專利名稱：：tRNA組合物和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及翻譯生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及制造tRNA的方法和tRNA組合物以及其用途。本發(fā)明還涉及使用所述tRNA和相關(guān)組合物在細(xì)胞中制造蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：從細(xì)菌到人類，每一種已知有機(jī)體的遺傳密碼都編碼相同的二十種常見(jiàn)氨基酸。這二十種相同天然氨基酸的不同組合形成進(jìn)行幾乎所有生命復(fù)雜過(guò)程(從光合作用到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng))的蛋白質(zhì)。為研究和改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，科學(xué)家們已嘗試操縱蛋白質(zhì)的遺傳密碼和氨基酸序列。然而，難以去除由遺傳密碼所強(qiáng)加的將蛋白質(zhì)局限于二十種遺傳編碼的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)單元(buildingblock)(其中極少見(jiàn)的特例為，硒代半胱氨酸(selenocysteine)(<列J(口參看A.Bock等人,(1991),MolecularMicrobiology5:515-20)和p比咯賴氨酸(pyrrolysine)(例如參看G.Srinivasan等人，(2002),Science296:1459-62))的約束。已取得一些進(jìn)展來(lái)去除這些約束，但這一進(jìn)展受到限制并且合理地控制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的能力仍不成熟。舉例來(lái)說(shuō)，化學(xué)家們已開(kāi)發(fā)出合成并且操縱小分子結(jié)構(gòu)的方法和策略(例如參看E.J.Corey,&X,M.Cheng,TheLogicofChemicalSynthesis(Wiley-Interscience,NewYork,1995))。全合成(例如參看B.Merrifield,(1986),Science232:341-7(1986))和半合成方法(例如參看D.Y.Jackson等人，(1994)Science266:243-7;和P.E.Dawson，&S.B.Kent,(2000),AnnualReviewofBiochemistry69:923-60)使得合成肽和小蛋白質(zhì)成為可能，但這些方法限制了10千道爾頓(kiloDalton,kDa)以上蛋白質(zhì)的效用。誘變方法盡管有效，但也局限于有限數(shù)量的結(jié)構(gòu)改變。在多種情況中，在整個(gè)蛋白質(zhì)中竟?fàn)幮圆⑷氤Ｒ?jiàn)氨基酸的結(jié)構(gòu)極其接近的類似物已成為可能。例如參看R.Furter,(1998),ProteinScience7:419-26;K.Kirshenbaum等人，(2002),ChemBioChem3:235-7;和V.Doring等人，(2001),Science292:501-4?；瘜W(xué)肽連接和天然化學(xué)連接描述于美國(guó)專利第6,184,344號(hào)、美國(guó)專利公開(kāi)案第2004/0138412號(hào)、美國(guó)專利公開(kāi)案第2003/0208046號(hào)、WO02/098902和WO03/04223中，這些專利都是以引用的方式并入本文中。Lu等人于MolCell.2001Oct;8(4):759-69中描述一種以化學(xué)方式將蛋白質(zhì)與含有非天然氨基酸的合成肽連接的方法(稱為蛋白質(zhì)連接)。早期的工作證實(shí)，大腸桿菌(￡.co/O的翻譯機(jī)器將容納結(jié)構(gòu)與常見(jiàn)二十種氨基酸類似的氨基酸。參看Hortin,G.和Boime,I.(1983)MethodsE歸mol.96:777-784。通過(guò)放寬內(nèi)源性大腸桿菌合成酶的特異性從而使其活化非天然氨基酸以及其同類天然氨基酸，使這項(xiàng)工作得以進(jìn)一步擴(kuò)充。此外，經(jīng)證實(shí)，也可以使用編輯域的突變來(lái)擴(kuò)充內(nèi)源性合成酶的底物范圍。參看Doring,V.等人，(2001)Science292:501-504。然而，這些策略局限于重新編碼遺傳密碼而非擴(kuò)展遺傳密碼，并且產(chǎn)生非天然氨基酸對(duì)常見(jiàn)二十種氨基酸中的一種的不同程度的取代。隨后證實(shí)，可通過(guò)將以化學(xué)方式氨?；恼荤暌种菩詔RNA加到活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中而在活體外將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地并入蛋白質(zhì)中。例如參看Noren，C.J.等人(1989)Science244:182-188;Bain，J.D.等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014;Dougherty,D.A.(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4，645-652;Cornish,V.W.等人(1995)Aneew.Chem.Int.Ed.34:621-633;J.A.Ellman等人，(1992),Science255:197-200;和D.Mendel等人，(1995),AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure24:435-462。這些研究表明，核糖體和翻譯因子可與大量非天然氨基酸、甚至具有不常見(jiàn)結(jié)構(gòu)的氨基酸相容。不幸的是，tRNA的化學(xué)氨?；茈y，并且這種方法的化學(xué)計(jì)量特性極大限制了能夠產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。已將非天然氨基酸顯微注射到細(xì)胞中。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)顯微注射以化學(xué)方式錯(cuò)酰基化的嗜熱四膜蟲(chóng)(Tetrahymenathermophila)tRNA(例如，M.E.Saks等人(1996)，爿"/roto>wsM/7pms^z'0",J.Biol.Chem.271:23169-23175)和相關(guān)mRNA而將非天然氨基酸引入爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopusoocyte)中的煙堿型乙酰膽堿受體中(例如，M.W.Nowak等人(1998),/"v/vofwcor/ora"cmtm福wra/歸/"o/wto/owc/zflfw"s,"Xe"o/附ooc,ex/my57'o"MethodEnzymol.293:504-529)。還參看D.A.Dougherty(2000),t/朋她m/"c/tfeow;ra6e51o/;ra/W"/ww"/ow,Curr.Opin.Chem.Biol.4:645-652和M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Science,268:439(1995)。將爪蟾卯母細(xì)胞與活體外制得的以下兩種RNA物質(zhì)共注射編碼在所關(guān)注的氨基酸位置處具有UAG終止密碼子的靶蛋白的mRNA,和經(jīng)所需非天然氨基酸氨?；溺暌种菩詔RNA。隨后所述卵母細(xì)胞的翻譯機(jī)器將非天然氨基酸插入U(xiǎn)AG指定的位置處。不幸的是，這種方法局限于細(xì)胞中可進(jìn)行顯微注射的蛋白質(zhì)，并且由于相關(guān)tRNA是在活體外以化學(xué)方式?；⑶覠o(wú)法再?；?，故蛋白質(zhì)的產(chǎn)率極低。為克服這些缺點(diǎn)，將新穎組件(例如，正交tRNA、正交氨?；鵷RNA合成酶和正交tRNA/正交氛?；鵷RNA合成酶對(duì))加到原核生物大腸桿菌(E^c/^n'c/z/aco//，五.co/z')(例如參看L.Wang等人，(2001),Science292:498-500)和真核生物釀酒酵母(Sacc/jra附少cesc，v/57'a，51.cwi^z'ae)(例如J.Chin等人,Science301:964-7(2003))的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器中，所述蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器能夠在活體內(nèi)將非遺傳編碼的氨基酸并入蛋白質(zhì)中。已使用這種方法響應(yīng)(例如)琥珀密碼子(TAG)以高保真度將多種具有新穎化學(xué)、物理或生物特性的新穎氨基酸有效地并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質(zhì)中，所述新穎氨基酸包括光親和標(biāo)記和光致異構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸(例如參看Chin,J.W.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024;和Chin,J.W.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮基氨基酸(例如參看Wang,L.等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:56-61和Zhang，Z.等人，5/oc/e附.42(22):6735-6746(2003))、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如參看J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem3(11):1135-1137和L.Wang,&P.G.Schultz,(2002)，Chem.Comm.,1:1-11。已報(bào)導(dǎo)若千其它正交對(duì)。已針對(duì)大腸桿菌中非天然氨基酸并入的可能性描述自釀酒酵母tRNA和合成酶獲得的谷氨酰胺?；?例如參看Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4780-4785)、天冬氨?；?例如參看Pastrnak,M.等人，(2000)Helv.Chim.Acta83:2277-2286)和酪氨?；?例如參看Ohno,S.等人，(1998)J.Biochem.(Tokvo,Jpn.)124:1065-1068;和Kowal,A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)系統(tǒng)。也已描述自大腸桿菌谷氨酰胺?；?例如參看Kowal,A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-227)和酪氨酰基(例如參看Edwards,H.和Schimmel,P.(19卯)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶獲得的系統(tǒng)以用于釀酒酵母中。已使用大腸桿菌酪氨酰基系統(tǒng)在活體內(nèi)將3-碘-L-酪氨酸并入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。參看Sakamoto,K.等人，(2002)NucleicAcidsRes.30:4692-4699。通常，這些系統(tǒng)都利用琥珀終止密碼子。為進(jìn)一步擴(kuò)展遺傳密碼，需要開(kāi)發(fā)生物合成機(jī)器(例如，tRNA)的經(jīng)改進(jìn)和/或額外組件。如在評(píng)估以下揭示內(nèi)容后將顯而易見(jiàn)，本發(fā)明滿足這些要求和其它要求。
發(fā)明內(nèi)容為擴(kuò)展遺傳密碼，本發(fā)明提供制造正交tRNA的組合物和方法。氨?；鵷RNA合成酶利用非天然編碼的氨基酸使本發(fā)明的tRNA氨酰基化。可使用這些翻譯組件響應(yīng)tRNA所識(shí)別的選擇性密碼子將所選氨基酸并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈(在核酸翻譯的過(guò)程中)的特定位置中。在細(xì)胞中制造在特定位置處具有所選氨基酸的蛋白質(zhì)的方法也為本發(fā)明的特征。舉例來(lái)說(shuō)，一種方法包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中使細(xì)胞生長(zhǎng)，其中所述細(xì)胞包含包括至少一個(gè)選擇性密碼子并且編碼蛋白質(zhì)的核酸；和提供所選氨基酸。所述細(xì)胞另外包含正交tRNA(O-tRNA)，其在細(xì)胞中起作用并且識(shí)別選擇性密碼子；和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)，其優(yōu)先利用所選氨基酸使O-tRNA氨?；?。通常，O-tRNA在存在同類合成酶的情況下包含抑制活性。由本方法制造的蛋白質(zhì)也為本發(fā)明的特征。圖1—繪示具有T>C莖干突變位點(diǎn)的J17tRNA的三葉草結(jié)構(gòu)；圖2—繪示使用J17或J17突變體(F12、F13、F14)進(jìn)行的人生長(zhǎng)激素中琥珀突變的抑制。通過(guò)SDSPAGE分析各樣本的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物；圖3—繪示在不同細(xì)胞系中使用F13進(jìn)行的人生長(zhǎng)激素中琥珀突變的抑制。具體實(shí)施方式定義在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)了解，本發(fā)明不限于特定生物系統(tǒng)，其當(dāng)然可以變化。還應(yīng)了解，本文所使用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述特定實(shí)施例的目的，并且不打算限制僅受隨附權(quán)利要求限制的本發(fā)明的范圍。除非另作明確指示，否則如本文和隨附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式"一"和"所述"包括多個(gè)參考物。因此，例如提及"一細(xì)胞，，包括兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞的組合并且包括所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物等。對(duì)"細(xì)菌，，的提及包括細(xì)菌的混合物等。除非本文和下文說(shuō)明書的剩余部分中另作定義，否則本文所使用的所有科技術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解相同的含義。本文所提及的所有公開(kāi)案和專利都是以引用的方式并入本文中以達(dá)到描述和揭示(例如)所述公開(kāi)案中所述的可能與當(dāng)前所述的發(fā)明結(jié)合使用的構(gòu)筑體和方法的目的。僅提供本文所討論的公開(kāi)案在本申請(qǐng)案申請(qǐng)日期之前的揭示內(nèi)容。本文在任何方面都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明者無(wú)權(quán)由于現(xiàn)有發(fā)明或任何其它原因使所述揭示案的日期提前。同源:當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和/或蛋白質(zhì)序列是天然或以人工方式從共同的祖先蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)序列得到時(shí)，其為"同源"的。類似地，當(dāng)核酸和/或核酸序列是天然或以人工方式從共同的祖先核酸或核酸序列得到時(shí)，其為"同源"的。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)任何可用的誘變方法來(lái)修飾任何天然存在的核酸以使其包括一個(gè)或一個(gè)以上選擇性密碼子。當(dāng)表達(dá)時(shí)，這一經(jīng)誘變核酸將編碼包含一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。當(dāng)然，突變方法可另外改變一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)密碼子，借此也使所得突變蛋白質(zhì)中的一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)氨基酸改變。可將所述一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)氨基酸變?yōu)榉翘烊话被峄蛱烊话被?。同源性一般是從兩種或兩種以上核酸或蛋白質(zhì)(或其序列)之間的序列相似性推斷得出。可用于確定同源性的序列之間相似性的確切百分比隨所討論的核酸和蛋白質(zhì)而變化，但通常使用僅25%的序列相似性確定同源性。較高的序列相似性水平(例如，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,或99%以上)也可用于確定同源性。測(cè)定序列相似性百分比的方法(例如，使用默認(rèn)參數(shù)的BLASTP和BLASTN)在本文中加以描述并且一般可用。正交:如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"正交，，是指以降低的效率被所關(guān)注的系統(tǒng)(例如，翻譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞)使用的分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS))。正交是指正交tRNA和/或正交RS無(wú)法在所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中起作用或以降低的效率(例如，低于20%的效率、低于10%的效率、低于5%的效率或例如低于1%的效率)在所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中起作用。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)與通過(guò)內(nèi)源性RS使內(nèi)源性tRNA氨酰基化相比較時(shí)，所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中的任何內(nèi)源性RS以降低的效率或甚至為零的效率使所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA氨酰基化。在另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)與通過(guò)內(nèi)源性RS使內(nèi)源性tRNA氨?；啾容^時(shí)，正交RS以降低的效率或甚至為零的效率使所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中的任何內(nèi)源性tRNA氨?；?。可將第二正交分子引入細(xì)胞中從而與第一正交分子一起作用。舉例來(lái)說(shuō)，正交tRNA/RS對(duì)包括所引入的在細(xì)胞中相對(duì)于相應(yīng)內(nèi)源性tRNA/RS對(duì)以一定效率(例如，約50%效率、約60%效率、約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約卯％效率、約95%效率或約99%或更高效率)一起作用的互補(bǔ)組件。"正交性的改進(jìn)"是指與原材料或天然存在的tRNA或RS相比正交性增強(qiáng)。同類物:術(shù)語(yǔ)"同類物"是指一起作用的組件，例如tRNA和氨酰基tRNA合成酶。所述組件也可稱為互補(bǔ)體。優(yōu)先氨?；?術(shù)語(yǔ)"優(yōu)先氨?；?是指與O-RS使天然存在的tRNA或用于產(chǎn)生O-tRNA的原材料氨酰基化相比，O-RS利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使O-tRNA氨?；男剩缂s70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約卯％效率、約95%效率或約99%或更高效率。隨后將非天然氨基酸以高保真度(例如)以對(duì)指定選擇性密碼子大于約70%的效率、對(duì)指定選擇性密碼子大于約75%的效率、對(duì)指定選擇性密碼子大于約80%的效率、對(duì)指定選擇性密碼子大于約85%的效率、對(duì)指定選擇性密碼子大于約90%的效率、對(duì)指定選擇性密碼子大于約95%的效率或?qū)χ付ㄟx擇性密碼子大于約99%的效率并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈中。選擇性密碼子:術(shù)語(yǔ)"選擇性密碼子"是指在翻譯過(guò)程中由O-tRNA識(shí)別且不被內(nèi)源性tRNA識(shí)別的密碼子。O-tRNA反密碼子環(huán)識(shí)別mRNA上的選擇性密碼子并且在多肽中的這一位點(diǎn)并入其氨基酸，例如所選氨基酸，諸如非天然氨基酸。選擇性密碼子可例如包括(但不限于)無(wú)義密碼子，諸如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子；四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子；稀有密碼子；自天然或非天然堿基對(duì)獲得的密碼子等。對(duì)于指定系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，選擇性密碼子也可以包括天然的三堿基密碼子中的一種，其中內(nèi)源性系統(tǒng)不使用(或極少使用)所述天然的三堿基密碼子。舉例來(lái)說(shuō)，這包括缺乏識(shí)別天然的三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)，和/或天然的三堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。抑制性tRNA:抑制性tRNA是(例如)通過(guò)提供響應(yīng)選擇性密碼子將氨基酸并入多肽鏈的機(jī)制來(lái)改變指定翻譯系統(tǒng)中信使RNA(mRNA)的閱讀的tRNA。舉例來(lái)說(shuō)，抑制性tRNA可通讀包括(但不限于)終止密碼子、四堿基密碼子或稀有密碼子的密碼子。抑制活性:術(shù)語(yǔ)"抑制活性"是指tRNA(例如，抑制性tRNA)通讀選擇性密碼子的能力?；钚钥梢援?dāng)與對(duì)照(例如缺乏同類合成酶)相比時(shí)所觀察到的活性百分比表示。翻譯系統(tǒng):術(shù)語(yǔ)"翻譯系統(tǒng)，，是指將天然存在的氨基酸并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈(蛋白質(zhì))所需的組件。翻譯系統(tǒng)的組件可包括(例如)核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發(fā)明的組件可加到活體外或活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中。翻譯系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)非真核細(xì)胞，例如細(xì)菌(諸如，大腸桿菌)；真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞；無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞溶解產(chǎn)物等。翻譯系統(tǒng)可為細(xì)胞翻i奪系統(tǒng)或無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，且可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。細(xì)胞翻i奪系統(tǒng)包括(但不限于)所需核酸序列可轉(zhuǎn)錄成mRNA且所述mRNA可經(jīng)翻譯的全細(xì)胞制劑，諸如透性化細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可為市售，且眾所周知許多不同的類型和系統(tǒng)。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)原核生物溶解產(chǎn)物(諸如大腸桿菌溶解產(chǎn)物)和真核生物溶解產(chǎn)物(諸如麥芽提取物)、昆蟲(chóng)細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔卵母細(xì)胞溶解產(chǎn)物和人類細(xì)胞溶解產(chǎn)物。當(dāng)所得蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化、磷酸化或另外經(jīng)修飾時(shí)，由于許多所述修飾僅可能在真核生物系統(tǒng)中，故可優(yōu)選真核生物提取物或溶解產(chǎn)物。這些提取物和溶解產(chǎn)物中的一些可為市售(Promega;Madison,Wis.;Stratagene;LaJolla,Calif.;Amersham;ArlingtonHeights,111.;GIBCO/BRL;GrandIsland,N.Y.)。可用于翻譯分泌型蛋白質(zhì)的膜提取物(諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)也可用。也可使用重建的翻譯系統(tǒng)。也已成功地使用純翻譯因子的混合物將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)以及溶解產(chǎn)物或補(bǔ)充有純翻譯因子的溶解產(chǎn)物的組合，所述純翻譯因子諸如起始因子-1(IF-l)、IF-2、IF-3(a或p)、延長(zhǎng)因子T(EF-Tu)或終止因子。還可使無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)與轉(zhuǎn)錄/翻i爭(zhēng)系統(tǒng)偶聯(lián)，其中如Cwrre"r尸ra/oco/sZ"Mo/ea//ar歷o/ogy(RM.Ausubel等人編，WileyInterscience,1993)(其是以引用的方式清楚地并入本文)中所述，將DNA引入所述系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄成mRNA且翻譯所述mRNA。在真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的RNA可為異核RNA(hnRNA)或5'端帽子(7-甲基鳥(niǎo)苷)和3'端聚A尾成熟mRNA的形式，此可為某些翻譯系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。舉例來(lái)說(shuō)，在網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解系統(tǒng)中以高效率翻譯經(jīng)封端mRNA。所選氨基酸:術(shù)語(yǔ)"所選氨基酸"是指任何所需的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"非天然氨基酸"或"非天然編碼的氨基酸"是指不為20種常見(jiàn)的天然存在的氨基酸中的一種或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的任何氨基酸、經(jīng)修飾氨基酸和/或氨基酸類似物?？梢耘c術(shù)語(yǔ)"非天然編碼的氨基酸"和"非天然氨基酸(unnaturalaminoacid)，，以相同意義4吏用的其它術(shù)語(yǔ)為"非天然氨基酸("non-naturalaminoacid")"、"非天然存在的氨基酸，，和其各種以連字符連接和不以連字符連接的型式。術(shù)語(yǔ)"非天然編碼的氨基酸"還包括(但不限于)通過(guò)對(duì)天然編碼的氨基酸(包括但不限于，20種常見(jiàn)氨基酸或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)進(jìn)行修飾(例如，翻譯后修飾)而產(chǎn)生但其本身未通過(guò)翻譯復(fù)合物天然并入到正在生長(zhǎng)的多肽鏈中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的實(shí)例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-蘇氨酸和O-磷酸酪氨酸。自......獲得:如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"自......獲得，，是指從特定分子或有機(jī)體分離或使用來(lái)自特定分子或有機(jī)體的信息制得的組件。陽(yáng)性選擇或篩選標(biāo)記:如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"陽(yáng)性選擇或篩選標(biāo)記"是指當(dāng)存在(例如，經(jīng)表達(dá)、經(jīng)活化等)時(shí)導(dǎo)致鑒別具有陽(yáng)性選擇標(biāo)記的細(xì)胞與不具有陽(yáng)性選擇標(biāo)記的細(xì)胞的標(biāo)記。陰性選擇或篩選標(biāo)記:如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"陰性選擇或篩選標(biāo)記"是指當(dāng)存在(例如，經(jīng)表達(dá)、經(jīng)活化等)時(shí)允許鑒別不具有所需特性(例如，當(dāng)與具有所需特性的細(xì)胞相比較時(shí))的細(xì)胞的標(biāo)記。報(bào)告基因:如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"報(bào)告基因，，是指可用于選擇所關(guān)注的系統(tǒng)中的靶組件的組件。舉例來(lái)說(shuō)，報(bào)告基因可包括蛋白質(zhì)，例如賦予抗生素抗性或敏感性的酶(包括但不限于，(3-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等)、焚光篩選標(biāo)記(包括但不限于，綠色熒光蛋白質(zhì)(例如GFP)、YFP、EGFP、RFP)、發(fā)光標(biāo)記(包括但不限于，螢火蟲(chóng)熒光素酶蛋白)、基于親和力的篩選標(biāo)記或陽(yáng)性或陰性選擇標(biāo)記基因(諸如lacZ、p-gal/lacZ(p-半乳糖苷酶)、ADH(醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2等)。真核生物:如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"真核生物"是指屬于系統(tǒng)發(fā)育真核生物領(lǐng)域的有機(jī)體，諸如動(dòng)物(包括但不限于，哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類等)、纖毛蟲(chóng)、植物(包括但不限于，單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲(chóng)、小孢子蟲(chóng)、原生生物等。非真核生物:如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"非真核生物"是指非真核有機(jī)體。舉例來(lái)說(shuō)，非真核有機(jī)體可屬于系統(tǒng)發(fā)育真細(xì)菌領(lǐng)域(包括但不限于，大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌(77iemm"/erwop/2//i^)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(j5"c/〃mWearof/zermop/^7i^)、熒光假單胞菌(i^ei/ifomowawy/i/orescews)、銅纟錄4艮單月包菌(i^ewt/owowasaerwg/"oyfl)、，惡臭JFi單月包菌(尸"wdowomw)等)或系統(tǒng)發(fā)育古細(xì)菌領(lǐng)域(例如詹氏曱烷球菌(Mw/w"ococcw;y_/a7wasc/7);嗜熱自養(yǎng)曱烷桿菌(JW""/a"o6a"en'wwAer附oaw/Wra/)/z/c"w);嗜鹽古菌(//a/o6acren'wm),-諸如沃氏嗜鹽富饒菌(//a/o/emxvo/cam7)和嗜鹽古菌NRC-1(//a/o6a"en'w附speciesiViC-J);閃爍古生3求菌(v4rc/aeog/oZ)Ms/"/g/dws);強(qiáng),勁、火5求菌(尸戶cocc"51/w〃'osi^);掘越氏熱球菌(戶戸coccw);嗜熱泉生古細(xì)菌(_perw/jc)等)。保守變異體:術(shù)語(yǔ)"保守變異體"是指在功能上與得到保守變異體的組件(例如O-tRNA或O-RS)類似但序列變異的翻譯組件，例如保守變異體O-tRNA或保守變異體O-RS。舉例來(lái)說(shuō)，O-RS將利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使互補(bǔ)O-tRNA或保守變異體O-tRNA氨酰基化，但所述O-tRNA和所述保守變異體O-tRNA不具有相同序列。類似地，可通過(guò)互補(bǔ)O-RS或保守變異體O-RS利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使tRNA氨?；?，但所述O-RS和所述保守變異體O-RS不具有相同序列。保守變異體的序列可具有(例如)一處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或五處或五處以上變異，只要保守變異體與相應(yīng)O-tRNA或O-RS互補(bǔ)即可。選擇或篩選劑:如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"選擇或篩選劑"是指當(dāng)存在時(shí)允許從群體中選擇/篩選某些組件的試劑。