專利名稱：：稻的鄰氨基苯甲酸合成酶基因oasa2的新改良基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及稻的鄰氨基苯甲酸合成酶基因OASA2的新改良基因及其用途，尤其是涉及編碼與野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶的活性相等或超出，并且對色氨酸所產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的改良的稻鄰氨基苯甲酸合成酶的新改良基因及其用途。
背景技術(shù)：
：色氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的其中一種，是生物生存所不可缺少的。由于動(dòng)物無法在體內(nèi)合成色氨酸，因此不得不從食物中攝取。稻，玉米、小麥等谷物由于色氨酸的含量非常少，因此需要在普通的谷物飼津牛中添加工業(yè)制造的色氨酸。已知在色氨酸的生物合成途徑中，由分支酸生物合成鄰氨基苯甲酸，但是鄰氨基苯甲酸的生成與鄰氨基苯曱酸合成酶的催化劑作用相關(guān)，由此生成鄰氨基苯甲酸，再由鄰氨基苯甲酸通過6階段的酶促反應(yīng)途經(jīng)p引咮生成色氨酸(參照非專利文獻(xiàn)1)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了稻鄰氨基苯甲酸合成酶的2個(gè)a亞基基因OASA1和OASA2，并將它們分離出來(參照專利文獻(xiàn)l)。而且據(jù)報(bào)道，對它們的特征進(jìn)行了詳細(xì)的研究，其結(jié)果是，發(fā)明人認(rèn)為基因表達(dá)量多、并且在稻中編碼主要作為鄰氨基苯曱酸合成酶a亞基行使功能的蛋白質(zhì)的基因是OASA2(參照非專利文獻(xiàn)2)。進(jìn)而，發(fā)明人報(bào)道了OASA2蛋白對色氨酸濃度的敏感性極高，伴隨細(xì)胞內(nèi)的色氨酸濃度上升，OASA2蛋白活性降低(參照非專利文獻(xiàn)3)。因此，認(rèn)為如果可以改變OASA2蛋白的功能，就可以制備積累了高濃度的色氨酸的新品種的植物。關(guān)于稻鄰氨基苯甲酸合成酶基因的改變，發(fā)明人報(bào)道了對色氨酸反饋抑制抗性的變異OASA1蛋白，例如通過將稻鄰氨基苯曱酸合成酶第1同功酶a亞基OASAl蛋白的第323位的天冬氨酸殘基取代為天冬酰胺殘基(D323N)的變異OASA1蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所獲得的色氨酸反饋抑制抗性變異體0ASA1D,愈傷組織中游離的色氨酸量比野生型中增加了180倍、重組稻中比野生型中游離的色氨酸量增加了35倍(參照非專利文獻(xiàn)2)。另一方面，最近人們認(rèn)為在基因中隨機(jī)地導(dǎo)入變異，篩選其變異基因的產(chǎn)物-變異蛋白質(zhì)的功能需要大量時(shí)間和勞力。而且，在目的位置同時(shí)導(dǎo)入多個(gè)變異，采用隨機(jī)導(dǎo)入變異的方法是極為困難的，并且?guī)缀醪豢赡?。專利文獻(xiàn)1國際/^開第WO99/11800號非專利文獻(xiàn)l生化學(xué)實(shí)-瞼講座、第11巻、東京化學(xué)同人、1976年、652頁~653頁非專利文獻(xiàn)2TozawaY,HasegawaH，TerakawaT和WakasaK(2001)CharacterizationofriceanthranilatesynthasealfasubunitgenesOSASAlandOSASA2:tryptophanaccumulationintransgenicriceexpressingafeedback-insensitivemutantofOASAl(鄰氛基苯甲酸合成酶oc亞單位基因OSASAl和OSASA2:表達(dá)反饋不敏感的OASA1變異株的轉(zhuǎn)基因稻中的色氨酸積聚).PlantPhysiology(植物生理學(xué))126:1493-1506非專利文獻(xiàn)3TakuyaKanno，KojiKasai，YasukoIkejiri-Kanno，KyoWakasa和YuzuruTozawa(2004)Invitroreconstitutionofriceanthranilatesynthase:DistinctfunctionalpropertiesofthealphasubunitsOASA1andOASA2(稻鄰氨基苯甲酸合成酶的體外重組oc亞單位OSASAl和OSASA2獨(dú)特的功能特性).PlantMolecularBiology(植物分子生物學(xué))54:11-22
發(fā)明內(nèi)容如上所述，在谷物飼料中添加工業(yè)制備的色氨酸，由于色氨酸比其它氨基酸價(jià)格高，因此希望制備色氨酸含量高的谷物。因此，如果通過在稻鄰氨基苯曱酸合成酶基因OASA2中導(dǎo)入變異，可以將OASA2蛋白的功能改變，即使細(xì)胞內(nèi)的色氨酸濃度上升，酶活性也不降低，就可以制備積累了高濃度色氨酸的新品種植物。本發(fā)明就是鑒于上述的問題而形成的，其目的在于，提供功能改變成即使細(xì)胞內(nèi)的色氨酸濃度上升，酶活性也不會(huì)降低的稻鄰氨基苯甲酸合成酶和編碼該酶的新型改良基因，實(shí)現(xiàn)含有高濃度色氨酸的新品種植物。本發(fā)明人為了解決上述問題，進(jìn)行了積極的研究，其結(jié)果是，通過在稻鄰氨基苯曱酸合成酶基因OASA2中導(dǎo)入變異，創(chuàng)建出對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的蛋白質(zhì)。進(jìn)而，發(fā)明人通過在上述野生型稻鄰氨基苯曱酸合成酶基因OASA2中導(dǎo)入多個(gè)變異，使其進(jìn)行組合，成功地創(chuàng)建出對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性，并且與野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶具有同等程度或以上的酶活性的蛋白質(zhì)，從而完成本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明中涉及的多肽是在序列號1中所示的氨基酸序列的第126位、第367位或第369位中的至少一個(gè)中具有變異的多肽，其特征在于，對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性。進(jìn)而，優(yōu)選除了上述變異之外，還在序列號1中所示的氨基酸序列的第351位、第522位或第530位中的至少一個(gè)中具有變異的多肽，并且與野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶相比具有至少0.7倍以上的酶活性的多肽。對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性并且與野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶相比具有至少0.7倍以上的酶活性的多肽，即使細(xì)胞內(nèi)的色氨酸濃度上升也可以合成色氨酸，表達(dá)該多肽的植物作為含有高濃度色氨酸的營養(yǎng)價(jià)值高的植物是有用的。優(yōu)選的是，上述序列號1中所示的氨基酸序列的第126位的變異是將絲氨酸取代為苯丙氨酸的變異，上述序列號1中所示的氨基Sl/f列的第367位的變異是將酪氨酸取代為丙氨酸或異亮氨酸的變異，上述序列號1中所示的氨基酸序列的第369位的變異是將丙氨酸取代為亮氨酸的變異。并且，優(yōu)選的是，上述序列號1中所示的氨基酸序列的第351位的變異為將天冬酰胺取代為天冬氨酸的變異，上述序列號1中所示的氨基酸序列的第522位的變異為將甘氨酸取代為酪氨酸的變異，上述序列號1中所示的氨基酸序列的第530位的變異為將亮氨酸取代為丙氨酸或天冬氨酸的變異。通過上述例舉的氨基酸取代，可以實(shí)現(xiàn)對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的變異型稻鄰氨基苯甲酸合成酶、或?qū)ι彼岙a(chǎn)生的反饋抑制具有抗性并且與野生型稻鄰氨基苯曱酸合成酶相比，具有至少0.7倍以上的酶活性的變異型稻鄰氨基苯甲酸合成酶。作為上述變異型稻鄰氨基苯曱酸合成酶，可以例舉序列號2至7和序列號29至32的任一項(xiàng)中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽、或序列號2至7和序列號29至32的任一項(xiàng)中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。由于具有這些氨基酸序列，可以實(shí)現(xiàn)對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的變異型稻鄰氨基苯甲酸合成酶、或?qū)ι彼岙a(chǎn)生的反饋抑制具有抗性并且與野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶相比，具有至少0.7倍以上的酶活性的變異型稻鄰氨基苯甲酸合成酶。而且，本發(fā)明中涉及的多肽是在鄰氨基苯曱酸合成酶的色氨酸結(jié)合區(qū)域具有變異的多肽，其特征在于，在序列號26中所示的氨基酸序列的第5位具有變異，且對在色氨酸生物合成途徑由色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性。優(yōu)選的是，上述序列號26中所示的氨基酸序列的第5位的變異為將酪氨酸取代為丙氨酸或異亮氨酸的變異。對色氨酸所產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽，即使細(xì)胞內(nèi)的色氨酸濃度上升，也可以合成色氨酸，表達(dá)該多肽的植物作為含有高濃度色氨酸的營養(yǎng)價(jià)值高的植物是有用的。本發(fā)明中涉及的多核苷酸是編碼上述本發(fā)明中涉及的多肽的多核苷酸。而且，本發(fā)明中涉及的多核苷酸優(yōu)選序列號9至14和序列號33至36的任一項(xiàng)中所示的石咸基序列構(gòu)成的多核苷酸、或與由與序列號9至14和序列號33至36的任一項(xiàng)中所示的石咸基序列構(gòu)成的多核苷酸相互補(bǔ)的堿基序列所構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸。通過在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入該多核香酸，可以制備能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上述本發(fā)明中涉及的多肽的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化體選擇用標(biāo)記基因是上述本發(fā)明中涉及的多核苷酸構(gòu)成的標(biāo)記基因。本發(fā)明中涉及的多核苷酸所編碼的多肽由于基于表達(dá)其的細(xì)胞對色氨酸類似化合物的抗性，因此可以利用其作為用于選擇表達(dá)對該色氨酸類似化合物的抗性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記基因。本發(fā)明中涉及的重組表達(dá)載體是上述本發(fā)明中涉及的多核苷酸構(gòu)成的重組表達(dá)載體。該重組表達(dá)載體不僅可以利用本發(fā)明中涉及的多核苷酸作為用于導(dǎo)入于細(xì)胞的重組表達(dá)載體，還可以在使用發(fā)明中涉及的多核苷酸作為選擇標(biāo)記時(shí)，作為用于在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入其它基因的重組表達(dá)載體來使用。本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化體是，導(dǎo)入了上述本發(fā)明中涉及的多核苷酸或上述本發(fā)明中涉及的重組表達(dá)載體，并且表達(dá)對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體優(yōu)選為植物細(xì)胞或植物體。表達(dá)對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽的轉(zhuǎn)化植物作為含有高濃度色氨酸的高營養(yǎng)價(jià)值的植物是有用的。而且，本發(fā)明還包括從上述轉(zhuǎn)化植物中獲得的種子。本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇方法是通過在細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明中涉及的標(biāo)記基因或本發(fā)明中涉及的重組表達(dá)載體，以使細(xì)胞產(chǎn)生對抑制細(xì)胞增殖的色氨酸類似化合物的抗性，并且選擇對表達(dá)出色氨酸類似化合物抗性的細(xì)胞的選擇方法。通過使用該基因作為選擇標(biāo)記，消除了可以在稻等單子葉植物中利用的標(biāo)記的種類受限制等問題。而且，通過使用該基因解決了目前對于在細(xì)胞中導(dǎo)入多個(gè)基因時(shí)可以使用的選擇標(biāo)記的種類受限制等問題。也就是說，除了對作為常規(guī)的選擇標(biāo)記使用的潮霉素等抗生素的抗性等之外，可以根據(jù)對色氨酸類似化合物、例如5-甲基色氨酸的抗性選擇導(dǎo)入了多個(gè)目的DNA的細(xì)胞。進(jìn)而，由于該標(biāo)記基因?yàn)樵从诘镜幕?，因此希望稻的轉(zhuǎn)化體中編碼該基因的蛋白質(zhì)是低抗原性的。本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化試劑盒的特征在于，至少含有本發(fā)明中涉及的多核苷酸，或本發(fā)明中涉及的重組表達(dá)載體。如果使用該轉(zhuǎn)化試劑盒，可以簡便且有效地獲得表達(dá)本發(fā)明中涉及的多肽的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明中涉及的篩選法是篩選只與本發(fā)明中涉及的多肽和野生型稻鄰氨基苯曱酸合成酶中的任意一個(gè)相結(jié)合的物質(zhì)的方法，其特征在于，包括篩選與本發(fā)明中涉及的多肽相結(jié)合的物質(zhì)的步驟，和篩選與野生型稻鄰氨基苯甲s臾合成酶相結(jié)合的物質(zhì)的步驟，和比較上述兩個(gè)步驟的結(jié)果的步驟。