專利名稱：Pan-HER拮抗劑及其使用方法
Pan-HER拮抗劑及其使用方法
相關(guān)申請
本申請要求申請日為2005年1月11日的美國臨時(shí)申請 NO.60643089的4又利，上述申^青的全部教導(dǎo)在此通過引"i正全 部并入本文。
背景技術(shù)：
表皮生長因子(EGF)是一種含有53個氨基酸的細(xì)胞生 長因子，通過蛋白水解作用從一個大的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)前體中 裂解開來。表皮生長因子在哺乳動物細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)方面起 著非常重要的作用。人類表皮生長因子的氨基酸和核酸序列 />開在例如Hollenberg編寫的《表皮生長因子-尿抑霉素， 一種形成;敫素狀態(tài)的多肽》，Academic Press, Inc., 紐約 (1979 ) , 69-110 頁；或者參見 Urdea 等人在 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.807461 ( 1983 )中的文章。表皮生 長因子的氨基酸序列也被公開在美國專利NO.5102789以及 美國專利申請NO.10820640中，上述兩篇文獻(xiàn)的全部教導(dǎo) 也在此引入作為參考。
人類表皮受體(HER),包括表皮生長因子受體(EGFR), 是/>知的受體酪氨酸激酶的范例。人類表皮受體同其關(guān)寫關(guān)配 位體或結(jié)構(gòu)相關(guān)的配位體間的相互作用會導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域* 的二聚及活化。這將引發(fā)一個信號級聯(lián)，并導(dǎo)致細(xì)胞分裂。
在許多癌癥中都牽涉到編碼人類表皮受體家族成員的基因 的過表達(dá)，例如在乳腺癌、卵巢癌、腦癌以及頸癌中。已經(jīng) 表明，作用于表皮生長因子受體(人類表皮受體1 )的分子 通過抑制表皮生長因子受體(人類表皮受體1 )的激酶活性
制細(xì)月包的增殖，這類分子已經(jīng)^皮用于抗癌治療當(dāng)中，例如
Iressa ( gefitinib ), —種酪氨酸激酶抑制劑；和ErbituxTM (cetuximab)， 一種對表皮生長因子受體具有特異性的單克 隆抗體。其他分子，包括例如Herceptin的單克隆抗體能作 用于人類表皮受體家族的其他不同成員。近來，已經(jīng)開展進(jìn) 行了幾種單克隆抗體和小分子激酶抑制劑(例如 Panituzumab和Lapatnib )的研制，作為能作用于多種人類 表皮受體的分子的范例。盡管這些治療制劑已經(jīng)在 一 些病例 中顯出成效，但是仍然需要找到能夠針對與人類表皮受體相 關(guān)的癌癥的新式療法，特別是需要找到能夠作用于整個人類 表皮受體家族的治療制劑組合物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了新的Pan-HER拮抗劑。"Pan-HER拮抗 劑，，意味著能夠抑制、消除多種由人類表皮受體介導(dǎo)的生物 活性的任何分子，或者能夠?qū)е露喾N由人類表皮受體介導(dǎo)的 生物活性的終止的任何分子，例如通過減少、千擾、阻遏或 其他能夠阻止天然的或激活的人類表皮受體配位體與人類 表皮受體相結(jié)合和相互作用的方式，這類分子優(yōu)選是人類表 皮受體1、人類表皮受體2、人類表皮受體3和/或人類表皮 受體4以及這些受體的變體形式。對人類表皮受體1、人類 表皮受體3和人類表皮受體4的直接干擾能夠達(dá)到間接干擾 人類表皮受體2的作用，這是通過消除保持活性必需的二聚
配偶子來實(shí)現(xiàn)的。這些Pan-HER拮抗劑是人類表皮受體的 配位體多肽變體。本發(fā)明優(yōu)選的Pan-HER拮抗劑是那些能 夠阻遏或者打斷全部人類表皮受體家族成員的至少一種生 物活性的非天然產(chǎn)生的多月太分子，例3p，它們廣；乏的減少或 者抑制人類表皮受體激酶活性，信號反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)制，二聚 反應(yīng)，或者抑制全部的人類表皮受體調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖。本發(fā) 明優(yōu)選的配位體變體是那些能夠選才奪性的抑制至少 一 種由 人類表皮受體介導(dǎo)的生物活性的變體。這類人類表皮受體配 位體多肽變體以及編碼這類多肽變體的核酸可以#皮臨床應(yīng) 用于需要抑制人類表皮受體生物活性的治療中，例如癌癥。 這里所說的術(shù)語"多肽"是指通常意義的多肽，指天然蛋白， 相關(guān)多肽序列的^^片、同系物或者類似物。
在一個方面，本發(fā)明描述了 一種卩汙生于天然形成的人類 表皮受體配位體的人類表皮受體配位體變體，相應(yīng)于野生型 表皮生長因子的Gly39 ^f立置，所述配位體變體在位置39處 的甘氨酸上(G39或Gly39)具有至少 一個氨基酸耳又代基， 具有至少一個來自于另一個不同的人類表皮受體配位體的 區(qū)域("取代區(qū)域")，并且具有至少一種廣泛拮抗人類表皮 受體的活性。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選甘氨酸在相應(yīng) 于野生型表皮生長因子Gly39處的位置上^皮亮氨酸耳又^
末端區(qū)域。
本發(fā)明還描述了一種用于處理病人體內(nèi)由人類表皮受 體過表達(dá)導(dǎo)致的狀況的方法，包4舌向病人施以能起到有歲文治 療作用的量(治療有效量)的藥物組合物，所述藥物組合物 包含至少一種本發(fā)明所述的人類表皮受體多肽變體。
附圖的簡要說明
附
圖1表示的是表皮生長因子、HRGP1與BiR的序列對比。
附圖2的圖表描癥會出A431細(xì)月包中的表皮生長因子受體 的自動磷酸化作用，使用表皮生長因子受體、表皮生長因子 和BiRegulin的兩個拮抗性配位體刺激上皮腫瘤細(xì)月包系。 <吏 用V35E和G39L取代的BiRegulin不會刺激產(chǎn)生自動磷酸 化作用。
附圖3和附圖4的圖表分別描繪了人類表皮受體5細(xì)胞 (過表達(dá)人類表皮生長因子受體的小鼠成纖維細(xì)胞)和 MCF-7細(xì)胞(表達(dá)人類表皮受體2和人類表皮受體3的人 類乳腺癌細(xì)胞系)的刺激反應(yīng)。人類表皮受體5細(xì)胞能夠被 表皮生長因子及BiR所刺-敫，不會^皮HRG所刺^t。 MCF-7 細(xì)胞能夠纟皮BiR及HRG所刺激，不會纟皮表皮生長因子所刺 激。沒有細(xì)胞系會^皮BiRV35EG39L所刺激。
附圖5A到5D的圖表描述了在本發(fā)明所述的人類表皮受 體配位體多肽變體的存在下的細(xì)胞增殖試-瞼。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明描述了 一種新的廣泛作用于人類表皮受體的拮 抗劑。這種廣泛作用于人類表皮受體拮抗劑是人類表皮受體 的配位體多肽變體。人類表皮受體配位體的例子包括哺乳動 物表皮生長因子(例如人類(表皮生長因子)，豬，貓，狗， 鼠類，馬以及兔)。其他的人類表皮受體的例子包括轉(zhuǎn)化生 長因子-a(TGFa), p細(xì)胞調(diào)節(jié)素，肝素結(jié)合性表皮生長因
