專(zhuān)利名稱(chēng)：：植物中類(lèi)胡蘿卜素的增強(qiáng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及增強(qiáng)植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、果實(shí)、根或植物的其它部分中類(lèi)胡蘿卜素和其它類(lèi)異戊二烯(優(yōu)選番茄紅素和P-胡蘿卜素)的含量，和/或涉及增加植物的高度的方法，涉及由這種方法產(chǎn)生的植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、根或果實(shí)，涉及獲得類(lèi)胡蘿卜素(優(yōu)選番茄紅素和P-胡蘿卜素)的方法，涉及核酸構(gòu)建體以及涉及這種核酸構(gòu)建體的使用。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)代的疾病和病患中，癌和心血管疾病都排名靠前，并且影響很大一部分人群。已經(jīng)將這些疾病與諸如活性氧簇(其引起對(duì)細(xì)胞膜、DNA和其它細(xì)胞功能的損傷)之類(lèi)的因素關(guān)聯(lián)。因此，抗氧化劑已經(jīng)成為十分普及的食品添加劑，在所有年齡群體中，許多食品(例如新鮮水果、果汁、植物提取液和片劑)都可以使用并且每天消費(fèi)以保持健康。這類(lèi)化學(xué)物質(zhì)包括維生素C和維生素E、多酚、黃酮醇和類(lèi)胡蘿卜素。由于人不能合成任何這些物質(zhì)，它們要從微生物來(lái)源的植物獲得。與活性氧簇猝滅有關(guān)的關(guān)鍵物質(zhì)的其中一類(lèi)是多元醇和多烯。眾所周知，番茄紅素(p-胡羅卜素的開(kāi)鏈異構(gòu)體)是一種最有效的抗氧化劑，為P-胡蘿卜素的單線態(tài)氧猝滅能力的兩倍和a生育酚的單線態(tài)氧猝滅能力的10倍。此外，其為人血漿中最主要的類(lèi)胡蘿卜素(Kaliora等，2005)。番茄紅素在血漿中的穩(wěn)定性及其優(yōu)越的猝滅能力使其在其產(chǎn)生和疾病治療方面成為受到廣泛研究的化合物。它的11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共輒雙鍵使其表征為紅色(在472"76nm下出現(xiàn)峰吸收度)。在另外可能的1056種異構(gòu)體中，大約12種在自然界中發(fā)現(xiàn)為直鏈全反式異構(gòu)體，為最穩(wěn)定且在植物中發(fā)現(xiàn)的。這種化合物是多不飽和烴，為親脂性，并且對(duì)光、熱和氧化作用敏感(Faulks和Southon，2005)。番癡ir素和妖食番茄紅素富含于多種水果和蔬菜中，例如葡萄柚、番石榴汁、西瓜、番茄中。在番茄中，紅色大部分由番茄紅素引起并且高-番茄紅素水果表現(xiàn)出增強(qiáng)的紅色。在植物，發(fā)現(xiàn)番茄紅素為全反式形式，并且難以從不經(jīng)烹飪的食物吸收。在油存在下加熱已經(jīng)顯示了更好的可提取性，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些番茄產(chǎn)品(例如番茄汁、蕃茄糊、番茄醬和番茄沙司)具有更好(即更高量)的番茄紅素。已經(jīng)顯示烹飪使番茄紅素異構(gòu)化為順式構(gòu)型，該構(gòu)型增加了其生物利用率。此外在血清中，大多數(shù)番茄紅素為順式形式。據(jù)估計(jì)，每天需要35mg番茄紅素并且可能目前不是消費(fèi)者當(dāng)前攝入的部分(Faulks和Southon，2005)?；钚匝醮?ROS)由許多途徑產(chǎn)生，憑借這些途徑能量被轉(zhuǎn)移至基態(tài)三線態(tài)氧，使其成為高度活性的受激單線態(tài)氧。這種物質(zhì)能夠造成脂、蛋白質(zhì)和DNA損傷。ROS因而與衰老癥狀、癌和心血管疾病有關(guān)。由于富含不飽和鍵以及這些鍵的共軛，類(lèi)胡蘿卜素分子可以猝滅來(lái)自單線態(tài)氧的能量。伴隨該步驟，類(lèi)胡蘿卜素獲得激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的類(lèi)胡蘿卜素隨后通過(guò)與溶劑環(huán)境相互作用耗散為熱。完成一個(gè)猝滅反應(yīng)后，類(lèi)胡蘿卜素再生以進(jìn)行另一個(gè)反應(yīng)。有些估計(jì)認(rèn)為，類(lèi)胡蘿卜素可以猝滅大約1000個(gè)單線態(tài)氧后，它們才分解(Krinsky，1998、Bhuvaneswari和Nagini2005、Gruszecki和Strzalka，2005)。由于ROS引起的氧化損傷，已經(jīng)將其與許多慢性疾病相關(guān)聯(lián)。繼而，又已經(jīng)將抗氧化劑與保護(hù)脂類(lèi)、膜、低密度脂蛋白、蛋白質(zhì)和DNA免受損傷相關(guān)聯(lián)。更具體來(lái)講，已經(jīng)證明番茄紅素能預(yù)防癌和心血管疾病。幾個(gè)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，番茄紅素通過(guò)結(jié)合至親脂性部分，保護(hù)這種復(fù)合物免受氧化損傷。