專利名稱：：調(diào)節(jié)植物氮水平的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請?zhí)峁┝松婕罢{(diào)節(jié)(如提高或降低)植物中氮水平的方法和材料。例如，本申請?zhí)峁┝说缴叩闹参镆约爸苽涞缴叩闹参锖椭参锂a(chǎn)品的材料和方法。
背景技術(shù)：
：光合自養(yǎng)性生產(chǎn)有機含氮化合物對植物代謝、生長和發(fā)育至關(guān)重要。在許多農(nóng)作物種類中，收獲的植物物質(zhì)的蛋白質(zhì)和氨基酸含量有非常重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值。葉中光驅(qū)動的氮(N)同化作用已經(jīng)進化為與光合作用和呼吸作用同步進行并整合。光合作用中還原碳(C)的產(chǎn)生以及它在呼吸作用中再氧化對于產(chǎn)生將無機N摻入氨基酸所需的能量和C骨架是必需的。相反，需要N同化來維持有機C和N的輸出。伴隨著光呼吸代謝的進行，此網(wǎng)絡(luò)變得更加復(fù)雜。N同化速率以及C和N同化的協(xié)調(diào)處于許多信號的多因素控制下，這些信號提供了C和N狀態(tài)的信息。需要可以在不同的氮條件下提高植物中氮含量的組合物和方法。發(fā)明概述本申請?zhí)峁┝松婕暗渴苷{(diào)節(jié)(如提高或降低)的植物的方法和材料。例如，本申請?zhí)峁┝说缴叩霓D(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞，用于產(chǎn)生氮水平升高的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞的核酸，以及制備氮水平升高的植物和植物細(xì)胞的方法?？膳囵B(yǎng)這種植物和植物細(xì)胞，以產(chǎn)生氮含量升高的種子。這些種子可用于生產(chǎn)營養(yǎng)物(如蛋白質(zhì))含量升高的糧食和動物飼料，這有利于糧食生產(chǎn)者和消費者。雖然不受限于任何具體作用方式，本文提供的氮調(diào)節(jié)性多肽可能具有作為轉(zhuǎn)運蛋白的活性。例如，本文提供的多肽可參與氮(如肽或氨基酸形式的有機氮、或銨或硝酸鹽形式的無機氮)的轉(zhuǎn)運。在一個實施方式中，提供了一種調(diào)節(jié)植物中氮水平的方法。該方法包括將分離核酸引入植物細(xì)胞，所述核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4-18和圖l所示共有序列，此植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。在另一實施方式中，提供了一種調(diào)節(jié)植物中氮水平的方法。該方法包括將分離核酸引入植物細(xì)胞，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:16和圖1所示共有序列，此植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。在另一實施方式中，提供了一種調(diào)節(jié)植物中氮水平的方法。該方法包括將分離核酸引入植物細(xì)胞，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:16，此植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。所述序列相同性可以是85%或更高、90%或更高、或者95%或更高。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于圖l所示共有序列的氨基酸序列的多肽。所述差異可以是氮水平升高。所述分離核酸可操作性連接于調(diào)節(jié)區(qū)。該調(diào)節(jié)區(qū)可以是組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)。該組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)可以是啟動子。所述啟動子可選自YP0092、PT0676、PT0708、油菜籽蛋白啟動子、Arcelin-5啟動子、菜豆蛋白基因啟動子、大豆胰蛋白酶抑制劑啟動子、ACP啟動子、硬脂酰-ACP去飽和酶基因、P-伴大豆球蛋白的大豆al亞基啟動子、油質(zhì)蛋白啟動子、15kD玉米醇溶蛋白啟動子、16kD玉米醇溶蛋白啟動子、19kD玉米醇溶蛋白啟動子、22kD玉米醇溶蛋白啟動子、27kD玉米醇溶蛋白啟動子、Osgt-l啟動子、(3-淀粉酶基因啟動子或大麥醇溶蛋白基因啟動子。所述啟動子可選自PT0613、PT0672、PT0678、PT0688、PT0837、YP0128、YP0275、PT0625、PT0660、PT0683或PT0758。所述調(diào)節(jié)區(qū)可以是廣泛表達的啟動子。廣泛表達的啟動子可選自p13879、p32449、21876、p326、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848、PT0633、YP0050、YP0144或YP0190。所述調(diào)節(jié)區(qū)可以是誘導(dǎo)型啟動子。該植物可以是雙子葉植物。該植物可以是蕓苔屬(5ra^/ca)、大豆屬(G/3;c/"e)、棉屬(Gay57/7/wm)、向曰葵屬(/Ze"a"f/z"^)、萵苣屬(丄ac&cfl)、番茄屬(Z^co/ers7.cow)、茄屬(So/cmww)、葡萄屬(W他)、豌豆屬CP/wm)、苜蓿屬(Afefifcago)、紅花屬(CaW/2amw力、落花生屬C4rac/n力、木犀欖屬(0/ea)、亞麻屬CL/"wm)或三葉草屬(7h/o/z'wm)的成員。該植物可以是單子葉植物。該植物可以是玉蜀黍?qū)?Zea)、小麥屬(7WY/cwm)、大麥屬(Horaww)、黑麥屬(&cfl/e)、稻屬(0^za)、小黑麥屬(7h'"co化ca/e)、燕麥屬04ve"a)、芭蕉屬(Mwa)、油棕屬(5/a"力、梯牧草屬(尸We"m)或高粱屬CSo^z謂)的成員。所述組織可以是種子組織。也提供了一種生產(chǎn)植物組織的方法。所述方法包括培養(yǎng)一種含有分離核酸的植物細(xì)胞，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4-18和圖1所示共有序列，所述組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。在另一實施方式中，提供了一種生產(chǎn)植物組織的方法。所述方法包括培養(yǎng)一種含有分離核酸的植物細(xì)胞，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:16和圖1所示共有序列，所述組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。在又一實施方式中，提供了一種生產(chǎn)植物組織的方法。所述方法包括培養(yǎng)一種含有分離核酸的植物細(xì)胞，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:16，所述組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。所述序列相同性可以是85%或更高、90%或更高、或者95%或更高。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于圖l所示共有序列的氨基酸序列的多肽。所述差異可以是氮水平升高。所述分離核酸可操作性連接于調(diào)節(jié)區(qū)。該調(diào)節(jié)區(qū)可以是組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)。該組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)可以是啟動子。所述啟動子可選自YP0092、PT0676、PT0708、油菜籽蛋白啟動子、Arcelin-5啟動子、菜豆蛋白基因啟動子、大豆胰蛋白酶抑制劑啟動子、ACP啟動子、硬脂酰-ACP去飽和酶基因、(3-伴大豆球蛋白的大豆al亞基啟動子、油質(zhì)蛋白啟動子、15kD玉米醇溶蛋白啟動子、16kD玉米醇溶蛋白啟動子、19kD玉米醇溶蛋白啟動子、22kD玉米醇溶蛋白啟動子、27kD玉米醇溶蛋白啟動子、Osgt-l啟動子、P-淀粉酶基因啟動子或大麥醇溶蛋白基因啟動子。所述啟動子可選自PT0613、PT0672、PT0678、PT0688、PT0837、YP0128、YP0275、PT0625、PT0660、PT0683或PT0758。所述調(diào)節(jié)區(qū)可以是廣泛表達的啟動子。廣泛表達的啟動子可選自p13879、p32449、21876、p326、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848、PT0633、YP0050、YP0144或YP0190。所述調(diào)節(jié)區(qū)可以是誘導(dǎo)型啟動子。該植物組織可以是雙子葉植物組織。該植物組織可以是蕓苔屬、大豆屬、棉屬、向曰葵屬、萵苣屬、番茄屬、茄屬、葡萄屬、豌豆屬、苜蓿屬、紅花屬、落花生屬、木犀欖屬、亞麻屬或三葉草屬的成員。該植物組織可以是單子葉植物組織。該植物組織可以是玉蜀黍?qū)?、小麥屬、大麥屬、黑麥屬、稻屬、小黑麥屬、燕麥屬、芭蕉屬、油棕屬、梯牧草屬或高粱屬的成員。所述組織可以是種子組織。也提供了一種植物細(xì)胞。所述植物細(xì)胞包含一種分離核酸，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80Q/Q或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4-18和圖1所示共有序列，此植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。在另一實施方式中，提供了一種植物細(xì)胞。所述植物細(xì)胞包含一種分離核酸，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:16和圖1所示共有序列，此植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。在又一實施方式中，提供了一種植物細(xì)胞。所述植物細(xì)胞包含一種分離核酸，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:16，此植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物組織中的氮水平與不含該核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。所述序列相同性可以是85%或更高、90%或更高、或者95%或更高。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列可編碼包含對應(yīng)于圖l所示共有序列的氨基酸序列的多肽。所述差異可以是氮水平升高。所述分離核酸可操作性連接于調(diào)節(jié)區(qū)。該調(diào)節(jié)區(qū)可以是組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)。