舉例來(lái)說(shuō)，選擇或篩選劑例如包括(但不限于)養(yǎng)分、抗生素、光波長(zhǎng)、抗體、經(jīng)表達(dá)聚核苷酸等。選擇劑的(例如)濃度、強(qiáng)度等可變化。術(shù)語(yǔ)"未有效識(shí)別，，是指來(lái)自一種有機(jī)體的RS使O-tRNA氨?；男?例如)小于約10%、小于約5%或小于約1%。適于制造包括一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)已描述于名稱為"METHODSANDCOMPOSITIONFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALtRNA-AMINOACYLtRNASYNTHETASEPAIRS"的美國(guó)專利申請(qǐng)案10/126,931和名稱為"INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS.，，的10/126,927中。此外，參看名稱為"EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE"的USSN10/825,867。這些申請(qǐng)案的每一個(gè)都是以全文引用的方式并入本文。所述翻i奪系統(tǒng)一般包含包括正交tRNA(O-tRNA)、正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)和所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的細(xì)胞，其中O-RS利用所選氨基酸使O-tRNA氨酰基化。本發(fā)明的正交對(duì)由O-tRNA(例如，抑制性tRNA、移碼tRNA等)和O-RS構(gòu)成。O-tRNA識(shí)別第一選擇性密碼子并且在存在同類合成酶的情況下響應(yīng)選擇性密碼子而具有抑制活性。細(xì)胞使用所述組件將所選氨基酸并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈中。舉例來(lái)說(shuō)，也可存在包含編碼所關(guān)注的多肽的聚核苦酸的核酸，其中所述聚核苷酸包含由O-tRNA識(shí)別的選擇性密碼子。翻譯系統(tǒng)也可以是活體外系統(tǒng)。本發(fā)明的tRNA分子可用于任何翻譯系統(tǒng)中，包括在翻譯中利用核糖體的系統(tǒng)。翻譯系統(tǒng)也可為無(wú)細(xì)胞(活體外)翻譯系統(tǒng)。在可包括mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(活體外轉(zhuǎn)錄與翻譯的組合)的這些系統(tǒng)中，活體外合成是由核糖體指導(dǎo)。已將相當(dāng)多的努力用于開(kāi)發(fā)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中。例如參看Kim,D.M.禾口J.R.Swartz,5z'o&c/mo/ogyawJ5/oewg/ween.wg,74:309-316(2001);Kim,D.M.和J.R.Swartz,說(shuō)她c/mo/ogy丄",eny，22,1537-1542,(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz,B/o&c/mo/ogy尸ragrew,16,385-390,(2000);Kim,D.M.禾口J.R.Swartz，5〖o(jì)&c/mo/ogy萬(wàn)/畫g/廳"'wg，66,180-188，(1999);和Patnaik,R.和J.R.Swartz,飾/e由z々腦24，862-868，(1998);美國(guó)專利第6,337,191號(hào)；美國(guó)專利公開(kāi)案第2002/0081660號(hào)；WO00/55353;WO卯/05785，所述專利文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文?？蓱?yīng)用的另一種方法包括mRNA-肽融合技術(shù)。例如參看R.Roberts和J.Szostak,戶rac.Ato/^cad(T7&4)94:12297-12302(1997);A.Frankel等人，C/^附&^ycfe祝o/ogy10:1043-1050(2003)。以本方法，在核糖體上將與噤呤霉素連接的mRNA模板翻譯成肽。如果已對(duì)一個(gè)或一個(gè)以上tRNA分子進(jìn)行修飾，那么也可將非天然氨基酸并入肽中。閱讀最后一個(gè)mRNA密碼子后，噤呤霉素將俘獲肽的C端。如果在活體外檢定中發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽連結(jié)物具有引人關(guān)注的特性，那么可輕易地從mRNA序列揭示其身份。以此方式，可篩選包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼的氨基酸的多肽的文庫(kù)以鑒別具有所需特性的多肽。目前，據(jù)報(bào)導(dǎo)，以純組件進(jìn)行的活體外核糖體翻譯將允許合成經(jīng)非天然編碼的氨基酸取代的肽。例如參看A.Forster等人，Prac.iVa"爿co^.Sc/.(77&i)100:6353(2003)。在某些實(shí)施例中，包含本發(fā)明的tRNA的大腸桿菌細(xì)胞包括所述翻譯系統(tǒng)。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的大腸桿菌細(xì)胞包括正交tRNA(O-tRNA)，其中所述O-tRNA在存在同類合成酶的情況下響應(yīng)選擇性密碼子而包含抑制活性；正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS);所選氨基酸；和核酸，其包含編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含由O-tRNA識(shí)別的選擇性密碼子。本發(fā)明還在細(xì)胞中提供多個(gè)O-tRNA/0-RS對(duì)，其允許并入一個(gè)以上所選氨基酸。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞可另外包括另一不同的O-tRNA/0-RS對(duì)和第二所選氨基酸，其中所述O-tRNA識(shí)別第二選擇性密碼子并且所述O-RS優(yōu)先利用第二所選氨基酸使O-tRNA氨?；Ｅe例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞可另外包含(例如)自詹氏曱烷球菌的酪氨?；鵷RNA合成酶獲得的琥珀抑制性tRNA-氨?；鵷RNA合成酶對(duì)。O-tRNA和/或O-RS可天然存在或者可通過(guò)來(lái)自多種有機(jī)體的天然存在的tRNA和/或RS的突變(例如，其產(chǎn)生tRNA文庫(kù)和/或RS文庫(kù))得到。舉例來(lái)說(shuō)，制造正交tRNA/氨?；鵷RNA合成酶對(duì)的一種策略涉及將來(lái)自(例如)除宿主細(xì)胞外的其它來(lái)源或多種來(lái)源的異源tRNA/合成酶對(duì)輸入宿主細(xì)胞中。異源合成酶候選物的特性包括(例如)其不負(fù)載任何宿主細(xì)胞tRNA,并且異源tRNA候選物的特性包括(例如)其不經(jīng)任何宿主合成酶氨?；４送?，異源tRNA與所有宿主細(xì)胞合成酶正交。產(chǎn)生正交對(duì)的另一種策略涉及產(chǎn)生突變體文庫(kù)以篩選和/或選擇O-tRNA或O-RS。這些策略也可以組合。在各種實(shí)施例中，O-tRNA和O-RS是自至少一種有機(jī)體獲得。在另一個(gè)實(shí)施例中，O-tRNA是自第一有機(jī)體的天然存在或突變的天然存在的tRNA獲得，并且O-RS是自第二有機(jī)體的天然存在或突變的天然存在的RS獲得。在一個(gè)實(shí)施例中，第一有機(jī)體與第二有機(jī)體不同。舉例來(lái)說(shuō)，正交對(duì)可包括自嗜熱自養(yǎng)曱烷桿菌獲得的tRNA合成酶和自古細(xì)菌tRNA(例如，自嗜鹽古菌NRC-1)荻得的tRNA?；蛘?，第一有機(jī)體與第二有機(jī)體相同。參看本文中標(biāo)題為"來(lái)源和宿主有機(jī)體，，的章節(jié)以得到額外信息。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，本發(fā)明的O-tRNA包含如SEQIDNO.:1、2或3中所述的聚核苷酸序列或其互補(bǔ)聚核苷酸序列或其保守變異體，或由所述聚核苷酸序列或其互補(bǔ)聚核脊酸序列或其保守變異體編碼。也參看本文中標(biāo)題為"核酸和多肽序列和變異體"的章節(jié)。正交tRNA(O-tRNA)正交tRNA(O-tRNA)介導(dǎo)(例如)活體內(nèi)或活體外將所選氨基酸并入由包含經(jīng)O-tRNA識(shí)別的選擇性密碼子的聚核普酸編碼的蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)任何方法或技術(shù)(包括但不限于，化學(xué)或酶促氨酰基化方法)利用所需氨基酸使本發(fā)明的O-tRNA氨?；?。本發(fā)明的氨酰基化O-tRNA可直接加到翻譯系統(tǒng)中。可在活體外或活體內(nèi)利用所選氨基酸通過(guò)RS使本發(fā)明的O-tRNA氨?；?。此外，RS可為O-RS?？蓪⒈景l(fā)明的O-tRNA直接提供到翻i奪系統(tǒng)(例如，活體外翻譯組件，或細(xì)胞)中，或通過(guò)提供編碼O-tRNA或其部分的聚核普酸將其提供到翻譯系統(tǒng)中。舉例來(lái)說(shuō)，O-tRNA或其部分是由如SEQIDNO.:l、2、3中所述的聚核苷酸序列或其互補(bǔ)聚核苷酸序列或其保守變異體編碼。本發(fā)明的O-tRNA在存在同類合成酶的情況下響應(yīng)選擇性密碼子而包含抑制活性。抑制活性可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的多種檢定中的任一種來(lái)測(cè)定。舉例來(lái)說(shuō)，可使用P-半乳糖苷酶報(bào)告基因檢定。使用在啟動(dòng)子控制下表達(dá)lacZ基因的質(zhì)粒的衍生物，例如，其中l(wèi)acZ的肽VVLQRRDWEN中的Leu-25經(jīng)選擇性密碼子(例如，TAG、TGA、AGGA等密碼子，或酪氨酸、絲氨酸、亮氨酸等的有義密碼子(作為對(duì)照))置換。將衍生化的lacZ質(zhì)粒以及包含本發(fā)明的O-tRNA的質(zhì)粒引入來(lái)自適當(dāng)有機(jī)體(例如，可使用正交組件的有機(jī)體)的細(xì)胞中。還可引入同類合成酶(當(dāng)表達(dá)時(shí)作為編碼同類合成酶的多肽或聚核苷酸)。使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到所需密度(例如，達(dá)到約0.5的OD600)，并且例如使用BetaFluorp-半乳糖苷酶檢定試劑盒(Novagen)進(jìn)行p-半乳糖苷酶檢定。以樣本相對(duì)于可比較對(duì)照(例如，由衍生化lacZ構(gòu)筑體觀察得到的值)的活性百分比計(jì)算抑制百分比，其中所述構(gòu)筑體在所禽位置處具有相應(yīng)的有義密碼子而非選擇性密碼子。在tRNA分子中，胸腺嘧啶(T)經(jīng)尿嘧啶(U)置換。此外，可存在對(duì)堿基的其它修飾。本發(fā)明還包括O-tRNA的保守變異體。舉例來(lái)說(shuō)，O-tRNA的保守變異體包括與O-tRNA功能類似并且保持tRNA的L形結(jié)構(gòu)但不具有相同序列的分子(且為除野生型tRNA分子之外的分子)。也參看本文中標(biāo)題為"核酸和多肽序列以及變異體"的章節(jié)。包含O-tRNA的組合物可另外包括正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS),其中所述O-RS優(yōu)先利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使O-tRNA氨酰基化。在某些實(shí)施例中，包括O-tRNA的組合物可另外包括翻譯系統(tǒng)(例如，活體外或活體內(nèi)翻譯系統(tǒng))。細(xì)胞或其它翻譯系統(tǒng)中也可存在包含編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸的核酸，其中所述聚核苷酸包含一個(gè)或一個(gè)以上由O-tRNA識(shí)別的選擇性密碼子，或一個(gè)或一個(gè)以上所述密碼子的組合。也參看本文中標(biāo)題為"正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)"的章節(jié)。制造正交tRNA(O-tRNA)(例如，O-tRNA)的方法也為本發(fā)明的特征。由所迷方法制造的tRNA(例如，O-tRNA)也為本發(fā)明的特征。制造正交tRNA的方法包括使tRNA池中的每一tRNA的反密碼子環(huán)突變以允許識(shí)別選擇性密碼子(例如，琥珀密碼子、蛋白石密碼子、四堿基密碼子等)，借此提供多個(gè)潛在的O-tRNA;并且分析所述多個(gè)潛在O-tRNA的成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)以鑒別二級(jí)結(jié)構(gòu)中的非規(guī)范堿基對(duì)；且視情況使所述非規(guī)范堿基對(duì)突變(例如，使非規(guī)范堿基對(duì)突變?yōu)橐?guī)范堿基對(duì))。非規(guī)范堿基對(duì)可位于二級(jí)結(jié)構(gòu)的莖干區(qū)中。O-tRNA可具有一種或一種以上特征或活性的改進(jìn)(諸如與原材料(例如，多個(gè)tRNA序列)相比對(duì)于所需有機(jī)體的正交性的改進(jìn))，而同時(shí)保持其對(duì)所需RS的親和力?；蛘撸赏ㄟ^(guò)使已知tRNA突變以調(diào)節(jié)其與一個(gè)或一個(gè)以上影響翻譯或作為翻譯機(jī)器組件的分子的相互作用或與所述分子的結(jié)合親和力來(lái)產(chǎn)生O-tRNA。所述組件包括(但不限于)延長(zhǎng)因子。細(xì)菌延長(zhǎng)因子EF-Tu對(duì)于蛋白質(zhì)合成中的延長(zhǎng)步驟起到關(guān)鍵作用。在tRNA合成酶使tRNA氨酰基化后，EF-Tu結(jié)合氨?；膖RNA并且將其帶到核糖體的A位點(diǎn)。帶電氨基酸與tRNA之間的酯鍵因EF-Tu與氨?；痶RNA之間的結(jié)合而避免發(fā)生自發(fā)水解。Stortchevoi等人已對(duì)大腸桿菌起始tRNA艦et的T^/C莖千中的U50:G64擺動(dòng)堿基對(duì)的突變體進(jìn)行研究，這是因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)這一堿基對(duì)是在延長(zhǎng)過(guò)程中阻斷tRNA活性的二級(jí)負(fù)決定因子(secondarynegativedeterminant),推測(cè)這是由EF-Tu.GTP與氨?；痶RNA之間減弱的相互作用引起(JBC2003278(20):17672-17679)。同樣，LaRiviere等人于Science,2001年10月5日；294(5540):165-8中描述氨基酸和tRNA主體對(duì)與EF-Tu的總結(jié)合親和力的熱動(dòng)力學(xué)貢獻(xiàn)。其表明，tRNA主體和氨基酸的貢獻(xiàn)彼此無(wú)關(guān)，并且當(dāng)tRNA經(jīng)正確?；瘯r(shí)，所述tRNA主體與所述氨基酸彼此補(bǔ)償。EF-Tu.GTP與經(jīng)非天然氨基酸氨?；膖RNA之間相互作用的改變可能影響將tRNA負(fù)載到核糖體A位點(diǎn)的效率。也可以通過(guò)分析tRNA與翻譯沖幾器其它組件(諸如EF-Tu)的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)現(xiàn)潛在的突變位點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，Nissen等人已指出，EF-Tu.GTP與酵母苯丙氨酰基轉(zhuǎn)移RNA(Phe-tRNA)的TyC莖干的磷酸主鏈直接結(jié)合(Science1995270(5241):1464-1472)。所述方法;現(xiàn)情況包括分析tRNA和/或氨酰基tRNA合成酶的序列的同源性以確定似乎對(duì)于特定有機(jī)體正交的O-tRNA、O-RS和/或O-tRNA/O-RS對(duì)的潛在候選物。所屬領(lǐng)域中已知并且本文描述的計(jì)算機(jī)程序可用于所述分析。在一個(gè)實(shí)例中，為選擇用于原核有機(jī)體中的潛在正交翻譯組件，選擇不顯示與原核有機(jī)體的異常同源性的合成酶和/或腦A。還可以通過(guò)一致性策略制造tRNA池。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)比對(duì)多個(gè)tRNA序列；確定一致序列；并且使用所述一致序列的至少一部分、大部分或全部產(chǎn)生tRNA文庫(kù)來(lái)制造tRNA池。舉例來(lái)說(shuō)，可用計(jì)算機(jī)程序(例如，GCG程序/z7ew/)來(lái)編譯一致序列。視情況，將由所述程序所測(cè)定的簡(jiǎn)并位置變?yōu)樗鑫恢锰幍淖畛Ｒ?jiàn)堿基。文庫(kù)是通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)使用一致序列合成。舉例來(lái)說(shuō)，可使用寡核苷酸的重疊延伸提供基于一致序列的文庫(kù)，其中tRNA基因的各個(gè)位點(diǎn)可合成為卯％—致序列與10%其它三堿基混合物的摻雜混合物。也可以使用其它混合物，例如75%—致序列和25%其它三堿基混合物；80%—致序列和20%其它三堿基混合物；95%—致序列和5%其它三堿基混合物等。突變體tRNA文庫(kù)可使用所屬領(lǐng)域中已知的各種誘變技術(shù)產(chǎn)生。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸式誘變方法、嵌合構(gòu)建或其任何組合產(chǎn)生突變體tRNA?？蓪⑵渌蛔円雝RNA的所需環(huán)或區(qū)域(例如，反密碼子環(huán)、受體莖干、D臂或環(huán)、可變環(huán)、Tv)/C臂或環(huán)、tRNA分子的其它區(qū)域或其組合)中的特定位置(例如，非保守性位置或保守性位置、隨機(jī)位置或其組合)處。突變可包括在莖千區(qū)中相配的堿基對(duì)。通常，通過(guò)使第一物種的細(xì)胞群體經(jīng)歷陰性選擇來(lái)獲得O-tRNA，其中所述細(xì)胞包含多個(gè)潛在O-tRNA中的成員。陰性選擇將除去包含經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性氨?；鵷RNA合成酶(RS)氨酰基化的多個(gè)潛在O-tRNA的成員的細(xì)胞。這提供與第一物種的細(xì)胞正交的tRNA池。在陰性選擇的某些實(shí)施例中，將選擇性密碼子引入編碼陰性選擇標(biāo)記(例如，賦予抗生素抗性的酶，例如p-內(nèi)酰胺酶；賦予可檢測(cè)的產(chǎn)物的酶，例如J3-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT);例如在非必需位置處的有毒產(chǎn)物，諸如bamase等)的聚核苷酸中。篩選/選擇可通過(guò)使細(xì)胞群體在存在選擇劑(例如，抗生素，諸如氨比西林(ampicillin))的情況下生長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇劑的濃度可變化。舉例來(lái)說(shuō)，為測(cè)量抑制性tRNA的活性，使用基于選擇性密碼子的活體內(nèi)抑制(例如，引入編碼陰性選擇標(biāo)記(例如，)3-內(nèi)酰胺酶的基因(Wa))的聚核香酸中的無(wú)義或移碼突變)的選擇系統(tǒng)。舉例來(lái)說(shuō)，構(gòu)建在一定位置(即某一位置)處具有(例如)TAG、AGGA和TGA的聚核苷酸變異體，例如Wa變異體。用這些聚核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞(例如，細(xì)菌)。在無(wú)法被內(nèi)源大腸桿菌合成酶有效負(fù)載的正交tRNA的情況中，抗生素抗性(例如，氨比西林抗性)應(yīng)與不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的抗性類似或比不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的抗性低。如果tRNA不為正交tRNA，或者如果在所述系統(tǒng)中共表達(dá)能夠負(fù)載tRNA的異源合成酶，那么將觀察到較高水平的抗生素(例如，氨比西林)抗性。選擇在與不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞大致相同的抗生素濃度下無(wú)法在LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)胞，例如細(xì)菌。在有毒產(chǎn)物(例如，核糖核酸酶barnase)的情況中，當(dāng)通過(guò)內(nèi)源宿主(例如，大腸桿菌)合成酶(即，其不與宿主正交，例如大腸桿菌合成酶)使多個(gè)潛在tRNA中的成員氨酰基化時(shí)，選擇性密碼子受抑制并且所產(chǎn)生的有毒的聚核苷酸產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞死亡。具有正交tRNA或非功能性tRNA的細(xì)胞存活。在一個(gè)實(shí)施例中，隨后使與所需有機(jī)體正交的tRNA池經(jīng)歷陽(yáng)性選擇，其中選擇性密碼子放入(例如)由藥物抗性基因(諸如(3-內(nèi)酰胺酶基因)編碼的陽(yáng)性選擇標(biāo)記中。陽(yáng)性選擇是對(duì)包含編碼或包含tRNA池的成員的聚核苷酸、編碼陽(yáng)性選擇標(biāo)記的聚核普酸和編碼同類RS的聚核苷酸的細(xì)胞進(jìn)行。這些聚核苷酸都在所述細(xì)胞中表達(dá)，并且所述細(xì)胞是在存在選擇劑(例如，氨比西林)的情況下生長(zhǎng)。隨后，針對(duì)tRNA經(jīng)共表達(dá)的同類合成酶氨?；⑶翼憫?yīng)此選擇性密碼子插入氨基酸的能力來(lái)選擇tRNA。通常，與具有非功能性tRNA或無(wú)法被所關(guān)注的合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞展現(xiàn)出抑制效率的增強(qiáng)。具有非功能性tRNA或不被所關(guān)注的合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞對(duì)抗生素敏感。因此，以下tRNA在兩種選擇下都存活(i)不為內(nèi)源宿主(諸如，大腸桿菌)合成酶的底物的tRNA;(ii)可經(jīng)所關(guān)注的合成酶氨?；膖RNA;和(iii)在翻譯過(guò)程中起作用的tRNA。在上述方法中，選擇(例如，陽(yáng)性選擇、陰性選擇或陽(yáng)性選擇與陰性選擇)的嚴(yán)格度視情況可變化。舉例來(lái)說(shuō)，由于barnase為劇毒蛋白質(zhì)，故陰性選擇的嚴(yán)格度可通過(guò)將不同數(shù)量的選擇性密碼子引入barnase基因中和/或通過(guò)使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來(lái)控制。在另一個(gè)實(shí)例中，選擇劑或篩選劑(例如氨比西林)的濃度可變化。一方面，由于在早期回合中所需活性較低，故嚴(yán)格度是變化的。因此，在早期回合中應(yīng)用較低嚴(yán)格度的選擇標(biāo)準(zhǔn)并且在隨后的選擇回合中應(yīng)用較高嚴(yán)格度的標(biāo)準(zhǔn)。在某些實(shí)施例中，陰性選擇、陽(yáng)性選擇或陰性選擇和陽(yáng)性選擇可重復(fù)多次。可使用多種不同的陰性選擇標(biāo)記、陽(yáng)性選擇標(biāo)記或陰性選擇和陽(yáng)性選擇標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，陽(yáng)性選擇標(biāo)記與陰性選擇標(biāo)記可相同?？蓪⑵渌愋偷倪x擇/篩選用于本發(fā)明中以制造正交翻譯組件，例如O-tRNA、O-RS和0-tRNA/O-RS對(duì)。舉例來(lái)說(shuō)，陰性選擇標(biāo)記、陽(yáng)性選擇標(biāo)記或陽(yáng)性選擇標(biāo)記和陰性選擇標(biāo)記可包括發(fā)熒光或在存在適當(dāng)反應(yīng)物的情況下催化發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記。在另一實(shí)施例中，標(biāo)記的產(chǎn)物是通過(guò)焚光活化細(xì)胞揀選(FACS)或通過(guò)發(fā)光來(lái)檢測(cè)。視情況，標(biāo)記包括基于親和力的篩選標(biāo)記。參看Francisco,J.A.等人，(1993)/V(k/wc"(W朋dT^ag附e"/1o"*gx&r""/ProcNatlAcadSciUSA.90:10444-8。制造重組正交tRNA的其它方法可見(jiàn)于(例如)名稱為"MethodsandCompositionsfortheProductionofOrthogonaltRNA-AminoacyltRNASynthetasePairs，，的美國(guó)專利申i青案10/126,93和名稱為"InvivoIncorporationofUnnaturalAminoAcids"的10/126,127以及名稱為"EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE."的USSN10/825,867中。也參看Forster等人,(2003)iVogra附w/wgpe/7/7V/o附/we"csyw^e/ases6>>frcms/a^/"ggewef/ccod"c^一c/tfe腳o.PNAS100(11):6353-6357;和Feng等人，(2003),五;c，必wg爵jrecogmY/cmo/"^/iV/4>syw*toeZy"w'"g/e"w/woc/wnge,PNAS100(10):5676-5681?？赏ㄟ^(guò)任何方法或技術(shù)(包括但不限于，化學(xué)或酶促氨?；椒?利用所需氨基酸使本發(fā)明的tRNA氨酰基化。氨酰基化可通過(guò)氨?；鵷RNA合成酶或其它酶分子(包括但不限于，核糖酶)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)"核糖酶"可與"催化性RNA"互換使用。Cech和同事(Cech,1987,Science,236:1532-1539;McCorkle等人，1987,ConceptsBiochem.64:221-226)證實(shí)可充當(dāng)催化劑的天然存在的RNA(核糖酶)的存在。然而，盡管僅已證實(shí)這些天然RNA催化劑對(duì)裂解和剪接的核糖核酸底物起作用，但近期有關(guān)人工核糖酶進(jìn)展的研究已擴(kuò)展對(duì)各種化學(xué)反應(yīng)的催化作用的型式。相關(guān)研究已鑒別出可催化自身(2')3'末端的氨酰基RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science267:643-647)和可將氨基酸從一個(gè)RNA分子轉(zhuǎn)移到另一RNA分子的RNA分子(Lohse等人，1996,Nature381:442-444)。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)案2003/0228593(其是以引用的方式并入本文)描述構(gòu)建核糖酶的方法和其對(duì)于用天然編碼的氨基酸和非天然編碼的氨基酸氨酰基化tRNA的用途。可使tRNA氨?；幕|(zhì)固定形式的酶分子(包括但不限于，核糖酶)能夠有效地親和純化氨酰基化產(chǎn)物。適當(dāng)基質(zhì)的實(shí)例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。供氨?；饔玫幕|(zhì)固定形式的核糖酶的制造和用途已描述于ChemistryandBiology2003，10:1077-1084和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)案2003/0228593中，所述專利文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文。化學(xué)氨?；椒ò?但不限于)由Hecht和同事(Hecht,S.M.Ace.Chem.Res.1992,25,545;Heckler,T.G.;Roesser,J.R.;Xu,C;Chang,P.;Hecht,S.M.Biochemistry1988,27,7254;Hecht,S.M.;Alford,B.L.;Kuroda,Y.;Kitano,S.J.Biol.Chem.1978,253,4517)和Schultz,Chamberlin，Dougherty等(Cornish，V.W.;Mendel,D.;Schultz，P.GAngew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A.;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722;Noren,C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C;Schultz:P.G.Science1989,244,182;Bain,J.D.;Glabe,C.G;Dix，T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013;Bain,J.D.等人Nature1992,356,537;Gallivan,J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740;Turcatti等人J.Biol.Chem.1996,271,19991;Nowak，M.W.等人Science,1995,268，439;Saks,M.E.等人J.Biol.Chem.1996,271,23169;Hohsaka,T.等人J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)提出的方法以避免在氨酰基化過(guò)程中使用合成酶。所述方法或其它化學(xué)氨酰基化方法可用于使本發(fā)明的tRNA分子氨?；Ｒ咽褂美靡曰瘜W(xué)方式修飾的氨?；鵷RNA的生物合成方法將數(shù)個(gè)生物物理探針并入活體外合成的蛋白質(zhì)中。參看本文所引用的以下公開(kāi)案和參考文獻(xiàn)Bru皿er,J.JV20to/a6e/z薩wgfirmscrossZ/wA/wg附e/7w(jfe,Annu.RevBiochem,62:483-514(1993);和Krieg,U.C.,Walter,P.，Hohnson,A.E./VzotocraM/z'wWwgo/w'gwa/segwewceo/wowcewf/re/ra/flf"/wo/_po(y_pe/"￡feo/s/g"a/recogwY/ow/w"'c/e'Proc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。先前已證實(shí)，可通過(guò)將經(jīng)化學(xué)方法氨?；囊种菩詔RNA加入經(jīng)含有所需琥珀無(wú)義突變的基因程式設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中，在活體外將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地并入蛋白質(zhì)中。使用這些方法，使用特定氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌抹，可以結(jié)構(gòu)類似的同源物取代20種常見(jiàn)氨基酸中的多種氨基酸，例如以氟代苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參看Noren,C.J.,Anthony-Cahill，Griffith,M.C.,Schultz,P.G.爿gewem/w"/zod>57Ye-577e"yc/wcor/7on^/owwww"^^"/"/w/woa"Viy/wfoScience,244:182-188(1989);M.W.Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin，A.R.,Diala，E.S.別os7"/e"cs"e邵ec(/c/wcorpora/iowo/awow-"afwra/a附z'wo/齒a/o(y/e/"We,J.AmChemSoe,111:8013-8014(1989);N.Budisa等人,FASEBJ.13:41-51(1999);Ellman,J.A.，Mendel,D.，Anthony-Cahill，S.,Noren,C丄，Schultz，P.G5/o"W/Wcwe/7odybrz'w的t/w"'"gw朋afwm/(3附z'wo57'/e-印eci(/cfl〃;v/w/o/ra^7w,MethodsinEtiz.,第202巻，301-336(1992);和Mendel,D.,Cornish,V.W.&Schultz，P.G.幼e-Z)/re"et/M/togewe57'51aw■Expawtfe^/Gewe"'cCWe,A皿uRevBiophvs.BiomolStruct.24，435-62(1995)。舉例來(lái)說(shuō)，制備識(shí)別終止密碼子UAG的抑制性tRNA，并且用非天然氨基酸以化學(xué)方法使其氨?；?。使用常規(guī)定點(diǎn)誘變將終止密碼子TAG引入蛋白質(zhì)基因中的所需位點(diǎn)處。例i口參看Sayers，J.R.，Schmidt,W.Eckstein,F.5'隱3'_Exom7c/ease>yp/ws//2ora//n'oa/"e-6oyedo//gwowc/eo/7<ie-fifz>*e"e<iNucleicAcidsRes,16(3):791-802(1988)。當(dāng)將?；种菩詔RNA和突變體基因組合于活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中時(shí)，響應(yīng)UAG密碼子而并入非天然氨基酸，此提供在特定位置處含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)。