此外還建議將其用來(lái)防止致癌物質(zhì)誘導(dǎo)的p53和Rb抗癌基因的磷酸化，并使細(xì)胞分裂停止于G0-G1期。其還是HMGCoA還原酶的抑制劑，HMGCoA還原是膽固醇生物合成的關(guān)鍵步驟。另外，通過(guò)結(jié)合至LDL和VLDL，其阻止了膽固醇氧化物的形成并因而防止了CVD的形成(Kaliora等，2005、Agarwal和Rao2000)。雖然有幾種轉(zhuǎn)基因方法已經(jīng)導(dǎo)致在番茄中增加了番茄紅素，但是幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)天然的高番茄紅素變種。歷史上由CampbellSoup公司于1917在番茄鑒定的自發(fā)性突變(力/7-7)、SanMarzano變種(1975)修飾得到的力/7-2和&(Manapal變種，1973)已經(jīng)與提高的番茄紅素水平相關(guān)，并因而用于育種程序中(對(duì)于綜述，參見(jiàn)Bramley2002)。植物代謝工程對(duì)更有營(yíng)養(yǎng)的具有增強(qiáng)的類(lèi)胡蘿卜素以及尤其是番茄紅素的植物或植物產(chǎn)品的尋求已經(jīng)使植物生物學(xué)經(jīng)歷了十分新且有奠基性的科學(xué)。對(duì)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的理解和作圖(對(duì)于綜述，參見(jiàn)Fraser等，1994、Hirschberg2001、Fraser等，2002和Bramley2002)已經(jīng)得到了豐富的信息，這些信息使得能進(jìn)行提高類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量的植物的代謝工程。最新進(jìn)展的關(guān)鍵是發(fā)現(xiàn)，與其它生物體不同，植物經(jīng)由l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(D0XP)途徑而不是甲羥戊酸途徑合成類(lèi)胡蘿卜素。盡管兩個(gè)途徑都產(chǎn)生異戊烯基焦磷酸，但曱羥戊酸途徑將碳引導(dǎo)進(jìn)固醇、倍半萜和三萜途徑中，而DOXP途徑導(dǎo)致形成類(lèi)胡蘿卜素、植醇、質(zhì)體醌-9和雙辟(Bramley2002、Romer和Fraser2005)。首先，IPP異構(gòu)化為二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)，其為活化的單體，該單體最終寡聚體化成櫳牛兒基維牛兒基焦磷酸，雄牛兒基維牛兒基焦磷酸是C40類(lèi)胡蘿卜素和該途徑的第一種化合物八氫番茄紅素的前體。八氫番茄紅素通過(guò)八氫番茄紅素脫氫酶去飽和為六氫番茄紅素，并進(jìn)一步去飽和為胡羅卜素。接著番茄紅素通過(guò)胡羅卜素脫氫酶經(jīng)由鏈孢紅素產(chǎn)生。有趣地是，細(xì)菌的crH(來(lái)自噬夏孢歐文菌(frw'/7iflz;re^^ra))將乂\氫番癡紅素轉(zhuǎn)化成全反式番癡紅素(Ye等，2000、Bramley2002)。盡管超出了該工作的范疇，但是也應(yīng)該注意，全反式番茄紅素進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成cc-胡羅卜素和p-胡羅卜素，其中胡羅卜素是維生素A前體。鑒于其在健康上的有益效果而對(duì)植物進(jìn)行工程改造和/或鑒定具有提高的番茄紅素的植物已經(jīng)進(jìn)行了很多年，最早的一些要追溯至1917年，當(dāng)時(shí)Campbellsoup公司鑒定力/-J為番茄的高著色突變體(Reynard1956)?，F(xiàn)象的擴(kuò)展由Liu等，(2004)等進(jìn)行了說(shuō)明，他表明//7-7的同系物DDBl、LeHY5和LeCOPlLIKE的調(diào)節(jié)影響了類(lèi)胡羅卜素的生物合成(Bramley1997)。力/;-2和^也從天然群體得以鑒定，并與提高的類(lèi)胡蘿卜素水平相聯(lián)系(對(duì)于綜述，參見(jiàn)Levin)。根據(jù)這些結(jié)果，hp2和dg被確定為擬南芥屬(^ra6/i/o/^/s)DET1(DE-ETI0LATED1)的番茄同系物。該基因的組成型沉默導(dǎo)致番茄中的P-胡蘿卜素和番茄紅素水平升高(Davuluri等，2004)。對(duì)于這些突變體具有嚴(yán)重的發(fā)育缺陷，因?yàn)樗鼈儼l(fā)育受到阻礙、叢生且矮小。此外，Davuluri及其同事(2005)用RNA干擾策略降低了DET1的水平，這顯著增加了類(lèi)胡蘿卜素的水平，導(dǎo)致番茄紅素加倍且P-胡蘿卜素增加了10倍。在類(lèi)似的策略中，藍(lán)光光感受器Ciy2的過(guò)表達(dá)通過(guò)降低番茄紅素P環(huán)化酶而增加了番茄紅素的含量(Giliberto等，2004)。