專利名稱：：通過OmpF和目的蛋白的共表達(dá)的目的蛋白細(xì)胞外生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種向細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌和生產(chǎn)目的蛋白的方法，并且更特別地，包含Kco/Z外部膜蛋白F(OmpF)的重組表達(dá)載體跟微生物的共轉(zhuǎn)化以及在細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌含有目的蛋白的重組表達(dá)載體，以及通過培養(yǎng)所述微生物在細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌和生產(chǎn)目的蛋白的方法。技術(shù)背景隨著基因處理技術(shù)的發(fā)展，通過使用細(xì)菌和各種動物和植物研究生產(chǎn)大量有用蛋白已經(jīng)頻繁進(jìn)行。至今為止，co//作為一種宿主細(xì)胞通常主要用作多種有用蛋白的批量生產(chǎn)，研究也還是主要集中在這里(Choi等，C/zew.Sc/.，66:876，2006;Lee，7>e"<^，14:98，1996)。然而，如果將待生產(chǎn)的有用蛋白在五.co/Z的細(xì)胞質(zhì)中生產(chǎn)，還是會存在許多問題。首先，為了在細(xì)胞質(zhì)中生產(chǎn)蛋白要進(jìn)行分離和純化以獲得高純度，這要進(jìn)行相當(dāng)復(fù)雜和昂貴的分離和純化步驟。并且，上述蛋白易于曝露于當(dāng)前細(xì)胞質(zhì)中的多種蛋白酶中，這將導(dǎo)致減少產(chǎn)量。還有，在大多數(shù)情況下，蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的過表達(dá)并不能完全折疊并形成不活動的包涵體。因為這些包涵體蛋白沒有作為蛋白質(zhì)的活性，為了從所述包涵體蛋白中獲得生物活性和水溶性的蛋白質(zhì)需要進(jìn)行復(fù)雜和昂貴的變性和再折疊步驟(Choi等，C/zem.，66:876，2006)。作為解決類似問題的方法之一，存在一種方法其在細(xì)胞質(zhì)中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)被分泌到外周胞質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基中。五.co//中的目的蛋白的細(xì)胞外生產(chǎn)有多種優(yōu)點。首先，在五."http://細(xì)胞中的目的蛋白的生產(chǎn)可以根本地防止細(xì)胞內(nèi)蛋白裂解，以至于可以得到預(yù)期蛋白質(zhì)的固定生產(chǎn)。其次，通過分泌步驟可以使蛋白質(zhì)得到正確的折疊以生產(chǎn)具有活性的蛋白質(zhì)，并可以防止由非正確折疊導(dǎo)致的包涵體的形成。第三，通過分泌步驟，去除N端分泌信號序列以至于可以保持同樣的氨基酸序列作為自然出現(xiàn)的不帶有N端的蛋氨酸(Met)殘基序列，蛋氨酸不可避免地在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)中連接上來。最后，純化步驟很容易實施。由于很少或幾乎沒有蛋白質(zhì)可以從Kco/Z天然地分泌到培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)基中的目的蛋白分泌生產(chǎn)允許目的蛋白維持在高純度，因此從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化分離目的蛋白變得非常容易。盡管在凡co//中的目的蛋白的細(xì)胞外生產(chǎn)同分泌到co//外周胞質(zhì)中一般的分泌生產(chǎn)具有相似的優(yōu)點，但是上述細(xì)胞外生產(chǎn)的優(yōu)點在工業(yè)生產(chǎn)上可以更有效。因為所述細(xì)胞外分泌生產(chǎn)是一種將目的蛋白完全分泌在細(xì)胞外部的方法，而不是將目的蛋白分泌在有限的外周胞質(zhì)中，它可以顯著減少導(dǎo)致蛋白過表達(dá)的細(xì)胞中的負(fù)擔(dān)以允許通過高細(xì)胞濃度培養(yǎng)基和連續(xù)培養(yǎng)基大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)。盡管兩種方法可以使高純度的蛋白質(zhì)在純化步驟中進(jìn)行生產(chǎn)，但是將目的蛋白生產(chǎn)分泌在外周胞質(zhì)中比細(xì)胞外分泌生產(chǎn)需要更復(fù)雜的步驟，它不易用于工業(yè)應(yīng)用(Choi和Lee，jp//.M/cra6/o/.5zWec/mo/.，64:625，2004)。如上所述，細(xì)胞外分泌的優(yōu)點非常突出和多樣化并因此有許多研究實施將尺co//中的目的蛋白在外周胞質(zhì)或細(xì)胞外分泌。在重組蛋白生產(chǎn)方面，在外周胞質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌分析自co//的有用蛋白的方法具有多種優(yōu)點。首先，因為外周胞質(zhì)或培養(yǎng)基比細(xì)胞質(zhì)包括顯著較少量的蛋白質(zhì)，它非常易于分離和純化預(yù)期有用的具有高純度的蛋白質(zhì)。而且，因為有用的蛋白質(zhì)分離自含有大部分蛋白酶的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白分解可以被預(yù)先防止，這樣在產(chǎn)量方面得到好的結(jié)果。而且，因為外周胞質(zhì)是一個比細(xì)胞質(zhì)更易被氧化的環(huán)境，二硫化物更容易被鍵接，由此得到具有準(zhǔn)確折疊的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，它導(dǎo)致包涵體蛋白的形式顯著減少(Choi禾口Lee，j/p/.Af/cro6/o/.S/o&c/mo/.，64:625，2004)。為了分泌五.co/Z不分泌的外部蛋白質(zhì)，在先已知的分泌信號序列(例如OmpA，OmpF，PhoA，SpA，等)連接到外部蛋白質(zhì)的N端末端或在經(jīng)過一些修飾后進(jìn)行連接(Abrahmsen等，五M5(9J，4:3901，1985;Choi禾口Lee，^;;/,Af/croZ)/o/.64:625，2004;Jobling等，Plasmid，38:158，1997;Klein等，尸/"'"，5:511，1992;Utsumi等，Ge"e基因，71:349，1988)。然而，類似的信號序列或蛋白質(zhì)在分泌效率方面顯示了巨大的差異并且在大量實施例中沒有出現(xiàn)分泌。這是因為沒有清楚地建立信號序列和目的蛋白之間的相關(guān)性以及這樣的研究調(diào)査能夠有效分泌目的蛋白的新的信號序列仍在世界范圍內(nèi)廣泛實施。