使用I^H]-Phe進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和以a羥基酸進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，僅所需氨基酸被并入U(xiǎn)AG密碼子指定的位置處，且并未將這一氨基酸并入蛋白質(zhì)中的任何其它位點(diǎn)。例如參看Noren等人，/^_i:X;Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;和Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.幼e鄰ec折c/wcor/wWowo/wove/6ac幼o(hù)we5fn/"wm1/"toprato7w,Scisncc,255(5041):197-200(1992)。產(chǎn)生催化性RNA的方法可涉及產(chǎn)生單獨(dú)隨機(jī)核糖酶序列池；對(duì)所迷池進(jìn)行定向進(jìn)化；針對(duì)所需氨?；钚院Y選所述池；和選擇那些展現(xiàn)所需氨?；钚缘暮颂敲傅男蛄?。核糖酶可包含有利于酰基化活性的基序和/或區(qū)域，諸如GGU基序和富集U的區(qū)域。舉例來(lái)說(shuō)，據(jù)報(bào)導(dǎo)，富集U的區(qū)域可有利于識(shí)別氨基酸底物，且GGU基序可與tRNA3'末端形成堿基對(duì)。總的說(shuō)來(lái)，GGU和基序以及富集U的區(qū)域有利于同時(shí)識(shí)別氨基酸與tRNA，且由此有利于使tRNA3'末端氨酰基化。可通過(guò)使用與tRNAAsnCCCG連結(jié)的部分隨機(jī)化r24mini進(jìn)行活體外選擇，隨后系統(tǒng)性工程設(shè)計(jì)見(jiàn)于活性克隆中的一致序列來(lái)產(chǎn)生核糖酶。由本方法獲得的例示性核糖酶稱為"Fx3核糖酶"且描述于美國(guó)公開(kāi)申請(qǐng)案第2003/0228593號(hào)中，所述專利的內(nèi)容是以引用的方式并入本文，所述核糖酶充當(dāng)合成載有同類非天然氨基酸的各種氨?；鵷RNA的通用催化劑。可使用在基質(zhì)上固定以能夠有效親和純化氨?；痶RNA。適當(dāng)基質(zhì)的實(shí)例包括(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠?？衫肦NA的化學(xué)結(jié)構(gòu)將核糖酶固定于樹(shù)脂上，諸如，可以高不爽酸鹽氧化RNA的核糖上的3'-順-二醇以得到相應(yīng)二醛以有利于將RNA固定于樹(shù)脂上?？墒褂酶黝悩?shù)脂，包括廉價(jià)酰肼樹(shù)脂，其中還原氨化使得樹(shù)脂與核糖酶之間以不可逆連接相互作用。可通過(guò)柱上氨?；夹g(shù)顯著有利于氨酰基tRNA的合成。Kourouklis等人Methods2005;36:239-4描述基于柱的氨?；到y(tǒng)?？梢远喾N方式實(shí)現(xiàn)氨?；痶RNA的分離。一種適當(dāng)方法為用緩沖液從柱中洗提出氨?；痶RNA,所述緩沖液諸如含有10mMEDTA的乙酸鈉溶液；含有50mMN-(2-羥乙基)哌漆-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mMKC1(pH7.0)、10mMEDTA的緩沖液；或簡(jiǎn)單地為經(jīng)EDTA緩沖的水(pH7.0)。可將本發(fā)明的氨?；痶RNA加入翻譯反應(yīng)中以便將使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻譯反應(yīng)所制造的多肽中選擇的位置中?？墒褂帽景l(fā)明的氨?；痶RNA的翻譯系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)細(xì)胞溶解產(chǎn)物。細(xì)胞溶解產(chǎn)物提供從輸入的mRNA活體外翻譯多肽必需的反應(yīng)組件。所述反應(yīng)組件的實(shí)例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始因子和延長(zhǎng)因子以及與翻譯有關(guān)的其它因子。此外，翻譯系統(tǒng)可為批量翻譯或區(qū)域化翻譯。批量翻譯系統(tǒng)將反應(yīng)組件組合于單一隔室中，而區(qū)域化翻譯系統(tǒng)使翻譯反應(yīng)組件與可抑制翻譯效率的反應(yīng)產(chǎn)物分離。所述翻譯系統(tǒng)均有市售。另外，可使用偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)允許將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)的mRNA，其接著經(jīng)反應(yīng)組件翻譯。市售偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯的實(shí)例為快速翻譯系統(tǒng)(RapidTranslationSystem)(RTS，RocheInc.)。所述系統(tǒng)包括含有^是供翻譯組件(諸如核糖體和翻譯因子)的大腸桿菌溶解產(chǎn)物的混合物。此外，還包括RNA聚合酶以將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成供翻譯使用的mRNA模板。RTS可使用借助插入到反應(yīng)隔室(包括供應(yīng)/廢物隔室和轉(zhuǎn)錄/翻譯隔室)之間的膜區(qū)域化反應(yīng)組件。tRNA的氨?；梢云渌噭┻M(jìn)行，所述試劑包括(但不限于)轉(zhuǎn)移酶、聚合酶、催化抗體、多功能蛋白等。正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)O-RS優(yōu)先利用所選氨基酸在活體外或活體內(nèi)使本發(fā)明的O-tRNA氨酰基化?？赏ㄟ^(guò)包括O-RS的多肽和/或通過(guò)編碼O-RS或其部分的聚核脊酸將本發(fā)明的O-RS提供到翻譯系統(tǒng)(例如，活體外翻譯組件，或細(xì)胞)中。O-RS或其部分是由聚核苷酸序列或其互補(bǔ)聚核苷酸序列或其保守變異體編碼?？赏ㄟ^(guò)多種不同的O-RS分子(包括但不限于，本文所述的分子)將本發(fā)明的O-tRNA氨?；ｈb別與O-tRNA(例如，O-tRNA)—起使用的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)(例如，O-RS)的方法也為本發(fā)明的特征。舉例來(lái)說(shuō)，方法包括使第一物種的細(xì)胞群體經(jīng)歷陽(yáng)性選擇，其中所述細(xì)胞各自包含1)多種氨酰基tRNA合成酶(RS)的成員，其中所述多種RS包含突變體RS、從除第一物種以外的物種得到的RS或突變體RS和從除第一物種以外的物種得到的RS;2)來(lái)自第二物種的正交tRNA(O-tRNA);和3)編碼陽(yáng)性選擇標(biāo)記并且包含至少一個(gè)選擇性密碼子的聚核苷酸。選擇或篩選細(xì)胞中與缺乏多種RS中的成員或具有減少量的多種RS中的成員的細(xì)胞相比展示增強(qiáng)的抑制效率的細(xì)胞。抑制效率增強(qiáng)的細(xì)胞包含使O-tRNA氨?；幕钚訰S。將活性RS使來(lái)自第一物種的第一組tRNA氨?；乃?活體外或活體內(nèi))與活性RS使來(lái)自第二物種的第二組tRNA氨?；乃?活體外或活體內(nèi))相比較。氨?；娇赏ㄟ^(guò)可檢測(cè)物質(zhì)(例如，經(jīng)標(biāo)記氨基酸或非天然氨基酸)測(cè)定。選擇與第一組tRNA相比使第二組tRNA更有效氨?；幕钚訰S，借此提供與O-tRNA—起使用的正交氨?；鵷RNA合成酶。由所述方法鑒別的O-RS(例如，O-RS)也為本發(fā)明的特征?？墒褂枚喾N檢定中的任一種測(cè)定氨?；?。這些檢定可在活體外或活體內(nèi)進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，活體外氨?；?全定描述于例如Hoben,P.和Soil,D.(1985)MethodsEnzvmol.113:55-59以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)案第2003/0228593號(hào)中。也可通過(guò)使用報(bào)告基因和正交翻譯組件，并且檢測(cè)表達(dá)包含至少一個(gè)選擇性密碼子且編碼蛋白質(zhì)的聚核苷酸的細(xì)胞中的報(bào)告基因來(lái)測(cè)定氨?；?。也參看名稱為"INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS"的美國(guó)專利申請(qǐng)案10/126,927;和名稱為"EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE，，的USSN10/825,867?？蛇M(jìn)一步對(duì)經(jīng)鑒別的O-RS進(jìn)行操縱以改變合成酶的底物特異性，從而僅所需非天然氨基酸而非常見(jiàn)20種氨基酸中的任一種載到O-tRNA上。產(chǎn)生對(duì)非天然氨基酸具有底物特異性的正交氨?；鵷RNA合成酶的方法包括使合成酶(例如)在合成酶的活性位點(diǎn)處、合成酶的編輯機(jī)制位點(diǎn)處、通過(guò)組合合成酶不同域得到的不同位點(diǎn)處等突變，和應(yīng)用選擇方法。使用基于陽(yáng)性選擇隨后陰性選擇的組合的策略。在陽(yáng)性選擇中，對(duì)陽(yáng)性標(biāo)記的非必需位置處引入的選擇性密碼子的抑制使細(xì)胞在陽(yáng)性選擇壓力下存活。因此，在存在天然和非天然氨基酸的情況下，存活者編碼使正交抑制性tRNA載上天然或非天然氨基酸的活性合成酶。在陰性選擇中，對(duì)陰性標(biāo)記的非必需位置處引入的選擇性密碼子的抑制將去除具有天然氨基酸特異性的合成酶。陰性選擇和陽(yáng)性選擇的存活者編碼僅利用非天然氨基酸使正交抑制性tRNA氨酰基化(裝載)的合成酶。隨后，可使這些合成酶經(jīng)歷進(jìn)--步的誘變，例如DNA改組或其它遞歸式誘變方法?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域中已知的各種誘變技術(shù)產(chǎn)生突變體O-RS文庫(kù)。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸式誘變方法、嵌合構(gòu)建或其任何組合產(chǎn)生突變體RS。舉例來(lái)說(shuō)，可由兩種或兩種以上其它(例如)較小、較少不同的"子文庫(kù)"來(lái)產(chǎn)生突變體RS文庫(kù)。RS的嵌合文庫(kù)也包括在本發(fā)明中。應(yīng)注意，視情況構(gòu)建來(lái)自各種有機(jī)體(例如，微生物，諸如真細(xì)菌或古細(xì)菌)的tRNA合成酶文庫(kù)，諸如，包含天然多樣性的文庫(kù)(例如參看Short等人的美國(guó)專利第6,238,884號(hào)；Schallenberger等人的美國(guó)專利第5,756,316號(hào)；Petersen等人的美國(guó)專利第5,783,431號(hào)；Thompson等人的美國(guó)專利第5,824,485號(hào)；Short等人的美國(guó)專利第5,958,672號(hào))；并且篩選正交對(duì)。使合成酶經(jīng)歷陽(yáng)性和陰性選擇/篩選策略后，隨后可使這些合成酶經(jīng)歷進(jìn)一步誘變。舉例來(lái)說(shuō)，可分離編碼O-RS的核酸；可由所述核酸產(chǎn)生(例如，通過(guò)隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變、重組或其任何組合)一組編碼突變O-RS的聚核苷酸；并且可重復(fù)這些個(gè)別步驟或這些步驟的組合直到獲得優(yōu)先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨?；耐蛔僌-RS。在本發(fā)明一個(gè)方面中，進(jìn)行所述步驟多次，例如至少2次。還可將不同程度的選擇/篩選嚴(yán)格度用于本發(fā)明的方法中，以用于產(chǎn)生O-tRNA、O-RS或0-tRNA/0-RS對(duì)。所述方法的一個(gè)或兩個(gè)步驟的選擇或篩選嚴(yán)格度可變化以產(chǎn)生O-RS。這可包括(例如)改變所使用的選擇劑/篩選劑的量等。也可進(jìn)行其它回合的陽(yáng)性選擇和/或陰性選擇。選擇或篩選也可包含一次或一次以上陽(yáng)性或陰性選擇或篩選，所述選擇或篩選包括(例如)氨基酸滲透性的改變、翻譯效率的改變、翻譯保真度的改變等。通常，一種或一種以上改變是基于使用正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)制造蛋白質(zhì)的有機(jī)體中一個(gè)或一個(gè)以上基因的突變?？蓪⑨槍?duì)(例如)O-RS、O-tRNA和0-tRNA/0-RS對(duì)的其它類選擇用于本發(fā)明中。陽(yáng)性選擇標(biāo)記可為多種分子中的任一種，包括(但不限于)提供營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充以供生長(zhǎng)的產(chǎn)物，并且在缺乏營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。編碼陽(yáng)性選擇標(biāo)記的聚核苦酸的實(shí)例包括(但不限于)例如基于補(bǔ)充細(xì)胞的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的報(bào)告基因、his3基因(例如，其中his3基因編碼通過(guò)提供3-氨基三唑(3-AT)檢測(cè)的咪唑甘油磷酸脫氬酶)、ura3基因、leu2基因、lys2基因、lacZ基因、adh基因等。例如參看G.M.Kishore,&D.M.Shah,(1988),Aminoacidbiosynthesisinhibitorsasherbicides,AnnualReviewofBiochemistry57:627-663。在一個(gè)實(shí)施例中，IacZ的產(chǎn)生是通過(guò)鄰硝基苯基-卩-D-p比喃半乳糖苷(ONPG)水解斗全測(cè)。例如參看I.G.Serebriiskii，&E.A.Golemis,(2000),UsesoflacZtostudygenefunction:evaluationofbeta-galactosidaseassaysemployedintheyeasttwo-hybridsystem,AnalyticalBiochemistry285:1-15。其它陽(yáng)性選擇標(biāo)記包括(例如)焚光素酶、綠色焚光蛋白質(zhì)(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的產(chǎn)物(例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(例如，GAL4)等。視情況，編碼陽(yáng)性選擇標(biāo)記的聚核苷酸包含選擇性密碼子?？蓪⒕幋a陽(yáng)性選擇標(biāo)記的聚核苷酸可操作地連接到反應(yīng)元件。還可存在編碼調(diào)節(jié)反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白且包含至少一個(gè)選擇性密碼子的額外聚核苷酸。通過(guò)經(jīng)非天然氨基酸氨?；腛-tRNA將非天然氨基酸并入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中將引起編碼陽(yáng)性選擇標(biāo)記的聚核苷酸(例如，報(bào)告基因)的轉(zhuǎn)錄。視情況，選擇性密碼子位于編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的DNA結(jié)合域的一部分聚核苷酸中或?qū)嵸|(zhì)上臨近編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的DNA結(jié)合域的一部分聚核苷酸。也可將編碼陰性選擇標(biāo)記的聚核苷酸可操作地連接到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)元件。例如參看A.J.DeMaggio等人，(2000)，Theyeastsplit-hybridsystem,MethodEnzymol.328:128-137;H.M.Shih等人，(1996),Apositivegeneticselectionfordisruptingprotein-proteininteractions:identificationofCREBmutationsthatpreventassociationwiththecoactivatorCBP,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:13896-13901;M.Vidal等人，(1996),Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:10321-10326;和M.Vidal等人，(1996),Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:10315-10320)。通過(guò)經(jīng)天然氨基酸氨?；腛-tRNA將天然氨基酸并入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中將引起陰性選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。視情況，陰性選擇標(biāo)記包含選擇性密碼子。本發(fā)明的陽(yáng)性選擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記可包含至少兩個(gè)選擇性密碼子，所述標(biāo)記各自或都可包含至少兩個(gè)不同的選擇性密碼子或至少兩個(gè)相同的選擇性密碼子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白為與核酸序列(例如，反應(yīng)元件)(直接或間接)結(jié)合并且調(diào)節(jié)可操作地連接到反應(yīng)元件的序列的轉(zhuǎn)錄的分子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可為轉(zhuǎn)錄活化蛋白(例如，GAL4、核激素受體、AP1、CREB、LEF/tcf家族成員、SMAD、VP16、SP1等)、轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白(例如，核激素受體、Groucho/tle家族、Engrailed家族等)或可視環(huán)境而具有兩種活性的蛋白質(zhì)(例如，LEF/tcf、同源盒蛋白等)。反應(yīng)元件通常為由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白識(shí)別的核酸序列或與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白協(xié)同作用的額外試劑。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的另一實(shí)例為轉(zhuǎn)錄活化蛋白GAL4。例如參看A.Laughon等人，(1984)，IdentificationoftwoproteinsencodedbytheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene,Molecular&CellularBiology4:268-275;A.Laughon,&R.F.Gesteland,(1984),PrimarystructureoftheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene,Molecular&CellularBiology4:260-267;L.Keegan等人，(1986),SeparationofDNAbindingfromthetranscription-activatingfunctionofaeukaryoticregulatoryprotein,Science231:699-704;和M.Ptashne,(1988),Howeukaryotictranscriptionalactivatorswork,Nature335:683-689。這一具有881個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的N末端147個(gè)氨基酸形成特異性結(jié)合DNA序列的DNA結(jié)合域(DBD)。例如參看M.Carey等人，(1989),Anamino-terminalfragmentofGAL4bindsDNAasadimer,J.Mol.Biol.209:423-432;和E.Giniger等人，(1985)，SpecificDNAbindingofGAL4,apositiveregulatoryproteinofyeast，Cell40:767-774。DBD是通過(guò)4#入的蛋白質(zhì)序列連接到當(dāng)與DNA結(jié)合時(shí)可活化轉(zhuǎn)錄的C末端113個(gè)氨基酸活化域(AD)。例如參看J.Ma，&M.Ptashne,(1987),DeletionanalysisofGAL4definestwotranscriptionalactivatingsegments,Cell48:847-853;和J.Ma,&M.Ptashne,(1987)，Thecarboxy-terminal30aminoacidsofGAL4arerecognizedbyGAL80,Cell50:137-142。通過(guò)將琥珀密碼子朝向(例如)含有GAL4的N末端DBD和其C末端AD的單一聚核苦酸的N末端DBD放置，可將O-tRNA/O-RS對(duì)的琥珀抑制連接到GAL4進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄活化?？墒褂肎AL4活化的報(bào)告基因進(jìn)行利用所述基因進(jìn)行的陽(yáng)性選擇和陰性選擇。用于陰性選擇的培養(yǎng)基可包含轉(zhuǎn)化成通過(guò)陰性選擇標(biāo)記可檢測(cè)的物質(zhì)的選擇劑或篩選劑。在本發(fā)明一個(gè)方面中，可檢測(cè)物質(zhì)為有毒物質(zhì)。編碼陰性選擇標(biāo)記的聚核苷酸可為(例如)ura3基因。舉例來(lái)說(shuō)，可將URA3報(bào)告基因放在含有GAL4DNA結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子的控制下。當(dāng)例如通過(guò)翻譯具有選擇性密碼子的編碼GAL4的聚核苦酸來(lái)制造陰性選擇標(biāo)記時(shí)，GAL4將活化URA3的轉(zhuǎn)錄。陰性選擇是在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的培養(yǎng)基上實(shí)現(xiàn)，所述5-FOA轉(zhuǎn)化成通過(guò)ura3基因的基因產(chǎn)物可^r測(cè)的物質(zhì)(例如，殺死細(xì)胞的有毒物質(zhì))。例如參看J.D.Boeke等人，(1984),Apositiveselectionformutantslackingorotidine-5'-phosphatedecarboxylaseactivityinyeast:5-fluorooroticacidresistance,Molecular&GeneralGenetics197:345-346);M.Vidal等人，(1996)，Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:10321-10326;和M.Vidal等人，(1996),Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:10315-10320。如同陽(yáng)性選擇標(biāo)記一樣，陰性選擇標(biāo)記也可為多種分子中的任一種。陽(yáng)性選擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記可為發(fā)焚光或在存在適當(dāng)反應(yīng)物的情況下催化發(fā)光反應(yīng)的多肽。舉例來(lái)說(shuō)，陰性選擇標(biāo)記包括(但不限于)例如熒光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的產(chǎn)物(例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))、lacZ基因的產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白等。陽(yáng)性選擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記可通過(guò)萸光活化細(xì)胞揀選(FACS)或通過(guò)發(fā)光來(lái)檢測(cè)。陽(yáng)性選擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記可包含基于親和力的篩選標(biāo)記。同一聚核普酸可編碼陽(yáng)性選擇標(biāo)記和陰性選擇標(biāo)記。舉例來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性選擇步驟、陰性選擇步驟或陽(yáng)性選擇和陰性選擇步驟可包括使用報(bào)告基因，其中所述報(bào)告基因是通過(guò)熒光活化細(xì)胞揀選(FACS)檢測(cè)。舉例來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性選擇可首先用陽(yáng)性選擇標(biāo)記(例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因)進(jìn)行，其中所述CAT基因在所述CAT基因中包含選擇性密碼子(例如，琥珀終止密碼子)；隨后進(jìn)行陰性選擇篩選，其是基于無(wú)法抑制陰性選擇標(biāo)記(例如，T7RNA聚合酶基因)內(nèi)各位置處的(例如，兩個(gè)或兩個(gè)以上)選擇性密碼子。陽(yáng)性選擇標(biāo)記和陰性選擇標(biāo)記可見(jiàn)于同一載體(例如質(zhì)粒)上。陰性標(biāo)記的表達(dá)將驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因(例如，綠色焚光蛋白質(zhì)(GFP))的表達(dá)。選擇和篩選的嚴(yán)格度可變化，例如使報(bào)告基因發(fā)熒光所需的光強(qiáng)度可變化。陽(yáng)性選擇可利用通過(guò)FACS篩選隨后陰性選擇篩選的報(bào)告基因作為陽(yáng)性選擇標(biāo)記進(jìn)行，所述陰性選擇篩選是基于無(wú)法抑制陰性標(biāo)記(例如，barnase基因)內(nèi)各位置處的(例如，兩個(gè)或兩個(gè)以上)選擇性密碼子。視情況，報(bào)告基因是在細(xì)胞表面(例如，噬菌體呈現(xiàn)等)上呈現(xiàn)。細(xì)胞表面呈現(xiàn)(例如，基于OmpA的細(xì)胞表面呈現(xiàn)系統(tǒng))取決于大腸桿菌細(xì)胞表面上特定抗原決定基(例如，融合到外膜孔蛋白OmpA的脊髓灰質(zhì)炎病毒C3肽)的表達(dá)。所述抗原決定基僅在翻譯期間抑制蛋白質(zhì)信使中的選擇性密碼子時(shí)呈現(xiàn)于細(xì)胞表面上。隨后所呈現(xiàn)的肽含有由文庫(kù)中的一個(gè)突變體氨酰基tRNA合成酶所識(shí)別的氨基酸，并且含有相應(yīng)合成酶基因的細(xì)胞可利用針對(duì)含有特定非天然氨基酸的肽所產(chǎn)生的抗體分離?；贠mpA的細(xì)胞表面呈現(xiàn)系統(tǒng)經(jīng)Georgiou等人研發(fā)并且優(yōu)化以作為噬菌體呈現(xiàn)的替代選擇。參看Francisco,J.A.，Campbell,R.，Iverson,B.L.&Georgoiu,G.Productionandfluorescence-activatedcellsortingofEscherichiacoliexpressingafunctionalantibodyfragmentontheexternalsurface.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10444-8(1993)。本發(fā)明的其它實(shí)施例包括在活體外執(zhí)行一個(gè)或一個(gè)以上選擇步驟。隨后可將所選組件(例如，合成酶和/或tRNA)引入細(xì)胞中以用于活體內(nèi)并入非天然氨基酸。制造O-RS并且改變合成酶的底物特異性的其它細(xì)節(jié)可見(jiàn)于名稱為"MethodsandCompositionsfortheProductionofOrthogonaltRNA-AminoacyltRNASynthetasePairs"的美國(guó)專利申請(qǐng)案10/126,931和名稱為"EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE"的USSN10/825,867中，所迷文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。制造O-RS的其它細(xì)節(jié)可見(jiàn)于Hamano-Takaku等人，(2000)AmutantEscherichiacoliTyrosyl-tRNASynthetaseUtilizestheUnnaturalAminoAcidAzatyrosineMoreEfficientlythanTyrosine,JournalofBiologicalChemistry,275(51):40324-40328;Kiga等人(2002),AnengineeredEscherichiacolityrosyl-tRNAsynthetaseforsite-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsineukaryotictranslationanditsapplicationinawheatgermcell-freesystem,PNAS99(15):9715-9723;和Francklyn等人，(2002),Aminoacyl-tRNAsynthetases:Versatileplayersinthechangingtheateroftranslation;RNA,8:1363-1372中,各文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。來(lái)源和宿主有機(jī)體本發(fā)明的翻"^組件通常是從非真核有機(jī)體得到。舉例來(lái)說(shuō)，正交O-tRNA可從非真核有機(jī)體得到，例如古細(xì)菌，諸如詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)曱烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強(qiáng)烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或真細(xì)菌，諸如大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，而正交O-RS可從非真核有機(jī)體得到，例如嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強(qiáng)烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或真細(xì)菌，諸如大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。在一個(gè)實(shí)施例中，也可使用真核來(lái)源，包括(但不限于)植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物等)等。O-tRNA/0-RS對(duì)的個(gè)別組件可從相同有機(jī)體或不同有機(jī)體得到。在一個(gè)實(shí)施例中，O-tRNA/0-RS對(duì)是來(lái)自相同有機(jī)體?；蛘?，O-tRNA/0-RS對(duì)中的O-tRNA和O-RS是來(lái)自不同有機(jī)體。舉例來(lái)說(shuō)，O-tRNA可從(例如)嗜鹽古菌NRC-1得到，并且O-RS可從(例如)嗜熱自養(yǎng)曱烷桿菌得到。可在活體內(nèi)或活體外選擇或篩選O-tRNA、O-RS或O-tRNA/0-RS對(duì)和/或?qū)⑵溆糜诩?xì)胞(例如，非真核細(xì)胞(諸如大腸桿菌細(xì)胞)或真核細(xì)胞)中以產(chǎn)生具有所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。非真核細(xì)胞可來(lái)自各種來(lái)源，諸如古細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育領(lǐng)域，包括(但不限于)詹氏曱烷球菌、嗜熱自養(yǎng)曱烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強(qiáng)烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或可屬于真細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育領(lǐng)域(包括但不限于，大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌等)等。真核細(xì)胞可來(lái)自各種來(lái)源，包括(但不限于)植物(例如，復(fù)雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母(包括但不限于，釀酒酵母)、動(dòng)物(包括但不限于，哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物等)等。具有本發(fā)明的翻譯組件的細(xì)胞組合物也為本發(fā)明的特征。有關(guān)篩選一種物種中的O-tRNA和/或O-RS供另一物種^f吏用，也參看名稱為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode，，的USSN10/825,867。為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)具有所選氨基酸的所關(guān)注的多肽，可將編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸亞克隆到表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體含有用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子，且如果針對(duì)編碼蛋白質(zhì)的核酸，那么還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。