專利名稱：：棒狀細(xì)菌mqo基因的等位基因的制作方法棒狀細(xì)菌mqo基因的等位基因本發(fā)明涉及編碼蘋果酸醌氧化還原酶(EC:1丄99.16)變體的棒狀細(xì)菌(coryneformbacteria)mqo基因的突變體和等位基因及使用包含這些等位基因的細(xì)菌制備氨基酸、特別是L-賴氨酸、色氨酸和L-脯氨酸的方法?，F(xiàn)有技術(shù)氨基酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)。已知氨基酸可通過棒狀細(xì)菌菌株、尤其谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于其極其重要，己不斷嘗試改進(jìn)生產(chǎn)方法。方法的改進(jìn)可涉及發(fā)酵相關(guān)措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或例如通過離子交換層析對產(chǎn)物形式的加工，或微生物本身的固有性能特性。為改良這些微生物的性能特性，可使用誘變、選擇及突變體選擇等方法，由此產(chǎn)生對抗代謝物有抗性或?yàn)檎{(diào)節(jié)重要性代謝物缺陷型并產(chǎn)生氨基酸的菌株。已知抗代謝物是賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。一段時(shí)間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于改善產(chǎn)L一氨基酸的棒桿菌菌株，其通過擴(kuò)增單個(gè)氨基酸生物合成基因，并研究其對氨基酸生產(chǎn)的影響而進(jìn)行。關(guān)于谷氨酸棒桿菌的遺傳學(xué)、代謝和生物技術(shù)學(xué)的多個(gè)方面的綜述可見于Piihler(chiefed.)，JournalofBiotechnology104(1-3)，1-338，2003。谷氨酸棒桿菌蘋果酸醌氧化還原酶編碼基因的核苷酸序列由Molenaaretal.(EuropeanJournalofBiochemistry254:395-403(1998))測定，并可以在國立醫(yī)學(xué)圖書館的生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫(Bethesda，MD，美國)中公開獲得，登記號為AJ224946。所述核苷酸序列也可見于專利申請WO01/00844中的序列No.569和序列No.571，以及專利申請EP-A-1108790中的序列No.3478、序列No.7065和序列No.7066。EP1038969描述了由棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸中的改良，其通過擴(kuò)增mqo基因?qū)崿F(xiàn)。另一方面，WO02086137描述了通過弱化mqo基因?qū)崿F(xiàn)的對棒狀細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)的有益作用。在本申請中描述并被稱作"等位基因672"的mqo基因的突變在mqo基因DNA序列的第672位攜帶腺嘌呤替代鳥嘌呤，這樣導(dǎo)致在谷氨酸棒桿菌蘋果酸醌氧化還原酶的氨基酸序列中的第224位形成終止密碼子。本發(fā)明還描述了"等位基因1230"，其除等位基因672中的突變之外，還含有在mqo基因的核苷酸序列中第1230位的由胞嘧啶至胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)變。本申請進(jìn)一步描述了通過整合誘變導(dǎo)致的基因中斷(geneinterruption)而引起的mqo基因的消除，由此導(dǎo)致相應(yīng)菌株的L-賴氨酸生產(chǎn)增加。棒狀細(xì)菌中L-氨基酸的微生物生物合成是一個(gè)復(fù)雜且多層的系統(tǒng)，并與細(xì)胞中的多個(gè)其它代謝途徑互相關(guān)聯(lián)。因此不能對于完全消除或降低蘋果酸醌氧化還原酶的催化活性是否能在改善不同歩驟的L-氨基酸生產(chǎn)做出任何預(yù)測。因此需要活性程度不同的可用的蘋果酸醌氧化還原酶變體。為更明了起見，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的信息，編碼谷氨酸棒桿菌蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(野生型基因)的核苷酸序列在SEQIDNO:l中描述，而其編碼的蘋果酸醌氧化還原酶的氨基酸序列在SEQIDNO:2和4中描述。位于上游和下游的核苷酸序列在SEQIDNO:3中示出。發(fā)明目的本發(fā)明人的目的是為生產(chǎn)氨基酸、特別是L-賴氨酸、L-色氨酸和L-脯氨酸提供改良的新方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及棒狀細(xì)菌的突變體，它們是被產(chǎn)生的或分離的，優(yōu)選分泌氨基酸并包含編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性的多肽的基因或等位基因，其特征在于所述多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列在第111位或相應(yīng)或相當(dāng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。優(yōu)選用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置換L-絲氨酸。所述棒狀細(xì)菌優(yōu)選是谷氨酸棒桿菌屬。特別優(yōu)選的是基于如下種的分泌氨基酸的菌株Corynebacteriumefficiens，例如菌株DSM44549，谷氨酸棒桿菌，例如菌株ATCC13032，熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)，例如菌株FERMBP-1539，產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)，例如菌株ATCC6871，特別優(yōu)選谷氨酸棒桿菌。谷氨酸棒桿菌菌種的一些代表性菌株在現(xiàn)有技術(shù)中也已知為其它菌種名稱。這些代表性菌株包括例如嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870百合棒桿菌(Corynebacteriumlilium)DSM20137棲糖蜜棒桿菌(Corynebacteriummelassecola)ATCC17965黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869，以及BrevibacteriumdivaricatumATCC14020己知的分泌氨基酸的棒狀細(xì)菌菌株例如是L-賴氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌DM58-l/pDM6(=DSM4697)，在EP0358940中描述谷氨酸棒桿菌MH20(=DSM5714)，在EP0435132中描述谷氨酸棒桿菌AHP-3(=FermBP-7382)，在EP1108790中描述熱產(chǎn)氨棒狀桿菌AJ12521(-FERMBP-3304)，在US5,250,423中描述，或者L-色氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌K76(=FermBP-1847)，在US5,563,052中描述谷氨酸棒桿菌BPS13(=FermBP-1777)，在US5,605,818中描述谷氨酸棒桿菌FermBP-3055，在US5,235,940中描述關(guān)于這組細(xì)菌菌株的分類信息可見于Seiler(JournalofGeneralMicrobiology129，1433-1477(1983)、KSmpferandKroppenstedt(CanadianJournalofMicrobiology42，989-1005(1996))、Liebetal(InternationalJournalofSystematicBacteriology41，255-260(1991)及US-A-5,250,434的描述。具有ATCC名稱的菌株可以得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA，USA)。具有DSM名稱的菌株可得自德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Brunswick,Germany)。具有FERM名稱的菌株可得自NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology(AISTTsukubaCentral6，1-1-1Higashi，TsukubaIbaraki，Japan)。上述Corynebacteriumthermoaminogenes菌株(FERMBP-1539、FERMBP-1540、FERMBP-1541和FERMBP-1542)在US-A5，250，434中描述。"蛋白質(zhì)氨基酸"是指在天然蛋白質(zhì)中存在的氨基酸，即在衍生自微生物、植物、動物和人的蛋白質(zhì)中存在的氨基酸。這些氨基酸包括選自如下氨基酸組成的組的L-氨基酸L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。本發(fā)明的突變體優(yōu)選分泌上述蛋白質(zhì)氨基酸，特別是L-賴氨酸。術(shù)語氨基酸還包括它們的鹽，如在L-賴氨酸的情況中為賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及棒狀細(xì)菌的突變體，其包含編碼下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列，所述氨基酸序列中第111位是除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。優(yōu)選用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置換L-絲氨酸。在適當(dāng)情況中，所述多肽的氨基酸序列另外在第201位含有L-丙氨酸由其它蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選由L-絲氨酸的置換。本發(fā)明另外涉及棒狀細(xì)菌的突變體，其包含編碼下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并在相應(yīng)于SEQIDN0.2所示氨基酸序列第111位的位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，其中所述mqo等位基因包含與可以使用引物對通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述引物對的核苷酸序列各自包含選自如下核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸SEQIDNO:3的第1—349位之間的核苷酸序列及SEQIDNO:3的第2002—1850位之間的互補(bǔ)核苷酸序列。合適的引物對例如是SEQIDNO:l1和SEQIDNO:12，以及SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。優(yōu)選起始材料(模板DNA)是已經(jīng)被處理、特別是用誘變劑處理的棒狀細(xì)菌染色體DNA。具體優(yōu)選的是棒桿菌屬的染色體DNA，特別具體優(yōu)選的是谷氨酸棒桿菌的染色體DNA。本發(fā)明進(jìn)一步涉及棒狀細(xì)菌的突變體，其包含編碼下述多月太的mqo等位基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并包含長度相應(yīng)于500個(gè)L-氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列第111位存在除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-苯丙氨酸或者L-丙氨酸。在適當(dāng)?shù)那闆r中，所述多肽的氨基酸序列另外在第201位含有L-丙氨酸由另一種蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸的置換。本發(fā)明進(jìn)一步涉及棒狀細(xì)菌的突變體，其包含編碼下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并且在氨基酸序列的第106—116位包含相應(yīng)于SEQIDNO:6或8的第106—116位的氨基酸序列。編碼的多肽的氨基酸序列優(yōu)選含有相應(yīng)于以下序列的氨基酸序列.，SEQIDNO:6或8的第96—126位，或者SEQIDNO:6或8的第81—141位，或者SEQIDNO:6或8的第66—156位，或者SEQIDNO:6或8的第51—181位，或者SEQIDNO:6、8或10的第21—201位，或者SEQIDNO:6、8或10的第2-301位，或者SEQIDNO:6、8或10的第2—401位，或者SEQIDNO:6、8或10的第2—499位，或者SEQIDNO:6、8或10的第2—500位。特別優(yōu)選地，編碼的蛋白質(zhì)的長度為500個(gè)氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及棒狀細(xì)菌的突變體，其包含編碼下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并且在其氨基酸序列第111位或相應(yīng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸，其中優(yōu)選用L-絲氨酸由L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置換，此外其氨基酸序列與SEQIDN0:6或8所示氨基酸序列具有至少90%、優(yōu)選至少92%或者至少94%或者至少96%、及特別優(yōu)選至少97%或至少98%或至少99%相同性。與SEQIDNO:6或8所示序列具有至少99%相同性的氨基酸序列例如SEQIDNO:IO所示序列。這種蘋果酸醌氧化還原酶多肽中除在第111位的氨基酸置換之外，在第201位的L-丙氨酸由L-絲氨酸置換。本發(fā)明進(jìn)一步涉及棒狀細(xì)菌的突變體，其包含編碼下述多肽的mqo基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并且在其氨基酸序列的第111位或相應(yīng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何氨基酸，其中優(yōu)選用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置換，另外所述基因的核苷酸序列與SEQIDNO:5或7所示核苷酸序列具有至少90%、優(yōu)選至少92%或者至少94%或者至少96%、特別優(yōu)選至少97%或至少98%或至少99%相同性。與SEQIDNO:5或7所示核苷酸序列具有至少99%相同性的mqo等位基因的核苷酸序列例如SEQIDNO:9所示。這個(gè)mqo等位基因的核苷酸序列中除第331位胸腺嘧啶由鳥嘌呤置換之外，其第601位的鳥嘌呤由胸腺嘧啶置換(見SEQIDNO:9)。已知保守氨基酸取代僅以非常微小程度地改變酶活性。因此，存在于本發(fā)明的突變體中并編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性的mqo等位基因除包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列之外還可含有一個(gè)(l)或多個(gè)保守氨基酸取代。所述多肽優(yōu)選含有至多2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或至多5個(gè)保守氨基酸取代。在芳香族氨基酸的情況中，當(dāng)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此置換時(shí)稱作保守取代。在疏水性氨基酸的情況中，當(dāng)亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸彼此置換時(shí)稱作保守取代。在極性氨基酸的情況中，當(dāng)谷氨酰胺和天冬酰胺彼此置換時(shí)稱作保守取代。在堿性氨基酸的情況中，當(dāng)精氨酸、賴氨酸和組氨酸彼此置換時(shí)稱作保守取代。在酸性氨基酸的情況中，當(dāng)天冬氨酸和谷氨酸彼此置換時(shí)稱作保守取代。在含有羥基基團(tuán)的氨基酸的情況中，當(dāng)絲氨酸和蘇氨酸彼此置換時(shí)稱作保守取代。在本發(fā)明研究期間，通過使用Clustal程序(Thompsonetal.，NucleicAcidsResearch22，4637-4680(1994))對比氨基酸序列觀察到，不同細(xì)菌如大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、Corynebacteriumefficiens、Corynebacteriumdiphtheriae、結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、蠟狀芽抱桿菌(Bacilluscereus)和Bacillushaloduraiis的蘋果酸醌氧化還原酶的氨基酸序列含有由Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu組成的序列基序及由Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser組成的序列基序。術(shù)語"Bra"代表氨基酸lie或Leu，而術(shù)語"Sal"代表氨基酸Ser或Ala,術(shù)語"Ali"代表氨基酸Ala或Gly。