該組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)可以是啟動子。所述啟動子可選自YP0092、PT0676、PT0708、油菜籽蛋白啟動子、Arcelin-5啟動子、菜豆蛋白基因啟動子、大豆胰蛋白酶抑制劑啟動子、ACP啟動子、硬脂酰-ACP去飽和酶基因、p-伴大豆球蛋白的大豆al亞基啟動子、油質(zhì)蛋白啟動子、15kD玉米醇溶蛋白啟動子、16kD玉米醇溶蛋白啟動子、19kD玉米醇溶蛋白啟動子、22kD玉米醇溶蛋白啟動子、27kD玉米醇溶蛋白啟動子、Osgt-l啟動子、P-淀粉酶基因啟動子或大麥醇溶蛋白基因啟動子。所述啟動子可選自PT0613、PT0672、PT0678、PT0688、PT0837、YP0128、YP0275、PT0625、PT0660、PT0683或PT0758。所述調(diào)節(jié)區(qū)可以是廣泛表達的啟動子。廣泛表達的啟動子可選自p13879、p32449、21876、p326、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848、PT0633、YP0050、YP0144或YP0190。所述調(diào)節(jié)區(qū)可以是誘導(dǎo)型啟動子。該植物可以是雙子葉植物。該植物可以是蕓苔屬、大豆屬、棉屬、向日葵屬、萵苣屬、番茄屬、茄屬、葡萄屬、豌豆屬、苜蓿屬、紅花屬、落花生屬、木犀欖屬、亞麻屬或三葉草屬的成員。該植物可以是單子葉植物。該植物可以是玉蜀黍?qū)?、小麥屬、大麥屬、黑麥屬、稻屬、小黑麥屬、燕麥屬、芭蕉屬、油棕屬、梯牧草屬或高粱屬的成員。所述組織可以是種子組織。也提供了一種轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)基因植物包含任何上述植物細(xì)胞。也提供了所述轉(zhuǎn)基因植物的子代。所述子代的氮水平與不含分離核酸的相應(yīng)對照植物中的氮水平有差異。也提供了轉(zhuǎn)基因植物的種子和營養(yǎng)組織。此外，提供了包含轉(zhuǎn)基因植物的營養(yǎng)組織的糧食和飼料。除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。雖然與本文所述內(nèi)容相似或等效的方法和材料可用于實施本發(fā)明，但下面描述了合適的方法和材料。將本文提及的所有發(fā)表物、專利申請、專利和清湯參考文獻以全文納入本文作參考。在有沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實施例僅為說明性，不會限制本發(fā)明。附圖和下面的說明書中闡述了本發(fā)明的一個或多個實施方式的詳情。從本說明書和附圖、以及權(quán)利要求書中可以明白本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點。圖l是SEQIDNO:4與直向同源氨基酸序列SEQIDNO:5-7、SEQIDNO:9-12、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16-18的比對。列出了通過比對確定的共有序列。發(fā)明詳述本發(fā)明描述了涉及氮水平受調(diào)節(jié)(如提高或降低)的植物、植物產(chǎn)品、植物組織和植物細(xì)胞的方法和材料。例如，本申請?zhí)峁┝说缴叩闹参锖椭参锛?xì)胞，以及生產(chǎn)這種植物和植物細(xì)胞的方法。所述方法可包括用編碼氮調(diào)節(jié)性多肽的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述多肽的表達導(dǎo)致氮水平升高。可培養(yǎng)用這種方法產(chǎn)生的植物和植物細(xì)胞，以產(chǎn)生氮水平升高的種子。這些種子可用于生產(chǎn)營養(yǎng)物(如蛋白質(zhì))含量升高的糧食和動物飼料，這有利于糧食生產(chǎn)者和消費者。多肽本文所用術(shù)語"多肽"指兩個或多個亞基氨基酸、氨基酸類似物或其它肽模擬物的化合物，不管翻譯后修飾(如磷酸化或糖基化)。亞基可通過肽鍵或其它鍵，如酯鍵或醚鍵連接。術(shù)語"氨基酸"指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D/L光學(xué)異構(gòu)體。該定義包括全長蛋白質(zhì)及其類似物、突變體和片段。本文描述的是氮調(diào)節(jié)性多肽。氮調(diào)節(jié)性多肽在植物或植物細(xì)胞中表達時可以有效調(diào)節(jié)氮水平。氮水平的調(diào)節(jié)可以是相對于對照植物中的相應(yīng)水平提高或降低氮水平。氮調(diào)節(jié)性多肽可以是轉(zhuǎn)運多肽，如寡肽轉(zhuǎn)運多肽。氮調(diào)節(jié)性多肽可以是質(zhì)子依賴性寡肽轉(zhuǎn)運(POT)家族多肽。據(jù)報道，POT家族多肽參與了伴隨著質(zhì)子攝取而攝入小肽的過程。SEQIDNO:2和SEQIDNO:4列出了了擬南芥04ra&cto;w的克隆的氨基酸序列，本文分別稱為CerescDNAID2998984(SEQIDNO:1)和Ceres克隆117581(SEQIDNO:3)，各自具有肽轉(zhuǎn)運多肽的特征性PTR2結(jié)構(gòu)域。氮調(diào)節(jié)性多肽可包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所列氨基酸序列?；蛘?，氮調(diào)節(jié)性多肽可以是具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所列氨基酸序列的多肽的同源物、直向同源物或變體。例如，氮調(diào)節(jié)性多肽可具有一氨基酸序列，該序列與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所列氨基酸序列的序列相同性至少為40%，如41%、45%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、56%、57%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、67%、68%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97°/。、98%或99%。在一些實施方式中，氮調(diào)節(jié)性多肽包含與SEQIDNO:2序列相同性至少為40%的氨基酸序列，該多肽的N末端包含葉綠體靶向信號序列。圖1提供了具有SEQIDNO:4所列氨基酸序列的多肽直向同源物的氨基酸序列，以及共有序列。比對來自各種物種的氨基酸序列，如關(guān)于SEQIDNO:4的氨基酸序列，并確定各位置上最常見的氨基酸或氨基酸類型，從而確定這種直向同源物的共有氨基酸序列。例如，圖1的比對提供了以下氨基酸序列Ceres克隆117581(SEQIDNO:4)、Ceres克隆:328378(SEQIDNO:5)、gi|2655098(SEQIDNO:6)、gi|34895718(SEQIDNO:7)、別4102839(SEQIDNO:9)、gi|31088360(SEQIDNO:10)、gi|6635838(SEQIDNO:11)、gi|56784523(SEQIDNO:12)、gi|50059161(SEQIDNO:14)、Ceres克隆352232(SEQIDNO:16)、gi|33411520(SEQIDNO:17)和gi|31429847(SEQIDNO:18)。其它直向同源物包括gii50933627(SEQIDNO:8)、gi|56784524(SEQIDNO:13)和gi|6409176(SEQIDNO:15)。在一些情況下，氮調(diào)節(jié)性多肽可包括與對應(yīng)于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQDDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或圖1所示共有序列的氨基酸序列的序列相同性至少為80%(如80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%或99%序列相同)的多肽。應(yīng)理解，許多核酸可編碼具有特定氨基酸序列的多肽。遺傳密碼的簡并性是本領(lǐng)域熟知的；即對許多氨基酸而言，有一種以上的核苷酸三聯(lián)體作為一種氨基酸的密碼子。例如，可用具體植物物種中合適的密碼子偏倚性表修飾給定氮調(diào)節(jié)性多肽的編碼序列中的密碼子，以獲得在該植物物種中的最優(yōu)表達。重組核酸編碼的氮調(diào)節(jié)性多肽可以是天然氮調(diào)節(jié)性多肽，即細(xì)胞中天然存在的氮調(diào)節(jié)性多肽編碼序列的一個或多個額外拷貝。或者，氮調(diào)節(jié)性多肽可能與該細(xì)胞異源，如，轉(zhuǎn)基因番茄屬植物可含有來自大豆屬植物的轉(zhuǎn)運多肽的編碼序列。氮調(diào)節(jié)性多肽可包括不參與氮調(diào)節(jié)的額外氨基酸，因此可能比不包括額外氨基酸的多肽長。例如，氮調(diào)節(jié)性多肽可包括用作報道物的氨基酸序列。這種氮調(diào)節(jié)性多肽可以是綠色熒光蛋白(GFP)多肽與SEQIDNO:2融合形成的、或黃色熒光蛋白(YFP)多肽與SEQIDNO:4融合形成的融合蛋白。在一些實施方式中，氮調(diào)節(jié)性多肽包括加在氨基或羧基末端的純化標(biāo)簽或前導(dǎo)序列?？赏ㄟ^核苷酸和多肽序列比對分析來鑒定適用于本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)性多肽候選物。例如，對核苷酸或多肽序列數(shù)據(jù)庫進行查詢可鑒定氮調(diào)節(jié)性多肽的直向同源物。序列分析可包括用已知的氮調(diào)節(jié)性多肽氨基酸序列對非冗余數(shù)據(jù)庫進行BLAST、交互BLAST或PSI-BLAST分析。數(shù)據(jù)庫中序列相同性大于40%的蛋白質(zhì)可以鑒定為候選物，以進一步評價其作為氮調(diào)節(jié)性多肽的適用性。如果需要，可手工檢查這些候選物，以減少需要進一步評價的候選物的數(shù)量。通過選擇^[以乎具有懷疑存在于氮調(diào)節(jié)性多肽中的結(jié)構(gòu)域(如保守的功能域)的候選物進行手工檢査。在模板或主題多肽中鑒定保守區(qū)可有利于產(chǎn)生野生型氮調(diào)節(jié)性多肽的變體?？赏ㄟ^以下方法鑒定保守區(qū)定位模板多肽的一級氨基酸序列內(nèi)是重復(fù)序列，形成某些二級結(jié)構(gòu)(如螺旋和(3折疊)，建立帶正電或帶負(fù)電的結(jié)構(gòu)域或者代表蛋白基序或結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。參見例如，Pfam網(wǎng)站，如萬維網(wǎng)sanger.ac.uk/Pfam/和genome.wustl.edu/Pfam描述了各種蛋白基序和結(jié)構(gòu)域的共有序列。Sonnhammer等，1998，Nucl.AcidsRes,26:320-322;Sonnhammer等，1997，Proteins28:405-420;和Bateman等，1999，Nucl.AcidsRes.27:260-262描述了Pfam數(shù)據(jù)庫所含信息的說明。也可通過比對緊密相關(guān)物種的相同或相關(guān)多肽的序列確定保守區(qū)。