專利名稱：：血管生成素-2的抗體及其應(yīng)用的制作方法血管生成素-2的抗體及其應(yīng)用本申請要求并入本文參考的2004年12月21日提交的美國臨時申請系列號60/638,354和2005年8月25日提交的美國臨時申請系列號60/711,289的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)的單克隆抗體及這些抗體的應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明涉及針對Ang-2的完全人單克隆抗體及這些抗體的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及表達這些抗體的雜交瘤或其它細胞系。所述抗體可用于診斷及治療與Ang-2的活性和/或過量產(chǎn)生相關(guān)的疾病。發(fā)明背景血管生成是從現(xiàn)有的血管中形成新的毛細血管的過程，是胚胎發(fā)生、正常生理性生長、修復(fù)和腫瘤擴展的基本成分。盡管有許多因素可以調(diào)節(jié)體外內(nèi)皮細胞(EC)應(yīng)答及體內(nèi)血管生長，但是只有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族成員和血管生成素被認為是幾乎專門地對血管EC起作用。Yancopoulosetal,Nature407:242-48(2000)。已發(fā)現(xiàn)血管生成素是Ties的配體，Ties是在血管內(nèi)皮中選擇性表達的酪氨酸激酶家族(Yanc叩oulosetal，Nature407:242-48(2000))。目前血管生成素家族有四個確定的成員。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可代表小鼠和人中相同基因座的非常不同的對應(yīng)物(Kimetal，F(xiàn)EBSLet,443:353-56(1999);Kimetal，JBiolChem274:26523-28(1999))。Ang-1和Ang-2最初是分別作為激動劑和拮抗劑在組織培養(yǎng)實驗中鑒別的(Davisetal,Cell87:1161-69(1996);Maisonpierreetal，Science277:55-60(1997))。所有已知的血管生成素均主要結(jié)合Tie2,Ang-l和-2均以3nM(Kd)的親和性結(jié)合Tie2(Maisonpierreetal，Science277:55-60(1997))。Ang-l示出支持EC存活并促進內(nèi)皮完整性(Davisetal，Cell87:1161-69(1996);Kwaketal.，F(xiàn)EBSLett448:249-53(1999);Surietal，Science282:468-71(1998);Thurstonetal,Science286:2511-14(1999);Thurstonetal，Nat.Med.6:460-63(2000))，而Ang-2具有相反作用并且在沒有存活因子VEGF或堿性成纖維細胞生長因子的條件下促進血管不穩(wěn)定和退化(Maisonpierreetal，Science277:55-60(1997))。然而，關(guān)于Ang-2功能的許多研究提示一種更復(fù)雜的情況。Ang-2也許是一種血管重塑的復(fù)雜調(diào)節(jié)物，在血管萌發(fā)和血管退化中均起作用。支持Ang-2這種作用的表達分析表明在成人血管發(fā)生性萌發(fā)中Ang-2與VEGF—起被快速誘導(dǎo)，Ang-2在血管退化的情況中在沒有VEGF的條件下被誘導(dǎo)(Holashetal，Science284:1994-98(1999);Holashetal，Oncogene18:5356-62(1999))。與鄰近依賴性(context-dependent)作用一樣，Ang-2結(jié)合由Ang-l激活的相同內(nèi)皮特異性受體Tie-2，但是對其激活具有鄰近依賴性效應(yīng)(Maisonpierreetal，Science277:55-60(1997))。角膜血管發(fā)生測定示出Ang-l和Ang-2具有相似作用，與VEGF協(xié)同起作用以促進新血管的生長(Asaharaetal，Circ.Res.83:233-40(1998))。通過在體外高濃度Ang-2也具有促進血管發(fā)生的觀測結(jié)果，提示可能存在劑量依賴性內(nèi)皮細胞應(yīng)答(Kimetal,Oncogene19:4549-52(2000))。在高濃度下，Ang-2在經(jīng)PI-3激酶和Akt途徑激活Tie2而導(dǎo)致血清剝奪凋亡期間作為內(nèi)皮細胞的凋亡存活因子而起作用(Kimetal，Oncogene19:4549-52(2000))。其它體外實驗提示在持續(xù)暴露期間，Ang-2的作用可逐漸從Tie2的拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧觿?，在隨后的時間點，其可直接有助于血管形成和新血管穩(wěn)定化(Teichert-Kuliszewskaetal，Cardiovasc.Res.49:659-70(2001))。另外，如果將EC在血纖蛋白凝膠上培養(yǎng)，也觀測到Ang-2對Tie2的激活，這也許提示Ang-2的作用依賴于EC分化狀態(tài)(Teichert-Kuliszewskaetal,Cardiovasc.Res.49:659-70(2001))。在三維膠原凝膠中培養(yǎng)的微血管EC中，Ang-2也可誘導(dǎo)Tie2激活并促進毛細血管樣結(jié)構(gòu)形成(Mochizukietal，J.Cell.Sci.115:175-83(2002》。3-D球形共培養(yǎng)物作為體外血管成熟的模型的應(yīng)用表明EC與間充質(zhì)細胞之間的直接接觸消除了對VEGF的應(yīng)答性，而VEGF和Ang-2的存在誘導(dǎo)萌發(fā)(Korffetal，F(xiàn)asebJ.15:447-57(2001))。Etoh等證實組成型表達Tie2的EC，MMP-l、-9和u-PA的表達在存在VEGF的情況下由Ang-2強力地正調(diào)節(jié)(Etoh,etal，CancerRes.61:2145-53(2001))。在體內(nèi)瞳孔膜模型中，Lobov等揭示了Ang-2在存在內(nèi)源VEGF的條件下促進毛細血管直徑迅速增加、基底層重塑、內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，并剌激新血管的萌發(fā)(Lobovetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:11205-10(2002))。相反，在無內(nèi)源VEGF的條件下，Ang-2促進內(nèi)皮細胞死亡及血管退化(Lobovetal,Proc,Natl.Acad.Sci.USA99:11205-10(2002))。相似地，在體內(nèi)腫瘤模型中，Vajkoczy等證實多細胞聚集體通過宿主和腫瘤內(nèi)皮同時表達VEGFR-2和Ang-2導(dǎo)致血管發(fā)生萌發(fā)從而引發(fā)血管生長(Vajkoczyetal，J.Clin.Invest.109:777-85(2002))。這個模型例證了生長中的腫瘤的已建立的微脈管系統(tǒng)特征在于持續(xù)重塑，推測其通過VEGF和Ang-2的表達介導(dǎo)(Vajkoczyetal，J.Clin.Invest.109:777-85(2002》。Tie-2和血管生成素-1的敲除小鼠研究示出相似的表型，提示血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化介導(dǎo)發(fā)育中的血管的重塑和穩(wěn)定，在血管發(fā)生期間促進血管成熟及維持內(nèi)皮細胞-支持細胞附著(Dumontetal,Genes&Development,8:1897-1卯9(1994);Sato,Nature,376:70-74(1995);Thurston,Getal.，2000NatureMedicine:6，460-463))。認為血管生成素-1的作用在成人中是保守的，并且在其中廣泛及組成型表達(Hanahan，Science,277:48-50(1997);Zagzag，etal，ExpNeurology,159:391-400(1999))。相反，血管生成素-2表達主要限于血管重塑位置，認為其在此阻斷血管生成素-1的組成型穩(wěn)定或成熟功能，使得血管回復(fù)至并保持對萌發(fā)信號更加應(yīng)答的可塑狀態(tài)(Hanahan,1997;Holashetal,Oncogene18:5356-62(1999);Maisonpierre，1997))。對血管生成素-2表達在病原性血管發(fā)生中的研究發(fā)現(xiàn)許多類型的腫瘤顯示出血管血管生成素-2表達(Maisonpierreetal,Science277:55-60(1997))。功能研究提示在小鼠異種移植模型中血管生成素-2參與腫瘤的血管發(fā)生，且血管生成素-2過表達與腫瘤生長增加相關(guān)(Ahmad，etal，CancerRes.，61:1255-1259(2001))。其它研究也表明血管生成素-2過表達與腫瘤超高血管狀態(tài)(hypervascularity)相關(guān)(Etoh，etal，CancerRes.61:2145-53(2001);Tanakaetal，CancerRes.62:7124-29(2002))。近年來，提出血管生成素-1、血管生成素-2和/或Tie-2可能是抗癌治療靶位。例如US6166185、US56504卯和US5814464均揭示了抗-Tie-2配體和受體抗體。使用可溶的Tie-2的研究報道降低嚙齒動物中腫瘤的數(shù)目和大小(Lin，1997;Lin1998)。Siemester等(1999)產(chǎn)生了表達Tie-2胞外結(jié)構(gòu)域的人黑素瘤細胞系，將其注射進裸鼠中，報道可溶的Tie-2導(dǎo)致腫瘤生長及腫瘤血管發(fā)生明顯抑制。鑒于血管生成素-1和血管生成素-2均結(jié)合Tie-2，從這些研究中不清楚血管生成素-1、血管生成素-2或Tie-2是否是抗癌治療的有吸引力的靶位。然而，認為有效的抗-血管生成素-2治療在治療如癌癥等疾病(其中疾病的進展依賴于異常的血管發(fā)生，其中阻斷該過程可防止疾病的進展)中是有益的(Folkman，J.，NatureMedicine.1:27-31(1995)。另外，一些研究小組報道了結(jié)合血管生成素-2的抗體的應(yīng)用，見例如美國專利No.6,166,185和美國專利申請公開No.2003/0124129Al所述。對血管生成素-2的病灶表達作用的研究示出拮抗血管生成素-l/Tie-2信號使得緊密的血管結(jié)構(gòu)松解，從而使得EC暴露于來自血管發(fā)生誘導(dǎo)劑例如VEGF的纟敫活的信號(Hanahan，1997)。這種得自血管生成素-1抑制的促血管發(fā)生(pro-angiogenic)作用表明抗-血管生成素-1治療不是有效的抗癌治療。Ang-2在發(fā)生血管重塑的部位發(fā)育期間表達(Maiso叩ierreetal，Science277:55-60(1997))。在成人中，Ang-2表達限于血管重塑部位以及高度血管化的腫瘤，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Osadaetal，Int.J.Oncol.18:305-09(2001);Kogaetal，CancerRes.61:6248-54(2001》、肝細胞癌(Tanakaetal，J.Ciin.Invest.103:341-45(1999))、胃癌(Etoh，etal，CancerRes.61:2145-53(2001);Leeetal,Int.J.Oncol.18:355-61(2001))、甲狀腺腫瘤(Bunoneetal，AmJPathol155:1967-76(1999))、非小細胞肺癌(Wongetal,LungCancer29:11-22(2000))及結(jié)腸癌(Ahmadetal，Cancer92:1138-43(2001))和前列腺癌(Wurmbachetal，AnticancerRes.20:5217-20(2000))。發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細胞表達Ang-2。例如，Tanakaetal,J.Clin.Invest103:341-45(1999)在12個人肝細胞癌(HCC)樣品中的10個樣品中檢測到Ang-2mRNA。Ellis研究小組報道Ang-2在腫瘤上皮中遍在表達(Ahmadetal，Cancer92:1138-43(2001))。其它研究者報道了相似的發(fā)現(xiàn)(Chenetal，J.TongjiMed.Univ.21:228-30，235(2001))。通過檢測存檔的人乳腺癌樣品中Ang-2mRNA水平，Sfilogoietal，Int.J.Cancer103:466-74(2003)報道了Ang-2mRNA與輔助淋巴結(jié)侵潤(auxiliarylymphnodeinvasion)、較短的無疾病時間及較差的全面存活顯著相關(guān)。Tanakaetal.，CancerRes.62:7124-29(2002)回顧了共236名病理階段分別為I至IIIA期的非小細胞肺癌(NSCLC)患者。使用免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)16.9%的NSCLC患者是Ang-2陽性。Ang-2陽性腫瘤的微血管密度顯著高于Ang-2陰性的。Ang-2的這種血管發(fā)生作用僅當(dāng)VEGF表達較高時才可見。另外，Ang-2的陽性表達是預(yù)知較差的手術(shù)后存活的重要因素(Tanakaetal，CancerRes.62:7124-29(2002))。然而，他們發(fā)現(xiàn)Ang-1表達與微血管密度之間無顯著關(guān)聯(lián)(Tanakaetal，CancerRes.62:7124-29(2002))。這些結(jié)果提示Ang-2是某些類型癌癥患者預(yù)后較差的指征。最近，Yancopoulos研究小組使用Ang-2敲除小鼠模型報道了Ang-2是出生后血管發(fā)生所必需的(Galeetal，Dev.Cell3:411-23(2002))。他們示出在眼中玻璃體脈管系統(tǒng)的進展性程序化退化在Ang-2V-小鼠中不發(fā)生，其視網(wǎng)膜血管不能從中央視網(wǎng)膜動脈中萌出(Galeetal，Dev.Cell3:411-23(2002))。他們還發(fā)現(xiàn)Ang-2的缺失導(dǎo)致淋巴脈管系統(tǒng)的式樣和功能明顯缺陷(Galeetal，Dev.Cell3:411-23(2002))。用Ang-1的遺傳拯救糾正了淋巴缺陷，但是未糾正血管發(fā)生缺陷(Galeetal，Dev.Cell3:411-23(2002))。Peters及其同事報道了可溶的Tie2當(dāng)作為重組蛋白質(zhì)或者在病毒表達載體中給予小鼠模型時，抑制鼠乳腺癌和黑素瘤的體內(nèi)生長(Linetal，Proc.NatlAcad.SciUSA95:8829-34(1998);Linetal,J.Clin.Invest.100:2072-78(1997))。如此處理的腫瘤組織中血管密度顯著降低。另外，可溶的Tie2阻斷腫瘤細胞條件培養(yǎng)基刺激的大鼠角膜中血管發(fā)生(Linetal，J.Clin.Invest.100:2072-78(1997))。另外，Isner及其小組證實了向VEGF中加入Ang-2比單獨的VEGF顯著促進更長和更多的環(huán)形新血管化(circumferentialneovascularity)(Asaharaetal，Circ.Res.83:233-40(1998))。過量的可溶Tie2受體阻礙Ang-2對VEGF-誘導(dǎo)的新血管化的調(diào)節(jié)(Asaharaetal，Circ.Res.83:233-40(1998))。Siemeisteretal，CancerRes.59:3185-91(1999)使用裸鼠異種移植物揭示了異種移植物中Flt-1或Tie2的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的過表達導(dǎo)致不能由另一途徑彌補的途徑的顯著抑制，提示VEGF受體途徑和Tie2途徑應(yīng)被認為是體內(nèi)血管發(fā)生過程必需的兩個獨立介導(dǎo)物(Siemeisteretal.,CancerRes.59:3185-91(1999))。這個結(jié)論由最近的出版物Whiteetal，Proc.Natl.Acad.SciUSA100:5028-33(2Q03)所證實。在其研究中，證實了特異性結(jié)合和抑制Ang-2的核酸酶抗性RNA適體(aptamer)顯著抑制大鼠角膜微囊(micropocket)血管發(fā)生模型中bFGF誘導(dǎo)的新血管化。發(fā)明概述本發(fā)明的實施方案涉及特異性結(jié)合血管生成素-2并由此抑制腫瘤血管發(fā)生和降低腫瘤生長的靶向結(jié)合劑?？梢詫崿F(xiàn)這個目的的機制可包括但不限于抑制Ang-2與其受體Tie2的結(jié)合、抑制Ang-2誘導(dǎo)的Tie2信號傳導(dǎo)或者增加Ang-2的清除，由此降低Ang-2的有效濃度。本發(fā)明的一個實施方案是所述靶向結(jié)合劑是結(jié)合Ang-2并防止Ang-2結(jié)合Tie2的完全人抗體。本發(fā)明的另一實施方案是結(jié)合Ang-2和Ang-1并還抑制Ang-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化的完全人單克隆抗體。所述抗體可結(jié)合Ang-2，Kd低于100pM、30pM、20pM、10pM或者5pM。所述抗體可包含重鏈氨基酸序列，該重鏈氨基酸序列具有互補決定區(qū)(CDR)，所述CDR具有表11所示的序列之一。注意本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于完成CDR確定。見例如Kabatetal，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NIHPublication91-3242，BethesdaMD(1991)，vols.1-3。本發(fā)明的一個實施方案包含特異性結(jié)合Ang-2的完全人單克隆抗體3.3.2(ATCC登記號PTA-7258)、3.19.3(ATCC登記號PTA-7260)和5.88.3(ATCC登記號PTA-7259)，如下文詳細描述。本發(fā)明另一實施方案是結(jié)合Ang-2的抗體，其包含輕鏈氨基酸序列，該輕鏈氨基酸序列具有包含表12所示序列之一的CDR。在某些實施方案中，所述抗體是完全人單克隆抗體。本發(fā)明另一實施方案是結(jié)合Ang-2的抗體，其包含重鏈氨基酸序列及輕鏈氨基酸序列，所述重鏈氨基酸序列具有表11所示CDR序列之一，所述輕鏈氨基酸序列具有表12所示CDR序列之一。在某些實施方案中，所述抗體是完全人單克隆抗體。本發(fā)明另一實施方案是與本發(fā)明的完全人抗體交叉競爭結(jié)合Ang-2的抗體，優(yōu)選包含重鏈氨基酸序列及輕鏈氨基酸序列的抗體，所述重鏈氨基酸序列具有表11所示CDR序列之一，所述輕鏈氨基酸序列具有表12所示CDR序列之一。本發(fā)明另一實施方案是結(jié)合Ang-2上的與本發(fā)明的完全人抗體結(jié)合相同表位的抗體，優(yōu)選包含重鏈氨基酸序列及輕鏈氨基酸序列的抗體，所述重鏈氨基酸序列具有表11所示CDR序列之一，所述輕鏈氨基酸序列具有表12所示CDR序列之一。本發(fā)明另一實施方案包括特異性結(jié)合血管生成素-2的人單克隆抗體，其中所述抗體包含相應(yīng)于典范類別1(canonicalclass1)的重鏈互補決定區(qū)l(CDRl)。本發(fā)明提供的抗體也可以包括相應(yīng)于典范類別3的重鏈互補決定區(qū)2(CDR2)，相應(yīng)于典范類別2的輕鏈互補決定區(qū)l(CDRl)，相應(yīng)于典范類別1的輕鏈互補決定區(qū)2(CDR2)及相應(yīng)于典范類別1的輕鏈互補決定區(qū)3(CDR3)。本發(fā)明進一步提供了分析患者樣品中血管生成素-2(Ang-2)水平的方法，所述方法包括將抗-Ang-2抗體與患者的生物學(xué)樣品接觸，檢測所述樣品中所述抗體與Ang-2之間的結(jié)合水平。在更特異的實施方案中，所述生物學(xué)樣品是血液。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包括抗體或其功能片段及藥物可接受的載體。本發(fā)明另外的實施方案包括有效治療患有血管發(fā)生相關(guān)疾病的動物的方法，包括選擇需要治療腫瘤或非腫瘤疾病的動物，給予所述動物治療有效量的特異性結(jié)合血管生成素-2(Ang-2)的完全人單克隆抗體?？芍委煹难馨l(fā)生相關(guān)疾病包括腫瘤疾病，如黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、甲狀腺腫瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、間皮瘤、肉瘤、膽管癌(膽管細胞癌)、小腸腺癌、兒童惡性腫瘤及表皮樣癌。本發(fā)明其它實施方案包括抑制動物中血管生成素-2(Ang-2)誘導(dǎo)的血管發(fā)生的方法。這些方法包括選擇需要治療Ang-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生的動物，給予所述動物治療有效量的完全人單克隆抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合Ang-2。本發(fā)明另外的實施方案包括抗體在制備用于治療動物中血管發(fā)生相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述單克隆抗體特異性結(jié)合血管生成素-2(Ang-2)?？芍委煹难馨l(fā)生相關(guān)疾病可包括腫瘤疾病，如黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、甲狀腺腫瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、間皮瘤、肉瘤、膽管細胞癌、小腸腺癌、兒童惡性腫瘤及表皮樣癌。在另外的實施方案中，本發(fā)明描述的抗體可用于制備有效治療動物中血管生成素-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生的藥物，其中所述單克隆抗體特異性結(jié)合血管生成素-2(Ang-2)。本文描述的本發(fā)明的實施方案涉及單克隆抗體，其結(jié)合Ang-2及影響Ang-2功能。其它實施方案涉及從治療觀點看具有希望性質(zhì)的完全人抗-Ang-2抗體及抗-Ang-2抗體制備物，所述希望性質(zhì)包括與Ang-2的高度結(jié)合親和性、在體外和體內(nèi)中和Ang-2的能力及抑制Ang-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生的能力。在一個優(yōu)選的實施方案中，本文描述的抗體以非常高的親和性(Kd)結(jié)合Ang-2。例如，能以如下Kd結(jié)合Ang-2的人、兔、小鼠、嵌合或人源化抗體，所述Kd低于但不限于10—5、10'6、10'7、i0'8、10'9、1(T1(}、l(T11、l(T12、10"3或1(T"M，或者其中的任何范圍或數(shù)值。親和性和/或親和力測定可通過如本文所述的KinExA⑧和/或BIACORE⑧測定。因此，本文描述的一個實施方案包括結(jié)合Ang-2的分離的抗體或其片段。如本領(lǐng)域所己知，所述抗體可有利地是多克隆抗體、寡克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體和/或完全人抗體。本文描述的本發(fā)明的實施方案還提供了生產(chǎn)這些抗體的細胞。本發(fā)明的另一實施方案是結(jié)合其它血管生成素-2家族成員的完全人抗體，所述成員包括但非限于血管生成素-1、血管生成素-3和血管生成素-4。本發(fā)明另一實施方案是與本發(fā)明的完全人抗體交叉競爭結(jié)合與Ang-2結(jié)合的Tie2的抗體。在本發(fā)明一個實施方案中，所述抗體結(jié)合并中和血管生成素-2，而且還結(jié)合并中和血管生成素-1。應(yīng)意識到本發(fā)明的實施方案非限于任何特定形式的抗體或者產(chǎn)生或生產(chǎn)方法。例如抗-Ang-2抗體可以是全長抗體(例如具有完整的人Fc區(qū)域)或者抗體片段(例如Fab、Fab'或F(ab')2)。另夕卜，所述抗體可以產(chǎn)生自分泌所述抗體的雜交瘤，或者得自已經(jīng)用編碼所述抗體的一或多個基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的重組產(chǎn)生的細胞。本發(fā)明的其它實施方案包括編碼本文描述的任何抗體的分離的核酸分子，具有編碼抗Ang-2抗體的分離的核酸分子的載體或者用任何這種核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細胞。另外，本發(fā)明的一個實施方案是產(chǎn)生抗-Ang-2抗體的方法，通過將宿主細胞在核酸分子被表達的條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生所述抗體，隨后回收所述抗體而進行。應(yīng)認識到本發(fā)明的實施方案還包括編碼本發(fā)明抗體或其片段的任何核酸分子，其包括經(jīng)優(yōu)化的當(dāng)轉(zhuǎn)染進宿主細胞中生產(chǎn)抗體時增加抗體或其片段產(chǎn)量的核酸序列。本發(fā)明另一實施方案包括產(chǎn)生Ang-2的高親和性抗體的方法，通過用人Ang-2或其片段及一或多個直系同源序列或其片段免疫一種哺乳動物而進行。其它實施方案基于特異性結(jié)合Ang-2的分離的抗體的產(chǎn)生和鑒別。Ang-2在血管發(fā)生相關(guān)疾病如腫瘤疾病中表達水平增加。