進(jìn)一步說，盡管從外周胞質(zhì)中分離和純化目的蛋白比從細(xì)胞質(zhì)中分離和純化容易，但是目的蛋白的細(xì)胞外分泌可以使目的蛋白的分離和純化更加容易。co/z'中的目的蛋白的細(xì)胞外分泌的方法，到目前為止已開始實施，其廣義上可以分為如下四類(1)第一種方法基于將信號縮氨酸和目的蛋白質(zhì)組合成融合蛋白質(zhì)并且主要地用所述信號縮氨酸來從co//到外周胞質(zhì)中分泌目的蛋白。Toksoy等人報道了通過融合帶有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的化《1蛋白的細(xì)胞外生產(chǎn)(Toksoy等，5/o,ec/mo/rec/m/《.，3:803，999).在這一方面，采用的是五.co//XLl菌株，并在1mMIPTG的誘導(dǎo)表達(dá)之后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中，有大約270x103單位/lLr"《I蛋白。Lo等人報道了(3-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶衍生自Sac〃/ww^/to并在co//中表達(dá)，結(jié)果出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的細(xì)胞外分泌(Lo等，J/;/.五m^o".M/cro6/o/.，54:2287，1988).Nagahari等人報道了通過融合帶有分泌信號序列和OmpF蛋白的八N端氨基酸的p-內(nèi)啡肽的細(xì)胞外分泌(Nagahari等，五MSOJ.，4:3589,1985).在這一方面，co//N99，RRI，和MC4100以及它們的突變株MH1461(envZ)和MH1160(ompR)用作宿主細(xì)胞，并且在它們當(dāng)中RR1菌株顯示了最高的分泌效率，其中(3-內(nèi)啡肽在分泌之后在細(xì)胞外蛋白酶的作用下出現(xiàn)降解。N99菌株顯示了最穩(wěn)定的分泌效率。另一方面，Yamamoto等人欲嘗試通過如上所述融合帶有OmpF分泌信號序列的Harvey小鼠肉瘤病毒衍生自p21蛋白來分泌生產(chǎn)。然而，所述p21蛋白在細(xì)胞外未分泌，卻以溶性的包涵體形式積累在細(xì)胞質(zhì)中(Yamamoto等，^!p/.M/croWo/.跑ec/mo/.，35:615，1991).(2)第二種方法采用目的蛋白和包含在co//中目的蛋白分泌中的蛋白的共同生產(chǎn)。Baneyx等人報道了OmpA-TEM-(3-內(nèi)酰胺酶融合蛋白的分泌生產(chǎn)中的TolAIII蛋白CE.co//transmembraneprotein)的共同生產(chǎn)(Baneyx和Eugene,ProteinExpr.Purif.，14:13，1998).為了得所述OmpA-TEM-p-內(nèi)酰胺酶融合蛋白的分泌生產(chǎn)，使用需要lpp-lac啟動子，而且為了表達(dá)TolAIII蛋白，使用需要IPTG衍生物的T71ac啟動子。在E.co"BL21(DE3)中的蛋白表達(dá)采用1mMIPTG誘導(dǎo)。結(jié)果是，與蛋白的單一表達(dá)相比帶有TolAIII的共同表達(dá)在P-內(nèi)酰胺酶的活性中顯示了3.5倍的增長。Robbens等人報道了在白細(xì)胞介素-2(IL-2)生產(chǎn)中的基因的共同表達(dá)(Robbens等，/VWe/"五x/r尸w〃;/:，6:481，1995)。在這一方面，IL-2基因在融合OmpA分泌信號序列之后，采用需要IPTG衍生物的tac啟動子對它的表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)，并且基因的共同表達(dá)需要在42°C下的震蕩加熱中采用Pt啟動子。已知在h'/基因通過加熱震蕩的誘導(dǎo)表達(dá)之前IL-2蛋白產(chǎn)生于五.co/Z的外周胞質(zhì)中，在h'/基因的誘導(dǎo)表達(dá)之后它主要通過外部膜分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。vanderWal等人采用細(xì)菌素釋放蛋白(BRP)，它是一種五.co/Z脂蛋白，獲得p-內(nèi)酰胺酶的細(xì)胞外分泌(vanderWal等，五m^o".ikf/croWo/.，64:392，1998).vanderWal等人通過隨即誘變現(xiàn)有的BRP基因得到了修飾的BRP基因，并且采用這些修飾的BRP基因以開發(fā)比現(xiàn)有BRP基因更穩(wěn)定的方式來培養(yǎng)可分泌和產(chǎn)生到細(xì)胞外部的系統(tǒng)。Aristidou等人報道了在采用BRP的細(xì)胞外分泌中將甘氨酸加入培養(yǎng)基中可以有效增加分泌效率(Aristidou等，所o&c/mo/.丄e".，15:331，1993).作為目的蛋白質(zhì)，采用a-淀粉酶和p-內(nèi)酰胺酶，并通過lpp/lac啟動子對BRP表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)。在介質(zhì)中添加1%的甘氨酸比添加0.1%的甘氨酸該a-淀粉酶顯示了大約高出10倍的活性。在添加1.0%的甘氨酸時該P-內(nèi)酰胺酶的活性顯示增加了大約2.5倍。(3)第三種方法采用不帶外部膜的E.co/Z菌株。這種突變株被稱為"L-形(form)"，它處于五.co/Z的外部膜去除后細(xì)胞形成的狀態(tài)，具有不帶外周胞質(zhì)的內(nèi)膜。也就是說，分泌蛋白到外周胞質(zhì)所用到的方法在現(xiàn)有技術(shù)中被廣泛采用，它允許蛋白質(zhì)的細(xì)胞外產(chǎn)生，因為一旦該蛋白質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)膜就不經(jīng)過外周胞質(zhì)而暴露于細(xì)胞培養(yǎng)基中。Kujau等人采用RV308菌株，它是一種L-形五.co//菌株，以得到微型抗體(miniAb)的細(xì)胞外分泌(Kujau等，Af/crc^/o/.S/c^ec/mo/.，49:51，1998).該miniAb基因與OmpA分泌信號序列融合，之后通過lac啟動子對它的表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)。在低溫26。C下培養(yǎng)比在37。C中培養(yǎng)顯示了較高的細(xì)胞濃度和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。(4)第四種方法是通過融合帶有目的蛋白的外部膜蛋白F(OmpF)來實施細(xì)胞外分泌。在這種方法中，融合有末端為C-端的外部膜蛋白F的目的蛋白(3-內(nèi)啡肽在高的細(xì)胞濃度中培養(yǎng)從而使其分泌到細(xì)胞的外部(韓國專利號10-0447530;Jeong禾口Lee，^;p/.五wv/row.，68:4979，2002).然而，這種方法的問題在于為了得到目的蛋白的細(xì)胞外分泌必須使用高細(xì)胞濃度培養(yǎng)基，并且通過消化分離和純化目的蛋白的步驟需要多種蛋白酶，因為產(chǎn)生的目的蛋白融合有OmpF蛋白。