緊密相關(guān)物種優(yōu)選為同一科的物種。在一些實施方式中，比對兩個不同物種的序列就足夠了。例如，來自擬南芥04ra6Wo;w的和玉蜀黍(Z^mfl少力的序列可用于鑒定一個或多個保守區(qū)。一般地，氨基酸序列相同性至少約為40%的多肽可用于鑒定保守區(qū)。相關(guān)多肽的保守區(qū)的氨基酸序列相同性至少為45%(如氨基酸序列相同性為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)。在一些實施方式中，耙多肽和模板多肽的保守區(qū)的氨基酸序列相同性至少為92%、94%、96%、98%或99%?？梢詮陌被峄蚝塑账嵝蛄型茖?dǎo)出氨基酸序列相同性。在某些情況下，可以鑒定氮調(diào)節(jié)性多肽中高度保守的結(jié)構(gòu)域。這些保守區(qū)可用于鑒定功能上相似(直向同源性)的氮調(diào)節(jié)性多肽。在一些情況下，可根據(jù)同源氮調(diào)節(jié)性多肽中共有功能域和/或保守區(qū)合成合適的氮調(diào)節(jié)性多肽。結(jié)構(gòu)域是可用于表征蛋白質(zhì)家族和/或蛋白質(zhì)某部分的多肽中的基本毗連氨基酸組。這種結(jié)構(gòu)域具有"指紋"或"簽名"，"指紋"或"簽名"可包括保守的(l)一級序列、(2)二級結(jié)構(gòu)和/或(3)三維構(gòu)象。通常，各結(jié)構(gòu)域與特定的體外和/或體內(nèi)活性有關(guān)。結(jié)構(gòu)域的長度可以是10個氨基酸-400個氨基酸，如10-50個氨基酸，或25-100個氨基酸，或35-65個氨基酸，或35-55個氨基酸，或45-60個氨基酸，或200-300個氨基酸，或300-400個氨基酸?？赏ㄟ^上述同源性多肽序列分析鑒定共有結(jié)構(gòu)域和保守區(qū)。可通過功能互補研究評價多肽用作氮調(diào)節(jié)性多肽的適用性。核酸本文提供了分離核酸。在本文中，術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"可互換使用，它們指RNA和DNA，包括cDNA、基因組DNA、合成的DNA和含有核酸類似物的DNA(或RNA)。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)。核酸可以是雙鏈或單鏈(即正義鏈或反義鏈)。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針和引物、以及核酸類似物。分離核酸可以是(例如)天然產(chǎn)生的DNA分子，如果在天然產(chǎn)生基因組中通常緊密側(cè)接于該DNA分子的核酸序列之一被去除或不存在。因此，分離核酸包括但不限于獨立于其它序列、以單獨分子存在的DNA分子(如化學(xué)合成的核酸，或者聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或限制性核酸內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)。分離核酸也指摻入載體的DNA、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒或摻入原核或真核生物的基因組DNA的DNA分子。此外，分離核酸可包括工程改造的核酸，如作為雜交或融合核酸的一部分的DNA分子。存在于(例如)cDNA文庫或基因組文庫，或含有基因組DNA限制性消化物的凝膠片中的幾百個至幾百萬個其它核酸中的核酸，不被認(rèn)為是分離核酸?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)分離核酸分子。例如，可用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)獲得含有本文所述核苷酸序列的分離核酸。PCR指擴增靶核酸的方法或技術(shù)。可采用PCR從DNA以及RNA中擴增特定序列，包括總基因組DNA或總細(xì)胞RNA中的序列。例如，《PCR引物實驗室手冊》(PCRPrimer:ALaboratoryManual),Dieffenbach和Dveksler編，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995中描述了各種PCR方法。通常，用感興趣區(qū)域末端或更遠(yuǎn)處的序列信息設(shè)計與待擴增模板的反義鏈序列相同或相似的寡核苷酸引物。也可獲得可將位點特異性核苷酸序列修飾引入模板核酸的各種PCR方案?；瘜W(xué)合成的分離核酸可以是單核酸分子(如用亞磷酰胺技術(shù)在3'-5'方向上進行自動DNA合成)或一系列寡核苷酸。例如，可合成含有所需序列的一對或多對長寡核苷酸(如>100個核苷酸)，各對含有互補性短片段(如約15個核苷酸)，以便在寡核苷酸對退火時形成雙鏈體。用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每對寡核苷酸產(chǎn)生單、雙鏈核酸分子，然后可將其連接入載體。也可通過誘變(例如)天然產(chǎn)生的DNA獲得本發(fā)明分離核酸。本文所用術(shù)語"序列相同性百分?jǐn)?shù)"指任何給定査詢序列和主題序列之間的相同程度。主題序列的長度一般大于査詢序列長度的80%，如大于查詢序列長度的82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115或120°/。。用計算機程序ClustalW(1.83版，默認(rèn)參數(shù))對査詢核酸或氨基酸序列和一種或多種主題核酸或氨基酸序列進行比對，在全長上進行核酸或蛋白序列的比對(全局比對)。Chenna等(2003)NucleicAcidsRes31(13):3497-500。ClustalW計算査詢序列和一種或多種主題序列之間的最佳匹配，并通過比對它們測定相同性、相似性和差異?？蓪⒁粋€或多個殘基的缺口插入査詢序列、主題序列或二者中，以最大程度進行序列比對。在核酸序列的快速成對比對中，采用以下默認(rèn)參數(shù)字長2;窗口大小4;評分方法百分?jǐn)?shù)；頂端對角線數(shù)量4;缺口罰分5。在核酸序列的多重比對中，采用以下參數(shù)缺口開放罰分10.0;缺口延伸罰分5.0;重量轉(zhuǎn)換是。在蛋白序列的快速成對比對中，采用以下參數(shù)字長1;窗口大小5;評分方法百分?jǐn)?shù)；頂端對角線數(shù)量5;缺口罰分3。在蛋白序列的多重比對中，采用以下參數(shù)加權(quán)矩陣i央和(bk)SUm);缺口開放罰分10.0;缺口延伸罰分0.05;親水性缺口開；親水性殘基Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys;殘基特異性缺口罰分開。輸出是反映序列間關(guān)系的序列比對。可以在(例如)貝勒藥物研究開拓者學(xué)院網(wǎng)站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和在歐洲|生物信息研究院萬維網(wǎng)址(ebi.ac.uk/clustalw)上運行ClustalW。為了確定查詢序列和主題序列之間的"相同性百分?jǐn)?shù)"，用比對中匹配的堿基或氨基酸的數(shù)量除以匹配和錯配的堿基或氨基酸的總數(shù)，然后乘以100。應(yīng)注意，相同性百分?jǐn)?shù)值可四舍五入至小數(shù)點后一位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入至78.2。也應(yīng)注意，長度值總是整數(shù)。提到核酸時，術(shù)語"外源性"指該核酸是重組核酸構(gòu)建物的一部分，或者不是在其天然環(huán)境下。例如，外源性核酸可以是從一種物種引入另一物種的序列，即異源核酸。一般地，通過重組核酸構(gòu)建物將這種外源性核酸引入其它物種。外源性核酸也可以是某種生物體天然具有并再引入該生物體細(xì)胞的序列。常?？赏ㄟ^連接于該外源性核酸的非天然序列，如側(cè)接重組核酸構(gòu)建物中天然序列的非天然調(diào)控序列的存在，將包含天然序列的外源性核酸與天然存在的序列區(qū)分開來。此外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的外源性核酸一般整合到發(fā)現(xiàn)天然序列的位置以外的位置上。應(yīng)理解，可將外源性核酸引入祖細(xì)胞，而非所研究的細(xì)胞。例如，含有外源性核酸的轉(zhuǎn)基因植物可以是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物和非轉(zhuǎn)基因植物之間雜交的子代。認(rèn)為這種子代含有外源性核酸。本文也提供了重組構(gòu)建物，可用重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞，以調(diào)節(jié)氮水平。重組核酸構(gòu)建物包含編碼本文所述氮調(diào)節(jié)性多肽的核酸，其操作性連接于適于在植物或細(xì)胞中表達此氮調(diào)節(jié)性多肽的調(diào)節(jié)區(qū)。因此，核酸可包含編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4-18和圖1所示共有序列所列的任意氮調(diào)節(jié)性多肽的核苷酸序列。也提供了含有如本文所述核酸的載體。"載體"是復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，其中可能插入了另一DNA節(jié)段，以便復(fù)制插入的節(jié)段。通常，載體與合適的控制元件相連時能夠復(fù)制。合適的載體骨架包括例如本領(lǐng)域常用載體，如質(zhì)粒、病毒、人工染色體、BAC、YAC或PAC。術(shù)語"載體"包括克隆和表達載體，以及病毒載體和整合載體。"表達載體"是包含調(diào)控區(qū)的載體。合適的表達載體包括但不限于質(zhì)粒和衍生自(例如)噬菌體、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載體。許多載體和表達系統(tǒng)可購自諸如Novagen(Madison，WI)，Clontech(PaloAlto,CA)，Stratagene(LaJolla，CA)禾口Invi加gen/LifeTechnologies(Carlsbad,CA)等公司。本文提供的載體也可包括例如，復(fù)制起點、支架附著區(qū)(SAR)和/或標(biāo)記。標(biāo)記基因可使植物細(xì)胞產(chǎn)生選擇性表型。例如，標(biāo)記可產(chǎn)生生物殺傷劑抗性，如抗生素(如卡那霉素、G418、博來霉素或潮霉素)抗性，或除草劑(如氯磺龍(chlorosulfuron)或草胺膦)抗性。此外，表達載體可包括經(jīng)設(shè)計有利于表達多肽的操作或檢測(如純化或定位)的標(biāo)簽序列。標(biāo)簽序列，如綠色熒光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、聚組氨酸、c-myc、血凝素或FlagTM標(biāo)簽(Kodak，NewHaven，CT)序列一般表達為與編碼多肽的融合物。這種標(biāo)簽可插入多肽中的任何位置，包括羧基和氨基末端。調(diào)控區(qū)術(shù)語"調(diào)控區(qū)"指影響轉(zhuǎn)錄或翻譯起始和速率、以及轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的穩(wěn)定性和/或流動性的核苷酸序列。