Ang-2的生物學(xué)活性的抑制可防止Ang-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生及其它希望的作用。本發(fā)明的另一實施方案包括診斷疾病或病變的方法，其中將如本文所述制備的抗體用于檢測患者樣品中Ang-2水平。在一個實施方案中，所述患者樣品是血液或血清。在另外的實施方案中，提供了鑒別危險因素、診斷疾病及對疾病進行分期的方法，包括使用抗-Ang-2抗體鑒別Ang-2的過表達。本發(fā)明的另一實施方案包括診斷與細胞中Ang-2表達相關(guān)的病變的方法，通過將血清或細胞與抗-Ang-2抗體接觸，之后檢測Ang-2的存在與否而進行診斷。優(yōu)選的病變包括血管發(fā)生相關(guān)疾病，包括但非限于腫瘤疾病，如黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、成膠質(zhì)細胞瘤、甲狀腺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、唾液腺癌及結(jié)腸直腸癌。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一個檢測哺乳動物組織、細胞或體液中血管生成素-2和血管生成素家族成員的分析試劑盒，以篩選血管發(fā)生相關(guān)疾病。所述試劑盒包括與血管生成素-2結(jié)合的抗體及指示所述抗體與血管生成素-2(如果存在的話)反應(yīng)的方式。優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體，在一個實施方案中，結(jié)合Ang-2的所述抗體被標記。在另一個實施方案中，所述抗體是未標記的一級抗體，所述試劑盒進一步包括檢測所述一級抗體的方式。在一個實施方案中，所述方式包括一種標記的二級抗體，其是抗免疫球蛋白。優(yōu)選地，所述抗體是用選自如下的標記物進行標記的熒光染料、酶、放射性核素和不透射線的材料。另一實施方案包括治療患者與Ang-2表達相關(guān)的疾病或病變的方法，通過給予患者有效量的抗-Ang-2抗體而進行。所述抗-Ang-2可以單獨給予，或者組合其它抗體或化療藥物或放療給予。例如，阻斷血管發(fā)生的Ang-2抗體的單克隆抗體、寡克隆抗體或多克隆抗體混合物可以與示出直接抑制腫瘤細胞增殖的藥物組合給予。所述方法可以在體內(nèi)進行，所述患者優(yōu)選是人類患者。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法涉及治療血管發(fā)生相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括但非限于腫瘤疾病，如黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、成膠質(zhì)細胞瘤、甲狀腺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、唾液腺癌及結(jié)腸直腸癌。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種包括容器的生產(chǎn)物品。所述容器包括含有抗-Ang-2抗體的組合物，及指示所述組合物可用于治療特征在于Ang-2過表達的血管發(fā)生相關(guān)疾病的包裝插入頁或標簽。在一些實施方案中，將抗-Ang-2抗體給予患者，隨后給予清除劑以從血液中除去過量的循環(huán)中的抗體。本發(fā)明另一實施方案是抗Ang-2抗體在制備治療如血管發(fā)生相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。在一個實施方案中，所述血管發(fā)生相關(guān)疾病包括癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、食管癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌。在另一個實施方案中，所述血管發(fā)生相關(guān)疾病包括但非限于腫瘤疾病，如黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、肉瘤、頭頸癌、間皮瘤、膽管癌(膽管細胞癌)、小腸腺癌、兒童惡性腫瘤和成膠質(zhì)細胞瘤。Ang-2是血管發(fā)生的重要"開關(guān)"。因此，期望拮抗這種分子以抑制病理生理過程，從而作為多種血管發(fā)生依賴性疾病的有效治療方法。除了實體腫瘤及其轉(zhuǎn)移瘤之外，血液系統(tǒng)惡性腫瘤如白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤也是血管發(fā)生依賴性的。過量的血管生長導(dǎo)致眾多的非腫瘤疾病。這些非腫瘤血管發(fā)生依賴性疾病包括動脈硬化癥、血管瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管纖維瘤、血管畸形(例如遺傳性出血性毛細血管擴張癥(HHT)或者Osier-Weber綜合征)、疣、膿性肉芽腫、過度毛發(fā)生長、Kaposis'肉瘤、瘢痕疙瘩、變應(yīng)性水腫、銀屑病、功能失調(diào)性子宮出血、濾胞囊胂、卵巢超刺激、子宮內(nèi)膜異位、呼吸窘迫、腹水、糖尿病患者腹膜硬化、得自腹部手術(shù)的粘連形成、肥胖、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、骨髓炎、血管翳生長、骨贅、血友病性關(guān)節(jié)、炎癥和感染性過程(例如肝炎、肺炎、腎小球性腎炎)、哮喘、鼻息肉、肝再生、肺動脈高壓、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)的黃斑變性、白質(zhì)軟化(leukomalacia)、新生血管性青光眼、角膜移植新血管化、沙眼、甲狀腺炎、甲狀腺肥大、及淋巴增殖性疾病。附圖簡述圖1是示出Ang-2mAb抑制在HEK293F細胞中異位表達的Tie2經(jīng)Ang-2誘導(dǎo)的磷酸化的Western印跡。圖2是抗Ang-2單克隆抗體抑制Ang-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化的劑量應(yīng)答關(guān)系的線圖。圖3是示出使用mAb3.19.3或Tie2/Fc以劑量依賴性方式抑制Ang-l(上圖)和Ang-2(下圖)與Tie2結(jié)合的線圖。圖4是示出mAb3.19.3在Eahy926內(nèi)皮細胞上抑制血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化的Western印跡。在這個系統(tǒng)中觀測到對血管生成素-1誘導(dǎo)的Tk-2磷酸化的抑制。所述抗體濃度以nM示出。圖5是示出mAb3.19.3在Eahy926內(nèi)皮細胞上抑制血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化的線圖。IC50=99nM。X軸是mAb3.19.3的濃度，y軸表示應(yīng)答。圖6是人Ang-2和Ang-2443的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖。上面的數(shù)字表示氨基酸序列(圖表取自Injuneetal.，(2000)JBC275:18550)。圖7示出小鼠/人嵌合分子的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。下劃線處為人殘基(克隆為&"/-77/片段)310-400。圖8是人Ang-l(SEQIDNO:2)、人Ang-2(SEQIDNO:3)和小鼠Ang-2(SEQIDNO:4)蛋白質(zhì)的氨基酸序列對比。Ang-2嵌合分子的融合點和點突變以黑體字示出。圖9是小鼠Ang-l(SEQIDNO:5)、人Ang-l(SEQIDNO:2)、小鼠Ang-2(SEQIDNO:4)和人Ang-2(SEQIDNO:3)的氨基酸序列對比。箭頭指示疏水性前導(dǎo)序列的切割位點。箭頭指出了巻曲螺旋與血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的界限。實心圓表示保守的半胱氨酸殘基(圖取自Maisonpierreetal.，1997，Science277:55)。圖IO是表示小鼠劑量應(yīng)答關(guān)系的交叉反應(yīng)性的線圖。圖中示出了單克隆抗體克隆5.2.1、5.28.1、3.19.3和3.31.2。圖11是示出使用mAb3.19.3以劑量依賴性方式對人(黑色三角形)和小鼠(黑色正方形)Ang-2結(jié)合人Tie2的抑制的線圖。圖12是抗體對MCF-7細胞誘導(dǎo)的血管發(fā)生的作用的條形圖分析。圖12A示出抗-Ang-2抗體對血管末端數(shù)目的作用，其中x軸表示實驗組，y軸表示血管末端的平均數(shù)目(+/-SD)。圖12B示出抗-Ang-2抗體對血管長度的作用，其中x軸表示實驗組，y軸表示平均血管長度(+/-SD)。圖13是示出抗-Ang-2單克隆抗體克隆3.19.3的抗腫瘤作用的線圖，使用A431細胞系在人皮膚表皮樣癌的小鼠異種移植模型中測試。X軸表示植入腫瘤細胞后的天數(shù)，y軸表示平均腫瘤體積+/-SEM(以cn^表示)。實心黑色三角形表示植入腫瘤后注射抗-Ang-2單克隆抗體克隆3.19.3的小鼠的腫瘤體積測量；實心黑色圓形表示植入腫瘤后注射同種型對照抗體PK16.3.1的小鼠的腫瘤體積測量。圖14A是示出在人結(jié)腸腺癌LoVo異種移植模型中阻止腫瘤生長的線圖，示出用0.5、2和10mg/kg所述抗體或同種型對照抗體處理小鼠的腫瘤大小。X軸表示腫瘤細胞植入后的天數(shù)，y軸表示平均腫瘤體積+/-SEM(以ci^表示)。圖14B是示出在人結(jié)腸腺癌SW480異種移植模型中mAb的腫瘤生長抑制作用的線圖。圖15A是示出HT29異種移植模型中阻止腫瘤生長的線圖。X軸表示植入腫瘤細胞后的天數(shù)，y軸表示平均腫瘤體積+/-SEM(以cm3表示)。圖15B是示出在Calu-6異種移植模型中阻止腫瘤生長的線圖，圖中示出了用10mg/kg的mAb克隆3.3.2或3.19.3或者用同種型對照抗體處理的小鼠的腫瘤大小。圖15C是示出用IgG對照抗體或10mg/kg3.19.3mAb處理的MDA-MB-231腫瘤攜帶小鼠的腫瘤中CD31+染色的強度的條形圖。圖中示出了閾值和人工網(wǎng)格計數(shù)方法的結(jié)果o發(fā)明詳述本文描述的本發(fā)明的實施方案涉及結(jié)合Ang-2的單克隆抗體。在一些實施方案中，所述抗體結(jié)合Ang-2并抑制Ang-2與其受體Tie2的結(jié)合。其它本發(fā)明的實施方案包括完全人抗-Ang-2抗體，及具有治療效用的抗體制備物。這種抗-Ang-2抗體制備物優(yōu)選具有希望的治療性質(zhì)，包括與Ang-2的強結(jié)合親和性、在體外中和Ang-2的能力及在體內(nèi)抑制Ang-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生的能力。本發(fā)明的一個實施方案包括結(jié)合并中和Ang-2但不結(jié)合Ang-l的抗體。在一個實施方案中，所述抗體既結(jié)合Ang-2也結(jié)合Ang-l，但僅中和Ang-2。在另一個實施方案中，所述抗體既結(jié)合Ang-2也結(jié)合Ang-l，并且中和Ang-l和Ang-2與Tie2的結(jié)合。本發(fā)明的實施方案還包括抗-Ang-2抗體的分離的結(jié)合片段。優(yōu)選地，所述結(jié)合片段衍生自完全人抗-Ang-2抗體。所述片段例如包括Fv、Fab'或其它熟知的抗體片段，如下文詳細描述。本發(fā)明的實施方案還包括表達抗Ang-2的完全人抗體的細胞。所述細胞的例子包括雜交瘤，或者重組產(chǎn)生的細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，CHO細胞的變體(例如DG44)及產(chǎn)生Ang-2抗體的NS0細胞。關(guān)于CHO細胞變體的另外的信息可見于以其全文并入本文作參考的AndersenandReilly(2004)CurrentOpinioninBiotechnology15，456-462。另外，本發(fā)明的實施方案包括使用這些抗體治療疾病的方法?？?Ang-2抗體可用于防止Ang-2介導(dǎo)的Tie2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制血管發(fā)生。這種抑制作用的機制可包括抑制Ang-2與其受體Tie2的結(jié)合，抑制Ang-2誘導(dǎo)的Tie2信號傳導(dǎo)，或者增強Ang-2的清除，由此降低Ang-2與Tie-2結(jié)合的有效濃度。可通過這種治療機制治療的疾病包括但非限于腫瘤疾病，如黑素瘤，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，肝細胞(肝)癌，成膠質(zhì)細胞瘤，甲狀腺癌，胃癌，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌，子宮癌，腎癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，唾液腺癌和結(jié)腸直腸癌。其它本發(fā)明的實施方案包括特異性確定生物學(xué)樣品中Ang-2數(shù)量的診斷分析。所述分析試劑盒可包括抗-Ang-2抗體及檢測這種抗體的必需標記物。這些診斷分析可用于篩選血管發(fā)生相關(guān)疾病，包括但非限于腫瘤疾病，如黑素瘤，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，肝細胞(肝)癌，成膠質(zhì)細胞瘤，甲狀腺癌，胃癌，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌，子宮癌，腎癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，唾液腺癌和結(jié)腸直腸癌。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑，其中所述拮抗劑不結(jié)合Tie-2的ATP結(jié)合位點。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑，其中所述拮抗劑結(jié)合血管生成素-1和血管生成素-2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑，其中所述拮抗劑不是化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑，其中所述血管生成素-1拮抗劑活性和血管生成素-2拮抗劑活性包含在一個分子中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種拮抗劑，其中所述血管生成素-1拮抗劑活性和血管生成素-2拮抗劑活性包含在一個以上的分子中。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑，其中所述拮抗劑可結(jié)合i)Tie-2受體；ii)血管生成素-l和/或血管生成素-2;iii)Tie-2受體-血管生成素-l復(fù)合物；或者iv)Tie-2受體-血管生成素-2復(fù)合物，或者這些物質(zhì)的任何組合。在本發(fā)明的一個實施方案中，血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑可結(jié)合血管生成素-1和/或血管生成素-2和/或Tie-2，從而阻止血管生成素-1和血管生成素-2介導(dǎo)的Tie-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制血管發(fā)生。這種抑制作用的機制可包括i)所述拮抗劑與血管生成素-l的結(jié)合及抑制血管生成素-1與其受體Tie-2的結(jié)合，和/或ii)所述拮抗劑與血管生成素-2的結(jié)合及抑制血管生成素-2與其受體Tie-2的結(jié)合，和/或iii)增強血管生成素-1和/或血管生成素-2的清除，由此降低血管生成素-1和/或血管生成素-2可用于與Tie-2結(jié)合的有效濃度，或者這些作用機制的組合，足以拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性。不希望受到理論的束縛，可以拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的機制包括但非限于抑制血管生成素-1和血管生成素-2與受體Tie-2的結(jié)合，抑制血管生成素-1和血管生成素-2誘導(dǎo)的Tie-2信號傳導(dǎo)，或者增加血管生成素-1和血管生成素-2的清除，由此降低血管生成素-1和血管生成素-2的有效濃度。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種血管生成素-1和血管生成素-2生物學(xué)活性拮抗劑，其中所述拮抗劑是抗體。優(yōu)選所述抗體能在體外和體內(nèi)拮抗血管生成素-1和/或血管生成素-2的生物學(xué)活性。優(yōu)選所述抗體是多克隆或單克隆抗體。更優(yōu)選所述抗體是單克隆抗體，更優(yōu)選所述抗體是完全人單克隆抗體。最優(yōu)選所述抗體是完全人單克隆抗體3.193。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種結(jié)合與完全人單克隆抗體3.19.3結(jié)合的表位相同的表位的抗體。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種完全人抗體，其結(jié)合血管生成素-1并阻止血管生成素-1結(jié)合Tie-2。本發(fā)明另一實施方案是完全人單克隆抗體，其結(jié)合血管生成素-1并抑制血管生成素-1誘導(dǎo)的Tie-2磷酸化。在一個實施方案中，所述抗體結(jié)合血管生成素-1，Kd小于1納摩爾(nM)。更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于500皮摩爾(pM)結(jié)合。更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于100皮摩爾(pM)結(jié)合。更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于30皮摩爾(pM)結(jié)合。更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于20pM結(jié)合。甚至更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于10或5pM結(jié)合。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種完全人抗體，其結(jié)合血管生成素-2并阻止血管生成素-2結(jié)合Tie-2。本發(fā)明的另一實施方案是完全人單克隆抗體，其結(jié)合血管生成素-2并抑制血管生成素-2誘導(dǎo)的Tie-2磷酸化。在一個實施方案中，所述抗體結(jié)合血管生成素-2，Kd小于1納摩爾(nM)。更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于500皮摩爾(pM)結(jié)合。更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于100皮摩爾(pM)結(jié)合。更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于30皮摩爾(pM)結(jié)合。更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于20pM結(jié)合。甚至更優(yōu)選地，所述抗體以Kd小于10或5pM結(jié)合。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種雜交瘤，其產(chǎn)生如上述抗體的輕鏈和/或重鏈。優(yōu)選所述雜交瘤產(chǎn)生完全人單克隆抗體的輕鏈和/或重鏈。更優(yōu)選地，所述雜交瘤產(chǎn)生完全人單克隆抗體3.19.3、3.3.2或5.88.3的輕鏈和/或重鏈?；蛘撸鲭s交瘤產(chǎn)生結(jié)合與完全人單克隆抗體3.19.3、3.3.2或5.88.3結(jié)合的表位相同的一或多個表位的抗體。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了編碼如上述抗體的輕鏈或重鏈的核酸分子。優(yōu)選提供了編碼完全人單克隆抗體的輕鏈或重鏈的核酸分子。更優(yōu)選提供了編碼完全人單克隆抗體3.193的輕鏈或重鏈的核酸分子。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了包含如上述一或多個核酸分子的載體，其中所述載體編碼如上述抗體的輕鏈和/或重鏈。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了包含如上述載體的宿主細胞?；蛘咚鏊拗骷毎砂粋€以上的載體。另外，本發(fā)明的一個實施方案是產(chǎn)生抗體的方法，通過將宿主細胞在核酸分子被表達的條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生抗體，隨后回收所述抗體而進行。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種產(chǎn)生抗體的方法，包括用編碼如上述抗體的至少一種核酸分子轉(zhuǎn)染至少一種宿主細胞，在所述宿主細胞中表達所述核酸分子及分離所述抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種拮抗所述血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的方法，包括給予上述拮抗劑。所述方法可包括選擇需要治療與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的動物，給予所述動物治療有效量的血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的方法，包括給予如上述的抗體。所述方法可包括選擇需要治療與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的動物，給予所述動物治療有效量的拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的抗體。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了一種治療哺乳動物中疾病相關(guān)血管發(fā)生的方法，包括給予治療有效量的血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑。所述方法包括選擇需要治療與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的動物，給予所述動物治療有效量的血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了一種治療哺乳動物中與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的方法，包括給予治療有效量的拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的抗體。所述方法可包括選擇需要治療與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的動物，給予所述動物治療有效量的拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的抗體。所述抗體可以單獨給予，或者可以組合其它抗體或化療藥物或放療給予。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療哺乳動物中癌癥的方法，包括給予治療有效量的血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性拮抗劑。所述方法可包括選擇需要治療癌癥的動物，給予所述動物治療有效量的拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑。所述拮抗劑可以單獨給予，或者可以組合其它抗體或化療藥物或放療給予。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了一種治療哺乳動物中癌癥的方法，包括給予治療有效量的拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的抗體。所述方法可包括選擇需要治療癌癥的動物，給予所述動物治療有效量的拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的抗體。所述抗體可以單獨給予，或者可以組合其它抗體或化療藥物或放療給予。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性拮抗劑在生產(chǎn)用于治療與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了拮抗血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的抗體在生產(chǎn)用于治療與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明特別適用于在腫瘤患者中以單獨或部分依賴于Tie-2受體方式拮抗血管生成素-1或血管生成素-2。本發(fā)明的另一實施方案包括檢測哺乳動物組織、細胞或體液中血管生成素-1和/或血管生成素-2的分析試劑盒，以篩選血管發(fā)生相關(guān)疾病。所述試劑盒包括結(jié)合血管生成素-1和/或血管生成素-2的抗體，及表示所述抗體與血管生成素-1和/或血管生成素-2(如果存在的話)反應(yīng)的方式。所述抗體可以是單克隆抗體。在一個實施方案中，結(jié)合血管生成素-2的抗體是標記的。