子樣生長因子(HB-EGF),神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，heregulin( HRG ), 兩性調(diào)節(jié)蛋白(AR)以及上皮調(diào)節(jié)蛋白，其中HRG包括 HRGa、 HRG|31、 HRG|32和HRG因子(NDF )。本發(fā)明l尤選 的人類表皮受體配位體變體是基于能夠選擇性的抑制由人 類表皮受體介導(dǎo)的生物活性的人類表皮受體配位體變體。
本發(fā)明是以本發(fā)明人過去的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)
使用其他氨基酸優(yōu)選亮氨酸(指這里所說的"EGFG39L，，)
耳又代表皮生長因子39位置上的甘氨酸，經(jīng)過這樣的》務(wù)飾會
使表皮生長因子變成一個表皮生長因子受體(人類表皮受體
1 )拮抗齊'J (參見Attorney Docket NO.35301002US2、題名
為"表皮生長因子受體拮抗劑及其使用方法"、申請日為
2005年6月30曰的美國有歲文申i貪，該申i青的內(nèi)容在it匕引入
作為參考)。現(xiàn)在，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將其他人類表皮受
體家族成員配位體的區(qū)域"交換"到表皮生長因子G39L中，
生成的新的人類表皮受體配位體嵌合分子不但能夠保持表
皮生長因子G39L的拮抗活性，而且進(jìn)一步提供了更廣泛的
適應(yīng)性，這是因?yàn)橥瑯拥娜祟惐砥な荏w配位體變體還可以作
用于額外添加的人類表皮受體分子以產(chǎn)生抑制作用。非常希
望得到能夠特異于人類表皮受體1、人類表皮受體3和人類
表皮受體4的一種人類表皮受體配位體變體，它能夠?yàn)槎喾N
癌癥提供強(qiáng)有力的治療，在這些癌癥中都包含了不希望的、
由一個或者多個人類表皮受體家族成員產(chǎn)生的由人類表皮 受體介導(dǎo)的生物活性。
考慮到受體和人類表皮受體配位體之間顯著的結(jié)構(gòu)相 似性，可以相4言，G39殘基、或者在其^也人類表皮受體配位 體中與G39殘基相對應(yīng)的氨基酸在整個人類表皮受體配位體家族中起著相同的作用，因此，可以確信，任何具有G39L
取代的人類表皮受體配位體或其等價(jià)物都可以作為制備本 發(fā)明所述的人類表皮受體配位體多肽變體(例如，嵌合體) 的起始物。
在一個方面，本發(fā)明描述了 一種書f生于天然形成的人類 表皮受體配位體的人類表皮受體配位體多肽變體，相應(yīng)于野
生型表皮生長因子Gly39,所述配位體多肽變體在位置39 處的甘氨酸上(G39或Gly39 )具有至少一個氨基酸取代基， 具有至少一個來自于另一個不同的人類表皮受體配位體的 區(qū)域(":取代區(qū)域")，并且具有至少一種廣泛拮抗人類表皮 受體的活性。在這個實(shí)施方式中，配位體被定義為在區(qū)域III 的結(jié)合斷裂，卻在區(qū)域I與其受體相結(jié)合。在一個優(yōu)選的實(shí) 施方式中，優(yōu)選在相應(yīng)于野生型表皮生長因子的Gly39位置 處的甘氨酸被亮氨酸(G39L)所取代，且取代的區(qū)域是表 皮生長因子的氨基末端區(qū)域。這里使用的短語"相應(yīng)于野生 型人類表皮生長因子的氨基酸G39的位置處的氨基酸"是 指，當(dāng)把來自于不同種類哺乳動物的未經(jīng)修飾的人類表皮受 體配位體與人類野生型表皮生長因子一一對應(yīng)以進(jìn)4亍最佳 的比較時(shí)，在與人類野生型表皮生長因子的G39位置相對 應(yīng)的位置上或位置旁的甘氨酸是對應(yīng)好的(參見Attorney Docket NO.35301002US2、題名為"表皮生長因子受體拮抗 劑及其4吏用方法"、申請日為2005年6月30日的美國有效 申i青，該申i青通過引i正在此并入本文)。
在另一個方面，本發(fā)明描述了一種合成的人類表皮受體 配位體多肽變體，例如被稱為BiRegulin(附圖1)的合成 的heregulin/表皮生長因子嵌合體，它在與野生型表皮生長 因子Gly39位置相對應(yīng)的位置39處的甘氨酸具有至少一個 氨基酸:f又代。BiRegulin ( BiR )是一種嵌合的表皮生長因子
同系物，其中表皮生長因子的氨基末端殘基(NSDSE) #皮 HRG(3 1的相應(yīng)殘基(SHLVK)所取代。
在另一個方面，本發(fā)明描述了一種合成的配位體多肽變
體，其中區(qū)域i或區(qū)域ni中的一個的結(jié)合^皮斷裂開來，但^呆 留了或增加了與區(qū)i或i或區(qū)i或m中另外一個的結(jié)合。這些變 體可以通過i奮飾在區(qū)i或i和/或區(qū)jt或ni中的其他氨基酸來制
備(例如，R41D)，正如這里所列舉的那些變體一才羊。這些
變體可以容易的^皮^修飾或者^皮加工，來改變其天然的受體特 異性(或者擴(kuò)展了其特異性，例如所述變體結(jié)合了額外添加 的受體或者能夠特異的作用于特異性受體)。這可以通過前 面所述的額外突變或者區(qū)i或交才奐方法中的4壬意 一 個來完成。
這里所說的"由人類表皮受體介導(dǎo)的生物活性"是指人 類表皮受體內(nèi)在固有的蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶活性，以及能夠
最終導(dǎo)致DNA合成和細(xì)胞增殖的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。
這里所說的"廣泛的作用于人類表皮受體的拮抗劑"是 指能夠抑制、消除多種由人類表皮受體介導(dǎo)的生物活性的、 或能夠?qū)е露喾N由人類表皮受體介導(dǎo)的生物活性的終止的 任^f可分子，例如通過減少、千護(hù)G、阻遏或其他能夠阻止天然 的或激活的人類表皮受體配位體與一種或多種人類表皮受 體亞型相結(jié)合和相互作用的方式。術(shù)i吾"拮^t劑"用在這里 只是一種功能性的表述，并非有意將本發(fā)明限制在一類具有 特殊反應(yīng)才幾制的化合物的范圍內(nèi)。例如，術(shù)語"拮抗劑"可 以包括，但并非局限于，具有竟?fàn)幮赞卓棺饔玫姆肿?。該?爭性拮抗劑與人類表皮受體結(jié)合，但并不會觸發(fā)人類表皮受 體的生物活性。
本發(fā)明所述的配位體多肽變體(包括"人類表皮受體" 配位體"嵌合體")具有i午多有效的性質(zhì)。例如，本發(fā)明所 述的多肽變體能夠-波用來治療某些疾病，這些疾病在病變過 程中都涉及到人類表皮受體的過表達(dá)(例如，癌癥)。
依照本發(fā)明所述，G39可以;陂任何適合的氨基酸所取代， 而經(jīng)過:f又代的人類表皮受體配位體多肽仍然具有完整的廣 泛拮抗人類表皮受體的活性。例如，G39可以被谷氨酸鹽耳又 代(G39E)、被谷酰胺取代(G39Q)、被賴氨酸取代(G39K )、 被天冬氨酸取代(G39D)、被異亮氨酸取代(G391)、或者 被亮氨酸取代(G39L)。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，G39 被苯丙氨酸取代(G39F)、被亮氨酸取代(G39L)、被天冬 氨酸取代(G39D)、或者被異亮氨酸取代(G39I )。優(yōu)選被 亮氨酸耳又代(G39L )。