調(diào)控區(qū)包括但不限于啟動子序列、增強子序列、效應(yīng)元件、蛋白識別位點、可誘導(dǎo)元件、蛋白結(jié)合序列、5'和3'非翻譯區(qū)(UTR)、轉(zhuǎn)錄起始位點、終止序列、聚腺苷酸化序列和內(nèi)含子。本文所用術(shù)語"操作性連接"指調(diào)控區(qū)和待轉(zhuǎn)錄序列在核酸中的定位能夠允許或有利于此轉(zhuǎn)錄序列的轉(zhuǎn)錄。例如，為了將編碼序列置于啟動子控制下，一般使多肽的翻譯讀框的翻譯起始位點位于啟動子下游約l-50個核苷酸之間。然而，啟動子可以定位于翻譯起始位點上游多達約5,000個核苷酸處，或者可以定位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約2,000個核苷酸處。啟動子一般包含至少一個核心(基礎(chǔ))啟動子。啟動子也可包含至少一個控制元件，如增強子序列、上游元件或上游激活區(qū)(UAR)。例如，合適的增強子是來自章魚氨酸合酶(ocs)基因上游區(qū)的順式調(diào)控元件(-212至-154)。Fromm等，7TzeCe〃1:977-984(1989)。所包含啟動子的選擇取決于幾項因素，包括但不限于效率、選擇性、誘導(dǎo)性、所需表達水平和細(xì)胞或組織-優(yōu)勢表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常能夠通過根據(jù)編碼序列適當(dāng)?shù)剡x擇和定位啟動子和其它調(diào)控區(qū)來調(diào)節(jié)編碼序列的表達。一些合適啟動子僅僅或主要在某些細(xì)胞類型中啟動轉(zhuǎn)錄。例如，可采用主要在生殖組織(如果實、胚珠、花粉、雌蕊、雌配子體、卵細(xì)胞、中央細(xì)胞、珠心、胚柄、助細(xì)胞、花、胚組織、胚囊、胚、合子、胚乳、珠被或種皮)中有活性的啟動子。因此，本文所用細(xì)胞類型或組織-優(yōu)勢啟動子是在靶組織中優(yōu)先驅(qū)動表達的啟動子，但也可在其它細(xì)胞類型或組織中產(chǎn)生一些表達。鑒定和表征植物基因組DNA中的啟動子區(qū)的方法包括例如以下參考文獻所述的方法Jordano等，PlantCell,1:855-866(1989);Bustos等，PlantCell,1:839-854(1989);Green等，EMBOJ.7,4035-4044(1988);Meier等，PlantCell,3，309-316(1991);和Zhang等，PlantPhysiology110:1069-1079(1996)。下面討論各種類型的啟動子的例子。美國專利申請序列號60/505,689;60/518,075;60/544,771;60/558,869;60/583,691;60/619,181;60/637,140;10/950,321;10/957,569;11/058,689;11/172,703;11/208,308;和PCT/US05/23639中更詳細(xì)地描述了下面所述的一些啟動子。應(yīng)理解，啟動子可以根據(jù)它在一個植物物種中的活性滿足一種分類標(biāo)準(zhǔn)，也可根據(jù)它在另一種植物物種中的活性滿足另一種分類標(biāo)準(zhǔn)。SEQIDNO:19-25列出了啟動子的核苷酸序列。廣泛表達的啟動子當(dāng)啟動子在許多，但不一定是全部植物組織中促進轉(zhuǎn)錄時，稱其為"廣泛表達的"啟動子。例如，廣泛表達啟動子可啟動芽、芽尖(頂端)和葉的一種或多種操作性連接序列的轉(zhuǎn)錄，但在諸如根或莖等組織中促進轉(zhuǎn)錄的程度弱或根本不促進轉(zhuǎn)錄。另一個例子是，廣泛表達啟動子可促進莖、芽、芽尖(頂端)和葉的一種或多種中操作性連接序列的轉(zhuǎn)錄，但在諸如花或發(fā)育種子等生殖組織中促進轉(zhuǎn)錄的程度弱或根本不促進轉(zhuǎn)錄。本文所提供核酸構(gòu)建物中可包含的廣泛表達啟動子的非限制性例子包括p326(SEQIDNO:19)、YP0144(SEQIDNO:20)、YP0190(SEQIDNO:21)、pl3879(SEQIDNO:22)、YP0050(SEQIDNO:23)、p32449(SEQIDNO:24)、21876(SEQIDNO:25)、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848和PT0633啟動子。其它例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、甘露氨酸合酶(MAS)啟動子、獲自根癌土壤桿菌(v4gra6。"m'"w^we/ade似)的T-DNA的l'或2'啟動子、玄參花葉病毒34S啟動子、肌動蛋白啟動子如稻米肌動蛋白啟動子和泛素啟動子如玉米泛素-1啟動子。在一些情況下，廣泛表達的啟動子不包括CaMV35S啟動子。根啟動子根活性啟動子在根組織，如根內(nèi)皮層、根表皮或根維管組織中產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄。在一些實施方式中，根活性啟動子是根-優(yōu)選啟動子，即僅僅或主要在根組織中產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄。根-優(yōu)選啟動子包括YP0128、YP0275、PT0625、PT0660、PT0683和PT0758啟動子。其它根-優(yōu)選啟動子包括PT0613、PT0672、PT0678、PT0688和PT0837啟動子，這些啟動子主要在根組織中驅(qū)動轉(zhuǎn)錄，在胚珠和/或種子中的驅(qū)動作用較弱。根-優(yōu)勢啟動子的其它例子包括CaMV35S啟動子的根特異性亞域(Lam等，尸rac.A^/.Jcfldt/W86:7890-7894(1989))、Conlding等，PlantPhysiol.93:1203-1211(1990)報道的根細(xì)胞特異性啟動子和煙草RD2基因啟動子。IH在成熟的胚乳的啟動子在一些實施方式中，可釆用在正在成熟的胚乳中驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的啟動子。正在成熟的胚乳的啟動子轉(zhuǎn)錄一般在授精后開始，主要在種子發(fā)育期間的胚乳組織中發(fā)生，一般在細(xì)胞化階段中活性最高。最合適的是在正在成熟的胚乳中有優(yōu)勢活性的啟動子，但有時也可采用也在其它組織中有優(yōu)勢活性的啟動子。本文所提供核酸構(gòu)建物中可包含的正在成熟的胚乳的啟動子的非限制性例子包括油菜籽蛋白啟動子、Arcelin-5啟動子、菜豆蛋白基因啟動子(Bustos等，尸/朋？Ce〃1(9):839-853(1989))、大豆胰蛋白酶抑制劑啟動子(Riggs等，尸/fl^Ce//1(6):609-621(1989))、ACP啟動子(Baerson等，P/aWMo/編.22(2):255-267(1993))、硬脂酰-ACP去飽和酶基因(Slocombe等，P/挺尸一o/104(4):167-176(1994))、卩-伴大豆球蛋白的大豆a亞基啟動子(Chen等，7VocA^Mc"fl^c/t/W83:8560-8564(1986))、油質(zhì)蛋白啟動子(Hong等，尸/fl^Mo/所o/34(3):549-555(1997))以及玉米醇溶蛋白啟動子，如15kD玉米醇溶蛋白啟動子、16kD玉米醇溶蛋白啟動子、19kD玉米醇溶蛋白啟動子、22kD玉米醇溶蛋白啟動子和27kD玉米醇溶蛋白啟動子。其它合適的啟動子是稻米谷蛋白-l基因的Osgt-l啟動子(Zheng等，Mo/Ce〃歷o/.13:5829-5842(1993))、p-淀粉酶基因啟動子和大麥醇溶蛋白基因啟動子。其它正在成熟的胚乳的啟動子包括YP0092、PT0676和PT0708啟動子。子房組織啟動子也可采用在子房組織如胚珠壁和中果皮中有活性的啟動子，如聚半乳糖醛酸酶啟動子、香蕉TRX啟動子和甜瓜肌動蛋白啟動子。胚囊/早期胚乳啟動子為了實現(xiàn)在胚囊/早期胚乳中表達，可采用在極核和/或中央細(xì)胞中、或在極核前體(precursor)中有活性，但在卵細(xì)胞或卵細(xì)胞前體中無活性的調(diào)節(jié)區(qū)。大多數(shù)合適的啟動子是僅僅或主要在極核或其前體和/或中央細(xì)胞中驅(qū)動表達的啟動子。也可在從極核延伸到早期胚乳發(fā)育的轉(zhuǎn)錄模式中發(fā)現(xiàn)胚囊/早期胚乳-優(yōu)勢啟動子，但細(xì)胞化階段其間或之后的晚期胚乳發(fā)育中轉(zhuǎn)錄一般顯著降低。合子或正在發(fā)育的胚中的表達一般與胚囊/早期胚乳啟動子無關(guān)?？赡芎线m的啟動子包括衍生自以下基因的啟動子擬南芥viviparous-l(參見GenBank編號U93215);擬南芥atmycl(參見Urao(1996)尸/a"fMo/.5/o/，32:571-57;Conceicao(1994)尸/a""5:493-505);擬南芥FIE(GenBank編號AF129516);擬南芥MEA;擬南芥FIS2(GenBank編號AF096096);和FIEU(美國專利6,906,244)?？赡芎线m的其它啟動子包括衍生自以下基因的啟動子玉米MAC1(參見Sheridan(1996)Genetics,142:1009-1020);玉米Cat3(參見GenBank編號L05934;Abler(1993)尸/a"fMo/.Ao/，22:10131-1038)。其它啟動子包括以下擬南芥啟動子YP0039、YP0101、YP0102、YP0110、YP0117、YP0119、YP0137、DME、YP0285和YP0212?？梢圆捎玫钠渌鼏幼影ㄒ韵碌久讍幼觩530cl0、pOsFIE2-2、pOsMEA、pOsYpl02和pOsYp285。胚啟動子優(yōu)勢驅(qū)動受精后合子細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)可提供胚優(yōu)勢表達。最合適的啟動子是優(yōu)勢驅(qū)動心期之前早期胚中轉(zhuǎn)錄的啟動子，但驅(qū)動晚期和正在成熟的胚中的表達的啟動子也適用。胚優(yōu)勢啟動子包括大麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Ltpl)啟動子(PlantCellRep(2001)20:647-654)。有光合活性的組織啟動子有光合活性的組織啟動子在光合活性組織如葉和莖中產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)合適的啟動子是僅僅或主要在這些組織中驅(qū)動表達的啟動子。