在另一個實施方案中，所述抗體是未標記的一級抗體，所述試劑盒進一步包括檢測所述一級抗體的方式。在一個實施方案中，所述方式包括一種標記的二級抗體，其是一種抗免疫球蛋白。優(yōu)選所述抗體用選自熒光染料、酶、放射性核素及不透射線的材料的標記物標記。本發(fā)明關(guān)于抗-Ang-2抗體的其它實施方案、特征在下文詳細描述。序列表本發(fā)明的實施方案包括在下表1中列出的特異性抗-Ang-2抗體。這個表報道了每種抗-Ang-2抗體的標識號，以及相應(yīng)重鏈和輕鏈基因的SEQID編號。給出了每種抗體的標識號，其包括由一或兩個小數(shù)點隔開的兩或三個數(shù)字。對于大多數(shù)抗體而言，僅列出了由一個小數(shù)點隔開的兩個標識號。然而，在一些情況中，制備了一種抗體的幾個克隆。盡管所述克隆具有與親代序列相同的核酸和氨基酸序列，但它們也是通過在第二個小數(shù)點右側(cè)的數(shù)字而標示克隆編號而單獨列出的。因此，例如抗體5.35的核酸和氨基酸序列與抗體535.1、535.2和5.35.3的序列相同。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>術(shù)語除非特別指出，本文使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含義。另外，除非特別需要，則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。通常地，本文描述的細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)和寡核苷酸或多核苷酸化學(xué)及雜交方面的術(shù)語為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知及常規(guī)使用。使用標準技術(shù)進行重組DNA、寡核苷酸合成、及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔、脂染)。根據(jù)廠商說明書或如本領(lǐng)域通常確認的或者如本文所述進行酶反應(yīng)和純化技術(shù)。前述技術(shù)和方法通常根據(jù)本領(lǐng)域熟知的及在許多普通或本說明書引用及論述的更特殊的參考文獻所述的常規(guī)方法進行。見例如并入作參考的Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001))所述。本文描述的分析化學(xué)、合成有機化學(xué)及醫(yī)藥化學(xué)的實驗程序和技術(shù)中的所用術(shù)語為本領(lǐng)域所熟知和通用。使用標準技術(shù)進行化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配方、及輸送和治療患者。如本發(fā)明所用，如下術(shù)語除非特別說明則應(yīng)具有如下含義拮抗劑可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干擾(RNAi)、反義RNA、重組蛋白質(zhì)、抗體、或者其綴合物或融合蛋白。關(guān)于RNAi，見MilhavetO，GaryDS，MattsonMP.(PharmacolRev.2003Dec;55(4):629-48.Review,),關(guān)于反義RNA，見OpalinskaJB，GewirtzAM.(SciSTKE.2003Oct28;2003(206):pe47.)。疾病相關(guān)的血管發(fā)生可以是任何異常、不希望的或病理性血管發(fā)生，例如腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生。血管發(fā)生相關(guān)的疾病包括但非限于非實體腫瘤如白血病、多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤，及實體腫瘤如黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、成膠質(zhì)細胞瘤、甲狀腺癌、膽管癌、骨癌、胃癌、腦/CNS癌、頭頸癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腎癌、睪丸癌、卵巢癌、皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、肌肉腫瘤、神經(jīng)元腫瘤、食管癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、陰道癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、胸膜/腹膜腫瘤、唾液腺癌和表皮樣癌?；衔锸侵溉魏涡》肿恿康幕衔?，分子量低于約2000道爾頓。術(shù)語"Ang-2"是指血管生成素-2分子。術(shù)語"中和"當(dāng)描述抗體時是指抗體消除或顯著降低靶抗原活性的能力。因此，"中和"抗-Ang-2抗體能消除或顯著降低Ang-2的活性。中和Ang-2抗體可例如通過阻斷Ang-2與其受體Tie2的結(jié)合而起作用。通過阻斷這種結(jié)合，Tie2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被顯著或完全消除。理想的抗Ang-2的中和抗體抑制血管發(fā)生。如本文所用術(shù)語"分離的多核苷酸"是指已經(jīng)從其天然發(fā)生的環(huán)境中分離的多核苷酸。這種多核苷酸可以是基因組、cDNA或合成的多核苷酸。分離的多核苷酸優(yōu)選與其天然締合的所有或部分多核苷酸不相結(jié)合。所述分離的多核苷酸可以與天然不連接的另一種多核苷酸可操縱地連接。另外，分離的多核苷酸優(yōu)選天然不以較大序列的一部分而出現(xiàn)。術(shù)語"分離的蛋白質(zhì)"是指已經(jīng)從其天然發(fā)生的環(huán)境中分離出的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)可衍生自基因組DNA、cDNA、重組DNA、重組RNA或者是合成的或者這些組合，根據(jù)其來源或衍生來源，所述"分離的蛋白質(zhì)"(1)與自然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)不相結(jié)合，(2)沒有相同來源的其它蛋白質(zhì)，例如沒有鼠蛋白質(zhì)，(3)由不同物種的細胞表達，或者(4)自然不發(fā)生。在本文作為專業(yè)術(shù)語使用的術(shù)語"多肽"是指天然蛋白質(zhì)、多肽序列的片段或類似物。因此，天然蛋白質(zhì)、片段及類似物是所述多肽屬種。本發(fā)明優(yōu)選的多肽包含人重鏈免疫球蛋白分子和人K輕鏈免疫球蛋白分子，以及包含通過重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子如1C或X輕鏈免疫球蛋白分子的組合形成的抗體分子(反之亦然)，以及其片段或類似物。本發(fā)明優(yōu)選的多肽也可僅包含人重鏈免疫球蛋40白分子或其片段。如本文針對一個物體所用術(shù)語"天然發(fā)生的"是指該物體可在自然界發(fā)現(xiàn)。例如，存在于生物體(包括病毒)中可分離自一個天然來源及未在實驗室中或另外人工有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然發(fā)生的。如本文所用術(shù)語"可操縱地連接"是指使所述成分以指定方式發(fā)揮作用的放置方式。例如，控制序列與編碼序列"可操縱地連接"是指以這種方式所述編碼序列的表達在與控制序列相容的條件下完成。如本文所用術(shù)語"控制序列"是指作用于或影響與其連接的編碼序列的表達和加工所必需的多核苷酸序列。這種控制序列的性質(zhì)依賴于宿主生物體而有所不同；在原核生物中，這種控制序列通常包括啟動子、核糖體結(jié)合位點及轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中，這種控制序列可包括啟動子、增強子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄終止序列、聚腺苷酸化信號序列，及5鄰3'非翻譯區(qū)。術(shù)語"控制序列"是指最少包括其存在是表達和加工所必需的所有成分，也可包括其存在是有利的其它成分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。術(shù)語"多核苷酸"是指長度為至少10個堿基的核苷酸的聚合形式，是核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型核苷酸的修飾形式，或者RNA-DNA雜合雙鏈體。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。術(shù)語"寡核苷酸"是指包括通過天然發(fā)生的及非天然發(fā)生的鍵連接在一起的天然發(fā)生的及修飾的核苷酸。寡核苷酸是通常包含200個或更少堿基的多核苷酸亞單位。優(yōu)選地，寡核苷酸的長度為10—60個堿基，最優(yōu)選長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個堿基。寡核苷酸通常是單鏈的，例如探針；但是寡核苷酸也可以是雙鏈的，例如用于構(gòu)建基因突變體。寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。術(shù)語"天然發(fā)生的核苷酸"是指包括脫氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。術(shù)語"修飾的核苷酸"是指包括具有修飾或取代的糖基團等的核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸鍵"是指包括如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、phosphoroselenoate、phosphorodiselenoate、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、氨基磷酸鹽等的寡核苷酸鍵。見例如LaPlaneheetal.Nucl.AcidsRes.14:卯81(1986);Stecetal.J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984);Steinetal.Nucl.AcidsRes.16:3209(1988);Zonetal.Anti-CancerDrugDesign6:539(1991);Zonetal.OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,pp.87-108(F.Eckstein,Ed,，OxfordUniversityPress,OxfordEngland(1991));Stecetal.U.S.PatentNo.5,151,510;UhlmannandPeymanChemicalReviews90:543(19卯)所述，所述文獻內(nèi)容在此并入作參考。如果需要，則寡核苷酸可包括一個標記以進行檢測。術(shù)語"選擇性雜交"是指可檢測及特異性結(jié)合。多核苷酸、寡核苷酸及其片段在使與非特異性核酸的可檢測結(jié)合的可測量降低至最小的雜交和洗滌條件下與核酸鏈選擇性雜交。可使用高度嚴格條件達到本領(lǐng)域己知及本文論述的選擇性雜交條件。通常地，多核苷酸、寡核苷酸或者抗體片段與感興趣的核酸序列之間的核酸序列同源性為至少80%，更優(yōu)選為至少85%、90%、95%、99%和100%同源性。兩個氨基酸序列如果其序列之間部分或完全相同，則這兩個氨基酸序列是"同源的"。例如，85%同源性是指當(dāng)將兩個氨基酸序列進行最大匹配排列對比時，85%的氨基酸是相同的。在最大匹配中允許缺口(在匹配的兩個序列中的任一個中);優(yōu)選缺口長度為5個或更少，更優(yōu)選缺口長度為2個或更少?；蛘呒皟?yōu)選地，如本文所用的該術(shù)語所描述，所述兩個蛋白質(zhì)序列在使用具有突變數(shù)據(jù)矩陣及缺口罰分為6或更高的ALIGN程序進行排列對比分值為5(標準差單位)以上，則這兩個蛋白質(zhì)序列是同源的。見Dayhoff，MO.,inAtlasofProteinSequenceandStructure,pp.101-110(Volume5，NationalBiomedicalResearchFoundation(1972))及Supplement2tothisvolume,pp.1-10。當(dāng)使用ALIGN程序最佳排列對比兩個序列或其一部分時，如果其氨基酸是大于或等于50%相同的，則這兩個序列或其一部分是更優(yōu)選同源的。應(yīng)意識到可以是在兩個直系同源序列內(nèi)同源的不同區(qū)域。例如，小鼠和人直向同源物的功能位點較非功能區(qū)可以具有較高程度的同源性。本文所用術(shù)語"相應(yīng)于"是指一個多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的(即相同的，非嚴格進化相關(guān))，或者一個多肽序列與參考多肽序列是相同的。對比之下，本文所用術(shù)語"互補于"是指所述互補序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的。例如，核苷酸序列"TATAC"相應(yīng)于參考序列"TATAC"，與參考序列"GTATA"互補。如下術(shù)語用于描述兩或多個多核苷酸或氨基酸序列之間的序列關(guān)系"參考序列"、"對比窗"、"序列相同性"、"序列相同性百分比"，及"基本上相同性"。"參考序列"是指用作序列對比基礎(chǔ)的指定序列。參考序列可以是較大序列的亞單位，例如序列表中示出的全長cDNA或基因序列的節(jié)段，或者可以包含完全cDNA或基因序列。通常地，參考序列的長度為至少18個核苷酸或者6個氨基酸，通常為至少24個核苷酸或8個氨基酸，經(jīng)常是至少48個核苷酸或16個氨基酸。由于兩個多核苷酸或氨基酸序列可以均(l)包含在兩個分子之間相似的一個序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，及(2)可進一步包含在兩個多核苷酸或氨基酸序列之間不同的一個序列，因此兩(或多)個分子之間的序列對比典型在"對比窗"中對比兩個分子的序列而進行，以鑒別和對比序列相似性的局部區(qū)域。如本文所用術(shù)語"對比窗"是指至少大約18個連續(xù)的核苷酸位置或大約6個氨基酸的一個概念上的節(jié)段，其中將所述多核苷酸序列或氨基酸序列與至少18個連續(xù)核苷酸或6個氨基酸序列的參考序列進行對比，及其中所述對比窗中多核苷酸序列的一部分可包括與參考序列(不包含添加或缺失)相比有20%或更少的添加、缺失、取代等(即缺口)以進行兩個序列的最佳排列對比。對于排列對比窗而進行的序列的最佳排列對比可通過SmithandWatermanAdv.Appl，Math.2:482(1981)的局部同源算法、通過NeedlemanandWunschJ.Mol.Biol.48:443(1970)的同源排列對比算法、通過PearsonandLipmanProc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的相似性搜索方法、通過這些算法的計算機執(zhí)行方法(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA,禾卩TFASTA，theWisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，(GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,Wis.),GENEWORKSTM，或MACVECTOR⑧軟件包)，或者通過審査(inspection)進行，選擇通過各種方法產(chǎn)生的最佳排列對比(即在對比窗中產(chǎn)生最高百分比的同源性)。術(shù)語"序列相同性"是指在對比窗中的兩個多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即基于核苷酸-核苷酸或殘基-殘基)。術(shù)語"序列相同性百分比"是通過在對比窗中對比兩個最佳排列的序列，確定這兩個序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基(例如A、T、C、G、U或I)或氨基酸殘基的位置數(shù)目，產(chǎn)生匹配位置數(shù)目，將匹配位置數(shù)目除以對比窗中總位置數(shù)目(即窗大小)，將結(jié)果乘以100而獲得序列相同性百分比。如本文所用術(shù)語"基本上相同性"表示多核苷酸或氨基酸序列的一種特性，其中所述多核苷酸或氨基酸包含與至少18個核苷酸(6個氨基酸)位置的對比窗之上的參考序列相對比具有至少85%序列相同性、優(yōu)選至少90—95%序列相同性、更優(yōu)選至少99%序列相同性的序列，所述對比窗通常為至少24—48個核苷酸(8—16個氨基酸)位置，其中所述序列相同性百分比通過在對比窗中將參考序列與可包含參考序列的共20%或更少的缺失或添加的序列進行對比而計算。所述參考序列可以是較大序列的亞單位。如本文所用，常規(guī)應(yīng)用二十個常規(guī)氨基酸及其縮略語。見并入本文作參考的Immunology-ASynthesis(2ndEdition,E.S.GolubandD.R.Gren，Eds.，SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))所述。所述二十個常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如D-氨基酸)、非天然的氨基酸如a、(x-雙取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸，及其它非常規(guī)的氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的合適成分。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、s-N，N,N-三甲基賴氨酸、s-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、cj-N-甲基精氨酸，及其它相似的氨基酸和亞氨基酸(例如4-羥基脯氨酸)。在本文所用多肽表示法中，根據(jù)標準甩法和慣例，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。相似地,除非特別說明，單鏈多核苷酸序列的左手末端是5'末端，雙鏈多核苷酸序列的左手方向稱作5'方向。新生的RNA轉(zhuǎn)錄體的5'至3'添加的方向稱作轉(zhuǎn)錄方向；在具有與所述RNA相同序列的DNA鏈上的并且位于所述RNA轉(zhuǎn)錄體的5'末端的5'的序列區(qū)稱作"上游序列"；在具有與所述RNA相同序列的DNA鏈上的并且位于所述RNA轉(zhuǎn)錄體的3'末端的3'的序列區(qū)稱作"下游序列"。如對于多肽所用術(shù)語"實質(zhì)上相同性(substantialidentity)"是指兩個多肽序列當(dāng)通過GAP或BESTFIT程序使用默認缺口權(quán)重進行最佳排列對比時，呈現(xiàn)至少80%的序列相同性、優(yōu)選至少90%的序列相同性、更優(yōu)選至少95%的序列相同性，最優(yōu)選至少99%序列相同性。優(yōu)選地，通過保守氨基酸取代，不同的殘基位置不相同。保守的氨基酸取代是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸;具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含有酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族倆鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是纈氨酸一亮氨酸一異亮氨酸，苯丙氨酸一酪氨酸，賴氨酸一精氨酸，丙氨酸一纈氨酸，谷氨酸一天冬氨酸，及天冬酰胺一谷氨酰胺。如本文所論述，本發(fā)明涵蓋了抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中少量變化，條件是所述氨基酸序列中的變化保持與本文所述抗體或免疫球蛋白分子至少75%、更優(yōu)選至少80%、卯％、95%及更優(yōu)選99%的序列相同性。特別地，本發(fā)明涵蓋保守氨基酸置換。保守置換是在具有相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的置換。遺傳編碼的氨基酸通常被分為如下家族(l)酸性-天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性=賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性-丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)無電荷極性=甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。更優(yōu)選的家族是絲氨酸和蘇氨酸是脂肪族-羥基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含有酰胺的家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂肪族家族；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族家族。例如，有理由期望亮氨酸由異亮氨酸或纈氨酸置換、天冬氨酸由谷氨酸置換、蘇氨酸由絲氨酸置換、或者氨基酸由具有結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸的相似置換對所得分子的結(jié)合功能或性質(zhì)無顯著作用，特別是如果所述置換不涉及構(gòu)架位點內(nèi)的氨基酸。氨基酸改變是否產(chǎn)生一種功能性肽可易于通過分析所述多肽衍生物的特異性活性而確定。本文詳細描述了分析方法?？贵w或免疫球蛋白分子的片段或類似物可易于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些方法制備。片段或類似物的優(yōu)選氨基和羧基末端在功能性結(jié)構(gòu)域的邊界附近出現(xiàn)。結(jié)構(gòu)和功能性結(jié)構(gòu)域可以通過將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公開或私有的序列數(shù)據(jù)庫進行對比而鑒別。優(yōu)選地，使用計算機對比方法鑒別在已知結(jié)構(gòu)和/或功能的其它蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的序列基序或預(yù)測的蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域已知鑒別折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法(Bowieetal.Science253:164(1991))。因此，前述實例表明本領(lǐng)域技術(shù)人員可以識別可用于限定本文所述抗體的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。優(yōu)選的氨基酸取代是(l)降低對蛋白酶解的易感性，(2)降低對氧化的易感性，(3)改變形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合親和性，(4)改變結(jié)合親和性，及(4)賦予或修飾這種類似物的其它物理化學(xué)或功能性質(zhì)。類似物可包括除了天然發(fā)生的肽序列之外的序列的各種突變蛋白。例如，單一或多個氨基酸取代(優(yōu)選保守氨基酸取代)可以在天然發(fā)生的序列中產(chǎn)生(優(yōu)選在所述多肽形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域之外的部分中產(chǎn)生)。保守的氨基酸取代應(yīng)不顯著改變親代序列的結(jié)構(gòu)特性(例如氨基酸置換應(yīng)不趨于破壞在親代序列中出現(xiàn)的螺旋，或者不破壞親代序列特征性的其它類型二級結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域認可的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的例子在Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton，Ed.，W,H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C.B認denandJ.Tooze，eds.，GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));及Thorntonetat.Nature354:105(1991)中描述，所述文獻在此并入本文作參考。如本文所用術(shù)語"多肽片段"是指這樣的多肽，其具有氨基末端和/或羧基末端缺失、但仍保留與例如從全長cDNA序列中推導(dǎo)出的天然發(fā)生的序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸序列。所述片段的長度典型為至少5、6、8或10個氨基酸，優(yōu)選至少14個氨基酸、更優(yōu)選至少20個氨基酸、通常至少50個氨基酸、更優(yōu)選至少70個氨基酸。如本文所用術(shù)語"類似物"是指這樣的多肽，其包含與推導(dǎo)的氨基酸序列的一部分具有實質(zhì)上相同性并且具有至少一種如下性質(zhì)的至少25個氨基酸的一個節(jié)段(1)在合適的結(jié)合條件下特異性結(jié)合Ang-2，(2)阻斷適當(dāng)?shù)腁ng-2結(jié)合的能力，或者(3)抑制Ang-2活性的能力。