因此，優(yōu)選地，這些棒狀細(xì)菌的突變體包含編碼下述的多肽的mqo等位基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性、包含選自Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu或Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser的至少一個(gè)氨基酸序列、并在氨基酸序列的第111位或相應(yīng)位置具有除L-絲氨酸之外的任何氨基酸、優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。在適當(dāng)情況中，所述氨基酸序列另外在SEQIDNO:2第201位的L-丙氨酸由另一蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸置換。氨基酸序列基序Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu例如存在于SEQIDNO:6、8或10的第59—69位。氨基酸序列基序Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser例如存在于SEQIDNO:6、8或10的第433—441位。本發(fā)明最后涉及棒狀細(xì)菌的突變體，其包含編碼這樣的多肽的mqo等位基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性及包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列。已知宿主固有的酶即所謂的氨基肽酶，在蛋白質(zhì)合成期間除去末端甲硫氨酸。短語"相應(yīng)于氨基酸序列第111位的位置"或者"相當(dāng)于氨基酸序列中第111位的位置"是指通過使編碼所編碼多肽N末端區(qū)域中氨基酸(基于SEQIDNO:6、8或10的第lll位)的密碼子的插入或缺失，位置規(guī)格和長度規(guī)格形式上增加(在插入情況中)或減少(在插入情況中)一個(gè)單位。例如，作為編碼SEQIDNO:5、7或8第2位L-絲氨酸的TCA密碼子缺失的結(jié)果，L-苯丙氨酸或L-丙氨酸從第111位移至第110位。長度規(guī)格則為499個(gè)氨基酸。同樣，由于使編碼所編碼多肽C末端區(qū)域中的氨基酸(基于第111位)的密碼子的插入和缺失，長度規(guī)格形式上增加(在插入情況中)或減少(在缺失情況中)一個(gè)單位。這種性質(zhì)的相當(dāng)位置可通過序列排列對比氨基酸序列而易于鑒別，例如使用Chistal程序進(jìn)行。所述酶活性不受這種插入或缺失的明顯影響。"不受明顯影響"是指所述變體的酶活性與具有SEQIDNO:6或8或10所示氨基酸序列的多肽活性相比有至多10%、至多7.5%、至多5%、至多2.5%或者至多1%不同。因此，本發(fā)明還涉及編碼SEQIDNO:6、8或10的多肽變體的mqo等位基因，所述多肽含有一或多個(gè)插入或缺失。所述多肽優(yōu)選含有至多5、4、3或者2個(gè)氨基酸插入或缺失。序歹lj基序Trp-Asn-Asn畫Ala國Gly-Thr-Gly國His-Sal-Ala-Leu和Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser優(yōu)選不被這些插入/缺失所破壞?？梢允褂脗鹘y(tǒng)的體外誘變方法，應(yīng)用棒狀細(xì)菌群和誘變物質(zhì)如N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)或者紫外光制備本發(fā)明的突變體。誘變方法在例如ManualofMethodsforGeneralBacteriology(Gerhardetal.(Eds.)、AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC，USA，1981)或者Tosakaetal.(AgriculturalandBiologicalChemistry42(4)，745-752(1978》或者Koniceketal(FoliaMicrobiologica33，337-343(1988))中描述。使用MNNG的常見通常誘變包括濃度為50—500mg/l、或者至多1g/l的更高濃度，保溫時(shí)間為1一30分鐘，pH為5.5—7.5。在這些條件下，存活細(xì)胞的數(shù)目下降大約50%—90%，或者大約50%—99%，或者大約50%—99.9°/?；蚋?。將突變體或細(xì)胞從經(jīng)誘變的細(xì)胞群中移出并復(fù)制。接下來，例如借助于Ribolyser(Hybaid，Heidelberg,Germany)破壞所述細(xì)胞，例如使用Molenaaretal.(EuropeanJournalofBiochemistry254:395-403(1998))所述方法確定胞內(nèi)蘋果酸醌氧化還原酶活性。這樣可以鑒別與未經(jīng)誘變的起始菌株相比其胞內(nèi)蘋果酸醌氧化還原酶活性降低至少30%、優(yōu)選至少35%及特別優(yōu)選至少40%的突變體。隨后，在使用合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基的分批培養(yǎng)中研究所述突變體分泌氨基酸、優(yōu)選L-賴氨酸、L-色氨酸或L-脯氨酸的能力。合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基及測試條件在US6,221,636，US5,840,551，US5，770，409，US5,605,818，US5，275，940和US4,224,409中描述。當(dāng)使用合適的機(jī)器人裝置時(shí)可以在短時(shí)間內(nèi)研究大量的突變體，所述機(jī)器人裝置在例如Zimmermannetal.(VDIreportsNo.1841，VDI-Verlag，Diisseldorf，Germany2004，439-443)或者Zimmermann(ChemieIngenenieurTechnik77(4)，426-428(2005》中描述。以這種方式，可以鑒別與親代菌株或未經(jīng)誘變的起始菌株相比，蘋果酸醌氧化還原酶活性降低并且向營養(yǎng)培養(yǎng)基中分泌氨基酸的程度增加的突變體。這些突變體包括例如其氨基酸分泌增加至少0.5%的那些突變體。隨后，提供DNA或者從所述突變體中分離DNA，使用引物對利用聚合酶鏈反應(yīng)合成相應(yīng)多核苷酸，所述引物對使mqo基因、或者本發(fā)明的mqo等位基因或者本發(fā)明所述在氨基酸序列第111位的突變得以擴(kuò)增。所述DNA優(yōu)選分離自分泌氨基酸的程度增加的那些突變體。為此目的，可以從位于本發(fā)明所述突變上游和下游的核苷酸序列中及從與其互補(bǔ)的核苷酸序列中選擇任何引物對。在這點(diǎn)上，引物對的一個(gè)引物優(yōu)選包含選自SEQIDNO:3中第1一679位的核苷酸序列的至少15、至少18、至少20、至少21或至少24個(gè)連續(xù)核苷酸。引物對的另一個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3中第2002—953位的互補(bǔ)核苷酸序列的至少15、至少18、至少20、至少21或至少24個(gè)連續(xù)核苷酸。如果需要擴(kuò)增編碼區(qū)，則所述引物對優(yōu)選選自SEQIDNO:3的第1一349位的核苷酸序列，及選自SEQIDNO:3的第2002-1850位的互補(bǔ)核苷酸序列。如果需要擴(kuò)增編碼區(qū)的一部分，如SEQIDNO:15、17和19中的一部分，則引物對優(yōu)選選自SEQIDNO:3的第351—679位的核苷酸序列及選自SEQIDNO:3的第1848—953位的互補(bǔ)核苷酸序列。合適的引物對例如是SEQIDNO:ll禾卩SEQIDNO:12所述的引物對mqo-起始引物和mqo-終止引物，或者SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所述的引物對mqo-Al和mqo-El。另外，可提供具有限制酶的識別位點(diǎn)、生物素基團(tuán)或者本領(lǐng)域所述其它附屬物的引物。引物的總長度通常至多30、至多40、至多50或至多60個(gè)核苷酸。通常地，熱穩(wěn)定DNA聚合酶用于通過利用PCR從例如所選的序列最初存在于其中的染色體中擴(kuò)增該所選的序列，所述序列如本發(fā)明的mqo等位基因來制備多核苷酸。這些DNA聚合酶例如是Qiagen公司(Hilden，Germany)銷售的ThermusaquaticusTaq聚合酶，NewEnglandBiolabs公司(Frankfort，Germany)銷售的ThermococcuslitoralisVent聚合酶，或者Stratagene公司(LaJolla，USA)銷售的PyrococcusfiiriosusPfb聚合酶。優(yōu)選具有校對活性的聚合酶。校對活性是指這些聚合酶能識別已經(jīng)錯(cuò)誤摻入的核苷酸并通過重新聚合化而修正錯(cuò)誤(LottspeichandZorbas，Bioanalytik[Bioanalysis]，SpektrumAkademischerVerlag，Heidelberg,Germany(1998))。具有校正活性的聚合酶例如是Vent聚合酶和PfU聚合酶。反應(yīng)混合物的條件根據(jù)廠商指導(dǎo)設(shè)定。聚合酶由廠商提供，通常一起提供常用的緩沖液，其濃度通常為10-100mMTris/HCl及6-55mMKCl，pH7.5-9.3。如果廠商提供的緩沖液中沒有氯化鎂，則向其中加入0.5-10mM濃度的氯化鎂。另外，向反應(yīng)混合物中加入0.1-16.6mM濃度的三磷酸脫氧核苷。向反應(yīng)培養(yǎng)基中導(dǎo)入終濃度為0.1-3pM的引物，優(yōu)選模板DNA為102—105拷貝。也可以使用106—107拷貝。向反應(yīng)混合物中加入2—5單位的合適聚合酶。常規(guī)的反應(yīng)混合物體積為20-100^。作為進(jìn)一步的補(bǔ)充，向反應(yīng)混合物中可以加入牛血清白蛋白、Tween-20、凝膠、甘油、甲酰胺或者DMSO(DieffenbachandDveksler，PCRPrimer-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,USA1995)。PCR常規(guī)進(jìn)程包括連續(xù)重復(fù)的三個(gè)不同溫度步驟。首先，在4—10分鐘將溫度升高至92。C一98。C而開始反應(yīng)，以使存在的DNA變性。然后以重復(fù)方式首先在大約92-98°C進(jìn)行10—60秒以使得DNA變性，然后在特定溫度(退火溫度)進(jìn)行10—60秒以使得所述引物與所述DNA結(jié)合，所述溫度與引物有關(guān)，但已經(jīng)通過經(jīng)驗(yàn)確定為50。C一60。C，并可以針對每種引物對單獨(dú)計(jì)算。技術(shù)人員可從Rychliketal.(NucleicAcidsResearch18(21):6409-6412)中發(fā)現(xiàn)這方面的準(zhǔn)確資料。最后進(jìn)行合成步驟，在對于各種情況規(guī)定的聚合酶的最佳活性條件下延伸所述引物(延伸)，根據(jù)聚合酶情況溫度通常為73。C一67。C、優(yōu)選72°C—68°C。這個(gè)延伸步驟的持續(xù)時(shí)間有賴于聚合酶的效率和被擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的長度。在常規(guī)的PCR中，這個(gè)步驟持續(xù)0.5-8分鐘、優(yōu)選2-4分鐘。這三個(gè)步驟重復(fù)30—35次，至多50次。最后進(jìn)行4一10分鐘的延伸步驟，反應(yīng)結(jié)束。以這種方式制備的多核苷酸也稱作擴(kuò)增物；術(shù)語核酸片段和核酸分子也常使用。技術(shù)人員在例如如下手冊中可發(fā)現(xiàn)關(guān)于PCR方法的進(jìn)一步指導(dǎo)和信息PCR策略(Innis，F(xiàn)elfandandSninsky，AcademicPress,Inc.,1995)、Diefenbach禾flDveksler所著PCR引物實(shí)驗(yàn)手冊(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)、Gait所著寡核苷酸合成實(shí)踐方法(IRLPress,Oxford,UK，1984)及Newton和Graham所著PCR(SpektrumAkademischerVerlag，Heidelberg,Germany,1994)。隨后確定核苷酸序列，例如使用Sangeretal.(ProceedingsoftheNationalAcademiesofSciences,USA，74，5463-5467(1977))所述并經(jīng)Zimmermannetal.(NucleicAcidsResearch18，1067pp(1990))修改的鏈終止方法進(jìn)行，分析由這個(gè)核苷酸序列編碼的多肽，特別其氨基酸序列。為此，將所述核苷酸序列注入程序中以將DNA序列翻譯成氨基酸序列。合適的程序例如是Patentin程序，該程序可得自專利事務(wù)所，例如美國專利事務(wù)所(USPTO);或者程序TranslateTool,其可在全球信息網(wǎng)的ExPASyProteomics服務(wù)器上獲得(Gasteigeretal.，NucleicAcidsResearch31，3784-3788(2003》。以這種方式，可以鑒別這樣的突變體，其mqo等位基因編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并且在其氨基酸序列第111或相應(yīng)或相當(dāng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸的多肽。優(yōu)選L-絲氨酸由L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置換。在適當(dāng)情況中，所述氨基酸序列在第201位或相應(yīng)或相當(dāng)位置另外含有L-丙氨酸由另一種蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-絲氨酸的置換。本發(fā)明因此涉及一種棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所述突變體可通過如下步驟獲得a)用誘變劑處理具有分泌氨基酸的能力的棒狀細(xì)菌；b)分離在a)步驟中產(chǎn)生的突變體并使其增殖，c)優(yōu)選確定突變體在培養(yǎng)基中分泌或在細(xì)胞內(nèi)部濃縮的能力，與在a)步驟中使用的棒狀細(xì)菌相比至少多0.5。％的氨基酸d)從在b)步驟中獲得的突變體制備核酸，e)使用聚合酶鏈反應(yīng)、得自d)步驟的核酸及引物對制備核酸分子，所述引物對的第一個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3第1一394位的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，第二個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3第2002—1850位的互補(bǔ)核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，f)確定e)步驟中獲得的核酸分子的核苷酸序列，確定編碼的氨基酸序列，g)在適當(dāng)情況中，將在f)步驟中確定的氨基酸序列與SEQIDNO:6、8或10或者SEQIDNO:15、17或19所示序列進(jìn)行對比，h)鑒別突變體，其含有編碼下述多肽的多核苷酸，所述多肽在第111位或相當(dāng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，并且在適當(dāng)情況中在第201位或相當(dāng)位置含有除L-丙氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-絲氨酸。以這種方式產(chǎn)生的突變體通常含有g(shù)nd等位基因的一(1)個(gè)拷貝。本發(fā)明突變體中mqo等位基因的編碼區(qū)例如SEQIDNO:5、7和9中描述的序列。野生型基因的編碼區(qū)在SEQIDNO:l中描述。SEQIDNO:l在第332位含有核堿基胞嘧啶，在第331位具有核堿基胸腺嘧啶，在第601位具有核堿基鳥嘌呤。SEQIDNO:l在第331—333位含有編碼L-氨基酸的TCT密碼子，在第601—603位含有編碼L-丙氨酸的GCT密碼子。SEQIDNO:5在第332位含有核堿基胸腺嘧啶。作為這種胞嘧啶轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶的結(jié)果，編碼L-苯丙氨酸的密碼子TTT在第331_333位形成。SEQIDNO:7在第331位含有核堿基鳥嘌呤。作為這種胸腺嘧啶顛換為鳥嘌呤的結(jié)果，在第331—333位形成編碼L-丙氨酸的密碼子GCT。除在第331位的突變之外，SEQIDNO:9在第601位含有核堿基胸腺嘧啶。由于這種鳥嘌呤顛換為硫胺的結(jié)果，在第601一603位形成編碼L-絲氨酸的密碼子TCT。除此之外，SEQIDNO:5、7和9所示核苷酸序列可含有由于誘變處理所致的另外的堿基取代，但其表達(dá)不使得氨基酸序列發(fā)生任何改變。在科學(xué)界，這種突變也稱作沉默或中性突變。這些沉默突變同樣也可存在于用于誘變處理的棒狀細(xì)菌中。用于誘變的棒狀細(xì)菌優(yōu)選具有向其周圍的營養(yǎng)培養(yǎng)基或發(fā)酵肉湯中分泌合意的氨基酸或者在細(xì)胞內(nèi)部濃縮合意的氨基酸的能力。產(chǎn)生L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌通常具有反饋抗性或者去敏感的(desensitized)天冬氨酸激酶。反饋抗性天冬氨酸激酶己知是這樣的天冬氨酸激酶，其與野生型形式相比對于賴氨酸和蘇氨酸的混合物或者AEC(氨乙基半胱氨酸)和蘇氨酸的混合物或賴氨酸自身或者AEC自身的抑制作用的敏感性較低。編碼這些不敏感的天冬氨酸激酶的基因或等位基因也稱作lysCF^等位基因。現(xiàn)有領(lǐng)域描述了許多編碼與野生型蛋白質(zhì)相比具有氨基酸取代的天冬氨酸激酶變體的lysCFBR等位基因(表1)。