除G39位置發(fā)生了氨基酸修飾之外，本發(fā)明所述的人類 表皮受體多肽變體還包含一種取代區(qū)域，它來自于另外一種 不同的人類表皮受體配位體。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所 述的取代區(qū)域是整個的或者一部分的SHLVK殘基，取自 HRG卩-1并且用以耳又代表皮生長因子的相應(yīng)殘基，優(yōu)選選耳又 氨基酸NSDSE的某一部分，使得表皮生長因子的1-5的氨 基終點(diǎn)對應(yīng)于該氨基酸NSDSE。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施 方式中，所述人類表皮受體的多肽變體是BiRegulin( BiR)， 在相應(yīng)于野生型表皮生長因子的39位置處，所述多肽變體 在該位置處的甘氨酸具有至少一個氨基酸耳又代基，且其中相 對應(yīng)于野生型表皮生長因子Gly39或G39的位置39處的甘 氨酸已經(jīng)被亮氨酸(BiRG39L )或其他合適的氨基酸所取代。 在另 一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，BiRG39L進(jìn)一步在氨基酸位 置35處被取代，在該位置處的纈氨酸^皮谷酰胺取代
(BiRV35EG39L )。本發(fā)明所述這些人類表皮受體多肽變體 還具有至少一種廣泛作用于人類表皮受體的拮抗活性，并且 優(yōu)選能夠拮抗每一種人類表皮受體亞型——人類表皮受體 1、人類表皮受體3和人類表皮受體4。
本4貞域已經(jīng)知曉，能夠結(jié)合人類表皮受體的配〗立體可以 被分為三類1 )與人類表皮受體1單獨(dú)結(jié)合的配位體(表 皮生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子a ,兩性調(diào)節(jié)蛋白)，2)與人類 表皮受體3和/或人類表皮受體4結(jié)合的配位體(heregulins 和神經(jīng)調(diào)節(jié)因子)和3)與人類表皮受體1和人類表皮受體 4結(jié)合的配位體(P細(xì)胞調(diào)節(jié)素，肝素結(jié)合性表皮生長因子， 神經(jīng)調(diào)節(jié)因子3,上皮調(diào)節(jié)蛋白)(參見Riese和Stern于 1998年在《生物文章》20: 41上發(fā)表的文章)。每種人類表 皮受體的受體都以 一種處于未激活狀態(tài)的單體形式存在。配 位體的結(jié)合促進(jìn)了結(jié)合受體與其他人類表皮受體家族成員 之間的均二聚作用或者雜二聚作用。不同的表皮生長因子樣
的生長因子高親和性的與除人類表皮受體2之外的每個表 皮生長因子受體相結(jié)合，其中人類表皮受體2沒有已知的配 位體，并且具有能形成均二聚體和雜二聚體的組成能力。均 二聚體通常并不是出現(xiàn)在腫瘤細(xì)月包的生長過考呈中，-f旦其對于
心肌的生長和修復(fù)是具有重要作用的(參見Dougall等人于 1994年在《致癌基因》9: 2109上發(fā)表的文章；Hynes和 Stern于1994年在《Biochims Biophys Acta》1198: 165上 發(fā)表的文章；Tzahar和 Yarden于 1998年在《Biochims Biophys Acta》1377: M25上發(fā)表的文章；以及Negro等人 于2004年在《近期激素研究進(jìn)展》59: 1上發(fā)表的文章)。 人類表皮受體2是優(yōu)選的與其他人類表皮受體進(jìn)行雜二聚 反應(yīng)的配偶子(參見Tzahar等人于1996年在《生物細(xì)胞分 子》16: 5276上發(fā)表的文章；Beerli等人于1995年在《生
物細(xì)月包分子》15: 6469上發(fā)表的文章；Karunagaran等人于 1996年在《EMBO J》15: 254上發(fā)表的文章；以及Wang 等人于1998年在《PNAS》95: 6809上發(fā)表的文章)。人類 表皮受體2與其他人類表皮受體家族成員的不同之處在于 它具有一種缺陷型酪氨酸激酶區(qū)i或(參見Guy等人于1994 年在《PNAS》91: 8132上發(fā)表的文章)，必須與另外一種 人類表皮受體家族的受體相結(jié)合才能觸發(fā)信號反應(yīng)。
本發(fā)明所述的人類表皮受體多肽變體例如BiRG39L或 者BiRV35EG39L的優(yōu)點(diǎn)在于它們能夠特異性的作用于多 種人類表皮受體目標(biāo)，例如人類表皮受體l,人類表皮受體 3和人類表皮受體4,并且能夠?qū)γ恳环N人類表皮受體亞型 產(chǎn)生拮抗作用。本發(fā)明所述的變體不需要直^妻作用于人類表 皮受體2,因?yàn)樗ㄟ^對人類表皮受體1、人類表皮受體3 和人類表皮受體4的作用，能夠有效阻止它們與人類表皮受 體2發(fā)生雜二聚作用，^人而阻遏了人類表皮受體2的不希望 具有的生物活性。這種方法有利于避免對人類表皮受體2 均二聚作用的阻遏，因?yàn)橐呀?jīng)表明，阻遏人類表皮受體2 的均二聚作用將導(dǎo)致心月幾癥，是一種威脅生命的副作用。
也可以設(shè)想另外一種"區(qū)域交換"的方法，這種方法也 包含在本發(fā)明之中。例如，相對應(yīng)于成熟的表皮生長因子的 氨基酸位置21-30處的表皮生長因子B環(huán)可以被另 一種不同 的人類表皮受體配位體的相應(yīng)B環(huán)區(qū)域所耳又代，優(yōu)選人類 的人類表皮受體配位體，例如人類轉(zhuǎn)化生長因子-a ( TGF a )， p細(xì)胞調(diào)節(jié)素，肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子 (HB-EGF),神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，heregulin ( HRG)，兩性調(diào)節(jié)蛋 白(AR)和上皮調(diào)節(jié)蛋白?？梢酝ㄟ^導(dǎo)入相應(yīng)的B環(huán)區(qū)域 來改變拮抗劑對人類表皮受體的特異性。因此，當(dāng)使用表皮
生長因子G39L作為制備本發(fā)明所述人類表皮受體配位體多 肽的起始物時(shí)，需要使用 一個不同的人類表皮受體配位體的 相應(yīng)B環(huán)區(qū)i或來耳又4、表皮生長因子G39L的B環(huán)區(qū)i或，其 中所使用的人類表皮受體配位體是已知的能夠與希望#1拮 抗的特異性人類表皮受體分子產(chǎn)生相互作用的。通過這種方 法獲得的經(jīng)修飾的嵌合體具有被改變了結(jié)合特異性的表皮 生長因子G39L變體所擁有的拮抗活性，這種拮抗活性取決 于交換得到的B環(huán)的來源。
因此，為了制備本發(fā)明所述的具有對人類表皮受體1增 強(qiáng)的作用力的、Pan-HER配位體多肽變體，可以4吏用轉(zhuǎn)化生 長因子-cc或者兩性調(diào)節(jié)蛋白的相應(yīng)B環(huán)區(qū)域來取J戈表皮生 長因子的B環(huán)區(qū)域。為了制備本發(fā)明所述的具有對人類表 皮受體3和/或人類表皮受體4增強(qiáng)的作用力的、Pan-HER 配位體多肽變體，可以^吏用神經(jīng)調(diào)節(jié)因子的相應(yīng)B環(huán)區(qū)域^ 來取代表皮生長因子的B環(huán)區(qū)域。為了制備本發(fā)明所述的 具有對人類表皮受體1和人類表皮受體4增強(qiáng)的作用力的、 Pan-HER配位體多肽變體，可以使用(3細(xì)胞調(diào)節(jié)素、肝素結(jié) 合性表皮生長因子樣生長因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)因子3或者上皮調(diào) 節(jié)蛋白的相應(yīng)B環(huán)區(qū)域來耳又代表皮生長因子的B環(huán)區(qū)i或。 由于人類表皮受體2沒有已知的配位體，可以通過消除人類 表皮受體1、人類表皮受體3或人類表皮受體4這些維持活 性所需的二聚^f匕配偶子來達(dá)到間4妄作用于負(fù)調(diào)節(jié)的目的，即 使用本發(fā)明所述的多肽變體來拮抗人類表皮受體1、人類表 皮受體3和人類表皮受體4，進(jìn)而達(dá)到拮抗人類表皮受體2 的目的。B環(huán)交換區(qū)域的拮抗活性的示例表示在附圖5A-5D 中。