典型地，多肽類似物包含與天然發(fā)生的序列相關(guān)的保守氨基酸取代(或者添加或缺失)。類似物長度典型為至少20個氨基酸，優(yōu)選至少50個氨基酸或更長，通常可以是全長天然發(fā)生的多肽那樣長。肽類似物通常用于制藥工業(yè)，作為具有與模板肽相似性質(zhì)的非肽藥物。這些類型的非肽化合物稱作"肽模擬物"(Fauchere，JAdv.DrugRes.15:29(1986);VeberandFreidingerTINSp.392(1985);andEvansetal.J.Med.Chem.30:1229(1987)，所述文獻在此并入本文作參考)。這種化合物通常借助于計算機分子建模而產(chǎn)生。與具有治療作用的肽結(jié)構(gòu)相似的肽模擬物可用于產(chǎn)生相等的治療或預(yù)防作用。通常地，肽模擬物與范例多肽(即具有生物化學(xué)性質(zhì)或藥物學(xué)活性的多肽)如人抗體結(jié)構(gòu)相似，但有一或多個肽鍵任選通過本領(lǐng)域熟知的方法由選自如下的鍵置換-CH2NH-、-CH2S-、-CHrCH2-、-CHK:H-(順式和反式)、-coch2-、-(^(011)(:112-及-01280-。共有序列的一或多個氨基酸由相同類型的D-氨基酸的系統(tǒng)取代(例如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。另外，包含共有序列或基本相同的共有序列變化的約束肽(constrainedpeptide)可以通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生(RizoandGieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992),所述文獻在此并入本文作參考)；例如通過加入能形成使所述肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫鍵的內(nèi)在半胱氨酸殘基。如本文所用，術(shù)語"抗體"是指包含至少一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽或一組多肽，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是通過具有與抗原的抗原決定簇的特征互補的內(nèi)部表面形狀和電荷分布的三維結(jié)合空間的多肽鏈的折疊而形成的?？贵w典型具有一種四聚體形式，包含兩對相同多肽鏈，每對均具有一個輕鏈和一個重鏈。每個輕鏈/重鏈對的可變區(qū)均形成一個抗體結(jié)合位點。如本文所用，"靶向結(jié)合劑"是與靶位點優(yōu)先結(jié)合的抗體或其結(jié)合片段。在一個實施方案中，所述靶向結(jié)合劑僅特異于一個靶位點。在其它實施方案中，所述靶結(jié)合劑特異于一個以上的靶位點。在一個實施方案中，所述靶結(jié)合劑可以是單克隆抗體，所述靶位點可以是表位?？贵w的"結(jié)合片段"是通過重組DNA技術(shù)或者通過酶或化學(xué)切割完整的抗體而產(chǎn)生的。結(jié)合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和單鏈抗體。除了"雙特異性"或"雙功能性"抗體之外的抗體是指具有相同的每一個結(jié)合位點。當(dāng)過量的抗體使與反受體結(jié)合的受體的數(shù)量降低至少大約20%、40%、60%或80%及更通常高于85%時(在體外競爭結(jié)合分析中測定)，所述抗體基本上抑制受體與反受體的粘附?？贵w可以是寡克隆抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR-接合的抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、催化抗體、嵌合抗體、人源化抗體、完全人抗體、抗獨特型抗體及可以可溶或結(jié)合形式標記的抗體以及所述抗體的片段、變體或衍生物，單獨或與其它已知技術(shù)提供的氨基酸序列組合?？贵w可以來自任何物種。術(shù)語"抗體"也包括本發(fā)明抗體的結(jié)合片段；所述片段例如包括Fv、Fab、Fab'、單鏈抗體(svFc)、二聚化可變區(qū)(Diabody)及二硫化物穩(wěn)定的可變區(qū)(dsFv)。術(shù)語"表位"包括能特異結(jié)合免疫球蛋白或T細胞受體的任何蛋200580048270.9說明書第45/123頁白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子如氨基酸或糖側(cè)鏈的^[七學(xué)活性表面組組成，及不總是具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征，以及特異性電荷特征。當(dāng)解離常數(shù)《lpM、優(yōu)選《100nM及最優(yōu)選《10nM時，所述抗體與所述抗原特異性結(jié)合。本文所用術(shù)語"制劑"是指化學(xué)化合物，化學(xué)化合物的混合物，生物學(xué)高分子，或者從生物學(xué)材料中制成的提取物。關(guān)于Ang-2多肽所用術(shù)語"活性的"或者"活性"是指Ang-2多肽的一部分，其具有天然Ang-2多肽的生物學(xué)或免疫學(xué)活性。本文所用術(shù)語"生物學(xué)的"是指得自天然Ang-2多肽活性的生物學(xué)功能。優(yōu)選的Ang-2生物學(xué)活性包括例如Ang-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生。本文所用術(shù)語"哺乳動物"是指被認為是哺乳動物的任何動物。優(yōu)選所述哺乳動物是人。木瓜蛋白酶對抗體的消化產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段Fab片段和Fc片段，F(xiàn)c片段不具有抗原結(jié)合活性但具有結(jié)晶能力。胃蛋白酶對抗體的消化產(chǎn)生F(ab')2片段，其中抗體分子的兩個臂保持連接，包含兩個抗原結(jié)合位點。F(ab')2片段具有與抗原交聯(lián)的能力。本文所用術(shù)語"Fv"是指抗體的最小片段，其既保留抗原識別位點也保留抗原結(jié)合位點。本文所用術(shù)語"Fab"是指抗體的片段，其包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"mAb"是指單克隆抗體。本文所用術(shù)語"脂質(zhì)體"是指小運載體，其可用于將可包括本發(fā)明的Ang-2多肽或者這種Ang-2多肽的抗體的藥物輸送至晡乳動物。如本文所用，術(shù)語"標記"或"標記的"是指向多肽中加入可檢測的部分，例如放射性標記、熒光標記、酶標記、化學(xué)發(fā)光標記或者生物素基團。放射性同位素或放射性核素可包括311、14C、15N、35S、9°Y、"Tc、"1111、1251、1311，熒光標記可包括羅丹明、鑭族元素?zé)晒夥刍騀ITC,酶標記可包括辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶。如本文所用，術(shù)語"藥物制劑或藥物"是指當(dāng)正確給予患者時能誘導(dǎo)希望的治療作用的化學(xué)化合物或組合物。本文所用其它化學(xué)術(shù)語根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)用法應(yīng)用，例如在此并入本文作參考的TheMcGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(Parker,S.，Ed.，McGraw-Hill,SanFrancisco(1985))所述。如本文所用，"基本上純的"是指目標物種是最主要存在物種(即在摩爾基礎(chǔ)上，其比組合物中任何其它個別物種均更充足)，優(yōu)選基本上純的級分是其中目標物種包含至少大約50%(基于摩爾)的所有存在的高分子物種的組合物。通常地，基本上純的組合物包含組合物中存在的大約80%以上的所有高分子物種，更優(yōu)選大約85%、90%、95%及99%以上。最優(yōu)選地，所述目標物種被純化為基本同質(zhì)的(組合物中污染物通過常規(guī)檢測方法不可檢測到)，其中所述組合物基本由一種高分子物種組成。術(shù)語"患者"包括人及動物。人抗體和抗體的人源化人抗體避免了一些與具有小鼠或大鼠可變和/或恒定區(qū)的抗體相關(guān)問題。這種小鼠或大鼠衍生的蛋白質(zhì)的存在可以導(dǎo)致抗體的快速清除或者可以導(dǎo)致患者針對所述抗體的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。為了避免利用小鼠或大鼠衍生的抗體，可以通過將功能性人抗體基因座導(dǎo)入嚙齒動物、其它哺乳動物或動物中，由此所述嚙齒動物、其它晡乳動物或動物產(chǎn)生完全人抗體，從而產(chǎn)生完全人抗體。一種產(chǎn)生完全人抗體的方法是通過使用小鼠XenoMous浐品系，其已經(jīng)工程化為含有小于等于1000kb大小的人重鏈基因座和K輕鏈基因座的種系構(gòu)型片段。見Mendezetal.NatureGenetics15:146-156(1997)和GreenandJakobovitsJ.Exp.Med.188:483-495(1998)所述。XenoMouse②品系可得自Abgenix公司(Fremont,CA)。小鼠XenoMous^品系的產(chǎn)生在如下文獻中進一步論述和描繪19卯年1月12日申請的美國專利申請系列號07/466,008、1990年11月8曰申請的07/610,515、1992年7月24日申請的07/919,297、1992年7月30日申請的07/922,649、1993年3月15日申請的08/031,801、1993年8月27日申請的08/112,848、1994年4月28日申請的08/234,145、1995年1月20日申請的08/376,279，、1995年4月27日申請的08/430,938、1995年6月5日申請的08/464,584、1995年6月5日申請的08/464,582、1995年6月5日申請的08/463,191、1995年6月5日申請的08/462,837、1995年6月5日申請的08/486,853、1995年6月5日申請的08/486,857、1995年6月5日申請的08/486,859、1995年6月5日申請的08/462,513、1996年10月2日申請的08/724,752、19%年12月3日申請的08/759,620、2001年11月30日申請的美國出版物2003/0093820及美國專利No.6，162，％3、6，150，584、6，114，598、6，075，181和5,939,598及日本專利No.3068180B2、3068506B2和3068507B2。也見于1996年6月12日準予公布的歐洲專利No.，EP0463151Bl，1994年2月3日公布的國際專利申請No.WO94/02602，1996年10月31日公布的國際專利申請No.WO96/34096，1998年6月11日公布的WO98/24893，2000年12月21日公布的WO00/76310。上述引用的專利、申請和參考文獻在此均以其全文并入作參考。在另一種方法中，包括GenPharmInternational公司，利用"小基因座(minilocus)"方法。在所述小基因座方法中，通過包含Ig基因座的一部分(各個基因)而模擬外源Ig基因座。因此，一或多個Vh基因、一或多個Dh基因、一或多個Jh基因、一個p恒定區(qū)及通常另一個恒定區(qū)(優(yōu)選Y恒定區(qū))形成一個構(gòu)建體，以插入動物中。這種方法在Surani等的美國專利No.5,545,807及Lonberg和Kay的美國專利Nos.5，545，806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5，661，016、5，770，429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5，874，299和6,255,458，Krimpenfort和Bems的美國專利No.5，591，669和6,023.010，Berns等的美國專利Nos.5，612，205、5,721,367和5，789，215，及Choi和Dunn的美國專利No.5,643,763，及GenPharm國際美國專利申請系列l(wèi)的0年8月29日申請的No.07/574,748、1990年8月31日申請的07/575,962、1991年12月17日申請的07/810，279、1992年3月18日申請的07/853,408、1992年6月23日申請的07/904,068、1992年12月16日申請的07膽,860、1993年4月26日申請的08/053,131、1993年7月22日申請的08/096,762、1993年11月18日申請的08/155,301、1993年12月3日申請的08/161,739、1993年12月10日申請的08/165,699、1994年3月9日申請的08/209,741中描述，所述文獻在此并入本文作參考。也見于歐洲專利No.0546073Bl、國際專利申請?zhí)朩O92/03918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852和WO98/24884及美國專利No.5,981,175所述，所述文獻在此以其全部并入本文作參考。進一步見Tayloretal,1992、Chenetal，1993、Tuaillonetal,1993、Choietal，1993、Lonbergetal，(1994)、Tayloretal,(1994)及Tuaillonetal,(1995)、Fishwildetal,(1996)所描述，所述文獻在此以其全文并入作參考。Kirin己經(jīng)證實了從通過微細胞融合己經(jīng)導(dǎo)入了大量染色體部分或全部染色體的小鼠中產(chǎn)生人抗體。見歐洲專利申請?zhí)?73288和843961所述，所述文獻在此以其全文并入作參考。另外，已經(jīng)產(chǎn)生了Kirin'sTc小鼠與Medarex's小基因座(Humab)小鼠雜交培育而產(chǎn)生的KMTM-小鼠。這些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)及Genpharm小鼠的k鏈轉(zhuǎn)基因(Ishidaetal，CloningStemCells,(2002)4:91-102)。人抗體也可以通過體外方法產(chǎn)生。合適的例子包括但非限于噬菌體展示(CAT，Morphosys,Dyax，Biosite/Medarex，Xoma,Symphogen,Alexion(先前稱作Proliferon)，Affimed)、核糖體展示(CAT)、酵母展示等?？贵w的制備如本文所述，抗體是通過利用如下文描述的XenoMouse(g)技術(shù)制備的。然后，這種小鼠能產(chǎn)生人免疫球蛋白分子和抗體，不能產(chǎn)生小鼠免疫球蛋白分子和抗體。用于實現(xiàn)該目的的技術(shù)在本文發(fā)明背景章節(jié)中揭示的專利、申請和參考文獻中揭示。然而，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠及從中產(chǎn)生抗體的優(yōu)選實施方案在如下文獻中揭示1996年12月3日申請的美國專利申請系列No.08/759,620及1998年6月11日公布的國際專利申請Nos.WO98/24893及2000年12月21日公布的WO00/76310,所述文獻在此并入作參考。也見于Mendezetal.NatureGenetics15:146-156(1997)所述，所述文獻在此并入作參考。通過應(yīng)用這種技術(shù)，產(chǎn)生了多種抗原的完全人單克隆抗體?；旧?，將小鼠XenoMouse⑧品系用感興趣的抗原(例如Ang-2)免疫，從超免疫的小鼠中回收淋巴細胞(如B-細胞)，將回收的淋巴細胞與骨髓型細胞系融合以制備無限增殖的雜交瘤細胞系。對這些雜交瘤細胞系進行篩選及選擇，以鑒別產(chǎn)生特異于所述感興趣的抗原的抗體。本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異于Ang-l和Ang-2的抗體的多個雜交癯細胞系的生產(chǎn)方法。另外，本發(fā)明提供了由這種細胞系產(chǎn)生的抗體的鑒定，包括對這種抗體的重鏈和輕鏈進行核苷酸和氨基酸序列分析。或者，代替與骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，可以對B細胞進行直接分析。例如，可以從超免疫的XenoMouse⑧小鼠分離CD19+B細胞，使所述細胞增殖及分化為分泌抗體的漿細胞。然后對細胞上清中的抗體通過ELISA篩選針對Ang-2免疫原的反應(yīng)性。也可以對上清篩選針對Ang-2片段的免疫反應(yīng)性，以進一步對結(jié)合Ang-2上感興趣的功能結(jié)構(gòu)域的不同抗體作圖。對所述抗體也可以針對Ang-l、Ang-3或Ang-4、其它相關(guān)的人趨化因子進行篩選，及針對大鼠、小鼠、非人靈長類動物如Cynomolgus猴篩選Arig-2的直向同源物，最后確定物種的交叉反應(yīng)性。來自含有感興趣的抗體的孔的B細胞可以通過多種方法無限增殖化，包括通過融合從一個或多個孔中產(chǎn)生雜交瘤，或者通過用EBV感染或通過已知的無限增殖化基因轉(zhuǎn)染，然后鋪板于合適的培養(yǎng)基中而進行?；蛘撸褂肁ng-l或Ang-2特異性溶血性噬斑分析分離分泌具有所需特異性的抗體的單個漿細胞(見例如Babcooketal，Pro"Natl.Acad.Sci.USA93:784348(1996》。耙向裂解的細胞優(yōu)選是用Ang-2抗原包被的綿羊紅細胞(SRBC)。在篩選也能拮抗血管生成素-1的抗體中，可同樣使用上述方法，以血管生成素-1代替血管生成素-2。在存在含有分泌感興趣的免疫球蛋白及補體的槳細胞的B細胞培養(yǎng)物的情況中，噬斑的形成表明特異性Ang-l/Ang-2-介導(dǎo)的所述感興趣的漿細胞周圍的綿羊紅細胞的裂解?？梢苑蛛x所述噬斑中心的單一抗原特異性漿細胞，從所述單一漿細胞中分離編碼所述抗體特異性的遺傳信息。使用反轉(zhuǎn)錄及隨后的PCR(RT-PCR)，可以克隆編碼所述抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA。然后，可將這種克隆的DNA進一步插入合適的表達載體中，優(yōu)選載體盒如pcDNA，更優(yōu)選如含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的這種pcDNA載體。然后將產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)染進宿主細胞中，例如HEK293細胞、CHO細胞，在經(jīng)修改為適合誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、選擇轉(zhuǎn)化體或者擴增編碼希望序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通常，通過融合的雜交瘤產(chǎn)生的抗體是具有完全人k或)i輕鏈的人lgG2重鏈。本文描述的抗體具有人IgG4重鏈以及IgG2重鏈?？贵w也可以是其它人同種型，包括IgGl。當(dāng)通過固相和液相技術(shù)測定時，所述抗體具有高親和性，典型具有Kd為大約10"至大約10"M或更低。優(yōu)選Kd為至少M的抗體抑制Ang-l和/或Ang-2的活性。如將為本領(lǐng)域所意識到，抗體可以在除了雜交瘤細胞系之外的細胞系中表達。編碼特定抗體的序列可用于轉(zhuǎn)化合適的哺乳動物宿主細胞?？梢酝ㄟ^任何已知的方法進行轉(zhuǎn)化，以將多核苷酸導(dǎo)入宿主細胞中，包括例如在病毒中包裝所述多核苷酸(或者包裝進病毒載體中)及用病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細胞或者通過本領(lǐng)域己知的轉(zhuǎn)染方法進行，例如美國專利Nos.4,399,216、4，912，040、4,740,461和4,959,455所例證(所述專利在此并入本文作參考)。所用的轉(zhuǎn)化方法依賴于被轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動物細胞中的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，磷酸鈣沉淀，polybrene介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融合，電穿孔，將所述多核苷酸包囊在脂質(zhì)體中，及將DNA直接顯微注射進細胞核中?？捎糜诒磉_的宿主的晡乳動物細胞系為本領(lǐng)域所熟知，包括得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的許多無限增殖化的細胞系，包括但非限于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如HepG2)、人上皮腎293細胞、及許多其它細胞系。通過確定哪個細胞系具有高表達水平及產(chǎn)生具有基本的Ang-2結(jié)合性質(zhì)的抗體以選擇特別優(yōu)選的細胞系?；趍Ab顯著中和血管生成素-1和血管生成素-2活性的能力(在下文實施例中證實)，這些抗體在治療由于血管生成素-1和/或血管生成素-2表達所致的癥狀和病變中將具有治療作用。在特異的實施方案中，本發(fā)明的抗體和方法涉及治療血管生成素-1和/或血管生成素-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生導(dǎo)致的癥狀。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，其包含血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性拮抗劑及一種藥物可接受的載體。在一個實施方案中，所述拮抗劑包含抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，其包含血管生成素-2的生物學(xué)活性拮抗劑及一種藥物可接受的載體。在一個實施方案中，所述拮抗劑包含抗體?？?Ang-2抗體可用于檢測患者樣品中的Ang-2及因此可用作本文所述疾病狀態(tài)的診斷劑。另外，基于其顯著中和Ang-2活性的能力(如下文實施例中所論述)，抗-Ang-2抗體在治療由于Ang-2表達導(dǎo)致的癥狀和病變中具有治療作用。在特異的實施方案中，本發(fā)明的抗體和方法涉及治療由于Ang-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生導(dǎo)致的癥狀。進一步的實施方案包括使用本發(fā)明的抗體和方法治療血管發(fā)生相關(guān)的疾病，包括腫瘤疾病如黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、甲狀腺腫瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸癌及胰腺癌。治療性給藥和制劑本發(fā)明的實施方案包括結(jié)合Ang-l和Ang-2的抗Ang-2抗體的無菌藥物制劑，其可用于治療疾病。這種制劑抑制Ang-2或Ang-l及Ang-2與其受體Tie2的結(jié)合，從而有效治療其中例如血清或組織Ang-l和/或Ang-2異常增高的病理學(xué)病變?？?Ang-2抗體優(yōu)選具有足夠的親和性以有力地中和Ang-2，及優(yōu)選具有足夠的作用時間以可以不用頻繁地給予人體?？?Ang-l/Ang-2抗體優(yōu)選具有足夠的親和性以有力中和Ang-l和Ang-2，及優(yōu)選具有足夠的作用時間以可以不用頻繁地給予人體。作用時間延長可以不用頻繁地及更方便地通過交替胃腸外途徑如皮下或肌內(nèi)注射途徑給藥。無菌制劑可以例如通過無菌過濾膜過濾而產(chǎn)生，之后凍干及復(fù)水(reconstitution)所述抗體。所述抗體通常以凍干形式或溶液形式貯存。治療性抗體組合物通常置于具有無菌進出口的容器中，例如具有可以取出所述制劑的無菌蓋子(adapter)的靜脈內(nèi)溶液包或小瓶，所述蓋子如通過皮下注射器刺穿的塞子。根據(jù)已知方法確定抗體給予途徑，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、吸入或損傷內(nèi)途徑注射或灌注或者通過下文指出的持續(xù)釋放系統(tǒng)給予。所述抗體優(yōu)選通過輸注或通過推注方式連續(xù)給予。治療性應(yīng)用的抗體的有效量依賴于例如治療目的、給予途徑和患者的狀況而定。因此，優(yōu)選醫(yī)生根據(jù)需要確定劑量和修改給予途徑以獲得最佳的治療作用。典型地，臨床醫(yī)生將給予抗體直至達到希望作用的劑量。這種治療方法的過程易于通過常規(guī)分析或通過本文描述的分析方法而監(jiān)測。如本文所述，抗體可以與一種藥物可接受的載體一起制備成混合物。這種治療組合物可以靜脈內(nèi)或者通過鼻或肺、優(yōu)選作為液體或粉末氣霧劑(凍干的)形式給予。根據(jù)需要，所述組合物也可以胃腸外或皮下給予。當(dāng)系統(tǒng)給予時，所述治療組合物應(yīng)是無菌的、無熱原的及于具有適當(dāng)pH、等滲性和穩(wěn)定性的胃腸外可接受的溶液中。這些條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。簡而言之，本文所述化合物的劑型的制備是將具有希望純度的化合物與生理學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合以貯存或者給予。