這種啟動子的例子包括核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶(RbcS)啟動子如美洲落葉松(丄ahx/an'c/"a)的RbcS啟動子，松樹cab6啟動子(Yamamoto等，PlantCellPhysiol,35:773-778(1994))，小麥的Cab-l基因啟動子(Fejes等，PlantMol.Biol15:921-932(1990))，菠菜的CAB-1啟動子(Lubberstedt等，PlantPhysiol.104:997-1006(1994))，水稻的cablR啟動子(Luan等，PlantCell4:971-981(1992))，玉米的丙酮酸正磷酸鹽二激酶(PPDK)啟動子(Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:9586-9590(1993))，煙草Lhcbl*2啟動子(Cerdan等，PlantMol.Biol.33:245-255(1997))，擬南芥(^ra/j/Jo;^Aa"a"a)SUC2蔗糖-H+協(xié)同轉(zhuǎn)運啟動子(Truernit等，Planta.196:564-570(1995))和菠菜的類囊體膜蛋白啟動子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)型啟動子響應(yīng)于外界刺激如化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境刺激產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄。例如，誘導(dǎo)型啟動子可響應(yīng)于激素如赤霉酸或乙烯、或響應(yīng)于光照或干旱產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄?；A(chǔ)啟動子基礎(chǔ)啟動子是裝配啟動轉(zhuǎn)錄所需轉(zhuǎn)錄復(fù)合物所必需的最小序列?；A(chǔ)啟動子常包括"TATA框"元件，可定位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約15-35個核苷酸之間?；A(chǔ)啟動子也可包括"CCAAT框"元件(一般是序列CCAAT)和/或GGGCG序列，它可定位于轉(zhuǎn)錄起始.位點上游約40-200個核苷酸之間，一般約60-120個核苷酸之間。其它啟動子其它類型的啟動子包括但不限于葉-優(yōu)勢、莖/芽-優(yōu)勢、愈傷組織-優(yōu)勢和衰老-優(yōu)勢的啟動子。也可采用稱為YP0086、YP0188、YP0263、PT0758、PT0743、PT0829、YP0119和YP0096的啟動子，如上述專利申請中所述。其它調(diào)控區(qū)本文所述的核酸構(gòu)建物中可包含5'非翻譯區(qū)(UTR)。5'UTR被轉(zhuǎn)錄但不被翻譯，該非翻譯區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點和翻譯起始密碼子之間，可包括+l核苷酸。3'UTR可位于翻譯終止密碼子和轉(zhuǎn)錄物末端之間。UTR可具有特別功能，如提高mRNA信使穩(wěn)定性或弱化翻譯。3'UTR的例子包括但不限于聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列，如胭脂氨酸合酶終止序列。應(yīng)理解，重組多核苷酸中可存在一種以上調(diào)控區(qū)，如內(nèi)含子、增強子、上游激活區(qū)、轉(zhuǎn)錄終止子和誘導(dǎo)元件。因此，一種以上調(diào)控區(qū)可操作性連接于編碼碳調(diào)節(jié)性多肽的多核苷酸序列?？p鵬激鵬激雄本發(fā)明也提供了含有本文所述至少一種重組核酸構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物?？赏ㄟ^將構(gòu)建物整合入基因組轉(zhuǎn)化，即可穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在每次細(xì)胞分裂中一般都能保留引入的核酸。也可瞬時轉(zhuǎn)化該植物或植物細(xì)胞，以便使構(gòu)建物不整合入其基因組。瞬時轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在每次細(xì)胞分裂中一般會丟失所引入核酸的全部或一部分，以致于在足夠次數(shù)的細(xì)胞分裂后不能在子細(xì)胞中檢測到引入的核酸。瞬時轉(zhuǎn)化的和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞都可用于本文所述方法。本文所述方法所用的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞構(gòu)成了整個植物的一部分或全部?？捎眠m合于所研究物種的方式，在培養(yǎng)箱、溫室或田野中培養(yǎng)所述植物?？筛鶕?jù)特定目的，如將重組核酸引入其它品系、將重組核酸轉(zhuǎn)移至其它物種或進一步選擇其它所需性狀的需要培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物?；蛘?，對于適應(yīng)這種技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物種類，可進行無性繁殖。子代包括特定植物或植物品系的子代。現(xiàn)有植物的子代包括F,、F2、F3、F4、F5、F6和子代植物，或BCpBC2、BC3和子代植物形成的種子，或F,BC"F,BC2、FjBC3和子代植物形成的種子。代號Fi指遺傳學(xué)上不同的兩種親代的雜交子代。代號F2、F3、F4、F5和F6指F,植株的自花授粉或同胞授粉的子代。可培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，然后使其自花授粉(或異型雜交并自花授粉)，以獲得核酸構(gòu)建物純合的種子?？稍趹腋∨囵B(yǎng)物、或者組織或器官培養(yǎng)物中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物。出于本發(fā)明目的，可采用固體和/或液體組織培養(yǎng)技術(shù)。采用固體培養(yǎng)基時，可將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞直接放置在培養(yǎng)基上，或可放置在接觸培養(yǎng)基的濾膜上。采用液體培養(yǎng)基時，可將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞放置在漂浮裝置，如接觸液體培養(yǎng)基的多孔膜上。一般通過加入瓊脂由液體培養(yǎng)基制備固體培養(yǎng)基。例如，固體培養(yǎng)基可以是含有瓊脂以及合適濃度的生長素如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和合適濃度的細(xì)胞分裂素如激動素的Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基。采用瞬時轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞時，轉(zhuǎn)化方法中可包括編碼具有報道物活性的報道多肽的報道序列，可在轉(zhuǎn)化后的適當(dāng)時機檢測報道物活性或表達。進行檢測的適當(dāng)時機一般是轉(zhuǎn)化后約1-21天，如約1-14天、約1-7天或約1-3天。對于在不同物種中進行快速分析，或要驗證以前沒有在具體受體細(xì)胞中驗證表達的異源氮調(diào)節(jié)性多肽的表達而言，采用瞬時測定特別方便。本領(lǐng)域已知將核酸引入單子葉植物和雙子葉植物的技術(shù)，包括但不限于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔和基因槍轉(zhuǎn)化，如美國專利5,538,880;5,204,253;6,329,571和6,013,863所述。如果細(xì)胞或培養(yǎng)組織用作轉(zhuǎn)化的受體組織，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知技術(shù)由轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物再生植物(如果需要)。澄餅類本文所述的多核苷酸和載體可用于轉(zhuǎn)化許多單子葉和雙子葉植物以及植物細(xì)胞系統(tǒng)，包括雙子葉植物，如苜蓿、莧菜、蘋果、豆類(包括菜豆、利馬豆、干豆、青豆)、花椰菜、甘藍、胡蘿卜、蓖麻子、櫻桃、鷹嘴豆、菊苣、車軸草、可可、叻卩啡、棉花、海甘藍、亞麻、葡萄、柚子、檸檬、小扁豆、萵苣、亞麻籽、芒果、瓜類(如西瓜、哈密瓜)、芥菜、橙、桃、花生、梨、豌豆、胡椒、李子、馬鈴薯、油菜、油菜籽(高芥酸和菜籽油)、紅花、芝麻、大豆、菠菜、草莓、甜菜、向日葵、甘薯、茶、番茄和薯蕷，以及單子葉植物如香蕉、大麥、早熟未、海棗、羊茅、非甜質(zhì)玉米、大蒜、粟、燕麥、油椰、洋蔥、菠蘿、爆裂種玉米、水稻、黑麥、黑麥草、高粱、蘇丹草、甘蔗、甜玉米、柳枝稷、梯牧草和小麥。也可采用褐藻、綠藻、紅藻和微藻類。因此，本文所述的方法和組合物可用于(例如)屬于以下目的雙子葉植物傘形目04/7/a/e力、檳榔目04recaks)、馬先鈴目(A/Woc/uWe力、菊目04說ra/es)、肉穗果目C8ato/es)、桔梗目(Garo;a"M/fl/e力、白花菜目(Cap/ara/e51)、石竹目(Ca70/7/y;〃a/es)、木麻黃目(OwwaWwfl/w)、衛(wèi)矛目(Ce/aWra/es)、山茱萸目(Coma/e力、葫戸目(Cwcwr6/to/e51)、巖梅目(Z)/opeww.a/e力、五極果目(D/〃em.a/e力、續(xù)斷目(Djrjtwaca/es)、柿樹目(五6e"aks)、杜鵑花目(五r/ca/e力、杜仲目CEwcom/a/e力、大戟目(五w;/2or6Zafes)、豆目(Fa6fl/e"、山毛櫸目(Faga/e力、龍膽目(Ge油'a"a/w)、櫳牛兒苗目(Geram'a/e力、小二仙草目(/fo/oragfl/e力、金縷梅目(7/amflme/Wa/e"、八角目(/Wd。/e力、胡桃目(Jwg/a"t/a/e力、脣形目(丄aw,a/e力、樟目(丄awra/e51)、玉蔬目(丄ecy^/ctofey)、銀毛木目(L"Y"en'a/e力、亞麻目(Lz'"a/e力、木蘭目(Magwo"a/e力、錦葵目(Ma/va/e力、楊梅目(M,/cfl/e力、桃金娘目(Myrta/e力、睡蓮目(A(ym;/zaea/e力、罌粟目(尸印everafey)、胡椒目(尸^era/es)、車前目(尸/awtog/"a/e51)、白花丹目(/wm6ag/wa/es)、川苔草目(Pocfcwfem(3/es)、花蔥目(尸o/ewo"/a/es)、遠(yuǎn)志目(尸o(yga/a/es)、蓼目(尸0/3;g0wa/e力、報春花目(尸Wmw/a/e力、山龍眼目(尸rafea/e力、大花草目(iq^7^/a/es)、毛茛目(ia"wcw/(3/ey)、鼠李目C//zow"a/es)、薔薇目(icwa/e力、茜草目(iw6/a/e力、楊賴卩目OSa/Zca/es^檀香目OSa"tofes)、無患子目(Sa//"da/es)、瓶子草禾斗(iSarracem'aceae)、玄參目(iS"cra//m/fln'a/es)、茄目(5b/aro3/es)、昆欄樹目(rrac/zocfe"(ira/e51)、山茶目(T7zea/e力、傘形目([/附^/^/^)、蕁麻目(t/Wca/^)和堇菜目(7/o/fl/es)。本文所述的方法和組合物也可用于(例如)屬于以下目的單子葉植物澤瀉目04/z'，fltofe)、天南星目04ra/w)、棕櫚目(Jwca/e力、天門冬目G^/araga/e力、鳳梨目CSrame/Za/^)、鴨跖草目(Comwe/Z"a/e力、環(huán)花草目(Cyc/awfAa/es)、莎草目(C[y;era/e力、谷精草目(￡WocaM/a/ej)、水鱉目(//;^rac/2ar/to/M)、燈心草目C/w"ca/")、百合目(h7/aks)、茨藻目(A^/fl由/e力、蘭目(Oc/z/cto/e力、露兜樹目(尸a"cfa"a/e力、禾本目(尸oa/e力、帚燈草目(ie幼'o"a/e"、霉草目(7H"n'ctofey)、香蒲目(7^/za/M)、姜目(Z/"gZ6erafe)和屬于裸子植物門，如蘇鐵目(Q;cfl^/e"、銀杏目(G/dgoa/e力、買麻藤目(G"etofe)和松杉目CP/"a/e力的植物。