通過該篩選方法，可以篩選與色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制相關(guān)的物質(zhì)，存在著與制備具有更強(qiáng)反饋抑制力的抗性的變異型稻鄰氨基苯甲酸合成酶相關(guān)的可能性。選方法的試劑盒，其特征在于，至少含有本發(fā)明中涉及的多肽中的1個(gè)和野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶。如果使用該篩選試劑盒，可以簡便且有效地實(shí)施本發(fā)明中涉及的篩選方法。如上所述，本發(fā)明中涉及的多肽具有對色氨酸合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性，并且與野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶具有同程度或以上的酶活性。因此，即使在高濃度的色氨酸存在下，也起到能夠合成色氨酸的效果。本發(fā)明中涉及的多核苷酸編碼上述本發(fā)明中涉及的多肽。因此，通過在植物細(xì)胞中導(dǎo)入該多核香酸，起到可以制備即使在高濃度的色氨酸存在下也可以合成色氨酸的轉(zhuǎn)化植物的效果。而且，本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化植物起到可以作為色氨酸含量高且營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)異的食品和飼料來使用的效果。并且，通過制備色氨酸含量高的飼料用稻，起到可以降低家畜用飼料的成本的效果，以及有效利用水田，提高日本的伺料的自給率的效果。本發(fā)明的其它目的，特征和優(yōu)點(diǎn)通過如下記載十分清晰，而且，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，參照附圖的以下說明也更加清晰。圖l顯示在用100mMNH4C1作為酰胺基提供基質(zhì)的測定體系中，鄰氨基苯甲酸合成酶活性的測定結(jié)果，其顯示具有增高的酶活性的變異型OASA2蛋白。圖2顯示在用lOOmMNH4C1作為酰胺基提供基質(zhì)的測定體系中，鄰氨基苯曱酸合成酶活性的測定結(jié)果，其顯示對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的變異型OASA2蛋白。圖3顯示野生型和變異體對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制的抗性程度。圖4(A)是野生型OASA2蛋白的模式圖。圖4(B)是具有色氨酸合成體系的生物在色氨酸結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列的比較圖。圖5是用農(nóng)桿菌法，在稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化中使用的包括變異型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D、S126F/L530D)或野生型(wt)OASA2基因的外源基因的用于導(dǎo)入的重組載體模式圖。具體實(shí)施方式(l)本發(fā)明中涉及的多肽本發(fā)明中涉及的多肽是在鄰氨基苯甲酸合成酶的色氨酸結(jié)合區(qū)域中具有變異的多肽，可以是在序列號26中所示的氨基酸序列的第5位上具有變異并且對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽。上述序列號26中所示的氨基酸序列的第5位的變異優(yōu)選為將酪氨酸取代為丙氨酸或異亮氨酸的變異。圖4(A)中表示了稻鄰氨基苯甲酸合成酶基因OASA2(以下，也稱為"OASA2基因"。)所編碼的稻鄰氨基苯曱酸合成酶(以下，也稱為"OASA2蛋白"或"野生型OASA2蛋白")的模式圖。圖4(A)中的數(shù)字表示氨基酸的位置。cTP表示葉綠體移行信號，I、II和III表示色氨酸結(jié)合區(qū)域的氨基酸殘基區(qū)域。而且，圖4(B)中表示具有各種色氨酸合成體系的生物的色氨酸結(jié)合區(qū)域I、II和III的氨基酸序列的比較。圖4(B)中的Osl表示稻OASAl(登錄號AB022602)、Os2表示稻OASA2(登錄號AB022603)、Atl表示擬南芥(Arabidopsis)ASA1(登錄號M92353)、At2表示擬南芥(Arabidopsis)ASA2(登錄號M92354)、Ss表示嗜熱性古細(xì)菌(Sulfolobussolfataricus)TrpE(登錄號1QDL_A)、St表示沙門氏菌(Salmonellatryphimurium)TrpE(登錄號1I1Q_A)、Sm表示沙雷氏菌(Serratiamarcescens)TrpE(登錄號117Q一A)。根據(jù)圖4(A)和圖4(B)的清楚所示，序列號26中所示的氨基酸序列(NPSPYM)在色氨酸結(jié)合區(qū)域II中，在例示的所有的生物中是保守的。因此認(rèn)為這些序列在色氨酸結(jié)合區(qū)域中起非常重要的作用。作為具有這種保守的氨基酸序列的生物種類，除了圖4(B)中例示的生物種以夕卜，可以例舉長春花(Catharanthusroseus)a亞基(登錄號CAC29060)、蕓香(Rutagraveolens)ASa1(登錄號L34343)、蕓香(Rutagraveolens)ASa2(登錄號L34344)、煙草(tobacco)ASA2(登錄號T01990)、酵母(Saccharomycescerevisiae)TRP2(登錄號X68327)、大腸桿菌(Escherichiacoli)TrpE(登錄號V0036S)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)TrpE(登錄號P03963)，但并不限于此。上述序列號26中所示的氨基酸序列相當(dāng)于，例如序列號1中所示的稻鄰氨基苯曱酸合成酶基因OASA2所編碼的野生型OASA2蛋白的氨基酸序列中第363位~第367位。而且，通過將該序列號26中所示的保守的氨基S吏序列中的酪氨酸取代為其它氨基酸，優(yōu)選丙氨酸或異亮氨酸，可以獲得對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制的抗性。本發(fā)明中涉及的多肽是在序列號1中所示的氨基酸序列的第126位、第367位或第369位的至少1個(gè)中具有變異的多肽，可以是對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽。上述序列號1中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽是稻鄰氨基苯甲酸合成酶基因OASA2編碼的野生型稻鄰氨基苯曱酸合成酶。也就是說，本發(fā)明中涉及的多肽可以是稻鄰氨基苯曱酸合成酶基因OASA2(OASA2基因)所編碼的野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶(野生型OASA2蛋白)的第126位、第367位或第369位中的至少一個(gè)中具有變異，并且對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性多肽。變異的類型沒有特別的限定，例如可以是氨基酸的取代、缺失、添加等。并且，為了說明的方便，無論變異的位置、種類、數(shù)量等，將具有變異的OASA2蛋白稱為"變異型OASA2蛋白"。在植物體中的色氨酸的生物合成途徑中，由分支酸生成鄰氨基苯曱酸，再由鄰氨基苯曱酸通過6個(gè)階段的酶促反應(yīng)經(jīng)過巧l哚生成色氨酸(參照非專利文獻(xiàn)l)。鄰氨基苯甲酸合成酶在上述途徑中催化由分支酸向鄰氨基苯甲酸的生成。而且，鄰氨基苯甲酸合成酶受最終生成物色氨酸的反饋抑制，伴隨細(xì)胞中的色氨酸濃度上升，酶活性降低。因此，如果細(xì)胞中的色氨酸積累到一定量，將不再有色氨酸的合成。本發(fā)明中涉及的多肽由于對如上所述色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性，即使細(xì)胞中的色氨酸濃度上升，也可以合成色氨酸，因此可以制備色氨酸含量高的植物體。測定對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制的抗性，例如，在體外酶活性測定體系中測定野生型OASA2蛋白的酶活性，以不添加色氨酸時(shí)的酶活性作為100%，可以基于存在色氨酸時(shí)的酶活性的比率(百分比)測定對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制的抗性。更具體的是，例如，如圖3所示，以野生型OASA2蛋白和變異型OASA2蛋白的各個(gè)不添加色氨酸時(shí)的酶活性作為100%,在比較色氨酸添加時(shí)的酶活性的比率(百分比)時(shí)，如果超過了野生型OASA2蛋白的色氨酸添加時(shí)的酶活性的比率(百分比)，就可以說對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性。以何種程度超過野生型OASA2蛋白的色氨酸添加時(shí)的酶活性的比率(百分比)，沒有特別限定，^f旦優(yōu)選至少2倍以上，更優(yōu)選至少3倍以上，特別優(yōu)選至少4倍以上，最優(yōu)選至少5倍以上。更具體的是，例如，在使用下文的實(shí)施例3(2)(酶活性測定l)所示的活性測定體系測定酶活性時(shí)，以不添加色氨酸時(shí)的酶活性(鄰氨基苯甲酸合成量)作為100%,添加100pM的色氨酸時(shí)的酶活性(鄰氨基苯甲酸合成量)優(yōu)選為殘留20%以上者，更優(yōu)選殘留30%以上者，尤為優(yōu)選殘留40%以上者，最優(yōu)選殘留50%以上者。只要滿足對上述反饋抑制的抗性的條件，OASA2蛋白的第126位取代絲氨酸的氨基酸沒有特別的限定，但優(yōu)選為苯丙氨酸。具體優(yōu)選的是，序列號29中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽(第126位的絲氨酸取代為苯丙氨酸代)，或序列號29中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽。只要滿足對上述反饋抑制的抗性的條件，0ASA2蛋白的第367位取代酪氨酸的氨基酸，沒有特別的限定，但優(yōu)選為丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸，更優(yōu)選丙氨酸、異亮氨酸。具體優(yōu)選的是，序列號2中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽(第367位的酪氨酸被取代為丙氨酸)，以及序列號3中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽(第367位的酪氨酸被取代為異亮氨酸)、或在序列號2或3中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了l個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且對色氨酸產(chǎn)生的反^t抑制具有抗性的多肽。只要滿足對上述反饋抑制的抗性的條件，OASA2蛋白的第369位取代丙氨酸的氨基酸沒有特別的限定，但優(yōu)選為亮氨酸。具體優(yōu)選的是，序列號30中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽(第369位的丙氨酸取代為亮氨酸)、或在序列號30中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽。作為本發(fā)明中涉及的多肽，除了在上述OASA2蛋白的第126位、第367位或第369位中的至少一個(gè)中的變異外，在第351位、第522位或第530位中的至少一個(gè)中的具有變異的多肽也是優(yōu)選的。本發(fā)明人證實(shí)，與野生型OASA2蛋白的酶活性相比，具有組合了上述第351位、第522位、第530位中的任意1個(gè)或2個(gè)以上變異的變異型OASA2蛋白的酶活性有提高(參照圖1)。通過將酶活性提高的變異和產(chǎn)生對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制的抗性的變異組合在一起，可以獲得對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性，并且酶活性等同野生型OASA2蛋白或更高的變異型OASA2蛋白。這其中所謂的酶活性，可以是指，例如，下文的實(shí)施例3(2)(酶活性測定l)中所示的活性測定體系測定的鄰氨基苯甲酸合成量。但是，用于測定酶活性的方法不限于此，可以是能測定鄰氨基苯曱酸合成酶活性的公知的酶活性測定方法或其改良方法。而且，所謂酶活性等同野生型OASA2蛋白或更高，優(yōu)選是在例如在體外酶活性測定體系(不添加色氨酸)中，變異型OASA2蛋白的酶活性是野生型OASA2蛋白的酶活性的至少0.7倍以上，更優(yōu)選至少0.8倍以上，尤為優(yōu)選至少0.9倍以上，最優(yōu)選至少l倍以上。更具體地優(yōu)選為，例如，在使用下文的實(shí)施例3(2)(酶活性測定l)中所述的活性測定體系(不添加色氨酸)測定酶活性時(shí)，變異型OASA2蛋白的鄰氨基苯甲酸合成量為野生型OASA2蛋白的鄰氨基苯甲酸合成量的至少0.7倍以上，更優(yōu)選為至少0.8倍以上，尤為優(yōu)選至少0.9倍以上，最優(yōu)選至少1倍以上。OASA2蛋白的第351位為天冬酰胺，第522位為甘氨酸，第530位為亮氨酸。分別取代這些氨基酸的氨基酸沒有特別的限定，不論變異單獨(dú)或組合出現(xiàn)，只要所述變異與第126位、第367位或第369位中的至少一個(gè)變異一起導(dǎo)致對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性，并且具有野生型OASA2蛋白的至少0.7倍的酶活性。取代第351位的天冬酰胺的氨基酸優(yōu)選為天冬氨酸，取代第522位的甘氨酸的氨基酸優(yōu)選為酪氨酸。