這種材料在應(yīng)用劑量和濃度對于受體無毒性，包括緩沖液如TRISHC1、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及其他有機酸鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量(低于大約10個殘基)肽如聚精氨酸，蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠，或者免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA;糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；帶相反電荷的離子如鈉和/或非離子表面活性劑如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。用于注射的無菌組合物可以根據(jù)常規(guī)制藥方法配制，如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(20ed，LippincottWilliams&WilkensPublishers(2003))。例如，希望的是活性化合物于載體如水或天然發(fā)生的植物油如芝麻、花生或棉籽油或合成的脂肪載體如油酸乙酯等中的溶解或懸浮液。根據(jù)公認的制藥方法可以摻入緩沖液、防腐劑、抗氧化劑等。合適的持續(xù)釋放制備物的例子包括含有所述多肽的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)是成形物品、薄膜或微膠囊形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，如Langeretal，J.BiomedMater.Res"(1981)15:167-277及Langer,Chem.Tech.,(1982)12:98-105所述，或者聚(乙烯醇))，聚交酯(美國專利No.3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸與Y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidmanetal.,Biopolymers,(1983)22:547-556)，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langeretal，如前)，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)組成的可注射的微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸可以釋放分子100天以上，某些水凝膠則較短時間地釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)包囊化的蛋白質(zhì)在體內(nèi)長時間保持時，由于暴露于37"C的潮濕環(huán)境下也許會變性或聚集，而導(dǎo)致生物學(xué)活性喪失及可能的免疫原性改變。根據(jù)所涉及的機制可以設(shè)計合理的方案使得蛋白質(zhì)穩(wěn)定。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是由于二硫化物交換而形成分子間S-S鍵的結(jié)果，則可以通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制水分含量、使用合適的添加劑及產(chǎn)生特異性聚合物基質(zhì)組合物而實現(xiàn)穩(wěn)定。持續(xù)釋放的組合物也包括懸浮于能保持晶體在懸浮液中的合適制劑中的所述抗體晶體的制備物。這些制備物當(dāng)經(jīng)皮下或腹膜內(nèi)注射時可產(chǎn)生持續(xù)釋放作用。其它組合物也可包括脂質(zhì)體包裹的抗體。含有這種抗體的脂質(zhì)體通過如下文獻所述方法制備美國專利No.DE3,218,121;Epsteinetal,Proc.Natl.Acad.SciUSA,(1985)82:3688-3692;Hwangetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1980)77:4030-4034;EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;142,641;日本專利申請83-118008;美國專利Nos.4，485，045和4，544，545;及EP102,324。給予一定患者的抗體制劑的劑量由主治醫(yī)生根據(jù)考慮已知改變藥物作用的不同因素包括疾病嚴重程度和類型、體重、性別、飲食、給予時間和途徑、其它藥物及其它相關(guān)臨床因素而確定。治療有效劑量可以在體外或體內(nèi)方法中確定。本文描述的治療應(yīng)用的抗體的有效量依賴于例如治療目標、給予途徑及患者的狀況。因此，優(yōu)選醫(yī)生根據(jù)需要確定給予的劑量及修改給予途徑，以獲得最佳治療作用。典型的每日劑量范圍依賴于上述因素可以是從大約0.001mg/kg至最多100mg/kg或更多。典型地，臨床醫(yī)生給予治療性抗體直至達到實現(xiàn)希望的作用的劑量。這種治療方法的過程易于通過常規(guī)或本文描述的分析方法監(jiān)測。本領(lǐng)域意識到本發(fā)明的組合物和方法中的治療實體的給予是與合適的載體、賦形劑及摻入制劑中的其它物質(zhì)一起給予的，以提供改良的轉(zhuǎn)移、輸送、耐受等作用。這些制劑包括例如粉末、糊、軟膏、凝膠、蠟狀物、油狀物、脂質(zhì)、含有脂質(zhì)(陽離子或陰離子)的載體(如UpofectinTM)、DNA綴合物、無水吸收糊、水包油和油包水乳狀液、乳狀液聚乙二醇(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠、及含有聚乙二醇的半固體混合物。任何前述混合物均可適當(dāng)用于本發(fā)明的治療中，條件是制劑中的活性成分不被該制劑失活，及所述制劑是生理學(xué)相容的及耐受給予途徑。也見于BaldrickP."Pharmaceuticalexcipientdevelopment:theneedforpreclinicalguidance."Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2):210-8(2000)、WangW."Lyophilizationanddevelopmentofsolidproteinpharmaceuticals."Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000)、CharmanWN"Lipids,lipophilicdrugs,andoraldrugdelivery-someemergingconcepts."JPharmSci.89(8):967-78(2000)、Powelletal."Compendiumofexcipientsforparenteralformulations"PDAJPharmSciTechnol.52:238-311(1998)及其中引用的關(guān)于藥物化學(xué)熟知的制劑、賦形劑和載體的其它信息。組合本文描述的抗血管發(fā)生治療方法可以作為唯一的療法應(yīng)用，或者除了本發(fā)明的化合物之外還可包含常規(guī)的手術(shù)或放療或化療。這種化療可包括一或多種如下抗腫瘤藥物(i)細胞生長抑制劑如抗雌激素物質(zhì)(例如三苯氧胺、toremifene、raloxifene、droloxifene和iodoxyfene)，雌激素受體負調(diào)節(jié)物(例如fulvestrant)，抗雄激素物質(zhì)(例如bicalutamide、fiutamide、nilutamide和乙酸環(huán)丙孕酮)，LHRH拮抗劑或LHRH激動劑(例如goserelin、leuprorelin和buserelin),孕激素(例如乙酸甲地孕酮)，aromatase抑制齊U(例女口anastrozole、letrozole、vorazole禾口exemestane)及5*還原酶的抑制劑如finasteride;(ii)抑制癌細胞侵潤的物質(zhì)(例如金屬蛋白酶抑制劑樣marimastat及尿激酶纖溶酶原激活物受體功能的抑制劑)；(iii)生長因子功能抑制劑，例如這種抑制劑包括生長因子抗體，生長因子受體抗體(例如抗erbb2抗體trastuzumab[Herceptin]及抗erbbl抗體cetuximab[C225])，法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，酪氮酸激酶抑制劑及絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑，例如表皮生長因子家族的抑制劑(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制劑如N(3氯4氟苯基)7甲氧基6(3嗎啉基丙氧基)喹唑啉4胺(gefitinib，AZD1839)，N(3乙炔基苯基)6，7二(2甲氧基乙氧基)喹唑啉4胺(erlotinib，OSI774)和6丙烯酰胺基N(3氯4氟苯基)7(3嗎啉基丙氧基)喹唑啉4胺(CI1033))，例如血小板衍生生長因子家族抑制劑和例如肝細胞生長因子家族抑制劑；(hO抗血管發(fā)生物質(zhì)如抑制血管內(nèi)皮生長因子的作用的那些(例如抗血管內(nèi)皮細胞生長因子抗體bevacizumab[Avastin],抗血管內(nèi)皮生長因子受體抗體如抗-KDR抗體和抗-fitl抗體，如國際專利申請WO97/22596、WO97/30035、WO97/3285、WO98/13354、WO00/47212和WO01/32651)揭示的化合物及其它作用機制的化合物(例如linomide，整聯(lián)蛋白avb3功能的抑制劑和制管張素)；(v)血管破壞物質(zhì)如CombretastatinA4及國際專利申請WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中揭示的化合物；(vi)反義治療，例如針對上述靶位的那些，如ISIS2503，一種抗ras反義；(vii)基因治療方法，包括例如替換異?；蛉绠惓５膒53或異常的BRCA1或BRCA2的方法，GDEPT(基因?qū)蛎盖绑w藥物治療)方法，如使用胞嘧啶脫氨酶、胸腺嘧啶激酶或細菌硝基還原酶的那些方法，及增加患者對化療或放療耐受性的方法，如多藥物抗性基因治療；(viii)免疫治療方法，包括例如增加患者腫癯細胞免疫原性的回體(exvivo)及體內(nèi)方法，如用細胞因子如白細胞介素2、白細胞介素4或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子轉(zhuǎn)染，降低T細胞無反應(yīng)性的方法，使用轉(zhuǎn)染的免疫細胞如細胞因子轉(zhuǎn)染的樹突細胞的方法，使用細胞因子轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞系的方法，及使用抗獨特型抗體的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的抗血管發(fā)生治療與抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作用的物質(zhì)(例如抗血管內(nèi)皮細胞生長因子抗體bevacizumab(Avastin),抗血管內(nèi)皮生長因子受體抗體如抗-KDR抗體和抗-fltl抗體，如國際專利申請WO97/22596、WO97/30035、WO97/3285、WO98/13354、WOOO/47212和WOO1/32651揭示的化合物)及具有其它作用機制的化合物(例如linomide，整聯(lián)蛋白avb3功能抑制劑及制管張素)組合應(yīng)用；在本發(fā)明另一實施方案中，本發(fā)明的抗血管發(fā)生治療與抑制血管內(nèi)皮生長因子受體KDR的酪氨酸激酶活性的物質(zhì)(例如AZD2171或AZD6474)組合。關(guān)于AZD2171的詳細描述可見于Wedgeetal(2005)CancerResearch.65(10):4389-400。關(guān)于AZD6474的另外的詳細描述可見于Ryan&Wedge(2005)BritishJournalofCancer.92Suppl1:S6-13。這兩個出版物在此均以其全文并入作參考。在本發(fā)明另一個實施方案中，完全人抗體3.19.3、3.3.2或5.88.3單獨或與Avastin、AZD2171或AZD6474組合應(yīng)用。這種聯(lián)合治療可以通過同時、相繼或單獨給予各個治療成分而實現(xiàn)。這種組合產(chǎn)物應(yīng)用在前述劑量范圍內(nèi)的本發(fā)明的化合物或者其藥物可接受的鹽及在許可劑量范圍內(nèi)的其它藥物活性物質(zhì)。實施例提供了如下實施例，包括進行的實驗和獲得的結(jié)果只是用于說明的目的，不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明。實施例1免疫和滴定爐使用得自R&DSystems,Inc.的重組人Ang-2(Minneapolis,MNCat.No.623-AM/CF)作為抗原。通過系列免疫XenoMouse⑧小鼠(XenoMouse株系XMG2和XMG4(3C-1株系)，Abgenix，Inc.Fremont,CA)而產(chǎn)生抗Ang-2單克隆抗體。對于所有注射，XenoMouse動物均經(jīng)足墊途徑進行免疫。每次注射的總體積是50nl/小鼠，25^1/足墊。第一次注射是每只小鼠使用2.35pg在無熱原的Dulbecco'sPBS(DPBS)中的重組人Ang-2(rhAng-2，cat#623-AM/CF;lot#BN023202A)并以1:1v/v與10嗎CpG(15|ilImmunEasyMouseAdjuvant,catalog#303101;lot#11553042;Qiagen)混合。以后的6次加強是每只小鼠使用2.35嗎在無熱原DPBS中的rhANG-2并混合25嗎Adju-Phos(磷酸鋁凝膠，Catalog#1452-250，batch#8937，HCIBiosector)和10嗎CpG，隨后為最后一次加強，其使用2.35嗎在無熱原DPBS中的rfiAng-2，不加佐劑。免疫XenoMouse小鼠在第0,3，6,10,13，17，20和24天進行這一方案，在第29天進行融合。通過效價選擇收獲動物用ELISA測定來自免疫的XenoMouse小鼠的血清中的抗Ang-2抗體效價。簡而言之，將以四種程度在抗原包被緩沖液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6NaHC038.4g/L)中的重組Ang-2(1嗎/ml)過夜包被到CostarLabcoatUniversalBindingPolystyrene96孔板(Corning，Acton,MA)上。第二天，用Biotek洗板器將平板用洗滌緩沖液(0.05n/。Tween20于lxPBS中)洗3次。然后用200^1/孔封閉緩沖液(0.5%BSA，0.1%Tween20，0.01%Thimerosal于lxPBS中)封閉平板并在室溫保溫1小時。1小時封閉后，使用Biotek洗板器將平板用洗滌緩沖液洗3次。來自Ang-2免疫的小鼠或未實驗過的XenoMouse動物的血清在0.5。/。BSA/PBS緩沖液中滴定，實驗使用來自1:100初始稀釋液的1:3稀釋液，一式二份。最后一個孔為空白。將這些平板在室溫保溫2小時，然后使用Biotek洗板器將平板用洗滌緩沖液洗3次。以1pg/ml的終濃度加入山羊抗人IgGFc特異性辣根過氧化物酶(HRP，Pierce,Rockford,IL)綴合的抗體，并在室溫保溫l小時。然后使用Biotek洗板器將平板用洗滌緩沖液洗3次。洗滌后，加入TMB生色底物(BioFxBSTP-0100-01)使平板顯色10-20分鐘或直至陰性對照孔開始顯示顏色。然后，通過添加終止溶液(650nM用于TMB的終止試劑(BioFxBSTP-0100-01)，每瓶用100ml水復(fù)水)而終止ELISA。每個XenoMouse動物的特異性效價是根據(jù)650nrn的光密度確定的，并在下表2和表3中示出。效價值是OD讀數(shù)為背景的兩倍的血清最大稀釋度的倒數(shù)。因此，數(shù)值越高，對Ang-2的體液免疫應(yīng)答越高。表2組l:10個小鼠(XMG2株系)<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>表3組2:10個小鼠(XMG4株系)<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>*PC=山羊AB,抗huAng-2(R&DSystems,CatalogNo.AF623)1mg/ml實施例2回收淋巴細胞、B細胞分離、融合和產(chǎn)生雜交瘤免疫的小鼠通過頸錯位處死，收集引流淋巴結(jié)并集合每一組的淋巴結(jié)。通過在DMEM中研磨而解離淋巴樣細胞以從組織中釋放細胞并且將細胞懸浮于DMEM中。計數(shù)細胞，向細胞沉淀中以每l億個淋巴細胞中加入0.9mlDMEM而溫和充分地重懸細胞。每1億個細胞使用lOOplCD卯+磁珠，通過將細胞與磁珠在4'C保溫15分鐘而標記細胞。將含有至多108個陽性細胞(或至多2xl()S個總細胞)的磁標記的細胞懸液上樣至LS+柱并用DMEM洗柱。收集總流出液作為CD90陰性級分(這些細胞的大多數(shù)預(yù)期是B細胞)。融合是通過以1"的比例混合來自以上的經(jīng)洗滌和富集的B細胞與購自ATCC，cat.#CRL1580(Kearneyetal，J.Immunol.123，1979,1548-1550)的非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞而進行。在800xg離心而溫和沉淀細胞混合物。完全除去上清后，將細胞用2-4mLPronase溶液(Ca舊iochem，cat.#53702;0.5mg/ml于PBS中)處理不超過2分鐘。然后加入3-5mlFBS以終止酶活性，并用細胞電融合溶液(ECFS，0.3M蔗糖，Sigma,Cat#S7903,O.lmM醋酸鎂，Sigma，Cat#M2545,O.lmM醋酸鈣，Sigma，Cat#C4705)將懸浮液調(diào)整至總體積為40ml。離心后除去上清，將細胞重懸于40mlECFS中。重復(fù)這一洗滌步驟，再次將細胞重懸于ECFS至濃度為2x106細胞/1111。細胞電融合使用融合發(fā)生器(型號ECM2001，Genetronic，Inc.,SanDiego，CA)進行。所用融合腔大小為2.0ml，使用如下儀器設(shè)置Alignment條件電壓50V，時間50sec.破膜電壓3000V，時間30(isec融合后保持時間3secECF之后，在無菌條件下小心地將細胞懸液從融合腔中移出，轉(zhuǎn)移至一無菌試管中，該試管中含有相同體積的雜交瘤培養(yǎng)基(DMEM，JRHBiosciences)、15°/。FBS(Hyclone)，補加L-谷氨酰胺、pen/strep、OPI(草酰乙酸鹽、丙酮酸鹽、牛胰島素)(均來自Sigma)和IL-6(BoehringerMannheim)。細胞在37。C保溫15-30分鐘，然后在400xg(1000rpm)離心5分鐘。將細胞輕輕重懸于小體積雜交瘤選擇培養(yǎng)基(補加0.5xHA(Sigma，cat.#A9666)的雜交瘤培養(yǎng)基)中，基于每個96孔板最終鋪板總共5xl06個B細胞以及每孔20(HU，用更多的雜交瘤選擇培養(yǎng)基合適地調(diào)節(jié)體積。將細胞輕輕混合并吸至96孔板中生長。在第7天或第10天，除去一半培養(yǎng)基，并用雜交瘤選擇培養(yǎng)基再飼養(yǎng)細胞。實施例3通過ELISA選擇候選抗體培養(yǎng)14天后，篩選雜交瘤上清是否存在Ang-2特異性單克隆抗體。ELISA平板(Fisher,Cat.No.12-565-136)用50nl/孔在包被緩沖液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6，NaHC038.4g/L)中的人Ang-2(2pg/ml)包被，然后在4'C保溫過夜。保溫后，用洗滌緩沖液(0.05%Tween20于PBS中)洗平板3次。加入200^11/孔封閉緩沖液(0.5%BSA，0.1%Tween20,0.01%Thimerosal于lxPBS中)并在室溫保溫平板1小時。保溫后，用洗漆緩沖液洗平板3次。加入50pl/孔雜交瘤上清和陽性及陰性對照，在室溫保溫平板2小時。所用的陽性對照是來自Ang-2免疫的XenoMouse小鼠XMG2Ang-2組1，足墊飾)N160-7的血清，陰性對照是來自KLH免疫的XenoMouse小鼠XMG2KLH組1，足墊(fp)L627-6的血清。保溫后，用洗滌緩沖液洗平板3次。加入100nl/孔檢測抗體山羊抗huIgGFc-HRP(Caltag,Cat.No.H10507),并在室溫保溫平板1小時。在第二輪篩選中，對第一輪篩選中呈陽性的進行兩套篩選，一套檢測hlgG，另一套檢測人IgK輕鏈(山羊抗hlgkappa-HRP(SouthernBiotechnology,Cat.No.2060-05)，以證實IgG和Igkappa均為完全的人類組成。保溫后，用洗滌緩沖液洗平板3次。加入100nl/孔TMB(BioFXLab.Cat.No.TMSK-0100-01)并使平板顯色約10分鐘(直至陰性對照孔剛剛開始顯示顏色)。然后加入50nl/孔終止溶液(TMB終止溶液(BioFXLab.Cat.No.STPR-0100-01))并將平板在ELISA平板閱讀器上于450nm讀數(shù)。有185個抗Ang-2的完全人類IgGkappa抗體。對在ELISA測定中結(jié)合的所有抗體根據(jù)ELISA進行針對結(jié)合Ang-1的反篩選(counterscreened)以排除與Ang-1交叉反應(yīng)的那些抗體。ELISA平板(Fisher，Cat.No.12-565-136)用在包被緩沖液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6，NaHC038.4g/L)中的50^1/孔重組Ang-1(2pg/ml，得自R&DSystems,CatJ293-AN-025/CF)包被，然后在4°C保溫過夜。在此處所述實驗條件下，當(dāng)重組Ang-1分子固定在ELISA平板上時，未發(fā)現(xiàn)與Ang-1結(jié)合的抗體。但是，此處描述的反篩選有技術(shù)上的限制。首先，抗體衍生自品系材料(linematerials)而非克隆的雜交瘤。僅占該品系少量百分比的來自一特定克隆的結(jié)合信號可能會在檢測靈敏度閾值之下。其次，在此實驗中由于由抗原的固定化誘導(dǎo)的輕微構(gòu)象變化可導(dǎo)致抗原中的某些表位被隱蔽不暴露于抗體。基于所有這些原因，用克隆的抗體和Biacore系統(tǒng)進一步檢査每一抗體對Ang-1的交叉反應(yīng)性(見實施例8)。如實施例8所述，確實發(fā)現(xiàn)一個克隆(mAb3.19.3)具有針對人重組Ang-l的強交叉反應(yīng)性(實施例8、9和12)。實施例4對Ang-2結(jié)合Tie2的抑制如上述所討論的，Ang-2通過結(jié)合Tie2受體而發(fā)揮其生物學(xué)作用。使用修改的ELISA經(jīng)競爭結(jié)合測定鑒別了抑制Ang-2/Tie2結(jié)合的單克隆抗體。所用的mAb是從50ml特異于Ang-2的雜交瘤集合(見實施例3)的耗竭上清(exhaustivesupernatants)進行微純化(micro-purification)的產(chǎn)物。通過在4'C保溫過夜將96孑LNuncImmplatesTM用lOOpl濃度為4|ig/ml的重組人Tie2/Fc融合蛋白(R&DSystems,Inc.,Cat.No.313-TI-100)包被。用SkanWasher300station(SKATRON)將平板用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗四次?？子胠OOplABX封閉緩沖液(0.5%BSA,0.1%Tween，0.01%Thimerosal于PBS中)封閉1小時。向具有或不具有100ng/ml的抗Ang-2mAb的每個孔中加入100ng/ml的生物素?；闹亟M人Ang-2(R&DSystems,Inc.Cat.No.BT623)。平板在室溫保溫2小時，然后洗掉未結(jié)合的分子。然后通過在室溫保溫半小時，用100pl/孔的1:200的鏈霉抗生物素蛋白-HRP綴合物檢測結(jié)合的生物素?；腁ng-2。洗滌2次后，用HRP底物(R&DSystems,Cat.No.DY998)檢測結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白。將平板保溫30分鐘，之后加入450終止溶液(IOOpl/孔，BioFX，Cat#BSTP-0100-01)以終止反應(yīng)。用SpectramaxPlus讀數(shù)器測定450nm的光吸收。相對于Ang-2為10倍摩爾過量的可溶性重組Tie2/Fc融合蛋白用作陽性對照。在這一濃度，Tie2/Fc抑制80%的Ang-2與固定的Tie2的結(jié)合。使用這一任意標準，175個結(jié)合Ang-2的mAb中有74個顯示抑制活性。為了方便操作，選擇最高的27個中和者用于隨后的雜交瘤克隆。用限制稀釋法經(jīng)下述標準程序克隆每個雜交瘤。從每一雜交瘤收集3個姐妹克隆。對于每一克隆，用ELISA測試上清與人Ang-2的結(jié)合以及如上所述與Ang-1的反結(jié)合，以保證每個抗體僅對于Ang-2是特異性的。測定耗竭上清中IgG的濃度，選擇來自每個雜交瘤的3個姐妹克隆中有最高產(chǎn)量的一個克隆進行IgG純化。從每個上清中純化0.5至1mg的IgG以用于進一步鑒定。為定量mAb對Ang-2與Tie2結(jié)合的抑制活性，用競爭結(jié)合測定確定從最高的27個候選者純化的mAb的效價。每種mAb濃度測試雙份。用GraphpadPrism繪圖軟件經(jīng)曲線擬合(非線性Sigmoid曲線)發(fā)現(xiàn)了濃度-應(yīng)答關(guān)系。由軟件計算最大抑制(效力)和ICso(強度)。顯示相對較高效力和強度的10個單克隆抗體被選擇用于進一步研究。這10個mAb的效力和強度列于表4。200580048270.9說明書第64/123頁表4最高lO個mAb的效力和強度<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>*效力表示為使用mAb(30嗎/ml)相對于不使用mAb的結(jié)合的Ang-2的比率實施例5抗體分倉(BINNING)進行表位分倉(binning)以確定哪個抗Ang-2抗體互相會交叉競爭并因此很可能結(jié)合Ang-2上的相同表位。