涉及類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑的酶的調(diào)節(jié)已經(jīng)產(chǎn)生了混雜結(jié)果。Fray等，(1995)在番茄中過(guò)表達(dá)八氫番茄紅素合酶基因，導(dǎo)致番茄紅素增加以及由于赤霉酸生物合成的減少而同時(shí)導(dǎo)致矮化。Fraser等，(2002)進(jìn)一步證明，利用多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子果實(shí)特異性地過(guò)表達(dá)八氫番茄紅素合酶(cWB來(lái)自噬夏孢歐文菌(Erwiniauredovora))導(dǎo)致番茄紅素增加1.8倍，八氫番茄紅素、P-胡蘿卜素和葉黃素也伴隨增加(2.4、和2.4倍的增加)。然而，番茄中細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶(or"來(lái)自噬夏孢歐文菌)的過(guò)表達(dá)(Romer等，2000)導(dǎo)致0-胡羅卜素增加3倍，而番茄紅素含量減半。Mehta等，(2002)利用成熟誘導(dǎo)的E8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的酵母S-腺苷蛋氨酸脫羧酶基因，對(duì)番茄中多胺積累進(jìn)行了工程改造。果實(shí)提取物表明了120|ig/mg的番茄紅素的產(chǎn)率(大約增加了300%)。Rosati等，(2000)利用了一種不同的方法，藉此番茄紅素環(huán)化酶通過(guò)反義技術(shù)失活，導(dǎo)致番茄紅素增加。育種者長(zhǎng)期以來(lái)針對(duì)高番茄紅素辛苦地育種，通過(guò)觀察潘那利番癡(Lycopersionpennellii)和M82(番癡(Lycopersionesculentum))之間的75個(gè)漸滲品系，Liu等，(2003)報(bào)道，大約16個(gè)QTL決定番茄的顏色并因而決定番茄紅素。同樣因?yàn)槠溆幸娴男再|(zhì)，番茄紅素已經(jīng)吸引了健康專(zhuān)家和植物科學(xué)家的注意。90年左右專(zhuān)注于發(fā)展新的策略以增加番茄中的類(lèi)胡蘿卜素水平說(shuō)明了其重要性，并且說(shuō)明盡管發(fā)展這種技術(shù)存在困難，仍然不斷需要將注意力集中在番茄紅素上。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目標(biāo)是提供增強(qiáng)植物和/或植物部分中的類(lèi)胡蘿卜素水平的手段。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供用于在植物和/或植物部分中產(chǎn)生增強(qiáng)水平的類(lèi)胡蘿卜素(尤其是番茄紅素)的方法。本發(fā)明的還有一個(gè)目標(biāo)是提供具有增強(qiáng)水平的類(lèi)胡蘿卜素，特別是番茄紅素的植物或植物部分。l本發(fā)明的目標(biāo)通過(guò)增強(qiáng)植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、果實(shí)、根或植物其它部分中的類(lèi)胡蘿卜素和其它類(lèi)異戊二烯(優(yōu)選番茄紅素和P-胡蘿卜素)的含量，和/或增加植物的高度來(lái)解決，所述方法包括-損傷所述植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、果實(shí)、根或植物其它部分中的線粒體功能，優(yōu)選損傷線粒體復(fù)合物I、II、III和/或IV，更優(yōu)選損傷線粒體復(fù)合物I。2在根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷利用所述植物細(xì)胞線粒體復(fù)合物I的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分，優(yōu)選為未編輯的編碼序列的翻譯產(chǎn)物的線粒體復(fù)合物I的蛋白質(zhì)組分來(lái)進(jìn)行。3優(yōu)選地，所述損傷通過(guò)用核酸構(gòu)建體(優(yōu)選DNA構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞，或通過(guò)用核酸構(gòu)建體經(jīng)由農(nóng)桿菌(Agrobacferium)種介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選才艮瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞，或通過(guò)利用合適植物病毒(例如煙草花葉病毒)的病毒轉(zhuǎn)染，或通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行。4在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體(優(yōu)選所述DNA構(gòu)建體)或所述農(nóng)桿菌包含，優(yōu)選二元栽體中，編碼所述線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白組分的核酸。