谷氨酸棒桿菌中相應(yīng)于NCBI數(shù)據(jù)庫中登記號AX756575的野生型lysC基因的編碼區(qū)在SEQIDNO:21中描述，而由這個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)在SEQIDNO:22中描述。表h編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBK等位基因<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>分泌L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌通常具有表1列出的一或多個(gè)氨基酸取代。優(yōu)選如下的lysC皿等位基因lysCA279T(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第279位丙氨酸由蘇氨酸置換)，lysCA279V(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第279位丙氨酸由纈氨酸置換)，lysCS301F(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第301位絲氨酸由苯丙氨酸置換)，lysCT308I(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第308位蘇氨酸由異亮氨酸置換)，lysCS301Y(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第308位絲氨酸由酪氨酸置換)，lysCG345D(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第345位甘氨酸由天冬氨酸置換)，lysCR320G(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第320位精氨酸由甘氨酸置換)，lysCT311I(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第311位蘇氨酸由異亮氨酸置換)，lysCS381F(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第381位絲氨酸由苯丙氨酸置換)，lysCS317A(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第317位絲氨酸由丙氨酸置換)及l(fā)ysCT380I(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第380位蘇氨酸由異亮氨酸置換)。特別優(yōu)選的是lysCFBR等位基因lysCT311I(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第311位的蘇氨酸由異亮氨酸置換)及含有選自如下至少一個(gè)取代的lysCFBR等位基因A279T(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第279位丙氨酸由蘇氨酸置換)和S317A(SEQIDNO:22所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中第317位絲氨酸由丙氨酸置換)。lysCfBK等位基因lysCT311I存在于保藏在DSMZ的菌株DM1797中。DM1797是谷氨酸棒桿菌ATCC13032的突變體。稱作DM1808的突變體，包含編碼在氨基酸序列第111位存在L-苯丙氨酸的多肽的mqo等位基因，是以上述方式從菌株DM1797中分離的。突變體DM1808中mqo等位基因的核苷酸序列以SEQIDNO:5示出，而編碼的多肽的氨基酸序列以SEQIDNO:6示出。以同樣方式發(fā)現(xiàn)這樣的突變體，其包含編碼在氨基酸序列第111位存在L-丙氨酸及在第201位存在L-絲氨酸的多肽的mqo等位基因。這種突變體中mqo等位基因的核苷酸序列以SEQIDNO:9描述，而編碼的多肽的氨基酸序列以SEQIDNO:10描述。除此之外，可以使用呈現(xiàn)弱化的高絲氨酸脫氫酶或者高絲氨酸激酶活性或者具有現(xiàn)有技術(shù)已知的其它性質(zhì)的分泌L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌。生產(chǎn)L-色氨酸的棒狀細(xì)菌通常對于去敏感的鄰氨基苯甲酸合酶具有反饋抗性。反饋抗性鄰氨基苯甲酸合酶已知是與野生型形式相比對于色氨酸或5-氟色氨酸(Matsuietal.，JournalofBacteriology169(11):5330-5332(1987))或相似的類似物的抑制作用呈現(xiàn)較低敏感性(5—10%、10%—15%或者10%—20%)的鄰氨基苯甲酸合酶。編碼這些去敏感的鄰氨基苯甲酸合酶的基因或等位基因也稱作trpEF皿等位基因。這些突變體或等位基因在例如US6180373和EP0338474中描述。與應(yīng)用的起始菌株或親代菌株相比，所得突變體在發(fā)酵方法中呈現(xiàn)合意的氨基酸的分泌或生產(chǎn)增多。本發(fā)明另外涉及分離的多核苷酸，其編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并在第111位或相應(yīng)或相當(dāng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸的多肽，優(yōu)選用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置換。本發(fā)明的多核苷酸可以分離自本發(fā)明的突變體。進(jìn)一步可以應(yīng)用體外方法誘變mqo基因。當(dāng)使用體外方法時(shí)，對含有棒狀細(xì)菌基因、優(yōu)選現(xiàn)有技術(shù)描述的谷氨酸棒桿菌野生型基因的分離的多核苷酸進(jìn)行誘變處理。所述分離的多核苷酸可例如是分離的總DNA或染色體DNA或者使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備的mqo基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。這種擴(kuò)增產(chǎn)物也稱作PCR產(chǎn)物；也常用術(shù)語核酸分子和核酸片段。熟練技術(shù)人員可在如下手冊中發(fā)現(xiàn)關(guān)于使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增DNA序歹ll的說明Gait:OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,UK，1984)及NewtonandGraham:PCR(SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg,Germany,1994)。同樣也可以首先將待誘變的mqo基因摻入載體中，例如摻入噬菌體或質(zhì)粒中。合適的體外誘變方法包括用羥胺處理，如Miller(Miller,J.H二AShortCourseinBacterialGenetics.ALaboratoryManualandHandbookforEscherichiacoliandRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1992)所述；使用致誘變寡核苷酸處理(T.A.Brown:GentechnologieftirEinsteiger[RecombinantDNATechnologyforthoseenteringthefield]，SpektrumAkademischerVerlag，Heidelberg,1993andR.M.Horton:PCR-MediatedRecombinationandMutagenesis，MolecularBiotechnology3，93-99(1995))及應(yīng)用呈現(xiàn)較高誤差率的DNA聚合酶時(shí)使用聚合酶鏈反應(yīng)。這種DNA聚合酶例如是由Stratagene(LaJolla，CA，USA)提供的MutazymeDNA聚合酶(GeneMorphPCRmutagenesiskit,No.600550)。關(guān)于在體內(nèi)或體外產(chǎn)生突變的進(jìn)一步指導(dǎo)和綜述可見于現(xiàn)有技術(shù)及己知的遺傳和分子生物學(xué)教科書所描述，如Knippers(MolecularGenetics,6thedition,GeorgThiemeVerlag，Stuttgart,Germany，1995)、Winnacker(GenesandClones，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany,1990)或者Hagemann(GeneralGenetics,GustavFischerVerlag，Stuttgart,1986)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性及包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列第111位具有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。優(yōu)選用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置換。在適當(dāng)情況中，所述多肽的氨基酸序列另外含有在第201位的L-丙氨酸由另一種氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸的置換。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性及包含長度為500個(gè)氨基酸的氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列第lll位具有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸，優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性且其氨基酸序列第106—116位含有相應(yīng)于SEQIDNO:6或8的第106—116位的氨基酸序列。編碼的多肽的氨基酸序列優(yōu)選含有相應(yīng)于以下序列的氨基酸序列SEQIDNO:6或8第96—126位、或者SEQIDNO:6或8第81—141位、或者SEQIDNO:6或8第66—156位、或者SEQIDNO:6或8第51—181位、或者SEQIDNO:6、8或10第21—201位、或者SEQIDN0:6、8或10第2—301位、或者SEQIDNO:6、8或10第2—401位、或者SEQIDNO:6、8或10第2—499位、或者SEQIDN0:6、8或10第2—500位。特別優(yōu)選的是所編碼多肽的長度為500個(gè)氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其編碼這樣的多肽，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性及在氨基酸序列第111位或相應(yīng)或相當(dāng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，并且包含與可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用引物對獲得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述引物對的核苷酸序列在每種情況中均包含選自SEQIDNO:3第1—349位的核苷酸序列及SEQIDNO:3第2002一1850位的互補(bǔ)核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。合適的引物對的兩個(gè)實(shí)例在SEQIDNO:l1禾卩SEQIDNO:12及在SEQIDNO:13禾BSEQIDNO:14中描述。應(yīng)用的起始材料(模板)是優(yōu)選已經(jīng)經(jīng)過致誘變處理的棒狀細(xì)菌的染色體DNA。特別優(yōu)選的是棒桿菌屬的染色體DNA，非常優(yōu)選的是谷氨酸棒桿菌的染色體DNA。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與和SEQIDNO:5、7或9互補(bǔ)的核苷酸序列雜交，并編碼這樣的多肽，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性且在氨基酸序列第111位或相應(yīng)或相當(dāng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，并且所述多肽在適當(dāng)情況中在相應(yīng)于第201位的位置含有除L-丙氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸。技術(shù)人員可在如下手冊中發(fā)現(xiàn)關(guān)于核酸或多核苷酸雜交的指導(dǎo)由BoehringerManheimGmbH(Mannheim,Germany,1993)出版的TheDIGSystemUsersGuideforFilterHybridization,及Liebletal.(InternationalJournalofSystematicBacteriology41:255-260(1991))。雜交是在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，即形成的雜交體是這樣的，其中探針即包含SEQIDNO:5、7或9的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸與靶序列即用探針處理的多核苷酸是至少90%相同的。已知所述雜交包括洗滌步驟的嚴(yán)格性受到緩沖液成分、溫度和鹽濃度改變的影響或由其決定。所述雜交反應(yīng)通常在與洗滌步驟相比較低的嚴(yán)格性下進(jìn)行(HybaidHybridisationGuide，HybaidLimited,Teddington，UK，1996)?？梢允褂美缦鄳?yīng)于5xSSC緩沖液的緩沖液、在大約Stre-68°C溫度下進(jìn)行雜交反應(yīng)。在這個(gè)反應(yīng)中，探針也可以與同所應(yīng)用探針核苷酸序列的相同性低于90%的多核苷酸發(fā)生雜交。這些雜交體穩(wěn)定較差，可通過在嚴(yán)格條件下洗滌除去。這可以例如通過將鹽濃度降低至2xSSC,在適當(dāng)情況中隨后降低至0.5xSSC(TheDIGSystemUser'sGuideforFilterHybridisation,BoehringerManheimGmbH(Mannheim,Germany,1995)，且溫度設(shè)定在大約50°C-68°C、大約52。C-68。C、大約54°C-68°C、大約56°C-68°C、大約58°C-68°C、大約60°C-68°C、大約62°C-68°C、大約64°C-68°C或者大約66°C-68°C來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選大約64。C-68?；蛘叽蠹s66°C-68°C的溫度范圍。在適當(dāng)情況中，可以將鹽濃度降低至相應(yīng)于0.2xSSC或O.lxSSC的濃度。在適當(dāng)情況中，SSC緩沖液含有0.1。/。濃度的十二垸基硫酸鈉(SDS)。通過將雜交溫度以大約1-2°C的梯度從50°C逐步增加至68°C，可以分離這樣的多核苷酸片段，其與應(yīng)用的探針序列或其互補(bǔ)序列具有至少90%或91%、優(yōu)選至少92%或93%、94%、95%、96%、特別優(yōu)選至少97%、或98%或者至少99%相同性并編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性且含有本發(fā)明所述氨基酸取代的多肽。使用已知方法確定以這種方式獲得的多核苷酸的核苷酸序列。關(guān)于雜交的進(jìn)一步指導(dǎo)可以試劑盒形式商購獲得(例如RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany提供的DIGEasyHyb,目錄號No.1603558)。由此獲得的核苷酸序列編碼這樣的多肽，其具有蘋果酸醌氧化還原酶活性，與SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示氨基酸序列具有至少90%、優(yōu)選至少92%、至少94%、至少96%、及特別優(yōu)選至少97%、或者至少98%、或者至少99%相同性，并含有本發(fā)明所述氨基酸取代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其編碼這樣的多肽，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性、在氨基酸序列第111位含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸、并包含與SEQIDNO:6或8的氨基酸序列至少90%、優(yōu)選至少92%、或者至少94%、至少96%、及特別優(yōu)選至少97%或至少98%或至少99%相同的氨基酸序列。具有蘋果酸醌氧化還原酶活性及包含與SEQIDNO:8所示序列至少99%相同的氨基酸序列的多肽在例如SEQIDNO:IO中所描述。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其編碼這樣的多肽，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性、在氨基酸序列第111位含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸、并包含與SEQIDNO:5或7的核苷酸序列至少90%、優(yōu)選至少92%、或者至少94%、至少96%、及特別優(yōu)選至少97%或至少98%或至少99%相同的核苷酸序列。編碼本發(fā)明具有蘋果酸醌氧化還原酶活性及具有與SEQIDNO:7所示序列至少99%相同的核苷酸序列的多肽在例如SEQIDNO:9中所描述。