如上所述，盡管在E.co/z'中目的蛋白的細(xì)胞外生產(chǎn)已開發(fā)研究了多種方法，但是仍存在許多問題。上述方法允許目的蛋白的分泌產(chǎn)生。然而，因為這些方法中的大多數(shù)包含有五.co/Z的部分裂解，￡.co/Z的大量的細(xì)胞內(nèi)蛋白包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中從而降低了目的蛋白的純度，這使得很難得到簡單的純化步驟，而這卻是細(xì)胞外分泌生產(chǎn)的最重要的優(yōu)點。而且，因為這些方法涉及凡co"的裂解，它們有一個缺點在于，在高細(xì)胞濃度的培養(yǎng)基中很難生產(chǎn)，以至于獲得預(yù)期蛋白的批量生產(chǎn)也變得困難。尤其是在L-形的E.co//中，因為E.co//菌株結(jié)構(gòu)的問題只有低細(xì)胞濃度的培養(yǎng)基中才可以。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明者作了很大的努力開發(fā)了一種從五.co/Z有效地分泌目的蛋白到微生物細(xì)胞外部(進(jìn)入培養(yǎng)基中)的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)五.coZ/外部膜蛋白F(OmpF)和目的蛋白共同表達(dá)時，該目的蛋白可以從五.中有效地分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且該分泌的蛋白可以以一種非常簡單的方式被分離和純化，因為在細(xì)胞培養(yǎng)基中它是一種純態(tài)，由此完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的主要目的是提供一種微生物，其特征在于將OmpF和目的蛋白的共同表達(dá)以將目的蛋白分泌和生產(chǎn)到微生物細(xì)胞外部。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種目的蛋白的細(xì)胞外分泌和生產(chǎn)的方法，該方法包含有培養(yǎng)所述微生物。為了完成上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種共轉(zhuǎn)化(co-transformed)重組微生物，其帶有含0mpF編碼基因的重組載體和含目的蛋白編碼基因的重組載體，并能夠表達(dá)和分泌目的蛋白到微生物的外周胞質(zhì)中，該重組微生物的特征在于能夠?qū)mpF編碼基因和目的蛋白編碼基因共同表達(dá)以分泌和產(chǎn)生目的蛋白到微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基中)。在另一方面，本發(fā)明提供一種通過誘導(dǎo)含目的蛋白編碼基因的重組載體得到的重組微生物并且能夠?qū)⒛康牡鞍妆磉_(dá)和分泌到微生物的外周胞質(zhì)中，在具有OmpF編碼基因的微生物中它的啟動子誘導(dǎo)進(jìn)入它的染色體，從而能夠表達(dá)OmpF編碼基因，該重組微生物的特征在于能夠共同表達(dá)OmpF編碼基因和目的蛋白編碼基因以將目的蛋白分泌和生產(chǎn)到微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)基)。在本發(fā)明中，該含有0mpF編碼基因的重組載體和含目的蛋白編碼基因的重組載體具有在基本相同條件表達(dá)的多個起點(origins)。例如，含OmpF編碼基因的重組載體的起點是pl5A，并且含目的蛋白編碼基因的重組載體的起點是ColEl。該含有OmpF編碼基因的重組載體在它的本身中具有OmpF啟動子，并且優(yōu)選地，該重組載體為pACYC-OmpF。同時，該含目的蛋白編碼基因的重組載體優(yōu)選其特征能夠表達(dá)和分泌目的蛋白到微生物的外周胞質(zhì)中。當(dāng)重組微生物與含有這種特征的重組載體共轉(zhuǎn)化(co-transformed)以及該OmpF編碼基因被培養(yǎng)時，該目的蛋白可被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。因此，本發(fā)明還提供了一種目的蛋白的細(xì)胞外分泌和生產(chǎn)的方法，該方法包括步驟(a)培養(yǎng)所述重組體微生物以分泌目的蛋白到微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基中)；和(b)從培養(yǎng)基中收集目的蛋白。在另一方面，本發(fā)明提供一種重組載體，其通過誘導(dǎo)OmpF編碼基因進(jìn)入含有目的蛋白編碼基因的載體中構(gòu)成，并能夠表達(dá)和分泌目的蛋白到微生物的外周胞質(zhì)。該重組載體的特征在于能夠共同表達(dá)該OmpF編碼基因和目的蛋白編碼基因以將目的蛋白分泌到微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基中)。然而在又一方面，本發(fā)明還提供一種得到目的蛋白的細(xì)胞外分泌和生產(chǎn)的方法，該方法包括步驟(a)培養(yǎng)微生物與所述重組載體變換并且該變換的微生物分泌目的蛋白到微生物細(xì)胞的外面(進(jìn)入培養(yǎng)基中)；和(b)從培養(yǎng)基中回收目的蛋白。在本發(fā)明獲得目的蛋白的細(xì)胞外分泌和生產(chǎn)的方法中，在步驟(a)中的目的蛋白的細(xì)胞外分泌并不伴隨該微生物的裂解。本發(fā)明將在下文中作詳細(xì)描述。為了OmpF的共同表達(dá)，本發(fā)明者創(chuàng)立了重組質(zhì)粒載體pACYC-OmpF。這種重組質(zhì)粒包含￡.co//OmpF基因和啟動子和氯霉素抗體基因并具有pl5A起點，因此它易于與用于大多數(shù)表達(dá)載體的ColEl起點共同表達(dá)。該OmpF基因和啟動子是通過PCR方法從co//BL21(DE3)染色體中獲得的。然后，為了制備分泌目的蛋白到微生物細(xì)胞外部的轉(zhuǎn)化五.CO"菌株，采用了多種重組質(zhì)粒。首先，五.CO/Z堿性磷酸酶用作目的蛋白。該堿性磷酸酶由450個氨基酸組成并且具有大約50kDa的分子量。已知這種蛋白質(zhì)在五.co//中被表達(dá)并分泌到外周胞質(zhì)，而且它只有在外周胞質(zhì)中存在才具有酶活性(Manoil等，科學(xué)，233:1403，1986)。該重組質(zhì)粒pTrcSlPhoA能夠分泌和生產(chǎn)堿性磷酸酶到外周胞質(zhì)，并且質(zhì)粒pACYC-OmpF在五.co//中得到共轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，并且分析該培養(yǎng)基，結(jié)果顯示該分泌自Kco//BL21(DE3)和MC4100的目的蛋白堿性磷酸酶以良好的效率進(jìn)入培養(yǎng)基中。純的堿性磷酸酶可以從上述五.co/!'菌株分泌到微生物細(xì)胞的外部獲得。