此外，人類表皮受體配^f立體多肽變體的同系物、類^f以物 及碎片也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。"同系物"意指來自于 其他種類哺乳動物的人類表皮受體配位體的相應(yīng)多肽，在本 質(zhì)上等同于人類野生型人類表皮受體配位體，只要這類同系 物保留了廣泛作用于人類表皮受體的拮抗活性即可。例如， 來自于不同種類哺乳動物的表皮生長因子多肽同系物序列
ERCQYRDLKWWELR人類(序歹'J 1)
ERCQHRDLKWWELR豬(序歹'J 2 )
ERCQHRDLK-WELR貓(序歹'J 3 )
ERCQHRDLK-WELR狗(序歹'J 4 )
RCQTRDLRWWELR鼠(序歹'J 5 )
GERCQHQDLR馬(序歹'J 6 )
ERCQHRDLRWWKLR兔(序歹'J 7 )
"類似物"意指包括那些發(fā)生了一個或者多個氨基酸改 變的多肽變體，例如氨基酸殘基的取代、添加或者缺失，但 其仍然具備了相關(guān)太的表皮生長因子受體拮抗特性。
除了在表皮生長因的位置G39處發(fā)生的突變，或者在其 4也Pan-HER配4立體相應(yīng)于野生型表皮生長因子氨基酸4立置 39的氨基酸位置處發(fā)生的突變，還可能發(fā)生其#>的突變， 這些突變將在本質(zhì)上完整的j呆留pan-HER配位體多肽變體
那種廣泛作用于人類表皮受體的抑制活性或者拮抗活性。這 些突變體可以是具有單個的氨基酸耳又代、缺失或者插入的形 式，也可以是具有多個氨基酸耳又代、缺失或者插入的形式。 用于取代的氨基酸取代基可以以保守取代或者非保守取代 的形式在多肽的一個或者多個位置上進(jìn)4亍耳又代。這里^f吏用的 術(shù)語"保守的氨基酸取代"是指那些通常存在于序列中的、 與被取代的氨基酸具有相似大小、電荷或者極性的氨基酸:f又 代基。保守取代的例子包括用一個非極性(疏水)殘基例如 異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸來取代另外一個非極性殘基。同 樣的，保守:f又代的例子還包括用 一個極性(親水)殘基來耳又 代另外一個極性殘基，例如在精氨酸和賴氨酸之間發(fā)生的:f又 代，在谷酰胺和天冬酰胺之間發(fā)生的取代，以及在甘氨酸和 絲氨酸之間發(fā)生的取代。此夕卜，石威性殘基之間的耳又代，例如 賴氨酸、精氨酸或組氨酸對其他堿性殘基的取代，或者g吏性 殘基之間的取代，例如天冬氨酸、谷氨酸對其他酸性殘基的 耳又代，這些都屬于保守取代的例子。非保守耳又代的例子包括「 用 一個非極性(疏水)殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 丙氨酸、曱硫氨酸來取代一種極性(親水)殘基例如半胱氨 酸、谷酰胺、谷氨酸或者賴氨酸，和/或使用極性殘基來耳又 代非極性殘基，都屬于非保守取代。
本發(fā)明所述的人類表皮受體配位體多肽變體的治療歲丈 果還可以通過在其他位置處發(fā)生的氨基酸耳又代、缺失和插入
來進(jìn)一步增強(qiáng)，作為選^奪，其他位置可以是G39處。所述 增強(qiáng)的治療效果包括^旦不局限于，增強(qiáng)的親和性，延長的半
衰期，增加的可溶性，以及增加的生物可利用性。在一個4尤
選的實(shí)施方式中，在BiR的位置G18、 V35、 G39和/或R41
處的任意幾個位置之上進(jìn)^f于的氨基酸的耳又^、缺失或插入， 或者在其他人類表皮受體配位體上與野生型表皮生長因子 的<立置G18、 V35、 G39和/或R41才目只于應(yīng)的^f立置之上進(jìn)4亍的 氨基酸的取代、缺失或插入，這些方法都可能用于制備本發(fā) 明所述的人類表皮受體配位體嵌合體。特別優(yōu)選的是制備一 個變體，這個變體在一個結(jié)合區(qū)域(區(qū)域I或區(qū)域III )的結(jié) 合是斷裂的，而在其他區(qū)i或的結(jié)合是增強(qiáng)的(增加親和性)。 本發(fā)明的一個優(yōu)選的人類表皮受體變體是BiRV35EG39L。
可以使用許多方法來設(shè)計(jì)、制備和測試本發(fā)明所述的人 類表皮受體配位體多肽變體。區(qū)域交換，氨基酸的取代、缺 失或插入都可以4吏用本領(lǐng)域已知的方法來完成，例如使用定 點(diǎn)誘變的方法。得到的誘變多肽隨后可以4吏用體外熒光試—瞼 例如本發(fā)明描述的熒光試-驗(yàn)或者其他任4可適合的熒光試-瞼 來測試它的廣泛拮抗人類表皮受體的活性。
這里記載的數(shù)據(jù)以及附圖5A-5D顯示的數(shù)據(jù)表明，以表 皮生長因子為基礎(chǔ)的、在其位置39處有氨基酸耳又代的、并 且具有來自于另外一個不同人類表皮受體配位體的取代區(qū) 域的人類表皮受體配位體多肽變體能夠抑制細(xì)胞的增殖，其 中提供取代區(qū)域的人類表皮受體配位體是例如兩性調(diào)節(jié)蛋 白、(3細(xì)月包調(diào)節(jié)素、上皮調(diào)節(jié)蛋白和轉(zhuǎn)--化生長因子-a 。可 以使用其他任何適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)或其他方法對本發(fā)明中的待測 多肽的抑制性或者廣泛針對人類表皮受體的拮抗活性進(jìn)4亍 進(jìn)一步的評定，并且與野生型人類配位體多肽的人類表皮受 體活性進(jìn)行比較。
如前所述，本發(fā)明的多肽變體和它們的同系物以及類4以 物在本質(zhì)上等同于野生型配位體。這里使用的"本質(zhì)上等同，， 意指與野生型人類配位體的氨基酸序列相比較(當(dāng)所述變體 是由區(qū)域交換而獲得的嵌合體時(shí)，與交換的區(qū)域的氨基酸序
歹'J相比砵交)，具有至少60%的序列同 一'性，^f尤選具有至少70 %的序列同一性，更優(yōu)選具有至少80%的序列同一性，更 更優(yōu)選具有至少90%的序列同一'l"生，并且保持了人類表皮 受體的抑制性或者其他的廣泛針對人類表皮受體的拮抗活 性。在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的多肽變體與野生型 人類酉己^f立體才目比，具有至少91%、至少92%、至少93%、 至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、或者至少 98%的氨基酸同 一'性，并且保持了人類表皮受體的抑制性或 者其他的廣泛針對人類表皮受體的拮抗活性。為了識別兩種 核酸序列或者氨基酸序列的同 一性百分?jǐn)?shù)，可以將兩個序列
--對準(zhǔn)，以達(dá)到最佳比專交的目的(例如，可以在最優(yōu)序列
中導(dǎo)入一些缺口 )。然后把位置相對應(yīng)的氨基酸進(jìn)行比較， 兩個序列間的同 一性百分凄l(xiāng)是一個關(guān)于由兩個序列共有的 等同位置的函數(shù)(例如，同 一性％ =等同的位置/位置總凄丈 x 100 )。可以4吏用已4口的方法來完成對兩個序列的實(shí)際比 較，例如使用數(shù)學(xué)運(yùn)算的方法。這種數(shù)學(xué)運(yùn)算方法的一個優(yōu) 選的、并非限制的例子在Karilin等人于 1993年在 《Proc.Natl.Acad.Sci》(美國)90: 5873-5877上發(fā)表的文章 中有所描述。Schaffer等人于2001年在《核酸研究》29: 2994-3005上發(fā)表的文章中描述了將這樣的算法導(dǎo)入了 BLASTN程序和BLASTX程序(版本2.2 )中。