適當(dāng)?shù)募?xì)菌啟動(dòng)子已為所屬領(lǐng)域眾所周知并且描述于(例如)Sambrook等人和Ausubel等人中。表達(dá)所關(guān)注的多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可用于(包括但不限于)大腸桿菌、枯草桿菌(5ac///^印，)、熒光假單胞菌，銅綠假單胞菌，惡臭假單胞菌和沙門氏菌(Sa/wowe〃a)中(Palva等人，22:229-235(1983);Mosbach等人，A^wre302:543-545(1983))。所述表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒在市面有售。哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知且也在市面有售?？蓪⒈景l(fā)明的tRNA和/或RS和/或所關(guān)注的多肽用于多種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)(例如包括，酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌)中和/或在所述系統(tǒng)中表達(dá)。有關(guān)例示性表達(dá)系統(tǒng)的描述將于下文中提供。酵母如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"酵母"包括能夠表達(dá)所關(guān)注的多肽的多種酵母中的任一種。所述酵母包括(但不限于)產(chǎn)子囊(ascosporogenous)酵母(內(nèi)孢霉目(五/w/o附戸fa/ej1))、產(chǎn)擔(dān)孑包子(basidiosporogenous)酵母和屬于半知菌類(芽孑包綱(5/aWomj;cetey))的酵母。產(chǎn)子囊酵母分為兩個(gè)家族，即蝕精霉科(5^WJ叩/^/zoraceae)和酵母科(SacctoTOmycWaceae)。酵母科是由四個(gè)亞家族構(gòu)成，即裂殖酵母亞科(5"c/^mracc/zaro附;;co/c/eae)(例如,裂殖酵母屬(genusScWmya"/ara，c^))、拿遜酵母亞科(A^c^om'o/i/efle)、油月旨酵母亞科(ZipowycoWeae)和酵母菌亞科(S"cc/"w附j(luò)cozWew)(例如，畢赤酵母屬(戶/cW")、克魯維酵母屬(f/j^veromycey)和酵母菌屬(Sacc/zara附少ce))。產(chǎn)擔(dān)孢子酵母包括白冬孢酵母屬(丄ewawjW〃W/ww)、紅冬孢酵母屬(及/wcfo印onW/ww)、鎖擲孢酵母屬(印w!W/o&o/附)、線黑粉酵母屬("/okwWwm)和擬線黑粉酵母屬(Ff/oftawW/e//")。屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母分為兩個(gè)家族，即擲孢酵母科(S;wra6o/ow;;ce^(ceae)(例如擲孢酵母屬(S/wro6o/om;K^)和布勒擲孢酵母屬(Bw〃era))和隱球酵母科(Co^ococcweae)(例如假絲酵母屬(OmAW))。用于本發(fā)明的特別值得關(guān)注的為畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、(^m;ye"w/a)、漢遜酵母屬(/fo附emz/a)、球擬酵母屬(7bnz/o/w^)和假絲酵母屬(Ca"AWa)內(nèi)的種，包括(但不限于)巴氏畢赤酵母(P;^WoWs)、季氏畢赤酵母(gm7/en'wow(i")、釀酒酵母(S.cerev/w'ae)、卡爾斯伯酵母(S.car/Aergem/s)、糖化酵母(S.WaWa"cws)、道格拉斯酵母(S.dowg/a;y〃)、克氏酵母(S,A:/w，yven')、諾氏酵母(S."w6e"w'j)、卵形酵母(Sov(/brw/_y)、乳酸克魯維斯酵母(〖脆壁克魯維斯酵母(L/mgz7h)、白假絲酵母(C.a/6/cww)、麥芽假絲酵母(Cwa/tosa)和多形漢遜酵母(if.pofy;nof77/7a)。酵母一般可從各種來(lái)源得到，包括(但不限于)加州大學(xué)(Berkeley,CA)生物物理學(xué)和醫(yī)學(xué)物理學(xué)系酵母基因儲(chǔ)備中心(YeastGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia)和美國(guó)典型孩吏生物菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,"ATCC")(Manassas,VA)。術(shù)語(yǔ)"酵母宿主"或"酵母宿主細(xì)胞"包括可用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體或已用作重組栽體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的酵母。所述術(shù)語(yǔ)包括已接收重組栽體或其它轉(zhuǎn)移DNA的原始酵母宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于存在偶發(fā)突變或有意突變，單一親代細(xì)胞的子代的形態(tài)或基因組或總DNA補(bǔ)體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過(guò)相關(guān)特性(諸如，編碼所關(guān)注的多肽的核苦酸序列的存在)表征的親本細(xì)胞子代包括在本定義所預(yù)期的子代中。已研發(fā)表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體(包括染色體外復(fù)制子或整合載體)以用于轉(zhuǎn)化到許多酵母宿主中。舉例來(lái)說(shuō)，已研發(fā)針對(duì)下述的表達(dá)載體釀酒酵母(Sikorski等人，Genetics(1989)122:19;Ito等人，J.Bacteriol.(1983)153:163;Hinnen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929);白假絲酵母(Kurtz等人，Mol.CELL.Biol.(1986)6:142);麥芽假絲酵母(Kunze等人，J.BASICMICROBIOL.(1985)25:141);多形漢遜酵母(Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459;Roggenkamp等人,Mol.Geneticsandgenomics(1986)202:302);脆壁克魯維斯酵母(Das等人，J.Bacteriol.(1984)158:1165);乳酸克魯維斯酵母(DeLouvencourt等人，J.Bacteriol.(1983)154:737;VandenBerg等人，Biotechnology(ny)(1990)8:135);季氏畢赤酵母(Kunze等人，J.BasicMicrobiol.(1985)25:141);巴氏畢赤酵母(美國(guó)專利第5,324,639號(hào)；第4,929,555號(hào)；和第4,837,148號(hào)；Cregg等人，Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376);粟酒裂殖酵母(Beach等人，NATURE(1982)300:706);和耶羅威亞解脂酵母(/*o(K/")、構(gòu)巢曲霉(AmWw/"朋)(Balance等人，BIOCHEM.BIOPHYS.RES.Commun.(1983)112:284-89;Tilburn等人，Gene(1983)26:205-221;和Yelton等人，Proc.Natl.Acad.SCI.USA(1984)81:1470-74);黑曲霉(A"一)(Kelly和Hynes，EMBOJ.(1985)4:475-479);木霉(Z證/a)(EP0244234);和絲狀真菌，諸如土壤真菌(A^wraspora)、青霉屬(Pew/c/仏'ww)、彎頸霉(7b〖y;oc/aWww)(WO91/00357)。酵母載體的控制序列已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且包括(但不限于)來(lái)自下述基因的啟動(dòng)子區(qū)諸如醇脫氫酶(ADH)(EP0284044);烯醇化酶；葡糖激酶；葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶；甘油醛-3-嶙酸脫氫酶(GAP或GAPDH);己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸變位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP0329203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供有用的啟動(dòng)子序列(Miyanohara等人，PROC.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOL.Chem.(1980)255:12073)和其它糖酵解酶(諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶)(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17:4卯0;Hess等人，J.Adv.EnzymeReg.(1969)7:149)的啟動(dòng)子。具有受生長(zhǎng)條件所控制的其它轉(zhuǎn)錄優(yōu)點(diǎn)的可誘導(dǎo)酵母啟動(dòng)子可包括醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氳酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。用于酵母表達(dá)的適當(dāng)栽體和啟動(dòng)子進(jìn)一步描述于EP0073657中。酵母增強(qiáng)子還可與酵母啟動(dòng)子合用。此外，合成啟動(dòng)子也可用作酵母啟動(dòng)子。舉例來(lái)說(shuō)，可將酵母啟動(dòng)子的上游活化序列(UAS)與另一酵母啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)連接，從而產(chǎn)生合成雜合啟動(dòng)子。所述雜合啟動(dòng)子的實(shí)例包括連接到GAP轉(zhuǎn)錄活化區(qū)的ADH調(diào)控序列。參看美國(guó)專利第4,880,734號(hào)和第4,876,197號(hào)，其是以引用的方式并入本文中。雜合啟動(dòng)子的其它實(shí)例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PH05基因的調(diào)控序列與糖酵解酶基因(諸如GAP或PyK)的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)組成的啟動(dòng)子。參看EP0164556。此外，酵母啟動(dòng)子可包括具有結(jié)合酵母RNA聚合酶并且起始轉(zhuǎn)錄的能力的非酵母來(lái)源的天然存在的啟動(dòng)子?？山M成部分酵母表達(dá)載體的其它控制元件包括(例如)來(lái)自GAPDH或烯醇化酶基因的終止子(HoIland等人，J.BIOL.Chem.(1981)256:1385)。此外，2fi質(zhì)粒來(lái)源的復(fù)制起點(diǎn)適用于酵母。用于酵母中的適當(dāng)選擇基因?yàn)榇嬖谟诮湍纲|(zhì)粒中的";7/基因。參看Tschumper等人，Gene(1980)10:157;Kingsman等人，Gene(1979)7:141。fr^基因提供針對(duì)缺乏在色氨酸中生長(zhǎng)的能力的酵母突變菌抹的選擇標(biāo)記。類似地，Leu2缺陷型酵母菌林(ATCC20,622或38,626)通過(guò)具有丄ew2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)充。將外源DNA引入酵母宿主中的方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并且通常包括(但不限于)原生質(zhì)球的轉(zhuǎn)化或經(jīng)堿陽(yáng)離子處理的完整酵母宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。舉例來(lái)說(shuō)，酵母的轉(zhuǎn)化可根據(jù)Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:3829和VanSolingen等人，J.Bact.(1977)130:946中所述的方法進(jìn)行。然而，也可如Sambrook等人，MolecularCloning:ALab.Manual(2001)中一般所述，使用將DNA引入細(xì)胞的其它方法，諸如細(xì)胞核注射、電穿孔或原生質(zhì)體融合。隨后可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)酵母宿主細(xì)胞。在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的其它方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。一般參看美國(guó)專利公開(kāi)案第20020055169號(hào)；美國(guó)專利第6,361,969號(hào)；第6,312,923號(hào)；第6,183,985號(hào)；第6，083，723號(hào)；第6，017，731號(hào)；第5,674,706號(hào)；第5，629，203號(hào)；第5，602,034號(hào)；和第5，089，398號(hào)；美國(guó)再審專利第RE37，343號(hào)和第RE35，749號(hào)；PCT公開(kāi)專利申請(qǐng)案WO99/07862;WO98/37208;和WO98/26080;歐洲專利申請(qǐng)案EP0946736;EP0732403;EP0480480;WO90/10277;EP0340986;EP0329203;EP0324274;和EP0164556。也參看Gellissen等人，AntonieVanLeeuwenhoek(1992)62(1隱2):79-93;Romanos等人，Yeast(1992)8(6):423-488;Goeddel,METHODSINENZYMOLOGY(19卯)185:3-7,各文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。在擴(kuò)增階段，酵母宿主菌林可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料分批發(fā)酵方法在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)。所述發(fā)酵方法可用于說(shuō)明特定酵母宿主的碳利用路徑或表達(dá)控制模式的差異。舉例來(lái)說(shuō)，酵母菌屬(Sacc/wramycM)酵母宿主的發(fā)酵可能需要單一葡萄糖原料、復(fù)合氮源(例如，酪蛋白水解物)和多種維生素補(bǔ)充。相比之下，曱醇酵母巴氏畢赤酵母可能需要甘油、曱醇和痕量礦物原料，但僅簡(jiǎn)單銨(氮)鹽以供最佳生長(zhǎng)和表達(dá)。例如參看美國(guó)專利第5,324,639號(hào)；Elliott等人，J.ProteinChem.(1990)9:95;和Fieschko等人，Biotech.Bioeng.(1987)29:1113,各文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。然而，所述發(fā)酵方法可具有與所使用的酵母宿主菌抹無(wú)關(guān)的某些常見(jiàn)特征。舉例來(lái)說(shuō)，可在擴(kuò)增階段將限制生長(zhǎng)的養(yǎng)分(通常為碳)加到發(fā)酵罐中以允許最大生長(zhǎng)。此外，發(fā)酵方法一般使用經(jīng)設(shè)計(jì)以含有足量的碳、氮、基礎(chǔ)鹽(basalsalt)、磷和其它微量養(yǎng)分(維生素、痕量礦物和鹽等)的發(fā)酵培養(yǎng)基。適用于畢赤酵母屬的發(fā)酵培養(yǎng)基的實(shí)例描述于美國(guó)專利第5,324,639號(hào)和第5,231,178號(hào)中，其是以引用的方式并入本文中。感染桿狀病毒的昆蟲(chóng)細(xì)胞術(shù)語(yǔ)"昆蟲(chóng)宿主"或"昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞"是指可用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的昆蟲(chóng)。所述術(shù)語(yǔ)包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于存在偶發(fā)突變或有意突變，單一親代細(xì)胞的子代的形態(tài)或基因組或總DNA補(bǔ)體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過(guò)相關(guān)特性(諸如，編碼所關(guān)注的多肽的核苷酸序列的存在)表征的親本細(xì)胞的子代包括在本定義所預(yù)期的子代中。表達(dá)所關(guān)注的多肽的適當(dāng)昆蟲(chóng)細(xì)胞的選擇已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。數(shù)種昆蟲(chóng)物種已在所屬領(lǐng)域中進(jìn)行充分描述并且在市面有售，包括埃及斑蚊(Xe&s)、家蠶(5om6yxwoW)、，繁、腹果蟲(chóng)1XZ>oso//7a附e/a"og"Wer)、草i也貪夜蛾(Spoi/o//ena(々wg/peraa)和粉紋夜蛾(7Wc/zo;/^/am')。在選擇供表達(dá)的昆蟲(chóng)宿主的過(guò)程中，適當(dāng)?shù)乃拗骺砂ń?jīng)證實(shí)尤其具有良好的分泌能力、低的蛋白水解活性和整體穩(wěn)定性的宿主。昆蟲(chóng)一般可從各種來(lái)源得到，包括(但不限于)加州大學(xué)(Berkeley,CA)生物物理學(xué)和醫(yī)學(xué)物理學(xué)系昆蟲(chóng)基因儲(chǔ)備中心(InsectGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics，UniversityofCalifornia)和美國(guó)典型微生物菌種保藏中心("ATCC")(Manassas,VA)。一般說(shuō)來(lái)，感染桿狀病毒的昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的組件包括轉(zhuǎn)移載體，通常為細(xì)菌質(zhì)粒，其含有桿狀病毒基因組的片段和插入欲表達(dá)的異源基因的便利限制性位點(diǎn)；具有與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源的序列(這允許將異源基因同源重組到桿狀病毒基因組中)的野生型桿狀病毒；和適當(dāng)?shù)睦ハx(chóng)宿主細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基。用于構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、揀選斑塊、使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)等的材料、方法和技術(shù)已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且可使用描述這些技術(shù)的手冊(cè)。將異源基因插入轉(zhuǎn)移栽體中后，將載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞中，其中載體與病毒基因組重組。表達(dá)經(jīng)包裝的重組病毒并且對(duì)重組斑塊進(jìn)行鑒別和純化。用于桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法是從(例如)InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)以試劑盒形式購(gòu)得。這些技術(shù)一般為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且充分地描述于以引用方式并入本文的SummersandSmith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555(1987)中。也參看Richardson,39MethodsinMolecularBiology:BaculovirusExpressionProtocols(1995);ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology16.9-16.11(1994);king和Possee,TheBaculovirusSystem:ALaboratoryGuide(1992);禾口O'Reilly等人,BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual(1992)。事實(shí)上，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知使用桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行的各種異源蛋白質(zhì)的制造。例如，參看美國(guó)專利第6,368,825號(hào)、第6,342,216號(hào)、第6,338,846號(hào)、第6,261,805號(hào)、第6,245,528號(hào)、第6，225，060號(hào)、第6,183,987號(hào)、第6，168，932號(hào)、第6,126,944號(hào)、第6,096,304號(hào)、第6,013,433號(hào)、第5,965,393號(hào)、第5,939,285號(hào)、第5,891,676號(hào)、第5,871,986號(hào)、第5,861,279號(hào)、第5,858,368號(hào)、第5,843,733號(hào)、第5，762,939號(hào)、第5,753,220號(hào)、第5,605,827號(hào)、第5,583,023號(hào)、第5,571,709號(hào)、第5,516,657號(hào)、第5,2卯，686號(hào)、WO02/06305、WOOl簡(jiǎn)卯、WO01/27301、WO01/05956、WO00/55345、WO00/20032、WO99/51721、WO99/45130、WO99/31257、WO99/10515、WO99/09193、WO97/26332、WO96/29400、WO96/25496、WO96/06161、WO95/20672、WO93/03173、WO92/16619、WO92/02628、WO92/01801、WO90/14428、WO90/10078、WO90/02566、WO90/02186、WO卯/01556、WO89/01038、WO89/01037、WO88/07082，所述專利都是以引用的方式并入本文中。可用于桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體已為所屬領(lǐng)域中所知并且包括(例如)自桿狀病毒苜蓿尺蠖(^w"gra//wca/zybr"/ca)核型多角體病毒(AcNPV)獲得的昆蟲(chóng)表達(dá)和轉(zhuǎn)移載體，其為非輔助依賴性病毒表達(dá)載體(helper-independentviralexpressionvector)。源自這一系統(tǒng)的病毒表達(dá)載體通常使用強(qiáng)的病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)異源基因的表達(dá)。一般參看O'Reilly等人,BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual(1992)。在將外來(lái)基因插入桿狀病毒基因組之前，通常將上述組件(包含啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列(視需要)、所關(guān)注的編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止序列)組裝成中間移位構(gòu)筑體(intermediatetransplacementconstruct)(轉(zhuǎn)移載體)。中間移位構(gòu)筑體通常保持在復(fù)制子中，諸如能夠在宿主(諸如細(xì)菌)中穩(wěn)定保持的染色體外元件(例如，質(zhì)粒)。復(fù)制子將具有復(fù)制系統(tǒng)，因此使其能夠保持在適當(dāng)宿主中以供克隆和擴(kuò)增。更具體地說(shuō)，質(zhì)?？珊卸嘟求w蛋白聚腺苦酸化信號(hào)(Miller,Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177)和原核生物氨比西林(ampicillin)抗性(aw/7)基因和復(fù)制起點(diǎn)以在大腸桿菌中選擇和繁殖。將外來(lái)基因引入AcNPV的一種常用轉(zhuǎn)移載體為pAc373。也已設(shè)計(jì)出許多所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它載體，包括(例如)pVL985,其將多角體蛋白起始密碼子從ATG變?yōu)锳TT并且在ATT下游32個(gè)堿基對(duì)處引入BamHI克隆位點(diǎn)。參看Luckow和Summers,VIROLOGY170:31(1989)。其它市售載體包括(例如)PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)。插入異源基因后，將轉(zhuǎn)移栽體和野生型桿狀病毒基因組共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞宿主中。將異源DNA引入桿狀病毒中所需位點(diǎn)中的方法已為所屬領(lǐng)域所知。參看Suimners和Smith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555(1987);Smith等人，MOL.CELL.Biol.(1983)3:2156;Luckow和Summers,VIROLOGY(1989)170:31。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)同源雙交換重組插入到基因(諸如多角體蛋白基因)中；也可插入到工程設(shè)計(jì)于所需桿狀病毒基因中的限制性酶位點(diǎn)中。參看Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4):91。轉(zhuǎn)染可通過(guò)電穿孔實(shí)現(xiàn)。參看Trotter和Wood,39MethodsINMolecularBiology(1995);Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501?；蛘撸墒褂弥|(zhì)體利用重組表達(dá)載體和桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞。例如參看Liebman等人，Biotechniques(1999)26(l):36;Graves等人，Biochemistry(1998)37:6050;Nomura等人，J.Biol.Chem.(1998)273(22):13570;Schmidt等人，ProteinExpressionandPurification(1998)12:323;Siffert等人，NatureGenetics(1998)18:45;Tilkins等人，CellBiology:ALaboratoryHandbook145-154(1998);Cai等人，ProteinExpressionandPurification(1997)10:263;Dolphin等人，NatureGenetics(1997)17:491;Kost等人，Gene(1997)1卯:139;Jakobsson等人，J.Biol.Chem.(1996)271:22203;Rowles等人，J.Biol.Chem.(1996)271(37):22376;Reverey等人，J.Biol.Chem.(1996)271(39):23607-10;Stanley等人，J.Biol.Chem.(1995)270:4121;Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2):766;和Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14(2):274。市售脂質(zhì)體包括(例如)Cellfecti禱和Lipofectin(Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA)。此外，還可使用磷酸釣轉(zhuǎn)染法。參看Trotter和Wood,39MethodsinMolecularBiology(1995);Kitts,NAR(1990)18(19):5667;和Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。桿狀病毒表達(dá)載體通常含有桿狀病毒啟動(dòng)子。桿狀病毒啟動(dòng)子是能夠結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并且起始編碼序列(例如，結(jié)構(gòu)基因)下游(3')轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子將具有通常放在接近編碼序列5'端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。桿狀病毒啟動(dòng)子也可具有稱為增強(qiáng)子的第二域，如果存在，那么其通常在結(jié)構(gòu)基因的遠(yuǎn)端。此外，表達(dá)可為經(jīng)調(diào)控表達(dá)或組成性表達(dá)。在感染循環(huán)的后期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供特別有用的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括從編石馬病毒多角體蛋白的基因(Friesen等人,J7/eiegw/af/owo/Sacw/ov/nwGewe五x/^esi7.ow，在THEMOLECULARBiologyOFBaculovi腦s(1986)中;EP0127839和0155476)和編碼p10蛋白的基因(Vlak等人，J.Gen.Virol.(1988)69:765)得到的序列。將新近形成的桿狀病毒表達(dá)載體包裝于感染性重組桿狀病毒中并且隨后可通過(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)對(duì)所生長(zhǎng)的斑塊進(jìn)行純化。參看Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4):91;Summers和Smith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555(1987)。已研發(fā)出重組桿狀病毒表達(dá)載體以感染到若干昆蟲(chóng)細(xì)胞中。舉例來(lái)說(shuō)，已研發(fā)出重組桿狀病毒用于(尤其)埃及斑蚊(ATCC第CCL-125號(hào))、家蠶(ATCC第CRL-8910號(hào))、黑腹果蠅(ATCC第1963號(hào))、草地貪夜蛾和粉紋夜蛾。參看Wright,Nature(1986)321:718;Carbonell等人，J.VIROL.(1985)56:153;Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156。一般參看Fraser等人，/"附raCe止Dev.Biol.(1989)25:225。更具體來(lái)說(shuō)，用于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的細(xì)胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地貪夜蛾)(ATCC第CRL-1711號(hào))、Sf21(草地貪夜蛾)(InvitrogenCorp"目錄號(hào)11497-013(Carlsbad,CA))、Tri-368(粉紋夜蛾)和High-FiveBTI-TN-5B1-4(粉紋夜蛾)。細(xì)胞和培養(yǎng)基可為市售以用于在桿狀病毒/表達(dá)中直接表達(dá)和融合表達(dá)異源多肽，并且細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一般為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。義應(yīng)^麥、瘋卓^霧^;^^&^核##所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知細(xì)菌表達(dá)技術(shù)。多種載體可用于細(xì)菌宿主中。所述載體可以為單一拷貝或者低或高多拷貝載體。載體可用于克隆和/或表達(dá)。鑒于存在有關(guān)載體、許多載體市面有售以及甚至描述載體和其限制性圖語(yǔ)與特征的手冊(cè)的大量文獻(xiàn)，此處就不需要多加論述。眾所周知，載體通常涉及允許選擇的標(biāo)記，這些標(biāo)記可提供細(xì)胞毒性劑抗性、原養(yǎng)性或免疫性。通常，存在將提供不同特征的多種標(biāo)記。細(xì)菌啟動(dòng)子是能夠結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并且起始編碼序列(例如，結(jié)構(gòu)基因)下游(3')轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子將具有通常放在接近編碼序列5'端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。細(xì)菌啟動(dòng)子也可具有稱為操縱子的第二域，其可與開(kāi)始RNA合成的相鄰RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)重疊。