同樣，添加堿性磷酸酶的其他蛋白質(zhì)，例如，由53個氨基酸組成的上皮細(xì)胞生長因子(EGF)，人血清瘦素(leptin)蛋白，來自芽孢桿菌(Bacillussp.)的木聚糖內(nèi)切酶，用作目的蛋白來分析它們分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中。本發(fā)明還顯示所有上述蛋白質(zhì)被有效地分泌自轉(zhuǎn)基因￡."http://而進(jìn)入培養(yǎng)基中。圖1顯示質(zhì)粒pACYC-OmpF的基因圖。圖2顯示獲得BL21(DE3)培養(yǎng)基與質(zhì)粒pACYC-OmpF禾口pTrcSlPhoA共轉(zhuǎn)化的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。圖3顯示得到￡.co//MC4100培養(yǎng)基與質(zhì)粒pACYC-OmpF禾口pTrcSlPhoA共轉(zhuǎn)化的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。圖4顯示通過培養(yǎng)E.co/出L21(DE3)與質(zhì)粒pACYC-OmpF和pTrcSlPhoA在不同濃度的NaCl中變換得到的培養(yǎng)基的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。圖5是質(zhì)粒psEGF的基因圖。圖6顯示得到￡.co//BL21(DE3)培養(yǎng)基與質(zhì)粒pACYC-OmpF禾PpsEGF共轉(zhuǎn)化的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。圖7顯示CuCl2染色的co//BL21(DE3)培養(yǎng)基與質(zhì)粒pACYC-OmpF和psEGF的共轉(zhuǎn)化的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。圖8顯示五.co//BL21(DE3)培養(yǎng)基與質(zhì)粒pACYC-OmpF和pJS101AP的共轉(zhuǎn)化的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。圖9顯示co〃BL21(DE3)培養(yǎng)基與質(zhì)粒pACYC-OmpF禾卩pTrcKObD的共轉(zhuǎn)化的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。具體實施方式在下文中，將通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。然而對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見這些實施例只是對發(fā)明目的進(jìn)行詳細(xì)說明，而本發(fā)明的范圍并不限于這些實施例。特別地，下列實施例說明了培養(yǎng)與含OmpF編碼基因的重組載體和含目的蛋白編碼基因的重組載體共轉(zhuǎn)化的微生物從而分泌和生產(chǎn)目的蛋白到微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)基)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見采用與通過OmpF編碼基因誘導(dǎo)到含目的蛋白編碼的載體中構(gòu)成的重組載體變換的微生物，并能夠?qū)⒛康牡鞍妆磉_(dá)和分泌到微生物的外周胞質(zhì)，同樣承認(rèn)待分泌和生產(chǎn)到微生物細(xì)胞外的目的蛋白(進(jìn)入培養(yǎng)基中)。除了含OmpF編碼基因的重組載體之外，采用通過誘導(dǎo)含目的蛋白編碼基因重組載體構(gòu)成的重組微生物并將目的蛋白表達(dá)和分泌到微生物的外周胞質(zhì)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，進(jìn)入具有OmpF編碼基因的重組微生物并且它的啟動子誘導(dǎo)進(jìn)入它的染色體，目的是能夠表達(dá)該OmpF編碼基因，使得待分泌和生產(chǎn)的目的蛋白到達(dá)微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基中)。此外，下面實施例說明了pJS101AP(—種能向外周胞質(zhì)表達(dá)和分泌木聚糖內(nèi)切酶的重組載體)和pTrcKObD(—種能向co/Z外周胞質(zhì)表達(dá)和分泌人血清痩素(leptin)蛋白的重組載體)作為含有目的蛋白編碼基因的重組載體，并能夠向的外周胞質(zhì)表達(dá)和分泌目的蛋白。然而，如果該重組載體能夠向微生物外周胞質(zhì)表達(dá)和分泌目的蛋白，則所有重組載體可不限制地被使用，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。而且，盡管下面的實施例中僅列舉了堿性磷酸酶、表皮生長因子(EGF)、木聚糖內(nèi)切酶和人血清瘦素(leptin)作為目的蛋白，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可以預(yù)見到本發(fā)明并不限于所列舉的目的蛋白。實施例1:OmpF基因表達(dá)系統(tǒng)的研制從￡.co/ZBL21(DE3)中分離的染色體，然后克隆OmpF基因和它的啟動子區(qū)，合成序列為5，-CGGAATTCTGGATTATACCGACGCAG-3'(序列l(wèi))的引物1和序列為5'-GCGGATCCTTAGAACTGGTAAACGATAC-3，(序列2)的引物2.該染色體采用引物l和2通過PCR以得到2160-bpPCR產(chǎn)物。該PCR產(chǎn)物經(jīng)//Mil和BflwHI進(jìn)行消化并被克隆進(jìn)入pACYC184(新英格蘭Biolabsd，美國).該克隆后的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到co//XL1-Bluer"(W，)]以獲得重組質(zhì)粒pACYC-OmpF(圖1).實施例2:重組質(zhì)粒pTrcSlPhoA的結(jié)構(gòu)分離自五.co/ZW3110(衍生自￡.co//K-12，r，F(xiàn)—，原養(yǎng)的)的染色體，之后，為了得到堿性磷酸酶基因，合成序列為5'-GGACTGCAGCACGGACACCAGAAATGCCTGTT-3，(序歹U3)的引物3和序列為5'-GCGGGATCCTTATTATTTCAGCCCCAGAGCCGG-3，(序歹iJ4)的弓l物4。該染色體采用引物3和4進(jìn)行PCR。該PCR反應(yīng)在如下條件下完成94。C下預(yù)變性5分鐘；94。C變性45秒，52。C下退火45秒，72°C下延長1分10秒，進(jìn)行30個循環(huán)；之后，在72。C下延長7分鐘。通過PCR反應(yīng)得到的DNA片段在瓊脂糖凝膠中作電泳以分離大約1360bpDNA片段。該分離后的DNA片段在兩種限制酶尸WI和5am/ZI中消化。同時，重組質(zhì)粒pJS101AP(Choi，J.H.