所述方法和組合物可用于一大類植物物種，包括以下雙子葉植物屬的物種莧屬04mara"f/7M)、花生屬、蕓苔屬、金盞花屬(Ca/eM"/fl)、山茶屬(07附￡//&)、辣椒屬(Ca;w/c"m)、紅花屬(CaW/zamw)、鷹嘴豆屬(C/ce。、菊苣屬(C/z/con'ww)、樟屬(a""amom"m)、柑桔屬(0>"力、西瓜屬(C"ra〃w)、咖啡屬(Cq^ea)、兩節(jié)薺屬(Cram6e)、香瓜屬(Cwcwm/5)、南瓜屬(Cwcw/^Ya)、胡蘿卜屬CDa"cz^)、薯蕷屬(Z)/ascorea)、草莓屬(Fragaha)、大豆屬、棉屬、向日葵屬、萵苣屬、兵豆屬CLew)、亞麻屬(Zim/m)、番茄屬、蘋果屬(Ma/w)、杧果屬(Ma"p/era)、苜蓿屬、薄荷屬(MeW/za)、煙草屬(vV〖co"a"fl)、羅勒屬(Odmwm)、木犀欖屬(0/ea)、菜豆屬(尸/zayeo/^)、黃連木屬(尸&toc/a)、豌豆屬、李屬(尸n^ms)、梨屬(尸,w力、迷迭香屬(^wman'"w力、鼠尾草屬(Sa/v〖a)、胡麻屬(Sesamwm)、茄屬、菠菜屬C"ac/a)、可可屬(77zeo6rama)、百里香屬(77z;w^)、三葉草屬(7>7/0//1^)、越桔屬(7accZm'wm)、豇豆屬(ngwa)和葡萄屬；以及以下單子葉植物屬的種類蔥屬(^tom)、鳳梨屬(^"am^)、天門冬屬(^^ragw力、燕麥屬04ve"a)、姜黃屬(Cw/rwma)、油棕屬(五/ae/力、羊茅屬(尸eWwca)、大麥屬(//onieww)、浮萍屬(LemMa)、黑麥草屬CLo/Zwm)、芭蕉屬(Mwa)、稻屬(Oo;za)、黍?qū)貱Pam'cwm)、狼尾草屬CPe""&"Mm)、梯牧草屬(尸/z/eww)、早熟禾屬(尸oa)、甘蔗屬0acc/za;^m)、黑麥屬(&ca/e)、高粱屬(&rg/mm)、小黑麥屬(7hWc(weca/e)、小麥屬(7hYZcwm)和玉蜀黍?qū)?Zea)。本文所述方法和組合物也可用于褐藻，如泡葉藻(^JCO/7/^/"m"O^W畫)、墨角藻ves/cM/os—、齒緣墨角藻(尸wcz^serra加)、延伸海條藻(///腸涵。//0e/owg她)和裙帶菜(t/"^n'ap/""油ycfl);紅藻，如皺葉角叉菜(C/7o"afmycWs;w力、江蘺(Gracz7aWcrve/rwcora)、臍形紫菜(尸or;/^rawmZn7/ca〃s)禾口掌狀紅皮藻(尸a/man'a/a/mato);綠藻，如稱苔(￡"^"0附0^7/^15/;7.)和石莼(^//^^/7/.);以及微藻，如螺旋藻(5^>M//"a取)(鈍頂螺旋藻/7toe肌;y)和極大螺旋藻(S.mccdma))和長耳齒狀藻(CWo"fe〃aflwnYa)。此外，該方法和組合物還可用于寇氏隱甲藻(Co^^eco^m'wmc。/z"/Z)、裂壺藻(ScA,z0c/7yfr/w;w)禾口雨生血球藻(Z/ae附fltococcwj//wvfa/51)。在一些實施方式中，植物是以下物種之一的成員鳳梨04mm^comomy)、蕓苔(5ra^M/cflcam/7eWn'力、歐洲油菜(5rawZca"ap^)、甘藍C6ra557'ca0/eracea)、大豆(G7yc/"em"x)、棉(Gom，/謂'，;.)、萵苣(Aa"wcaW/vfl)、番茄(Z^co/em'co"esra/e她m)、粉芭蕉(M"j"/flrafifa,flcfl)、禾萏(O，fl虛/va)、馬鈴薯0S"o/朋廳？w6e履謂)、普通小麥(7h'"c謂aest/v顧)、葡萄(版51Wm/era)或玉蜀黍(Zeaw，)0滯纖靜性多,表這財法本文所述多核苷酸和重組載體可用于在感興趣的植物物種中表達氮調(diào)節(jié)性多肽或抑制其表達。術(shù)語"表達"指將多核苷酸遺傳信息通過由RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)化為RNA和通過在核糖體上翻譯mRNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的過程。"上調(diào)"或"激活"指相對于基礎(chǔ)或天然狀態(tài)提高表達產(chǎn)物(mRNA、多肽、或二者)的產(chǎn)量的調(diào)控作用，而"下調(diào)"或"抑制"指相對于基礎(chǔ)或天然狀態(tài)降低表達產(chǎn)物(mRNA、多肽、或二者)的產(chǎn)量的調(diào)控作用。可采用許多基于核酸的方法，包括反義RNA、核酶定向的RNA切割和RNA干擾(RNAi)來抑制植物中的蛋白質(zhì)表達。反義技術(shù)是一種熟知的方法。在此方法中，克隆來自內(nèi)源性基因的核酸節(jié)段并操作性連接于啟動子，以便轉(zhuǎn)錄RNA的反義鏈。然后，如上所述將重組載體轉(zhuǎn)化到植物中，產(chǎn)生RNA的反義鏈。核酸節(jié)段不需要是待抑制內(nèi)源性基因的整個序列，但一般與至少一部分待抑制內(nèi)源性基因基本相同。通常，使用的序列越短，可使用更高的同源性補償。一般采用至少30個核苷酸的序列(如至少40、50、80、100、200、500個核苷酸或更多)。因此，例如，本文提供的分離核酸可以是編碼氮調(diào)節(jié)性多肽，如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4-18或圖1所示共有序列的一種上述核酸的反義核酸。將能降低氮調(diào)節(jié)性多肽編碼基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物水平的核酸轉(zhuǎn)錄為與氮調(diào)節(jié)性多肽的正義編碼序列相似或相同的反義核酸?；蛘撸蛛x核酸的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能與氮調(diào)節(jié)性多肽的正義編碼序列相似或相同，但它是未聚腺苷酸化的RNA，缺少5'帽結(jié)構(gòu)，或含有不可剪接的內(nèi)含子。在另一方法中，核酸可轉(zhuǎn)錄為能影響mRNA表達的核酶或催化性RNA。(參見美國專利號6,423,885)?？梢栽O(shè)計核酶，使其基本上能與任何靶RNA特異性配對并在特異性位點上切割磷酸二酯鍵骨架，從而使該靶RNA功能性失活。異源核酸可編碼設(shè)計用于切割特定mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶，從而防止多肽的表達。錘頭核酶可用于破壞特定mRNA，盡管可采用在位點特異性識別序列上切割mRNA的各種核酶。錘頭核酶在與靶mRNA形成互補堿基對的側(cè)接區(qū)所示位置上切割mRNA。唯一的要求是靶RNA含有5'-UG-3'核苷酸序列。錘頭核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國專利號5,254,678和WO02/46449和其中引用的參考文獻。錘頭核酶序列可嵌入穩(wěn)定的RNA如轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)中，以提高體內(nèi)切割效率。Perriman等，戶roc.淑/.加"c/.園，92(13):6175-6179(1995);deFeyter和Gaudron，《分子生物學(xué)方法》(MethodsinMolecularBiology),第74巻，第43章，"在植物中表達核酶"(ExpressingRibozymesinPlants),Turner,P.C編，HumanaPressLie.，Totowa，NJ?？刹捎肦NA核糖核酸內(nèi)切酶如嗜熱四膜蟲(rwra/7;;me加Ae;7770/7Ma)中天然存在的RNA核糖核酸內(nèi)切酶，Cech和同事對其進行詳盡描述。參見例如，美國專利號4,987,071?？舍娪没赗NA干擾(RNAi)的方法。RNA干擾是調(diào)節(jié)基因表達和病毒復(fù)制的細(xì)胞學(xué)機制。人們認(rèn)為此機制由雙鏈小干擾RNA分子介導(dǎo)。細(xì)胞對這種雙鏈RNA的反應(yīng)是破壞與此雙鏈RNA序列相同的內(nèi)源性RNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道設(shè)計和制備干擾RNA的方法；參見例如，WO99/32619和WO01/75164。例如，可制備包含能轉(zhuǎn)錄成干擾RNA的序列的構(gòu)建物。這種RNA可以是可與本身退火的RNA，如具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA。雙鏈RNA的莖部分的一條鏈包含與感興趣多肽的正義編碼序列相似或相同的序列，該序列的長度約為10-2,500個核苷酸。與正義編碼序列相似或相同的序列的長度可以是10-500個核苷酸、15-300個核苷酸、20-100個核苷酸、或者25-100個核苷酸。雙鏈RNA的莖部分的另一條鏈包含感興趣氮調(diào)節(jié)性多肽的反義序列，與對應(yīng)的正義序列的長度相比，其長度可以較短、相同或較長。雙鏈RNA的環(huán)部分的長度可以為10-5,000個核苷酸，如15-1，000個核苷酸、20-500個核苷酸，或者25-200個核苷酸。RNA的環(huán)部分可包含內(nèi)含子。參見例如，WO99/53050。在一些用于抑制植物基因表達的基于核酸的方法中，合適的核酸可以是核酸類似物。核酸類似物可能是在堿基部分、糖部分或磷酸骨架上被修飾，以提高(例如)核酸的穩(wěn)定性、雜交能力或溶解度。堿基部分的修飾包括脫氧尿苷取代脫氧胸苷，和5-甲基-2'-脫氧胞苷和5-溴-2'-脫氧胞苷取代脫氧胞苷。糖部分的修飾包括修飾核糖的2'羥基以形成2'-0-甲基或2'-0-烯丙基糖?？尚揎椕撗鹾颂橇姿峁羌墚a(chǎn)生嗎啉代核酸(其中各堿基部分連接于六元嗎啉代環(huán))或肽核酸(其中脫氧磷酸骨架被假肽主鏈取代，并且保留4種堿基)。參見例如，Summerton和Weller,1997，爿w&mse7V"c/e/c」cWZ>wg￡>ev,，7:187-195;Hyrup等，1996，MedOzem.，4:5-23。此外，脫氧磷酸骨架可被(例如)硫代磷酸或二硫代磷酸骨架、磷酸亞酰胺、或烷基磷酸三酯主鏈取代。縫鵬歸盧可通過選擇或篩選工程改造的植物物質(zhì)的特定性狀或活性，如標(biāo)記基因或抗生素抗性基因編碼的性狀或活性，來鑒定和分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞、愈傷組織、組織或植物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知這種篩選和選擇方法。此外，可用物理和生化方法鑒定轉(zhuǎn)化子。這些方法包括用于檢測多核苷酸的Southern分析或PCR擴增；用于檢測RNA轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡、S1RNA酶保護、引物延伸或RT-PCR擴增；用于檢測多肽或多核苷酸的酶活性或核酶活性的酶學(xué)試驗；以及用于檢測多肽的蛋白質(zhì)凝膠電泳、Western印跡、免疫沉淀和酶聯(lián)免疫試驗。也可采用其它技術(shù)如原位雜交、酶染色和免疫染色來檢測多肽和/或多核苷酸的存在或表達。