可以使用幾種技術(shù)來制備本發(fā)明所述的多肽變體。在一 個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的多肽變體通過將編碼該 多肽變體的基因在適合的宿主中表達(dá)的方法來制備。所述的
基因最容易通過前述的野生型人類基因的定點(diǎn)誘變而得到。 然而，本發(fā)明所述的多肽變體全部或者部分通過化學(xué)合成才支 術(shù)來獲得，例如通過梅里菲爾德合成法來獲得。當(dāng)使用非天 然存在的氨基酸對多肽變體進(jìn)行取代的時(shí)候，尤其希望通過
4b學(xué)方法合成全部的或者部分的修飾多肽。
本發(fā)明還提供了能夠編碼本發(fā)明所述人類表皮受體配
位體多肽的核酸分子。本發(fā)明所述的核酸分子可以是RNA, 例如信l吏RNA,或是DNA。所述DNA分子可以是雙《連的 或者單鏈的。所述核酸分子也可以與 一個標(biāo)記序列進(jìn)行融 合，例如， 一種能編碼多肽、有助于多肽的分離和純化的才示 記序列。這類序列包括但不局限于，編碼一種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST )融合蛋白的序列，編碼來自于流感病毒的血 凝素A(HA)多肽標(biāo)記的序列，以及編碼組氨酸標(biāo)記物的序列。
本領(lǐng)域沖支術(shù)人員能夠理解，對表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以依才居 宿主細(xì)月包選擇的被轉(zhuǎn)化形式和所希望的多肽的表達(dá)水平這 類因素來決定。本發(fā)明使用的表達(dá)載體可以被導(dǎo)入到宿主細(xì) 胞中，從而制備本發(fā)明所述的經(jīng)過修飾的多肽，包括由前述 核酸分子編碼的融合多肽。用于制備本發(fā)明所述的經(jīng)過》務(wù)飾 的多肽的重組產(chǎn)物的分子生物4支術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且在 例如Sambrook等人于2000年發(fā)表的文章《分子克隆一 項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室手工技術(shù)》(冷泉港實(shí)-驗(yàn)室出版社)第3版中有所 描述。
本發(fā)明同樣涉及到包含這里所述的人類表皮受體配位 體多肽變體的藥物組合物。例如，可以將本發(fā)明所述的多肽 變體與生理可接受載體或者賦形劑配制成藥物組合物。所述
載體及組合物可以是無菌的，其用量配方應(yīng)當(dāng)與纟會藥形式相 適應(yīng)。
適合的藥物可接受載體的例子包括但不局限于水，鹽 溶液(例如氯化鈉)，鹽水，鹽水緩沖液，酒精，甘油，乙 醇，阿^立伯樹月交，植物油，千基乙醇，聚乙二醇，明月交，碳 水化合物例如乳糖，淀粉酶或淀粉，葡萄糖，硬脂酸鎂，滑 石，硅酸，粘性石蠟，芳香油，脂肪酸酯，羥甲基纖維素， 聚乙烯吡咯烷酮等等，以及它們的混合物。此外，可以〗吏用 例如脂質(zhì)體和微乳狀液之類的載體。也可以將本發(fā)明所述的 多肽變體共價(jià)結(jié)合到蛋白載體例如白蛋白之上，或者將所述 多肽變體共i"介結(jié)合到一個多聚物例如聚乙二醇之上，以減少 多肽的早期純化。如果需要，可以將所述藥物制劑與輔助劑 進(jìn)4t'混合，豐乾助劑是例3口潤滑劑，防腐劑，穩(wěn)、定劑，潤濕劑， 乳化劑，影響滲透壓力的鹽類，緩沖劑，著色劑，風(fēng)味劑和 /或芳香物質(zhì)及其類似物這些不會與組合物中的活性成分發(fā) 生有害反應(yīng)的物質(zhì)(例如，本發(fā)明所述的多肽和/或核酸分 子)。
如果需要，上述纟且合物還可以包含少劑量的潤濕劑或H 化劑，或者PH纟爰沖劑。該組合物可以是〉容液形式，懸浮液 形式，乳液形式，片劑形式，丸劑形式，月交嚢形式，緩釋劑 形式，或者4分末形式。該組合物還可以^皮制成纟全劑形式，4吏 用傳統(tǒng)的粘合劑以及載體，例如甘油三酯。口力良形式的配方 可以包4舌標(biāo)準(zhǔn)載體，例如藥用級的甘露津唐醇，乳糖，；定并分， 硬脂酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等等。
所述組合物的給藥方式包括但不局限于透皮給藥，月幾 肉內(nèi)給藥，腹膜內(nèi)給藥，目艮內(nèi)給藥，靜脈內(nèi)給藥，皮下癥會藥， 局部給藥，口服給藥以及鼻內(nèi)給藥。其他適合的給藥方式還
可以包括基因治療(將在下面進(jìn)行描述)，4吏用再充電式裝 置或者生物可降解裝置，例子加速裝置("基因槍，，)以及^爰 慢釋放聚合裝置。本發(fā)明所述組合物還可以作為一部分與其 4也組合物一并纟合藥進(jìn)4亍治療。
本發(fā)明所述的人類表皮受體配位體多肽變體可以采用 常規(guī)程序配制成適合施用于人類的藥物組合物。例如，以請爭 樂JC注射方式纟合藥的組合物可以^皮制成典型的無菌等滲水性
纟爰沖液;容液的形式。如果需要，該組合物還可以含有增;容劑 和局部麻醉劑，以纟爰解注射位點(diǎn)處的疼痛。 一力吏的，這些紐二 分可以4姿照個體用藥劑量分別供^會或者混合在一起供纟合，例 如，可以將制成干的凍干4分末形式或制成無水濃縮液形式的 組分裝在密封的容器中供《會，所述密封的容器例如安瓿并瓦或 者裝液袋這類注明了活性組合物(多肽和/或核酸)的量的
容器。如果該組合物是以4ir液的形式給藥，可以爿夸其溶解于 裝有無菌藥用級水、鹽水或葡萄4唐/水的輸…液并瓦中。如果該 組合物是以注射的形式給藥，可以將其置于裝有注射用無菌 水或鹽水的安培瓶中供給，以便在給藥之前使各組分混合均 勻。
本發(fā)明所述的人類表皮受體配位體多肽變體可以^皮制 成中性形式或是鹽的形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括那些能夠 結(jié)合游離氨基的鹽，例如鹽酸鹽，磷酸鹽，醋酸鹽，草酸鹽， 酒石酸鹽等等，以及那些能夠結(jié)合游離羧基的例如鈉鹽，鉀
鹽，胺鹽，鈣鹽，氳氧化鐵，異丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙 醇，組氨酸，普魯卡因等等。
本發(fā)明所述的人類表皮受體配位體多肽變體以能起到 有效治療作用的劑量(治療有效量)給藥。針對特定疾病或 狀況的治療有效量的劑量耳又決于所述疾病或狀況的性質(zhì)，可
以憑4昔標(biāo)準(zhǔn)的臨床才支術(shù)來測定。此外，可以選4奪性的^f吏用體 內(nèi)試驗(yàn)或者體外試驗(yàn)來幫助確定最優(yōu)劑量范圍。藥方中使用 的精確劑量還取決于給藥的方式，以及疾病或狀況的癥兆的 嚴(yán)重程度，并且應(yīng)該才艮據(jù)4丸業(yè)醫(yī)生的判斷以及每個病人的具 體情況來決定。可以通過體外試-瞼或者動物4莫型試-驗(yàn)體系4尋 到的劑量響應(yīng)曲線來推斷有效劑量。
本發(fā)明同樣涉及到處理由人類表皮受體的過表達(dá)而引 起的狀況的方法(預(yù)防、i貪斷、和/或治療)。"由人類表皮 受體的過表達(dá)而引起的狀況"是指在引入本發(fā)明所述的多肽 變體后能有助于治療的狀況。這類狀況包含許多類型的癌 癥，例如，由人類表皮受體家族成員的過表達(dá)引起的中胚層 腫瘤和外胚層腫瘤。已經(jīng)表明，人類表皮受體在i午多神經(jīng)月交 質(zhì)瘤、扁平細(xì)力包瘤、乳腺瘤、黑素瘤、^f憂入性膀力先瘤和食道 癌中存在過表達(dá)。此外，對原始人類乳中瘤的研究表明了 人類表皮受體基因的高水平表達(dá)與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、高速率的 增殖、以及病人存活時(shí)間的縮短都具有相關(guān)性。人類表皮受 體基因的過表達(dá)同樣存在于其他不同種類的疾病中，例如牛 皮褲和纖維癥。