，等，A^croWo/.B/o&c/mo/.，53:640，2000)在兩種限制酶尸M禾0Sam/n中消化以去除endoxylase基因，并且所得到的質(zhì)粒與上面得到的DNA序列通過T4DNA連接酶混合和連接，從而得到重組質(zhì)粒pTrcSlPhoA。實施例3:堿性磷酸酶的細(xì)胞外生產(chǎn)co//BL21(DE3)菌株是共轉(zhuǎn)化自重組質(zhì)粒pACYC-OmpF和pTrcSlPhoA。該轉(zhuǎn)化通過電穿孔實現(xiàn)。該轉(zhuǎn)化菌株選自包含氨芐青霉素抗生素(50lag/L)和氯霉素(34嗎/L)的LB平板培養(yǎng)基。該轉(zhuǎn)化菌株接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/LNaCl)和在30。C培養(yǎng)，之后，檢査堿性磷酸酶的細(xì)胞外分泌。當(dāng)用分光光度計測量接種到液態(tài)培養(yǎng)基中之后在600nm波長下的光密度值(O.D.)達(dá)到0.7時，向培養(yǎng)介質(zhì)中加入0.1和1.0mM的IPTG，以誘導(dǎo)基因表達(dá)。在誘導(dǎo)基因表達(dá)12小時之后，在每個培養(yǎng)基中收集lmL培養(yǎng)物并測量堿性磷酸酶的活性，同時在SDS-PAGE凝膠中分析(圖2)。在圖2中，"M"表示標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)，"1"表示在0.1mMIPTG中誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，用SDS-PAGE凝膠分析BL21(DE3)轉(zhuǎn)化pACYC-OmpF禾卩pTrcSlPhoA的培養(yǎng)基的結(jié)果，如圖2所示，可以檢測出對應(yīng)大約50kDa的堿性磷酸酶，暗示了上述系統(tǒng)可以使目的蛋白有效地分泌到培養(yǎng)基中。目卩，可見在Kco//堿性磷酸酶分泌中出現(xiàn)。分泌的堿性磷酸酶的量通過Bradford方法測量，結(jié)果顯示在培養(yǎng)基中生產(chǎn)大約0.1g/L的水溶性堿性磷酸酶。如上所述，可見堿性磷酸酶可以有效地從凡co//BL21(DE3)分泌到培養(yǎng)基中，同樣，除了￡.co//BL21(DE3)之外，這種蛋白質(zhì)還分泌自其他的￡.菌株進(jìn)入培養(yǎng)基中。上述重組質(zhì)粒pACYC-OmpF和pTrcSlPhoA是共轉(zhuǎn)化進(jìn)入五.co//MC4100[FaraD"9z/f^gF/ac」C/M9r/wl"0(^力w"7deoC7p^PZ5該轉(zhuǎn)化通過電穿孔實施，該轉(zhuǎn)化菌株選自包含氨芐青霉素抗生素(50嗎/L)和氯霉素(34嗎/L)的LB平板培養(yǎng)基。該轉(zhuǎn)化菌株接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/LNaCl)并在30。C在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并檢查堿性磷酸酶的細(xì)胞外分泌。當(dāng)用分光光度計測量接種到液態(tài)培養(yǎng)基中之后在600nm波長下的光密度值(O.D.)達(dá)到0.7時，向培養(yǎng)介質(zhì)中加入0.1和1.0mM的IPTG，以誘導(dǎo)基因表達(dá)。在引起基因表達(dá)12小時之后，收集1mL培養(yǎng)物并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析(圖3)，在圖3中，"M"表示標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)，"1"表示在1mMIPTG中引起表達(dá)12小時之后，用SDS-PAGE凝膠分析￡.co//MC4100轉(zhuǎn)化pACYC-OmpF和pTrcSlPhoA的培養(yǎng)基的結(jié)果，如圖3所示，堿性磷酸酶對應(yīng)大約50kDa可以被檢測出，暗示了上述系統(tǒng)可以將目的蛋白有效地分泌到培養(yǎng)基中。然而，在尺co//MC4100中的堿性磷酸酶的分泌效率要低于在co//BL21(DE3)中的分泌效率。實施例4:分泌自重組co//的堿性磷酸酶的活性測量堿性磷酸酶的活性通過如下方式進(jìn)行測量(Brickman和Beckwith，J"似o/.歷o/.，96:307，1975).重組五.co//菌株BL21(DE3)與重組質(zhì)粒pACYC-OmpF禾卩pTrcSlPhoA共轉(zhuǎn)化接種到含50mLLB介質(zhì)的250mL燒瓶中在37。C中培養(yǎng)。當(dāng)用分光光度計測量在600nm波長下的光密度值(O.D.)達(dá)到0.7時，向培養(yǎng)介質(zhì)中加入lmM的IPTG，以誘導(dǎo)基因表達(dá)。在誘導(dǎo)基因表達(dá)12小時之后，收集lmL培養(yǎng)物加入0.1mL氯仿，之后，該混合物在37°C下反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)之后，將0.1mL的0.4%PNPP(p-硝基苯磷酸鹽)加入反應(yīng)混合物，隨后在37。C下反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)之后，將0.1mL的1MK2HP04溶液加入反應(yīng)物以終止反應(yīng)。將得到的反應(yīng)溶液用相應(yīng)的50mMTris-HCl溶液進(jìn)行稀釋并在420nm和550nm波長下測量其吸收率。而且在控制實驗中，不帶質(zhì)粒的凡co//BL21(DE3)和￡.co//BL21(DE3)的培養(yǎng)基與pTrcSlPhoA轉(zhuǎn)化，并以上述同樣的方法測量得到堿性磷酸酶的活性。堿性磷酸酶的活性通過如下公式計算，結(jié)果顯示在下表1中活性(U/mL)=1000x(Abs420nm-1.75xAbs550nm)/[反應(yīng)時間(min)x反應(yīng)物體積(mL)]<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>0.1mM誘導(dǎo)劑co//BL21(DE3)(pTrcSlPhoA，pACYC-OmpF)，0.01mM誘導(dǎo)劑7800如表1所示，￡.co"菌株的培養(yǎng)基與質(zhì)粒pACYC-OmpF禾PpTrcSlPhoA的轉(zhuǎn)化顯示出堿性磷酸酶高的活性，其中未轉(zhuǎn)化的菌株顯示出很少或幾乎沒有活性。堿性磷酸酶在細(xì)胞中沒有活性，只有通過分泌步驟出現(xiàn)二硫化物結(jié)合時才顯示活性。由上述實驗結(jié)果看，堿性磷酸酶生產(chǎn)在轉(zhuǎn)化的重組￡."http://菌株中，并以高效率連續(xù)地分泌到培養(yǎng)基中。