除此之外，優(yōu)選分離的多核苷酸，其編碼這樣的多肽，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性、在氨基酸序列第111位或相應(yīng)或相當(dāng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸及包含選自Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu禾nBra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser的至少一個(gè)序列基序或一個(gè)氨基酸序列。"Bm"是指氨基酸lie或Leu，而"Sal"是指氨基酸Ser或Ala，"Ali"是指氨基酸Ala或Gly。本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離的多核苷酸，其編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性及包含SEQIDNO:6、8或10所示氨基酸序列的多肽。在適當(dāng)情況中，編碼的多肽含有一(1)個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代。優(yōu)選所述多肽含有至多2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或至多5個(gè)保守氨基酸取代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其編碼這樣的多肽，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性及包含SEQIDNO:6、8或10所示氨基酸序列，其中包括在N或C末端的至少一個(gè)氨基酸的延伸。這種延伸不超過50、40、30、20、10、5、3或2個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明最后還涉及mqo等位基因，其編碼SEQIDNO:6、8或10的多肽變體，所述變體含有一或多個(gè)插入或缺失。這些變體含有至多5、至多4、至多3或至多2個(gè)氨基酸插入或缺失。序列基序Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu禾QBra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser優(yōu)選不被這些插入/缺失破壞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:5、7或9所示核苷酸序列。本發(fā)明最后涉及一種分離的多核苷酸，其包含突變體DM1808的mqo等位基因。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其包含本發(fā)明mqo等位基因的一部分編碼區(qū)，在每種情況中所述分離的多核苷酸包含在編碼的多肽的氨基酸序列中第111位含有氨基酸取代的編碼區(qū)部分。特別地，所述多核苷酸包含核酸分子或DNA片段，其編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第95—127位的至少一個(gè)氨基酸序列、或者編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第79—144位的至少一個(gè)氨基酸序列、或者編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第62—160位的至少一個(gè)氨基酸序列、或者編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第45—177位的至少一個(gè)氨基酸序列、或者編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第27—194位的至少一個(gè)氨基酸序列、或者編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第11—211位的至少一個(gè)氨基酸序列、或者編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第2—250位的至少一個(gè)氨基酸序列、或者編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第2—375位的至少一個(gè)氨基酸序列、或者編碼相應(yīng)于SEQIDNO:2第2—495位的至少一個(gè)氨基酸序列，或者包含相應(yīng)的讀框，其中在相應(yīng)于SEQIDNO:2第111位的位置具有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，并且在適當(dāng)情況中在相應(yīng)于第201位的位置存在除L-丙氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸，優(yōu)選L-絲氨酸。本發(fā)明讀框的實(shí)例如下所示，其中包含這樣的多核苷酸，所述多核苷酸編碼至少SEQIDNO:2的第95—127位氨基酸序列，并且在所述氨基酸序列第Ul位的相應(yīng)位置存在除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸caggtttcccg仁cagttctggtctcacetcgttgaagagggagtgctgnnnGinValSerArgGinPheTrpSerHisLeuValGluGluGlyValLeuXaa95100105U0gatcctaaggaattcateaaccctgttcctcacgtatctttcggccagAspProLysGluPhelieAsnProValProHisValSerPheGlyGin115120125其也示作SEQIDNO:15。由這個(gè)讀框編碼的氨基酸序列示作SEQIDNO:16。優(yōu)選的核酸分子編碼至少一種下述的氨基酸序列，所述氨基酸序列相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10的第95—127位，或者至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10的第79—14位，或者至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10的第62—160位，或者至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10的第45—177位，或者至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10的第27—194位，或者至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10的第11—211位，或者至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10的第2—250位，或者至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10第的2—375位，或者至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10的第2—495位。包含編碼至少相應(yīng)于SEQIDNO:6第95—127位的氨基酸序列的多核苷酸的本發(fā)明讀框的實(shí)例如下所示cagrgtttcccgtcagttctggtctcacetcgttgaagagggagtgctgtttGinValSerArgGinPheTrpSerHisLeuValGluGluGlyValLeuPhe95100105110gatcctaaggaattcateaaccctgttcctcacgtatctttcggccagAspProLysGluPhe工leAsnProValProHisValSerPheGlyGin115120125所述讀框也示作SEQIDNO:17。SEQIDNO:18示出由這個(gè)讀框編碼的氨基酸序列。包含編碼至少相應(yīng)于SEQIDNO:8或10第95—127位的氨基酸序列的多核苷酸的本發(fā)明讀框的實(shí)例如下所示caggttteccgtcagttctggtctcacetcgttgaagagggagtgctggetGinValSerArgGinPheTrpSerHisUeuValGluGluGlyValLeuAla95100105110gatcctaaggaattcateaaccctgttcctcacgtatctttcggccagAspProLysGluPhelieAsnProValProHisValSerPheGlyGin115120125所述讀框也示作SEQIDNO:19。SEQIDNO:20示出由這個(gè)讀框編碼的氨基酸序列。特別優(yōu)選的核酸分子包含相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第283一381位的至少一個(gè)核苷酸序列，或者相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第235—432位的至少一個(gè)核苷酸序列，或者相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第184—480位的至少一個(gè)核苷酸序列，或者相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第133—531位的至少一個(gè)核苷酸序列，或者相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第85—582位的至少一個(gè)核苷酸序列，或者相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第28—630位的至少一個(gè)核苷酸序列，或者相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第4一753位的至少一個(gè)核苷酸序列，或者相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第4一1125位的至少一個(gè)核苷酸序列，或者相應(yīng)于SEQIDNO:5、7或9第4一1485位的至少一個(gè)核苷酸序列。除此之外，本發(fā)明的讀框，例如顯示為SEQIDNO:15、17和19中所示核苷酸序列并在SEQIDNO:16、18和SEQIDNO:20中顯示為所編碼氨基酸序列的形式，所述讀框可含有一或多個(gè)突變，導(dǎo)致一或多個(gè)保守氨基酸取代。優(yōu)選所述突變導(dǎo)致至多4%、至多2%或者至多1%的保守氨基酸突變。另外，本發(fā)明的讀框可含有一或多個(gè)沉默突變。優(yōu)選本發(fā)明的讀框含有至多4%、特別優(yōu)含有一或多個(gè)沉默突變。優(yōu)選本發(fā)明的讀框含有至多4%、特別優(yōu)選至多2%到至多1%的沉默突變。本發(fā)明的分離的多核苷酸可用于制備微生物的重組菌株，其以優(yōu)于起始或親代菌株的方式向其周圍的培養(yǎng)基中釋放氨基酸或者在細(xì)胞內(nèi)部積聚氨基酸。在棒狀細(xì)菌基因中摻入突變的普遍使用的方法是等位基因取代，也稱作"基因置換"。在這種方法中，將含有感興趣的突變的DNA片段轉(zhuǎn)移進(jìn)合意的棒狀細(xì)菌菌株中，并通過至少兩次重組事件或"交換"事件在合意菌株的染色體中摻入突變，或者將存在于所述菌株中的基因序列用突變的序列置換。Schwarzer禾QPiihler(Bio/Technology9，84-87(1991)使用這種方法向谷氨酸棒桿菌染色體中摻入攜帶缺失的lysA等位基因及摻入攜帶插入的lysA等位基因以置換野生型基因。Schafer等(Gene145，69-73(1994))使用這種方法在谷氨酸棒桿菌hom-thrB操縱子中摻入缺失。Nakagawa等(EP11087卯)使用這種方法基于分離的等位基因向谷氨酸棒桿菌染色體中摻入多種突變。以這種方式，Nakagawa等成功地在谷氨酸棒桿菌中將稱作Val59AIa的突變摻入高絲氨酸脫氫酶基因(hom)中，將稱作Thr311Ile的突變摻入天冬氨酸激酶基因(lysC或ask)中，將稱作Pro458Ser的突變摻入丙酮酸羧化酶基因(pyc)中及將稱作Ala213Thr的突變摻入葡萄糖六磷酸脫氫酶基因(zwf)中。本發(fā)明的多核苷酸可用于本發(fā)明的方法中，所述多核苷酸包含完整的編碼區(qū)，例如SEQIDNO:5、7或9所示，或者包含一部分編碼區(qū)，例如編碼至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10第95—127位的氨基酸序列的核苷酸序列，其在SEQIDNO:15、17或19中示出。根據(jù)SEQIDNO:15、17和19的部分編碼區(qū)的長度為99個(gè)核堿基。優(yōu)選長度^195個(gè)核堿基的這部分編碼區(qū)，如編碼至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10第79—144位氨基酸序列的核酸分子。特別優(yōu)選長度^295個(gè)核堿基的這部分編碼區(qū)，如編碼至少相應(yīng)于SEQIDNO:6、8或10第62—160位氨基酸序列的核酸分子。在這種方法中，含有感興趣的突變的DNA片段通常存在于載體中，具體存在于質(zhì)粒中，所述載體或質(zhì)粒優(yōu)選在將對其提供突變的菌株中不復(fù)制，或者僅以有限程度復(fù)制。通常地，埃希氏菌(Escherichia)屬的細(xì)菌、優(yōu)選大腸桿菌菌種，用作輔助或中間宿主，所述載體在其中可以復(fù)制。這些質(zhì)粒載體例如是pK*mob禾tlpK*mobsacB載體，如Schafer等(Gene145，69-73(1994))所述的pK18mobsacB及WO02/070685和WO03/014362中描述的載體。這些載體可以在大腸桿菌中復(fù)制，但在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制。特別合適的是含有以條件性負(fù)顯性方式作用的基因的載體，所述基因如芽孢桿菌(Bacillus)中的sacB基因(果聚糖蔗糖酶基因)或者大腸桿菌中的galK(半乳糖激酶)基因。(以條件性負(fù)顯性方式作用的基因是指在特定條件下對攜帶該基因的宿主不利例如有毒性、但是在其它條件下對該宿主無任何負(fù)作用的基因)。這些載體可以選擇其中所述載體從染色體中消除的重組事件。另外，Nakamum等(US-A-6，303,383)已經(jīng)針對棒狀細(xì)菌描述了僅在低于31°C的溫度復(fù)制的溫度敏感性質(zhì)粒。隨后將載體轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，可根據(jù)例如Schafer(JournalofBacteriology172，1663-1666(1990))所述方法通過接合，或者根據(jù)例如Dunican禾卩Shivnan(Bio/Technology7，1067-1070(1989))所述方法或者Thierbach等(AppliedMicrobiologyandBiotechnology29，356-3。(1988))所述方法通過轉(zhuǎn)化進(jìn)行。在適當(dāng)情況中，所述DNA也可以通過粒子轟擊方式轉(zhuǎn)移。在同源重組后，通過在靶基因或靶序列中導(dǎo)致整合的第一次交換事件及導(dǎo)致切除的適當(dāng)?shù)牡诙谓粨Q事件，摻入了突變及獲得重組的細(xì)菌。可以使用Southern印跡雜交、聚合酶鏈反應(yīng)或者序列測定或者熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法(Layetal.ClinicalChemistry43，2262-2267(1997))或者酶學(xué)方法等方法，鑒別并鑒定所得菌株。因此，本發(fā)明還涉及一種制備棒狀細(xì)菌的方法，其中a)將本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，b)將存在于所述棒狀細(xì)菌染色體中并編碼在氨基酸序列第111位或相應(yīng)位置含有L-絲氨酸的氨基酸序列的蘋果酸醌氧化還原酶基因用來自a)的多核苷酸置換，所述多核苷酸編碼在氨基酸序列第111位或相應(yīng)位置具有另一種L-氨基酸、優(yōu)選L-苯丙氨酸或L-丙氨酸的氨基酸序列，并且在適當(dāng)情況中所述氨基酸序列在第201位具有除L-丙氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸，c)增殖在步驟a)和b)中獲得的棒狀細(xì)菌。由此產(chǎn)生了重組棒狀細(xì)菌，其包含本發(fā)明的mqo等位基因，所述mqo等位基因代替了野生型mqo基因。本發(fā)明的另一種制備微生物的方法，包括a)將編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性的本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)微生物中，b)在所述微生物中復(fù)制所述多核苷酸，c)使在步驟a)和b)中獲得的微生物增殖。由此產(chǎn)生了重組微生物，所述微生物包含本發(fā)明多核苷酸的至少一(l)個(gè)或幾個(gè)拷貝，所述多核苷酸編碼蘋果酸醌氧化還原酶，該酶在所編碼多肽的氨基酸序列第111位或相當(dāng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸，優(yōu)選用L-苯丙氨酸及L-丙氨酸置換。在適當(dāng)情況中，所述多肽在第201位或相當(dāng)位置含有除L-丙氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸，優(yōu)選L-絲氨酸。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的宿主或宿主細(xì)胞，優(yōu)選微生物，具體優(yōu)選棒狀細(xì)菌和埃希氏菌屬細(xì)菌。本發(fā)明還涉及使用分離的多核苷酸制備的微生物。