這里使用的術(shù)語"處理"不僅僅是指改善疾病或狀況的 癥狀，還包括防止或者延緩疾病的發(fā)作，以及減輕所述疾病 或狀況的癥狀的嚴(yán)重程度及發(fā)作頻率。如果需要，可以協(xié)同 使用不止一種的本發(fā)明所述的多肽變體，作為一種協(xié)同治療 處理體系。這里^f吏用的"協(xié)同治療處理體系，，是指將兩種藥 物以單獨(dú)形式或者混合形式同時(shí)全合藥的處理體系，或者將兩 種藥物以間隔數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)或數(shù)天的不同時(shí)間按順序給 藥、 <旦各自藥歲丈同時(shí)作用以達(dá)到所希望的治療響應(yīng)的處理體 系。還可以將本發(fā)明所述的多肽與其他藥物耳關(guān)合^f吏用，以達(dá)
到抑制人類表皮受體受體的各種異?；钚缘哪康?。這類聯(lián)合 使用的藥物包括但不局限于人類表皮受體特異性抗體，小分 子激酶抑制劑，以及傳統(tǒng)化療劑。
本發(fā)明所述的治療組合物以治療有效量的劑量舌會藥(例 如，足以有效處理疾病或狀況的劑量，例如能有效改善疾病 或狀況的癥狀、防止或者延纟爰疾病的發(fā)作、和/或減輕所述 疾病或狀況的癥狀的嚴(yán)重程度及發(fā)作頻率的劑量)。針對特 定個體疾病或狀況的治療有效量的劑量耳又決于所述疾病的 癥狀及嚴(yán)重程度，可以憑^f昔標(biāo)準(zhǔn)的臨床沖支術(shù)來測定。此外， 可以選擇性的^f吏用體內(nèi)試—驗(yàn)或者體外試一驗(yàn)來幫助確定最Y尤 劑量范圍。藥方中^f吏用的精確劑量還取決于給藥的方式，以 及疾病或狀況的嚴(yán)重程度，并且應(yīng)該才艮據(jù)纟丸業(yè)醫(yī)生的判斷以 及每個病人的具體情況來決定?？梢酝ㄟ^體外試-驗(yàn)或者動物 模型試驗(yàn)體系得到的劑量響應(yīng)曲線來推斷有效劑量。
本發(fā)明所述的治療組合物可以單獨(dú) <吏用，也可以以如前 所述的藥物組合物的形式^f吏用。例如，本發(fā)明所述的1^飾多 肽的基因可以以單獨(dú)的形式或者^皮包含于載體之中的形式 導(dǎo)入到細(xì)胞中(體內(nèi)形式或者體外形式)，然后所述細(xì)J包可 以制備所希望的多肽。如果需要，可以將已經(jīng)轉(zhuǎn)染了本發(fā)明 所述的核酸分子的細(xì)胞導(dǎo)入(或者重導(dǎo)入)到侵染了疾病的 個體當(dāng)中。
可以使用其他的基因轉(zhuǎn)移體系，包括病毒性轉(zhuǎn)移體系和 非病毒性轉(zhuǎn)移體系?？蛇x擇的，非病毒基因轉(zhuǎn)移方法例如石粦
酸鈣共同沉淀、初4戒4支術(shù)(例如顯樣i注射)、電穿孔、經(jīng)由 脂質(zhì)體的膜融合介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、或者DNA的直接攝取，這些 方法同樣可以被用于將所希望的核酸分子導(dǎo)入到細(xì)J包中去。
實(shí)施例
實(shí)施例1: 方法和材剩-
克隆和基因表達(dá)?；瘜W(xué)合成人類表皮生長因子(EGF) 基因，并4奪其連結(jié)到Pet-9栽體(Novagen^^司)的Nde I 和BamHI克隆位點(diǎn)上。所述表皮生長因子基因包含OmpA 前導(dǎo)序列，其后是一個N末端6x-《且氨S臾才示i己物禾口一個Xa 分裂位點(diǎn)因子，該因子在需要的情況下能夠進(jìn)行之后的組氨 酸才示i己物的去除。？t應(yīng)于下述氨基&復(fù)序列
......-OmpA---------leader--------------......—his-tag--Xa-----E
GF—........國國.......------------------------------MKKTAIAIAVA
(序歹'J 8 )
這個凈皮指定為pMLPPl的最初的克隆凈皮用來作為制備所 有的廣泛人類表皮受體配位體變體(包括發(fā)生了耳又代、缺失、 插入和區(qū)域交換的變體)的基礎(chǔ)，通過^f吏用快速改變誘變工 具(Stratagene公司)來制備。為了獲得蛋白制品，將表皮 生長因子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌抹BL21 ( DE3 ) pLysS (Novagen公司)中。
配位體變體的制備。將單個的克隆接種到含有培養(yǎng)基的 搖瓶中，所述培養(yǎng)基中含有15ml的LB培養(yǎng)基、25單位的 卡那霉素以及30單位的氯霉素。生長過夜后，取樣品量的 培養(yǎng)物用于繁殖，并用于質(zhì)粒的制備，以確保同才羊的表皮生 長因子基因的插入。其余的培養(yǎng)物用來接種培養(yǎng)在Terrific 肉湯、25單位的卡那霉素以及30單位的氯霉素中的產(chǎn)物。
在早期對數(shù)生長階段使用0.2mM的IPTG使細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)， 并令培養(yǎng)物生長過夜。通過離心方法收集培養(yǎng)基上層清液，
通過斑點(diǎn)印跡對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行確i人，并且4吏用小鼠Western Breeze顯色免疫才企測體系(Invitrogen/〉司生產(chǎn)，編號為cat #WB7103),將初級抗體與小鼠抗6x組氨S臾單克隆抗體 (anti-penta his antibody) (Qiagen公司生產(chǎn),編號為cat # 34660 ) 4姿1: 1000的t匕產(chǎn)4勿進(jìn)4亍鑒定。
表皮生長因子蛋白的純化。將3ml的Ni-NTA樹脂 (Qiagen 乂〉司生產(chǎn)，編號為# 30230 )裝入5ml的層沖斤4主 (Qiagen/>司生產(chǎn)，編號為cat # 34964 )中，i亥層沖斤一主已經(jīng) 使用了 PH8.0的PBS進(jìn)行平4lf。在將培養(yǎng)基上層清液上柱 之前，先使用1
N鹽酸將其PH調(diào)整至7.5-8.0。然后使用PBS和PBS與 10mM的口米唑混和液洗滌該層4斤4主；用PBS與250mM的。末 唑的混和液將表皮生長因子變體蛋白/人層斥斤柱洗脫出來，并 使用Bradford蛋白測試方法來監(jiān)測蛋白濃度。
蛋白濃縮和H沖液交換。在4"C下，在一個纟爰沖液交換: 器中使用 PBS對柱層析洗脫液進(jìn)行透析，然后使用 3000MWCO Macrosep離心裝置(ISC#OD003C41 )對其進(jìn) 行濃縮。使用BCA方法測試最終產(chǎn)物的蛋白濃度，并使用 SDS-聚丙烯酰胺凝月交電泳測試其純度。
實(shí)施例2:細(xì)胞增殖刺j敫試,驗(yàn)
人類表皮受體5細(xì)胞系， 一種經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能夠表達(dá)人 類表皮生長因子受體的鼠類成纖維細(xì)J包系(/人NR-6細(xì)i包系 衍生而來)，由M.C.Hung博士提供(MD Anderson癌癥中