而且，取代第530位的亮氨酸的氨基酸優(yōu)選為丙氨酸、天冬氨酸，更優(yōu)選為天冬氨酸。具體地，具有以下所述變異的組合的多肽是優(yōu)選的。i)第367位的酪氨酸被取代為丙氨酸，第530位的亮氨酸被取代為天冬氨酸的多肽(序列號4)。ii)第351位的天冬酰胺被取代為天冬氨酸，第367位的酪氨酸被取代為丙氨酸，第530位的亮氨酸被取代為天冬氨酸的多肽(序列號5)。iii)第367位的酪氨酸被取代為丙氨酸，第522位的甘氨酸被取代為酪氨酸，第530位的亮氨酸被取代為天冬氨酸的多肽(序列號6)。iv)第367位的酪氨酸被取代為異亮氨酸，第522位的甘氨酸被取代為酪氨酸，第530位的亮氨酸被取代為天冬氨酸的多肽(序列號7)。v)第369位的丙氨酸被取代為亮氨酸的多肽(序列號30)。vi)第126位的絲氨酸被取代為苯丙氨酸，第530位的亮氨酸被取代為天冬氨酸的多肽(序列號31)。vii)第369位的丙氨酸被取代為亮氨酸，第530位的亮氨酸被取代為天冬氨酸的多肽(序列號32)。上述這些多肽中，最優(yōu)選的是具有vi)所示的變異的組合的多肽。這是因?yàn)?，如下文?shí)施例所示，在稻愈傷組織中導(dǎo)入編碼上述多肽的基因，可以確認(rèn)游離色氨酸含量增加到400倍左右。也就是說，本發(fā)明中涉及的多肽優(yōu)選為序列號4至7和序列號30至32的任一項(xiàng)中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽、或序列號4至7和序列號30至32的任一項(xiàng)中所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了l個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，所述多肽對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性并且具有野生型OASA2蛋白的至少0.7倍的酶活性的多肽。上述所謂"缺失、取代或添加了l個(gè)或多個(gè)氨基酸"是指一定數(shù)目(例如20個(gè)以下，優(yōu)選10個(gè)以下，更優(yōu)選7個(gè)以下，更優(yōu)選5個(gè)以下，特別優(yōu)選3個(gè)以下)的氨基酸的缺失、取代或添加，通過位點(diǎn)特異性突變誘導(dǎo)法等公知的變異多肽制備方法可以獲得這些數(shù)目的氨基酸的取代、缺失、或添加。這種變異多肽不限于應(yīng)用公知的變異多肽制備方法人工導(dǎo)入變異的多肽，也可以是分離純化于天然存在的近似的變異多肽。而且，本發(fā)明中涉及的多肽可以是由氨基酸進(jìn)行了肽結(jié)合形成的多肽，但不限于此，可以是含有非多肽結(jié)構(gòu)的多肽。這種非多肽結(jié)構(gòu)，可以是例如，糖鏈和類異戊二烯基等，但不特別限定于此。而且，本發(fā)明中涉及的多肽可以是包括附加多肽的多肽。作為這種附加多肽的情況，可以列舉出，例如、由His或Myc、Flag等標(biāo)識表位作為附加多肽的情況。而且，本發(fā)明中涉及的多肽可以由被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的本發(fā)明所涉及的多核苷酸(編碼本發(fā)明中涉及的多肽的多核苷酸)編碼在細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)，可選擇地，本發(fā)明中涉及的多肽也可以分離純化自細(xì)胞、組織。而且，通過在上述宿主細(xì)胞中的表達(dá)條件，本發(fā)明中涉及的多肽可以是與其它多肽相連的融合蛋白質(zhì)。而且，本發(fā)明中涉及的多肽也可以是化學(xué)合成的。對本發(fā)明中涉及的多肽的獲得方法(生產(chǎn)方法)沒有特別的限定，但是由于本發(fā)明中涉及的多肽是在野生型OASA2蛋白中導(dǎo)入了l個(gè)或多個(gè)變異的多肽，因此制備本發(fā)明涉及的多肽優(yōu)選為首先在OASA2基因的堿基序列中人工導(dǎo)入變異基因，然后使由該變異基因編碼的多肽表達(dá)。可通過公知的方法在堿基序列中導(dǎo)入變異，可以例舉在下文的實(shí)施例中，發(fā)明人使用的Kunkel法或利用PCR在堿基序列中導(dǎo)入變異的方法等。而且，還可以使用市售的試劑盒(例如、Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm、LA—PCRinvitromutagenesisKit(i勻?yàn)門aKaRaBio公司制備)等)。這樣一來，通過在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中插入人工導(dǎo)入了變異的OASA2基因，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中在宿主內(nèi)翻譯而獲得的產(chǎn)物(多肽)，可以獲得本發(fā)明中涉及的多肽。而且，還可以使用如在下文的實(shí)施例中發(fā)明人所使用的小麥胚芽無細(xì)胞系統(tǒng)等公知的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系獲得導(dǎo)入了上述變異的OASA2基因的產(chǎn)物(多肽)。本的說明。(2)本發(fā)明中涉及的多核苷酸本發(fā)明中涉及的多核苷酸可以是編碼上述本發(fā)明中涉及的多肽的多核苷酸。對于本發(fā)明中涉及的多肽，由于上述(l)中已詳細(xì)地說明，這里就省略說明，但是，例如，具體可以是編碼以下的〔1〕和〔2〕中記載的多肽的多核苷酸?！?〕在序列號1中所示的氨基酸序列的第126位、第367位或第369位中的至少l個(gè)位置上具有變異，并且對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽。〔2〕除了上述〔1〕的變異之外，在序列號l中所示的氨基酸序列的第351位、第522位或第530位的至少1個(gè)位置上具有變異，并且對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性，且與野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶相比具有至少0.7倍以上的酶活性的多肽。例如，作為序列號2中所示的氨基酸序列，即編碼OASA2蛋白的氨基酸序列的第367位酪氨酸被取代為丙氨酸的多肽的多核苷酸，可堿基序歹'J)構(gòu)成的多核苷酸的第1099、1100和1101位的堿基序列(tac:酪氨酸)被變異為對應(yīng)于丙氨酸的密碼子，即gct、gcc、gca或gcg中的任一個(gè)的多核苷酸。而且，1099~1101位的堿基以外的石威基序列也可以不與序列號8中所示的堿基序列相同，例如可以是具有編碼的氨基酸沒有變異的堿基取代的多核香酸。對于編碼具有上述例示以外的氨基酸變異的多肽的多核苷酸，也是同樣，可以是序列號8中所示的堿基序列中與變異的氨基酸對應(yīng)的位置的3個(gè)堿基被取代成對應(yīng)于被取代的氨基酸的密碼子的堿基的多核苷酸，或具有該堿基的變異和在其之外的堿基序列中氨基酸沒有變異的堿基取代的多核苷酸。作為本發(fā)明中涉及的多核苷酸，優(yōu)選編碼以下的〔3〕和〔4〕中記載的多肽的多核苷酸?！?〕在序列號2、3、29或30中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，或序列號2、3、29或30中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了l個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽?！?〕在序列號4至7和序列號30至32的任一項(xiàng)中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽、或序列號4至7和序列號30至32的任一項(xiàng)中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性，且具有野生型OASA2蛋白的0.7倍以上的酶活性的多肽。也就是說，可以是編碼序列號2~7和序列號29~32中所示的氨基酸序列的任意一個(gè)的堿基序列構(gòu)成的多核香酸，具體的堿基序列沒有特別的限定。但是，當(dāng)然優(yōu)選序列號8中所示的堿基序列、也就是說與OASA2基因的開放閱讀框區(qū)域的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸的同源性高的多核苷酸。作為同源性，可以是例如、具有至少90%的同一性、優(yōu)選至少95%的同一性、最優(yōu)選至少97%的同一性。作為本發(fā)明中涉及的多核苷酸，可以例舉序列號9至14和序列號33至36的任一項(xiàng)中所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸、或與序列號9至14和序列號33至36的任一項(xiàng)中所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸的互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核香酸。但是，不限于此。序列號9至14和序列號33至36中所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸是分別編碼序列號2至7和序列號29至32中所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸。序列號9至14和序列號33至36中所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸是發(fā)明人用下文的實(shí)施例中記載的方法制備的多核苷酸。上述所稱"嚴(yán)謹(jǐn)條件"是指只在序列間存在至少90%的同一性、優(yōu)選至少95%的同一性、最優(yōu)選至少97%的同一性時(shí)發(fā)生雜交，例如、于60。C2xSSC清洗條件下結(jié)合。上述雜交可以用"MolecularCloning(分子克隆)(第三版)(J.Sambrook和D.W.Russell，ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)，2001)中記載的方法等以往公知的方法進(jìn)行。通常、溫度越高，鹽濃度越低，嚴(yán)謹(jǐn)度越高。本發(fā)明中涉及的多核苷酸中包括DNA和RNA,可以是單鏈，也可以是雙鏈。而且，可以是包括非翻譯區(qū)域(UTR)的序列和載體序列(包括表達(dá)載體序列)等序列的序列。本發(fā)明中涉及的多核苷酸的獲得方法(生產(chǎn)方法)沒有特別的限定，但可以例舉，例如、在OASA2基因的堿基序列中人工導(dǎo)入變異的方法。作為在堿基序列中導(dǎo)入變異的公知方法，可以例舉Kunkel法和利用PCR在堿基序列中導(dǎo)入變異的方法等。而且還可以使用市售的試劑盒(例長口、Mutan-K、Mutan國SuperExpressKm、LA-PCRinvitromutagenesisKit(均由TaKaRaBio公司制)等)。本發(fā)明中涉及的多核苷(3)轉(zhuǎn)化用標(biāo)記基因和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇方法本發(fā)明中涉及的多核苷酸可以用作轉(zhuǎn)化用標(biāo)記基因。也就是說，本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化體選擇用標(biāo)記基因可以是上述(2)中記載的本發(fā)明中涉及的多核苷酸構(gòu)成的標(biāo)記基因。導(dǎo)入了本發(fā)明中涉及的多核香酸的細(xì)胞由于形成色氨酸抗性，通過在培養(yǎng)基中添加色氨酸類似化合物，可以只選擇導(dǎo)入了該多核香酸的細(xì)胞?？梢宰鳛檫x擇用藥劑使用的抑制細(xì)胞的增殖的色氨酸類似化合物的例子有，例如，5-甲基色氨酸(5MT)、4-曱基色氨酸(4MT)、6-甲基色氨酸(6MT)、7-甲基色氨酸(7MT)、6-曱基鄰氨基苯曱酸(6MA)、5-曱基鄰氨基苯甲酸(5MA)、3-曱基鄰氨基苯曱酸(3MA)、5-氟代鄰氨基苯曱酸(5FA)、6-氟代鄰氨基苯甲酸(6FA)等。具體的是，為了利用本發(fā)明中涉及的多核苷酸作為轉(zhuǎn)化用標(biāo)記基因，例如，構(gòu)建整合了該多核香酸的表達(dá)載體，將該表達(dá)載體導(dǎo)入目的細(xì)胞。由于導(dǎo)入了該表達(dá)載體，表達(dá)編碼由本發(fā)明中涉及的多核苷酸編碼的多肽的細(xì)胞獲得色氨酸抗性，因此即使在添加了上述示例的選擇用藥劑的培養(yǎng)基中也可以增殖；另一方面，沒有導(dǎo)入該表達(dá)載體的細(xì)胞和不表達(dá)本發(fā)明中涉及的多核苷酸所編碼的多肽的細(xì)胞的增殖受到抑制。因此，可以只選擇導(dǎo)入了該表達(dá)載體，表達(dá)由本發(fā)明中涉及的多核苷酸所編碼的多肽的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。上述的例子中，本發(fā)明中涉及的多核苷酸可以作為在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的基因和標(biāo)記基因兩者使用，本發(fā)明中涉及的多核苷酸也可以只作為標(biāo)記基因使用。而且，例如，通過使用植物的愈傷組織細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，還可以控制作為選擇標(biāo)記的本發(fā)明中涉及的多核苷酸的表達(dá)時(shí)間。此時(shí)，可以再構(gòu)建另一個(gè)表達(dá)載體，在所述表達(dá)載體中插入了要在目的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，該表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞。而且，不構(gòu)建整合了本發(fā)明中涉及的多核苷酸的表達(dá)載體，也可以單獨(dú)在目的細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明中涉及的多核苷酸。