實施例5:NaCl的濃度對堿性磷酸酶的細(xì)胞外分泌的作用使五.co〃BL21(DE3)菌株與重組質(zhì)粒pACYC-OmpF和pTrcSlPhoA共轉(zhuǎn)化，所述轉(zhuǎn)化過程通過電穿孔實現(xiàn)，并從含有抗生素氨芐青霉素(50pg/L)和氯霉素(34昭/L)的LB平板培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化菌株。將轉(zhuǎn)化的菌株在不同的NaCl濃度中接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和0、1、5和10g/LNaCl)，30°C下培養(yǎng)并檢測堿性磷酸酶的細(xì)胞外分泌。當(dāng)用分光光度計測量接種到液態(tài)培養(yǎng)基中之后在600nm波長下的光密度值(O.D.)達(dá)到0.7時，向培養(yǎng)液中加入0.1禾P1.0mM的IPTG，以誘導(dǎo)基因表達(dá)。在誘導(dǎo)基因表達(dá)12小時之后，收集1mL培養(yǎng)物并在SDS-PAGE凝膠中分析(圖4)。在圖4中，"M"表示標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)，"1"到"4"表示用0.1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，用pACYC-OmpF和pTrcSlPhoA轉(zhuǎn)化的五.co"BL21(DE3)培養(yǎng)物的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。也就是說，該數(shù)字l-4分別顯示結(jié)果在不同濃度NaCl中在LB液態(tài)培養(yǎng)基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和0、1、5和10g/LNaCl)培養(yǎng)之后得到的結(jié)果。如圖4所示，可以被檢測出對應(yīng)大約50kDa的堿性磷酸酶，特別是，顯示了在培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶的分泌隨NaCl濃度從O到10g/L的增長而增加。實施例6:重組質(zhì)粒psEGF的構(gòu)建采用重組質(zhì)粒G82，嵌入上皮細(xì)胞生長因子(EGF)基因，由韓國細(xì)胞因子庫提供(生命科學(xué)系，Jeonbuk大學(xué)，Jeonju-si，Jeollabuk-do)，作為模板DNA以獲得EGF基因。合成序列為5，-GAACTGCAGCTAATAGTGACYCTGAATGTCCC-3，(序歹!j5)的引物5和序列為5，-GCGGATCCTTATTAGCGCAGTTCCCACCACT-3，(序列6)的引物6并用于PCR。該PCR反應(yīng)在如下條件下完成94。C下預(yù)變性5分鐘；在94。C變性45秒，在56°C下退火45秒，并在72°C下延長30秒；之后，在72°C下延長7分鐘，循環(huán)30次。通過PCR反應(yīng)得到的DNA片段在瓊脂糖凝膠中作電泳以分離擴(kuò)增的EGFDNA片段。該分離后的DNA片段在兩種限制酶PstI和BamHI中消化。同時，重組質(zhì)粒pJS101AP(Choi，J.H.，等，^P;/.M,c油W.所Wec/mo/.，53:640，2000)在兩種限制酶Pstl和BamHI中消化以去除endoxylase基因，并且所得到的質(zhì)粒與上面得到的DNA片段通過T4DNA連接酶混合和連接，從而得到重組質(zhì)粒psEGF(圖5)。實施例7:EGF的細(xì)胞外分泌和生產(chǎn)使五.co//BL21(DE3)菌株與重組質(zhì)粒pACYC-OmpF和psEGF共轉(zhuǎn)化，所述轉(zhuǎn)化過程通過電穿孔實現(xiàn)，并從含有抗生素氨芐青霉素(50)ig/L)和氯霉素(34嗎/L)的LB板介質(zhì)中選擇轉(zhuǎn)化菌株。將轉(zhuǎn)化的菌株接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和5g/LNaCl)，并檢測EGF的細(xì)胞外分泌。當(dāng)用分光光度計測量接種到液態(tài)培養(yǎng)基中之后在600nm波長下的光密度值(O.D.)達(dá)到0.7時，向培養(yǎng)介質(zhì)中加入0.1和1.0mM的IPTG，以誘導(dǎo)基因表達(dá)。在引起基因表達(dá)12小時之后，收集lmL培養(yǎng)物并在TricineSDS-PAGE(Shagger，H.禾PvonJogot，G.，Anal.Biochem.，166:368，1987)凝膠中分析。圖6顯示的是SDS-PAGE之后采用通用染色法的染色結(jié)果。在圖6中，"M"表示標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)，并且"l"表示在0.1mMIPTG中誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，用SDS-PAGE凝膠分析BL21(DE3)轉(zhuǎn)化pACYC-OmpF和psEGF的培養(yǎng)基的結(jié)果，并且"2"表示在1mMIPTG中誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，用SDS-PAGE凝膠分析BL21(DE3)轉(zhuǎn)化pACYC-OmpF禾卩psEGF的培養(yǎng)基的結(jié)果。如圖6所示，大約36kDa的外部膜蛋白F，結(jié)合EGF蛋白(標(biāo)有箭頭)對應(yīng)大約5kDa可以通過SDS-PAGE檢測出。而且，少量的細(xì)胞可從濃度為lmM的IPTG中裂解檢測到，而且檢測到的細(xì)胞暗示了上述系統(tǒng)可以將目的蛋白有效地分泌到培養(yǎng)基中。然而，在￡.co/fMC4100中的堿性磷酸酶的分泌效率要低于在五.co//BL21(DE3)中。并且檢測到細(xì)胞沒有裂解由于蛋白質(zhì)的性質(zhì)在濃度為0.1mM的IPTG表達(dá)速率沒有降低，檢測到未被染為藍(lán)色。因此，，使用300mMCuC12染色5分鐘(Lee，C.等，Anal.Biochem.，166:308，1987)來取代采用普通的考馬斯藍(lán)染色方法，同樣的樣品也可以測得(圖7).在圖7中，"M"表示標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)，并且"l"表示在O.lmMIPTG中誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，用SDS-PAGE凝膠分析BL21(DE3)轉(zhuǎn)化pACYC-OmpF禾卩psEGF的培養(yǎng)基的結(jié)果，如圖7所示，可檢測出有效分泌到培養(yǎng)基中的EGF蛋白(標(biāo)有箭頭)。也就是，可見EGF蛋白的分泌出現(xiàn)在五.co/z'中。分泌的EGF蛋白的量通過Bradford方法測量，結(jié)果顯示在培養(yǎng)基中以水溶態(tài)生產(chǎn)大約0.07g/L的EGF蛋白。