這些微生物或細(xì)菌也稱作重組微生物或重組細(xì)菌。同樣，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明多核苷酸的載體。最后，本發(fā)明還涉及包含這些載體的宿主。在適當(dāng)情況中，本發(fā)明分離的多核苷酸可用于實(shí)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)/多肽的過表達(dá)。"過表達(dá)"通常是指核糖核酸、蛋白質(zhì)或酶的胞內(nèi)濃度或活性增加。在本發(fā)明的情況中，下述編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo等位基因或多核苷酸被過表達(dá)，所述mqo等位基因或多核苷酸在其所編碼多肽的氨基酸序列第111位含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置換。在適當(dāng)情況中，編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸序列第201位還含有L-丙氨酸由另一種蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸的置換。已知N末端的氨基酸、具體是N-末端的甲硫氨酸可以通過酶從形成的多肽中切除，所述酶即為宿主固有的氨基肽酶。上述基因產(chǎn)物的濃度或活性的增加可例如通過使相應(yīng)多核苷酸的拷貝數(shù)增加至少一個(gè)拷貝而實(shí)現(xiàn)。廣泛應(yīng)用的增加拷貝數(shù)的方法包括將相應(yīng)基因或等位基因摻入由棒狀細(xì)菌復(fù)制的載體、優(yōu)選質(zhì)粒中。合適的質(zhì)粒載體例如是pZl(Menkeletal.，AppliedandEnvironmentalMicrobiology(1989)64:549-554)或者Tauchetal.(JournalofBiotechnology99，79-91(2002))所述的pSELF載體。關(guān)于谷氨酸棒桿菌中質(zhì)粒的綜述文章可見Tauchetal.(JournalofBiotechnology104，27-40(2003))所述。另一種廣泛應(yīng)用的實(shí)現(xiàn)過表達(dá)的方法是染色體基因擴(kuò)增方法。在這種方法中，感興趣的基因或等位基因的至少一個(gè)額外的拷貝被插入棒狀細(xì)菌的染色體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，如在例如Reinscheidetal.(AppliedandEnvironmentalMicrobiology60，126-132)對于hom-thrB操縱子的情況的描述中，將在谷氨酸棒桿菌中不復(fù)制并含有感興趣的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中。在通過交換事件進(jìn)行同源重組后，所得菌株包含至少兩個(gè)拷貝的相關(guān)基因或等位基因。在WO03/040373和US-2003-0219881-A1描述的另一實(shí)施方案中，通過至少兩次重組事件將感興趣的基因的一或多個(gè)拷貝插入谷氨酸棒桿菌中合意的位點(diǎn)。以這種方式，編碼L-賴氨酸去敏感的天冬氨酸激酶的LysC等位基因的拷貝摻入谷氨酸棒桿菌gluB基因中。在WO03/014330禾PUS-2004-0043458-A1描述的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過至少兩次重組事件將感興趣的基因的至少一個(gè)額外的拷貝摻入天然位點(diǎn)，優(yōu)選以與已經(jīng)存在的基因或等位基因串聯(lián)的形式摻入。以這種方式，在例如天然lysC基因的基因座實(shí)現(xiàn)lysCF^等位基因的串聯(lián)復(fù)制。實(shí)現(xiàn)過表達(dá)的另一種方法包括將相應(yīng)基因或等位基因與啟動子或表達(dá)盒功能性(可操縱地)連接。對于谷氨酸棒桿菌的合適啟動子在例如Pateketal.(JournalofBiotechnology104(1-3)，311-323(2003)的綜述性文章中描述。另外可以使用熟知的啟動子T3、T7、SP6、M13、lac、tac禾Btrc，所述啟動子在Amannetal.(Gene69(2)，301-315(1988))禾BAmannandBrosius(Gene40(2-3)，183-190(1985))中描述。這種啟動子可例如插入重組棒狀細(xì)菌的mqo等位基因上游，通常與起始密碼子距離大約1一500個(gè)核苷酸，所述重組棒狀細(xì)菌含有另一種蛋白質(zhì)氨基酸代替天然存在第111位的L-絲氨酸。這種啟動子當(dāng)然可以也插入本發(fā)明突變體的mqo等位基因的上游。另外可以將編碼本發(fā)明蘋果酸醌氧化還原酶變體的分離的多核苷酸與啟動子連接，將所得表達(dá)單位摻入染色體外復(fù)制型質(zhì)粒或者摻入棒狀細(xì)菌的染色體中。除此之外，可以使位于結(jié)構(gòu)基因上游的所述啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或者核糖體接合位點(diǎn)發(fā)生突變。通過延長mRNA的壽命也可以改善表達(dá)。另外，所述酶的活性通過防止酶蛋白被分解而增強(qiáng)。另外，相關(guān)基因或等位基因的過表達(dá)也可以通過改變培養(yǎng)基成分和進(jìn)行培養(yǎng)的方式而實(shí)現(xiàn)。通常地，實(shí)現(xiàn)過表達(dá)的措施使得相應(yīng)蛋白質(zhì)/多肽的活性或濃度基于起始微生物或親代菌株中蛋白質(zhì)的活性或濃度增加至少10%、25%、50%，75%、100%、150%、200%、300%、400%或500%，或者最多直至1000%或2000%。起始微生物或親代菌株是指對其應(yīng)用本發(fā)明措施的微生物。測定蘋果酸醌氧化還原酶的酶活性的方法在Molenaaretal.(JournalofBacteriology182(24)，6884-6891(2000))中描述。蛋白質(zhì)的濃度可以通過一維或二維蛋白質(zhì)凝膠分級分離及隨后使用適當(dāng)?shù)姆治鲕浖Φ鞍踪|(zhì)濃度進(jìn)行光學(xué)鑒定而測定。為了在棒狀細(xì)菌情況中制備蛋白質(zhì)凝膠以及鑒定所述蛋白質(zhì)，常用的方法是Hermannetal.(Electrophoresis,22:1712-23(2001))所述方法。蛋白質(zhì)濃度也可以通過Western印跡雜交使用特異于被檢測的蛋白質(zhì)的抗體來確定(Sambrooketal,，Molecularcloning:alaboratorymanual.2ndEd.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)，隨后使用合適軟件進(jìn)行光學(xué)分析以確定濃度(LohausandMeyer(1998)Biospektrum[Biospectrum]5:32-39;Lottspeich，AngewandteChemie[AppliedChemistry]111:2630-2647(1999))。因此，本發(fā)明涉及一種過表達(dá)本發(fā)明的蘋果酸醌氧化還原酶的方法。本發(fā)明用于的過表達(dá)方法包括使本發(fā)明編碼蘋果酸醌氧化還原酶變體的多核苷酸的拷貝數(shù)增加至少一(1)或多個(gè)拷貝，所述蘋果酸醌氧化還原酶變體中所編碼氨基酸序列的第111位或相應(yīng)位置存在除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。本發(fā)明的另一方法包括將啟動子與所述多核苷酸功能性連接。本發(fā)明進(jìn)一步涉及微生物，其表現(xiàn)為在其細(xì)胞內(nèi)部本發(fā)明蘋果酸醌氧化還原酶變體的濃度或活性增加。另外，過表達(dá)本發(fā)明突變體或重組菌株中相關(guān)生物合成途徑、糖酵解、添補(bǔ)反應(yīng)、檸檬酸循環(huán)、磷酸戊糖循環(huán)、氨基酸輸出的一或多種酶及適當(dāng)情況下過表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白，對于改善L-氨基酸的生產(chǎn)也是有益的。通常優(yōu)選使用內(nèi)源基因。"內(nèi)源基因"或者"內(nèi)源核苷酸序列"是指在種群中存在的基因或核苷酸序列或等位基因。因此，為了制備L-賴氨酸，可以過表達(dá)選自下組的一或多種基因編碼二氫吡啶二羧酸(dihydropicolinate)合酶的dapA基因，例如EP0197335中描述的谷氨酸棒桿菌野生型dapA基因，編碼葡萄糖六磷酸脫氫酶的zwf基因，例如JP-A-09224661和EP-A-1108790中描述的谷氨酸棒桿菌野生型zwf基因，谷氨酸棒桿菌zwf等位基因，其在US-2003-0175911-A1中描述，其編碼這樣的蛋白質(zhì)，其中例如氨基酸序列第243位的L-丙氨酸由L-蘇氨酸置換或者其中第245位的L-天冬氨酸由L-絲氨酸置換，編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，例如DE-A-19831609和EP11087卯中描述的谷氨酸棒桿菌野生型pyc基因，谷氨酸棒桿菌pyc等位基因，其在EP1108790中描述，編碼其中氨基酸序列第458位的L-脯氨酸由L-絲氨酸置換的蛋白質(zhì)，谷氨酸棒桿菌pyc等位基因，其在WO02/31158中描述，并且編碼這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)如權(quán)利要求1所述攜帶選自下組的一或多個(gè)氨基酸取代第153位L-谷氨酸由L-天冬氨酸置換，第182位L-丙氨酸由L-絲氨酸置換，第206位L-丙氨酸由L-絲氨酸置換，第227位L-組氨酸由L-精氨酸置換，第452位L-精氨酸由甘氨酸置換及第1120位L-天冬氨酸由L-谷氨酸置換(WO02/31158中圖2A描述了丙酮酸羧化酶的兩個(gè)不同起始位置，所述位置的長度差異相當(dāng)于17個(gè)氨基酸。因此，WO02/31158中根據(jù)權(quán)利要求1的第153位相應(yīng)于WO02/31158的圖2A中的第170位，而根據(jù)權(quán)利要求1的第182位相應(yīng)于圖2A中的第199位，根據(jù)權(quán)利要求1的第206位相應(yīng)于圖2A中的第223位，根據(jù)權(quán)利要求1的第227位相應(yīng)于圖2A中的第244位，根據(jù)權(quán)利要求1的第452位相應(yīng)于圖2A中的第469位，根據(jù)權(quán)利要求1的第1120位相應(yīng)于圖2B中的第1137位。WO02/31158中圖2A進(jìn)一步描述了在第472位氨基酸A(丙氨酸)由G(甘氨酸)的置換。具有N末端序列MTA的蛋白質(zhì)中的第472位相應(yīng)于具有N末端序列MST的蛋白質(zhì)中的第455位，如圖2A所示。WO02/31158中圖2B描述了在具有N末端MTA的蛋白質(zhì)中的第1133位，氨基酸D(天冬氨酸)由E(谷氨酸)的置換)，編碼天冬氨酸激酶的lysC基因，例如在EP-A-1108790中以SEQIDNO:281描述的谷氨酸棒桿菌野生型lysC基因(見登記號AX120085和120365)及在WO01/00843中以SEQIDNO:25描述的所述基因(見登記號AX063743)，lysCFBK等位基因，具體如表1所示，編碼反饋抗性天冬氨酸激酶變體，編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因，例如在DE-A-19548222中描述的谷氨酸棒桿菌野生型lysE基因，編碼Zwal蛋白的谷氨酸棒桿菌野生型zwal基因(US6,632,644)。除使用本發(fā)明mqo基因的等位基因之外，為了生產(chǎn)L-賴氨酸，同時(shí)弱化或消除選自下組的一或多種內(nèi)源基因也是有益的編碼葡萄糖六磷酸異構(gòu)酶的pgi基因，例如US6,586,214和US6,465,238中描述的谷氨酸棒桿菌pgi基因，編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因，例如EP-A-0131171中描述的谷氨酸棒桿菌hom基因，編碼高絲氨酸激酶的thrB基因，例如Peoplesetal.(MolecularMicrobiology2(1988):63-72)所述的谷氨酸棒桿菌thrB基因，編碼磷酸果糖激酶的pfkB基因，例如WO01/00844中描述的谷氨酸棒桿菌pfkB基因。(序列No.57)在適當(dāng)情況中，可以組合列出的弱化措施和額外的過表達(dá)措施(dapA基因、zwf基因等的過表達(dá))。文中術(shù)語"弱化"描述了降低或消除微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性，通過例如使用弱啟動子或使用編碼具有低活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，或滅活相應(yīng)基因或酶(蛋白質(zhì))，及任選地組合使用這些措施。通過利用用于實(shí)現(xiàn)弱化的措施，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度一般降低至野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)活性或濃度的0—75%，0—50%，0—25%，0—10%或者0—50/0?？紤]到可用于產(chǎn)生弱化的突變是轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失至少一(1)個(gè)堿基對或核苷酸。根據(jù)突變引起的氨基酸取代對酶活性的影響，稱作錯(cuò)義突變或無義突變。錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)中給定氨基酸由另一氨基酸置換，具體地，氨基酸置換形成非保守氨基酸取代。這種取代削弱了所述蛋白質(zhì)的效力或活性，使其降低至0—75%,0—50%，0—25%,0_10%，0—5%。無義突變導(dǎo)致終止密碼子位于所述基因編碼區(qū)中，使得翻譯過早中止。在基因中至少一個(gè)堿基對的插入或缺失導(dǎo)致移碼突變，這樣導(dǎo)致不正確的氨基酸摻入或者翻譯過早中止。如果終止密碼子由于突變的結(jié)果而在編碼區(qū)中形成，則也導(dǎo)致翻譯過早中止。缺失至少一個(gè)或多個(gè)密碼子通常也導(dǎo)致酶活性的完全喪失。產(chǎn)生這種突變的指導(dǎo)屬于現(xiàn)有
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，可見于己知的遺傳和分子生物學(xué)教科書，例如Knippers(MolecularGenetics，6thedition,GeorgThiemeVerlag，Stuttgart,Germany,1995)、Winnacker(GenesandClones，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany,1990)或者Hagemann(GeneralGenetics,GustavFischerVerlag，Stuttgart,1986)的教科書。其他措施在現(xiàn)有
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中描述。在發(fā)酵過程中顯示，通過本發(fā)明的方法獲得的分離的棒狀細(xì)菌與最初應(yīng)用的起始菌株或親代菌株相比更多地分泌或產(chǎn)生合意的氨基酸。"分離的細(xì)菌"是指突變體和重組細(xì)菌，具體是棒狀細(xì)菌，根據(jù)本發(fā)明其是分離或產(chǎn)生的并包含編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo等位基因，所述酶在氨基酸序列第111位含有所述氨基酸取代并在適當(dāng)情況中在第201位L-丙氨酸由另一蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸置換?；谄鹗季昊蛴H代菌株或者使用這些菌株的發(fā)酵方法，分離的細(xì)菌或者使用這些細(xì)菌的發(fā)酵方法在選自如下的一或多個(gè)參數(shù)方面的性能改善至少0.5%、至少1%、至少1.5%或者至少2%:產(chǎn)物濃度(產(chǎn)物/體積)、產(chǎn)物產(chǎn)量(形成的產(chǎn)物/消耗的碳源)及產(chǎn)物形成(形成的產(chǎn)物/體積/時(shí)間)，或者其它參數(shù)及參數(shù)組合。本發(fā)明的分離的棒狀細(xì)菌可以持續(xù)培養(yǎng)，如例如PCT/EP2004/008882中的描述，或者以分批或補(bǔ)料分批或者重復(fù)補(bǔ)料分批方法不連續(xù)地培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-氨基酸。已知的培養(yǎng)方法概述可見于Chmiel(BioprocessTechnology1.IntroductiontoBioprocessTechnology(GustavFischerVerlag，Stuttgart,1991))或者Storhas(BioreactorsandPeripheralEquipment(ViewegVerlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))所著教科書的描述。所用培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合給定菌株的需求。關(guān)于不同微生物培養(yǎng)基的描述見于美國細(xì)菌學(xué)會的"細(xì)菌學(xué)通用方法手冊"(美國華盛頓D.C.，1981)。術(shù)語培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基可互換使用?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔铮缙咸烟?