當(dāng)基因阻遏蛋白可結(jié)合操縱子并且由此抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，操縱子允許負(fù)調(diào)控(可誘導(dǎo))轉(zhuǎn)錄。組成性表達(dá)可在不存在負(fù)調(diào)控元件(諸如操縱子)的情況下發(fā)生。此外，可通過(guò)基因活化蛋白結(jié)合序列(如果存在，則通常鄰近(5')RNA聚合酶結(jié)合序列)實(shí)現(xiàn)正調(diào)控?；蚧罨鞍椎膶?shí)例為分解代謝物活化蛋白(CAP)，其幫助起始大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等人，Annu.Rev.Genet.(1984)18:173]。因此，調(diào)控表達(dá)可為正或負(fù)調(diào)控表達(dá)，由此增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。編碼代謝路徑酶的序列提供特別有用的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括自糖代謝酶獲得的啟動(dòng)子序列，諸如，半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，NATURE(1977)198:1056]和麥芽糖。其它實(shí)例包括自生物合成酶獲得的啟動(dòng)子序列，諸如色氨酸(trp)[Goeddel等人，Nuc.ACIDSRES.(1980)8:4057;Yelverton等人，Nucl.AcidsRes.(1981)9:731;美國(guó)專利第4,738,921號(hào)；EP公開(kāi)案第036776號(hào)和第121775號(hào)，其是以引用的方式并入本文中〗。P-半乳糖苷酶(bla)啟動(dòng)子系統(tǒng)[Weissmann(1981)"Thecloningofinterferonandothermistakes."InInterferon3(Ed.I.Gresser)]、噬菌體XPL[Shimatake等人，Nature(1981)292:128]和T5[美國(guó)專利第4，689,406號(hào)，其是以引用的方式并入本文]啟動(dòng)子系統(tǒng)也提供有用的啟動(dòng)子序列。可使用強(qiáng)啟動(dòng)子(諸如T7啟動(dòng)子)以高水平誘導(dǎo)所關(guān)注的多肽。所述載體的實(shí)例已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且包括來(lái)自Novagen的pET29系列和WO99/05297(其是以引用的方式并入本文)中所述的pPOP載體。所述表達(dá)系統(tǒng)在不損害宿主細(xì)胞的活力或生長(zhǎng)參數(shù)的情況下于宿主中產(chǎn)生高水平的多肽。pET19(Novagen)為所屬領(lǐng)域已知的另一載體。此外，自然界中不存在的合成啟動(dòng)子也可充當(dāng)細(xì)菌啟動(dòng)子。舉例來(lái)說(shuō)，可將一種細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化序列與另一種細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的操縱子序列連接，從而產(chǎn)生合成雜合啟動(dòng)子[美國(guó)專利第4,551,433號(hào)，其是以引用的方式并入本文中]。舉例來(lái)說(shuō)，tac啟動(dòng)子為由trp啟動(dòng)子與lac操縱子序列構(gòu)成的雜合trp-lac啟動(dòng)子，其受到lac阻遏子調(diào)控[Amann等人，Gene(1983)25:167;deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80:21]。此外，細(xì)菌啟動(dòng)子可包括具有結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并且起始轉(zhuǎn)錄的能力的非細(xì)菌來(lái)源的天然存在啟動(dòng)子。也可將非細(xì)菌來(lái)源的天然存在的啟動(dòng)子與可相容的RNA聚合物偶聯(lián)以使一些基因在原核生物中高水平表達(dá)。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)為偶聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)的實(shí)例[Studier等人，J.Mol.BIOL.(1986)189:113;Tabor等人，ProcNatl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。此外，雜合啟動(dòng)子也可由噬菌體啟動(dòng)子和大腸桿菌操縱子區(qū)構(gòu)成(EP公開(kāi)案第267851號(hào))。除起作用的啟動(dòng)子序列外，有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于原核生物中外來(lái)基因的表達(dá)也有用。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)被稱為Shine-Dalgarno(SD)序列并且包括起始密碼子(ATG)和位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸處3-9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列[Shine等人，Nature(1975)254:34]。認(rèn)為SD序列通過(guò)SD序列與大腸桿菌16SrRNA的3'端之間的堿基配對(duì)來(lái)促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合[Steitz等人"GeneticsignalsandnucleotidesequencesinmessengerRNA"，InBiologicalRegulationandDevelopment:GeneExpression(R.F.Goldberger編，1979)]。為表達(dá)具有弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的真核基因和原核基因[Sambrook等人"ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli",MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989]。術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌宿主"或"細(xì)菌宿主細(xì)胞"是指可用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的細(xì)菌。所述術(shù)語(yǔ)包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始細(xì)菌宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于存在偶發(fā)突變或有意突變，單一親代細(xì)胞的子代的形態(tài)或基因組或總DNA補(bǔ)體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過(guò)相關(guān)特性(諸如，編碼所關(guān)注的多肽的核苷酸序列的存在)表征的親本細(xì)胞的子代包括在本定義所預(yù)期的子代中。表達(dá)多肽的適當(dāng)宿主細(xì)菌的選擇已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。在選擇供表達(dá)的細(xì)菌宿主的過(guò)程中，適當(dāng)?shù)乃拗骺砂ń?jīng)證實(shí)尤其具有良好的包涵體形成能力、低的蛋白水解活性和整體穩(wěn)定性的宿主。細(xì)菌宿主一般可從各種來(lái)源得到，包括(但不限于)加州大學(xué)(Berkeley,CA)生物物理學(xué)和醫(yī)學(xué)物理學(xué)系細(xì)菌基因儲(chǔ)備中心和美國(guó)典型微生物菌種保藏中心("ATCC，，)(Manassas,VA)。工業(yè)/藥物發(fā)酵一^:使用自K菌抹獲得的細(xì)菌(例如W3110)或自B菌抹獲得的細(xì)菌(例如，BL21)。由于這些菌林的生長(zhǎng)參數(shù)眾所周知并且相當(dāng)穩(wěn)定，故其特別有用。此外，這些菌林為非病原性菌林，出于安全和環(huán)境原因，其在商業(yè)上也極為重要。適當(dāng)大腸桿菌宿主的其它實(shí)例包括(但不限于)菌抹BL21、DH10B或其衍生物。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施例中，大腸桿菌宿主為負(fù)蛋白酶菌林(proteaseminusstrain),包括(但不限于)OMP-和LON-。宿主細(xì)胞抹可為假單胞菌屬，包括(但不限于)熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌。已知焚光假單胞菌生物型1(稱為菌林MB101)對(duì)于重組制造有用并且可用于治療性蛋白質(zhì)的制造過(guò)程中。假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括購(gòu)自TheDowChemicalCompany的系統(tǒng)作為宿主菌抹(Midland,MI，可在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)dow.com上獲得)。美國(guó)專利第4,755,465號(hào)和第4,859,600號(hào)(以引用的方式并入本文中)中描述假單胞菌菌抹作為宿主細(xì)胞用于hGH制造的用途。在產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞林(即，已將表達(dá)構(gòu)筑體引入宿主細(xì)胞中并且將具有適當(dāng)表達(dá)構(gòu)筑體的宿主細(xì)胞分離)后，在適于制造所關(guān)注的多肽的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞林。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，重組宿主細(xì)胞抹的培養(yǎng)方法將視所利用的表達(dá)構(gòu)筑體的性質(zhì)和宿主細(xì)胞的身份而定。通常使用所屬領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)培養(yǎng)重組宿主菌林。重組宿主細(xì)胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽源并且視情況含有維生素、氨基酸、生長(zhǎng)因子和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它蛋白質(zhì)培養(yǎng)補(bǔ)充物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)宿主細(xì)胞的液體培養(yǎng)基可視情況含有用于防止不需要的微生物生長(zhǎng)的抗生素或抗真菌劑，和/或用于選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的化合物，包括(但不限于)抗生素。可以分批或連續(xù)方式培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，且以分批或連續(xù)方式進(jìn)行細(xì)胞采集(在所關(guān)注的多肽在細(xì)胞內(nèi)積累的情況中)或進(jìn)行培養(yǎng)物上清液的采集。對(duì)于在原核宿主細(xì)胞中制造來(lái)說(shuō)，優(yōu)選分批培養(yǎng)和細(xì)胞采集。選擇性密碼子本發(fā)明的選擇性密碼子擴(kuò)展蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器的遺傳密碼子框架。舉例來(lái)說(shuō)，選擇性密碼子包括(例如)獨(dú)特的三堿基密碼子；無(wú)義密碼子，諸如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA);非天然密碼子；四堿基(或更多堿基)密碼子；稀有密碼子等?？蓪⒍鄠€(gè)(例如一個(gè)或一個(gè)以上、兩個(gè)或兩個(gè)以上、三個(gè)或三個(gè)以上等)選擇性密碼子引入所需基因或多肽中。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法涉及使用為終止密碼子的選擇性密碼子以在活體內(nèi)并入所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)。舉例來(lái)說(shuō)，制造識(shí)別終止密碼子并且通過(guò)O-RS用所選氨基酸氨?；腛-tRNA。天然存在的宿主氨酰基tRNA合成酶不識(shí)別所述O-tRNA?？墒褂贸Ｒ?guī)定點(diǎn)誘變將終止密碼子引入所關(guān)注的多肽中的所關(guān)注的位點(diǎn)處。侈']:ft口參看Sayers，J.R.等人(1988)，5'-3'五xowwc/eosesp^os/Aon3f/n'oflfe-6oset/o//gowwc/eo^fe-A>e"ed附wtogewes/s.NucleicAcidsRes.16:791-802。當(dāng)例^口在活體內(nèi)^夸O-RS、O-tRNA和編碼所關(guān)注的多肽的核酸組合時(shí)，響應(yīng)終止密碼子而并入所選氨基酸從而得到在特定位置處含有所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用作選擇性密碼子的終止密碼子為琥珀密碼子UAG和/或蛋白石密碼子UGA。舉例來(lái)說(shuō)，有關(guān)識(shí)別琥珀密碼子的O-tRNA的實(shí)例參看SEQIDNO.:6,并且有關(guān)識(shí)別蛋白石密碼子的O-tRNA的實(shí)例參看SEQIDNO.:7。將UAG和UGA用作選擇性密碼子的遺傳密碼可在保留赭石無(wú)義密碼子UAA(其為最豐富的終止信號(hào))的同時(shí)編碼22個(gè)氨基酸。在活體內(nèi)并入所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)可在不顯著干擾宿主細(xì)胞的情況下進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，在非真核細(xì)胞(諸如大腸桿菌)中，由于UAG密碼子的抑制效率視O-tRNA(例如，琥珀抑制性tRNA)與釋放因子1(RF1)(其與UAG密碼子結(jié)合并且起始正在生長(zhǎng)的肽從核糖體釋放)之間的竟?fàn)幎?，故所述抑制效率?例如)通過(guò)增加O-tRNA(例如，抑制性tRNA)的表達(dá)水平或使用RF1缺陷型菌抹來(lái)加以調(diào)節(jié)。在真核細(xì)胞中，由于UAG密碼子的抑制效率視O-tRNA(例如，琥珀抑制性tRNA)與真核釋放因子(例如，eRF)(其結(jié)合終止密碼子并且起始正在生長(zhǎng)的肽從核糖體釋放)之間的竟?fàn)幎?，故所述抑制效率?例如)通過(guò)增加O-tRNA(例如，抑制性tRNA)的表達(dá)水平來(lái)加以調(diào)節(jié)。非天然氨基酸也可用稀有密碼子來(lái)編碼。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)活體外蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中精氨酸的濃度降低時(shí)，經(jīng)證實(shí)，稀有的精氨酸密碼子AGG對(duì)于通過(guò)經(jīng)丙氨酸酰基化的合成tRNA插入Ala有效。例如參看Ma等人，Biochemistry.32:7939(1993)。在這一情況中，合成tRNA與在大腸桿菌中作為少量物質(zhì)存在的天然存在的tRNAArg竟?fàn)帯Ｒ恍┯袡C(jī)體不使用所有三聯(lián)體密碼子。已將藤黃微球菌(M/ctococcm/w^m)中的未指定密碼子AGA用于在活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯提取物中插入氨基酸。例如參看Kowal和Oliver,Nucl.Acid.Res..25:4685(1997)?？僧a(chǎn)生本發(fā)明的組件以在活體內(nèi)使用這些稀有密碼子。選擇性密碼子也包含擴(kuò)充的密碼子，例如四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子，諸如四堿基密碼子、五堿基密碼子、六堿基密碼子或更多個(gè)堿基的密碼子。四堿基密碼子的實(shí)例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五堿基密碼子的實(shí)例包括(但不P艮于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。特征可包括基于移碼抑制使用擴(kuò)充的密碼子。四個(gè)或四個(gè)以上石咸基的密碼子可將(例如)一個(gè)或多個(gè)所選氨基酸(包括但不限于，非天然氨基酸)插入同一蛋白質(zhì)中。舉例來(lái)說(shuō)，在存在具有反密碼子環(huán)、例如具有CU(X)nXXXAA序歹'J(其中n=l)的突變O-tRNA(例如，特定移碼抑制性tRNA)的情況下，將四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子讀作單一氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，有關(guān)識(shí)別四堿基密碼子的O-tRNA參看PCT/US04/22061的SEQIDNO.:6、12。在其它實(shí)施例中，反密碼子環(huán)可解碼(例如)至少四堿基密碼子、至少五堿基密碼子或至少六堿基密碼子或更多堿基的密碼子。由于存在256個(gè)可能的四堿基密碼子，故可在同一細(xì)胞中使用四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子編碼多個(gè)非天然氨基酸。參看Anderson等人，(2002)f/eo/CWow^""'codo"57ze,ChemistryandBiology,9:237-244;Magliery,(2001)五xp朋WwgGewWcCWe:5We"/o"o/^c/eWSw/;pr咖oryJ/praac/^sc/zm'c/n'aco//，J.Mol.Biol.307:755-769。舉例來(lái)說(shuō)，已使用四堿基密碼子使用活體外生物合成方法將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參看Ma等人，(1993)Biochemistry,32:7939;和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121:34。使用CGGG和AGGU利用兩個(gè)以化學(xué)方式酰基化的移碼抑制性tRNA在活體外將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物同時(shí)并入抗生蛋白鏈菌素中。例如參看Hohsaka等人.(1999、J.Am.Chem.Soc.121:12194。在活體內(nèi)研究中，Moore等人檢查具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，并且發(fā)現(xiàn)四聯(lián)體UAGA可以通過(guò)具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13%到26%的效率解碼且在0或-1框內(nèi)極少解碼。參看Moore等人,(2000)J.Mol.Biol.298:195。在一個(gè)實(shí)施例中，可將基于稀有密碼子或無(wú)義密碼子的擴(kuò)充的密碼子用于本發(fā)明中，其可減少錯(cuò)義通讀和其它不合需要的位點(diǎn)處的移碼抑制。對(duì)于指定系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，選擇性密碼子也可包括一個(gè)天然三堿基密碼子，其中內(nèi)源系統(tǒng)不使用(或極少使用)天然堿基密碼子。舉例來(lái)說(shuō)，這包括缺乏識(shí)別天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)和/或三堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。選擇性密碼子視情況包括非天然堿基對(duì)。這些非天然堿基對(duì)使現(xiàn)有的遺傳代碼進(jìn)一步擴(kuò)展。一種額外的堿基對(duì)使三聯(lián)體密碼子的數(shù)量從64增加到125。第三堿基對(duì)的特性包括穩(wěn)定且具選擇性的堿基配對(duì)、通過(guò)聚合酶以高保真度有效酶促并入DNA中和合成新的非天然堿基對(duì)之后有效的持續(xù)引物延伸?？捎糜诜椒ê徒M合物的非天然堿基對(duì)的描述包括(例如)Hirao等人,(2002)w朋她ra/6cwe/or/"corpora/iwgoww'wofl朋/ogwes/咖/rato'",NatureBiotechnology,20:177-182。還參看Wu，Y.等人,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相關(guān)公開(kāi)案列于下文中。對(duì)于活體內(nèi)使用來(lái)說(shuō)，非天然核苷可滲透膜并且磷酸化形成相應(yīng)的三磷酸鹽。此外，增加的遺傳信息穩(wěn)定并且不^t細(xì)胞酶所^:壞。Benner和其它人先前的工作利用不同于規(guī)^范Watson-Crick配對(duì)的氫鍵:才莫式，最值得關(guān)注的實(shí)例為iso-C:iso-G配對(duì)。例如參看Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc,111:8322;和Piccirilli等人，(19卯)Nature,343:33;Kool,(2000、Curr.Opin.Chem.Biol..4:602。一般說(shuō)來(lái)，這些堿基以某種程度與天然堿基錯(cuò)配并且無(wú)法酶促?gòu)?fù)制。Kool和同事證實(shí)，堿基之間的疏水堆積相互作用可替代氫鍵以驅(qū)動(dòng)堿基對(duì)的形成。參看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4:602:和Guckian和Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36,2825。在研發(fā)滿足所有上述需求的非天然堿基對(duì)的工作中，Schultz、Romesberg和同事已系統(tǒng)地合成一系列非天然疏水堿基并且對(duì)其進(jìn)行研究。已發(fā)現(xiàn)，PICS:PICS自身配對(duì)比天然堿基對(duì)穩(wěn)定，并且能夠通過(guò)大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如參看McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121:11585-6;和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc,122:3274。3MN:3MN自身配對(duì)可通過(guò)KF以足以用于生物功能的效率和選擇性合成。例如參看Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc,122:8803。然而，兩種堿基都充當(dāng)用于進(jìn)一步復(fù)制的鏈終止子。近來(lái)已開(kāi)發(fā)出可用于復(fù)制PICS自身配對(duì)的突變體DNA聚合酶。此外，可復(fù)制7AI自身配對(duì)。例如參看Tae等人,(2001)J.Am.Chem.Soc,123:7439。也已開(kāi)發(fā)出新穎的金屬堿基對(duì)Dipic:Py,其在結(jié)合Cu(II)后形成穩(wěn)定的配對(duì)。參看Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.§^122:10714。由于擴(kuò)充的密碼子和非天然密碼子內(nèi)在地與天然密碼子正交，故本發(fā)明的方法可利用這一特性產(chǎn)生正交tRNA供其使用。也可使用翻譯旁路系統(tǒng)將所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)并入所需多肽中。在翻譯旁路系統(tǒng)中，將較大序列插入基因中但并不被翻譯成蛋白質(zhì)。所述序列含有充當(dāng)誘導(dǎo)核糖體越過(guò)所述序列并且在插入下游重新開(kāi)始翻譯的線索的結(jié)構(gòu)。經(jīng)選擇且非天然的氨基酸如本文所使用，所選氨基酸是指任何所需的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。天然存在的氨基酸包括二十種遺傳編碼的a-氨基酸中的任一種丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲疏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。在一個(gè)實(shí)施例中，將所選氨基酸以高保真度(例如)以對(duì)指定的選擇性密碼子大于約70%的效率、對(duì)指定的選擇性密碼子大于75%的效率、對(duì)指定的選擇性密碼子大于約80%的效率、對(duì)指定的選擇性密碼子大于約85%的效率、對(duì)指定的選擇性密碼子大于約90%的效率、對(duì)指定的選擇性密碼子大于約95%的效率或?qū)χ付ǖ倪x擇性密碼子大于約99%或更高的效率并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈中。如本文所使用，非天然氨基酸是指任何氨基酸、經(jīng)修飾氨基酸或除硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸和以下二十種遺傳編碼的a-氨基酸外的氨基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。a-氨基酸的通用結(jié)構(gòu)如式I中所示非天然氨基酸通常為具有式I的任何結(jié)構(gòu)，其中R基團(tuán)為除二十種天然氨基酸中所用基團(tuán)外的任何取代基。有關(guān)二十種天然氨基酸的結(jié)構(gòu)例如參看L.Stryer的說(shuō)oc/2e/m'sfr乂第3版1988,FreemanandCompany,NewYork。應(yīng)注意，本發(fā)明的非天然氨基酸可為除上述二十種a-氨基酸外的天然存在的化合物。由于本發(fā)明的非天然氨基酸與天然氨基酸的不同之處通常僅在于側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)，故非天然氨基酸與其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然)以與其在天然存在的蛋白質(zhì)中形成酰胺鍵相同的方式形成酰胺鍵。然而，非天然氨基酸具有使其與天然氨基酸相區(qū)別的側(cè)鏈基團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，式I的R可包含烷基-、芳基-、?；?、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、面基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、勵(lì)基-、磺?；?、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦?；㈧?、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、酉旨、硫代酸、羥胺、胺等，或其任何組合。其它非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含感光交聯(lián)劑的氨基酸、自旋標(biāo)記的氨基酸、熒光氨基酸、結(jié)合金屬的氨基酸、含金屬的氨基酸、放射性氨基酸、具有新穎官能團(tuán)的氨基酸、與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸、光籠鎖(photocaged)和/或光致異構(gòu)化氨基酸、包含生物素或生物素類似物的氨基酸、糖基化氨基酸(諸如經(jīng)糖取代的絲氨酸)、其它碳水化合物修飾的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化學(xué)裂解和/或可光裂解的氨基酸、與天然氨基酸相比具有較長(zhǎng)側(cè)鏈(包括但不限于，聚醚或長(zhǎng)鏈烴，包括但不限于，大于約5個(gè)或大于約10個(gè)碳原子)的氨基酸、含碳連接的糖的氨基酸、具有氧化還原活性的氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一個(gè)或一個(gè)以上有毒部分的氨基酸。也參看美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)案2003/0082575和2003/0108885,其是以引用的方式并入本文中。非天然氨基酸可具有用于(例如)將蛋白質(zhì)與固體支撐物連接的感光交聯(lián)劑。非天然氨基酸可具有連接到氨基酸側(cè)鏈的糖部分。除含有新穎側(cè)鏈的非天然氨基酸外，非天然氨基酸還視情況包含經(jīng)修飾的主鏈結(jié)構(gòu)，例如，如式II和III的結(jié)構(gòu)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R';X和Y可相同或不同且通常包含S或0;且R和R'視情況相同或不同且通常選自與上文關(guān)于具有式I的非天然氨基酸所述的R基的組分相同的列表以及氫。舉例來(lái)說(shuō)，如式II和III所示，非天然氨基酸可在氨基或羧基上包含取代。此類非天然氨基酸包括(但不限于)(例如)具有與常見(jiàn)二十種天然氨基酸相對(duì)應(yīng)的側(cè)鏈或非天然側(cè)鏈的a-羥基酸、a-硫代酸、a-氨基硫代羧酸酯。此外，a-碳的取代視情況包括L、D或a-a雙取代氨基酸，諸如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-曱基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它結(jié)構(gòu)替代選擇包括環(huán)狀氨基酸，諸如脯胺酸類似物以及3、4、6、7、8和9元環(huán)脯胺酸類似物；(3和y氨基酸，諸如經(jīng)取代p-丙氨酸和y-氨基丁酸。許多非天然氨基酸都是建立在天然氨基酸(諸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等)的基礎(chǔ)上。酪氨酸類似物包括對(duì)位取代的酪氨酸、鄰位取代的酪氨酸和間位取代的酪氨酸，其中所述經(jīng)取代酪氨酸包含酮基(包括但不限于，乙?；?、苯曱?；?、氨基、肼、羥胺、硫醇基、羧基、異丙基、曱基、Cs-C2o直鏈或支鏈烴、飽和或不飽和烴、O-曱基、聚瞇基、硝基等。此外，也涵蓋多取代的芳環(huán)。谷氨酰胺類似物包括(但不限于)a-羥基衍生物、y取代的衍生物、環(huán)狀衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。苯丙氨酸類似物的實(shí)例包括(但不限于)對(duì)位取代的苯丙氨酸、鄰位取代的苯丙氨酸和間位取代的苯丙氨酸，其中所述取代基包含羥基、曱氧基、曱基、烯丙基、醛、疊氮基、碘基、溴基、酮基(包括但不限于，乙?；?等。非天然氨基酸的特定實(shí)例包括(但不限于)對(duì)乙?；?L-苯丙氨酸、對(duì)炔丙基-苯丙氨酸、O-曱基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-曱基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙?；?GlcNAcp-絲氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)?；?L-苯丙氨酸、對(duì)苯甲?；?L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦?；z氨酸、膦?；野彼?、對(duì)碘-苯丙氨酸、對(duì)溴苯丙氨酸、對(duì)氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸和對(duì)炔丙基氧基-苯丙氨酸等。多種非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)的實(shí)例提供于(例如)名稱為"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids，，的WO2002/085923中，其是以引用的方式并入本文中。關(guān)于其它曱石危氨酸類似物參看Kiick等人,(2002)/"corpom"owo/az/c/es/WorecomWwaW/7r0e/ws/orc/ewcwe/ec"ve附odzycaf/ow6少5^awfi/wger//gaf/ow,PNAS99:19-24，其是p乂引用的方式并入本文中。并入多肽的氨基末端處的非天然氨基酸可由除二十種天然氨基酸中所使用的取代基以外的任何取代基R基和不同于通常存在于a-氨基酸中的NH2基團(tuán)的第二反應(yīng)性基團(tuán)(參看式I)構(gòu)成。具有不同于通常存在于a-氨基酸中的COOH基團(tuán)的第二反應(yīng)性基團(tuán)(參看式I)的類似非天然氨基酸可并入羧基末端處。本發(fā)明的非天然氨基酸可經(jīng)選擇或經(jīng)設(shè)計(jì)以提供二十種天然氨基酸不可得的額外特征。舉例來(lái)說(shuō)，可視情況對(duì)非天然氨基酸進(jìn)行設(shè)計(jì)或選擇以改變(例如)并入所迷氨基酸的蛋白質(zhì)的生物特性。