5在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分是來(lái)自不同于所述植物細(xì)胞的另一植物種的功能障礙性蛋白質(zhì)或是與所述植物細(xì)胞相同的植物種的功能障礙性蛋白質(zhì)。6在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分是選自NAD1、2、3、4、4L、5、6、7、9、核線粒體蛋白76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda和?；d體蛋白的功能障礙性蛋白質(zhì)。7優(yōu)選編碼所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的所述核酸選自SEQIDNO:1_3。8在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體(優(yōu)選所述DNA構(gòu)建體)或所述農(nóng)桿菌(優(yōu)選所述農(nóng)桿菌二元載體)另外包含編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸，該核酸有效連接至編碼所述線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的所述核酸。9在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，其中所述核酸構(gòu)建體(優(yōu)選所述DNA構(gòu)建體)或所述農(nóng)桿菌(優(yōu)選所述農(nóng)桿菌二元載體)另外包含啟動(dòng)子和終止子，并且所述啟動(dòng)子和終止子有效連接至編碼所述線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的所述核酸。10在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述核酸構(gòu)建體(優(yōu)選所述DNA構(gòu)建體)或所述農(nóng)桿菌(優(yōu)選所述農(nóng)桿菌二元載體)包含所述啟動(dòng)子和所述終止子、編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的所述核酸和編碼所述線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的所述核酸，全部如前面所定義，它們?nèi)康靡杂行нB接。11優(yōu)選所述損傷通過(guò)突變所述植物細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，所述突變是關(guān)于所述植物細(xì)胞中所述線粒體復(fù)合物I的至少一個(gè)組分。12在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突變是通過(guò)利用施加至至少一個(gè)植物細(xì)胞，優(yōu)選相同植物的多個(gè)植物細(xì)胞的化學(xué)和/或物理誘變劑隨機(jī)突變所述植物細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，所述的化學(xué)誘變劑優(yōu)選選自甲基磺酸乙酯，而所述物理誘變劑選自快中子轟擊、X射線、Y射線和其它誘變輻照。13在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在突變后，另外包括額外的篩選步驟，篩選是針對(duì)所述植物細(xì)胞或多個(gè)植物細(xì)胞中的線粒體復(fù)合物I的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分或其它線粒體功能。14在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷是通過(guò)施加所述植物細(xì)胞的線粒體功能的化學(xué)抑制劑，優(yōu)選線粒體復(fù)合物I的化學(xué)抑制劑至所述植物細(xì)胞、植物、愈傷組織、組織、所述植物的部分、所述植物全部、果實(shí)、根和/或其它植物器官。15在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化學(xué)抑制劑選自魚(yú)藤酮、抗霉素A、乙氧氟草醚、堇菜黃質(zhì)、殺粉蝶菌素、殺粉蝶霉素A、p比峻、峻竭酉同、會(huì)峻淋、聚乙酸、thiangazole和fenaza(抗螨唑)。16在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述損傷是所述線粒體復(fù)合物I的抑制。17在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法另外包括栽培已經(jīng)經(jīng)受了任意前述權(quán)利要求的方法的所述植物細(xì)胞、植物部分、組織、種子或器官，以產(chǎn)生植物愈傷組織、組織、植物、根和/或果實(shí)的步驟。