通過使用本發(fā)明中涉及的多核苷酸作為選擇標(biāo)記，消除了可以在稻等單子葉植物中應(yīng)用的標(biāo)記的種類受限制等問題。而且，針對目前在細(xì)胞中導(dǎo)入多個(gè)基因時(shí)可以使用的選擇標(biāo)記的種類受限制等問題，通過使用該基因可以解決。也就是說，除了作為常規(guī)的選擇標(biāo)記使用的潮霉素等抗生素的抗性之外，可以根據(jù)對色氨酸類似化合物，例如5-曱基色氨酸的抗性選擇導(dǎo)入了多個(gè)目的DNA的細(xì)胞。進(jìn)而，由于該標(biāo)記基因源于稻，因此希望稻的轉(zhuǎn)化體中編碼該基因的蛋白是低抗原性的。并且，在本發(fā)明中，還包括通過在細(xì)胞中導(dǎo)入上述本發(fā)明中涉及的標(biāo)記基因或以下說明的重組表達(dá)載體，賦予細(xì)胞對抑制細(xì)胞增殖的色氨酸類似化合物的抗性，而且選擇表達(dá)對該色氨酸類似化合物的抗性的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇方法。(4)重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化試劑盒本發(fā)明中涉及的重組表達(dá)載體如果是含有上述(2)中記載的本發(fā)明中涉及的多核苷酸的表達(dá)載體，就沒有特別的限定。例如，可以列舉插入了cDNA的重組表達(dá)載體。在重組表達(dá)載體的制備中，可以使用質(zhì)粒、噬菌體、或柯斯質(zhì)粒等，沒有特別的限定。而且，可以使用7>知的方法進(jìn)4于制備。載體的具體的種類沒有特別的限定，可以適當(dāng)選擇在宿主細(xì)胞中能夠表達(dá)的載體。也就是說，根據(jù)宿主細(xì)胞的種類，選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列以使基因確實(shí)地表達(dá)，可以使用在各種質(zhì)粒中整合了本發(fā)明中涉及的多核苷酸和所述啟動(dòng)子的載體作為表達(dá)載體。當(dāng)然可以使用該重組表達(dá)載體表達(dá)本發(fā)明中涉及的多肽，但也可以利用本發(fā)明中涉及的多核苷酸作為標(biāo)記基因，通過整合其它基因作為用于使這些基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)的重組表達(dá)載體。為了確認(rèn)本發(fā)明中涉及的多核苷酸是否導(dǎo)入于宿主細(xì)胞中，而且在宿主細(xì)胞中是否確實(shí)地表達(dá)，可以4吏用各種標(biāo)記。使用賦予細(xì)胞抗生素例如潮霉素抗性的藥物抗性基因作為標(biāo)記，在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入作為表達(dá)載體的含有該標(biāo)記和本發(fā)明中涉及的多核苷酸的質(zhì)粒。由此可以根據(jù)標(biāo)記基因的表達(dá)確認(rèn)本發(fā)明的基因的導(dǎo)入。上述宿主細(xì)胞如果是具有色氨酸合成體系的細(xì)胞、生物，就沒有特別的限定，可以適當(dāng)使用以往公知的各種細(xì)胞。具體可以例舉，例如、大腸桿菌(Escherichiacoli)等細(xì)菌、酵母(出芽酵母Saccharomycescerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomycespombe)等，但沒有特另'J的限定。在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入上述表達(dá)載體的方法，即轉(zhuǎn)化方法，沒有特別的限定，例如，電穿孔法(electroporation法)、磷酸釣法、原生質(zhì)體法、醋酸鋰法等以往公知的方法。本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化試劑盒可以是含有上述(2)中記載的本發(fā)明中涉及的多核苷酸或該本發(fā)明中涉及的重組表達(dá)載體的至少一個(gè)的試劑盒。對于其它的具體的構(gòu)成，沒有特別的限定，可以適當(dāng)選擇需要的試劑和器具等構(gòu)成試劑盒。通過使用轉(zhuǎn)化期試劑盒，可以簡便且有效地獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。。)轉(zhuǎn)化體本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化體如果是導(dǎo)入了上述(2)中記載的本發(fā)明中涉及的多核苷酸或上述(4)中記載的重組表達(dá)載體，并且，表達(dá)對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽的轉(zhuǎn)化體，就沒有特別的限定。這里所稱的"轉(zhuǎn)化體"，不僅包纟舌細(xì)胞、組織、器官，還包括生物個(gè)體。轉(zhuǎn)化體的制備方法(生產(chǎn)方法)沒有特別的限定，可以列舉，例如，通過在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入上述重組表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法。而且，如果是具有色氨酸合成系的細(xì)胞、生物，作為轉(zhuǎn)化對象的生物沒有特別的限定，可以例舉上述(4)中作為宿主細(xì)胞的例示的各種微生物等。本發(fā)明中涉及的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選植物細(xì)胞或植物體。這種轉(zhuǎn)化植物作為色氨酸的含量高，營養(yǎng)價(jià)值高的食品原料和飼料，具有高利用價(jià)值?？梢栽谥参矬w的轉(zhuǎn)化中使用的重組表達(dá)載體如果可以是使插入基因在該植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組表達(dá)載體，沒有特別的限制。尤其是，在向植物體導(dǎo)入載體的方法為采用農(nóng)桿菌的方法時(shí)，優(yōu)選使用pBI系等二元載體。作為二元載體，具體可以例舉例如、pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。而且，優(yōu)選具有在植物體內(nèi)可以使基因表達(dá)的啟動(dòng)子的載體。作為啟動(dòng)子，可以適當(dāng)使用公知的啟動(dòng)子，具體可以列舉，例如、花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)、泛素(Ubiquitin)啟動(dòng)子和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。而且、可以使用各種形態(tài)的植物細(xì)胞、例如、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉切片、愈傷組織等。在向植物細(xì)胞導(dǎo)入重組表達(dá)載體時(shí)，可以使用聚乙二醇法、電穿孔法(electroporation法)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法、基因槍法等公知的各種方法。而且，可以根據(jù)植物細(xì)胞的種類用公知的方法進(jìn)行由轉(zhuǎn)化細(xì)胞向植物體的再生。如果已經(jīng)獲得了在基因組內(nèi)導(dǎo)入了本發(fā)明中涉及的多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物體，在由該植物體獲得的種子中也導(dǎo)入了該多核苷酸。例如、在被本發(fā)明中涉及的多核苷酸轉(zhuǎn)化的稻等谷物中，可以獲得色氨酸含量高的谷物。本發(fā)明還包括由轉(zhuǎn)化植物獲得的種子。(6)篩選方法和篩選試劑盒本發(fā)明中涉及的篩選方法為篩選只與(l)中記載的本發(fā)明中涉及的多肽(變異型OASA2蛋白)和野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶(OASA2蛋白)中的任一者的物質(zhì)的方法，并且可以包括篩選與變異型OASA2蛋白相結(jié)合的物質(zhì)的步驟，和篩選與野生型OASA2蛋白結(jié)合的物質(zhì)的步驟，和比較上述兩步驟的結(jié)果的步驟。上述本發(fā)明中涉及的多肽、即變異型OASA2蛋白，由于對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性，因此我們認(rèn)為上述只與變異型OASA2蛋白和野生型OASA2蛋白中的任一者結(jié)合的物質(zhì)非?？赡苁窃谏彼嵘锖铣赏緩街猩婕胺答佉种频男盘栁镔|(zhì)。如果通過該篩選方法發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)，則有望促進(jìn)了解反饋抑制的機(jī)制，有助于開發(fā)對反饋抑制的抗性更強(qiáng)的變異型OASA2蛋白。而且，本發(fā)明中涉及的篩選試劑盒為用于實(shí)施上述篩選方法的試劑盒，可以是至少含有l(wèi)種本發(fā)明中涉及的多肽和野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶的試劑盒。對于其它具體的構(gòu)成，沒有特別的限定，可以適當(dāng)選擇需要的試劑和器具等構(gòu)成試劑盒。通過使用該轉(zhuǎn)化期試劑盒，可以簡便且有效地實(shí)施上述本發(fā)明中涉及的篩選方法。本發(fā)明不限于所描述的實(shí)施方式，在權(quán)利要求中公開的范圍內(nèi)，可以進(jìn)行各種改變，在不同的實(shí)施方式中，通過適當(dāng)組合各個(gè)公開的技術(shù)手段獲得的實(shí)施方式，也包括在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。實(shí)施例實(shí)施例l:向稻鄰氨基苯曱酸合成酶基因0ASA2中導(dǎo)入變異<目的基因向克隆載體的插入〉在克隆載體pBluescriptSK+(Stratagene公司制)的多克隆位點(diǎn)的EcoRI位點(diǎn)插入稻鄰氨基苯曱酸合成酶基因OASA2(登錄號AB022603),構(gòu)建pBS-OASA2。并且，按由多克隆位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)KpnI向SacI方向插入基因。<變異導(dǎo)入用引物>用Kunkel法在編碼目的蛋白質(zhì)的基因中導(dǎo)入變異時(shí)，設(shè)定在要導(dǎo)入變異的位置導(dǎo)入正義(或反義)的變異用多核苷酸。用PCR在編碼目的蛋白質(zhì)的基因中導(dǎo)入變異時(shí)，在要導(dǎo)入變異的位置設(shè)計(jì)使用2條引物、即正義和反義的多核苷酸。因此，該變異導(dǎo)入用引物中的一條，可以作為在上述Kunkel法中使用的變異導(dǎo)入用寡核苷酸使用。此時(shí)，通過在不改變基因所編碼的氨基酸的適當(dāng)位置導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可以對變異導(dǎo)入的有無進(jìn)行確認(rèn)。用Kunkel法導(dǎo)入下述i)~vi)的變異，用PCR導(dǎo)入下述vii)和viii)的變異。<變異導(dǎo)入用引物>i)將第351位的天冬酰胺殘基取代為天冬氨酸殘基(N351D)將變異導(dǎo)入用引物設(shè)計(jì)成將第351位的天冬酰胺殘基氨基酸取代為天冬氨酸殘基，并且，在編碼的氨基酸不改變的位置導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(BsiWI)。變異導(dǎo)入用引物的石成基序列如下所述。而且，下劃線表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，小寫字表示變異導(dǎo)入密碼子。N351D-F:5'-GTTTGAGAGGCGAACGTACGCCgatCCATTTGAAGTCT-3'(序列號15)分別根據(jù)野生型OASA2的AAT(天冬酰胺，N)和CATACG的堿基序列設(shè)計(jì)引物N351D-F的第23位至第25位的gat(天冬氨酸，D)和第15位至第20位的CGTACG(BsiWI位點(diǎn))。通過將AAT變成GAT將第351位的天冬酰胺殘基取代成天冬氨酸殘基。而且，通過使CATACG變成CGTACG,不發(fā)生氨基酸取代卻導(dǎo)入(ACA、ACG均為蘇氨酸)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(BsiWI:CGTACG)，可以使變異導(dǎo)入后的選擇變得容易。ii)將第367位的酪氨酸殘基取代為丙氨酸殘基(Y367A)與上述i)相同，將變異導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)為將第367位的酪氨酸殘基取代為丙氨酸殘基，并且，在編碼的氨基酸不發(fā)生變化的位置導(dǎo)入限制內(nèi)切性酶位點(diǎn)(SnaBI:TACGTA)。變異導(dǎo)入用引物的堿基序列如下所述。而且，下劃線表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，小寫字表示變異導(dǎo)入密碼子。Y367A-F:5'畫GTGAACCCAAGTCCAgccATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC-3'(序列號16)iii)將第367位的酪氨酸殘基取代為異亮氨酸殘基(Y3671)與上述i)相同，將變異導(dǎo)入用引物設(shè)計(jì)成將第367位的酪氨酸殘基氨基酸取代為異亮氨酸殘基，并且，在編碼的氨基酸不改變的位置導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(SnaBI:TACGTA)。變異導(dǎo)入用引物的堿基序列如下所述。而且，下劃線表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，小寫字表示變異導(dǎo)入密碼子。