舉例來(lái)說(shuō)，可視情況通過(guò)將非天然氨基酸包涵于蛋白質(zhì)中來(lái)改變以下特性毒性、生物學(xué)分布、溶解性、穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性、水解穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、對(duì)酶降解的抗性等)、純化和加工的便利性、結(jié)構(gòu)特性、光譜特性、化學(xué)和/或光化學(xué)特性、催化活性、氧化還原電位、半衰期、與其它分子(例如)共價(jià)或非共價(jià)反應(yīng)的能力等。多種非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)提供于(例如)名稱為"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids"的WO2002/085923的圖16、17、18、19、26和29中，其是以引用的方式并入本文中。所述實(shí)例不打算以任何方式限制可與本發(fā)明的tRNA連接的氨基酸。非天然氨基酸的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，其提供可用于加入額外分子的額外化學(xué)部分。這些修飾可在活體內(nèi)于真核或非真核細(xì)胞中或活體外進(jìn)行。因此，在某些實(shí)施例中，翻譯后修飾是通過(guò)非天然氨基酸進(jìn)行。多肽中的非天然氨基酸可用于將另一分子與所述多肽連接，所述分子包括(但不限于)標(biāo)記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯(lián)劑、放射性核、細(xì)胞毒性化合物、藥物、親和標(biāo)記、光親和標(biāo)記、反應(yīng)性化合物、樹(shù)脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苦酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、糖類、水溶性樹(shù)枝狀高分子、環(huán)糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米顆粒、自旋標(biāo)記、熒光團(tuán)、含金屬部分、放射性部分、新穎官能團(tuán)、與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)、光籠鎖部分(photocagedmoiety)、光化輻射可激發(fā)部分、光致異構(gòu)化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、并入重原子的部分、化學(xué)方式可裂解基團(tuán)、光可裂解基團(tuán)、延長(zhǎng)的側(cè)鏈、經(jīng)碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經(jīng)同位素標(biāo)記部分、生物物理學(xué)探針、發(fā)磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、電子致密基團(tuán)、磁性基團(tuán)、插入基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、能量轉(zhuǎn)移劑、生物活性劑、可檢測(cè)標(biāo)記、小分子、量子點(diǎn)、納米傳導(dǎo)物或上述物質(zhì)的任何組合或任何其它所需化合物或物質(zhì)；所述連接包含利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適用于特定反應(yīng)性基團(tuán)的化學(xué)方法將第二反應(yīng)性基團(tuán)與至少一個(gè)包含第一反應(yīng)性基團(tuán)的非天然氨基酸連接。舉例來(lái)說(shuō)，翻譯后修飾可通過(guò)親核-親電反應(yīng)進(jìn)行。目前用于選擇性修飾蛋白質(zhì)的大部分反應(yīng)都涉及在親核與親電反應(yīng)搭配物之間形成共價(jià)鍵，包括(但不限于)a-囟酮與組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)。在這些情況下，選擇性是通過(guò)蛋白質(zhì)中親核殘基的數(shù)量和可接近性決定。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，可使用其它更具選擇性的反應(yīng)，諸如非天然酮基氨基酸與酰肼或氨基氧基化合物于活體外和活體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)。例如參看Comish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science.276:1125-1128;Wang等人，(2001)Science292:498-500;Chin等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:卯26-9027;Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024:Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry,42:6735-6746;和Chin等人.(2003)Science,301:964-7，所有參考文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。這使得能夠用包括熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖衍生物和細(xì)胞毒性分子的大量試劑選擇性標(biāo)記幾乎任何蛋白質(zhì)。也參看名稱為"Glycoproteinsynthesis"的美國(guó)專利第6,927,042號(hào)，其是以引用的方式并入本文中。翻譯后修飾(包括但不限于，通過(guò)疊氮基氨基酸進(jìn)行的修飾)也可通過(guò)施陶丁格連接(Staudingerligation)(包括但不限于，利用三芳基膦試劑)進(jìn)行。例如參看Kiick等人，(2002)/wcorpora"owo/az/cfes/wforeco附6她w/"/>rafez>w/orc/2e,se/e"/ve,i/zyc加'ow6少AeS似w&wger//ga/7'ow,PNAS99:19-24。非天然氨基酸的化學(xué)合成許多非天然氨基酸都是購(gòu)自(例如)Sigma-Aldrich(St.Louis,MO，USA)、Novabiochem(EMDBiosciences的分公司，Darmstadt,Germany)或Peptech(Burlington,MA,USA)。非市售的非天然氨基酸是視情況如本文所提供或使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成。有關(guān)有沖幾合成技術(shù)，例如參看Fessendon和Fessendon的OrganicChemistry,(1982，第2版，WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,WileyandSons,NewYork);以及Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，第A和B部分，19卯，PlenumPress,NewYork)。描述非天然氨基酸的合成的其它公開(kāi)案包括(例如)名稱為"InvivoincorporationofUnnaturalAminoAcids，，的WO2002/085923;Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem..38,4660-4669;King,F.E.&Kidd,D.A.A.(1949)JiView5^w/力es"o/G7w,a;w/wecr/w/0/y-Dz》ep"V/eso/G7"Z"w/cJc/d々ow戶/^/2y/a^ec//w"rwed/fl&s.j.Chem.Soc,3315-3319;Friedman,O.M.&Chatterrji,R.(1959)Sy"^2e57.51o/Z)en'va/7veso/G/w^wi/weasMoJe/SwZ)Wraf/e51/orJw/i-Tlwworj.Am.Chem.Soc.81,3750-3752;Craig,j.C.等人(1988)愈o/w/eC—g固"owo/Ae(ICTz/orogMz'wej.j.Org.Chem.53,1167-1170;Azoulay，M.,Vilmont,M.&Frappier，F(xiàn).G/w^/w/wetma/ogwesas_PoZew/ia/Jwf/wa/aWa/s,Eur.J.Med.Chem.26,201-5;Koskinen,A.M.P.&Rapoport,H.(1989)外威e^o/4-SW65f/加eciVo/fwesas1Co"/or附加'owa〃yCow欲cn'we"/m-""c7'"wa/ogwes.J.Org.Chem.54,1859-1866;Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)0/Pp/ica〃y_Pwe尸z》eco/fl/e51女om丄-爿5^flrflg/"e.J/Tp/Zcaf/owJ.Org.Chem.50:1239-1246;Barton等人，(1987)外w&e;^o/iVove/—/m-J/m'wo-Jc/AawfiZ)er/vWvej[Zs7wgicrc//cfl/C77em/價(jià)乂'5^"http://^/51o/丄-awe/Dm'vWves.Tetrahedron43:4297-4308;和Subasinghe等人,Qw/wwa//cac/c/flwa/ogww5^w/72e57'so/2-a附z.Mo/^o/7flMo/caddt/m.vWvesa"/v//yawove/—5^w/她-5^w礎(chǔ)zedWe.J.Med.Chem.35:4602-7。還參看名稱為"ProteinArrays，，的美國(guó)專利公開(kāi)案第US2004/0198637號(hào)，其是以引用的方式并入本文中。非天然氨基酸的細(xì)胞吸收細(xì)胞對(duì)非天然氨基酸的吸收是在設(shè)計(jì)和選擇(例如)并入蛋白質(zhì)中的非天然氨基酸時(shí)通?？紤]的一個(gè)問(wèn)題。舉例來(lái)說(shuō)，a-氨基酸的高電荷密度表明這些化合物可能無(wú)法滲透細(xì)胞。天然氨基酸是通過(guò)基于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的收集而吸收到細(xì)胞中。可進(jìn)行評(píng)定何種非天然氨基酸(如果存在)被細(xì)胞吸收的快速篩選。例如參看，例如名稱為"ProteinArrays"的美國(guó)專利公開(kāi)案第US2004/0198637號(hào)中的毒性檢定，所述專利是以引用的方式并入本文中；和Liu,D.R.&Schultz,P.G.(1999)/Vogre^"wardevo/w"owo/cmorgam'57wawex/flwtfefigewedccocfe.PNASUnitedStates96:4780-4785。盡管易于利用多種檢定分析吸收，但設(shè)計(jì)可用于細(xì)胞吸收路徑的非天然氨基酸的替代選擇在于提供生物合成路徑以在活體內(nèi)產(chǎn)生氨基酸。非天然氨基酸的生物合成許多生物合成路徑已存在于細(xì)胞中以制造氨基酸和其它化合物。盡管自然界(包括但不限于，細(xì)胞)中可能不存在有關(guān)特定非天然氨基酸的生物合成方法，但本發(fā)明將提供此類方法。舉例來(lái)說(shuō)，視情況通過(guò)加入新酶或改變現(xiàn)有的宿主細(xì)胞路徑在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生非天然氨基酸的生物合成路徑。額外的新酶為視情況天然存在的酶或人工開(kāi)發(fā)的酶。舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)氨基苯丙氨酸的生物合成方法(如名稱為"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids，，的WO2002/085923中的實(shí)例所提出)取決于加入來(lái)自其它有機(jī)體的已知酶的組合?？赏ㄟ^(guò)用包含這些酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞來(lái)將所述基因引入細(xì)胞中。當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述基因?qū)⑻峁┖铣伤杌衔锏拿复俾窂?。視情況加入的此類酶的實(shí)例將提供于下文的實(shí)例中。其它酶序列(例如)見(jiàn)于基因庫(kù)(Genbank)中。也^見(jiàn)情況以相同方式將人工開(kāi)發(fā)的酶加到細(xì)胞中。以此方式，對(duì)細(xì)胞機(jī)器和細(xì)胞資源加以操縱以制造非天然氨基酸。多種方法可用于制造新穎的酶以用于生物合成路徑中或用于發(fā)展現(xiàn)有路徑。舉例來(lái)說(shuō)，視情況使用(例如，如Maxygen,Inc所開(kāi)發(fā))的遞歸式重組(可于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)maxygen.com獲得)來(lái)開(kāi)發(fā)新穎的酶和路徑。例如參看Stemmer(1994),iaj!Wevo/w"owo/a戸Wmv"ro房jNature370(4):389-391;和Stemmer,(1994),ev由z》",Proc.Natl.Acad.Sd.USA.,91:10747-10751。類似地，視情況將Genencor(可于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)genencor.com獲得)開(kāi)發(fā)的DesignPathTMM于代謝路徑工程設(shè)計(jì)中(例如)工程設(shè)計(jì)在細(xì)胞中產(chǎn)生O-甲基-L-酪氨酸的路徑。這一技術(shù)使用新基因(包括但不限于，通過(guò)功能性基因組鑒別的基因)的組合以及分子進(jìn)化和設(shè)計(jì)在宿主有機(jī)體中重建現(xiàn)有路徑。DiversaCorporation(可于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)diversa.com獲得)也提供快速篩選基因文庫(kù)和基因路徑(包括但不限于)以產(chǎn)生新路徑的技術(shù)。通常，利用本發(fā)明的經(jīng)工程設(shè)計(jì)的生物合成路徑制造的非天然氨基酸是以足以有效細(xì)胞資源的程度的濃度產(chǎn)生?；铙w內(nèi)以此方式產(chǎn)生的典型濃度為約10mM到約0.05mM。在利用包含用于制造特定路徑所需的酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞并且產(chǎn)生非天然基酸之后，視情況使用活體內(nèi)選擇以使用于核糖體蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的非天然氨基酸的制造進(jìn)一步優(yōu)化。核酸和多肽序列以及變異體如上下文所述，本發(fā)明提供核酸聚核苷酸序列和多肽氨基酸序列，例如tRNA和RS，以及(例如)包含所迷序列的組合物和方法。所述序列(例如，tRNA和RS)的實(shí)例揭示于本文中。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解本發(fā)明不限于本文(例如，實(shí)例)所揭示的序列。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，本發(fā)明還提供許多具有本文所述的功能(例如，編碼O-tRNA或O-RS)的相關(guān)和不相關(guān)序列。本發(fā)明提供多肽(O-RS)和聚核苷酸(例如O-tRNA)、編碼O-RS或其部分的聚核苷酸、用于分離氨?；鵷RNA合成酶克隆的寡核普酸等。本發(fā)明的聚核普酸包括利用一個(gè)或一個(gè)以上選擇性密碼子編碼本發(fā)明的所關(guān)注蛋白質(zhì)或多肽的聚核普酸。此外，本發(fā)明的聚核苷酸包括(例如)包含如SEQIDNO.:1、2、3中任一者所述的核苦酸序列的聚核苷酸、與其互補(bǔ)的聚核苷酸或其保守變異體。類似地，在高嚴(yán)格度條件下與實(shí)質(zhì)上超過(guò)核酸全長(zhǎng)的上文所述的聚核苷酸雜交的核酸為本發(fā)明的聚核普酸。在某些實(shí)施例中，載體(例如，質(zhì)粒、柯斯質(zhì)粒(cosmid)、噬菌體、細(xì)菌、病毒、棵聚核苷酸、連結(jié)的聚核苷酸等)包含本發(fā)明的聚核脊酸。在一個(gè)實(shí)施例中，載體為表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)載體包括可操作地連接到一個(gè)或一個(gè)以上本發(fā)明的聚核苷酸的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞包含包括本發(fā)明的聚核苦酸的載體。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員還將了解，所揭示序列的許多變異體包括在本發(fā)明中。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明包括得到在功能上相同的序列的所揭示序列的保守變異體。認(rèn)為核酸聚核普酸序列的變異體(其中所述變異體與至少一個(gè)所揭示序列雜交)包括在本發(fā)明中。如通過(guò)(例如)標(biāo)準(zhǔn)序列比較技術(shù)測(cè)定的本文所揭示的序列的獨(dú)特子序列也包括在本發(fā)明中。保守變異體歸因于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，"沉默取代(silentsubstitution)，，(即，不會(huì)引起所編碼的多肽改變的核酸序列的取代)為編碼氨基酸的各核酸序列所暗含的特征。類似地，"保守氨基酸取代"(即，氨基酸序列中一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸經(jīng)具有高度相似性的不同氨基酸取代)也易于鑒別為與所揭示的構(gòu)筑體高度相似。所述各所揭示的序列的保守變異體為本發(fā)明的特征。特定核酸序列的"保守變異體"是指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或當(dāng)所述核酸不編碼氨基酸序列時(shí)是指基本上相同的序列。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，改變、添加或缺失經(jīng)編碼序列中的單一氨基酸或少量氨基酸的個(gè)別取代、缺失或添加為"保守性修飾變異"或"保守性修飾變異體"，其中所述改變將導(dǎo)致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或化學(xué)上類似的氨基酸對(duì)氨基酸的取代。因此，本發(fā)明所列多肽序列的"保守變異"包括少量、通常小于5%、更通常小于4%、2%或1%的多肽序列的氨基酸經(jīng)具有相同保守取代基團(tuán)的保守性所選氨基酸取代。不改變核酸分子的編碼活性的序列的添加(諸如，非功能性序列的添加)為基本核酸的保守變異。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知提供功能類似的氨基酸的保守取代表。以下八個(gè)群組各含有彼此互為保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)絲氨酸(S)、蘇氛酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(例如參看Creighton,iVoto'朋dMo/ecw/flr/Vo/eWes(WHFreeman&Co.;第2版(1993年12月))。核酸雜交可使用比較雜交來(lái)鑒別本發(fā)明的核酸，諸如SEQIDNO.:1-3，包括本發(fā)明核酸的保守變異體，并且所述比較雜交方法是區(qū)別本發(fā)明的核酸的優(yōu)選方法。此外，與SEQIDNO:l-3所示的核酸在高、超高和/或極高嚴(yán)格度條件下雜交的靶核酸為本發(fā)明的特征。所述核酸的實(shí)例包括與指定的核酸序列相比具有一個(gè)或數(shù)個(gè)沉默或保守核酸取代的核酸。當(dāng)測(cè)試核酸以其與最佳匹配的互補(bǔ)靶雜交的至少1/2水平與探針雜交時(shí)，也就是說(shuō)，以高達(dá)探針與靶在最佳匹配的探針以高達(dá)關(guān)于與不匹配靶核酸所觀察的信雜比的至少約5x-10x的信雜比與最佳匹配的互補(bǔ)耙結(jié)合的條件下雜交的信雜比的至少1/2信雜比雜交時(shí)，認(rèn)為所述測(cè)試核酸與探針核酸特異性雜交。當(dāng)核酸通常在溶液中締合時(shí)，其"雜交"。核酸因存在多種良好表征的物理化學(xué)力(諸如氫鍵、溶劑排斥、堿基堆疊等)而雜交。短語(yǔ)"嚴(yán)格雜交條件"是指如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知的低離子強(qiáng)度和高溫條件。通常，在嚴(yán)格條件下，探針將與其在核酸復(fù)雜混合物(包括但不限于，全細(xì)胞或者DNA或RNA文庫(kù))中的靶子序列雜交，但不與所述復(fù)雜混合物中的其它序列雜交。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見(jiàn)于Tijssen(1993)丄Worator少第2章第I部分,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,"(Elsevier,NewYork),以及Ausubel等人，Ci^reWiVotoco/sMo/ecw/ar5Zo/ogy(7P95)中。Hames和Higgins(1995)GeneProbes1IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford,England,(HamesandHigginsl)以及Hames和Higgins(1995)GeneProbes2IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford,England(HamesandHiggins2)中提供有關(guān)合成、標(biāo)記、檢測(cè)和量化DNA和RNA(包括寡核苷酸)的細(xì)節(jié)。一般來(lái)說(shuō)，在指定離子強(qiáng)度和pH值下，選擇比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5-10。C的嚴(yán)格條件。Tm為與靶互補(bǔ)的50%的探針在平衡狀態(tài)下與靶序列雜交(當(dāng)在Tm下靶序列過(guò)量存在時(shí)，在平衡狀態(tài)時(shí)占據(jù)50%探針)的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH值和核酸濃度下)。嚴(yán)格條件可為在pH7.0到8.3下鹽濃度小于約l.OM鈉離子、通常為約0.01到l.OM鈉離子濃度(或其它鹽)以及溫度對(duì)于短探針(包括但不限于，10到50個(gè)核苦酸)為至少約30。C且對(duì)于長(zhǎng)探針(包括但不限于，大于50個(gè)核苷酸)為至少約6(TC的條件。嚴(yán)格條件也可通過(guò)加入去穩(wěn)定劑(諸如曱酰胺)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交，正信號(hào)可為背景的至少兩倍，視情況為背景雜交的10倍。例示性嚴(yán)格雜交條件可如下50%曱酰胺、5xSSC和1。/。SDS，在42。C下培養(yǎng)；或5xSSC、1%SDS，在65。C下培養(yǎng)，且在65。C下于0.2xSSC和0.1%SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120或更多分鐘。在Southern印跡或Northern印跡中于過(guò)濾器上具有超過(guò)100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸雜交的嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例為42°C,50%福爾馬林和1mg肝素，且進(jìn)行雜交整夜。嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例為65°CT0.2xSSC洗滌15分鐘(關(guān)于SSC緩沖液的描述參看Sambrook等人，M/ecM/arC7om'wg，Z^6ora/wyMa肌a/(第3版2001))。通常,高嚴(yán)格度洗滌是通過(guò)低嚴(yán)格度洗滌去除背景探針信號(hào)進(jìn)行。例示性低嚴(yán)格度洗滌是在40。C下以2xSSC洗滌15分鐘。一般來(lái)說(shuō)，5x(或更高)于在特定雜交檢定中關(guān)于不相關(guān)探針?biāo)^察的信雜比的信雜比指示對(duì)于特異性雜交的檢測(cè)。在有關(guān)核酸雜交實(shí)驗(yàn)(諸如Southern和Northern雜交)的上下文中，"嚴(yán)格雜交洗滌條件"為序列依賴性，并且在不同環(huán)境參數(shù)下不同。較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。有關(guān)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見(jiàn)于Tijssen(1993),河J:X以及Hames和Higgins,1和2，河J:X。任何測(cè)試核酸的嚴(yán)格雜交和洗滌條件可易于依經(jīng)驗(yàn)確定。舉例來(lái)說(shuō)，在測(cè)定高度嚴(yán)格雜交和洗滌條件的過(guò)程中，將雜交和洗滌條件逐漸增加(例如，通過(guò)增加溫度、降低鹽濃度、增加清潔劑濃度和/或增加雜交或洗滌中有機(jī)溶劑(諸如福爾馬林)的濃度)，直到滿足所選擇的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。舉例來(lái)說(shuō)，逐漸增加雜交和洗滌條件，直到探針與最佳匹配的互補(bǔ)靶以高達(dá)對(duì)于探針與不匹配靶雜交所觀察的至少5倍的信雜比結(jié)合。選擇與特定探針的熱熔點(diǎn)(Tm)相等的"極嚴(yán)格"條件。Tm為50%的測(cè)試序列與最佳匹配的探針雜交的溫度(在指定離子強(qiáng)度和pH值下)。出于本發(fā)明的目的，一般地說(shuō)，選擇在指定離子強(qiáng)度和pH值下比特定序列的Tm低約5。C的"高度嚴(yán)格"雜交和洗滌條件。"超高嚴(yán)格度"雜交和洗滌條件為增加雜交和洗滌條件的嚴(yán)格度，直到探針與最佳匹配的互補(bǔ)靶核酸結(jié)合的信雜比為高達(dá)對(duì)于任何不匹配輩巴核酸所觀察的至少10倍的條件。據(jù)悉，在所述條件下以最佳匹配的互補(bǔ)靶核酸的至少1/2的信雜比與探針雜交的輩巴核酸在超高嚴(yán)格度條件下與所述探針結(jié)合。類似地，可通過(guò)逐漸增加相關(guān)雜交檢定的雜交和/或洗滌條件來(lái)確定甚至較高水平的嚴(yán)格度。舉例來(lái)說(shuō)，增加雜交和洗滌條件的嚴(yán)格度，直到探針與最佳匹配的互補(bǔ)把核酸結(jié)合的信雜比為高達(dá)對(duì)于任何不匹配靶核酸所觀察的至少10x、20x、50x、100x或500x或更高倍數(shù)。據(jù)悉，在所述條件下以最佳匹配的互補(bǔ)靶核酸的至少1/2的信雜比與探針雜交的靶核酸在極高嚴(yán)格度條件下與所述探針結(jié)合。如果在嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸編碼的多肽實(shí)質(zhì)上相同，那么所述核酸也實(shí)質(zhì)上相同。例如當(dāng)使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)，出現(xiàn)此情形。獨(dú)特子序列一方面，本發(fā)明提供一種核酸，其包含選自本文所揭示的O-tRNA和O-RS序列的核酸中的獨(dú)特子序列。獨(dú)特子序列相比與任何已知的O-tRNA或O-RS核酸序列相對(duì)應(yīng)的核酸為獨(dú)特的?？墒褂?例如)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)的BLAST進(jìn)行比對(duì)。任何獨(dú)特子序列都(例如)可用作鑒別本發(fā)明的核酸的探針。類似地，本發(fā)明包括一種多肽，其包含選自本文所揭示的O-RS序列的多肽中的獨(dú)特子序列。在本文中，獨(dú)特子序列相比與已知多肽序列相對(duì)應(yīng)的多肽為獨(dú)特的。本發(fā)明還提供靶核酸，其在嚴(yán)格條件下與編碼選自O(shè)-RS的序列的多肽中的獨(dú)特子序列的獨(dú)特編碼寡核苦酸雜交，其中所述獨(dú)特子序列相比與任何對(duì)照多肽相對(duì)應(yīng)的多肽為獨(dú)特的(例如，通過(guò)突變得到本發(fā)明的合成酶的親本序列)。獨(dú)特子序列是如上文所述確定。序列比較、一致性和同源性在關(guān)于兩個(gè)或兩個(gè)以上核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語(yǔ)"相同，，或"一致性"百分比是指當(dāng)在比較窗或指定區(qū)中比較和比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，如使用下文所述的序列比較算法中的一種(或所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可用的其它算法)或通過(guò)手工比對(duì)和目測(cè)所測(cè)量，相同或具有特定的相同氨基酸殘基或核苷酸百分比的兩個(gè)或兩個(gè)以上序列或子序列。在關(guān)于兩個(gè)核酸或多肽(例如，編碼O-tRNA或O-RS的DNA，或O-RS的氨基酸序列)的上下文中，短語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上相同"是指當(dāng)在比較窗或指定區(qū)中比較和比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，如使用序列比較算法(或所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可用的其它算法)或通過(guò)手工比對(duì)和目測(cè)所測(cè)量，具有至少約60%、約80%、約90-95%、約98%、約99%或更高百分比的核苦酸或氨基酸殘基一致性的兩個(gè)或兩個(gè)以上序列或子序列。在不提及實(shí)際祖先的情況下，通常認(rèn)為所述"實(shí)質(zhì)上相同"的序列"同源"。"實(shí)質(zhì)一致性"可存在于至少約50個(gè)殘基長(zhǎng)的序列區(qū)、至少約100個(gè)殘基的區(qū)域或至少約150個(gè)殘基的區(qū)域，或超過(guò)欲比較的兩個(gè)序列的全長(zhǎng)的區(qū)域內(nèi)。為進(jìn)行序列比較和同源性測(cè)定，通常一種序列充當(dāng)與測(cè)試序列相比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參考序列輸入計(jì)算機(jī)內(nèi)，視需要指定子序列坐標(biāo)，并且指定序列算法程序參數(shù)。隨后序列比較算法基于指定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列一致性百分比。比對(duì)供比較的序列的方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知?？?例如)通過(guò)Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch，LMol.Biol.48:443(1970)的同源性比對(duì)算法、Pearson&Lipman,Proc.Nafl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法、這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通過(guò)手工比對(duì)和目測(cè)(例如參看Ausubel等人，CwreWPrafoco/s/"Mo/ecw/w所o/ogy(1995增補(bǔ)))進(jìn)行供比較序列的最佳比對(duì)。適于測(cè)定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一個(gè)實(shí)例為BLAST算法和BLAST2.0算法，其描述于Altschul等人.(1997)M/c.Jcz'Ai仏25:3389-3402;和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(19卯)中。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)可于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov訪問(wèn)的美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開(kāi)獲得。所述算法涉及首先通過(guò)鑒別詢問(wèn)序列中長(zhǎng)度W的短字來(lái)鑒別高得分的序列對(duì)(highscoringsequencepair,HSP)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)，所述HSP匹配或滿足一些正值臨界得分T。T是指鄰近字的臨界分值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul等人，同上文)。這些初始鄰近字匹配(wordhit)充當(dāng)起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有其的較長(zhǎng)HSP的種子。隨后使字匹配沿各序列的兩個(gè)方向延伸直到可增加累積比對(duì)的分值。對(duì)核苷酸序列使用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分值；通常>0)和N(錯(cuò)配殘基的處罰分值，通常<0)計(jì)算累積分值。對(duì)于氨基酸序列，使用得分矩陣計(jì)算累積分值。