分倉方法如美國專利申請20030175760所述，也見Jiaetal"J.Immunol.Methods,(2004)288:91-98所述，兩篇文獻均全文并入?yún)⒖?。簡而言之，根?jù)Luminex網(wǎng)站提供的蛋白質(zhì)偶聯(lián)方案將Luminex珠與小鼠抗huIgG0Pharmingen#555784)偶聯(lián)。使用保護珠避光的下述程序制備偶聯(lián)前的珠以用于偶聯(lián)一級未知抗體。對每一未知上清使用單獨的試管。所需上清體積使用下式計算(1^2+10)"0^11(其中11=樣品總數(shù))。在這一測定中使用0.1pg/ml的濃度。將珠原液溫和渦旋，在上清中稀釋至50^1/孔中每種珠的濃度為2500或者0.5Xl()S個珠/ml。樣品在搖床中于黑暗中室溫保溫過夜。過濾平板通過加入200^1洗滌緩沖液/孔而預(yù)濕潤，之后吸去緩沖液。向過濾平板的每個孔中加入50nl的每種珠。通過加入100^1/孔洗滌緩沖液并抽吸而洗滌樣品。以50nl/孔將抗原和對照加到過濾平板。覆蓋平板，在搖床上于黑暗中保溫1小時，然后洗滌樣品3次。然后以50nl/孔加入二級未知抗體。一級抗體使用0.1)Lig/ml的濃度。平板然后在搖床上于黑暗中室溫保溫2小時，然后洗滌樣品3次。加入50iil/孔1:500稀釋的生物素酰化的小鼠抗人IgG(Pharmingen#555785)，樣品在黑暗中于室溫振蕩保溫1小時。樣品洗滌3次。加入50)!l/孔1:1000稀釋度的鏈霉抗生物素蛋白-PE，樣品在黑暗中于室溫振蕩保溫15分鐘。在Luminex100上運行2個洗滌周期后，洗滌樣品3次。將每孔內(nèi)容物重懸于8(Hil封閉緩沖液中。通過抽吸幾次將樣品小心地混和以重懸珠。然后在Luminex100上分析樣品。結(jié)果示于下表5。表5在功能測定中為陽性的最高24個Ang-2抗體的倉倉1倉23.33.383.285.1033.315.145.25.165.395.415.495.545.625.835.865.885.1015.108倉3倉4倉5倉6倉75.56*5.285.783.196.3倉85.355.40一注:mAb5.56具有類似于3.38和5.103的結(jié)合模式，差別很小并且信號低得多<實施例6用BIACORE分析確定抗Ang-2抗體親和性27個純化的單克隆抗體的低分辨率篩選使用無標記表面等離子體共振(SPR)或Biacore來測量抗體對抗原的親和性。為此目的，用常規(guī)胺偶聯(lián)技術(shù)制備在CM5Biacore芯片上的高密度山羊抗人抗體表面。所有純化的mAb在含有100pg/mlBSA禾n10mg/mL羧甲基葡聚糖的HBS-P電泳緩沖液中稀釋至約8|ig/ml。每種mAb用42秒的接觸時間捕獲在單獨的表面上，并且進行5分鐘洗滌以穩(wěn)定mAb基線。將Ang-2以90.9nM注射到所有表面上1分鐘，隨后進行10分鐘解離。通過減去來自對照流動池(flowcell)的信號以及減去就在Ang-2注射之前注射的緩沖液的基線漂移而制備雙重參考的結(jié)合數(shù)據(jù)(Double-referencedbindingdata)。根據(jù)捕獲在每一表面上的mAb的量對每一mAb的Ang-2結(jié)合數(shù)據(jù)進行標準化，確定27個mAb的標準化的并修正漂移后的應(yīng)答。數(shù)據(jù)整體擬合為1:1交互作用模型以確定結(jié)合動力學(xué)。在25'C的Ang-2結(jié)合的動力學(xué)分析結(jié)果見下表。mAb從最高親和性至最低親和性排列。表627個純化的單克隆抗體的Ang-2低分辨率Biacore篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>除了mAb5.101和5.86之外的所有mAb的、結(jié)果后的星號表示這些kd保持恒定，是慢解離速率數(shù)據(jù)數(shù)量級特征的最佳估值。這些樣品的擬合模型在相對較短的解離時間內(nèi)未檢測到可測得的解離速率變化，因此需要kd保持恒定以擬合結(jié)合速率數(shù)據(jù)。這些標出的、的數(shù)據(jù)在模擬IO'V1量級的&中也擬合良好，因此相互作用可以比上述報道的高10倍或更多。對于使用具有亞100pM親和性的mAb的高分辨率動力學(xué)實驗，解離數(shù)據(jù)通常測量4-6小時?？梢詮牟东@的mAb表面測得的無漂移假象(driftartifacts)的最大解離時間是20分鐘。在如此相對短時間內(nèi)用高親和性mAb測得的信號衰變幾乎可以忽略不計，因此&估值可以變化達2個數(shù)量級。實施例7用BIACORE分析確定抗ANG-2抗體親和性用3個純化的單克隆抗體進行Ang-2中等/高分辨率篩選純化的mAb5.16，5.35和5.41在10mM醋酸鈉，pH5.0中稀釋至約8pg/ml。每種稀釋的mAb隨后用常規(guī)胺偶聯(lián)固定在不同的流動池表面(CM5Biacorechip)。為獲得結(jié)合速率數(shù)據(jù)，將范圍為90.9-0.71nM的8種濃度(2倍稀釋)的Ang-2—式三份隨機注射90秒，其中間插幾次緩沖液注射以用于雙重參考(doublereferencing),隨后進行4分鐘解離。抗體表面在每個注射周期后用兩次9秒鐘脈沖的10mM甘氨酸-HCl,pH1.5再生。為獲得解離速率數(shù)據(jù)，如上所述注射在含有100pg/mlBSA的HBS-P電泳緩沖液中的3個90.9nMAng-2樣品，在8小時內(nèi)記錄解離數(shù)據(jù)。樣品注射與3個空白注射周期交替。如上所述進行再生。使用CLAMP(DavidG.MyszkaandThomasMorton(1998)"CLAMP:abiosensorkineticdataanalysisprogram,"TIBS23,149-150)將數(shù)據(jù)整體擬合至具有質(zhì)量傳送(masstransport)的1:1相互作用模型。所得到的結(jié)合常數(shù)如下表7所示。表73個純化的單克隆抗體的Ang-2中等分辨率Biacore篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>在8小時解離時間內(nèi)測得顯著的信號衰變。使用8小時解離數(shù)據(jù)，CLAMP能更合理地估測每種mAb的kd。5.16和5.35的、均在10"6S一級別內(nèi)。然后通過如下述實施例8所述測量mAb對Ang-l的親和性而研究抗體對Ang-l的交叉反應(yīng)性。實施例8用BIACORE分析確定抗ANG-1抗體親和性抗體對Ang-l的交叉反應(yīng)性通過測量mAb對Ang-l的親和性進行進一步研究。與基于ELISA的反結(jié)合(實施例3)中所述的固定Ang-l不同，將Ang-2mAb固定到CM5Biacore芯片上，并注射溶液中的Ang-l以確定結(jié)合速率和解離速率。在這一實驗中如下所述測定了六個mAb，即3.3.2,3.31.2,5.16.3,5.86.1，5.88.3和3.19.3，以確定它們與Ang-l的交叉反應(yīng)性的強度。6個純化的單克隆抗體的中等分辨率篩選使用無標記表面等離子體共振(SPR)或Biacore2000儀器測量對Ang-l的抗體親和性。為此目的，用常規(guī)胺偶聯(lián)技術(shù)制備在CM5Biacore芯片上的高密度山羊a人抗體表面。為了顯色實驗，純化的mAb(克隆3.19.3、3.3.2、5.88.3、5.86.1、3.31.2、5.16.3)在含有100—1BSA的HBS-P電泳緩沖液中稀釋至約2.5-3.5|ig/ml。每種mAb的捕獲水平約為150RU。每個捕獲周期后進行5分鐘洗滌以穩(wěn)定mAb基線。將在電泳緩沖液中稀釋至87.4nM的單一Ang-l樣品注射到全部捕獲表面上1分鐘。有5個mAb未顯示結(jié)合，但是發(fā)現(xiàn)Ang-l與mAb3.19.3結(jié)合。通過增加mAb捕獲水平至遠超過500-600RU并注射380nMAng-l1分鐘而重復(fù)這一實驗。因為Ang-l僅示出對mAb3.19.3的結(jié)合活性，測定這一mAb對Ang-l和Ang-2的親和性。由于在上述顯色實驗中Ang-l顯示出低的解離速率，中等分辨率的捕獲實驗不會記錄足夠用于精確估計kd的解離速率數(shù)據(jù)。因此，在高分辨率Biacore條件下測量Ang-l和Ang-2與mAb3.19.3的結(jié)合。實施例9用高分辨率Biacore分析確定mAb3.19.3對Ang-l和Ang-2的親和性純化的mAb3.19.3在10mM醋酸鈉，pH4.0中稀釋至12.5|tig/ml。然后用常規(guī)胺偶聯(lián)將mAb固定在流動池1-3(CM5Biacore芯片)上，以流動池4作為參考流動池。為獲得結(jié)合速率數(shù)據(jù)，將范圍為39.8-0.31nM的8種濃度(2倍稀釋)的Ang-l(于含有100ng/ml的BSA的HBS-P電泳緩沖液中)一式三份隨機注射90秒(IOOpL/min.流速)，其中間插幾次緩沖液注射以用于雙重參考，隨后進行4分鐘解離?？贵w表面在每個注射周期后用6秒鐘脈沖的10mMNaOH再生。為獲得解離速率數(shù)據(jù)，如上所述注射3個19.9nMAng-l樣品，在6小時內(nèi)記錄解離數(shù)據(jù)。樣品注射與3個空白注射周期交替。如上所述進行再生。使用CLAMP(DavidG.MyszkaandThomasMorton(1998)"CLAMP:abiosensorkineticdataanalysisprogram,"TIBS23，149-150)將數(shù)據(jù)整體擬合至1:1相互作用傳質(zhì)模型。用純化的MAb3.19.3進行ANG-2高分辨率Biacore研究純化的mAb3.19.3在10mM醋酸鈉，pH4.0中稀釋至12.5嗎/ml。然后用常規(guī)胺偶聯(lián)將mAb固定在流動池1-3(CM5Biacore芯片)上，以流動池4作為參考流動池。為獲得結(jié)合速率數(shù)據(jù)，將范圍為30.0-0.23nM的8種濃度(2倍稀釋)的Ang-2(在含有100iag/mlBSA的HBS-P電泳緩沖液中)一式三份隨機注射90秒(IOOpL/min.流速)，其中間插幾次緩沖液注射以用于雙重參考，隨后進行4分鐘解離。抗體表面在每個注射周期后用6秒鐘脈沖的15mMNaOH再生。為獲得解離速率數(shù)據(jù)，如上所述注射3個15.0nMAng-2樣品，在6小時內(nèi)記錄解離數(shù)據(jù)。樣品注射與3個空白注射周期交替。每個表面在每個長解離速率注射周期后用6秒鐘脈沖的15mMNaOH再生。使用CLAMP(DavidG.MyszkaandThomasMorton(1998)"CLAMP:abiosensorkineticdataanalysisprogram,"TIBS23，149-150)將數(shù)據(jù)整體擬合至1:1相互作用傳質(zhì)模型。結(jié)果和討論用mAb3.19.3進行的ANG-l和ANG-2高分辨率Biacore研究用每種抗原進行兩個獨立的實驗。結(jié)果見下表8所示表8Ang-1和Ang-2與純化的mAb結(jié)合的高分辨率Biacore結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>在上表中針對Ang-2的kd用星號標出是因為這些值在CLAMP軟件中的1:1相互作用模型擬合過程中保持恒定。對于Ang-2實驗未記錄到顯著的解離信號，因此最佳的解離速率估值是將&保持恒定在1X10、ecf1。針對Ang-2的長解離速率數(shù)據(jù)實際上在6小時的數(shù)據(jù)獲得時間內(nèi)顯示出向上的趨勢。在兩種儀器進行了"超級清洗"的保養(yǎng)方案后，這一趨勢在使用這兩種不同儀器的兩個不同傳感器芯片上重復(fù)。為了更精確地測量mAb3.19.3對Ang-1和Ang-2的結(jié)合親和性，進行進一步的實驗(見實施例10)以確定mAb3.19.3對這些抗原的Kd。不一致的可能解釋是當(dāng)Ang-l被固定于塑料表面上時，對于mAb3.19.3的結(jié)合是關(guān)鍵性的一個精細表位沒有被合適暴露。但是當(dāng)Ang-l在液相中時，如在Biacore實驗條件中時，這一表位變得可被mAb3.19.3接近并發(fā)生結(jié)合。實施例10用高分辨率KINEXA(動力學(xué)排除測定)確定mAb3.19.3對人Ang-2的親和性當(dāng)用高分辨率Biacore測量mAb3.19.3對人Ang-2的親和性時(實施例9)，發(fā)現(xiàn)沒有顯著的解離信號。針對Ang-2的長解離速率數(shù)據(jù)顯示在6小時的數(shù)據(jù)采集期間的一個向上趨勢。由此，使用KinExA技術(shù)確定mAb3.19.3結(jié)合人Ang-2的KD，目的是獲得更可靠的Kd值。為此目的，使用KinExA3000儀器。首先，使用10mL脫鹽柱(PierceD-SaltTMpolyacrylamidecolumn,6000molecularweightcut-off,Lot#GF97965)將lmL(271|ag)Ang-2原液(R&DSystems,Inc.,Lot#BNO32510A)緩沖液交換到lxPBS，pH7.0中。使用C.NickPace(Pace,etal.，ProteinScience,Vol.4:2411-2423，1995)所述的蛋白質(zhì)濃度測定方法測得合并的級分的濃度是1.7一。接著，在24""C將200mg聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，Lot#206-01)珠與450pL(約122嗎)Ang-2原液偶聯(lián)過夜。然后離心珠并用封閉緩沖液(lxPBS,10mg/mlBSA)洗一次，再次離心，然后在封閉緩沖液中在24。C保溫1小時。封閉后，將珠在標準KinExA珠儲存瓶中的約30mL的HBS緩沖液(0.01MH印es，0.15MNaCl，pH7.4)中稀釋并放置在儀器中。Kr^控制滴定含有25.3pM的mAb3.19.3結(jié)合位點濃度的12種溶液用增加濃度的Ang-2滴定。緩沖液交換的Ang-2用于樣品制備。每種溶液的總體積為25mL，并在24'C平衡5天。滴定溶液使用玻璃量具制備，Ang-2濃度在5.09nM至99.3fM變化。用于分析這些溶液的KinExA儀器方法由珠填裝步驟組成，其中PMMA珠被填裝在玻璃毛細管中，平衡的溶液一式二份以0.25mL/min流經(jīng)珠柱6min(1.5mL)。隨后，使3.4nM的熒光標記的Cy-5山羊抗人(Fc特異性)多克隆抗體以0.5mL/min流經(jīng)珠填裝物1分鐘以標記捕獲在珠上的具有游離結(jié)合位點的mAb。從珠填裝物發(fā)出的熒光經(jīng)在620nm激發(fā)而在670nm測量。用所附的KinExA軟件包(version1.0,3，Sapidyne,Inc.)將所得的熒光測量值轉(zhuǎn)化為相對于總抗原濃度的"M游離mAb結(jié)合位點"。所得的Ko控制滴定曲線用KinExA軟件擬合成包括漂移校正因子的1:1平衡等勢線(equilibriumisotherm)。最佳擬合數(shù)據(jù)的K。值是86.4pM,低和高95%置信限分別為64.3pM和98.7pM。未進行mAb控制滴定曲實施例11Ang-2誘導(dǎo)的在HEK293細胞中異位表達的Tie2磷酸化的阻斷如上述所討論的，Tie2是一種內(nèi)皮細胞特異性受體酪氨酸激酶。用血管內(nèi)皮細胞進行的體外實驗顯示Ang-1誘導(dǎo)Tie2磷酸化，而Ang-2抑制由Ang-1誘導(dǎo)的受體磷酸化。但是，當(dāng)Tie2被異位表達如在成纖維細胞中表達時，在某些條件下，包括但不限于延長暴露于血管生成素-2或暴露于高濃度的血管生成素-2，Ang-2也能誘導(dǎo)Tie2磷酸化。當(dāng)受體在HEK293F細胞中表達時，也發(fā)生Ang-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化。用經(jīng)人Tie2受體轉(zhuǎn)染的HEK293F細胞檢查了抗Ang-2mAb阻斷Ang-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化的能力。具有Tie2cDNA的質(zhì)粒載體pORK7pBS-SK得自ATCC(Cat.No.69003，GenbanksequenceBC0335M)。cDNA的精確性由核苷酸測序證實。通過EcoRI消化從載體中移出含有編碼人Tie2的3375bpcDNA的3.9kb片段。該片段用標準程序以正確方向亞克隆進用EcoRI消化的pCR3.1載體中。用標準方案擴增和純化所選擇的質(zhì)粒。由上述程序獲得的含有Tie2的構(gòu)建體通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染進HEK293F細胞。1X106個HEK293F細胞在37°C、5%(302條件下生長在用1%明膠包被的100mm組織培養(yǎng)皿中。在轉(zhuǎn)染之前細胞用新鮮培養(yǎng)基飼養(yǎng)2—3小時。將10昭質(zhì)粒DNA溶解在248mM磷酸鈣溶液中。用標準程序進行轉(zhuǎn)染。通過在0.5mg/mlG418中保溫而選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。使用用于檢測的小鼠抗Tie2mAb(R&DCat.No.MAB313)和山羊抗小鼠IgG-PE綴合抗體(Caltag，Cat.No.M30004-4)經(jīng)FACS分析鑒別表達Tie2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。為進行Tie2磷酸化測定，在37°C、5%(302條件下將HEK293F/Tie-2轉(zhuǎn)染體以2xl06細胞/平板的密度在具有完全培養(yǎng)基的60mm細胞培養(yǎng)皿中生長直至它們達到亞鋪滿(subconfluency)。每個平板中的完全培養(yǎng)基用2ml無血清培養(yǎng)基置換。細胞再保溫16小時。隨后，將培養(yǎng)基再次用2ml無血清培養(yǎng)基置換。再保溫2小時后，將細胞用0.1mM正釩酸鈉(Sigma,Cat.No.S6508)處理20分鐘。在存在或不存在100嗎/mlmAb條件下將細胞用Ang-2(2pg/ml)處理。處理一式二份進行。包括無Ang-2處理的陰性對照。細胞用冰冷的含有釩酸鹽的TBS洗，并用300jal/平板的冷的NP-40裂解緩沖液(50mMHepes，pH7.2，補加0.15MNaCl,10%甘油，10mM焦磷酸鹽，50mMNaF，1%NP40，100U/ml抑蛋白酶肽，lmMPMSF，O.lmM原釩酸鹽，10pM亮抑蛋白酶肽和IOjiM胃酶抑制劑A)裂解，同時將平板置于冰上10分鐘。將處理的細胞從平板上刮下，置于在冰上預(yù)冷的微型管中。將細胞裂解物短暫超聲處理并在臺式微型離心機中于4。C以12，000g離心10分鐘。將上清收集至新鮮微型管中，向上清中加入l-5嗎抗Tie2mAb(R&DSystems,Inc.)，隨后在4'C輕輕搖動2小時。向混合物中加入50jilImmimoPureImmobilizedProteinA(PIERCECat.No.20333)，在搖床上于4i:保溫至少3小時。在12,000xg離心10分鐘收集復(fù)合物。小心除去上清后，將復(fù)合物用裂解緩沖液經(jīng)離心(12,000xg，4°C)4分鐘而洗2次。沉淀重懸于5(Hil具有l(wèi)mMp巰基乙醇或DTT的2X電泳樣品緩沖液(Invitrogen，Cat.No.LC-2676)中，并煮沸5分鐘，之后離心(12,000xg,4。C)5分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至新鮮試管中。樣品加樣至SDS-PAGE凝膠(例如4-20%Tris-甘氨酸凝膠，Invitrogen,Cat.No.EC6025)的孔中。在Tris-甘氨酸緩沖液系統(tǒng)中進行電泳。電泳后，按照標準方案將凝膠印跡在PVDF膜(Invitrogen，Cat.No.LC2005)上。酪氨酸磷酸化用1lig/ml的4G10抗磷酸酪氨酸抗體(Upstate，Cat.No.05-321)通過在室溫振蕩保溫1小時，隨后用1XTBST(含有0.1%Tween—20的TBS)洗3次而探査。結(jié)合的抗體的檢測通過與1:10,000稀釋度的辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(SantaCruz，Cat.No.sc-2302)在室溫保溫1小時，隨后用SuperSignalWestDuraExtendedDurationSubstratesystem(PIERCECat.No.34075)增強化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而進行。隨后，將印跡用RestoreWesternBlotStripping緩沖液(P正RCE,Cat.No.21059)剝離(stripped),并用抗RTK的特異性抗體再次探査以證實樣品加樣的質(zhì)發(fā)現(xiàn)當(dāng)人Tie2在HEK293F細胞中異位表達時，Tie2的自磷酸化不可檢測。作為對Ang-2(2嗎/ml)處理的應(yīng)答，用針對磷酸化的酪氨酸的mAb(4G10)從用該特異的mAb免疫沉淀的Tie2中檢測到顯著水平的酪氨酸磷酸化。在100pg/ml的濃度，所測試的所有抗Ang-2mAb均顯示對Tie2磷酸化的明顯的抑制，而同種型對照mAb沒有抑制作用(圖1)。未在圖1中示出的單克隆抗體5.103.1有類似的抑制作用。為了排列各Ang-2mAb體外抑制Ang-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化的強度，建立一種基于ELISA的可定量方法以檢測Tie2磷酸化。簡而言之，用不同濃度的mAb從用Ang-2處理的HEK293F/Tie2轉(zhuǎn)染體制備細胞裂解物。來自裂解物的總Tie2被捕獲在96孔ELISA平板中，該平板用小鼠抗hTie-2mAb包被。用一級抗體4G10-HRP(購自Upstate)禾卩HRP底物溶液檢測了磷酸化的Tie2。650nm的OD用SpectraMax讀數(shù)儀測定。用GraphpadPrism繪圖軟件(非線性，Sigmoid曲線)進行的曲線擬合發(fā)現(xiàn)了濃度-應(yīng)答關(guān)系。計算了最大抑制(效力)和ICsq(強度)并示于圖2。EC50計算示于下表9。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>如以上所報道的，發(fā)現(xiàn)mAb3.19.3與Ang-1交叉反應(yīng)。然而，初始實驗的結(jié)果未發(fā)現(xiàn)mAb3.19.3對血管生成素-1誘導(dǎo)的Tie-2磷酸化的抑制。值得注意的是Tie2的異位表達可能影響其對由不同配體導(dǎo)致的活化的易感性，這由Ang-2在HUVEC中不誘導(dǎo)Tie2磷酸化，但是當(dāng)受體在HEK293細胞中異位表達時其確實誘導(dǎo)強Tie2磷酸化這一事實所表明。鑒于這些結(jié)果，進行了進一步的實驗以更充分研究mAb3.19.3是否能抑制Ang-l和Ang-2與細胞結(jié)合的Tie2的結(jié)合。另外，如下述實施例12所述更詳細地研究了mAb3.19.3對血管生成素-1誘導(dǎo)的Tie-2磷酸化的抑制。實施例12mAb3.19.3抑制血管生成素-1與Tie-2的結(jié)合以及ANG-l誘導(dǎo)的Tie2磷酸化mAb3.19.3與人Ang-l交叉反應(yīng)(實施例8和9)。但是，初始實驗表明mAb3.19.3不抑制由Ang-l誘導(dǎo)的Tie2的磷酸化。這一不一致可由如下原因解釋(1)可能需要遠高于生理濃度的Ang-l的高濃度來產(chǎn)生強Tie2磷酸化信號；或(2)Tie2在HEK293中的異位表達可改變Tie2的構(gòu)象，由此改變其對不同配體的易感性。為了測試這些假說，在結(jié)合測定中測試了mAb3.19.3，其中低濃度的Ang-l或Ang-2(3nM)結(jié)合細胞表面Tie2。發(fā)現(xiàn)mAb3.19.3在這個實驗中既抑制Ang-l也抑制Ang-2的結(jié)合。另外，使用固定化的內(nèi)皮細胞(EA.hy926/B3)研究Ang-l誘導(dǎo)的Tie2磷酸化。這個實驗的結(jié)果見如下詳述，其證實mAb3.19.3以劑量依賴方式抑制Ang-l誘導(dǎo)的Tie2磷酸化。使HEK293F/Tie2轉(zhuǎn)染子生長直至在培養(yǎng)瓶中95%鋪滿，之后收獲。制備在FACS緩沖液中的4百萬個細胞/ml的細胞懸液，然后等分到96孔聚丙烯平板中，每孔50nl。向細胞懸液中加入具有指明濃度的mAb3.19.3。隨后，向細胞懸液中加入重組人Ang-l和Ang-2的溶液，在室溫保溫2小時。在1,200rpm離心平板5分鐘洗細胞，通過吸取除去上清，將細胞用200pl/孔FACS緩沖液重懸。重復(fù)洗滌程序2次。然后細胞用在FACS緩沖液中稀釋至2jag/ml的100pl小鼠抗6X組氨酸抗體懸浮，在室溫保溫30分鐘。洗滌后，將細胞懸浮在100^在FACS緩沖液中1:100稀釋的PE綴合的山羊抗小鼠IgG中，在室溫保溫30分鐘。樣品體積用FACS緩沖液調(diào)節(jié)至300)il，并用FACSCalibur測量。結(jié)果在圖3示出并匯總在表10中。如所示，可溶性Tie2/Fc通過阻斷配體而劑量依賴性地抑制Ang-l和Ang-2的結(jié)合，而同種型對照mAb，PK16.3.1對每種配體的結(jié)合均無作用。mAb3,19.3顯示出濃度依賴性抑制Ang-l和Ang-2。令人感興趣地，使用Tie2/Fc的強度作為參考，mAb3.19.3對Ang-2結(jié)合的強度比對Ang-l結(jié)合的強度高。表10Ang-l和Ang-2與Tie2結(jié)合的抑制EC50(nM)Ang-lAng-2Tie2/Fc18.7325.703.19.3218.50.7310這些結(jié)果表明mAb3.19.3不僅結(jié)合人Ang-l，也阻斷其與受體Tie2的結(jié)合。這進一步通過如下所述在固定化的內(nèi)皮細胞中對Ang-l誘導(dǎo)的Tie2磷酸化的抑制而證實。mAb3.19.3對Ang-l誘導(dǎo)的Tie2磷酸化的抑制活性如下進行定量。隨著抗體濃度的增加該mAb顯示明顯增加的對Tie2磷酸化的抑制，如圖4和5所示。劑量應(yīng)答曲線圖計算IC50為99nM。