，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，衍生自糖用甜菜或甘蔗的含有蔗糖的溶液，淀粉，淀粉水解產(chǎn)物和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油，甲醇和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牡窗ê挠袡C(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機(jī)化物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿?，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)含鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的鹽，例如金屬如鈉、鉀、鎂、鈣和鐵的氯化物或硫酸鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)，如氨基酸例如高絲氨酸以及維生素例如硫胺素、生物素或泛酸。此外，可將各種氨基酸的適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中。上述添加的物質(zhì)可以單批混合物的形式加入培養(yǎng)物或以適宜方式在培養(yǎng)期間適當(dāng)補(bǔ)加。為了控制培養(yǎng)物的pH值，可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨或氨水，或者酸性化合物如磷酸或硫酸。通常將pH調(diào)節(jié)為6.0—9.0，優(yōu)選6.5—8之間。為了控制泡沫產(chǎn)生，可以使用抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯。為了保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可將適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素加入培養(yǎng)基中。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可通入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。也可以使用富含過氧化氫的液體。在適當(dāng)情況下，發(fā)酵是在例如0.03-0.2Mpa的正壓下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度通常在20°C45°C，優(yōu)選25'C—4(TC。在分批培養(yǎng)方法中，連續(xù)培養(yǎng)直至合意的氨基酸的形成達(dá)到最大量。此目的通常在10160小時(shí)達(dá)到。在持續(xù)培養(yǎng)方法中可以進(jìn)行較長的培養(yǎng)時(shí)間。合適的發(fā)酵培養(yǎng)基在US6，221，635,US5,840,551，US5,770,409，US5,605,818，US5,275,940和US4,224,409等中描述。確定L-氨基酸的方法為本領(lǐng)域所已知。所述分析可以如Spackman等(AnalyticalChemistry,30，(1958)，1190)所述通過陰離子交換層析及隨后的茚三酮衍生化進(jìn)行，或者可以如Lindroth等(AnalyticalChemistry(1979)51:1167-1174)所述通過反向HPLC進(jìn)行。本發(fā)明因此涉及一種制備L-氨基酸的方法，其中a)將分離的棒狀細(xì)菌在合適培養(yǎng)基中發(fā)酵，所述細(xì)菌包含編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性的多肽的基因，所述多肽的氨基酸序列第111位或相應(yīng)位置的L-絲氨酸由另一種蛋白質(zhì)氨基酸置換，并且在適當(dāng)情況中，在第201位或相應(yīng)位置的L-丙氨酸由另一種蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸置換，b)L-氨基酸在發(fā)酵肉湯或分離的棒狀細(xì)菌細(xì)胞中富集。然后將以這種方式制備的發(fā)酵肉湯進(jìn)行進(jìn)一步加工成為固體或液體產(chǎn)物。發(fā)酵肉湯是指在其中將微生物在一定溫度培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵期間應(yīng)用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有保證所述微生物增殖及合意的氨基酸形成所需要的所有物質(zhì)或成分。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，所得發(fā)酵肉湯因此含有a)作為所述微生物細(xì)胞復(fù)制的結(jié)果而形成的微生物的生物量，b)在發(fā)酵期間形成的合意的氨基酸，c)在發(fā)酵期間形成的有機(jī)副產(chǎn)物，及d)未被發(fā)酵消耗的所用發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分，或者加入的物質(zhì)，例如維生素如生物素，氨基酸如高絲氨酸，或者鹽如硫酸鎂。所述有機(jī)副產(chǎn)物包括由發(fā)酵所用微生物產(chǎn)生的除合意氨基酸之外的物質(zhì)，在適當(dāng)情況中其被分泌。這些副產(chǎn)物包括比合意的氨基酸少至少30%、20%或10%的L-氨基酸。所述副產(chǎn)物也包括具有l(wèi)一3個(gè)羧基基團(tuán)的有機(jī)酸，如乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸或者延胡索酸。最后，這些副產(chǎn)物還包括糖，如海藻糖。適于工業(yè)化目的的通常的發(fā)酵肉湯的氨基酸含量為40g/kg—180g/kg或者50g/kg—150g/kg。通常地，生物量的含量(干生物量)為20—50g/kg。在L-賴氨酸的情況中，現(xiàn)有
技術(shù)領(lǐng)域：
主要公開了四種不同產(chǎn)物形式。一組含有L-賴氨酸的產(chǎn)物包含經(jīng)純化L-賴氨酸的濃縮堿性水溶液(EP國B畫0534865)。另一組如US6,340,486和US6，465，025所述，包含含有L-賴氨酸發(fā)酵肉湯的含有生物量的酸性含水濃縮物。最常見的固體產(chǎn)物的組包含粉狀或晶體形式的經(jīng)純化的或純L-賴氨酸，其通常以鹽如L-賴氨酸鹽酸鹽的形式存在。另一組固體產(chǎn)物形式在例如EP-B-0533039中描述。在本文中描述的產(chǎn)物形式除含L-賴氨酸之外，還含有在發(fā)酵生產(chǎn)期間使用的而未被消耗的大部分添加的物質(zhì)，并且在適當(dāng)情況中為所用微生物的生物量的>0%至100%。根據(jù)不同的產(chǎn)物形式，已知有許多方法從發(fā)酵肉湯中收集、分離或純化L-氨基酸，以制備含有L-氨基酸的產(chǎn)物或者純化的L-氨基酸?；旧鲜褂玫姆椒ㄊ窃谶m當(dāng)情況下使用活性炭的離子交換層析方法及用于制備固態(tài)純L-氨基酸的結(jié)晶化方法。在賴氨酸的情況中，這樣產(chǎn)生了相應(yīng)的堿或相應(yīng)的鹽如一鹽酸鹽(Lys-HCl)或者賴氨酸硫酸鹽(Lys2-H2S04)。對于賴氨酸，EP-B-0534865描述了一種從發(fā)酵肉湯中制備含有L-賴氨酸的堿性水溶液的方法。在該文中，從發(fā)酵肉湯中分離出生物量并棄去。使用堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀或者氫氧化銨將pH調(diào)節(jié)為9一11。在濃縮和冷卻之后，通過結(jié)晶化從肉湯中分離出礦物質(zhì)成分(無機(jī)鹽)，用作肥料或棄去。在使用本發(fā)明的細(xì)菌制備賴氨酸的方法中，優(yōu)選產(chǎn)生含有發(fā)酵肉湯組成成分的產(chǎn)物。這些產(chǎn)物具體可用作動物飼料添加劑。根據(jù)需要，可以通過分離方法如離心、過濾或傾析或這些方法的組合將全部或部分生物量從發(fā)酵肉湯中除去，或者可將所有生物量均保留在發(fā)酵肉湯中。在適當(dāng)情況中，在適當(dāng)?shù)牟襟E中滅活所述生物量或者含有生物量的發(fā)酵肉湯，例如通過熱處理(加熱)或者加入酸來進(jìn)行。所述生物量的化學(xué)成分是胞外被膜等，例如肽聚糖和阿拉伯半乳聚糖，蛋白質(zhì)或多肽，例如蘋果酸醌氧化還原酶多肽，脂質(zhì)和磷脂及核酸(DNA和RNA)，例如含有本發(fā)明突變的多核苷酸。作為滅活措施和/或其它程序步驟(例如酸化、噴霧干燥、造粒等)的結(jié)果，核酸通常以片段形式存在，所述片段長度為240-60bp，>60-80bp，>80—100bp，〉100-200bp，>200-300bp，>300—400bp，>400-500bp，>500-750bp，>750—1000bp，>1000-1250bp，>1250—1500bp，>1500-1750bp，〉1750-2000bp，>2000-2500bp，>2500-3000bp，>3000-4000bp，>4000—5000bp等。在一種方法中，所述生物量被完全或基本完全除去，由此在制備的產(chǎn)物中沒有(0%)生物量，或者保存有至多30%、20%、10%、5%、1%或者至多0.1%的生物量。在另一種方法中，所述生物量未被除去，或者僅除去微量，由此所有(100%)或者超過70%、80%、90%、95%、99%或99.9%的生物量保留在制備的產(chǎn)物中。在本發(fā)明的一種方法中，所述生物量被除去的比例是20%勤100%。最后，在發(fā)酵后獲得的發(fā)酵肉湯在完全或部分除去所述生物量之前或之后可以用無機(jī)酸如鹽酸、硫酸或磷酸或者用有機(jī)酸如丙酸調(diào)節(jié)為酸性(GB1,439,728或者EP1331220)。同樣當(dāng)發(fā)酵肉湯含有全部的生物量時(shí)也可以對其進(jìn)行酸化。最后，肉湯也可以通過加入亞硫酸氫鈉(NaHS03，GB1，439，728)或者另一種鹽例如銨、堿金屬或堿土金屬的硫酸鹽而穩(wěn)定化。當(dāng)所述生物量被分離出時(shí)，發(fā)酵肉湯中存在的有機(jī)或無機(jī)固體被部分或全部除去。溶解于發(fā)酵肉湯中的有機(jī)副產(chǎn)物中的至少一些(>0%)，優(yōu)選至少25%、具體優(yōu)選至少50%、特別優(yōu)選至少75%及溶解且未消耗的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分(加入的物質(zhì))保留在產(chǎn)物中。在適當(dāng)情況中，這些副產(chǎn)物和組成成分也完全保留(100%)或者基本上完全保留(即>95%或>98%)在產(chǎn)物中。在這個(gè)意義上，術(shù)語"發(fā)酵肉湯主要成分"是指包含至少一部分發(fā)酵肉湯組成成分的產(chǎn)物。隨后，使用已知方法從肉湯中排出水分，或者將肉湯增稠或濃縮，例如使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器或者降膜蒸發(fā)器，或者通過反滲透或納米過濾方法。然后可以將這種濃縮的發(fā)酵肉湯制成易流動的產(chǎn)物，具體是制成細(xì)碎的粉末，或者優(yōu)選制成粗粒，使用凍干方法、噴霧干燥方法或者噴霧造?；蛘呤褂闷渌椒ㄔ诶鏟CT/EP2004/006655所述的循環(huán)流化床中進(jìn)行。在適當(dāng)情況中，通過篩選或除塵方法將合意的產(chǎn)物從所得顆粒物中分離出。另外可以通過噴霧干燥或噴霧造粒方法直接將發(fā)酵肉湯干燥，之前不用任何濃縮方法。"易流動的"是指粉末不受阻礙地從具有不同大小流出孔的一系列玻璃流出管中流出的粉末，即其不受阻礙地從具有5mm(毫米)孔的流量管中流出(Klein:Seifen，Ole，F(xiàn)ette，Wachse[Soaps，Oils,FatsandWaxes]94，12(1968))。"細(xì)碎的"是指大部分(>50%)粉末的粒徑大小為20—200"粗粒"是指大部分(>50%產(chǎn)物)的粒徑大小為200—2000,。顆粒大小可以使用激光衍射光譜法確定。相應(yīng)方法在R.H.MiillerandR.Schuhmann的教禾斗書Teilchengr6i3enmessunginderLaborpraxis[ParticleSizeMeasurementinLaboratoryPractice]"，WissenschaftlicheVerlagsgesellschaftStuttgart(1996)或者IntroductiontoParticleTechnology"byM.Rhodes,Wiley&Sons(1998)中描述?？梢酝ㄟ^合適的壓型或造粒方法將易流動的細(xì)粉末轉(zhuǎn)變?yōu)榇至５?、易流動的、耐貯存的且在很大程度上無塵的產(chǎn)物。術(shù)語"無塵"是指所述產(chǎn)物僅含有較小比例(<5%)的直徑小于100pm的顆粒。在本發(fā)明中，"耐貯存的"是指產(chǎn)物在干燥和冷卻環(huán)境中可以貯存至少一(1)年或更長時(shí)間，優(yōu)選至少1.5年或更長時(shí)間，特別優(yōu)選至少2年或更長時(shí)間，而指定的氨基酸不明顯喪失(<50/0)。本發(fā)明因此還涉及一種從發(fā)酵肉湯中制備含有L-氨基酸、優(yōu)選L-賴氨酸或L-色氨酸的產(chǎn)物、優(yōu)選動物飼料添加劑的方法，所述方法的特征在于如下步驟a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)和發(fā)酵分泌L-氨基酸的棒狀細(xì)菌，其包含編碼一種多肽的至少一個(gè)mqo等位基因，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性，包含其中第111位或相應(yīng)位置存在除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸的氨基酸序列，且在適當(dāng)情況中在所述氨基酸序列第201位或相應(yīng)位置存在任何蛋白質(zhì)氨基酸、優(yōu)選L-絲氨酸，b)除去在發(fā)酵期間形成的生物量的0—100%重量，c)干燥根據(jù)步驟a)和域b)中獲得的發(fā)酵肉湯，以獲得合意的粉末形式或顆粒形式的產(chǎn)物，在適當(dāng)情況中，在步驟b)或c)之前加入選自硫酸、磷酸或鹽酸的酸。優(yōu)選在步驟a)或b)之后從含有L-氨基酸的發(fā)酵肉湯中除去水分(濃縮)。使用以下物質(zhì)對于造?；驂盒褪怯幸娴某Ｓ玫挠袡C(jī)或無機(jī)輔助物質(zhì)，或者載體如淀粉、凝膠、纖維素衍生物或者類似物質(zhì)，如在食品和飼料加工中通常用作粘合劑、稠化劑或者增稠劑的物質(zhì)，或者其它物質(zhì)如硅酸、硅酸鹽(EP0743016A)或硬脂酸鹽。用油提供所得顆粒的表面也是有益的，如WO04/054381所述?？梢允褂玫挠褪堑V物質(zhì)油、植物油或植物油混合物。這些油例如是大豆油、橄欖油和大豆油/卵磷脂混合物。在相同方式中，硅油、聚乙二醇或羥乙基纖維素也是適合的。用所述油處理所述表面增加產(chǎn)物的磨損抗性及降低灰塵含量。產(chǎn)物中油的含量基于飼料添加劑總量為0.02—2.0%重量，優(yōu)選為0.02—1.0%重量，特別優(yōu)選為0.2—1.0%重量。優(yōu)選粒徑為100—1800pm的產(chǎn)物的含量297%(重量)，或者粒徑為300—1800pm的產(chǎn)物的含量295%?；覊m，即直徑〈100)im的顆粒，優(yōu)選為>0—1%(重量)，具體優(yōu)選至多0.5%(重量)。然而，或者所述產(chǎn)物也可以附著于飼料加工中已知及慣用的有機(jī)或無機(jī)載體物質(zhì)上，例如硅酸、硅酸鹽、谷粉、糠、粗谷粉、淀粉、糖等，和/或與慣用的增稠劑或粘合劑混和及穩(wěn)定。關(guān)于這方面的應(yīng)用實(shí)例和方法在文獻(xiàn)(DieMiihle+MischfUttertechnik[TheGrindingMill+MixedFeedTechnology]132(1995)49，page817)中描述。最后，如DE-C-4100920所述，所述產(chǎn)物也可以通過包被方法使用成膜劑如金屬碳酸鹽、硅酸、硅酸鹽、藻酸鹽、硬脂酸鹽、淀粉、橡膠和纖維素醚進(jìn)行加工，形成對于動物胃、特別是反芻動物的胃的消化穩(wěn)定的狀態(tài)。為了設(shè)定產(chǎn)物中合意的氨基酸濃度，根據(jù)需要在發(fā)酵期間可以加入適當(dāng)?shù)陌被?，以濃縮物形式或極純物質(zhì)形式或者其液體或固體形式的鹽加入。后者可以單獨(dú)或者作為混和物加入所得發(fā)酵肉湯中，或者加入濃縮的發(fā)酵肉湯中，或者在干燥或造粒期間加入。在賴氨酸情況中，在含有賴氨酸的產(chǎn)物制備期間調(diào)節(jié)離子比率以使根據(jù)如下化學(xué)式2x[S042-]+[Cl-]-[NH4+]-[Na+]-[K+]-2x[Mg+]-2x[Ca2+]/[L-Lys]的離子比率值為0.68—0.95，優(yōu)選為0.68—0.90，如Kushikietal.于US20030152633中的描述。在賴氨酸的情況中，以這種方式制備的基于發(fā)酵肉湯的固體產(chǎn)物的賴氨酸含量(作為賴氨酸堿)基于產(chǎn)物干重為10%—70%重量，或者20%—70%重量，優(yōu)選30%—70%重量，特別優(yōu)選40%一70%重量。也可以實(shí)現(xiàn)的賴氨酸堿的最大含量為71%重量、72%重量或73%重量。在電學(xué)中性氨基酸如L-色氨酸的情況中，以這種方式制備的基于發(fā)酵肉湯的固體產(chǎn)物的氨基酸含量為至少5%重量、10%重量、20%重量或者30%重量，最高為50%重量、60%重量、70°/。重量、80%重量、90%重量或者直至95%重量。所述固體產(chǎn)物的水含量為至多5%重量，優(yōu)選至多4%重量，具體優(yōu)選少于3%重量。