實施例8:木聚糖內(nèi)切酶的細(xì)胞外分泌和生產(chǎn)重組質(zhì)粒pJS101AP是一種能夠從芽孢桿菌向外周胞質(zhì)表達(dá)和分泌木聚糖內(nèi)切酶的重組載體(Choi，J.H.，等'Appl.Microbiol.Biotechnol.，53:640，2000)。使￡.co//BL21(DE3)菌株與重組質(zhì)粒pACYC-OmpF和pJS101AP共轉(zhuǎn)化，以從尺co//向培養(yǎng)液中分泌和生產(chǎn)木聚糖內(nèi)切酶。所述轉(zhuǎn)化過程通過電穿孔實現(xiàn)，并從含有抗生素氨芐青霉素(50嗎/L)和氯霉素(34嗎/L)的LB平板培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化菌株。將轉(zhuǎn)化的菌株接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，禾卩5g/LNaCl)，30°C下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)并檢測木聚糖內(nèi)切酶的細(xì)胞外分泌。當(dāng)用分光光度計測量接種到液態(tài)培養(yǎng)基中之后在600nm波長下的光密度值(O.D.)達(dá)到0.7時，向培養(yǎng)介質(zhì)中加入O.lmM的IPTG，以誘導(dǎo)基因表達(dá)。在誘導(dǎo)基因表達(dá)12小時之后，收集1mL培養(yǎng)物并在SDS-PAGE凝膠中分析。在SDS-PAGE分析之后，用通用染色方法將其染色(圖8)。在圖8中，"M"表示標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)，"1"表示用O.lmMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，僅用pACYC-OmpF轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)培養(yǎng)物的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果，"2"表示用0.1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，用pACYC-OmpF和pJS101AP轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)培養(yǎng)物的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。如圖7所示，通過SDS-PAGE能夠檢測到大約36kDa的外膜蛋白F以及對應(yīng)于大約20kDa的木聚糖內(nèi)切酶(標(biāo)有箭頭)。結(jié)果表明，在培養(yǎng)過程中五.co//中的木聚糖內(nèi)切酶蛋白有效地分泌到培養(yǎng)液中。實施例9:人血清瘦素(leptin)蛋白的細(xì)胞外分泌和生產(chǎn)重組質(zhì)粒pTrcKObD是一種能夠向co//的外周胞質(zhì)表達(dá)和分泌人血清瘦素(leptin)蛋白的重組載體(Jeong，K丄和Lee，S.Y.，胸ec/mo/,5&e"g.，67:398，2000)。使五.co//BL21(DE3)菌株與重組質(zhì)粒pACYC-OmpF和pTrcKObD共轉(zhuǎn)化，以從co//向培養(yǎng)液中分泌和生產(chǎn)人血清瘦素(leptin)蛋白。所述轉(zhuǎn)化過程通過電穿孔實現(xiàn)，并從含有抗生素氨芐青霉素(50)ig/L)和氯霉素(34嗎/L)的LB平板培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化菌株。將轉(zhuǎn)化的菌株接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和5g/LNaCl)，30。C下在培養(yǎng)液中培養(yǎng)并檢測人血清瘦素(leptin)蛋白的細(xì)胞外分泌。當(dāng)用分光光度計測量接種到液態(tài)培養(yǎng)基中之后在600mn波長下的光密度值(O.D.)達(dá)到0.7時，向培養(yǎng)介質(zhì)中分別加入0.1和1.0mM的IPTG,以引起基因表達(dá)。在引起基因表達(dá)12小時之后，收集1mL培養(yǎng)物并在SDS-PAGE凝膠中分析。在SDS-PAGE分析之后，用通用染色方法將其染色(圖9)。在圖9中，"M"表示標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)，"l"表示用lmMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，用pACYC-OmpF和pTrcKObD轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)培養(yǎng)物的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果，"2"表示用0.1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)12小時之后，用pACYC-OmpF和pTrcKObD轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)培養(yǎng)物的SDS-PAGE凝膠分析結(jié)果。如圖9所示，通過SDS-PAGE能夠檢測到大約36kDa的外膜蛋白F以及對應(yīng)于大約14kDa的血清痩素(leptin)蛋白(標(biāo)有箭頭)。而且，當(dāng)用lmMIPTG的濃度引起表達(dá)時，檢測到少量的細(xì)胞發(fā)生了裂解，當(dāng)用0.1mMIPTG的濃度誘導(dǎo)表達(dá)時，沒有檢測到細(xì)胞裂解，并且表達(dá)速率沒有降低。結(jié)果表明，在培養(yǎng)過程中fi.co"中的血清痩素(leptin)蛋白有效地分泌到了培養(yǎng)液中。如上所述，已經(jīng)對本發(fā)明的特殊部分進(jìn)行了詳細(xì)解釋，然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯然這些特殊技術(shù)僅對應(yīng)于優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的范圍并不受那些實施方式的限制。因此，本發(fā)明的實際范圍將由所附權(quán)利要求及其等價方式所確定。工業(yè)實用性如上面詳細(xì)描述和證明的那樣，本發(fā)明提供了向細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌目的蛋白的微生物，以及用于向微生物細(xì)胞外部分泌和生產(chǎn)目的蛋白的方法。