18本發(fā)明的目標(biāo)通過(guò)根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)來(lái)解決。19優(yōu)選地，所述植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)源自植物起源，所述的植物起源選自癡科種(solanaceousspecies),包括番茄、胡椒、辣椒、馬鈴薯、碧冬茄和/或煙草。20優(yōu)選地，在植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)中，類(lèi)胡蘿卜素(優(yōu)選番茄紅素)的量增強(qiáng)至每100g鮮重的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根和/或果實(shí)>10mg，優(yōu)選>15mg,甚至更優(yōu)選>16mg并且最優(yōu)選>20mg。21優(yōu)選的是，在植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)中，類(lèi)胡蘿卜素(優(yōu)選番茄紅素)的量相對(duì)于沒(méi)有經(jīng)歷根據(jù)本發(fā)明方法的植物細(xì)胞/愈傷組織/組織/植物、根或果實(shí)，增強(qiáng)了至少2倍，優(yōu)選3倍。22本發(fā)明的目標(biāo)通過(guò)獲得類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選番茄紅素和/或P-胡蘿卜素的方法來(lái)解決，所述方法包括以下步驟根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)，-從所述植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)純化類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選番茄紅素和/或p-胡蘿卜素，優(yōu)選通過(guò)溶劑萃取和純化或通過(guò)超臨界二氧化碳萃取或本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所采用的任意其它方法進(jìn)行。23本發(fā)明的目標(biāo)也通過(guò)核酸構(gòu)建體解決，所述核酸構(gòu)建體包含編碼線粒體復(fù)合物I的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的核酸序列。24優(yōu)選地，線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分選自NAD1、2、3、4、4L、5、6、7和9或所述復(fù)合物的其它蛋白質(zhì)性質(zhì)的組25在根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的一個(gè)實(shí)施方案中，線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分來(lái)自選自番茄、馬鈴薯、煙草、稻、玉米、碧冬茄、擬南芥屬和/或蓮屬(丄o&s)、苜蓿屬(Medicago)、小麥和/或高粱屬(Sorghum)的物種。26優(yōu)選的是，線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分具有選自SEQIDNO:4、5和6的序列。27本發(fā)明的目標(biāo)通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體用于增強(qiáng)植物細(xì)胞、植物、愈傷組織、組織、果實(shí)、根或所述植物的其它部分中的類(lèi)胡蘿卜素和其它類(lèi)異戊二烯的含量，優(yōu)選番茄紅素和/或P-胡蘿卜素的含量和/或用于增加植物的高度來(lái)解決。定義"轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)化的植物"指含有通過(guò)轉(zhuǎn)化引入的重組多核普酸的植物。轉(zhuǎn)化意指以這樣一種方式將多核苷酸序列引入植物中，該方式使得引起該核普酸序列穩(wěn)定整合或引起該序列的瞬時(shí)表達(dá)。這可以通過(guò)粒子轟擊(基因槍)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)(利用經(jīng)適當(dāng)開(kāi)發(fā)的質(zhì)粒載體)、用病毒DNA或載體轉(zhuǎn)染、通過(guò)電穿孔或脂轉(zhuǎn)染引入DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。植物轉(zhuǎn)化可以在植物細(xì)胞、花粉上、在植物種子上、在植物原生質(zhì)體上，或任意其它類(lèi)型的植物組織、完整的植物或植物部分上于無(wú)菌或有菌條件下進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的植物可以指整個(gè)植物、任意植物部分、植物細(xì)胞、植物器官、植物組織、種子、根、花、果實(shí)、根或芽。