本發(fā)明因此還涉及一種含有L-賴氨酸的基于發(fā)酵肉湯的飼料添加劑，其呈現(xiàn)如下特征a)賴氨酸含量(作為堿)為至少10%重量至至多73%重b)水含量為至多5%重量，c)生物量含量相應(yīng)于發(fā)酵肉湯中含有的生物量的至少0.1%，其中所述生物量是從本發(fā)明的棒狀細(xì)菌形成的，其在適當(dāng)情況下是失活的。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及一種含有L-色氨酸的基于發(fā)酵肉湯的飼料添加劑，其呈現(xiàn)如下特征a)色氨酸含量為至少5%重量至至多95%重量，b)水含量為至多5%重量，c)生物量含量相應(yīng)于發(fā)酵肉湯中含有的生物量的至少0.1%,所述生物量是從本發(fā)明的棒狀細(xì)菌形成的，其在適當(dāng)情況下是失活的。稱作DM1797且在其天冬氨酸激酶中包含氨基酸取代lysCT311I的谷氨酸棒桿菌于2004年10月28日保藏在德國微生物和細(xì)胞保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)，保藏號為DSM16833。在mqo多肽的氨基酸序列中第111位包含L-苯丙氨酸的本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌DM1808于2004年ll月24日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)，保藏號為DSM16937。實(shí)施例實(shí)施例1:產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株DM1797的誘變將谷氨酸棒桿菌菌株DM1797用作起始菌株，使用N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)進(jìn)行誘變。菌株DM1797是谷氨酸棒桿菌ATCC13032的一種氨乙基半胱氨酸抗性突變體，保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)，保藏號為DSM16833。將菌株DM1797在33°(3在100mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中的10ml的LB肉湯(Merck，Darmstadt,Germany)中以200rpm在CertomatBS-1型旋轉(zhuǎn)式搖瓶(B.BraunBiotechInternational,Melsungen，Germany)上培養(yǎng)24小時(shí)。然后將培養(yǎng)物離心，將沉淀物再懸浮于10ml的0.9%NaCl溶液中；將所得懸浮液再離心一次，將獲得的沉淀物置于10ml的0.9%NaCl溶液中。將5ml這種細(xì)胞懸浮液用400pg的MNNG/ml在3(TC在搖床上以200rpm處理15分鐘(見上述)。然后將誘變混合物離心，將沉淀物置于10ml0.9°/。NaCl緩沖液(pH=6.0)中的2%硫代硫酸鈉中。然后將細(xì)胞懸浮液用0.9。/。NaCl溶液以1:1000、1:10000和1:100000的比例稀釋，將等分試樣鋪板于腦-心瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany)上。以此方式分離大約2500個(gè)突變體。實(shí)施例2:菌株DM1797突變體的性能測試將在實(shí)施例1中獲得的突變體在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定培養(yǎng)上清中的賴氨酸含量。為此，首先將克隆在33t:在腦-心瓊脂平板(Merck，Darmstadt,Germany)上增殖24小時(shí)。然后用這些瓊脂平板培養(yǎng)物接種一份預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基，于100mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是MM培養(yǎng)基。將所述預(yù)培養(yǎng)物在33'C在搖床上以240rpm保溫24小時(shí)。這個(gè)預(yù)培養(yǎng)物用于接種主培養(yǎng)物，使得主培養(yǎng)物的初始OD(660nm)為0.1OD。MM培養(yǎng)基也用于主培養(yǎng)物。MM培養(yǎng)基葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)鹽(NH4)2S04KH2P04MgS04*7H20CaCl2*2H20FeS04*7H20MnS04*H20生物素(過濾滅菌)硫胺素+HCl(過濾滅菌)25g/l0.1g/11,0g/110mg/110mg/l5.0mg/l0.3mg/10.2mg/1CaC0325g/l用氨水將CSL(玉米浸液)，MOPS(嗎啉代丙磺酸)和鹽溶液調(diào)至pH7并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaC03。培養(yǎng)在具有檔板的100mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中的10ml體積中進(jìn)行。溫度為33'C，轉(zhuǎn)速為250rpm，大氣濕度為80%。48小時(shí)后，用Biomek1000(Beckmann儀器有限公司，慕尼黑)在660nm測量波長測定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)，經(jīng)離子交換層析和柱后衍生及茚三酮檢測來測定形成的賴氨酸的量。特征為賴氨酸形成量增多的突變體被稱作DM1808.表1菌株OD(660)賴氨酸-HCl(g/l)DM179712.14.9DM180812.05.3實(shí)施例3:突變體DM1808的mqo基因的測序使用Eikmannsetal.(Microbiology140:1817-1828(1994))戶萬述方法從DM1808克隆中分離染色體DNA。使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增攜帶mqo基因的DNA節(jié)段。為該目的使用如下寡核苷酸作為引物mqo畫Al(SEQIDNO:13):5，ggtgaaacttccgcgatact3，mqo-El(SEQIDNO:14):5，gtgtcgcctaaatcacactg3'所述引物由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成。它們使得長度為大約2kb并攜帶mqo基因的DNA節(jié)段得以擴(kuò)增。引物mqo-Al結(jié)合相應(yīng)于SEQIDNO:3互補(bǔ)鏈中第22—41位的區(qū)域。引物mqo-El結(jié)合相應(yīng)于SEQIDNO:3所示鏈中第2002—1983位的區(qū)域。使用PhusionHighFidelityDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，F(xiàn)rankfort,Germany)進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述反應(yīng)混合物根據(jù)廠商指導(dǎo)制備，含有10^的5XPhusionHF緩沖液，以及在每種情況中200濃度的三磷酸脫氧核苷，0.5濃度的引物，大約50ng的模板DNA及2單位的Phusion聚合酶，總體積為50pl。通過加入水將體積調(diào)節(jié)為50pl。首先將PCR混合物在98°C30秒進(jìn)行初步變性。然后將如下步驟重復(fù)35次在98°C20秒的變性步驟，在60°C20秒使所述引物與導(dǎo)入的DNA結(jié)合的步驟，及在72'C60秒使引物延伸的延伸步驟。最后在72'C5分鐘的延伸步驟之后，對PCR混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(0.8%瓊脂糖)。鑒定長度為大約2kb的DNA片段，使用Qiagen的QIAquick凝膠提取試劑盒(Hilden，Germany)從凝膠中分離并純化。擴(kuò)增的DNA片段或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列通過Agowa(Berlin,Germany)確定。所得mqo等位基因的編碼區(qū)序列示于SEQIDNO:5。使用Patentin程序獲得的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于SEQIDNO:6。突變體DM1808中mqo等位基因的編碼區(qū)的核苷酸序列在第332位含有核堿基胸腺嘧啶332(見SEQIDNO:5)。野生型基因(見SEQIDNO:l)在這個(gè)位置含有核堿基胞嘧啶。這種胞嘧啶—胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換導(dǎo)致在所得氨基酸序列第111位的絲氨酸由苯丙氨酸置換。下文將這個(gè)突變稱作mqoSlllF。實(shí)施例4:置換型載體pK18omobsacB—mqoSl1IF的構(gòu)建使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增攜帶mqoSlllF突變的mqo等位基因的一部分編碼區(qū)，即內(nèi)部片段或內(nèi)部區(qū)域。將在實(shí)施例3中分離的染色體DNA用作模板。選擇如下寡核苷酸作為PCR引物mqo-intl-bam(SEQIDNO:27):5"ctag-gg^^國ccgaagaacgcaccgaggat3"mqo-int2-bam(SEQIDNO:28):5,ctag-ggatcc-ggcggatggacttgaacagg3，它們由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成，使得擴(kuò)增長度為大約1.05kb的編碼區(qū)的DNA節(jié)段成為可能。mqo-intl-bam引物的第11—30位核苷酸結(jié)合SEQIDNO:3互補(bǔ)鏈中第362_381位的區(qū)域。SEQIDNO:3的第362禾卩381位相應(yīng)于SEQIDNO:l的第13和32位。mqo-int2-bam引物的第11—30位核苷酸結(jié)合相應(yīng)于SEQIDNO:3所示鏈中第1385—1366位的區(qū)域。SEQIDNO:3中第1385位和1366位相應(yīng)于SEQIDNO:l中第1036和1017位。另外，所述引物含有針對限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的切割位點(diǎn)的序列，該位點(diǎn)在上述核苷酸序列中以下劃線示出。使用PhusionHigh-FidelityDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，F(xiàn)rankfort,Germany)進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述反應(yīng)混合物具有如上述組成?；救缟鲜鲞M(jìn)行PCR，一處差別外是重復(fù)35次的循環(huán)中的72。C延伸步驟在每種情況中均只進(jìn)行30秒。將長度為大約1.05kb的擴(kuò)增物用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI處理，通過在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳鑒別。然后使用Qiagen的QIAquick提取試劑盒從凝膠中分離并純化。以此方式純化的DNA片段含有所述mqoSlllF突變，并具有Bamffl相容性末端(mqoSlllF片段或圖1中的'mqo')。然后將其摻入ScMferetal.(Gene，145，69-73(1994))所述的可移動載體pK18mobsacB中，以使實(shí)現(xiàn)等位基因或突變置換成為可能。為此，將pK18mobsacB用限制酶BamHI消化，將末端用堿性磷酸酶(BoehringerMannheim,Germany)去磷酸化。將以此方式制備的載體與mqoSl1IF片段混和，將該混合物用Ready-To-GoT4DNA連接酉每試齊!j盒(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg,Germany)處理。然后將大腸桿菌菌株S17-l(Simonetal.，Bio/Technologie1:784-791，1993)用該連接混合物轉(zhuǎn)化(Ha皿han，In.DNAcloning.Apracticalapproach.Vol.1.ILR-Press，ColdSpringHarbor,NewYork,1989)。通過將該轉(zhuǎn)化混合物鋪板于添加了25mg/1卡那霉素/lLB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrooketal.，MolecularCloning:alaboratorymanual.2ndEd.ColdSpringHarbor,NewYork,1989)。使用QiagenQIAprepSpinMiniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過用酶BamHI限制切割一次及用酶EcoRI限制切割一次進(jìn)行檢測，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將該質(zhì)粒稱作pK18mobsacB—mqoSlllF，并在圖1中描繪。實(shí)施例5:將突變mqoSllIF摻入菌株DM1797中將如實(shí)施例4所述的載體pK18mobsacB—mqoSlllF通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DM1797中，使用Schaferetal.(JournalofMicrobiology172:1663-1666(1990))所述方案進(jìn)行。所述載體在DM1797中不能獨(dú)立復(fù)制，當(dāng)其通過重組事件而整合進(jìn)染色體中時(shí)才在細(xì)胞中保持。轉(zhuǎn)接合子，即含有整合的pK18mobsacB一mqoSlllF的克隆，通過將接合混合物鋪板于添加了25mg卡那霉素/1和50mg萘啶酸/1的LB瓊脂上進(jìn)行選擇。然后將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子在添加了卡那霉素(25mg/l)的LB瓊脂上劃線，將平板在33'C保溫24小時(shí)。為了選擇其中通過二次重組事件切除所述質(zhì)粒的突變體，將克隆在LB液體培養(yǎng)基中非選擇性培養(yǎng)30小時(shí)，然后在添加了10X蔗糖的LB瓊脂上劃線，之后將該平板在33'C保溫24小時(shí)。除卡那霉素抗性基因之外，與起始質(zhì)粒pK18mobsacB—樣，質(zhì)粒pK18mobsacB—mqoSlllF也含有sacB基因的拷貝，其編碼枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶。sacB基因的蔗糖誘導(dǎo)型表達(dá)導(dǎo)致果聚糖蔗糖酶形成，該酶催化對于谷氨酸棒桿菌有毒性的果聚糖的合成。因此在添加了蔗糖的LB瓊脂上生長的克隆才是其中通過二次重組事件切除了整合的pK18mobsacB—mqoSlllF的那些克隆。當(dāng)發(fā)生切除時(shí)，根據(jù)二次重組事件相對于突變位點(diǎn)的位置，發(fā)生等位基因的置換或者突變的摻入，或者原始拷貝保留在宿主的染色體中。然后尋找其中發(fā)生合意的置換、即己經(jīng)摻入了突變mqoSlll的克隆。為此，在呈現(xiàn)"在存在蔗糖的條件下生長"及"在存在卡那霉素條件下不生長"表型的10個(gè)克隆中確定mqo基因的序歹U。這樣可以鑒別攜帶突變mqoSlllF的克隆。將這個(gè)菌株稱作谷氨酸棒桿菌DM1797_mqoSlllF。實(shí)施例6:菌株DM1797—mqoSlllF與起始菌株DM1797的性能對比如實(shí)施例2所述進(jìn)行性能測試。與DM1808—樣，菌株DM1797一mqoSlllF顯示的賴氨酸分泌顯著高于DM1797(見表1)。附圖簡述圖1:質(zhì)粒pK18mobsacB—mqoSlllF的圖譜。文中所用縮寫和名稱具有如下含義。給出的堿基對數(shù)目是在測量再現(xiàn)性的限度內(nèi)獲得的近似值。Kan:卡那霉素抗性基因BamHI:限制酶BamHI的切割位點(diǎn)EcoRI:限制酶EcoRI的切割位點(diǎn)mqo:含有mqoS111F等位基因內(nèi)部區(qū)域的克隆的DNA片段sacB:sacB基因RP4-mob:含有復(fù)制轉(zhuǎn)移起點(diǎn)(or汀)的mob區(qū)域oriV:復(fù)制起點(diǎn)V權(quán)利要求1.一種分離的棒狀細(xì)菌突變體，其包含編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性的多肽的基因，其特征在于所述多肽包含這樣的氨基酸序列，其中在第111位或相應(yīng)位置存在除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。2.權(quán)利要求1的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所述棒狀細(xì)菌是選自Corynebacteriumefficiens、谷氨酸棒桿菌、熱產(chǎn)氨棒狀桿菌和產(chǎn)氨棒狀桿菌組成的組的細(xì)菌。3.權(quán)利要求2的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所述細(xì)菌是谷氨酸棒桿菌。4.權(quán)利要求1、2或3的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所述細(xì)菌是分泌L-氨基酸的細(xì)菌。5.權(quán)利要求4的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所述細(xì)菌是分泌L-賴氨酸的細(xì)菌，分泌L-色氨酸的細(xì)菌或者分泌L-脯氨酸的細(xì)菌。6.