進行所有這些技術(shù)的方法都是熟知的。與缺少轉(zhuǎn)基因或不表達轉(zhuǎn)基因的相應(yīng)對照植物相比，轉(zhuǎn)基因植物可具有改變的表型。多肽在植物(如轉(zhuǎn)基因植物)中在例如合適的時間、合適的組織中或以合適的表達水平表達時，可影響植物的表型?？上鄬τ诓槐磉_感興趣的外源性多核苷酸的對照植物，如對應(yīng)的野生型植物、未轉(zhuǎn)入感興趣的外源性多核苷酸但與感興趣的轉(zhuǎn)基因植物遺傳背景相同的對應(yīng)植物、或降低、抑制或未誘導(dǎo)多肽表達(如表達處于誘導(dǎo)型啟動子的控制下)的遺傳背景相同的對應(yīng)植物，來評價表型影響。當(dāng)植物產(chǎn)生的多肽量或編碼該多肽的mRNA量是感興趣植物所產(chǎn)生量的10%以下，如9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%以下時，稱該植物"不表達"該多肽?？捎靡韵路椒ㄔu價表達，包括例如RT-PCR、Northern印跡、SIRNA酶保護、引物延伸、Western印跡、蛋白質(zhì)凝膠電泳、免疫沉淀、酶聯(lián)免疫試驗、芯片試驗和質(zhì)譜。應(yīng)注意，如果多肽在組織特異性或廣泛表達的啟動子的控制下表達，可在整個植物或所選組織中評價表達。相似地，如果多肽在特定時間表達，如在發(fā)育中或誘導(dǎo)后的特定時間表達，則可在所需時間上選擇性評價表達。在一些實施方式中，氮調(diào)節(jié)性多肽表達被調(diào)節(jié)的植物可具有提高的種子氮水平。例如，本文所述氮調(diào)節(jié)性多肽可在轉(zhuǎn)基因植物中表達，導(dǎo)致種子氮水平升高。與不表達該轉(zhuǎn)基因的相應(yīng)對照植物的種子氮水平相比，種子氮水平可升高至少5%，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100%、或大于100%。在一些實施方式中，氮調(diào)節(jié)性多肽表達被調(diào)節(jié)的植物可具有降低的種子氮水平。與不表達該轉(zhuǎn)基因的相應(yīng)對照植物的種子氮水平相比，種子氮水平可降低至少5%，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50%、或大于50%。調(diào)節(jié)種子氮水平可能對其有用的植物包括但不限于苜蓿、萵苣、胡蘿卜、洋蔥、花椰菜、番茄、馬鈴薯、甘蔗、葡萄、棉花、菜籽油(canola)、甜玉米、爆裂種玉米、非甜質(zhì)玉米、豌豆、豆類、紅花、大豆、咖啡、莧菜、油菜籽、花生、向日葵、油椰、小麥、黑麥、大麥、燕麥、水稻、粟、草莓、菠蘿、瓜類、桃、梨、蘋果、櫻桃、橙、檸檬、柚子、李子、芒果、香蕉、羊茅、黑麥草、早熟禾、三葉草、梯牧草、蘇丹草、柳枝稷和高粱。這些植物中種子氮增加可提高蛋白質(zhì)/氨基酸的飲食攝入量常常不足的地區(qū)的營養(yǎng)供給量。這些植物中種子氮減少可用于種子不是收獲用于人類或動物消耗的主要植物部分的情況。在一些實施方式中，氮調(diào)節(jié)性多肽表達受調(diào)節(jié)的植物的一種或多種非種子組織，如種子以外的葉組織、莖組織、根或球莖組織或果實組織中氮水平可提高或降低。例如，與不表達該轉(zhuǎn)基因的相應(yīng)對照植物的種子氮水平相比，氮水平可提高至少5%，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100%、或大于100%。在一些實施方式中，氮調(diào)節(jié)性多肽表達受調(diào)節(jié)的植物的一種或多種非種子組織中的氮水平可降低。與不表達該轉(zhuǎn)基因的相應(yīng)對照植物的種子氮水平相比，氮水平可降低5%，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或大于50%。調(diào)節(jié)非種子組織的氮水平可能對其有用的植物包括但不限于苜蓿、萵苣、胡蘿卜、洋蔥、花椰菜、番茄、馬鈴薯、甘蔗、葡萄、甜玉米、爆裂種玉米、非甜質(zhì)玉米、豌豆、豆類、紅花、大豆、咖啡、莧菜、油菜籽、花生、向日葵、油椰、小麥、黑麥、大麥、燕麥、水稻、粟、草莓、菠蘿、瓜類、桃、梨、蘋果、櫻桃、橙、檸檬、柚子、李子、芒果、香蕉、羊茅、黑麥草、早熟禾、三葉草、梯牧草、蘇丹草、柳枝稷和高粱。這些植物中非種子氮增加可提高食用水果和蔬菜中的營養(yǎng)含量，或改進動物飼料。非種子氮減少可使氮更有效地分配到收獲用于人類或動物消耗的植物部分中。一般地，用合適的參數(shù)或非參數(shù)統(tǒng)計，如X2檢驗、Student'st-檢驗、Mann-Whitney檢驗或F-檢驗測得p^).05時，認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞相對于對照植物或細(xì)胞的氮含量差異(如增加)有統(tǒng)計學(xué)顯著性。在一些實施方式中，p<0.01、p<0.005或p〈0.001時，氮含量的差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。轉(zhuǎn)基因植物的種子中氮含量與對照植物的細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異表明(1)轉(zhuǎn)基因植物中存在的重組核酸導(dǎo)致氮水平改變和/或(2)應(yīng)該作為改變植物氮含量的候選物進一步研究重組核酸。劍〃S本文也提供了可包括(例如)來自本文所提供轉(zhuǎn)基因植物的種子混合物(如基本均一的種子混合物)的制品。可用本領(lǐng)域已知方式調(diào)整和包裝種子混合物，以制備制品。種子的包裝可具有標(biāo)簽,，如固定在包裝材料上的標(biāo)記或標(biāo)簽、打印在包裝材料上的標(biāo)簽或插入包裝中的標(biāo)簽。標(biāo)簽中可說明，由此包裝中所含種子長出的植物可產(chǎn)生種子氮水平高于對應(yīng)對照植物的作物。在以下實施例中進一步描述本發(fā)明，這些實施例不會限制權(quán)利要求書所述的本發(fā)明范圍。實施例錯伊"一縫離激實施例中采用以下符號T1:第一代轉(zhuǎn)化子；T2:第二代，自花授粉的T,植株的子代；T3:第三代，自花授粉的l2植株的子代；T4:第四代，自花授粉的T3植株的子代。將獨立轉(zhuǎn)化稱為事件。以下核酸分離自擬南芥C4ra6Wo/w^纟/^//""")生態(tài)型Wassilewskija(Ws)植株。CerescDNAID2998984(SEQIDNO:l)是預(yù)計編碼505個氨基酸的(SEQIDNO:2)推定寡肽轉(zhuǎn)運多肽的基因組DNA克隆。Ceres克隆117581(cDNAID23364185;SEQIDNO:3)是預(yù)計編碼587個氨基酸的(SEQIDNO:4)推定肽轉(zhuǎn)運多肽的cDNA克隆。將上述各分離多核苷酸克隆入含有草胺膦乙?；D(zhuǎn)移酶基因的載體中，該載體能使轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生FinaleTM抗性。構(gòu)建含有操作性連接于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S調(diào)控區(qū)的CerescDNAID2998984或Ceres克隆117581的NB42-35S雙載體。NB42-35S雙載體是pMOG800雙載體的衍生物。用含有CerescDNAID2998984或Ceres克隆117581的NB42-35S雙載體各自轉(zhuǎn)化野生型擬南芥生態(tài)型C24植株?；旧习凑誃echtold等，CT.^c^i尸w&，316:1194-1199(1993)所述進行轉(zhuǎn)化。含有CerescDNAID2998984或Ceres克隆117581的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系分別稱為SR00829和SR05001。通過FinaleTM抗性、由綠葉組織提取物進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增和對PCR產(chǎn)物進行測序驗證了SR00829中存在CerescDNAID2998984載體，并且SR05001存在Ceres克隆117581載體。作為轉(zhuǎn)基因擬南芥生態(tài)型C24植株的對照，用空載體NB42-35S轉(zhuǎn)化野生型擬南芥生態(tài)型C24植株。將CerescDNAID2998984和Ceres克隆117581的植物中核苷酸序列與同源性擬南芥生態(tài)型Columbia序列作比較。Ceres克隆117581的植物中核苷酸序列與同源性Columbia序列的差一個核苷酸。與同源性Columbia序列相比，CerescDNAID2998984的植物中核苷酸序列含有堿基對插入、缺失和取代。為了確定CerescDNAID2998984編碼的預(yù)測多肽的總體結(jié)構(gòu)是否類似于同源性Columbia核苷酸序列編碼的預(yù)測多肽，用Tmpred程序(ch.embnet.org/software/TMPRED—form)分析這兩個序列中可能的轉(zhuǎn)運多肽特征性跨膜結(jié)構(gòu)域。分析表明，這兩種預(yù)測多肽具有預(yù)期的12個跨膜區(qū)。然而，對翻譯起始位點的預(yù)測表明，CerescDNAID2998984編碼的預(yù)測多肽的氨基末端比Columbia同源物編碼的預(yù)測多肽短40個氨基酸。因此，根據(jù)SignalP算法(cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，CerescDNAID2998984編碼的預(yù)測多肽缺少預(yù)測的Columbia多肽序列的前40個氨基酸所含的分泌信號肽序列。用iPSORT信號序列預(yù)測算法(hc.ims.u-tokyo.ac.jp/iPSORT/index.htm說aaindex)分析CerescDNAID2998984編碼的預(yù)測多肽序列表明，前40個氨基酸含有可能的葉綠體靶向信號序列。如下所述篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥品系l)篩選溫室中T,候選物的形態(tài)表型，2)分析T2種子的碳和氮含量，3)驗證T3種子中碳和/或氮含量提高，和4)評價T2植株的陰性表型和FinaleTM分離。篩選SR00829和SR05001的各五個事件在1\代中產(chǎn)生的可見表型改變。所有T,植株的外表特征與相應(yīng)對照植物相同。實嚴(yán)劍2—錄基厲教廢芥#7^薪*氮盒量游分析稱量約2.00±0.15mg干燥的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子(約IOO粒)，加入錫罐中，分析總的碳和氮含量。以與試驗樣品相同的方式制備三種匹配對照，在整個批次中間隔均勻。每個批次中的前三個樣品分別是空白樣品(空錫罐)、旁路(bypass)(約5mg天冬氨酸)和標(biāo)準(zhǔn)樣品(5.00±0.15mg天冬氨酸)。用分析天平稱量天冬氨酸加入錫罐中。每15個試驗樣品之間插入一個空白樣品。用FlashEA1112NC分析儀(ThermoFinnigan，SanJose，CA)完成分析。設(shè)備參數(shù)如下左爐90(TC，右爐840'C，烘箱5(TC，氣流載體130mL/分鐘，氣流參比100mL/分鐘。