其也指其子代。"栽體，，是通過(guò)重組、人造或化學(xué)產(chǎn)生多核酸構(gòu)建體，包含可以編碼基因、蛋白質(zhì)、啟動(dòng)子、終止子和轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸元件。這些片段將被有效連接，以至于能夠表達(dá)編碼的基因或完全執(zhí)行編碼的程序。啟動(dòng)子區(qū)可以包括組成型的或組織特異性的、組織活性的、發(fā)育階段活性的/發(fā)育階段特異性的或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如(但不限于)花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子或玉米泛素啟動(dòng)子。核苷酸序列是"有效連接的"，在DNA序列的鄰接片段以這樣的方式連接時(shí)，以便使得具有如基因序列編碼的細(xì)胞/生物學(xué)功能。類(lèi)胡羅卜素類(lèi)胡蘿卜素是一類(lèi)碳?xì)浠衔?胡蘿卜素類(lèi))以及它們的氧合衍生物(葉黃素)，由8個(gè)類(lèi)異戊二烯單元組成，所述的類(lèi)異戊二烯單元是以這樣的方式連接類(lèi)異戊二烯單元的排列在分子的中心反轉(zhuǎn)以便兩個(gè)中心甲基基團(tuán)處于1，6-位置關(guān)系，并且剩下的非末端甲基基團(tuán)處于1，5-位置關(guān)系。所有的類(lèi)胡蘿卜素可以通過(guò)(i)氫化、Ui)脫氫、(iii)環(huán)化或(iv)氧化或這些方法的任意組合，從形式上源于開(kāi)鏈C40H56結(jié)構(gòu)，具有長(zhǎng)的共軛雙鍵的中心鏈。損傷損傷指細(xì)胞器、功能性復(fù)合物、酶或其它功能實(shí)體的功能的部分喪失或完全喪失。如在此所用的，功能的完全喪失有時(shí)也稱(chēng)為抑制。線粒體復(fù)合物線粒體復(fù)合物指分別稱(chēng)為I、II、III和IV的線粒體的四個(gè)電子傳遞鏈復(fù)合物，其中復(fù)合物I是NADH-脫氬酶，復(fù)合物II是琥珀酸脫氫酶，復(fù)合物III是細(xì)胞色素c還原酶，而復(fù)合物IV是細(xì)胞色素c氧化酶。它們?yōu)閰⑴c通過(guò)氧化NADH+H+和FADH2為NAD+和FAD而產(chǎn)生ATP的多一多肽復(fù)合物(multipolypeptidecomplex)。線粒體復(fù)合物I蛋白這種復(fù)合物包含大約43條多肽鏈，所述的多肽鏈包括線粒體編碼的nadl、nad2、nad3、nad4、nad札m、nad5、nad6、nad7、nad9以及核編碼的76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda?；d體蛋白。"經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分"指在其核酸序列、結(jié)構(gòu)或功能上不同于天然的功能性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組分，并且可以是無(wú)功能的。應(yīng)該注意，在植物線粒體中，由于一個(gè)或多個(gè)翻譯后的RNA編輯事件，天然的(功能性)蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同于編碼該蛋白質(zhì)的天然基因序列的假定翻譯產(chǎn)物。"未編輯的"指與線粒體基因組中天然存在的基因序列相同的基因序列。由于轉(zhuǎn)錄后的RNA編輯(由此某些C核糖核苷酸被修飾為U核糖核苷酸，而少有的，某些U核糖核苷酸被修飾為C核糖核苷酸)，其通常不同于編碼天然的(功能性)蛋白質(zhì)的mRM產(chǎn)物。例如，"未編輯序列的翻譯產(chǎn)物"是如果在轉(zhuǎn)錄后水平上沒(méi)有發(fā)生編輯事件時(shí)將期望產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。功能障礙部分或完全無(wú)功能的轉(zhuǎn)運(yùn)肽指N-端前序列，其引導(dǎo)由核編碼的線粒體結(jié)合蛋白至線粒體。需要轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)將這種蛋白質(zhì)從它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中的合成位點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)相關(guān)的膜。