心)。4吏人類表皮受體5的繁殖培養(yǎng)物在D-MEM/F12 i告養(yǎng) 基中進(jìn)行繁殖培養(yǎng)，該培養(yǎng)基包含10%的胎牛血清、100 單位/毫升的盤尼西4木和100纟鼓克/毫升的鏈霉素，繁殖培養(yǎng) 過程在水套孵化器中進(jìn)行，在37°C 、相對濕度5%的二氧化 碳?xì)怏w中進(jìn)行。為了對人類表皮受體5進(jìn)行增殖試驗(yàn)，將細(xì) 胞置入不添加胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)基中；備養(yǎng)24小 時(shí)。然后將細(xì)胞胰酶化并按照105個細(xì)胞/毫升的水平進(jìn)4亍懸 浮。連續(xù)稀釋表皮生長因子(Pepro Tech, Pocky Hill, NJ ), 在不含胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)基中以2倍的最終濃度 培養(yǎng)人類表皮受體配位體多肽變體，并將其置于96孔培養(yǎng)
板中。將50微升細(xì)胞懸浮液(5000個細(xì)胞)力口入到適合的 孔中，使具有所希望的濃度的液體總體積達(dá)到100微升。將 培養(yǎng)^L進(jìn)行一個48小時(shí)增殖周期的孵化。在增殖周期的最 后三小時(shí)里以每孔10微升的量加入WST-1細(xì)胞增殖試劑 (羅氏應(yīng)用科學(xué)公司生產(chǎn)，印第安納波利斯，印第安納州) 以斗全測細(xì)胞的增殖。WST-1是一種通過成活細(xì)胞內(nèi)的線粒體 脫氫酶與甲臜染料相粘附的四唑化鹽。使用裝有MRX相關(guān) 性豸欠件的樣t量培養(yǎng)4反讀H器(Dynex Technologies 7>司)在 450納米下測量所述甲臜的劑量。
MCF-7纟田胞是從美國典型培養(yǎng)中心(ATCC)獲得的。 將MCF-7細(xì)胞的繁殖培養(yǎng)物培養(yǎng)在補(bǔ)充有1%的ITS-X (Invitrogen 司)和10 %的胎牛血清的Eagle， s MEM i咅養(yǎng) 基中。為了對其進(jìn)行增殖試-驗(yàn)，將MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移至沒有 添加胎牛血清的培養(yǎng)基(SFM )中培養(yǎng)24小時(shí)，然后將細(xì) 胞胰酶化并按照105個細(xì)胞/毫升的水平懸浮于SFM中。在 96孔《敬量培養(yǎng)板的每個孔中加入50樣t升細(xì)胞懸浮液(5000 個細(xì)胞)。制備人類表皮受體配位體或者突變蛋白的連續(xù)稀 釋物，其具有兩倍于SFM中濃度的最終濃度，并將50孩i升
這樣的連續(xù)稀釋物加入到孔中，使具有所希望的濃度的液體
總體積達(dá)到100微升。在37°C 、相對濕度5 %的二氧化碳?xì)?體中對所述培養(yǎng)板培養(yǎng)72小時(shí)。在增殖周期的最后三小時(shí) 里以每^L 10孩t升的量加入WST-1細(xì)月包增殖試劑(羅氏應(yīng)用 科學(xué)/>司生產(chǎn)，印第安納波利斯，印第安納州)以凈會測細(xì)月包 的增殖。
參與測試的人類表皮受體配位體多肽變體是其B環(huán)區(qū) 域被來自于兩性調(diào)節(jié)蛋白的相應(yīng)區(qū)域所耳又代的BiRegulin, BiRV35EG39L以及表皮生長因子G39L ( G39L + Amp ds ); 其B環(huán)區(qū)域被來自于|3細(xì)胞調(diào)節(jié)素的相應(yīng)區(qū)域所取代的表 皮生長因子G39L ( G39L+ BTC ds );其B環(huán)區(qū)域j皮來自于 上皮調(diào)節(jié)蛋白的相應(yīng)區(qū)域所取代的表皮生長因子G39L (G39L + Epi ds );以及其B環(huán)區(qū)域被來自于轉(zhuǎn)化生長因子-
oc的相應(yīng)區(qū)；或所取4義的表皮生長因子G39L ( G39L + TGF-
oc ds )。
存在于一種上皮腫瘤細(xì)^^系--A431細(xì)^^包系中的表皮
生長因子受體的自身磷酸化是由兩個針對表皮生長因子受 體的拮抗性配位體刺激發(fā)生的，所述的兩個拮抗體是附圖2 中所示的表皮生長因子和BiRegulin。同時(shí)，附圖3也顯示 出具有V35E和G39L取代基的BiRegulin不會刺激自身磷
酸4b的發(fā)生。
附圖3和附圖4分別表示出人類表皮受體5細(xì)胞(過表 達(dá)人類表皮生長因子受體的小鼠成纖維細(xì)l包)和MCF-7細(xì) 胞(能夠表達(dá)人類表皮受體2和人類表皮受體3的人類乳腺 癌細(xì)胞系)的刺激情況。人類表皮受體5細(xì)胞能夠被表皮生 長因子和BiR所刺激，但不能夠被HRG所刺激。MCF-7細(xì)
胞能夠^皮BiR和HRG所刺激， <旦不能夠凈皮表皮生長因子所 刺激。BiRV35EG39L對兩種細(xì)胞都不產(chǎn)生刺激作用。
如附圖5所示，試驗(yàn)結(jié)果表明，區(qū)域交換保留了表皮生 長因子G39L的拮抗活性，使其仍然能夠抑制細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明所涉及的專利文獻(xiàn)和科技文獻(xiàn)公開了本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠使用的知識。在此引用的全部美國專利文獻(xiàn)、公 開的或者未公開的美國專利申請的全部內(nèi)容在此引入作為 參考。在此引用的所有公開的外國專利文獻(xiàn)以及外國專利申 請的全部內(nèi)容在此引入作為參考。在此引用的其4也所有7〉開 的參考書、文獻(xiàn)、手稿以及^H支文獻(xiàn)的全部內(nèi)容在此引入作 為參考。
盡管本發(fā)明只是對其中的優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行了詳細(xì) 的描述和表示，^E是本領(lǐng)域才支術(shù)人員能夠理解，在不背離本 發(fā)明包含的附加權(quán)利要求的范圍的情況下，各種形式和細(xì)節(jié) 上的改變同才羊包含在本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.一種人類表皮受體(HER)配位體多肽變體，它包括一種人類表皮受體配位體多肽，所述多肽在相對應(yīng)于人類野生型表皮生長因子(EGF)的氨基酸Gly39位置處的氨基酸被另一種氨基酸所取代，且所述人類表皮受體配位體多肽進(jìn)一步包含至少一個取代區(qū)域，且所述變體具有至少一種能廣泛作用于人類表皮受體的拮抗活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述的人類表皮受體 配位體多肽是表皮生長因子。
3. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述的氨基酸:f又代基 選自苯丙氨酸，亮氨酸，天冬氨酸和異亮氨酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述的氨基酸取代基 是亮氨酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述的取〗氣區(qū)域是表 皮生長因子的氨基末端區(qū)域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述的人類表皮受體 配位體多肽是表皮生長因子，并且其取代區(qū)域是相應(yīng)于 氨基酸NSDSE的成熟表皮生長因子的第l-5個氨基酸。