標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)據(jù)參數(shù)LLOD為0.25mg，其它材料不同。標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)據(jù)參數(shù)LLOQ為3mg，種子組織的數(shù)據(jù)參數(shù)LLOQ為1mg，其它材料不同。用EA1112軟件進行定量。使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，并用絕對百分?jǐn)?shù)表示。一式三份地分析各個樣品，計算標(biāo)準(zhǔn)差。以前測得非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏目偺己繛?3.3±2.4%，總氮含量為3.9±0.3%。天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的理論標(biāo)準(zhǔn)差為碳±2.0%，氮±1.0%。為了被稱為有效，需要各輪的天冬氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)重量為5mg土0.15mg，需要空白樣品的氮或碳含量記錄為零。需要重復(fù)樣品之間的標(biāo)準(zhǔn)差百分?jǐn)?shù)低于10%。實嚴(yán)賄J-W卯S29事伴錄菜如實施例2所述分析含有CerescDNAID2998984的SR00829經(jīng)兩次事件后T2和丁3種子中的總碳和總氮含量。與相應(yīng)的對照種子的氮含量相比，SR00829經(jīng)兩次事件后的丁2種子的氮含量顯著增加。如表1所示，與對照種子的氮含量相比，經(jīng)事件-01和-02的種子中氮含量增加到110%和109%。表l:SR00829事件的T2和T3種子總氮含量(V。對照)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>與相應(yīng)的對照種子的氮含量相比，SR00829經(jīng)兩次事件后T3種子的氮含量顯著增加。如表1所示，與對照種子的氮含量相比，經(jīng)事件-01和-02的種子中氮含量分別增加到111%和118%。觀察到SR00829事件的丁2和T3種子的碳含量與相應(yīng)對照種子的碳含量沒有顯著區(qū)別。用于分析碳和氮含量的SR00829事件的T3種子是從經(jīng)過各事件的一個丁2植株收集的。SR00829經(jīng)過事件-01和-02后的丁2植株中FinaleTM抗性分離的結(jié)果是抗性與敏感比為3:1。T2SR00829和對照植物在萌發(fā)、開花初期、蓮座區(qū)、能育性、植株高度和總體形態(tài)/結(jié)構(gòu)方面都沒有可觀察的或統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。實嚴(yán)劍4-S朋500/事伴游碧菜如實施例2所述分析含有Ceres克隆117581的SR05001經(jīng)兩次事件后丁2和T3種子中的總碳和總氮含量。與相應(yīng)的對照種子的碳含量相比，SR05001經(jīng)一次事件后丁2種子的碳含量顯著降低。如表2所示，與對照種子的碳含量相比，經(jīng)事件-02的種子中碳含量降低至97%。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>與相應(yīng)的對照種子的氮含量相比，SR05001經(jīng)兩次事件后丁2種子的氮含量顯著增加。如表3所示，與對照種子的氮含量相比，經(jīng)事件-02和-03的種子中氮含量分別增加到112%和115%。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>與相應(yīng)的對照種子的碳含量相比，SR05001經(jīng)兩次事件后丁3種子的碳含量顯著增加。如表2所示，與對照種子的碳含量相比，經(jīng)事件-02和-03的種子中碳含量分別增加到106%和107%。與相應(yīng)的對照種子的氮含量相比，SR05001經(jīng)兩次事件后T3種子的氮含量顯著增加。如表3所示，與對照種子的氮含量相比，經(jīng)事件-02和-03的種子中氮含量分別增加到109%和106%。用于分析碳和氮含量的SR05001事件的Ts種子是從經(jīng)過各事件的一個丁2植株收集的。SR05001經(jīng)過事件-02和-03后的丁2植株中FinaleTM抗性分離的結(jié)果是抗性與敏感比為3:1。T2SR05001和對照植物在萌發(fā)、開花初期、蓮座區(qū)、能育性、種子大小和總體形態(tài)/結(jié)構(gòu)方面都沒有可觀察的或統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。實嚴(yán)劍5-勸諧^^^^7/^^直場婦^^^/y游凝定如果主題和査詢序列編碼的蛋白質(zhì)具有相似功能和/或活性，則認(rèn)為主題序列是查詢序列的功能同源物和/或直向同源物。用稱為交互BLAST(Rivera等，ZVoc.7Va//.Jcad&/.(U.S.A.)，95:6239-6244(1998))的方法鑒定來自可用的公共和專利肽序列數(shù)據(jù)庫，包括NCBINR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和Ceres克隆的肽翻譯數(shù)據(jù)庫中可能的功能同源物和/或直向同源序列。開始交互BLAST法之前，用BLAST在來源物種的所有肽中搜索特定的查詢多肽，以鑒定與查詢多肽的序列相同性為80%或更高并且比對長度占所比對較短序列的85%或更多的多肽。査詢多肽與上述鑒定的多肽被稱為簇。主要的交互BLAST法由兩輪BLAST搜索組成正向搜索和反向搜索。在正向搜索步驟中，用感興趣物種的所有蛋白序列BLAST檢索來自來源種類SA的査詢多肽序列"多肽A"。用E-值截止值l(rS和相同性截止值35。/。確定最高命中。在最高命中中，E值最低的序列被稱為最佳命中，并被認(rèn)為是潛在的功能同源物和/或直向同源物。與最佳命中或初始查詢多肽的序列相同性為80%或更高的任何其它最高命中也被認(rèn)為是潛在的功能同源物和/或直向同源物。對所有感興趣種類重復(fù)此方法。在反向搜索中，用來源種類SA的所有蛋白序列BLAST檢索正向搜索中從所有種類中鑒定出的最高命中。正向搜索的最高命中如果將上述簇的多肽返回為其最佳命中，也被認(rèn)為是潛在的功能同源物和/或直向同源物。手工檢査潛在的功能同源物和/或直向同源物序列，以鑒定功能同源物和/或直向同源物。SEQIDNO:4的代表性功能直向同源物見圖1。功能直向同源物與SEQIDNO:4的相同性百分?jǐn)?shù)見表4。表4:與Ceres克隆117581(SEQIDNO:4)的相同'生百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>其它實施方式應(yīng)理解，雖然與本發(fā)明詳述一起描述了本發(fā)明，但上述說明書旨在說明而非限制所附權(quán)利要求書的范圍所確定的本發(fā)明范圍。所附權(quán)利要求書的范圍包括其它方面、優(yōu)點和修改。權(quán)利要求1.一種調(diào)節(jié)植物中氮水平的方法，所述方法包括將分離核酸引入植物細(xì)胞，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80％或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO2，SEQIDNO4-18，和圖1所示共有序列，所述植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物組織中的氮水平與不含所述核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述差異是氮水平升高。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離核酸操作性連接于調(diào)控區(qū)。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述調(diào)控區(qū)是選自下組的啟動子YP0092、PT0676、PT0708、PT0613、PT0672、PT0678、PT0688、PT0837、油菜籽蛋白啟動子、Arcelin-5啟動子、菜豆蛋白基因啟動子、大豆胰蛋白酶抑制劑啟動子、ACP啟動子、硬脂酰-ACP去飽和酶基因、P-伴大豆球蛋白的大豆al亞基啟動子、油質(zhì)蛋白啟動子、15kD玉米醇溶蛋白啟動子、16kD玉米醇溶蛋白啟動子、19kD玉米醇溶蛋白啟動子、22kD玉米醇溶蛋白啟動子、27kD玉米醇溶蛋白啟動子、Osgt-l啟動子、P-淀粉酶基因啟動子和大麥醇溶蛋白基因啟動子。5.—種生產(chǎn)植物組織的方法，所述方法包括培養(yǎng)一種含有分離核酸的植物細(xì)胞，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2，SEQIDNO:4-18,和圖1所示共有序列，所述組織中的氮水平與不含所述核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。6.—種含有分離核酸的植物細(xì)胞，所述分離核酸包含編碼與選自下組的氨基酸序列的序列相同性為80%或更高的多肽的核苷酸序列SEQIDNO:2，SEQIDNO:4-18,和圖1所示共有序列，所述植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物組織中的氮水平與不含所述核酸的對照植物組織中的相應(yīng)水平有差異。7.—種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求6所述的植物細(xì)胞。8.—種權(quán)利要求7所述的植物的子代，其特征在于，所述子代的氮水平與不含所述分離核酸的相應(yīng)對照植物中的氮水平有差異。9.一種權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物的種子。10.—種權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物的營養(yǎng)組織。11.一種食品，其包含權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物的營養(yǎng)組織。12.—種飼料產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植^/的營養(yǎng)組織。全文摘要本發(fā)明公開了調(diào)節(jié)(如提高或降低)植物中氮水平的方法和材料。例如，本發(fā)明公開了編碼氮調(diào)節(jié)性多肽的核酸，以及采用這種核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法。也公開了氮水平升高的植物和植物產(chǎn)品。文檔編號C12N15/82GK101535483SQ200580046997公開日2009年9月16日申請日期2005年12月2日優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日發(fā)明者B·詹科沃斯基,E·馬戈勒斯-克拉克,J·派克,R·施內(nèi)貝格爾,S·C·鮑伯齊恩申請人:賽樂斯股份有限公司