線粒體的抑制劑包括(但不限于)魚(yú)藤酮、抗霉素A、氰化物、丙二酸(琥珀酸脫氫酶抑制劑)、2，4-二硝基苯酚(DNP)、碳酰基氰基對(duì)[三氟甲氧基]-苯基-腙(FCCP)、寡霉素、乙氧氟草醚、堇菜黃質(zhì)、殺粉蝶霉素A、吡唑、峻螨酮、會(huì)唑啉、聚乙酸、thiangazole、抗螨唑、蓬喻甲醜三氣丙酉同(thenoxyltrifluoroacetone)、carfboxin、氧化萎銹靈、丁烯酰胺、DDT、chlorproham、敵稗、地樂(lè)酚、碘苯腈、環(huán)戊二烯、百草枯、地樂(lè)酚、丁醚脲、滅多蟲(chóng)、米酵菌酸和氟蟻腙。農(nóng)桿菌指農(nóng)桿菌種的細(xì)菌，其用于利用合適的重組農(nóng)桿菌二元載體用所關(guān)注的基因轉(zhuǎn)化植物。同樣，農(nóng)桿菌二元載體指重組DM構(gòu)建體，其將與所關(guān)注的其它基因一起轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌細(xì)胞中。這些細(xì)胞繼而將被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物部分、種子或完整的整林植物。本發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)水平的類(lèi)胡蘿卜素可以用基因工程或其它手段通過(guò)損傷植物中的線粒體功能而實(shí)現(xiàn)。與沒(méi)有經(jīng)歷根據(jù)本發(fā)明的方法的植物比較，利用本發(fā)明，本發(fā)明人能夠在植物中產(chǎn)生出乎意料高的水平的類(lèi)胡蘿卜素，更顯著的是番茄紅素(表1)。類(lèi)似水平的類(lèi)胡羅卜素僅可以在經(jīng)加工的和人工濃縮食品(例如調(diào)味番茄醬或濃縮番茄醬)中具有(也參見(jiàn)表2)。例如，所述目標(biāo)可以通過(guò)組裝編碼玉米泛素啟動(dòng)子(SEQIDNo7)、擬南芥屬At-mRBPla線粒體靶向轉(zhuǎn)運(yùn)肽(核苷酸序列為SEQIDNo8，多肽序列為SEDIDNo9)、來(lái)自稻線粒體肽的未編輯的nad9基因(核苷酸序列為SEQIDNo1，多肽序列為SEDIDNo2)和胭脂堿合酶(NOS)終止子的多核苷酸構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢赃M(jìn)行這種組裝以便賦予該構(gòu)建體在植物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯能力，并且此外還使得蛋白質(zhì)產(chǎn)物得以轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。可以觀察到通過(guò)這種或類(lèi)似構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞/植物/植物部分顯示出上述高水平的類(lèi)胡蘿卜素，更顯著的是番茄紅素和/或fi-胡蘿卜素。本發(fā)明因而涉及培養(yǎng)高類(lèi)胡蘿卜素植物、植物細(xì)胞、組織或植物部分(包括葉、莖、根、果實(shí)和花)的方法。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)具有增強(qiáng)水平的番茄紅素和/或P-胡蘿卜素的植物的方法。本發(fā)明此外還涉及增強(qiáng)源于類(lèi)異戊二烯途徑的植物化合物的水平的方法，所述的植物化合物包括(但不限于)赤霉酸、脫落酸、色素、固醇。下面提及了實(shí)例，所述的實(shí)例旨在舉例說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。也提及了圖1-5，其中圖1示出了用作用于轉(zhuǎn)化的基本構(gòu)建體的質(zhì)粒pBS(SK-)構(gòu)建體。定向序列表示At-mRBPla的編碼區(qū)，其在SacI和XbaI限制位點(diǎn)之間克隆進(jìn)來(lái)以得到pNGl。圖2示出了用作用于轉(zhuǎn)化的基本構(gòu)建體的質(zhì)粒pBS(SK-)構(gòu)建體。TS和未編輯的/7aW表示At-mRBPla和在XbaI和BamHI限制位點(diǎn)間克隆進(jìn)來(lái)的經(jīng)編輯的/JaW基因的編碼區(qū)，得到pNG3。圖3示出了用作用于轉(zhuǎn)化的基本構(gòu)建體的質(zhì)粒pBS(SK-)構(gòu)建體。稱(chēng)為T(mén)P的盒和未編輯的/adi表示At-mRBPla和在pBS(SK-)載體的多克隆位點(diǎn)插入的未編輯的"a"的編碼區(qū)。該嵌合基因處于泛素啟動(dòng)子和Nos終止子的控制下。圖4示出了編碼潮霉素抗性基因(hph)的質(zhì)粒pLAU6.hph，該基因由木薯葉脈花葉病毒(CVMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，并具有NOS終止子。圖5示出了番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其用于確定本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中的番茄紅素含量。圖6示出了通過(guò)解析如本文所述的番茄紅素提取物而獲得的典型的色譜圖。