7. 才艮據(jù)4又利要求6所述的變體，其中所述的表皮生長因子 的取代區(qū)域被相應(yīng)于氨基酸SHLVK的HRG卩1同源氨基酸所耳又代。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述的人類表皮受體 配位體多肽是BiRegulin ( BiR )。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的變體，其中所述的氨基酸Gly39 被亮氨酸所取代。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中還包含至少一個額外子Gly39位置處以外的位置上。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的變體，其中所述的額外的氨基 酸耳又^至少有 一 個耳又^在相對應(yīng)于野生型人類表皮生 長因子的G18、 V35、和R41的位置上，或是這些^f立置 的任意組合。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的變體，其中在氨基酸位置V35處 含有額外的氨基酸取代。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的變體，其中在氨基酸位置35處 的纈氨酸被谷氨酸取代。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中包含BiRV35EG39L。
15. 4艮據(jù)^又利要求1所述的變體，其中所述的變體含有至少 一種能針對人類表皮受體1、人類表皮受體3和人類表 皮受體4的拮抗活性。
16. —種藥物組合物，其含有4又利要求15所述的人類表皮 受體配位體多肽變體和一種藥物可接受載體。
17. —種治療病人的方法，該病人患有由人類表皮受體的過 表達(dá)而引起的疾病，包括-給病人施用治療有效量的權(quán)利 要求16所述的藥物組合物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的疾病是癌癥。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的癌癥選自神 經(jīng)月交質(zhì)瘤、扁平細(xì)力包瘤、乳&泉瘤、黑素瘤、4曼入性力旁月先 瘤、直腸瘤和食道癌。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的疾病是牛皮褲。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述的人類表皮受體 配位體多肽選自人類表皮生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGFa)， p細(xì)胞調(diào)節(jié)素，肝素結(jié)合性表皮生長因子樣 生長因子(HB-EGF)，神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，heregulin,兩性 調(diào)節(jié)蛋白(AR)和上皮調(diào)節(jié)蛋白。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其中所述的取代區(qū)域是B 環(huán)區(qū)域。
23. 權(quán)利要求1所述的人類表皮受體配位體多肽變體，包括 其B環(huán)區(qū)域;故來自于另外的人類表皮受體配位體多肽 的相應(yīng)B環(huán)區(qū)域所取代的表皮生長因子G39L,其中所 述的另外的人類表皮受體配位體多肽選自人類表皮生 長因子(EGF),轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGFa)， (3細(xì)胞調(diào)節(jié) 素，肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF), 一申經(jīng)調(diào)節(jié)因子，heregulin,兩性調(diào)節(jié)蛋白(AR)和上皮 調(diào)節(jié)蛋白，并且所述變體具有至少一種能廣泛作用于人 類表皮受體的拮抗活性。
24. —種藥物組合物，含有權(quán)利要求1所述的人類表皮受體 配位體多肽變體和一種藥學(xué)上可4妄受的載體。
25. —種藥物組合物，含有權(quán)利要求23所述的人類表皮受 體配位體多肽變體和一種藥學(xué)上可4妄受的載體。
26. —種治療病人的方法，該病人患有由人類表皮受體的過 表達(dá)而引起的疾病，該方法包括「給病人施用治療有效量 的4又利要求16所述的藥物組合物。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的疾病是癌癥。
28. 才艮據(jù)4又利要求27所述的方法，其中所述的癌癥選自神 經(jīng)月交質(zhì)瘤、扁平細(xì)萬包瘤、乳&袈瘤、黑素瘤、4憂入性月旁月光 瘤、直腸瘤禾口食道癌。
29. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的疾病是牛皮褲。
30. —種人類表皮受體(HER)配位體多肽變體，其具有至 少一種能廣泛作用于人類表皮受體的拮抗活性，并且所 述變體發(fā)生一種突變，導(dǎo)致區(qū)域I和/或區(qū)域III的結(jié)合斷裂。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的變體，其中所述變體發(fā)生一種 突變，導(dǎo)致區(qū)i或I的結(jié)合斷裂。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的變體，其中所述變體進(jìn)一步發(fā) 生一種突變，導(dǎo)至丈區(qū)i或III的結(jié)合親和性增強(qiáng)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的變體，其中所述變體發(fā)生一種突變，導(dǎo)致區(qū)域m的結(jié)合斷裂，還發(fā)生了一種突變，導(dǎo) 致區(qū)域I的結(jié)合親和性增強(qiáng)。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的變體，其中所述變體進(jìn)一步發(fā) 生一種突變，這種突變改良了受體的結(jié)合特異性。
35. —種編碼—又利要求1所述變體的核酸。
36. —種編碼權(quán)利要求14所述變體的核酸。
37. —種編碼4又利要求23所述變體的核酸。
38. —種編碼^5L利要求30所述變體的核酸。
全文摘要
本發(fā)明描述了人類表皮受體拮抗劑(HER)。這類拮抗劑是人類表皮受體的配位體多肽變體。本發(fā)明所述的人類表皮受體配位體多肽變體具有廣泛針對人類表皮受體的特性，并且能夠抑制一種或者多種人類表皮受體亞型中由人類表皮受體介導(dǎo)的生物活性的至少一種，例如可以抑制受體激酶的活化活性和隨后的細(xì)胞增殖。這類多肽變體以及編碼該多肽變體的核酸可以被臨床用于需要抑制人類表皮受體活性的情況中。
文檔編號C12P21/06GK101365712SQ200580048895
公開日2009年2月11日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月11日
發(fā)明者丹尼爾·J·蒙蒂絲爾蘿, 菲利普·T·皮恩科斯 申請人:莫勒丘爾洛吉克斯有限公司