAAAATTCAATACTGTCGCAA表27TG10RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG10插入物大小900載體pUC切割位點(diǎn)EcoR1/HindIII抗藥性AMP正向序列AACTCTGCTCTGCCAATAGTAGTCAGGCAGATCAAGATGCTCAAAATTTTCTATTTGAATTGGAAGCATCAAGATGGTTCTTAGCATTTATTTTAGAAAGACTAACCATATTATCAAATAACCAGACTGAGACGCACACAAAAGTTTCCCTCTATTATTTTTATAATGATGTGAAGATGCTACATAATGAGTACACTTTGCCTTACTTTACTGCAGATGGACCTACCAGGCCCAAACGGACATGTAGCTATGACAGAAGAGCAACCGCTATGAATGTCTCAAACTGTTGGCCTAGGCGATCAGCACAGATGATGAATCTGGAAGTACATTCCAAGAAGGAAAGCTGGAGCGTGGGAACTAACCAGATGCAGGGGATGAATCCACACCTTTCAGTTGATCATCTGAAGGGAAAACTAAGAATTTTCATGAGAAAATGACTGGCTATTTTCAACTTTG反向序列TTCAATGCATTTAAGCTCAAAAAAACAAAGCTGTAGGAAGGAGCATATTAGTAGCCTAACTCTGCTCTGCCAATAATAGTTAAGCAGATCAAGATGCTCAAAATTTTCTAATTGAATTGTTAGCATCAAGATGCTTCTTAGCATTTATTTTAGAAAGATTAACCATATTATCAAATAACCAGACAGAGACGCACACAAAAGTTTCAATCTATTATTTTTATAATGATGTGAAAATGCTACATAATGAGTACACTTTCCCTTACTTTACTGCAGATGGACCTACCAGGCCCAAACGGTCATGTAGTTATGACAGAAGAACAACAGTATGAATTTCTCAAACTGTTGGCCAAGGTGATCAGCAAAGATTATGAATTTGGAAGTACATTCCAAGAGGAAAGCTGGAGCATCGTAACTAACCAGATGCAGGGGATGAATCCACACCTTTCAGTTGATCATCTGAAGGCAAAACTAAGAATTTTCATGAGAAAATACTGGTTATTTTCAACTTTGTTGGCCAGACGAGGAGTCCAATGGGATAGAAGGACTAACTCAATGACGTATG表28TM2aTM標(biāo)記物TM信息名稱(chēng)TM2A老的COSIDT0899序列CNAGCTCGANNNACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGCTCCTCCATTGAAAAGGGAATCAAGTTTGCCAAAGAAAACTAAAAAAACAAAATTATGGTCTAGTTTTCTATAGTGACAGTTTTGGATCTTTTTGGGTCAATTGTTTTTGTATCCTTTGCAAGTTTCTTGCAGCCGGAGGCTTAGATTTAGCTCTTTTGATATTATACCCAACATTTCTACAAAATAATGTATGGCAAACTGGGGGCCTATCCCATTTGCCTTAGTGTGGAGGTGTTATTCTCACATGAATCGTTTTCCAATTATGGTTAGTAGCAGACAATTGATGCAAAATGAAGAAATGTTCATGACCAAAAAAAAAAAAAAAAAA基因定位圖染色體偏移置信度Tomato-EXPEN2000(TM2A)950.5I表29TG551RFLP標(biāo)記物RFLP信息名稱(chēng)TG551插入物大小950載體pGEM4Z切割位點(diǎn)PST1抗藥性AMP正向序列AATGAAGTTCAGTTGATAAGCTAAATGGTGGAAATACTAATTTTAATTGACAGTAACTTTGCATTTCAAGGTCCATACCAAAACATTTGCTAACACCAGTTGCTTTGTCAACGAAAACCTTGGCACTCAAAACCCTACCAAAAGGCTGAAATGCATTTGCAAGCTCTTGATCACCAAATTCTTGAGGAATATGGTAAATAAATAGATTAGCACCAGGTGGACCTGTAAACAGCAAAATCGTTTTTGATAAGTACAGGTTTATTTCTACATGTTCAACTACCACTGCCAAGTACACTAGTTCAAGTGACATCTCCACCACTTAATTGCATAAAGCTTTACCAACGACAAATATAACAAACTTGTGCAAGTAATTTGAGTTCCTGTCTATACAGTCCAGAATCTCCATATGCTGCTCATCTCACAATGTTGGTTAAGGAAATTTGTCAAGTAAAGTTCAA反向序列CATCTTCAAGTGTCAGCTCAAGTACAGGGGGTCAGGTTGAAGGTTGTTGAACATTTATTTTGTGACCTTTTTAGCTCTAGAATTTCTGTAGCTAATCAAGTACAGTCCCATAACCTAGGGGCTGTTAGGGTTTTCTGCTGAATGAGGCTGCTTGTCTTTATTTTGGTTAATTATTTTCTGGAAATTGTTCCTCGTCATAGAGAATAGAAGTAGAAGAAGAAGAAGATAGTATAATCTATTATATTTGTTTTTTACTTAATTTATAAAGATTCCATAAATGCATGTGATCTTTGATCAATGATATCTTATACAAGTGTATCACTAGAATCTATTATATTTGGATTTACTTATTTTATATAGGATTTCATAAACGCATGTG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求3到11中任一項(xiàng)的方法可以獲得的番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的QTL。13.番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的QTL，其中所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1、2和4號(hào)染色體上的QTL以及小花番茄G1.1601的3、4和9號(hào)染色體上的QTL或它們的賦予葡萄孢抗性的部分組成的組。14.權(quán)利要求13的QTL，包括至少一種選自由表1和2的標(biāo)記物以及圖1、5和6中所示的與所述QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分連鎖的標(biāo)記物組成的組中的標(biāo)記物。