當(dāng)累積比對(duì)分值比其所得到的最大值低數(shù)量X;累積分值因一個(gè)或一個(gè)以上負(fù)得分殘基比對(duì)的積累而為零或更低；或到達(dá)各序列的末端時(shí)，在各個(gè)方向上的字匹配延伸停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X將決定比對(duì)的敏感性和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用11的字長(zhǎng)(W)、10的期望值(expectation,E)、100的截止值、M=5、N;4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字長(zhǎng)(W)、10的期望值(E)和50的BLOSUM62得分矩陣(參看Henikoff&Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比對(duì)(B)、IO的的期望值(E)、M=5、N=-4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。BLAST算法通常在"低復(fù)雜性"過(guò)濾器關(guān)閉的情形下進(jìn)行。除計(jì)算序列一致性百分比外，BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(例如參看Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一種相似性量度為最小和概率(smallestsumprobability,P(N))，其提供對(duì)于兩個(gè)核苦酸或氨基酸序列之間偶然出現(xiàn)匹配的概率的指示。舉例來(lái)說(shuō)，如果在將測(cè)試核酸與參考核酸相比較時(shí)，最小和概率小于約0.2、小于約0.01或小于約0.001,那么可認(rèn)為所述核酸與參考序列相似。誘變和其它分子生物學(xué)技術(shù)本發(fā)明和用于本發(fā)明中的聚核苷酸和多肽可使用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行操縱。可根據(jù)常規(guī)方法通過(guò)定點(diǎn)誘變便利地修飾核普酸序列。另外，可通過(guò)化學(xué)合成(包括但不限于，使用寡核苦酸合成儀)來(lái)制備核苷酸序列，其中根據(jù)所需多肽的氨基酸序列且優(yōu)選選擇將產(chǎn)生重組多肽的宿主細(xì)胞所青睞的密碼子來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸。舉例來(lái)說(shuō)，可合成編碼所需多肽的部分的若干小寡核苷酸并且通過(guò)PCR、連接或連接鏈反應(yīng)加以組裝。例如參看Barany等人，尸rac.淑/.^cadSc/.88:189-193(1991);美國(guó)專利6,521,427，其是以引用的方式并入本文中。本發(fā)明利用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。揭示用于本發(fā)明中的通用方法的基本文本包括Sambrook等人，M9/ecw/"rC/ow/wg,J丄a60m/107Maw認(rèn)/(第3版2001);Kriegler,Gewe7><ms/er」丄a60m"ryM朋wa/(1990);和Cwrre"http://Vofoco/sMo/ecw/w歷o/ogy(Ausubel等編，1994))。描述分子生物學(xué)技術(shù)的通用文本包括Berger和Kimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzvmologvvolume152AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA(Berger);Sambrook等人，MolecularCloning國(guó)ALaboratoryManual(第2版)，第1-3巻,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989("Sambrook，，)和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人編,CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.,(1999增補(bǔ))("Ausubel"))。這些文本描述誘變、載體的使用、啟動(dòng)子和許多其它相關(guān)課題，所述課題與(例如)包括用于制造包括所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)的選擇性密碼子的基因或聚核苷酸、正交tRNA、正交合成酶和正交tRNA/正交合成酶對(duì)的產(chǎn)生相關(guān)。將多類誘變方法用于本發(fā)明中以達(dá)到多個(gè)目的，包括(但不限于)制造新穎的合成酶或tRNA、使tRNA分子突變、制造tRNA文庫(kù)、使RS分子突變、制造合成酶文庫(kù)、制造選擇性密碼子、插入在所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽中編碼所選氨基酸的選擇性密碼子。其包括(但不限于)定點(diǎn)資變、隨機(jī)點(diǎn)誘變、同源重組、DNA改組或其它遞歸式誘變方法、嵌合構(gòu)建、使用含有尿嘧啶的模板進(jìn)行的誘變、寡核香酸定向誘變、經(jīng)硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用有缺口的雙鏈體DNA等進(jìn)行的誘變或其任何組合。其它適當(dāng)?shù)姆椒òc(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、使用修復(fù)缺陷型宿主菌抹進(jìn)行的誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、通過(guò)全基因合成進(jìn)行的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等。(包括但不限于)涉及嵌合構(gòu)筑體的誘變也包括在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施例中，可通過(guò)天然存在的分子或者改變或突變的天然存在的分子的已知信息(包括但不限于，序列、序列比較、物理特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)或四級(jí)結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)等)指導(dǎo)誘變。本文中所見(jiàn)的文本和實(shí)例描述這些程序。額外信息見(jiàn)于本文所引用的以下公開(kāi)案和參考文獻(xiàn)Ling等人，^ppra^/zes*M"崩扁fagewd'"wovem，，AnalBiochem.254(2》157-178(1997);Dale等人，0//gowwc/eWcfe-<iz>^"e<iram/cw附她ge/^kws/wgj^oyp/2oro^u'o她膨/Zzc^，MethodsMol.Biol,57:369-374(1996);Smith,/"v/加腦/Ggewe57.51,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985);Botstein&Shortle,5^她g7'^anda;Wca"(msW加聽(tīng)啤ewe減Science229:1193-1201(1985);Carter,57&-A>e"^/附t^"gew^s7XBiochem.J.237:1-7(1986);Kunkel，772e孝c/ewc^0//gowwc/eo"Wec/z>"/^t/附齒ge"e57XNucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein,F.andLilley,D,M.J，編，SpringerVerlag，Berlin)(1987);Kunkel,ia;/(ia/d孝c/ew/57Ye-5pe"ye附wfagewe^p/2歸妙/cProc.Natl,Acad.Sci.USA82:488-492(1985);Kunkel等人，"wc/e^"'ew/1s7/^->S7e"yc*附wf"gewes/sw/f/ow///ze/o/y//cse/eCz'ow,MethodsinEnzvmol.154,367-382(1987);Bass等人,她她/Trpw，￡>M4-6zW/wg5/7e"ykr//^，Science242:240-245(1988);Zoller&Smith，/rac/w"/ow/ww/附w加/omawyZWJ々ag歸w/,NucleicAcidsRes.10:6487-6500(1982);Zoller&Smith,0//gowwc/eo"'^:>e"eJmw/agewe*0/DiV/ic/owec/MJ雨塗'MethodsinE野mol.100:468-500(1983);Zoller&Smith,am/aW一e-欲flTO^dDA^4fe，/她，MethodsinEnzymol.154:329-350(1987);Taylor等人,￡W^，Nucl,AcidsRes,13:8749-8764(1985);Taylor等人，77^rapW^wwa"owNucl.AcidsRes.13:8765-8785(1985);Nakamaye&Eckstein,7w緣她wmy/W"/owo//gowwc/eo/7U^"e<iNucl.AcidsRes.14:9679-9698(1986);Sayers等人,AcidsRes,16:791-802(1988);Sayers等人，5Vm"d^e"ycc/e"v"ge。/e,/z/(i/訓(xùn)6to附/叔(1988)Nucl.AcidsRes,16:803-814;Kramer等人，77zegoppec/c/w—a:ZWJflj^raac/o//gowwc/eo"c/e-<iz>^"e<i附w加/owco/欲wc"'ow,Nucl,AcidsRes,12:9441-9456(1984》Kramer&FritzO/z'gowwc/eWtfe-^ec/Wcow欲w"/owo/附w勵(lì)'ow51vz'ago/^edt/w//e;ciM4，MethodsinEnzvmol.154:350-367(1987);Kramer等人，/mpravedcoww"/ow'ora，Nucl.AcidsRes.16:7207(1988);Fritz等人，enz>7naf/cre"cffosfvffro，Nucl.AcidsRes.16:(1988);Kramer等人,Z)(^ferewf6a5^/&a<yem&mafc/zesarecorrectedwz7ftd(j^^fe^7c'ecfes6f/zee^y^-dfrec&c/DiV^4/m'5a/z-rezV，towcj/E'co//，Cell38:879-887(1984);Carter等人,TmpravWs/z^-iec/Wwf"gewe^s7'5"ve加ny，Nucl,AcidsRes.13:4431-4443(1985);Carter,Tw^raved,ewes7、,'wg3ve"ors，MethodsinEnzvmol.154:382-403(1987);Eghtedarzadeh&Henikoff,C/m0//gowwc/eo"Wesgewer/arge^fe/e"》叫Nucl.AcidsRes.14:5115(1986);Wells等人,7m/o/t"wce/y;(irogew-Z)(wdybrwa/iowWaft/Z/z/wg/7zefraws/"》wsw&"7/s/w，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317:415-423(1986);Nambiar等人，7b/"/""/Amzj"w"0/"/or〃6owwc/^xyeS/rato>7，Science223:1299-1301(1984);Sakmar和Khorana,7b/^/"w/7^z'51awe/ex/ms^/ow"geweybr^p/z"-<sw6wmY0/6ov/werodow&r5^ge"Zgwam'wewwc/eo"V/e-6/wgpro/e/w(^nmy^/wcz77人Nucl.AcidsRes.14:6361-6372(1988);AVells等人，Casse"ew/"gewe57'5..awe^c/ewfe/Z;oJybrgewe/y/"owa/1cfeyw^/57to，Getic34:315-323(1985);Grundstrom等人，0//gowwc/eo/We-(i/rec/^w&gewe57、6/crasc"/eS/zW-gww'gewe^e^,Nucl,AcidsRes,13:3305-3316(1985);Mandecki,Wgowwe/eo"We-c/z>e"ec/Jow6/e-awd6""A:mV//as/c/51o/￡^/zm'c/n'"co//.'af/zc^/orsz7^-5^c(/cProc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986);Arnold,iV他/wewg/wem'wgybrwwwswa/ew/w,eCurrentOpinioninBiotechnology4:450-455(1993);Sieber,等人，NatureBiotechnology,19:456-460(2001);W.RC.Stemmer,Nature370,389-91(1994);和LA.Lorimer，I.Pastan，NucleicAcidsRes.23，3067-8(1995)。有關(guān)許多上述方法的其它細(xì)節(jié)可見(jiàn)于MethodsinEnz簡(jiǎn)logv第154巻中，其也描述針對(duì)各種誘變方法中難以解決的問(wèn)題的有用控制方法。通常根據(jù)如Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetts.22(20):1859-1862，(1981)中所述的固相亞磷酰胺三酯方法，(例如)使用如Needham-VanDevanter等人，NucleicAcidsRes,，12:6159-6168(1984)中所述的自動(dòng)化合成儀以化學(xué)方式合成(例如)用于本發(fā)明的誘變(例如，使合成酶文庫(kù)突變或改變tRNA)中的寡核苷酸。此外，基本上任何核酸都可為從多種商業(yè)來(lái)源中的任一種訂購(gòu)的定制品或標(biāo)準(zhǔn)品，戶斤述商業(yè)來(lái)源諸:i口TheMidlandCertifiedReagentCompany(mcrc@oligos.com)、TheGreatAmericanGeneCompany(www.genco.com)、ExpressGenInc.(www.expressgen.com)、OperonTechnologiesInc.(Alameda,Calif.)和許多其它來(lái)源。本發(fā)明還涉及真核宿主細(xì)胞、非真核宿主細(xì)胞和在活體內(nèi)經(jīng)由正交tRNA/RS對(duì)并入非天然氨基酸的有機(jī)體。利用本發(fā)明的聚核苷酸或包括本發(fā)明的聚核苷酸的構(gòu)筑體(包括但不限于，本發(fā)明的載體，其例如可為克隆載體或表達(dá)載體)對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程(包括但不限于，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)。舉例來(lái)說(shuō)，將正交tRNA的編碼區(qū)、正交tRNA合成酶和欲衍生化的蛋白質(zhì)可操作地連接到在所需宿主細(xì)胞中起作用的基因表達(dá)控制元件。載體可(例如)為質(zhì)粒、柯斯質(zhì)粒、噬菌體、細(xì)菌、病毒、棵聚核普酸或連結(jié)的聚核苦酸的形式。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將載體引入細(xì)胞和/或微生物中，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括電穿孔(F畫m等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5824(1985))、用病毒栽體感染、用在小珠?；蝾w?；|(zhì)內(nèi)或表面上具有核酸的小顆粒進(jìn)行高速?gòu)椀来┩?Klein等人，Nature327，70-73(1987))等。將靶核酸引入細(xì)胞中的若干種眾所周知的方法都可用；所述方法的任一種都可用于本發(fā)明中。這些方法包括受體細(xì)胞與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、電穿孔、基因槍法(projectilebombardment)和用病毒載體感染(將于下文中進(jìn)一步論述)等?？墒褂眉?xì)菌細(xì)胞擴(kuò)大含有本發(fā)明的DNA構(gòu)筑體的質(zhì)粒的數(shù)量。使細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并且通過(guò)所屬領(lǐng)域已知的多種方法(例如參看Sambrook)分離細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒。此外，用于從細(xì)菌中純化質(zhì)粒的試劑盒為市售(例如參看，EasyPrep、FlexiPrep,二者都是購(gòu)自PharmaciaBiotech;StrataClean,購(gòu)自Stratagene;和QIAprepTM，購(gòu)自Qiagen)。隨后進(jìn)一步操縱經(jīng)分離和純化的質(zhì)粒以制造用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或并入相關(guān)載體中以感染有機(jī)體的其它質(zhì)粒。典型載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列和可用于調(diào)控特定靶核酸的表達(dá)的啟動(dòng)子。載體視情況包含基因表達(dá)盒，其含有至少一個(gè)獨(dú)立的終止子序列、允許所述盒在真核生物或原核生物或二者(包括但不限于，穿梭載體)中復(fù)制的序列和用于原核生物系統(tǒng)和真核生物系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。載體適于在原核生物、真核生物或二者中復(fù)制和/或整合。參看Gillam&Smith,Gene8:81(1979);Roberts等人，Nature.328:731(1987);Schneider,E.等人，ProteinExpr.Purif.6(1)10-14(1995);Ausubel,(例如，由ATCC出片反的77^^rCCO^a/ogwe。/5a"e〃"tmd5a"en'op/zage(1992)Gherna等人(編))所提供。用于測(cè)序、克隆和分子生物學(xué)其它方面的其它基本程序和基礎(chǔ)理論考yit-也見(jiàn)于Watson等人(1992)"A^4Seco"d￡d//7owSciew/zycJwer/c""丑ooib，iv;r中。此外，基本上任何核酸(和實(shí)際上任何經(jīng)標(biāo)記的核酸，無(wú)論標(biāo)準(zhǔn)還是非標(biāo)準(zhǔn)核酸)都可為從多個(gè)商業(yè)來(lái)源中的任一個(gè)訂購(gòu)的定制品或標(biāo)準(zhǔn)品，所述商業(yè)來(lái)源諸如MidlandCertifiedReagentCompany(國(guó)際互耳關(guān)網(wǎng)mcrc.com可見(jiàn)，Midland,TX)、TheGreatAmericanGeneCompany(國(guó)際互耳關(guān)網(wǎng)genco.com可見(jiàn),Ramona，CA)、ExpressGenInc.(國(guó)際互耳關(guān)網(wǎng)expressgen.com可見(jiàn)，Chicago,IL)、OperonTechnologiesInc.(Alameda,CA)和許多其它商業(yè)來(lái)源?？蓪⒔?jīng)工程設(shè)計(jì)的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于修飾為適于諸如篩選步驟、活化啟動(dòng)子或選擇轉(zhuǎn)化體的活性的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中?？蓪⑦@些細(xì)胞視情況培養(yǎng)于轉(zhuǎn)基因有機(jī)體中。舉例來(lái)說(shuō)，有關(guān)細(xì)胞分離和培養(yǎng)(例如，有關(guān)隨后的核酸分離)的其它有用參考文獻(xiàn)包括Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版,Wiley-Liss,NewYork和其中所引用的參考文獻(xiàn)；Payne等人(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY;GamborgandPhillips(編)(1995)PlantCellTissueandOrganCulture;FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)和AtlasandParks(編)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL。在活體內(nèi)將非天然氨基酸直接并入蛋白質(zhì)中的能力將提供多種優(yōu)勢(shì)，包括(但不限于)突變體蛋白的高產(chǎn)量、技術(shù)簡(jiǎn)便性、研究細(xì)胞或可能的活有機(jī)體中突變體蛋白的潛力和這些突變體蛋白于治療性治療和診斷使用中的用途。將具有各種尺寸、酸度、親核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括于蛋白質(zhì)中的能力可極大擴(kuò)展合理且系統(tǒng)性操縱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以探查蛋白質(zhì)功能并產(chǎn)生具有新穎特性的新穎蛋白質(zhì)或有機(jī)體的能力。所關(guān)注的蛋白質(zhì)和多肽可并入非天然氨基酸以達(dá)成各種目的，包括(但不限于)修整蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或功能的改變；改變尺寸、酸度、親核性、氫鍵、疏水性、蛋白酶目標(biāo)位點(diǎn)的可接近性；靶向部分(包括但不限于用于蛋白質(zhì)陣列)；加入生物活性分子；連接聚合物；連接放射性核；調(diào)節(jié)血清半衰期；調(diào)節(jié)組織滲透性(例如腫瘤)；調(diào)節(jié)活性轉(zhuǎn)運(yùn)體；調(diào)節(jié)組織、細(xì)胞或器官特異性或分布；調(diào)節(jié)免疫原性；調(diào)節(jié)蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白質(zhì)可具有增強(qiáng)的或甚至完全新穎的催化或生物物理特性。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)將非天然氨基酸包括于蛋白質(zhì)中來(lái)視情況改變以下特性毒性、生物分布、結(jié)構(gòu)特性、光譜特性、化學(xué)和/或光化學(xué)特性、催化能力、半衰期(包括但不限于，血清半衰期)、與其它分子反應(yīng)(包括但不限于共價(jià)或非共價(jià)反應(yīng))的能力等。包括包含至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的組合物可用于(包括但不限于)新穎的治療法、診斷法、催化酶、工業(yè)酶、結(jié)合蛋白(包括但不限于抗體)和(包括但不限于)有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究中。例^口，參看Dougherty,(2000)f/wwa^wa/J附/woJc/c&os/Vo6ey/Vwe/wS&Mc/weof"d尸w"c"o",CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645-652。蛋白質(zhì)可具有至少一個(gè)、包括(但不限于)至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)或至少十個(gè)或十個(gè)以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，包括(但不限于)蛋白質(zhì)中可存在包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或10個(gè)以上不同非天然氨基酸的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或10個(gè)以上不同位點(diǎn)。蛋白質(zhì)可具有至少一個(gè)(但少于全部)存在于所迷蛋白質(zhì)中的經(jīng)非天然氨基酸取代的特定氨基酸。對(duì)于具有一個(gè)以上非天然氨基酸的指定蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，非天然氨基酸可相同或不同(包括但不限于，所述蛋白質(zhì)可包括兩種或兩種以上不同類型的非天然氨基酸，或可包括相同非天然氨基酸中的兩個(gè))。對(duì)于具有兩個(gè)以上非天然氨基酸的指定蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，非天然氨基酸可相同、不同或?yàn)槎喾N相同種類的非天然氨基酸與至少一種不同非天然氨基酸的組合。通過(guò)在真核細(xì)胞中制造具有至少一個(gè)非天然氨基酸的所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽，蛋白質(zhì)或多肽通常將包括真核翻譯后修飾。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包括至少一個(gè)非天然氨基酸和至少一個(gè)于活體內(nèi)由真核細(xì)胞所作的翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾不是通過(guò)原核細(xì)胞進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，翻譯后修飾包括(但不限于)乙?；Ⅴ；?、脂質(zhì)修飾、棕櫚酰化、棕櫚酸鹽添加、磷酸化、糖酯鍵聯(lián)修飾、糖基化等。另一方面，翻譯后修飾包括前體(包括但不限于，降鈣素前體、降鈣素基因相關(guān)的肽前體、前曱狀旁腺激素原、前胰島素原、胰島素原、前阿皮黑素原、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工；組裝成多亞基蛋白質(zhì)或大分子組裝；翻譯到細(xì)胞(包括但不限于，細(xì)胞器，諸如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體(Golgiapparatus)、核、溶酶體、過(guò)氧化物酶體、線粒體、葉綠體、液泡等；或通過(guò)分泌路徑)中的另一位點(diǎn)。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包含分泌或定位序列、抗原決定基標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、GST融合物等。在細(xì)胞中制造在指定位置處具有所選氨基酸的蛋白質(zhì)的方法也為本發(fā)明的特征。舉例來(lái)說(shuō)，方法包括使細(xì)胞在適當(dāng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中所述細(xì)胞包含核酸，所述核酸包含至少一個(gè)選擇性密碼子并且編碼蛋白質(zhì)；和提供所選氨基酸，其中所述細(xì)胞另外包含在細(xì)胞中起作用并且識(shí)別選擇性密碼子的正交tRNA(O-tRNA);和優(yōu)先利用所選氨基酸使O-tRNA氨?；恼话滨；鵷RNA合成酶(O-RS)。通常，O-tRNA在存在同類合成酶的情況下響應(yīng)選擇性密碼子包含抑制活性。由本發(fā)明的方法制造的蛋白質(zhì)也為本發(fā)明的特征。本發(fā)明的組合物和由本發(fā)明的方法制造的組合物視情況處于細(xì)胞中。隨后可將本發(fā)明的O-tRNA/O-RS對(duì)或個(gè)別組件用于宿主系統(tǒng)的翻譯機(jī)器中，這導(dǎo)致所選氨基酸(例如，非天然氛基酸)并入蛋白質(zhì)中。名稱為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode，，的專利申請(qǐng)案USSN10/825,867和名稱為"TNVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS"的10/126,927中描述此方法并且所述專利文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)將O-tRNA/O-RS對(duì)引入宿主(例如，大腸桿菌)中時(shí)，所迷對(duì)在活體內(nèi)響應(yīng)選擇性密碼子導(dǎo)致將可外源地加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所選氨基酸(諸如非天然氨基酸，例如合成氨基酸，諸如亮氨酸衍生物)并入蛋白質(zhì)中。視情況，本發(fā)明的組合物可處于活體外翻譯系統(tǒng)中或處于活體內(nèi)系統(tǒng)中。可使用本文的組合物和方法制造任何蛋白質(zhì)(或其部分)，所迷蛋白質(zhì)包括所選氨基酸，例如非天然氨基酸(和任何相應(yīng)的編碼核酸，例如其包括一個(gè)或一個(gè)以上選擇性密碼子)。任何多肽都適于并入一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸。尚未嘗試鑒別數(shù)十萬(wàn)已知蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)中的任一種可經(jīng)修飾以包括一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸，例如通過(guò)改編任何可用突變方法經(jīng)修飾而在相關(guān)翻譯系統(tǒng)中包括一個(gè)或一個(gè)以上適當(dāng)選擇性密碼子。已知蛋白質(zhì)的常見(jiàn)序列鐠系包括GenBankEMBL、DDBJ和NCBI。其它語(yǔ)系可易于通過(guò)搜索互聯(lián)網(wǎng)來(lái)鑒別。通常，蛋白質(zhì)與任何可用蛋白質(zhì)(例如，治療性蛋白質(zhì)、診斷用蛋白質(zhì)、工業(yè)酶或其部分等)(例如)至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%或99%以上相同，并且其包含一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸?？山?jīng)修飾以包含一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的治療性蛋白質(zhì)、診斷用蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的實(shí)例可見(jiàn)于(但不限于)名稱為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的USSN10/825,867和名稱為"INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS"的美國(guó)專利申請(qǐng)案第10/126,927號(hào)中。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和/或組合物中所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽(或其部分)是由核酸編碼。通常，核酸包含至少一個(gè)選擇性密碼子、至少兩個(gè)選擇性密碼子、至少三個(gè)選擇性密碼子、至少四個(gè)選擇性密碼子、至少五個(gè)選擇性密碼子、至少六個(gè)選擇性密碼子、至少七個(gè)選擇性密碼子、至少八個(gè)選擇性密碼子、至少九個(gè)選擇性密碼子、十個(gè)或十個(gè)以上選擇性密碼子?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知且本文在"誘變和其它分子生物學(xué)技術(shù)"章節(jié)中所述的方法誘變編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽的基因，以使其包括(例如)一個(gè)或一個(gè)以上選擇性密碼子以供并入所選氨基酸，例如非天然氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，誘變用于所關(guān)注的蛋白質(zhì)的核酸以使其包括一個(gè)或一個(gè)以上選擇性密碼子，從而使一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)插入。本發(fā)明包括任何蛋白質(zhì)的任何所述變異體(例如突變體)型式，例如包括至少一個(gè)所選氨基酸。類似地，本發(fā)明還包括相應(yīng)核酸，即具有一個(gè)或一個(gè)以上編碼一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸的選擇性密碼子的任何核酸。為制造包括所選氨基酸的蛋白質(zhì)，可使用適于在活體內(nèi)經(jīng)由正交tRNA/RS對(duì)并入所選氨基酸的宿主細(xì)胞和有機(jī)體。利用一個(gè)或一個(gè)以上表達(dá)正交tRNA、正交tRNA合成酶的載體和編碼欲衍生化的蛋白質(zhì)的載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程(例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)。這些組件中的每一個(gè)都可在相同載體上，或各自可在單獨(dú)載體上，兩個(gè)組件可在一個(gè)載體上且第三組件在第二載體上。載體可(例如)為質(zhì)粒、柯斯質(zhì)粒、噬菌體、細(xì)菌、病毒、棵聚核苷酸或連結(jié)的聚核普酸的形式。替換系統(tǒng)已使用數(shù)種策略將非天然氨基酸引入非重組宿主細(xì)胞、誘變的宿主細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)中。使具有反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸(諸如Lys、Cys和Tyr)衍生化將導(dǎo)致賴氨酸轉(zhuǎn)化成N、乙?