Y367I畫F:5'-GTGAACCCAAGTCCAatcATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC-3'(序列號17)iv)將第530位的亮氨酸殘基取代為丙氨酸殘基(L530A)與上述i)相同，將變異導(dǎo)入用引物設(shè)計(jì)成將第530位的亮氨酸殘基取代為丙氨酸殘基，并且，在編碼的氨基酸不改變的位置導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(NheI:GCTAGC)。變異導(dǎo)入用引物的石成基序列如下所述。而且，下劃線表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，小寫字表示變異導(dǎo)入密碼子。L530A-F:5'畫ACGGAGACATGgctATCGCGCTAGCACTCCGCACCATT-3'(序列號18)v)將第530位的亮氨酸殘基取代為天冬氨酸殘基(L530D)將變異導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)為將第530位的亮氨酸殘基取代為天冬氨酸殘基，并且，在編碼的氨基酸不改變的位置導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Nhel:GCTAGC)。變異導(dǎo)入用引物的堿基序列如下所述。而且，下劃線表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，小寫字表示變異導(dǎo)入密碼子。L530D-F:5'-ACGGAGACATGgacATCGCGCTAGCACTCCGCACCATT-3'(序列號19)vi)將第522位的甘氨酸殘基取代為酪氨酸殘基，將第530位的亮氨酸殘基取代為天冬氨酸殘基(G522Y+L530D)與上述i)相同，將變異導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)為將第522位的甘氨酸殘基取代為酪氨酸殘基，將第530位的亮氨酸殘基取代為天冬氨酸殘基，并且，在編碼的氨基酸不改變的位置導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(BciVI:GTATCC/GGATAC)。變異導(dǎo)入用引物的石咸基序列如下所述。而且，下劃線表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，小寫字表示變異導(dǎo)入密碼子。G522Y+L530D畫F:5'畫AGTGGCGGCCTTGGAtacATATCATTTGACGGAGACATGgatATCGCTCTTGCACT-3'(序列號20)vii)將第126位的絲氨酸殘基取代為苯丙氨酸殘基(S126F)將變異導(dǎo)入用引物設(shè)計(jì)為將第126位的絲氨酸殘基取代為苯丙氨酸殘基。變異導(dǎo)入法中，由于要通過采用PCR的方法導(dǎo)入變異，因此制成正義和反義的多核苷酸。變異導(dǎo)入用引物的堿基序列如下所述。而且，小寫字表示變異導(dǎo)入密碼子。S126F-F:5'畫GCTTCCTCTTCGAGttcGTCGAGCAGGGGCC-3'(序列號37)S126F陽R:5'-GGCCCCTGCTCGACgaaCTCGAAGAGGAAGC國3'(序列號38)根據(jù)野生型OASA2的TCC(絲氨酸，S)設(shè)計(jì)引物S126F-F的第15位至第17位的ttc(苯丙氨酸，F(xiàn))。通過將TCC變成TTC,將第126位的絲氨酸殘基耳又代為苯丙氨酸殘基。引物S126F-R為引物S126F-F的互補(bǔ)鏈。viii)將第369位的丙氨酸殘基取代為亮氨酸殘基(A369L)與上述i)相同，將變異導(dǎo)入用引物設(shè)計(jì)成將第369位的丙氨酸殘基取代為亮氨酸殘基。變異導(dǎo)入法中，由于要通過采用PCR的方法導(dǎo)入變異，因此制成正義和反義的多核苷酸。變異導(dǎo)入用引物的堿基序列如下所述。而且，小寫字表示變異導(dǎo)入密碼子。A369L-F:5'-CAAGTCCATACATGctaTATGTACAGGCAA-3'(序列號39)A369L-R:5'-TTGCCTGTACATAtagCATGTATGGACTTG-3'(序列號40)引物A369L-R為引物A369L-F的互補(bǔ)鏈。<用Kunkel法進(jìn)行變異導(dǎo)入DNA的制備>Kunkel法按照下述參考文獻(xiàn)l-3中記載的方法進(jìn)行。參考文獻(xiàn)l:Kunkel，T.A.(1985)Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection(無表型選擇的快速有效的位點(diǎn)凈特異性誘變).ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUSA(美國科學(xué)院院刊)，82:488-492.參考文獻(xiàn)2:Kunkel，T.A.，Bebenek,K.和McClary，J.(1991)Efficientsite-Directedmutagenesisusinguracil-containingDNA(使用含尿嘧啶DNA的有效的定點(diǎn)誘變).MethodsinEnzymology(酶學(xué)方法)，204:125-139.參考文獻(xiàn)3:MolecularCloning(分子克隆)(第三版)(J.Sambrook和D.W.Russell,ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社),(2001)Chapter13(第13章).例如，在將第351位的天冬酰胺殘基取代為天冬氨酸殘基時(shí)，以前述的pBS-OASA2載體作為模板，使用上述i)中記載的變異導(dǎo)入用引物，通過進(jìn)行Kunkel法導(dǎo)入變異。上述ii)、iv)、v)、vi)中記載的使用變異導(dǎo)入用引物時(shí)，使用與上述相同的模板進(jìn)行Kunkel法。通過以上才喿作制備N351D、Y367A、L530A、L530D、G522Y+L530D變異DNA。通過重復(fù)兩次變異導(dǎo)入步驟制備N351D+L530A的雙重變異DNA。也就是說，起初，以前述的pBS-OASA2載體作為模板，使用上述i)中記載的變異導(dǎo)入用引物制備N351D變異DNA。然后，以導(dǎo)入了N351D的變異的質(zhì)粒DNA(pBS-OASA2(N351D)載體)作為模板，使用上述iv)中記載的變異導(dǎo)入用引物，獲得了導(dǎo)入了兩個(gè)變異的變異DNA(N351D+L530A)。同樣，以導(dǎo)入了N351D的變異的質(zhì)粒DNA(pBS-OASA2(N351D)載體)作為模板，使用上述v)中記載的變異導(dǎo)入用引物，獲得了導(dǎo)入了兩個(gè)變異的變異DNA(N351D+L530D)，以導(dǎo)入了Y367A的變異的質(zhì)粒DNA(pBS-OASA2(Y367A)載體)作為模板，使用上述v)中記載的變異導(dǎo)入用引物，獲得了導(dǎo)入了兩個(gè)變異的變異DNA(Y367A+L530D)。通過以含有上述雙重變異DNA的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行Kunkel法制備三重變異DNA。也就是說，以預(yù)先導(dǎo)入了N351D+L530A的變異的質(zhì)粒DNA(pBS-OASA2(N351D+L530A)載體)作為模板、使用上述ii)中記載的變異導(dǎo)入用引物，獲得了導(dǎo)入了3個(gè)變異的變異DNA(N351D+Y367A+L530A)。同樣，以導(dǎo)入了G522Y+L530D的變異的質(zhì)粒DNA(pBS-OASA2(G522Y+L530D)載體)作為模板、使用上述ii)中記載的變異導(dǎo)入用引物，獲得了導(dǎo)入了3個(gè)變異的變異DNA(Y367A+G522Y+L530A)。同樣，以導(dǎo)入了G522Y+L530D的變異的質(zhì)粒DNA(pBS-OASA2(G522Y+L530D)載體)作為模板、使用上述iii)中記載的變異導(dǎo)入用引物，獲得了導(dǎo)入了3個(gè)變異的變異DNA(Y3671+G522Y+L530A)。<用RCR法制備變異導(dǎo)入用DNA〉按照下述參考文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行通過PCR法進(jìn)行的變異導(dǎo)入法。HiguchiR,KrummelB,SaikiRK(1988)AgeneralmethodofinvitropreparationandspecificmutagenesisofDNAfragments:studyofproteinandDNAinteractions(DNA片l殳的體外制備和特異突變的一4殳方法蛋白質(zhì)和DNA相互作用的研究).NucleicAcidsRes(核苷酸研究)16:7351-7367通過將OASA2基因分成5，側(cè)區(qū)域和3，側(cè)區(qū)域使得在變異導(dǎo)入用的引物區(qū)域重疊進(jìn)行PCR。例如，在使用用于將上述vii)中記載的第126位的絲氨酸取代為苯丙氨酸的變異導(dǎo)入用引物時(shí)，5'側(cè)區(qū)域以pBS-OASA2載體作為模板，通過組合克隆用正義引物(5'-AAAACTAGTTGGAGTCCATCGCCGCCGCCACG-3':序歹。號41,下劃線表示限制性內(nèi)切酶Spel位點(diǎn))和引物S126F-R進(jìn)行PCR,3，區(qū)域以pBS-OASA2載體作為模板，通過組合引物S126F-F和克隆用反義虧I物(5'-AAAGTCGACTTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC-3':序列號42,下劃線表示限制性內(nèi)切酶SalI位點(diǎn))進(jìn)行PCR。在使用上述viii)中記載的變異導(dǎo)入用引物時(shí)，也使用與上述相同的模板，通過組合相同的引物進(jìn)行PCR。在制備S126F+L530D的雙重變異DNA時(shí)，使用在作為模板的pBS-0八3八2載體中用前述的Kunkel法已經(jīng)導(dǎo)入了將OASA2的第530位的亮氨酸殘基氨基酸取代為天冬氨酸殘基的變異的質(zhì)粒DNA。因此，通過使用上述vii)中記載的變異導(dǎo)入用引物(S126F-F和S126F-R)進(jìn)行PCR,獲得了導(dǎo)入了將OASA2的第126位的絲氨酸殘基取代為苯丙氨酸殘基，將第530位的亮氨酸殘基氨基酸取代為天冬氨酸殘基這兩個(gè)變異的變異基因。而且，引物的組合與上述相同。A369L+L530D的雙重變異DNA的制備，通過使用與上述相同的模板和上述viii)中記載的變異導(dǎo)入用引物(A369L-F和A369L-R)進(jìn)行PCR，獲得了導(dǎo)入了將OASA2的第369位的丙氨酸殘基取代為亮氨酸殘基，將第530位的亮氨酸殘基氨基酸取代為天冬氨酸殘基的兩個(gè)變異的變異基因。PCR反應(yīng)的組成為，1xPyrobestbufferII(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.5juM正義和反義引物、0.025單位/julPyrobestDNA聚合酶(TaKaRa公司)、10ng模板DNA,使用PCR^應(yīng)裝置(寶酒造公司制，TaKaRaPCRThermalCyclerMPTP3000型)，于95。C保持2分鐘后，重復(fù)進(jìn)行25個(gè)98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反應(yīng)的循環(huán)，保持在72。C10分鐘后，冷卻至4。C。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(5'區(qū)域片段和3，區(qū)域片段)稀釋20倍，將平均每ljal加入到PCRA應(yīng)液[lxPyrobestbufferII(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.025單位/ialPyrobestDNA聚合酶(TaKaR"土)]中，使用上述PCR^應(yīng)裝置、于95。C保持2分鐘后，重復(fù)進(jìn)行25個(gè)98"20秒、60°C35秒、72。C3分的反應(yīng)的循環(huán)，進(jìn)行延伸反應(yīng)。通過該反應(yīng)，合成由克隆用正義引物至克隆用反義引物連接的DNA片段。上述反應(yīng)后立即添加克隆用正義引物和克隆用反義引物使得引物的濃度分別達(dá)到0.2jaM，使用上述PCR裝置，于95。C保持2分鐘后，重復(fù)進(jìn)行20個(gè)98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反應(yīng)的循環(huán)、保持在72。C10分鐘后，冷卻至4。C。通過以上反應(yīng)，擴(kuò)增出由上述克隆用正義引物至克隆用反義引物連結(jié)的DNA片段，將其插入于克隆載體pBluescriptKS+(Stratagene&3)的多克隆位點(diǎn)的SpeI和SalI中，構(gòu)建出pBS國OASA2(S126F)、pBS-OASA2(A369L)、pBS-OASA2(S126F/L530D)、pBS-OASA2(A369L/L530D)。實(shí)施例2:由小麥胚芽無細(xì)胞系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)(l)用Split-PCR法合成轉(zhuǎn)錄模板DNA<Split-PCR用模板的制備>OASA2基因?yàn)榈镜暮嘶蚪M上的編碼基因，但是推測合成的蛋白質(zhì)移行進(jìn)入葉綠體，在葉綠體內(nèi)行使功能。在合成的蛋白質(zhì)的N末端區(qū)域存在用于向葉綠體移行的信號序列，通過除去該序列形成成熟型酶，發(fā)揮酶活性。因此，為了在小麥胚芽無細(xì)胞合成系統(tǒng)合成OASA2蛋白作為成熟型酶，將引物設(shè)計(jì)成除去了存在于N末端區(qū)域的49個(gè)殘基構(gòu)成的信號序列的形態(tài)而被合成。