血管生成素-1配體刺激的Tie-2受體磷酸化測定用在2ml體積的DMEM;HAT;10%FCS中的2.5x105EA.hy926細胞/孔將EA.hy926/B3細胞接種在6孔板中，在標準哺乳動物細胞生長條件下保溫3天。生長培養(yǎng)基用2mlDMEM(無FCS)置換，并將細胞進行血清饑餓總共2小時。測試化合物在DMEM;1%FCS中稀釋至所需終濃度的2倍。在血清饑餓1小時40分鐘后，從細胞中除去培養(yǎng)基并用lml測試化合物稀釋液置換。類似地，也設(shè)置無化合物處理的對照以提供代表100%配體刺激標準的樣品。保溫再持續(xù)10分鐘，之后向每孔中加入100nl在DMEM溶液中的10mM原釩酸鹽以獲得每孔中l(wèi)mM原釩酸鹽的終濃度。然后保溫細胞以完成2小時血清饑餓時間的最后10分鐘。完成2小時血清饑餓時間后，向每孔中加入lml血管生成素-1(在DMEM中稀釋至合適濃度并含有l(wèi)mM原釩酸鹽)并在37'C再保溫10分鐘。然后將6孔板置于冰冷的金屬板(其本身保持在冰上)上進行冷卻。除去細胞培養(yǎng)基并用5ml冷PBS;1mM原釩酸鹽洗細胞層。向每孔中加入lml冰冷的裂解緩沖液(20mMTrispH7.6，150mMNaCl，50mMNaF，0.1%SDS,1%NP40，0.5%DOC,1mM原釩酸鹽，lmMEDTA，1mMPMSF，30pl/ml抑蛋白酶肽，10pg/ml胃酶抑制劑，10pg/ml亮抑蛋白酶肽)并置于冰上10—20分鐘。用細胞lifter將細胞從平板上刮下并將完整裂解物溶液轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管并保持在冰上。然后在13000rpm、4。C離心樣品3分鐘，所有后續(xù)步驟在4。C進行。保留50^每種裂解物以用于BCA蛋白質(zhì)測定(Pierce,Cat.No.23225)(在來自Greiner的低蛋白質(zhì)結(jié)合聚丙烯微滴板中)。用試劑盒提供的標準測定條件確定蛋白質(zhì)濃度。將進一步的800jal每種樣品裂解物轉(zhuǎn)移至新鮮的2mlEppendorf管中準備用于免疫沉淀(IP)。向裂解物中加入15iil(3mg)抗P-Y(SantaCruzCat.No.E2203)并在4°C保溫2小時，之后加入600|ilMagnabind珠(山羊抗小鼠IgG，PierceCat.No.21354)。Magnabind珠如下制備將所需體積轉(zhuǎn)移進15ml錐形管中。然后將管置于磁場中并除去液體。用原始體積加入新鮮PBS，珠被重懸。這一過程重復(fù)2次。然后將含裂解物的溶液與珠混和，并將試管置于轉(zhuǎn)子混合器上于4。C旋轉(zhuǎn)過夜。樣品暴露于磁鐵大約1分鐘并小心除去液體。加入1ml裂解緩沖液并將試管旋轉(zhuǎn)5分鐘進行洗滌。洗滌步驟重復(fù)2次。完全除去液體并將珠重懸于12nl熱(94°C)2xLaemmli上樣緩沖液+bME，然后室溫保持15分鐘。將試管暴露于磁鐵1分鐘，從珠中分離的液體在PAGE/SDS凝膠上分析。樣品用具有15孔的4-12%BisTrisNuPAGE/MOPS凝膠(Novex)經(jīng)PAGE/SDS凝膠進行分析。每槽上樣總共12|il每種免疫沉淀物。凝膠在200V/120mA/25瓦電泳55分鐘，然后在50V/250mA將樣品western印跡至硝酸纖維素膜上1小時30分鐘。然后所有印跡用在PBS-Tween中的5%Marvel于室溫處理1小時，然后用PBS-Tween洗。兔抗Tie-2抗體(SantaCruzCat.No.C1303)在0.5%Marvel/PBS-Tween中1:500稀釋，將12.5ml加至每一印跡并置于4'C過夜。然后用PBS-Tween洗印跡并向每一印跡加入山羊抗兔POD(DakoCat.No.P0448)(在0.5%Marvel/PBS-Tween中1:5000稀釋)，置于室溫1小時。印跡用PBS-Tween洗，并用12.5mL(等體積的溶液A和B)Supersignal(PIERCECat.No.34080)顯色每一印跡10分鐘。印跡轉(zhuǎn)移至X光盒中并在膠片上曝光(曝光5秒/15秒/30秒/60秒/150秒)。圖4是顯示這一測定結(jié)果的Western印跡。在這一系統(tǒng)中，觀察到mAb3.19.3對血管生成素-1剌激的Tie-2磷酸化的抑制。然后使用FluorSBioRad圖像分析系統(tǒng)評價在膠片上所見的每一樣品的圖像。像素密度作為OD/mn^測定并以體積百分比表示。體積百分比結(jié)果用BCA測定確定的蛋白質(zhì)濃度和免疫沉淀中所用的每一樣品的裂解物體積而標準化為lmg蛋白質(zhì)/免疫沉淀。針對每一凝膠上未處理對照樣品的100%磷酸化值而計算每一樣品的磷酸化百分比，并且每一樣品的抑制百分比相對于100%磷酸化值而計算，100%磷酸化值本身代表0%抑制。圖5是這些值的圖形示意，并顯示出對血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化的抑制的IC50是99nM?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明在這一系統(tǒng)中，所述mAb抑制血管生成素-1誘導(dǎo)的Tie-2的磷酸化。實施例13ANG-2抗體的結(jié)構(gòu)分析對所述抗體的可變重鏈和可變輕鏈進行測序以確定其DNA序列。關(guān)于抗-Ang-2抗體的完整序列信息在序列表中提供，其具有每個Y和k鏈組合的核苷酸和氨基酸序列。分析可變重鏈序列以確定VH家族，D-區(qū)序列和J區(qū)序列。然后翻譯該序列以確定一級氨基酸序列，與種系VH、D個J區(qū)序列對比以確定體細胞高變。表11是抗體重鏈區(qū)與其同源種系重鏈區(qū)的對比表。表12是抗體k輕鏈區(qū)與其同源種系輕鏈區(qū)的對比表。免疫球蛋白鏈的可變區(qū)(V)由多個種系DNA節(jié)段編碼，在B細胞個體發(fā)生期間結(jié)合成功能性可變區(qū)(VHDJH或VKJK)。對所述抗體應(yīng)答Ang-2的分子和遺傳多樣性進行詳細研究。這些分析表明特異于抗Ang-2抗體的一些點。對特異于Ang-2的152個抗體進行分析，確定所述抗體衍生自21個不同種系VH基因，其中有112個衍生自VH3家族，46個抗體衍生自VH3-33基因節(jié)段。表11和12示出了這個分析的結(jié)果。應(yīng)意識到從每個雜交瘤中收集的姐妹克隆之中氨基酸序列是相同的。例如，mAb3.19.3的重鏈和輕鏈序列與表11和12中示出的mAb3.19和3.19.1的序列是相同的。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>表12.輕鏈分析<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>實施例14:抗體典范類別的確定Chothia等關(guān)于每個免疫球蛋白鏈的高可變區(qū)的"典范類別(canonicalclasses)"描述了抗體結(jié)構(gòu)(JMolBiol.1987Aug20;196(4):901-17)。分析了許多免疫球蛋白的Fab和VL片段的原子結(jié)構(gòu)，以確定其抗原結(jié)合位點的氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。Chothia等發(fā)現(xiàn)通過其包裝、氫鍵或采用不尋常的phi、psi或Q構(gòu)象的能力，有相對很少的殘基主要負責(zé)高可變區(qū)的主鏈構(gòu)象。發(fā)現(xiàn)這些殘基在高可變區(qū)及保守的P折疊構(gòu)架內(nèi)的位點出現(xiàn)。通過檢測具有未知結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白的序列，Chothia等示出許多免疫球蛋白具有大小與已知結(jié)構(gòu)之一相似的高可變區(qū)，及另外在負責(zé)觀測到的構(gòu)象的位點含有相同的殘基。他們的發(fā)現(xiàn)提示這些高可變區(qū)具有與已知結(jié)構(gòu)相近的構(gòu)象。對于5個高可變區(qū)，構(gòu)象的所有組成成分看起來限于相對小數(shù)目的不連續(xù)的結(jié)構(gòu)類別。高可變區(qū)的這些常出現(xiàn)的主鏈構(gòu)象稱作"典范結(jié)構(gòu)"。Chothia等{Nature1989Dec21-28;342(6252):877-83}及其它研究人員(Martin,etal.JMolBiol.1996Nov15;263(5):800-15)的進一步研究證實抗體的6個高可變區(qū)中至少5個高可變區(qū)的主鏈構(gòu)象的所有組成成分是小的。分析上述每個抗體的CDR以確定其典范類別。正如所已知的，典范類別僅是針對抗體重鏈的CDR1和CDR2及抗體輕鏈的CDRl、CDR2和CDR3指定的。下表(表13)概括了分析結(jié)果。所述典范類別數(shù)據(jù)是承HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3形式，其中HCDR是指重鏈CDR，LCDR是指輕鏈CDR。因此，例如典范類別1-3-2-1-5是指抗體具有屬于典范類別1的HCDR1,屬于典范類別3的HCDR2，屬于典范類別2的LCDR1，屬于典范類別1的LCDR2，及屬于典范類別5的LCDR3。當(dāng)抗體的氨基酸與每個典范類別的氨基酸具有70%或更高相同性時，就將其劃分為特定的典范類別。在低于70%相同性時，典范類別劃分以星號*表示，表明基于每個CDR長度和數(shù)據(jù)整體產(chǎn)生了正確典范類別的最佳估值。在沒有與相同CDR長度匹配的典范類別的情況中，典范類別劃分以Y表示。關(guān)于每個抗體的氨基酸可見例如上文提及的Chothia等的文章所述。表13報道了每個Ang-2抗體的典范類別數(shù)據(jù)。表13.抗Ang-2抗體的典范類別抗體典范類<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>表14是對每個類別的抗體數(shù)目的分析。具有在左欄中指定的特定典范類別的抗體數(shù)目在右欄中示出。表14.每種典范類別中抗Ang-2抗體的數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>注1.*是指已經(jīng)進行最佳匹配類別劃分，盡管在指定位置有一些違背。2.Y表示沒有與相同CDR長度匹配的典范類別。實施例15:ANG-2抗體的表位作圖對27個中和Ang-2活性的抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行了分析。重組人Ang-2購自R&Dsystems(623-AN)。根據(jù)山羊抗人Ang-2多克隆抗體(R&DsystemsAF623)在直接ELISA和Western印跡中識別rhAng-2的能力而加以選擇。所述多克隆抗體經(jīng)生物素?；钥梢杂肏RP綴合的-鏈霉抗生物素蛋白檢測。所有限制酶均由NewEnglandBiolabs提供，根據(jù)廠商指導(dǎo)加以應(yīng)用。所有質(zhì)米立DNA均^f吏用spinminicolumns(Invitrogen，Carlsbad,CA)純化。用于克隆和定點誘變的寡核苷酸引物由QiagenOperon合成?？贵w基于其抑制rhAng-2與其受體結(jié)合的能力選擇27個雜交瘤衍生的人抗Ang-2抗體。所述抗體在下表15中列出。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>27個中和抗-Ang-2抗體的表位鑒定斑點印跡使用Bio-DotMicrofiltration設(shè)備，將RhAng-2(R&Dsystems)以其天然或還原形式點滴于硝基纖維素膜上。對針對人Ang-2產(chǎn)生的所有人單克隆抗體(MAb)均結(jié)合非還原的而不是還原形式的Ang-2，表明所有mAb均識別構(gòu)象表位，構(gòu)象表位在蛋白質(zhì)還原時顯然被破壞。Angl和Ang-2蛋白質(zhì)的克隆與表達為了更好地理解mAb與Ang-2相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使用一組嵌合Angl/Ang-2分子。這種方法利用血管發(fā)生家族成員結(jié)構(gòu)是相關(guān)的這一事實。盡管Ang-2與Angl在其蛋白質(zhì)序列僅示出60%同源性，但其均呈現(xiàn)由氨基末端巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域和羧基末端血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的相同模塊結(jié)構(gòu)。人Arig-l和Ang-2的克隆兩個可變剪接形式的人Ang-2cDNA從人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(HUVEC)中擴增。使用Ang-2特異性引物PCR擴增HUVECcDNA揭示了全長Ang-2(1491bp)和1330堿基對的變體Ang-2443(Injuneetal.，(2000)JBC275:18550)。Ang-2443是通過可變剪接外顯子B及缺少部分巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域(第96—148位氨基酸)而產(chǎn)生的變體。將這兩種Ang-2cDNA均克隆進pCR3.1表達載體中，在293F細胞中表達，如圖6所示。人Ang-1cDNA通過RT-PCR使用從人乳腺癌細胞系MDA-MB-231中提取的總RNA而獲得。將1.5KbcDNA克隆進pCR3.1表達載體中，在瞬時轉(zhuǎn)染的293F細胞的上清中檢測表達。ELISA使用抗體捕獲ELISA測試27個mAb與Ang-2和AnglcDNA瞬時轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的上清的結(jié)合。將Ang-2、Ang-2化和Ang-1與山羊抗人Ang-2或Ang-1的多克隆抗體(分別)包被的ELISA平板結(jié)合。前27個人單克隆抗體的結(jié)合用HRP綴合的山羊抗人抗體檢測，隨后用生色辣根過氧化物酶底物(增強的K-BlueTMB底物NeogenCorporation)檢測。在微平板自動讀器上在450nm測量ELISA平板的每個孔的吸收。293F細胞的轉(zhuǎn)染將293F人胚胎腎細胞保持在補加了青霉素和鏈霉素的Dulbecco'smodifiedEagles培養(yǎng)基中的10%胎牛血清中。將293F細胞用磷酸鈣瞬時轉(zhuǎn)染。在72小時，收獲培養(yǎng)基及過濾以進行ELISA和Western印跡分析。所有27個抗體均示出特異性結(jié)合Ang-2/Ang-2443抗原。與人Ang-l未檢測到交叉反應(yīng)性。排除在Ang-2443蛋白質(zhì)序列中缺少的Ang-2的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域中的第96—148位氨基酸是這27個抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Ang-l/Ang-2嵌合分子的構(gòu)建人Ang-l和Ang-2基因中共有的限制性切割位點用于構(gòu)建符合讀框的融合血管生成素嵌合蛋白質(zhì)。制備四種構(gòu)建體人Ang-l/2&附/、Ang-2/l」Rsw/、Ang-l/2&;/和Ang-2/1&p/。所有蛋白質(zhì)均以通過使用抗人Ang-l和Ang-2的多克隆抗體經(jīng)ELISA分析可檢測的水平表達和分泌。氨基酸結(jié)合點在如下位置Bsml-117(Ang-2)/119(Ang-1)SspI-353(Ang-2)/354(Ang-l)。一個氨基酸的差異是由于與人Ang-2的496個殘基相比在人Ang-l中存在第497位殘基。所有構(gòu)建體均在293F細胞中表達，通過對抗Ang-l和Ang-2的山羊抗人多克隆抗體檢測。測試前27個抗體的結(jié)合嵌合的Ang-l/2分子的能力。所有27個抗體均只示出相似的結(jié)合Ang-l/2&m/構(gòu)建體的模式。這些實驗結(jié)果表明所有抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域均在第117—496位殘基之間，很可能在血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，其中&/7/融合Ang蛋白質(zhì)中所述表位在第353位氨基酸周圍被破壞。小鼠/人Ang-2嵌合分子的構(gòu)建由于Ang-2與Ang-l呈現(xiàn)~55%的氨基酸相同性，因此難以發(fā)現(xiàn)共同的限制位點以用于克隆嵌合分子。小鼠和人Ang-2更相似，具有大約85%的序列同源性。克隆進pCMCsport表達載體中的小鼠Ang-2cDNA購自Invitrogen。對27個選擇的抗體測試其與重組小鼠Ang-2的免疫反應(yīng)性。27個抗體中有6個抗體與小鼠Ang-2交叉反應(yīng)，具有與人Ang-2的100%免疫反應(yīng)性，表明所述小鼠抗原保留大多數(shù)的人Ang-2的免疫反應(yīng)性(數(shù)據(jù)概括示于表16)。選擇人-小鼠嵌合系統(tǒng)用于基于發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗體特異性結(jié)合人Ang-2抗原及與小鼠Ang-2不交叉反應(yīng)的事實進行表位作圖。產(chǎn)生多種Ang-2的cDNA構(gòu)建體并克隆進哺乳動物表達載體中。小鼠/人Ang-2的構(gòu)建體使用位于血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的共有Stul限制位點制備，氨基酸結(jié)合點在第311位殘基。所有特異于人Ang-2的mAb均能結(jié)合小鼠/人Ang-2Stul，表明所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中第311—496位殘基之間。為了縮小所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域，制備一種新的構(gòu)建體，其中人片段Stul-Tfil取代小鼠Ang-2cDNA中小鼠序列(圖9)。所有特異于人Ang-2的抗體均示出陽性ELISA信號，具有與人Ang-2的15—100%免疫反應(yīng)性。具有如表17所示獨特的VH基因用法的兩個抗體5.35.1(VH3-20)和5.28.1(VH3-43)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域被作圖為在第310—400位氨基酸之間的區(qū)域。期望與小鼠Ang-2交叉反應(yīng)的抗體示出100%反應(yīng)性，使用小鼠/人嵌合構(gòu)建體不能作圖所述抗體。定點誘變?yōu)榱苏f明參與不同抗體的結(jié)合位點的重要殘基，對人Ang-2的少數(shù)殘基迸行突變，通過ELISA分析針對全部抗體的結(jié)合情況進行篩選。因為通過ELISA檢測的直接結(jié)合對親和性的少量和中等量的差異不靈敏，因此在取代一個氨基酸之后觀測到結(jié)合情況較大的變化可能鑒別與所述抗體相互作用的關(guān)鍵位點。另外，人Ang-2的多克隆抗體保持與每個構(gòu)建體100%反應(yīng)性，表明所述誘變程序不引起Ang-2分子任何廣泛的結(jié)構(gòu)變化。在第345位Val變?yōu)镸et(V345M)及在第375位His變?yōu)镚ln(H375G)的兩個獨立改變?yōu)樗?7個抗體所忽視，表明這些殘基不是反應(yīng)性的，或者構(gòu)象表位中的變化需要一個以上的氨基酸取代。在第365和367位的兩個殘基的改變顯著改變抗體Mab5.35.1的結(jié)合。對5.35.1的序列分析示出在重鏈和輕鏈上獨特的VH3-20用法和獨特的CDR3。Ang-2嵌合分子的所有融合點及點突變在圖8中加亮示出。圖9是小鼠Ang-1(SEQIDNO:5)、人Ang-1(SEQIDNO:2)、小鼠Ang-2(SEQIDNO:4)和人Ang-2(SEQIDNO:3)氨基酸序列對比。箭頭表示疏水性前導(dǎo)序列的切割位點。箭號表示巻曲螺旋和血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的界限。實心圓表示保守的半胱氨酸殘基(圖像取自Maisonpierreetal.，1997，Science277:55)。對所有Ang-2分子的結(jié)合數(shù)據(jù)總結(jié)于下表16表16<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>數(shù)據(jù)表示為與人Ang-2相比的百分比結(jié)合。表17:序列分析和與小鼠Ang"2的交叉反應(yīng)性<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>對IgH和IgL序列進行序列分析是使用序列分析軟件工具，通過將VH基因與種系數(shù)據(jù)庫進行排列對比而實現(xiàn)。所述軟件還評估了D元件、讀框、N區(qū)域插入、P核苷酸添加、核苷酸喪失和CDR3長度。對特異于CR64的27個抗體進行分析僅產(chǎn)生7個種系VH基因，27個抗體中IO個抗體來自相同VH1家族。對中和抗體進行選擇示出表達相同IgVh及在一些情況中相同VhDJh重排及H和L鏈成對的抗體是保守的。這個發(fā)現(xiàn)提示對于任何給定的表位，僅有少數(shù)種系成員用于形成相應(yīng)的互補位，對于每個抗原表位而言，只有有限數(shù)目的L和H鏈基因可以配對形成特異性互補位。相似的VH、VK和互補決定區(qū)(CDR)結(jié)構(gòu)由不同的單克隆抗體的循環(huán)應(yīng)用與這樣的事實相關(guān)聯(lián)，即所有Ang-2中和活性均受限于血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域，與Procopioetal(1999，JBC274:30196)公布的研究工作結(jié)果一致，示出Ang-2對Tie2的作用與血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)。表位作圖數(shù)據(jù)表明所述單克隆抗體通過包括大多數(shù)血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域的廣泛界面而結(jié)合Ang-2。實施例16與小鼠ANG-2的交叉反應(yīng)性的確定通過ELISA檢測抗人Ang-2mAb與小鼠Ang-2的交叉反應(yīng)性。為此，構(gòu)建小鼠Ang-2表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染真核細胞以產(chǎn)生小鼠Ang-2。小鼠血管生成素-2(mAng-2)表達構(gòu)建體得自ResearchGenetics,I.M.A.GE協(xié)會的一個銷售商(見image.llnl.gov)。小鼠Ang-2cDNA(GenBankAccessionNo.BC027216,IMAGE:3494566)衍生自肺腫瘤文庫NCI—CGAP_Lu29。將所述cDNA克隆進pCMV-SPORT6表達載體(InvitrogenCarlsbad,CA)的Sall(5')和Notl(3')位點之間，含有496個氨基酸的全長小鼠Ang-2(mAng-2)開放讀框，以及共2471堿基對的5'及3'非翻譯側(cè)翼區(qū)。使用磷酸鈣方法將10|ig的上述mAng-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進HEK293F細胞中。在前一天將大約1X1(^個HEK293F細胞種植于10cm組織培養(yǎng)平板上。在5小時或過夜轉(zhuǎn)染后更換培養(yǎng)基，將細胞再生長2—3天，之后收集含有分泌的mAng-2蛋白質(zhì)的上清。mAng-2的表達通過ELISA使用得自R&DSystems的多克隆抗體(目錄號No.AF623)證實。將96孔NuncImmplates用從HEK293F/小鼠Ang-2轉(zhuǎn)染體中收集的條件培養(yǎng)基(lOOpl/孔)包被。將該平板在4'C保溫過夜，隨后在SkanWasher300station(SKATRON)中用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌4次。將所述孔用100^tl的ABX-封閉緩沖液(0.5Q/。BSA，0.1%Tween，0.01%Thimerosal于PBS中)封閉1小時。將適當(dāng)濃度的及于封閉緩頁沖液中稀釋的抗-Ang-2mAb加入孔中，體積為100pl/空，在室溫保溫至少1小時。mAb及其稀釋物均一式兩份進行測試。在洗滌兩次后，結(jié)合的mAb通過1/1,000稀釋的山羊抗人Fc-HPPO-綴合的抗體(Caltag,CodeH10507)在室溫檢測1小時。為了設(shè)立檢測產(chǎn)色反應(yīng)，在將孔用PBS洗滌3次后加入100pl的TMB底物(TMB-microwell，BioFX，Cat.No.TMSK-1000-01)。將平板保溫30分鐘，之后加入650終止溶液(10(Hil/孔，BioFX，Cat.No.BSTP-OlOO-Ol)以終止反應(yīng)。用SpectramaxPlus讀數(shù)器確定在650歸的光吸收。這個分析中測試了前27個中和mAb。光吸收表明單克隆抗體3.19.3、3.38、5.2.1、5.52.1、5.56.1和5.78.1在實驗條件下能結(jié)合小鼠Ang-2。為了證實，將每種結(jié)合抗體均通過ELISA滴定。將平均OD650nm(±S.D.)值根據(jù)mAb的濃度Oig/ml)的Log繪圖，示于圖10。圖中示出了克隆5.2.1、5.28.1、3.19.3和3.31.2。單克隆抗體5.2.1和3.19.3以劑量依賴性方式結(jié)合小鼠Ang-2，在大約10ng/ml達到飽和(圖10)。這兩種mAb的結(jié)合曲線是典型的Sigmoidal劑量應(yīng)答關(guān)系曲線。除了克隆5.2.1和3.19.3之外，在測試的抗體濃度范圍均未觀測到劑量依賴性和飽和。基于這個結(jié)果，看來僅有mAb5.2.1和3.19.3與小鼠Ang-2具有交叉反應(yīng)性。