；?賴氨酸?；瘜W(xué)合成也提供一種并入非天然氨基酸的簡(jiǎn)單方法。隨著肽片段的酶連接和天然化學(xué)連接的最新發(fā)展，可能制造出較大蛋白質(zhì)。例如參看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,A匪.Rev.Biochem.69:923(2000)。化學(xué)肽連接和天然化學(xué)連接已描述于美國(guó)專利第6,184,344號(hào)、美國(guó)專利公開(kāi)案第2004/0138412號(hào)、美國(guó)專利公開(kāi)案第2003/0208046號(hào)、WO02/098902和WO03/042235中，所述專利都是以引用的方式并入本文中。已使用通用活體外生物合成方法將超過(guò)100個(gè)非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地并入實(shí)際上任何尺寸的多種蛋白質(zhì)中，在所述方法中將經(jīng)所需非天然氨基酸化學(xué)?；囊种菩詔RNA加入能夠支持蛋白質(zhì)生物合成的活體外提取物中。例如參看V.W.Cornish,D.Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl..1995,34:621(1995);CJ.Noren,SJ.Anthony國(guó)Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,ge"em/膨《/jod/ors"e鄰e"》c/wcorpom/iowo/wmza/wa/a/m'wo/齒/ra/z>is'Science244:182-188(1989);和J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,祝0，f/2"/c，c(/c/wcorpora/iowo/awow-wa^ra/am/woz'她a/o(yj3eWcfe，J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已將廣泛多種官能團(tuán)引入蛋白質(zhì)中以用于研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)折疊、酶機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。已研究出一種被稱為選擇性壓力并入的活體內(nèi)方法來(lái)開(kāi)發(fā)混雜的野生型合成酶。例如參看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger，F(xiàn).M.Dong，L.Moroder和R.Huber,FASEBJ.,13:41(1999)。使向細(xì)胞供應(yīng)特定天然氨基酸的相關(guān)代謝路徑已切斷的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌林生長(zhǎng)于含有有限濃度的天然氨基酸的基本培養(yǎng)基中，同時(shí)阻遏靶基因的轉(zhuǎn)錄。穩(wěn)定生長(zhǎng)期開(kāi)始時(shí)，耗盡天然氨基酸并以非天然氨基酸類似物加以置換。裔導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)將導(dǎo)致含有非天然類似物的蛋白質(zhì)的積累。舉例來(lái)說(shuō)，使用這一策略，已將鄰、間和對(duì)氟苯丙氨酸并入蛋白質(zhì)中并且在UV光語(yǔ)中展現(xiàn)出易于鑒別的兩個(gè)特征性峰肩，例如參看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem..284:29(2000);已使用三氟曱疏氨酸置換噬菌體T4溶菌酶中的曱硫氨酸，以通過(guò)19FNMR研究其與殼低聚糖配體的相互作用，例如參看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek,Biochemistry,36:3404(1997);并且已并入三氟亮氨酸替代亮氨酸，從而使亮氨酸拉鏈蛋白的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性增加。例如參看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Ansew.Chem.Int.Ed.Enel..40:1494(2001)。此外，將竭代曱硫氨酸和碲代曱疏氨酸并入各種重組蛋白中以有利于對(duì)X射線晶體學(xué)中各相的解析。例如參看W.A.Hendrickson,J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBOJ.,9:1665(1990);J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom，B.Dunlap,L.Lebioda和M.Hatada,Nat.Struct.Biol..1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange，C.Eckerskorn,,J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.,230:788(1995);和N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder和R.Huber,J.Mol.Biol.'270:616(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能團(tuán)的曱硫氨酸類似物，從而允許通過(guò)化學(xué)方式對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行額外修飾。例如參看J.C.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett..428:68(1998);J.C..vanHest,K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000);和K.L.KiickandD.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美國(guó)專利第6,586,207號(hào)；美國(guó)專利公開(kāi)案2002/0042097，所述專利文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。本方法的成功視氨酰基tRNA合成酶對(duì)非天然氨基酸類似物的識(shí)別而定，總的說(shuō)來(lái)，這需要高選擇性以確保蛋白質(zhì)翻譯的保真性。一種擴(kuò)展本發(fā)明方法的范圍的方式為放寬氨?；鵷RNA合成酶的底物特異性，這已在有限數(shù)量的情況下實(shí)現(xiàn)。舉例來(lái)說(shuō)，在大腸桿菌苯丙氨?；鵷RNA合成酶(PheRS)的情況下以Gly置換Ala^將增加底物結(jié)合口袋的尺寸，并且引起對(duì)氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)對(duì)tRNAPhe的酰基化作用。參看M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke.Biochemistry,33:7107"994)。具有此突變體PheRS的大腸桿菌菌抹允許并入對(duì)氯苯丙氨酸或?qū)︿灞奖彼醽?lái)替代苯丙氨酸。例如參看M.Ibba和H.Hennecke，F(xiàn)EBSLett.,364:272(1995);和N.Sharma，R.Furter,P.Kast和D.A.Tirrell,FEBSLett..467:37(2000)。類似地，已證實(shí)鄰近大腸桿菌酪氨?；鵷RNA合成酶的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變Phel30Ser使重氮酪氨酸(azatyrosine)能夠比酪氨酸更有效地并入。參看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soil和S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。在活體內(nèi)將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中的另一種策略為修飾具有校對(duì)機(jī)制的合成酶。這些合成酶無(wú)法區(qū)分且因此活化在結(jié)構(gòu)上與同類天然氨基酸類似的氨基酸。這一錯(cuò)誤在單獨(dú)位點(diǎn)處經(jīng)校正，其使來(lái)自tRNA的錯(cuò)載氨基酸脫酰基化以保持蛋白質(zhì)翻譯的保真度。如果喪失合成酶的校對(duì)活性，那么錯(cuò)誤活化的結(jié)構(gòu)類似物可逃避編輯功能并且被并入。近來(lái)已以纈氨?；鵷RNA合成酶(ValRS)證實(shí)這一方法。參看V.Doring,H.D.Mootz:L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel和P.Marliere;Scicnc6,292:501(2001)。ValRS可以Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)錯(cuò)誤氨?；痶RNAVal;隨后，這些非同類的氨基酸經(jīng)編輯域水解。在隨機(jī)誘變大腸桿菌染色體后，選擇在ValRS的編輯位點(diǎn)中具有突變的突變體大腸桿菌菌抹。這一編輯缺陷型ValRS錯(cuò)誤地將Cys裝載于tRNAVal上。由于Abu在空間上與Cys類似(Cys的-SH基團(tuán)在Abu中經(jīng)-CH3置換)，故當(dāng)這一突變體大腸桿菌菌林在存在Abu的情況下生長(zhǎng)時(shí)，突變體ValRS也將Abu并入蛋白質(zhì)中。質(zhì)譜分析表明，在天然蛋白質(zhì)的各纈氨酸位置處約24%的纈氨酸經(jīng)Abu置換。固相合成和半合成方法也已允許合成大量含有新穎氨基酸的蛋白質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，參看本文所引用的以下公開(kāi)案和參考文獻(xiàn)Crick，F(xiàn).H.C.，Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin，R.Ge"era/贈(zèng)weo/f/zecocfe，/ra/e/肌Naturs,192:1227-1232(1961);Hofmann,K.,Bohn，H.5V"J/eso"/o(y"ep"cfe51.XQTZ7Teej^ecfo//7>razo/e-//w/(/azo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10/825,867;名稱為"INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS"的WO2002/085923;名稱為"Glycoproteinsynthesis"的美國(guó)專利第6,927,042號(hào)；和名稱為"ProteinArrays，，的美國(guó)專利公開(kāi)案第US2004/0198637號(hào)，所述專利文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。試劑盒試劑盒也為本發(fā)明的特征。舉例來(lái)說(shuō)，提供在細(xì)胞中制造包含至少一個(gè)所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)的試劑盒，其中所述試劑盒包括含有編碼O-tRNA的聚核苷酸序列和/或O-tRNA和/或編碼O-RS的聚核苷酸序列和/或O-RS的容器。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒另外至少包括所選氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括本發(fā)明的氨?；痶RNA。在另一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒另外包含制造蛋白質(zhì)的說(shuō)明材料。另一實(shí)例為在無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中制造包含至少一個(gè)所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)的試劑盒，其中所述試劑盒包括含有編碼O-tRNA的聚核苷酸序列和/或O-tRNA和/或編碼O-RS的聚核苷酸序列和/或O-RS的容器。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒另外包括所選氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括本發(fā)明的氨?；痶RNA。在另一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒另外包含制造蛋白質(zhì)的說(shuō)明材料。實(shí)例提供以下實(shí)例進(jìn)行說(shuō)明，但并非限制本發(fā)明。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下，可改變多個(gè)不重要的參數(shù)。實(shí)例1:針對(duì)對(duì)乙?；奖彼徇x擇氨?；鵷RNA合成酶在兩個(gè)DNA文庫(kù)中篩選針對(duì)對(duì)乙酰基苯丙氨酸(即，非天然編碼的氨基酸)的氨酰基tRNA合成酶。這些文庫(kù)都是由pBK質(zhì)粒中來(lái)自詹氏甲烷球菌的酪氨酰基tRNA合成酶基因的六種突變組成。執(zhí)行選擇程序，其是由五輪交替選擇(三輪陽(yáng)性選擇、兩輪陰性選擇)組成。將文庫(kù)以1:1的比率組合并且將其電穿孔到陽(yáng)性選擇細(xì)胞系(具有陽(yáng)性選擇質(zhì)粒pREP的GeneHog)中，并且將所述細(xì)胞系接種到含有適當(dāng)抗生素和非天然編碼的氨基酸對(duì)乙酰基苯丙氨酸(pAF)的基本培養(yǎng)基平板(GMML)中。將平板在37。C下培養(yǎng)約40小時(shí)，此時(shí)通過(guò)刮擦采集細(xì)胞。使用QiagenMini-Prep程序提取DNA，且隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化以分離文庫(kù)質(zhì)粒DNA。接著，將所述DNA電穿孔到陰性選擇細(xì)胞系(具有陰性選擇質(zhì)粒pBAD衍生物的GeneHog)中。將這些轉(zhuǎn)化體接種到含有適當(dāng)抗生素而無(wú)非天然編碼的氨基酸(pAF)的LB平板上。約17小時(shí)后，通過(guò)刮擦采集這些細(xì)胞，并且使用QiagenMini-Prep程序和瓊脂糖純化來(lái)純化質(zhì)粒DNA。利用相同的電穿孔、接種、采集和DNA純化方法進(jìn)行隨后的多輪選擇。在最后一輪(第五輪)選擇中，制得經(jīng)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性選擇細(xì)胞的連續(xù)稀釋液，將其接種于基本培養(yǎng)基平板上。隨后，揀取個(gè)別集落并且使其在96孔板上生長(zhǎng)整夜。隨后，將所述板復(fù)制接種于含有不同濃度的氯霉素(陽(yáng)性選擇抗生素)且含有或不含有非天然氨基酸pAF的基本培養(yǎng)基平板上。在37。C下生長(zhǎng)約40小時(shí)后，目視比較平板以確定哪些集落在最高氯霉素濃度下生長(zhǎng)但在不存在非天然編碼的氨基酸pAF的情況下不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)較弱。使?jié)M足這些標(biāo)準(zhǔn)的集落生長(zhǎng)整夜。通過(guò)Mini-Prep和瓊脂糖凝膠純化將DNA從培養(yǎng)物中分離并且測(cè)序。從所述對(duì)于pAF的選擇看，發(fā)現(xiàn)13個(gè)克隆具有獨(dú)特的氨基酸序列并且經(jīng)歷進(jìn)一步表征以確定pAF-tRNA合成酶的保真度和加工性。為表征這些合成酶，進(jìn)行小范圍的琥珀抑制以表明已將非天然編碼的氨基酸pAF并入多肽中，并且通過(guò)SDS-PAGE檢驗(yàn)結(jié)果。揀取單一集落并且使其在LB肉湯中生長(zhǎng)整夜，隨后使用所述集落接種50mLLB。使細(xì)胞生長(zhǎng)到0.3-0.4的OD，此時(shí)將1.5mL等分試樣視為預(yù)先誘導(dǎo)點(diǎn)并且將培養(yǎng)物分到兩個(gè)燒瓶中。將1mMpAF加到一個(gè)分離燒瓶中并且使兩個(gè)燒瓶都生長(zhǎng)30分鐘。30分鐘生長(zhǎng)后，用0.2。/。L-阿拉伯糖誘導(dǎo)兩個(gè)培養(yǎng)物(+/-pAF)并且使其生長(zhǎng)4.5小時(shí)，并記錄OD麵。隨后從+ApAF燒瓶中取出1.5mL等分試樣以供SDS-PAGE分析。將1.5mL等分試樣(預(yù)先誘導(dǎo)，+pAF、-pAF)以10,000xg離心10分鐘以使細(xì)胞?；ｋS后將細(xì)胞懸浮于相對(duì)于其在采集時(shí)的OD,成比例的量的細(xì)菌蛋白提取試劑(BacterialProteinExtractionReagent)(BPER,Pierce)中。將DNaseI加到溶解的細(xì)胞中并且在4。C下培養(yǎng)20分鐘。隨后，將所述樣本與還原劑和裝載染料組合并且在MES緩沖液中的4-12%Bis-TRIS凝膠上跑膠30分鐘。將凝膠在DIH20中洗涂?jī)纱芜_(dá)10分鐘并且用考馬斯藍(lán)(coommassieblue)染料染色。針對(duì)導(dǎo)致并入pAF的pAF-tRNARS的保真度比較+/-pAF譜帶，并且將+pAF譜帶與先前選擇的pAF-tRNARS相比較。為檢查RS的加工性，利用含有C-H6S4am肌紅蛋白(S4am-Myo)的質(zhì)粒執(zhí)行相同程序。隨后通過(guò)IMAC純化S4amMyo并且將其用于蛋白質(zhì)測(cè)序以測(cè)定pAF并入的量。在由所述選擇鑒別的pAF-tRNARS中，發(fā)現(xiàn)一種合成酶(E9)以大于95%的pAF并入效率將pAF有效并入S4am-Myo中。在通過(guò)比較SDS-PAGE凝膠上蛋白質(zhì)譜帶展現(xiàn)加工性的同時(shí)，通過(guò)氨基酸測(cè)序測(cè)定并入。E9的核苷酸序列展示于SEQIDNO:4中并且E9的氨基酸序列展示于SEQIDNO:5中。對(duì)與E9具有類似活性的其它突變體進(jìn)行鑒別，并且其具有SEQIDNO:17中所示的氨基酸序列。實(shí)例2:tRNA資變產(chǎn)生三種tRNAJ17的突變體。野生型J17的DNA序列如SEQIDNO:8和美國(guó)專利公開(kāi)案第2003/0108885號(hào)中SEQIDNO:1以及US2003/0082575中SEQIDNO:l(分別為美國(guó)專利申請(qǐng)案第10/126,931號(hào)和第10/126,927號(hào))所示，所述專利都是以引用的方式并入本文中。如圖l所示，J17tRNA在T\|/C莖干中具有U51:G63擺動(dòng)配對(duì)。產(chǎn)生三種J17突變體(F12、F13和F14)以在Tv|/C莖干的51位和63位產(chǎn)生Watson-Crick堿基對(duì)。通過(guò)重疊PCR進(jìn)行誘變，并且將最終構(gòu)筑體克隆到包含編碼氨?；鵷RNA合成酶E9的聚核苷酸序列(SEQIDNO:4)和編碼人生長(zhǎng)激素(hGH)且具有琥珀密碼子取代的聚核苷酸序列(SEQIDNO:16)的pET19質(zhì)粒中的EcoRI和Ndel位點(diǎn)中。hGH表達(dá)是在T7啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行。產(chǎn)生兩個(gè)片段以用于重疊PCR。通過(guò)引物延伸獲得第一個(gè)片段。用于產(chǎn)生三種突變體中的每一種的正向引物的序列為TCCGCATGGCGC(FTamll;SEQIDNO:9)。為產(chǎn)生F12突變體(51C:63G),使用以下反向引物GTCCGCCGTTCTGC(FTaml2;SEQIDNO:10)。為產(chǎn)生F13突變體(51U:63A),使用以下反向引物GTCCGCCGTTCTGC(FTaml3;SEQIDNO:11)。為產(chǎn)生F14突變體(51A:63U),使用以下反向引物GTCCGCCGTTCTGC(FTaml4;SEQIDNO:12)。為產(chǎn)生第二個(gè)片段，將包含J17tRNA的聚核香酸序列(SEQIDNO:8)、編碼tRNA合成酶E9的聚核香酸序列(SEQIDNO:4)和編碼人生長(zhǎng)激素且具有琥珀密碼子取代的聚核苦酸序列(SEQIDNO:16)的質(zhì)粒pET19J17E9hGH用作利用以下引物組擴(kuò)增的模板(正向引物，F(xiàn)Taml5;SEQIDNO:13)和CAAATTCGTCCATATGGGATTCC(FTam16;SEQIDNO:14)。使用正向引物將序列從tRNA的3'端延伸到質(zhì)粒的Ndel位點(diǎn)。將所得產(chǎn)物凝膠純化。重疊PCR的最后步驟涉及正向引物GTAACGCTGAATTCCCGGCG(FTaml7，SEQIDNO:15)、反向引物FTaml6(SEQIDNO:14)、第一個(gè)片段和第二個(gè)片段。將組裝的產(chǎn)物用EcoRI和NdeI消化并且將其連接到經(jīng)EcoRI和NdeI消化的質(zhì)粒pET19J17E9hGH中。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)各構(gòu)筑體的序列，并且各J17突變體tRNA的DNA序列如SEQIDNO:1(F12)、SEQIDNO:2(F13)和SEQIDNO:3(F14)所示。將tRNA按照其相應(yīng)的反向引物命名。蛋白質(zhì)表達(dá)通過(guò)化學(xué)方式將編碼tRNA(J17、F12、F13或F14)的質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌抹1和菌抹2細(xì)菌宿主細(xì)胞中并且將其接種于含有50叫/ml羧節(jié)西林(carbenicillin)的LB瓊脂平板上。將平板在37。C下培養(yǎng)整夜。對(duì)于各tRNA,揀取單一集落以開(kāi)始在37°C下于1ml含有50pg/ml羧千西林的2xYT中進(jìn)行的整夜培養(yǎng)。在37。C下，使用所述1ml培養(yǎng)物接種兩份10ml含有50嗎/ml羧千西林的2xYT培養(yǎng)物。對(duì)一份10ml培養(yǎng)物補(bǔ)充4mM對(duì)乙酰基苯丙氨酸。OD6of0.7時(shí)，用0.4mMIPTG諸導(dǎo)hGH的表達(dá)。在37°C下以250rpm將細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)后，通過(guò)以5000xg離心5分鐘來(lái)采集細(xì)胞。將細(xì)胞用補(bǔ)充有5ng/mlDNAseI的B-PER試劑(Pierce,Rockford,IL)溶解。通過(guò)4-12°/。SDSPAGE分析全細(xì)胞溶解產(chǎn)物。圖2繪示通過(guò)SDSPAGE進(jìn)行的大腸桿菌菌林1全細(xì)胞溶解產(chǎn)物的分析。使用J17或J17突變體(F12、F13、F14)tRNA和氨酰基tRNA合成酶E9進(jìn)行人生長(zhǎng)激素中選擇性密碼子的抑制。具有J17突變體的細(xì)胞比具有J17的細(xì)胞生長(zhǎng)略慢。在不存在4mM對(duì)乙?；奖彼岬那闆r下，通過(guò)SDS-PAGE對(duì)于tRNA突變體未觀察到全長(zhǎng)hGH產(chǎn)物。在存在4mM對(duì)乙?；奖彼岬那闆r下，利用各tRNA突變體產(chǎn)生全長(zhǎng)產(chǎn)物，表明這些tRNA突變體-RSE9對(duì)與大腸桿菌機(jī)器正交。根據(jù)SDS-PAGE,J17突變體的經(jīng)抑制hGH的產(chǎn)率比大腸桿菌菌才朱1中J17的hGH的產(chǎn)率高約1.5到2倍。如圖3所示，在大腸桿菌菌抹2細(xì)菌細(xì)胞系中進(jìn)一步測(cè)試一種J17突變體F13的琥珀抑制。在大腸桿菌菌抹2中，表達(dá)以及琥珀抑制的產(chǎn)率比大腸桿菌菌抹1中的情形有所降低。在不存在對(duì)乙?；奖彼岬那闆r下，通過(guò)SDS-PAGE未觀察到全長(zhǎng)hGH產(chǎn)物。在存在4mM對(duì)乙酰基苯丙氨酸的情況下，對(duì)于兩種tRNA都觀察到全長(zhǎng)hGH。根據(jù)SDS-PAGE,F13的經(jīng)抑制hGH的產(chǎn)率比J17的hGH的產(chǎn)率高約3倍。利用約1.5L的最終體積進(jìn)行比較J17和F13的發(fā)酵試驗(yàn)。將編碼J17tRNA的質(zhì)粒和編碼F13tRNA的質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌抹1中。其各自的最終細(xì)胞密度為約190克濕細(xì)胞/升。J17克隆的hGH滴度為347mg/L,并且F13克隆的hGH滴度為542mg/L。盡管已出于清楚和理解的目的相當(dāng)詳細(xì)地描述本發(fā)明，但在閱讀本發(fā)明后所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，在不偏離本發(fā)明的真實(shí)范圍的情況下，可對(duì)形式和細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改。舉例來(lái)說(shuō)，上述所有技術(shù)和設(shè)備可以各種組合使用。本申請(qǐng)案中所引用的所有公開(kāi)案、專利、專利申請(qǐng)案和/或其它文獻(xiàn)都是以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，所引用的程度就如同將各個(gè)別公開(kāi)案、專利、專利申請(qǐng)案和/或其它文獻(xiàn)個(gè)別地以引用的方式并入本文中用于所有目的一般。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>權(quán)利要求1.一種組合物，其包含具有選自由SEQIDNO1、2、3、其互補(bǔ)聚核苷酸序列和其保守變異體組成的群組的核酸序列的tRNA。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述tRNA以化學(xué)方式經(jīng)氨?；?.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述tRNA以酶方式經(jīng)氨?；?.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述tRNA經(jīng)RS以酶方式氨?；?。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述tRNA經(jīng)核糖體以酶方式氨酰基化。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其另外包含RS，其中所述tRNA經(jīng)氨基酸氨?；?。10..根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述氨基酸為非天然編碼的氨基酸。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物,其中所述非天然編碼的氨基酸為對(duì)乙酰基苯丙氨酸。12.,根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所迷tRNA自古細(xì)菌tRNA得到。13.,根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述tRNA自詹氏曱烷球菌(M7a朋^c/z)得到。14.,根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其另外包含翻譯系統(tǒng)。15.,根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述翻譯系統(tǒng)為無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。16..根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物,其中所述翻譯系統(tǒng)為細(xì)胞溶解產(chǎn)物。17,,根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物,其中所述翻譯系統(tǒng)為重建的系統(tǒng)。18..根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物,其中所述翻譯系統(tǒng)為細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。19.,一種細(xì)胞，其包含翻譯系統(tǒng)，其中所述翻譯系統(tǒng)包含權(quán)利要求1的tRNA。20..根據(jù)權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。21..根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。22..根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是真菌細(xì)胞。23.,根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞。25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是植物細(xì)胞。26.根據(jù)權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是非真核細(xì)胞。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的細(xì)胞，其中所述非真核細(xì)胞是大腸桿菌(￡.co/O細(xì)胞。28.根據(jù)權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其另外包含編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸，其中所述聚核普酸包含由所述tRNA識(shí)別的選擇性密碼子。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)胞，其中所述所關(guān)注的多肽為人生長(zhǎng)激素。30.—種大腸桿菌細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的tRNA。31.—種酵母細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的tRNA。32.—種真菌細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的tRNA。33.—種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的tRNA。34.—種昆蟲(chóng)細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的tRNA。35.—種植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的tRNA。36.—種載體，其包含編碼tRNA的聚核苦酸，所述tRNA具有選自由SEQIDNO:1、2、3、其互補(bǔ)聚核苷酸序列和其保守變異體組成的群組的核酸序列。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的載體，其中所述載體包含質(zhì)粒、柯斯質(zhì)粒(cosmid)、噬菌體或病毒。38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的載體，其中所述載體為表達(dá)載體。39.—種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求36的載體。40.—種在細(xì)胞中制造在特定位置處具有所選氨基酸的多肽的方法，所述方法包含使所述細(xì)胞在適當(dāng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中所述細(xì)胞包含核酸，所述核酸包含至少一個(gè)選擇性密碼子并且編碼多肽；和提供所述所選氨基酸；其中所述細(xì)胞另外包含正交tRNA(O-tRNA),其在所述細(xì)胞中起作用并且識(shí)別具有選自由SEQIDNO:1、2、3、其互補(bǔ)聚核普酸序列和其保守變異體組成的群組的氨基酸序列的選擇性密碼子；和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS利用所述所選氨基酸使所述O-tRNA氨?；?1.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述所選氨基酸為對(duì)乙?；奖彼帷?2.—種多肽，其是由權(quán)利要求40的方法制造。43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的多肽，其中所述所選氨基酸為對(duì)乙?；奖彼帷?4.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述多肽為人生長(zhǎng)激素。45.—種聚核苷酸，其具有選自由SEQIDNO:1、2、3、其互補(bǔ)聚核苷酸序列和其保守變異體組成的群組的核酸序列。全文摘要本發(fā)明提供制造蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器的組件的組合物和方法，所述組合物和方法包括正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和正交tRNA/合成酶對(duì)。本發(fā)明還提供鑒別這些正交對(duì)的方法以及使用這些正交對(duì)制造蛋白質(zhì)的方法。文檔編號(hào)C12N15/12GK101273140SQ200580051325公開(kāi)日2008年9月24日申請(qǐng)日期2005年12月1日優(yōu)先權(quán)日2005年8月18日發(fā)明者芬·蒂昂申請(qǐng)人:Ambrx公司