也就是說，在小麥胚芽無細(xì)胞合成系統(tǒng)中在可以Split-PCR的linker序列的下游配置ATG起始密碼子，設(shè)計(jì)由OASA2基因的第148至第164位的堿基序列構(gòu)成的全長為36mer的引物。而且，在插入了OASA2基因的載體(pBluescriptSK+)上，在上述正義Split-PCR用引物的互補(bǔ)鏈側(cè)的位置設(shè)定兩種Split-PCR用反義引物。按從插入DNA的位置至遠(yuǎn)處順序作為反義Split-PCR用引物l和反義Split-PCR用引物2。Split-PCR用引物的石咸基序列如下所述。而且，下文對Split-PCR進(jìn)行描述。正義Split畫PCR用引物5'-CCTCTTCCAGGGCCCAATGTGCTCCGCGGGGAAGCC-3'(序列號21,下劃線部分為linker序列)反義Split-PCR用引物l:5'-GGAGAAAGGCGGACAGGTAT-3'(序列號22)反義Split-PCR用引物2:5'-GGGGAAACGCCTGGTATCTT-3'(序列號23)SK+載體作為模板，使用上述正義Split-PCR用引物和反義Split-PCR用引物1進(jìn)行PCR等擴(kuò)增反應(yīng)，可以將擴(kuò)增的DNA片段作為接下來進(jìn)行的Split-PCR的模板。PCR反應(yīng)液的組成1xPyrobestbufferII(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.5|uM正義Split-PCR用引物和反義Split-PCR用引物1、0.025單位/n1PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa公司)、10ng模板DNA(導(dǎo)入了各變異的pBS-OASA2載體)，使用PCR反應(yīng)裝置(寶酒造公司制、TaKaRaPCRThermalCyclerMPTP3000型)，于95。C保持2分鐘后，重復(fù)進(jìn)行25個(gè)98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反應(yīng)的循環(huán)，保持在72。C10分鐘后，冷卻至4。C。通過以上反應(yīng)，擴(kuò)增出由上述正義Split-PCR用引物至反義Split-PCR用引物1連結(jié)的DNA片段，將擴(kuò)增的DNA片段作為接下來進(jìn)行的Split-PCR的沖模板。<轉(zhuǎn)錄模板DNA的合成〉為了以上述Split-PCR用模板DNA作為轉(zhuǎn)錄模板DNA,需要在片段的5'末端上游添加SP6RNA聚合酶的啟動(dòng)子和煙草花葉病毒(TMV)來源的翻譯增強(qiáng)序列(omega序列)。為此，按照Sawasaki等人的方法(Sawasaki等人.(2002)ProcNatlAcadSciUSA(美國科學(xué)院院刊)99,14652-14657),進(jìn)行Split-PCR。也就是說，將上述Split-PCR用模板DNA稀釋50倍，在PCR反應(yīng)液[lxEXTaqbuffer(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.025單位/|a1TaKaRaEXTaq(TaKaRa公司)、0.2jaMSP6啟動(dòng)子引物、lnMTMV-Omega引物、0.2pM反義Split-PCR用引物2]中添加lial,使用上述PCR反應(yīng)裝置、于95。C保持2分鐘后，重復(fù)進(jìn)行35個(gè)98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反應(yīng)的循環(huán)，保持在72。C10分鐘后，冷卻至4。C。SP6啟動(dòng)子引物和TMV-Omega引物的石成基序列如下所示。而且，下劃線表示SP6啟動(dòng)子序列，小寫字表示兩引物的重復(fù)部分。SP6啟動(dòng)子引物5'-GCGTAGCATTTAggtgacact-3'(序列號24)TMV-Omega引物5'國ggtgacactATAGAAGTATTTTTACAACAATTCTACAACTACCTCTTCCAGGGCCCAATG國3'(序列號25)這里，如上述SP6啟動(dòng)子引物和TMV-Omega引物這樣，將引物分為上游側(cè)引物和下游側(cè)引物，將^皮:沒計(jì)成與上游側(cè)引物的3，末端和下游側(cè)引物的5，末端的序列部分重復(fù)的引物稱為Splitprimer。而且，將使用這種f1物進(jìn)行的PCR^應(yīng)稱為Split-PCR。(2)小麥胚芽無細(xì)月包系統(tǒng)用的mRNA的合成使用上述(1)中獲得的PCR產(chǎn)物作為直接模板，合成(轉(zhuǎn)錄)mRNA。也就是說，將上述(1)中獲得的PCR產(chǎn)物以1/10量添加于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液[80mMHEPES畫KOH(pH7.8)、16mMMg(OAc)2、10mM亞精胺、10mMDTT、3mMNTP、1單位/ja1RNasinRNaseinhibitor(Promega公司)、l單位/iulSP6RNA聚合酶(Promega公司)]中。于37。C反應(yīng)2小時(shí)后，進(jìn)行乙醇沉淀、70%的乙醇清洗，溶解于適量的無菌水中。通過測定260nm的吸光度計(jì)算出RNA量。(3)用d、麥胚芽無細(xì)胞系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)按照Sawasaki等人的方法(Sawasaki等人.(2002)ProcNatlAcadSciUSA(美國科學(xué)院院刊)99,14652-14657)，以上述(3)中合成的mRNA作為模板合成蛋白質(zhì)。也就是說，在裝入了50jal的小麥胚芽無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成液的透析杯中添加上述mRNA(約30-35jag),將上述透析杯浸漬于每l孔裝入了lml的底物液的24孔板，于26。C溫育24小時(shí)。實(shí)施例3:變異型OASA2蛋白的活性測定(l)用蛋白印記法(WesternBlot)進(jìn)行的OASA2蛋白的定量使用基于OASA2蛋白的氨基酸序歹'J(序列號1)的第161位~第175位的序歹U(MDHEKGKVTEQVVDD)的肽片段制作的家兔抗OASA2抗體和OASA2蛋白純化標(biāo)品，通過小麥胚芽無細(xì)胞系統(tǒng)定量合成的OASA2蛋白。按照Towbin等人的方法(Towbin，H.，Staehelin，T.和Gordon,J.1979.Electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:procedureandsomeapplications(蛋白乂人聚丙烯酰胺凝膠到硝化纖維素片的電泳轉(zhuǎn)移步驟及一些應(yīng)用).ProcNatlAcadSciUSA(美國科學(xué)院院刊)76:4350-4354.)進(jìn)行WesternBlot分析。以用上述方法估計(jì)的OASA2蛋白量校正下文的酶活性。(2)OASA2蛋白的活性測定稻鄰氨基苯曱酸合成酶的oc亞基-OASA2蛋白通過利用P亞基提供的谷氨酰胺酰胺基來源的氨由分支酸生成鄰氨基苯甲酸。在生物體內(nèi)，OASA2蛋白通過利用(3亞基供給的氨發(fā)揮鄰氨基苯甲酸合成活性(以下，簡稱為"AS活性，，。)，即使從外部添加氨、例如NH4C1，也顯示酶活性。OASA2蛋白的活性由于會(huì)受到公知的色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制，因此需要從上述蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液中除去色氨酸，而且需要將表達(dá)的蛋白質(zhì)的環(huán)境改變成AS活性測定用的緩沖液成分。因此，用MicrospinG-25columns(AmershamBiosciences公司制)將蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液的成分置換成緩沖液A(50mMTris國HC1,pH7.6;0.05mMEDTA;2mMMgCl2;0.05mMDTT;5%甘油)。<酶活性測定1〉在90ial的反應(yīng)液(20mMTris-HCl，pH8.3;100mMNH4C1;0.5mM分支酸；10mMMgCl2)中加入2.5iLil被緩沖液置換的粗提取液，使之于32。C反應(yīng)l小時(shí)。通過添加10jul1NHC1使反應(yīng)停止，通過添加300iul的醋酸乙酯提取合成的鄰氨基苯甲酸。用Wallacl420ARVOsx-FL(PerkinElmerLifeScienceJapan司制)于激發(fā)波長355nm/螢光(emmision)460nm處測定鄰氨基苯甲酸的合成量。分析對色氨酸的反饋抑制活性時(shí)，在反應(yīng)系中添加色氨酸使得終濃度達(dá)到10jaM或100iaM。結(jié)果示于圖1和圖2。如圖l清楚所示，6種變異型OASA2蛋白(N351D、L530A、L530D、N351D/L530A、N351D/L530D和G522Y/L530D)與野生型(wt)相比，酶活性提高。而且，如圖2清楚所示，7種變異型OASA2蛋白(A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D和Y367I/G522Y/L530D)在不添加色氨酸時(shí)的酶活性等同或超出野生型酶活性，并且，獲得了對色氨酸反饋抑制的抗性。<酶活性測定2〉為了更詳細(xì)地研究獲得了對上述色氨酸反饋抑制的抗性的5種變異型OASA2蛋白的酶學(xué)性質(zhì)，在使用稻鄰氨基苯甲酸合成酶p亞基的反應(yīng)系中分析酶活性和色氨^饋抑制。在添加了過剩量的稻鄰氨基苯甲酸合成酶(3亞基的90jul反應(yīng)液(20mMTris-HCl，pH8.3;5mM谷氨酰胺；0.2~0.8mM分支酸；10mMMgCl2;)中添加2.5ial被緩沖液取代的粗提取液，使之于32。C反應(yīng)1小時(shí)。而且，稻鄰氨基苯曱酸合成酶(3亞基的制備和通過WesternBlot法進(jìn)行的合成量的定量按照Kanno等人的方法(Kannoetal.(2004)PlantMolecularBiology(植物分子生物學(xué))54,11-22)進(jìn)行。通過添加10jalINHC1使反應(yīng)停止、通過添力口300nl的醋酸乙酯提取合成的鄰氨基苯甲酸。用Wallacl420ARVOsx-FL(PerkinElmerLifeScienceJapan爿^司制)于激發(fā)波長355nm/螢光(emmision)460nm處測定鄰氨基苯甲酸的合成量。分析對色氨酸的反饋抑制活性時(shí)，在反應(yīng)系中添加色氨酸使得終濃度達(dá)到10)aM、25laM或50jaM。結(jié)果示于表1和圖3。如表l清楚所示，9種變異型OASA2蛋白(S126F、Y367A、A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D和Y367I/G522Y/L530D)，除了S126F、Y367A,與野生型(wt)相比具有同等程度或超出的酶活性。更詳細(xì)的是，與野生型(wt)相比，A369L的酶活性為約l倍、S126F/L530D的酶活性為約2.5倍、Y367A/L530D的酶活性為約2.2倍、A369L/L530D的酶活性為約1.8倍、Y367A/G522Y/L530D的酶活性為約1.3倍、N351D/Y367A/L530D的酶活性為約1.2倍、Y367I/G522Y/L530D的酶活性為約0.8倍。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>而且，圖3為以在不添加色氨酸的野生型和各變異型OASA2蛋白酶活性作為100%，將添加各濃度的色氨酸時(shí)的酶活性與不添加色氨酸時(shí)的酶活性相比較的圖。如圖3清楚所示，野生型如果添加50jliM以上色氨酸，酶活性下降為不添加時(shí)的10。/。，但是9種變異型OASA2蛋白(S126F、Y367A、A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D和Y3671/G522Y/L530D)即使在添加50jaM色氨酸時(shí)也具有不添加時(shí)的300/。以上的酶活性。實(shí)施例4:使變異型0ASA2基因表達(dá)的酵母TRP2基因缺失變異抹(MATalphahis3A1leu2AOmetl5AOura3AOtrp2::KANMX)的游離色氨酸含量分析缺失了相當(dāng)于0ASA2基因的TRP2基因的酵母為了生長需要色氨酸。因此，將OASA2基因?qū)胗谠撊笔Я种?，如果可以在色氨酸非存在下生長，導(dǎo)入的OASA2基因就可以互補(bǔ)TRP2的功能。而且，使對色氨酸反饋抑制具有抗性的變異型OASA2基因在該酵母中表達(dá)，通過測定積累在生物體內(nèi)中的游離色氨酸含量可以進(jìn)行該基因的效果測定。為了構(gòu)建表達(dá)載體，以插入了對色氨酸反饋抑制具有抗性的變異型OASA2基因(S126F、Y367A、A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D、Y367I/G522Y/L530D)和野生型(Wt)OASA2基因的pBluescript載體作為模板，使用下述引物進(jìn)行PCR。如上所述，由于OASA2蛋白的N末端區(qū)域上存在葉綠體移行信號，與上述(2)中記載的"Split-PCR用引物"的設(shè)計(jì)同樣，將引物設(shè)計(jì)成以除去信號序列的形式表達(dá)。而且，在正義引物中導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)KpnI(GGTACC)、在反義引物中導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRI(GAATTC),使得整合到酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen公司制)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Kpnl/EcoRI中。這些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用下劃線表示。