盡管當(dāng)使用現(xiàn)有技術(shù)的方法來從co//向細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌重組蛋白質(zhì)時，可以向微生物細(xì)胞外部分泌和生產(chǎn)預(yù)期的蛋白質(zhì)，但大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)的方法會造成一些co//的裂解，這樣培養(yǎng)液中含有不少量的￡.co/z'的胞內(nèi)蛋白質(zhì)從而降低了目的蛋白的濃度，因此造成了純化過程的難題。相反，在本發(fā)明中，利用OmpF啟動子同時通過組成性表達(dá)的方式使細(xì)胞生長，可以表達(dá)目的蛋白。因此，目的蛋白的分泌相對細(xì)胞濃度的增加而成比例地增加，同時，可以以一種非常有效的方式高純度地生產(chǎn)目的蛋白。而且，本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術(shù)更簡單。因此根據(jù)本發(fā)明，利用本發(fā)明的微生物可以向細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌和生產(chǎn)各種目的蛋白。權(quán)利要求1.一種重組微生物與含OmpF編碼基因的重組載體和含目的編碼基因的重組載體的共轉(zhuǎn)化并且能夠向微生物外周胞質(zhì)中表達(dá)和分泌目的蛋白，該重組微生物，其特征在于，能夠共表達(dá)該OmpF編碼基因和目的蛋白編碼基因從而向微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基中)分泌和生產(chǎn)該目的蛋白。2.—種通過誘導(dǎo)含目的蛋白編碼基因的重組載體獲得的微生物并能夠向微生物的外周胞質(zhì)中表達(dá)和分泌目的蛋白，進(jìn)入具有OmpF編碼基因的重組微生物中和其啟動子引入到其染色體中從而表達(dá)OmpF編碼基因，該重組微生物，其特征在于，能夠共表達(dá)該OmpF編碼基因和目的蛋白編碼基因以向微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基中)分泌和生產(chǎn)該目的蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組微生物，其特征在于，含有OmpF編碼基因的重組載體和含有目的蛋白編碼基因的重組載體具有在同樣條件下可表達(dá)的起點。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組微生物，其特征在于，含OmpF編碼基因的重組載體的起點是pl5A，并且含目的蛋白編碼基因的重組載體的起點是ColEl。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組微生物，其特征在于，含OmpF編碼基因的重組載體本身具有OmpF啟動子。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組微生物，其特征在于，含OmpF編碼基因的重組載體是pACYC-OmpF。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組微生物，其特征在于，OmpF編碼基因來源于五.co仏8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組微生物，其特征在于，重組微生物是五.co/z'。9.一種獲得目的蛋白的細(xì)胞外生產(chǎn)的方法，其特征在于，該方法包括的步驟是(a)根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的重組微生物，向微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基)分泌目的蛋白;和(b)從培養(yǎng)基中回收目的蛋白。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的目的蛋白在細(xì)胞外生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟(a)中的目的蛋白的細(xì)胞外分泌并不伴隨著微生物進(jìn)行裂解。11.一種重組載體通過將OmpF編碼基因引入含目的蛋白編碼基因載體構(gòu)成，并能夠向微生物的外周胞質(zhì)中表達(dá)和分泌目的蛋白，該重組載體，其特征在于，能夠共表達(dá)含OmpF編碼基因和目的蛋白編碼基因從而向微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基中)分泌目的蛋白。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組載體，其特征在于，該含OmpF編碼基因來源于E.co//.13.—種根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組載體轉(zhuǎn)化而來的微生物。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化微生物，其特征在于，的微生物是15.—種目的蛋白的細(xì)胞外生產(chǎn)的方法，其特征在于，該方法包括的步驟是(a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13或14的轉(zhuǎn)化微生物，向微生物細(xì)胞的外部(進(jìn)入培養(yǎng)基)分泌目的蛋白;和(b)從培養(yǎng)基中回收目的蛋白。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的目的蛋白的細(xì)胞外生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟(a)中的目的蛋白的細(xì)胞外分泌并不伴隨著微生物進(jìn)行裂解。全文摘要本發(fā)明涉及一種向細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌和生產(chǎn)目的蛋白的方法。更特別的是，本發(fā)明涉及與含E.coli外部膜蛋白F(OmpF)的重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化的微生物以及向細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌含目的蛋白的重組載體，同時，經(jīng)過培養(yǎng)微生物向細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌和生產(chǎn)目的蛋白的一種方法。根據(jù)本發(fā)明，該目的蛋白可以以不與其它蛋白融合的純態(tài)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中，因此使有效的分離和純化目的蛋白成為可能。文檔編號C12N15/70GK101223275SQ200580051085公開日2008年7月16日申請日期2005年7月15日優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日發(fā)明者崔鐘鉉,李相燁申請人:韓國科學(xué)技術(shù)院