實施例17小鼠ANG-2與人TIE2結(jié)合的抑制選擇單克隆抗體3.19.3進一步測試其抑制小鼠Ang-2與人Tie2結(jié)合的能力。為此，將ELISA平板以100—孔用4pg/ml的hTie2/Fc(R&DSystems,Inc.)包被，將所述孔在4"C常規(guī)封閉過夜。應(yīng)用上述293T/mAng-2轉(zhuǎn)染體的培養(yǎng)上清中的重組小鼠Ang-2(mAng-2)。向預(yù)包被的孔中加入10(Hil含有mAng-2的上清及不同濃度的mAb3.19.3，在室溫保溫1小時。作為對照，這個實驗還包括與所述抗體混合的重組人Ang-2(R&DSystems,Inc.)。一式三份測試每種濃度的mAb。結(jié)合的小鼠和人Ang-2使用與小鼠Ang-2交叉反應(yīng)、與二級兔抗山羊IgG-HRP偶聯(lián)的山羊抗人Ang-2多克隆抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)檢測。在加入HRP底物之后30分鐘確定OD650。發(fā)現(xiàn)mAb3.19.3以劑量依賴性方式抑制人和小鼠Ang-2與人Tie2的結(jié)合(圖11)。實施例18與猴脈管系統(tǒng)的交叉反應(yīng)性的確定由于Ang-2在血管發(fā)生內(nèi)皮細胞中特異性表達，因此對猴的這些細胞用抗-Ang-2抗體進行免疫組織化學(xué)染色，以間接確定每種抗體是否均與猴Ang-2交叉反應(yīng)。在這個實驗中使用猴的富集內(nèi)皮細胞的卵巢組織檢測如實施例4所述選擇的前10個中和mAb(表4)。將完全干燥的6mn冷凍的猴(Cynomolgusmacaque)卵巢組織切片用4"C丙酮固定5分鐘。在將該玻片用PBS洗滌3次后，將組織的內(nèi)源過氧化物酶用0.3%的H202封閉10分鐘。隨后，將該組織用PBS洗滌，用lOpg/ml山羊抗人IgGFab封閉15分鐘。將該組織切片再用PBS洗滌，隨后用10%正常山羊血清處理10分鐘。在排出所述血清后，將10種抗-Ang-2mAb的每一種(10pg/ml)加到所述切片上，保溫2小時。結(jié)合的Ang-2mAb用10pg/ml小鼠抗人IgG檢測15分鐘，隨后與過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG—起保溫30分鐘。使用AEC-底物系統(tǒng)(DAKO,Cat.No.3464)在顯微鏡觀測下進行染色以獲得最佳結(jié)果。發(fā)現(xiàn)所有10個mAb在卵巢組織中均染色血管發(fā)生血管內(nèi)皮細胞；而同種型對照mAb不染色。這表明表4的這10個mAb均與猴Ang-2交叉反應(yīng)。實施例19mAb3.19.3在MATRIGELPLUG分析中抑制體內(nèi)血管發(fā)生為了評價抗-Ang-2單克隆抗體的體內(nèi)抗血管發(fā)生潛力，進行Matrigelplug血管發(fā)生分析。發(fā)現(xiàn)當(dāng)將MCF-7細胞在體外培養(yǎng)或作為異種移植物植入免疫缺陷的小鼠中時，其產(chǎn)生Ang-2。當(dāng)將MCF-7摻入Matrigel中并皮下植入裸鼠中時，發(fā)現(xiàn)大量血管生長進入凝膠中。為了建立Matrigelplug模型，應(yīng)用6—8周齡的體重為18—20g雌性BALB/c/nu/nu小鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)。將共0.5mL的含有2X1()S個MCF-7細胞及有或無Ang-2抗體的Matrigel或者對照制劑(僅包含Matrigel,Tie2/Fc，IgG2和IgG4同種型對照，及抗-VEGFmAb)皮下注射進裸鼠的右側(cè)。每個測試組有5只小鼠。所有測試的mAb均調(diào)節(jié)為濃度為10(Hig/ml。7天后，收獲Matrigelplugs及計算血管密度。為此，在深度麻醉下進行小鼠頸部錯位處死。除去覆蓋的皮瓣暴露Matrigelplugs。然后剝離Matrigelplugs及記錄數(shù)字圖像。將Matrigelplugs小心切下并切成兩部分。一部分在TissueTek中速凍，另一部分在緩沖的福爾馬林中固定。然后將這兩部分包埋于石蠟中進行切片。每個小鼠切3個5一7pm厚度的切片，用蘇木精和伊紅染色。然后將切片在相差顯微鏡下檢測。記錄代表性顯微照片[兩幅(100X和400X)],記錄內(nèi)皮細胞和血管浸潤。將冷凍的Matrigelplugs在Cryocut切片機中切片(10^m切片)。每只小鼠切2個獨立的切片用于染色。將切片用BSA(O.l%)封閉，然后用與小鼠反應(yīng)的單克隆抗體處理。將CD31與Phycoerythin(如廠商推薦稀釋)綴合。充分洗滌后，將切片加上抗褪色試劑(VectaShield),使用紅色濾膜在UV顯微鏡下觀測。捕獲代表性數(shù)字圖像(在100X和200X放大倍率下兩張圖片)。細胞核用DAPI復(fù)染。將CD31染色的免疫熒光圖像通過Skeletinization程序進行分析。對數(shù)據(jù)進行加工以提供每組平均血管密度、血管結(jié)和長度。結(jié)果可見于圖12A和12B，示出抗-Ang-2對血管末端的數(shù)目(圖12A)和血管長度(圖12B)的作用。這個實驗表明與單獨的Matrigel相對比，摻入Matrigel中的MCF-7細胞能誘導(dǎo)顯著水平的血管發(fā)生。誘導(dǎo)的血管發(fā)生可以由陽性對照抗-VEGF抗體抑制。血管發(fā)生也可以由可溶的重組Tie2/Fc蛋白質(zhì)顯著抑制，提示由MCF-7細胞產(chǎn)生的Ang-2在這個模型中在血管發(fā)生中起作用。通過與任何Ang-2結(jié)合，Tie2/Fc有效地降低暴露于MCF-7細胞的Ang-2水平。還不清楚IgG2同種型陰性對照抗體PK16丄3怎樣影響血管發(fā)生，盡管也發(fā)現(xiàn)這種抗體在一些異種移植模型中有時候會干擾腫瘤生長(數(shù)據(jù)未示出)。在這個模型中IgG4同種型對照抗體對于血管發(fā)生不具有任何作用。如圖12A和12B所示，克隆5.88.3、3.3.2、3.19.3和5.28.1顯著抑制血管發(fā)生(p〈0.05，由VasculoGen進行的t-檢驗)，其它克隆具有較低的作用。充分確定Ang-2在腫瘤中由內(nèi)皮細胞表達，因此認為可作為自分泌血管發(fā)生因子。然而，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ang-2在體外和體內(nèi)由許多類型的腫瘤細胞表達。除了3.19.3之外，本文測試的mAb與小鼠Ang-2均不交叉反應(yīng)。在這個體內(nèi)模型中，所述mAb僅中和由MCF-7細胞產(chǎn)生的人Ang-2而不中和小鼠Ang-2。這些mAb的抑制作用提示腫瘤表達的Ang-2可以是旁分泌血管發(fā)生因子。mAb的全部抗血管發(fā)生活性除了歸因于血管內(nèi)皮表達的Ang-2的中和之外，部分可歸因于腫瘤Ang-2的中和。實施例20mAb3.19.3在A431預(yù)防性異種移植模型中治療效力的確定抗-Ang-2mAb克隆3.19.3不僅結(jié)合小鼠Ang-2，還抑制小鼠Ang-2與人Tie2的結(jié)合。在人皮膚表皮樣癌的小鼠異種移植模型中使用A431細胞系測試這種單克隆抗體的抗腫瘤活性。將A431細胞在培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)直至細胞達到亞鋪滿。將免疫缺陷的6—8周齡的雌性小鼠(Balb/c/nu/nu訴于產(chǎn)生模型。收獲A431細胞并懸浮于Matrigel中。將含有5乂106個細胞的細胞懸浮液經(jīng)皮內(nèi)注射進小鼠的側(cè)面。將小鼠隨機分為不同組，每組具有11只小鼠。同一天，為小鼠腹膜內(nèi)注射0.5mg的mAb3.19.3或者同種型對照抗體，之后每周注射兩次。每周測定兩次每個腫瘤的直徑。腫瘤體積如下式計算體積=長度X(寬度^X0.5(cm3)。如圖13所例證，mAb3.19.3使A431異種移植腫瘤生長顯著延緩。同種型對照組的平均腫瘤體積在實驗結(jié)束時達到大約1.5cm3，而處理組的生長速度在第IO天后顯著減慢，在實驗結(jié)束時為大約0.5cm3。第23天，T/C(處理組/對照組)的體積比例為1/3，表明66%的生長抑制作用。結(jié)果提示在這個實驗中使用的劑量下，通過與小鼠Ang-2結(jié)合及阻斷該配體與其受體Tie2的結(jié)合，mAb3.16.3在裸鼠中能顯著延緩A431異種移植物的生長。很可能單克隆抗體的抗腫瘤作用是由于抑制宿主中血管發(fā)生所致，通過Matrigelplug分析所證實。使用腫瘤中微血管密度(MVD)作為藥物動力學(xué)標記，關(guān)于抗血管發(fā)生的作用機制在實施例22中進一步證實。mAb3.19.3的作用機制非限于其阻斷Ang-2/Tie2結(jié)合及隨后的信號傳導(dǎo)。如實施例7所示，還發(fā)現(xiàn)這種mAb結(jié)合Ang-l并阻斷Ang-l與Tie2的結(jié)合。令人感興趣地，所述mAb還阻斷Ang-l-誘導(dǎo)的Tie2磷酸化。已知Ang-l參與血管成熟。當(dāng)比較mAb3.19.3的抑制Ang-l和Ang-2結(jié)合Tie2的效力(實施例12)時，顯然mAb3.19.3主要是Ang-2拮抗劑。不受任何特定理論的限制，Ang-2和Ang-l信號傳導(dǎo)的雙重阻斷可能損害血管發(fā)生及隨后的腫瘤生長。實施例21mAb3.19.3在確定的異種移植模型中抑制腫瘤生長Ang-2由血管發(fā)生內(nèi)皮細胞正調(diào)節(jié)，與許多類型的腫瘤的進展相關(guān)?？梢约俣ㄗ钄郃ng-2/Tie2結(jié)合的單克隆抗體能抑制血管發(fā)生，因此抑制腫瘤生長。在這個實驗中，證實了抗Ang-2mAb的治療效力。由于mAb3.19.3交叉反應(yīng)并中和小鼠Ang-2/Tie2信號傳導(dǎo)，因此選擇這種mAb證實其抑制腫瘤生長的體內(nèi)效力。為了測試抗-Ang-2mAb3.19.3是否也抑制確定的腫瘤及除了A-431之外的腫瘤，應(yīng)用人結(jié)腸腺癌LoVo異種移植模型。每周經(jīng)腹膜內(nèi)給予兩次劑量0.5、2和10mg/kg的Mab3.19.3。當(dāng)確定腫瘤的平均體積達到0.2cm3時才開始進行所述處理。對于這些確定的腫瘤，mAb3.19.3與同種型對照相比也表現(xiàn)出抑制作用。圖14A示出在0.5和2mg/kg劑量達到79。/o抑制作用(p值分別為0.022和0.027)，在10mg/kg劑量發(fā)現(xiàn)對腫瘤生長達到75。/。抑制作用(p-0.006)。在一另外的異種移植物模型即使其生長至平均體積為0.2cr^的人結(jié)腸腺癌SW480中再現(xiàn)了腫瘤生長抑制作用。盡管在0.5mg/kg劑量未發(fā)現(xiàn)mAb3.19.3具有顯著作用，但是在2和10mg/kg劑量，在腫瘤植入后第53天所述mAb也使腫瘤生長抑制60%(p值分別為0.003和0.006)(圖14B)。總而言之，抗-Ang-2mAb3.19.3在測試的三個模型中均顯著抑制腫瘤生長。令人感興趣地，LoVo和SW480均表達人Ang-2。然而，無小鼠Ang-2交叉反應(yīng)性的兩種其它mAb未示出對腫瘤生長的顯著抑制活性(數(shù)據(jù)未示出)，盡管事實上人Ang-2是由腫瘤細胞表達。這些結(jié)果提示需要宿主Ang-2的拮抗劑以阻斷血管發(fā)生和腫瘤生長。如上所述，Mab3.19.3與Ang-l交叉反應(yīng)。然而，mAb3.19.3對于Ang-1/Tie2結(jié)合的效力遠低于對Ang-2/Tie2結(jié)合的效力(實施例12)。為此，可以推斷在這些模型中觀測到的治療效力主要是由于Ang-2拮抗作用所致。然而，在模型中體內(nèi)Ang-l的封閉不可完全排除。在整個實驗期間，未觀測到明顯的毒性作用，如體重減輕或出血。實施例22mAb3.19.3在另外的腫瘤異種移植模型中的體內(nèi)效力使用9種不同的腫瘤細胞系，在人癌癥的小鼠異種移植模型中測試3.19.3單克隆抗體的抗腫瘤活性。將結(jié)腸腺癌(Lovo，SW480,Colo205，HT29，HCT116)、表皮樣癌(A431)、肺癌(Calu-6)和乳腺癌(MCF7，MDA-MB-231)細胞在培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)直至細胞達到亞鋪滿。使用免疫缺陷的7—10周齡的雌性小鼠產(chǎn)生模型。收獲細胞，懸浮于Matrigd中，然后經(jīng)皮下注射進每只小鼠中。然后將小鼠隨機分為具有10—12只小鼠的群組。為小鼠腹膜內(nèi)注射0.5mg的mAb3.19.3或者同種型對照抗體，之后每周注射兩次。所有實驗均包括同種型對照抗體處理。每周測定兩次每個腫瘤的直徑。腫瘤體積如下計算體積=長度X(寬度^X0.5(cm3)。對于HT29(圖15A)和Calu6(圖15B)異種移植物示出了腫瘤生長抑制的圖解比較。如表16所示，mAb3.19.3在測試的所有7個異種移植皮下注射模型及具有非優(yōu)化劑量和方案的兩個正位模型中均示出明顯活性。表18.mAb3.19.3的體內(nèi)效力的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>所有情況下p<0.05*生長抑制統(tǒng)計學(xué)不顯著N.D,未確定MDA-MB-231腫瘤組織通過CD31+血管染色密度進行分析。CD31染色密度通過閾值及通過人工網(wǎng)格(grid)計數(shù)方法測定。對每組11個腫瘤及每個腫瘤至少20幅圖像進行分析。如圖15C所示，與對照IgG抗體相比，用3.19.3抗體處理小鼠使得CD31染色密度降低40%。使用閾值(pO.015)和人工網(wǎng)格計數(shù)(pO.00004)這兩種計數(shù)方法通過單尾T-檢驗均具有統(tǒng)計學(xué)意義。對Colo205和HCT116異種移植物的回體組織進行相似的CD31+血管計數(shù)。這些樣品也呈現(xiàn)出相似的CD31+血管染色密度降低。實施例23抗-ANG-2抗體在治療血管發(fā)生相關(guān)疾病中的應(yīng)用為了確定抗-Ang-l和抗-Ang-2抗體在具有各種實體瘤的病人體內(nèi)的治療作用，為病人周期性給予有效量的抗-Ang-l和抗-Ang-2抗體。在治療期間定期監(jiān)測病人，以確定腫瘤生長是否受抑制。在治療后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷抗-Ang-l和抗-Ang-2抗體治療的病人與未治療的患者相比在如下一或多方面有相對改善，包括但非限于腫瘤縮小、進展時間延緩及存活時間延長。實施例24抗ANG-2抗體作為診斷劑的應(yīng)用樣品中Ang-2抗原的檢測可以進行酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以檢測樣品中的Ang-l或Ang-2抗原。在這個分析中，將微滴定平板如96-孔微滴定平板或384-孔微滴定平板的孔用Ang-l和Ang-2的第一種完全人單克隆抗體吸附幾小時。固定的抗體作為測試樣品中也許存在的任何抗原的捕獲抗體。將所述孔用封閉劑如牛乳蛋白質(zhì)或白蛋白漂洗及處理，以防止非特異性分析物的吸附。隨后，將所述孔用懷疑含有所述抗原的測試樣品或者用含有標準量所述抗原的溶液處理。這種樣品可以例如是懷疑具有被認為達到病理學(xué)診斷水平的循環(huán)抗原水平的對象的血清樣品。在漂洗去測試樣品或標準樣品之后，將所述孔用通過與生物素綴合而標記的第二種完全人單克隆抗-Ang-l和抗-Ang-2抗體處理。也可以使用單克隆或小鼠或其它物種來源的抗體。所述標記的抗-Ang-l和抗-Ang-2抗體作為檢測抗體。在漂洗去過量的第二種抗體之后，將所述孔用抗生物素蛋白綴合的辣根過氧化物酶(HRP)及一種合適的生色底物處理。測試樣品中所述抗原的濃度通過與得自標準樣品的標準曲線對比而確定。這個ELISA分析提供了檢測測試樣品中Ang-l和Ang-2抗原的高度特異性和非常靈敏的分析。患者中Ang-2抗原濃度的確定進行夾心ELISA(sandwichELISA)以量化人血清中Ang-l和Ang-2水平。夾心ELISA中的兩種完全人單克隆抗-Ang-2抗體識別Ang-2分子上的不同表位?；蛘?，可以使用小鼠或其它物種來源的單克隆抗體。所述ELISA可以但非必須如下進行將于包被緩沖液(0.1MNaHCO"pH9.6)中濃度為2嗎/mL的50|iL的捕獲抗-Ang-2抗體包被在ELISA平板(Fisher)上。在4。C保溫過夜后，將平板用20(HiL的封閉緩沖液(0.5%BSA，0.1%Tween20，0.01%Thimerosal于PBS中)在25。C處理1小時。將平板用于PBS中的0.05。/。Tween20(洗滌緩沖液，WB)洗滌3次。將正?；蚧颊哐?Clinomics，Bioreclaimation)于含有50%人血清的封閉緩沖液中稀釋。將平板與血清樣品在4'C保溫過夜，用WB洗滌，然后與100pL/孔的生物素?；臋z測抗-Ang-2抗體在25""C保溫1小時。在洗滌后，將平板與HRP-鏈霉抗生物素蛋白保溫15分鐘，如前述洗滌，然后用于11202中10(HiL/孔的鄰苯二胺(Sigma顯色溶液)處理以生色。該反應(yīng)用50nL/孔H2SO4(2M)終止，在492nm用ELISA平板讀數(shù)器分析。血清樣品中Ang-2抗原的濃度通過與純化的Ang-2抗原的稀釋液對比而計算，使用四參數(shù)曲線擬合程序計算。參考文獻本文引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請、文章、教科書等及其中引用的參考文獻在此均以其全部并入本文作參考。等價物前述說明書足以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實施本發(fā)明。前述描述和實施例詳述了某些優(yōu)選的本發(fā)明實施方案，并描述了本發(fā)明人預(yù)期的最佳模式。然而，應(yīng)意識到無論文中前述信息描述的內(nèi)容如何，本發(fā)明可以以多種方式實施，本發(fā)朋應(yīng)根據(jù)所附權(quán)利要求書及其任何等價物加以解釋。權(quán)利要求1.一種以低于100皮摩爾(pM)的Kd結(jié)合血管生成素-2的靶向結(jié)合劑。2.權(quán)利要求1的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑也結(jié)合血管生成素-1。3.權(quán)利要求1的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑阻止Tie2的磷酸化。4.權(quán)利要求l的靶向結(jié)合劑，其中所述耙向結(jié)合劑以低于50皮摩爾(pM)的Kd結(jié)合血管生成素-2。5.權(quán)利要求l的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑以低于20皮摩爾(pM)的Kd結(jié)合血管生成素-2。6.權(quán)利要求1的耙向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑以低于6皮摩爾(pM)的Kd結(jié)合血管生成素-2。7.權(quán)利要求2的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑以低于300皮摩爾(pM)的Kd結(jié)合血管生成素-l。8.權(quán)利要求2的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑以低于160皮摩爾(pM)的Kd結(jié)合血管生成素-1。9.權(quán)利要求2的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑以低于80皮摩爾(pM)的Kd結(jié)合血管生成素-1。10.權(quán)利要求2的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑以低于40皮摩爾(pM)的Kd結(jié)合血管生成素-1。11.權(quán)利要求1或2的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑是單克隆抗體。12.權(quán)利要求11的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑是完全人單克隆抗體。13.權(quán)利要求12的靶向結(jié)合劑，其中所述靶向結(jié)合劑是mAb3.19.3(ATCt登記號PTA-7260)或者mAb3.3.2(ATCC登記號PTA-7258)或者mAb5.88.3(ATCC登記號PTA-7259)。14.權(quán)利要求1或2的靶向結(jié)合劑，其與一種藥物可接受的載體組合在一起。15.—種編碼權(quán)利要求1或2的靶向結(jié)合劑的核酸分子。16.—種包含權(quán)利要求15的核酸分子的載體。17.—種包含權(quán)利要求16的載體的宿主細胞。18.—種治療動物惡性腫瘤的方法，包括給予需要其的所述動物治療有效劑量的權(quán)利要求1或2的靶向結(jié)合劑。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述動物是人。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述靶向結(jié)合劑是單克隆抗體3.19.3(ATCC登記號PTA-7260)或者3.3.2(ATCC登記號PTA-7258)或者5.88.3(ATCC登記號PTA-7259)。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述惡性腫瘤選自黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、甲狀腺腫瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和表皮樣癌。22.—種治療血管生成素-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生的方法，包括給予需要其的動物治療有效劑量的權(quán)利要求1或2的靶向結(jié)合劑。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述動物是人。24.權(quán)利要求22的方法，其中所述靶向結(jié)合劑是完全人單克隆抗體025.權(quán)利要求22的方法，其中所述靶向結(jié)合劑結(jié)合血管生成素-1。26.—種血管生成素-1和血管生成素-2的生物學(xué)活性的拮抗劑，其中所述拮抗劑不結(jié)合Tie-2的ATP結(jié)合位點。27.權(quán)利要求26的拮抗劑，其中血管生成素-1拮抗劑活性和血管生成素-2拮抗劑活性包含在一個分子內(nèi)。28.權(quán)利要求26的拮抗劑，其中血管生成素-1拮抗劑活性和血管生成素-2拮抗劑活性包含在一個以上的分子內(nèi)。29.權(quán)利要求26的拮抗劑，其中所述拮抗劑結(jié)合Tie-2受體。30.權(quán)利要求26的拮抗劑，其中所述拮抗劑結(jié)合血管生成素-1和血管生成素-2。31.權(quán)利要求26—30任一項的拮抗劑，其中所述拮抗劑是抗體。32.權(quán)利要求31的拮抗劑，其中所述拮抗劑是單克隆抗體。33.權(quán)利要求32的拮抗劑，其中所述拮抗劑是完全人單克隆抗體。34.權(quán)利要求33的掊抗劑，其中所述拮抗劑是完全人單克隆抗體3.19.3(ATCC登記號PTA-7260)或33.2(ATCC登記號PTA-7258)或5.88.3(ATCC登記號PTA-7259)。35.權(quán)利要求32的拮抗劑，其中所述拮抗劑是抗體，其結(jié)合的表位與完全人單克隆抗體3.19.3(ATCC登記號PTA-7260)或3.3.2(ATCC登記號PTA-7258)或5.88.3(ATCC登記號PTA-7259)結(jié)合的表位相同。36.權(quán)利要求1或2的靶向結(jié)合劑在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。37.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述惡性腫瘤選自黑素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞(肝)癌、甲狀腺腫瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和表皮樣癌。38.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述靶向結(jié)合劑是單克隆抗體。39.權(quán)利要求38的應(yīng)用，其中所述抗體是完全人單克隆抗體。40.權(quán)利要求39的應(yīng)用，其中所述完全人單克隆抗體是完全人3.19.3抗體(ATCC登記號PTA-7260)或3.3.2(ATCC登記號PTA-7258)或5.88.3(ATCC登記號PTA-7259)。全文摘要本發(fā)明描述了抗原Ang-2的抗體及這種抗體的應(yīng)用。特別地，本發(fā)明描述了針對抗原Ang-2的完全人單克隆抗體。本發(fā)明還描述了編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子、特別是相應(yīng)于跨越構(gòu)架區(qū)和/或互補決定區(qū)(CDR)、特別是從FR1至FR4或者CDR1至CDR3的連續(xù)重鏈和輕鏈序列的序列的核苷酸序列及包含重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子、特別是相應(yīng)于跨越構(gòu)架區(qū)和/或互補決定區(qū)(CDR)、特別是從FR1至FR4或者CDR1至CDR3的連續(xù)重鏈和輕鏈序列的序列的氨基酸序列。本發(fā)明還描述了表達這些免疫球蛋白分子和單克隆抗體的雜交瘤或其它細胞系。文檔編號C12N15/85GK101128483SQ200580048270公開日2008年2月20日申請日期2005年12月19日優(yōu)先權(quán)日2004年12月21日發(fā)明者B·A·基特,D·C·布萊基,L·L·格林,Q·周,S·C·埃默里,X·楊申請人:阿斯利康公司