15.一種生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的方法，其包括將包括權(quán)利要求12到14中任一項(xiàng)的至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸從抗葡萄孢的供體番茄植株轉(zhuǎn)移到葡萄孢易感的受體番茄植株的步驟，其中通過(guò)轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合、雙單倍體技術(shù)或通過(guò)胚拯救進(jìn)行所述核酸的轉(zhuǎn)移。16.一種生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的方法，其步驟包括在抗葡萄孢的供體番茄植株中進(jìn)行權(quán)利要求3到11中任一項(xiàng)的用于檢測(cè)番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的QTL的方法，和將包括由此檢測(cè)到的至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的核酸從所述抗葡萄孢的供體番茄植株轉(zhuǎn)移到葡萄孢易感的受體番茄植株。17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述抗葡萄孢的供體番茄植株選自由櫻桃番茄、奇士曼尼番茄、智利番茄、克梅留斯基番茄、普通番茄、多毛番茄、小花番茄、潘那利番茄、秘魯番茄、醋栗番茄和類(lèi)番茄茄組成的組。18.權(quán)利要求15到17中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗葡萄孢的供體番茄植株是多毛番茄或小花番茄的野生株，更優(yōu)選地是多毛番茄LYC4/78或小花番茄G1.1601。19.權(quán)利要求15到18中任一項(xiàng)的方法，其中所述葡萄孢易感的受體番茄植株是普通番茄種的植株，更優(yōu)選地是具有商業(yè)所需特性的普通番茄品系。20.權(quán)利要求16到19中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸的轉(zhuǎn)移包括將所述抗葡萄孢的供體番茄植株與葡萄孢易感的受體番茄植株雜交以產(chǎn)生子代植株，并從子代植株中選出其基因組中包括所述至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分的植株。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述選擇包括利用標(biāo)記物的標(biāo)記物輔助性選擇，所述標(biāo)記物選自由表1和2的標(biāo)記物以及圖1、5和6所示的與所述QTL連鎖的標(biāo)記物組成的組。22.權(quán)利要求15到21中任一項(xiàng)的方法，其中所述供體植株是多毛番茄LYC4/78和/或小花番茄G1.1601，且其中從所述供體番茄植株轉(zhuǎn)移到所述受體植株中的所述DNA包括至少一種與番茄的葡萄孢抗性相關(guān)的QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分，所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1、2和4號(hào)染色體上的QTL以及小花番茄G1.1601的3、4和9號(hào)染色體上的QTL組成的組。23.用權(quán)利要求13到22中任一項(xiàng)的方法獲得的抗葡萄孢的番茄植株或其部分。24.抗葡萄孢的番茄植株或其部分，其基因組中包括至少一種QTL或其賦予葡萄孢抗性的部分，其中所述QTL選自由與葡萄孢抗性相關(guān)的多毛番茄LYC4/78的1、2和4號(hào)染色體上的QTL以及小花番茄G1.1601的3、4和9號(hào)染色體上的QTL組成的組，且其中所述QTL或所述其賦予葡萄孢抗性的部分并不處于其天然遺傳背景內(nèi)。25.權(quán)利要求24的植株或植株部分，其中用選自由表1和2的標(biāo)記物以及圖1、5和6所示的與所述QTL連鎖的標(biāo)記物組成的組中的至少一種標(biāo)記物指示出所述QTL。26.通過(guò)雜交權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的番茄植株與表現(xiàn)出商業(yè)所需特性的番茄植株而獲得的雜種番茄植株或其部分。27.通過(guò)種植權(quán)利要求23到26中任一項(xiàng)的番茄植株產(chǎn)生的番茄種子。28.番茄種子，其通過(guò)回交權(quán)利要求26的植株和具有所需表型性狀的普通番茄植株以獲得抗葡萄孢并具有所需表型性狀的普通番茄植株，以及收集所述植株產(chǎn)生的種子而制備。29.權(quán)利要求11或12的QTL用于生產(chǎn)抗葡萄孢的番茄植株的用途。30.選自表1和2的標(biāo)記物以及圖1、5和6所示的與與葡萄孢抗性相關(guān)的所述QTL連鎖的標(biāo)記物組成的組中的標(biāo)記物用于檢測(cè)抗葡萄孢的番茄植株的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)番茄中的與葡萄孢抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法，包括步驟雜交抗葡萄孢的供體番茄植株和無(wú)抗性的或葡萄孢易感的受體番茄植株，用感染量的葡萄孢接觸一種或多種子代植株，定量測(cè)定所述一種或多種子代植株中的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率，建立聯(lián)系在所述一種或多種子代植株中觀察到的發(fā)病率和/或病變生長(zhǎng)速率與存在所述供體番茄植株的染色體標(biāo)記物的遺傳連鎖圖，并將所述圖上的與降低發(fā)病率和/或降低病變生長(zhǎng)速率相關(guān)的相鄰標(biāo)記物分配給QTL。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101087884SQ200580044768公開(kāi)日2007年12月12日申請(qǐng)日期2005年10月24日優(yōu)先權(quán)日2004年10月25日發(fā)明者J·A·L·范坎,A·坦恩哈韋,W·H·林德豪特,H·J·芬克爾斯,R·范貝爾羅,A·W·范霍斯丹恩申請(qǐng)人:德魯伊特種子研發(fā)有限公司