權(quán)利要求l一5之一的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所編碼的多肽在第lll位或相應(yīng)位置含有L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。7.權(quán)利要求l一5之一的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所編碼的多肽包含SEQIDN0:2所示氨基酸序列，其中在第111位存在除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。8.權(quán)利要求7的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于在第201位的L-丙氨酸由另一蛋白質(zhì)氨基酸置換。9.權(quán)利要求l一5之一的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所述基因包含這樣的核苷酸序列，其相同于可通過使用得自棒狀細(xì)菌的DNA及使用引物對通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得的多核苷酸的核苷酸序列，所述引物對由第一個(gè)引物和第二個(gè)引物組成，其中第一個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3第l一349位的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，第二個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3第2002一1850位的互補(bǔ)核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。10.權(quán)利要求l一5之一的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所編碼的多肽包含長度相應(yīng)于500個(gè)L-氨基酸的氨基酸序列。11.權(quán)利要求l一5之一的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所編碼的多肽在其氨基酸序列的第106—1164位含有相應(yīng)于SEQIDN0:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10中第106—1164位的氨基酸序列。12.權(quán)利要求l一5之一的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所編碼的多肽包含與SEQIDN0:6或SEQIDNO:8的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。13.權(quán)利要求l一5之一的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所述基因包含與SEQIDN0:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列至少90%相同的核苷酸序列。14.權(quán)利要求6的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所編碼的蛋白質(zhì)包含選自如下序列組成的組的氨基酸序列a)SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列，b)包含一或多個(gè)保守氨基酸取代的SEQIDN0:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列，c)包含一或多個(gè)氨基酸插入或缺失的SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列。15.權(quán)利要求7或8的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于SEQIDNO:2所示氨基酸序列在第111位含有L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。16.權(quán)利要求15的棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于所述基因包含SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9所示核苷酸序列。17.—種分離的多核苷酸，其編碼這樣的多肽，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并在氨基酸序列第111位含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。18.權(quán)利要求17的分離的多核苷酸，其特征在于所述蛋白質(zhì)氨基酸是L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。19.權(quán)利要求17的分離的多核苷酸，其特征在于所編碼的多肽包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列，在該氨基酸序列第111位存在除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。20.權(quán)利要求19的分離的多核苷酸，其特征在于所編碼的多肽在第201位含有除L-丙氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。21.權(quán)利要求17的分離的多核苷酸，其特征在于所編碼的多肽包含長度為500個(gè)氨基酸的氨基酸序列。22.權(quán)利要求18的分離的多核苷酸，其特征在于所編碼的多肽在其氨基酸序列中的第324—334位含有相應(yīng)于SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10中第324—334位的氨基酸序列。23.權(quán)利要求18的分離的多核苷酸，其特征在于其相同于可通過使用得自棒狀細(xì)菌的DNA并使用引物對通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得的多核苷酸的核苷酸序列，所述引物對由第一個(gè)和第二個(gè)引物組成，其中第一個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3中第1一349位的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，第二個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3中第2002—1850位的互補(bǔ)核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。24.權(quán)利要求18的分離的多核苷酸，其特征在于其在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9的互補(bǔ)核苷酸序列雜交。25.權(quán)利要求18的分離的多核苷酸，其特征在于所編碼的多肽包含與SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。26.權(quán)利要求18的分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列至少90%相同的核苷酸序列。27.權(quán)利要求19或20的分離的多核苷酸，其特征在于所編碼的蛋白質(zhì)包含選自以下序列組成的組的氨基酸序列a)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列，b)包含一或多個(gè)保守氨基酸取代的SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列，c)包含一或多個(gè)氨基酸插入或缺失的SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列。28.權(quán)利要求27的分離的多核苷酸，其特征在于所編碼的多肽包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示氨基酸序列。29.權(quán)利要求28的分離的多核苷酸，其特征在于所述核苷酸序列包含SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9。30.—種分離的多核苷酸，其包含這樣的核酸分子，其至少編碼具有相應(yīng)于SEQIDNO:2第95—127位的氨基酸序列的讀框，所述氨基酸序列中在相應(yīng)于SEQIDNO:2第111位的位置具有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。31.權(quán)利要求30的分離的多核苷酸，其特征在于其至少編碼下述的讀框，所述讀框具有相應(yīng)于SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10的第95—127位的氨基酸序列。32.權(quán)利要求30的分離的多核苷酸，其特征在于所述氨基酸序列含有一或多個(gè)保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代不影響第111位。33.權(quán)利要求30的分離的多核苷酸，其特征在于其含有一或多個(gè)沉默突變。34.權(quán)利要求31的分離的多核苷酸，其特征在于其至少包含相應(yīng)于SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9中第283—381位的核苷酸序列。35.—種制備重組棒狀細(xì)菌的方法，其特征在于a)將權(quán)利要求17—29或者權(quán)利要求30—34的分離的多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，b)用得自a)的多核苷酸置換下述蘋果酸醌氧化還原酶基因，所述基因存在于所述棒狀細(xì)菌的染色體中并編碼在氨基酸序列第111位或相應(yīng)位置具有L-絲氨酸及在第201位或相應(yīng)位置具有L-丙氨酸的氨基酸序列，其中所述得自a)的多核苷酸編碼在第111位且在適當(dāng)時(shí)在第201位具有不同L-氨基酸的氨基酸序列，c)使根據(jù)a)和b)步驟獲得的棒狀細(xì)菌增殖。36.權(quán)利要求35的方法，其特征在于使用權(quán)利要求17—29之一所述分離的多核苷酸。37.權(quán)利要求35的方法，其特征在于使用權(quán)利要求30—34之一所述的分離的多核苷酸。38.權(quán)利要求35的方法，其特征在于所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。39.—種制備重組微生物的方法，其特征在于a)將權(quán)利要求17—20之一所述的分離的多核苷酸轉(zhuǎn)移到微生物中，b)使所述分離的多核苷酸在所述微生物中復(fù)制，c)使根據(jù)步驟a)和b)獲得的微生物增殖。40.—種重組微生物，其包含權(quán)利要求17—29或者30—34之一的分離的多核苷酸。41.權(quán)利要求40的重組微生物，其特征在于所述微生物是棒狀細(xì)菌或者埃希氏菌屬的細(xì)菌。42.權(quán)利要求41的重組微生物，其特征在于所述棒狀細(xì)菌是棒桿菌屬的細(xì)菌。43.權(quán)利要求42的重組微生物，其特征在于所述棒桿菌屬細(xì)菌是谷氨酸棒桿菌。44.載體，其含有權(quán)利要求17—29或者30—34之一的分離的多核苷酸。45.包含權(quán)利要求44的載體的重組微生物。46.權(quán)利要求45的重組微生物，其特征在于所述微生物是棒狀細(xì)菌或者埃希氏菌屬的細(xì)菌。47.權(quán)利要求46的重組微生物，其特征在于所述棒狀細(xì)菌是棒桿菌屬的細(xì)菌。48.權(quán)利要求47的重組微生物，其特征在于所述棒桿菌屬的細(xì)菌是谷氨酸棒桿菌。49.一種在微生物中過表達(dá)蘋果酸醌氧化還原酶的方法，其特征在于a)使微生物中權(quán)利要求17-29之一的多核苷酸的拷貝數(shù)增加至少1個(gè)拷貝，或者將啟動子與編碼下述多肽的多核苷酸功能性連接，所述多肽具有蘋果酸醌氧化還原酶活性并且其氨基酸序列第111位或相應(yīng)位置存在除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸，b)使所得微生物增殖。50.—種制備L-氨基酸的方法，其特征在于a)將分離的棒狀細(xì)菌在合適培養(yǎng)基中發(fā)酵，所述細(xì)菌包含編碼具有蘋果酸醌氧化還原酶活性的多肽的基因，其中所述多肽氨基酸序列中第111位或相應(yīng)位置的L-絲氨酸及適當(dāng)時(shí)第201位或相應(yīng)位置的L-丙氨酸由另一種蛋白質(zhì)氨基酸置換，b)L-氨基酸在發(fā)酵肉湯或細(xì)菌細(xì)胞中富集。51.權(quán)利要求50的方法，其特征在于分離的棒狀細(xì)菌是權(quán)利要求1一16之一的突變體。52.權(quán)利要求50的方法，其特征在于所述分離的棒狀細(xì)菌是下述的重組棒狀細(xì)菌，其包含權(quán)利要求17—34之一的分離的多核苷酸或者使用這種多核苷酸制備得來。53.權(quán)利要求50的方法，其特征在于所述氨基酸是分離的或收集的。54.權(quán)利要求53的方法，其特征在于所述L-氨基酸是純化的。55.權(quán)利要求50的方法，其特征在于所述L-氨基酸是與發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量(〉0至100%)—起分離或收集的。56.權(quán)利要求50的方法，其特征在于a)從權(quán)利要求50的b)步驟中獲得的發(fā)酵肉湯中除去已經(jīng)形成的生物量的0—100%，b)通過選自如下方法組成的組的方法從步驟a)中獲得的肉湯中制備基本干燥的和成形的產(chǎn)物造粒、壓制、噴霧干燥和擠出。57.權(quán)利要求56的方法，其特征在于在步驟a)之前或之后向發(fā)酵肉湯中加入選自硫酸、鹽酸或磷酸的酸。58.權(quán)利要求56的方法，其特征在于在步驟a)之前或之后從獲得的肉湯中除去水分。59.權(quán)利要求56的方法，其特征在于用油對在步驟b)中或其間獲得的成形產(chǎn)物進(jìn)行噴霧。60.—種棒狀細(xì)菌突變體，其特征在于其可以通過如下步驟獲得a)用誘變劑處理具有分泌氨基酸的能力的棒狀細(xì)菌，b)分離在步驟a)中產(chǎn)生的突變體并使其增殖，c)從步驟b)獲得的突變體中制備核酸，d)通過聚合酶鏈反應(yīng)使用得自步驟c)的核酸及引物對制備核酸分子，所述引物對由第一個(gè)引物和第二個(gè)引物組成，其中第一個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3中第l一349位的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，第二個(gè)引物包含選自SEQIDNO:3中第2002—1850位的互補(bǔ)核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，e)測定在步驟d)中獲得的核酸分子的核苷酸序列及測定編碼的氨基酸序列，f)在適當(dāng)情況下，將步驟e)中測定的氨基酸序列與SEQIDNO:6、8或10或者SEQIDNO:15、17或19進(jìn)行對比，g)鑒別含有編碼下述多肽的多核苷酸的突變體，所述多肽在第111位或相應(yīng)位置具有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸，并且在適當(dāng)時(shí)在第201位或相應(yīng)位置具有除L-丙氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸。61.權(quán)利要求60的突變體，其特征在于在步驟b)之后，選擇與步驟a)中應(yīng)用的棒狀細(xì)菌相比，能在培養(yǎng)基中分泌或者在細(xì)胞內(nèi)部濃縮至少多0.5%的氨基酸的突變體。62.權(quán)利要求60的步驟g)中的突變體，其特征在于在第lll位的蛋白質(zhì)氨基酸是L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。63.權(quán)利要求60的步驟g)中的突變體，其特征在于在第201位的蛋白質(zhì)氨基酸是L-絲氨酸。64.—種含有L-賴氨酸的基于發(fā)酵肉湯的飼料添加劑，其具有如下特點(diǎn)a)賴氨酸含量(作為堿)為至少10%—至多73%重雖,b)水含量為至多5%重量，c)生物量含量相應(yīng)于發(fā)酵肉湯中包含的生物量的至少0.1%，其中所述生物量在適當(dāng)情況中是失活的，其是從權(quán)利要求1一16或者40—43或者45—48或者60—63中的一或多項(xiàng)的細(xì)菌形成的。65.—種含有L-色氨酸的基于發(fā)酵肉湯的飼料添加劑，其具有如下特點(diǎn)a)色氨酸含量為至少5%—至多95%重量，b)水含量為至多5%重量，c)生物量含量相應(yīng)于發(fā)酵肉湯中包含的生物量的至少0.1%，所述生物量在適當(dāng)情況中是失活的，其是從權(quán)利要求1一16或者40—43或者45—48或者60—63的一或多項(xiàng)的細(xì)菌形成的。全文摘要本發(fā)明涉及棒狀細(xì)菌mqo基因的突變體和等位基因，其編碼蘋果酸醌氧化還原酶，其氨基酸序列的第111位或相應(yīng)位置含有除L-絲氨酸之外的任何蛋白質(zhì)氨基酸，本發(fā)明還涉及使用包含這些等位基因的細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵制備氨基酸、優(yōu)選制備L-賴氨酸、L-色氨酸和L-脯氨酸的方法。文檔編號C12P13/00GK101103104SQ200580046930公開日2008年1月9日申請日期2005年12月29日優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日發(fā)明者B·巴特,G·蒂爾巴赫,N·席施卡,S·漢斯申請人:德古薩有限責(zé)任公司