而且，pYES2載體具有URA3基因，通過半乳糖可以控制蛋白質(zhì)的表達(dá)誘導(dǎo)。正義引物5'-AAAGGTACCATGTGCTCCGCGGGGAAGCC-3，(序列號27)反義引物5'國AAAGAATTCTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC-3，(序列號28)PC版應(yīng)液的組成為1xpyrobestbufferII(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.5iaM正義和反義引物、0.025單位/ja1PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa公司)、10ng模板DNA(pBS-OASAZ載體)，使用PCR反應(yīng)裝置(寶酒造公司制、TaKaRaPCRThermalCyclerMPTP3000型)，于95。C保持2分鐘后，重復(fù)進(jìn)行25個(gè)98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反應(yīng)的循環(huán)，保持在72。C10分鐘后，冷卻至4。C。按照Sambrook等人的方法(《分子克隆第三版》(J.Sambrook和D.W.Russell,ColDSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實(shí)-瞼室出版社)，2001))進(jìn)行與載體的DNA片段的克隆。按照Kaiser等人的方法(MethodsinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual(酵母遺傳學(xué)方法冷泉港實(shí)驗(yàn)室課程手冊)(ChrisKaiser，SusanMichaelis,AaronMitchell,ColdSpringHarborLaboratory,1994))進(jìn)4亍3尋構(gòu)建的載體向酵母TRP2基因缺失變異抹的轉(zhuǎn)化等基礎(chǔ)的方法。酵母轉(zhuǎn)化體，用含有2%葡萄糖的合成完全瓊脂培養(yǎng)基(0.67%不含氨基酸的BactoYeastNitrogenBase、除去了尿嘧，定的0.2。/odropout混合物、2%細(xì)菌用瓊脂)分離單菌落，然后將菌體涂布在含有2%半乳糖的合成完全瓊脂培養(yǎng)基(0.67。/。不含氨基酸的BactoYeastNitrogenBase、除去了尿嘧啶和色氨酸的0.2。/odropout混合物、2%細(xì)菌用瓊脂)上，于30。C培養(yǎng)兩天。將20mg從瓊脂培養(yǎng)基上刮取的菌體懸浮于105pl蒸餾水中，于100。C處理20分鐘。然后，添加595iul的氯仿:曱醇混合液(5:12、v/v),充分混合后，以20,000xg的離心加速度離心分離10分鐘。將獲得的上清轉(zhuǎn)移到新的管中，加入175jul的蒸餾水和263pl的氯仿，強(qiáng)烈地混合后，以20,000xg的離心加速度離心分離10分鐘。這樣一來，將提取的水層轉(zhuǎn)移到新的管中，在減壓下使之干燥后，溶解于200ial的10mMNaOH中，作為色氨酸才是取液。將其提供給高效液相色i普(HPLC)裝置(Waters公司制、WatersAllianceHPLCFLDSystem2695),測定游離色氨酸含量。在該HPLC中使用的柱是XterraRP18column(4.6x150mM)(Waters公司制)，在激發(fā)波長278nm/螢光波長348nm處檢測色氨酸。結(jié)果示于表2。如表2清楚所示，確認(rèn)了使對色氨酸反饋抑制具有抗性的變異型OASA2基因(S126F、Y367A、A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D、Y367I/G522Y/L530D)表達(dá)的酵母中生成的游離色氨酸含量比使野生型(Wt)OASA2基因表達(dá)的酵母中所生成的積累了更高濃度(野生型的1.92.3倍)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實(shí)施例5:使變異型0ASA2基因表達(dá)的稻愈傷組織轉(zhuǎn)化體的制備和該轉(zhuǎn)化愈傷組織的游離色氨酸含量分析外源基因?qū)胗弥亟M載體的構(gòu)建外源基因?qū)胗弥亟M載體的構(gòu)建按照下述參考文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行。參考文獻(xiàn)l:UrushibaraS,TozawaY,Kawagishi-KobayashiM和WakasaK(2001)Efficienttransformationofsuspension-culturedricecellsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens(由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懸浮培養(yǎng)的稻細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)化).BreedingScience(孵育科學(xué))51:33-38參考文獻(xiàn)2:TozawaY，HasegawaH，TerakawaT和WakasaK(2001)CharacterizationofriceanthranilatesynthasealfasubunitgenesOSASAlandOSASA2:tryptophanaccumulationintransgenicriceexpressingafeedback-insensitivemutantofOASAl(稻鄰氨基苯甲酸合成酶oc亞基基因OSASAl和OSASA2的特點(diǎn)在表達(dá)反饋抑制-不敏感型的OASAl變異株的轉(zhuǎn)基因稻中的氨酸積聚).PlantPhysiology(植物生理學(xué))126:1493-1506參考文獻(xiàn)3:HieiY,OhtaS,KomariT和KumashiroT(1994)Efficienttransformationofrice(Oryzasativa)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisofboundariesoftheT-DNA(由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻的高外源基因?qū)胗弥亟M載體pUB-Hm(Urushibaraetal.，BreedingScience51:33-38(2001))帶有玉米的泛素(Ubiquitin)啟動(dòng)子，第一內(nèi)含子，和限制性內(nèi)切酶Sse8387I位點(diǎn)，NOS終止子，潮霉素抗性基因，通過在Sse8387I位點(diǎn)插入目的外源基因可以構(gòu)建稻轉(zhuǎn)化用的重組載體。以實(shí)施例1中記載的pBS-OASA2作為模板，并且用下述中所述的正義引物和反義引物用PCR擴(kuò)增全長構(gòu)成的野生型(Wt)OASA2基因。在正義引物中導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SpeI(ACTAGT)、在反義引物中導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SalI(GTCGAC)。這些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用下劃線表示。正義引物5'-AAAACTAGTATGGAGTCCATCGCCGCCGCCACG-3'(序列號43)反義引物5'-AAAGTCGACTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC國3'(序列號44)為得到全長的變異型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D),以pBS-0ASA2作為模板，用上述正義引物(序列號43)和反義引物(序列號44)，用實(shí)施例1〈用RCR法制備變異導(dǎo)入用DNA〉中記載的方法，制備DNA片段。用限制性內(nèi)切酶SpeI和SalI消化以上的通過PCR擴(kuò)增的DNA片段(l)，獲得的DNA片段插入小麥胚芽無細(xì)胞合成系統(tǒng)用表達(dá)載體pEU3s的Spel/Sall位點(diǎn)，表達(dá)載體pEU3s是經(jīng)修飾的表達(dá)載體pEU3b,根據(jù)Sawasaki等人(Sawasaki等人.(2002)ProcNatlAcadSciUSA(美國科學(xué)院院刊)99,14652-14657)所述，其中，在多克隆位點(diǎn)Spel/Sall位點(diǎn)的兩端插入了Sse8387I位點(diǎn)。不同的是，用限制性內(nèi)切酶Sse83871消化含有上述的變異型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D)或野生型(Wt)OASA2基因的pEU3s質(zhì)粒載體，獲得了1.8kb大小的DNA片段(2)。用DNA連接試劑盒ver.2(TaKaKabio公司制)處理上述用限制性內(nèi)切酶Sse8387I消化的pUB-Hm^粒載體和DNA片|史(2),進(jìn)行DNA連結(jié)反應(yīng)。由此，構(gòu)建環(huán)狀的重組載體。該重組載體在泛素(Ubiquitin)啟動(dòng)子區(qū)域的下游具有第一內(nèi)含子區(qū)域，在第一內(nèi)含子區(qū)域與NOS終止子區(qū)域之間插入并連接變異型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D)或野生型(Wt)OASA2基因，并且具有含有植物中表達(dá)的潮霉素抗性基因的構(gòu)造。將獲得的外源基因?qū)胗弥亟M載體分別稱為pUB-OASA2(wt)-Hm(具有野生型OASA2基因)、pUB-OASA2(Y367A)-Hm(具有變異型OASA2基因(Y367A))和pUB-OASA2(Y367A/L530D)畫Hm(具有變異型OASA2基因(Y367A/L530D))。圖5中表示pUB-OASA2(wt)-Hm、pBU-OASA2(Y367A)-Hm和pBU-OASA2(Y367A/L530D)-Hm的模式圖。圖中Pubi表示泛素(Ubiquitin)啟動(dòng)子區(qū)域，P35S表示花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子區(qū)域，nos3'表示NOS終止子區(qū)域，hp滾示潮霉素抗性基因區(qū)域，Sse8387I表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，RB表示右側(cè)境界序列(RightBorder),LB表示左側(cè)境界序列(LeftBorder)。<農(nóng)桿菌的制備>將農(nóng)桿菌(AgrobactqriumtumefaciensEHA101)移植到在50mlYEB培養(yǎng)基(5g/l細(xì)菌用蛋白胨、細(xì)菌用牛肉提取物5g/1、bactoyeast提取物lg/1、5g/l蔗糖、2mMMgCl2、pH7)的液體培養(yǎng)基中，于30。C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)后，通過于4。C離心分離培養(yǎng)溶液獲得了細(xì)菌的沉淀。用水冷的10mMTris-HclpH7.5懸浮細(xì)菌的沉淀物，通過離心分離獲得沉淀。將沉淀物懸浮于0.5ml的YEB培養(yǎng)基中。在0.2ml該菌懸浮液中分別添加上述3種外源基因?qū)胗弥亟M載體的溶解液(5iug),充分混合。將其立即冷凍、于37i:融解、再次冷凍融解，這樣進(jìn)行3次。將該懸浮液添加到16ml的YEB培養(yǎng)基，于30。C振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。將該培養(yǎng)液涂布于通過在L培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌用蛋白胨、5g/l細(xì)菌用酵母提取物、5g/lNaCl、15g/l細(xì)菌用瓊脂、pH7.5)添加100mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素所構(gòu)成的瓊脂培養(yǎng)基上，于30。C培養(yǎng)36小時(shí)，獲得了生長出的菌落作為導(dǎo)入了重組載體的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。<稻愈傷組織的制備>從稻(品種日本晴)的完熟種子中脫除稻殼。通過將獲得的帶著外皮的種子浸漬于70%乙醇溶液中60秒，接著，浸漬于有效氯為約4%的次氯酸鈉溶液6分鐘，對種子進(jìn)行滅菌處理，再用無菌水清洗種子。將上述經(jīng)滅菌的稻種子置于在N6培養(yǎng)基的無機(jī)鹽組成中添加30g/l的蔗糖、2mg/l的2，4-D、lg/l的酪蛋白氨基酸和2g/l的固化劑，和N6維生素構(gòu)成的2N6固體培養(yǎng)基(Urushibara等人.，BreedingScience(孵育科學(xué))51:33-38(2001))中。通過28。C溫育3周形成愈傷組織。從胚乳部分切出這些愈傷組織，將該愈傷組織移植到與上述相同組分的培養(yǎng)基中，進(jìn)行7天的培養(yǎng)。<稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化>將如上所述獲得的基因?qū)胗玫霓D(zhuǎn)化農(nóng)桿菌懸浮于30ml液體培養(yǎng)基中獲得菌液，所述液體培養(yǎng)基通過在AA培養(yǎng)基的組成(Hiei等人.，PlantJournal(植物雜志)6:271-282(1994))中添加20g/l的蔗糖、2mg/1的2,4-D、0.2mg/l的激動(dòng)素和10mg/l的乙酰丁香酮而形成。將該懸浮液裝入9cm的皿中，裝入100個(gè)由上述獲得的稻的愈傷組織后，使之浸漬5分鐘。浸漬后，用紙巾除去多余的菌液后，將上述浸漬的愈傷組織以平均每皿20個(gè)轉(zhuǎn)移到2N6CO固體培養(yǎng)基中，所述2N6CO固體培養(yǎng)基通過在N6培養(yǎng)基的無機(jī)鹽組成中添加30g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、2mg/12,4-D、lg/l酪蛋白氨基酸、2g/l固化劑和10mg/l乙酰丁香酮構(gòu)成。于24°C,在黑暗中培養(yǎng)3天，進(jìn)行農(nóng)桿菌向稻的愈傷組織的感染。<愈傷組織的選擇〉用添加500mg/l羧節(jié)青霉素所構(gòu)成的無菌水清洗導(dǎo)入了重組載體的轉(zhuǎn)化愈傷組織，除去農(nóng)桿菌細(xì)菌。從愈傷組織除去多余的水分后，將愈傷組織以平均每皿20個(gè)移植到2N6SE固體培養(yǎng)基中，所述2N6SE固體培養(yǎng)基通過在N6培養(yǎng)基的無機(jī)鹽組成中添加30g/l蔗糖、2mg/12，4-D、500mg/l羧千青霉素、30mg/l潮霉素、lg/l酪蛋白氨基酸、2mg/1固化劑構(gòu)成。于28。C,在黑暗下培養(yǎng)3周，獲得了潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化愈傷組織。再將增殖愈傷組織移植到相同組成的個(gè)體培養(yǎng)基上，于28。C進(jìn)行3周潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化愈傷組織的培養(yǎng)。3周后，從擴(kuò)增的愈傷組織的一部分中提取DNA,通過^f吏用下述中所述的正義引物和反義引物的PCR,鑒定轉(zhuǎn)化愈傷組織。正義引物5'-GGATGGCACCCGCAGCAGATCG-3'(序列號45)反義引物5'-GTACTCATCACTTGTCATGGTTG國3'(序列號46)增，確認(rèn)轉(zhuǎn)化體中的0ASA2變異基因。原來所含的基因組上的OASA2基因中含有內(nèi)含子序列，轉(zhuǎn)化基因中不含內(nèi)含子，因此402個(gè)堿基對的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物只來源于轉(zhuǎn)化用基因。PCR反應(yīng)液的組成為1xPyrobestbufferII(TaKaRa^>司)、0.2mMdNTP、0.5M正義引物(序列號45)和反義引物(序列號46)、0.025單位/ji1PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa公司)、10ng模板DNA(愈傷組織DNA)，使用PC版應(yīng)裝置(寶酒造公司制、TaKaRaPCRThermalCyclerMPTP3000型)，于95。C保持2分鐘后，重復(fù)進(jìn)行25個(gè)98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反應(yīng)的循環(huán)，保持在72。CIO分鐘后，冷卻至4。C。再按照參考文獻(xiàn)(Tozawa等人.，PlantPhysiologyl(植物生理學(xué))26:1493-1506(2001))中記載的方法從轉(zhuǎn)化愈傷組織中提取RNA，同文獻(xiàn)(Tozawa等人.，PlantPhysiology(植物生理學(xué))126:1493-1506(2001))中記載的使用的地高辛標(biāo)識的OASA2的RNA探針的方法進(jìn)行RNA印異型基因((Y367A)或(Y367A/L530D))在選擇出的愈傷組織中作為RNA表達(dá)。<轉(zhuǎn)化愈傷組織的游離色氨酸含量解析-1〉對于表達(dá)變異型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D)或野生型(Wt)OASA2基因的稻愈傷組織這兩個(gè)系統(tǒng)，在液氮中粉碎100mg各稻愈傷組織。將粉碎物轉(zhuǎn)移到容積為1.5ml的管中，然后加入500nl的氯仿:甲醇:水混合液(5:12:3的容積比)，充分混合后、以5,000xrpm的離心加速度離心分離10分鐘。將獲得的上清轉(zhuǎn)移到新的管中，添加375jul的蒸留水和250iul的氯仿，強(qiáng)烈混合后、以5,000xrpm的離心加速度離心分離10分鐘。將這樣獲得的水層轉(zhuǎn)移到新的管中，減壓下使其千燥后、溶解于2ml的10mMNaOH中，作為色氨酸提取液。將其提供給高效液相色譜(HPLC)裝置(Waters公司制、WatersAllianceHPLCFLDSystem2695),測定游離色氨酸含量。該HPLC中使用的柱為XterraRP18column(4.6x150mM)(Waters公司制)，在乙腈-0.1M11304水溶液(pH4.0)的濃度梯度下使用洗脫劑，乙腈濃度為5%~45%,流量為lml/分，在激發(fā)波長278nm處進(jìn)行螢光波長348nm的測定，評價(jià)色氨酸含量。作為對照，使用未經(jīng)轉(zhuǎn)化的通常的稻(品種日本晴)的愈傷組織。獲得的測定結(jié)果示于表3中。如表3清楚所示，確認(rèn)了表達(dá)對色氨酸反饋抑制具有抗性的變異型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D)的稻愈傷組織中所生成的游離色氨酸含量比對照的稻愈傷組織積累了更高的濃度(野生型的5.538.8倍)。表3測定的稻愈傷組織游離色氨酸含量(nmol/g濕重)相對量(倍數(shù))對照稻愈傷組織(日本晴)32±51pUB-OASA2(wt)-Hm導(dǎo)入愈傷組織W227±1123pUB-OASA2(wt)-Hm導(dǎo)入愈傷組織W2820±5134pUB-OASA2(Y367A)-Hm導(dǎo)入愈傷組織Yl176±12308pUB-OASA2(Y367A/L530D)-Hm導(dǎo)入愈傷組織Y29532±225387<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><轉(zhuǎn)化愈傷組織的游離色氨酸含量解析-2〉對于表達(dá)變異型OASA2基因(S126F/L530D)的稻愈傷組織6系統(tǒng)，按與上述<轉(zhuǎn)化愈傷組織的游離色氨酸含量解析-1>相同的方法評l介游離色氨酸的含量。作為對照，使用未經(jīng)轉(zhuǎn)化的通常的稻(品種日本晴)的愈傷組織。獲得的測定結(jié)果示于表4。如表4清楚所示，確認(rèn)了表達(dá)對色氨酸反饋抑制具有抗性的變異型OASA2基因(S126F/L530D)的稻愈傷組織中所生成的游離色氨酸含量比對照的稻愈傷組織積累了更高的濃度(野生型的123-467倍)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>pUB-OASA2(S126F/L530D)-Hm導(dǎo)入愈傷組織SL273927403pUB-OASA2(S126F/L530D)-Hm導(dǎo)入愈傷組織SL324558467并且，用于實(shí)施發(fā)明的最佳方式的項(xiàng)目中形成的具體的實(shí)施方式或?qū)嵤├瑥氐浊宄吮景l(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，其不應(yīng)當(dāng)是只限定于這種具體例子進(jìn)行的狹義解釋，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以進(jìn)行各種改變來實(shí)施。工業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明，可以制備高色氨酸累積植物。因此，本發(fā)明可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，而且由于高色氨酸累積植物適于家畜的飼料和食品原料，本發(fā)明也可以應(yīng)用于畜產(chǎn)和食品產(chǎn)業(yè)中。權(quán)利要求1.一種多肽，其特征在于，所述多肽在序列號1中所示的氨基酸序列的第126位、第367位或第369位中的至少一個(gè)位置上具有變異，且對色氨酸生物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的多肽，所述多R^序列號1中所示的^J^序列的第351位、第522位或第53(M立的至少一個(gè)位置上具有變異，其特征在于，所述多肽具有野生型稻鄰^J^苯甲酸合成酶至少0.7倍以上的酶活性。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述多^所述序列號1中所示的M酸序列的第12W立的變異為將絲氨酸取代為苯丙氨酸的變異，在所述序列號l中所示的M酸序列的第367位的變異為將酪氨酸取代為丙氨酸或異亮氨酸的變異，在所述序列號l中所示的M酸序列的第369位的變異為將丙氨酸取代為亮氨酸的變異。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多錄所述序列號1中所示的M酸序列的第351位的變異為將天冬SW^取代為天冬氨酸的變異，在所i^列號l中所示的^JJ臾序列的第522位的變異為將甘氨酸取代為酪氨酸的變異，在所述序列號l中所示的^tJJ菱序列的第530位的變異為將亮氨酸取代為丙氨酸或天4^氨酸的變異。5.根據(jù)權(quán)利要求l至4中^f—項(xiàng)所述的多肽，其特;fi^于，所述多肽為序列號2至7和序列號29至32中的任一項(xiàng)所示的^JJ臾序列構(gòu)成的多肽，或序列號2至7和序列號29至32中任一項(xiàng)所示的tt酸序列中缺失、取^^添加了l個(gè)或多個(gè)M酸的tt酸序列構(gòu)成的多肽。6.—種多肽，所述多l(xiāng)i^鄰^J^甲酸合成酶的色氨酸結(jié)合區(qū)i絲變異，其特征在于，所述多l(xiāng)i^序列號26中所示的^J^序列的第5位有變異，并JL^"色氨妙物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其特征在于，所述多肽在所述序列號26中所示的M酸序列的第5位的變異為將酪氨酸取代為丙氨酸或異亮氨酸的變異。8.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多核苷酸，其特4^于，所述多核苷,序列號9至14和序列號33至36任一項(xiàng)所示的磁基序列構(gòu)成的多核苷酸，或與序列號9至14和序列號33至36任一所示的堿基序列構(gòu)成的多核普酸相互補(bǔ)的減基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸。10.才艮據(jù)4又利要求8或9所述的多核苷酸構(gòu)成的轉(zhuǎn)^f^^4^^用標(biāo)記基因。11.含有根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的多核苷酸的重^L4ii^體。12.導(dǎo)入了根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求11所述的重纟錄錄體，并JL4i^于色氨齡物合成途徑中色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制具有抗性的多肽的轉(zhuǎn)>[脈。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化體，其特44于，所述轉(zhuǎn)化體是植物細(xì)胞或植物體。14.從根據(jù)權(quán)利要求13所述的植物體獲得的種子。15.—種轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇方法，其特征在于，所述方法由以下步^f勾成通過在細(xì)胞中導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求10所述的標(biāo)記基因或根據(jù)權(quán)利要求l1所述的重纟錄達(dá)載體，賦予細(xì)月^f抑制細(xì)月^曽殖的色氨酸類似^^4勿的抗性，并JLi4擇表i^于該色氨酸類似^^4勿的抗性的細(xì)胞。16.—種轉(zhuǎn)化試劑盒，其特4iE^于，所述試劑盒至少含有根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的多核苷酸、或根據(jù)權(quán)利要求l1所述的重^L^達(dá)載體中的任意一種。17.—種篩選方法，所述方法為篩選只與根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)中所述的多^野生型稻鄰M苯曱酸合成酶中的任意一個(gè)結(jié)合的物質(zhì)的方法，其特;f球于，所述方法包括篩選與根據(jù)權(quán)利要求1至5中^-項(xiàng)所述的多月;U吉合的物質(zhì)的步驟，篩選與野生型稻鄰M笨甲酸合成酶結(jié)合的物質(zhì)的步驟，和比較上述兩步驟的結(jié)果的步驟。18.—種用于實(shí)翻艮據(jù)權(quán)利要求17所述的篩選方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少含有根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的多月沐野生型稻鄰氨絲曱酸合成酶。全文摘要通過在稻鄰氨基苯甲酸合成酶基因OASA2的堿基序列中導(dǎo)入變異，以在特定的多個(gè)氨基酸中發(fā)生取代而產(chǎn)生稻鄰氨基苯甲酸合成酶。所述酶獲得對色氨酸產(chǎn)生的反饋抑制的抗性，并且維持與野生型稻鄰氨基苯甲酸合成酶相同或以上的酶活性。文檔編號C12Q1/02GK101128584SQ20058004870公開日2008年2月20日申請日期2005年10月11日優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日發(fā)明者戶澤讓,若狹曉,菅野拓也申請人:國立大學(xué)法人愛媛大學(xué);獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu);獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)和食物綜合產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究機(jī)構(gòu)