此外，還提及了序列，其中SEQIDNO1:NADH脫氬酶亞基9的稻(^yzaw">a)線粒體nad9基因(GenBank登記號(hào)D50099[RICMTNAD9])。SEQIDNO2:NADH脫氫酶亞基9的馬鈴薯(5Wa/7咖"6eros咖)線粒體nad9基因(GenBank登記號(hào)X79774[STMINAD9])。SEQIDNO3:NADH脫氫酶亞基9的煙草(治'co〃a加"6ac咖)線粒體nad9基因(GenBank登記號(hào)YP173479[YP173479])。SEQIDNO4:NADH脫氬酶亞基9的稻(0r/za線粒體nad9蛋白(SEQIDNO1的翻譯產(chǎn)物)。0.1%BSA4.0mM2-巰基乙醇2mMDTT洗涂緩沖液(無(wú)BSA&DTT的提取緩沖液)2X梯度緩沖液0.5M蔗糖100mMTrisHCLpH7.56.0mMEDTA在2X梯度緩沖液中制備Percoll梯度將稻線粒體(大約75ug)重新懸浮于重懸浮緩沖液中并用1/4體積的裂解緩沖液裂解。通過(guò)倒轉(zhuǎn)溫和地混合后，加入苯酚，隨后加入氯仿。進(jìn)行3次苯酚氯仿萃取，然后用氯仿萃取。在-20。C下孵育30分鐘后，用2.5體積的乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉，通過(guò)在13，000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘，從液相中沉淀出DNA。用70%的乙醇洗滌DNA沉淀顆粒，干燥并溶解于水中。利用如下引物對(duì)，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從擬南芥cDNA克隆線粒體定向序列(At-fflRBPla，參見(jiàn)DNA序列SEQIDNo8和肽序列SEQIDNO9)。正向引物5、AAGAGCTCCCATGGTVTTCTGTAACAAACTCG3’反向引物5、AATCTAGACTTGGTAGACATCAACCGG3’正向引物和反向引物分別具有整合于它們中間的Sacl位點(diǎn)和Xbal位點(diǎn)，而這使得易于將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pBS(SK-)中，將所得的栽體稱(chēng)為pNGl(圖1)。線粒體的裂解將稻線粒體(大約75pg)重新懸浮于重懸浮緩沖液中并用1/4體積的裂解緩沖液裂解。通過(guò)倒轉(zhuǎn)溫和地混合后，加入苯酚，隨后加入氯仿。進(jìn)行3次苯酚氯仿萃取，然后用氯仿萃取。在-2(TC下孵育30分鐘后，用2.5體積的乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉，通過(guò)在13，000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘，從液相中沉淀出DNA。用70°/。的乙醇洗滌DM沉淀顆粒，干燥并溶解于水中。pNG3:線粒體定向的未編輯NAD9通過(guò)PCR從稻線粒體DNA獲得未編輯的nad9(DNA序列為SEQIDNO1，肽序列為SEQIDNO4)。將以下的引物組合用于擴(kuò)增正向引物5、AATCTAGAATGGATAACCAATCCATTTTCCAA3、反向引物5、AAGGATCCGGGATTATCCGTCGCTACG3、正向引物具有XbaI位點(diǎn)而反向引物具有BamHI位點(diǎn)，通過(guò)所述位點(diǎn)未編輯的nad9基因得以克隆至鄰接所述線粒體定向序列，該載體稱(chēng)為pNG3(圖2)。pNGll:利用SacI位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)將未編輯的nad9基因從pNG3切出，并使之與上游的泛素啟動(dòng)子(SEQIDN07)和下游的Nos終止子連接。得到的構(gòu)建體稱(chēng)為pNGll(圖3)。已經(jīng)為番癡(Z/co;em'co/7esctz/e/^z/izz)將完成了的基本的轉(zhuǎn)4匕工作和實(shí)驗(yàn)室水平的組織培養(yǎng)程序進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，并且轉(zhuǎn)化方法如下轉(zhuǎn)化番茄的方法種子番癡(Z/co/ers2.co/7escu/e/U咖Mi11)變種S-22(ArkaVikas)種子得自印度園藝研究所(IndianInstituteofHorticulturalResearch)(IIHR，Hesarghatta，Bangalore)?！鲇秒p蒸餾高壓滅菌水洗滌兩次。醒將種子在70%乙醇中漂洗2分鐘。國(guó)在搖動(dòng)器中將種子浸入市售漂洗劑的70%溶液中30分鐘?！鰧⑺鼈冞M(jìn)行洗滌直至所有的漂白劑痕跡都被移除。畫(huà)在高壓滅菌的薄紙上干燥。■步驟'd，和'e，在層流罩下進(jìn)行以避免污染。用于轟擊的外植體的制備使種子在半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基上體外發(fā)芽。將IO天大的籽苗連根拔起并將子葉切掉，將該子葉的中心部分用于轟擊。將大約40個(gè)這種外植體置于裝有滲壓劑培養(yǎng)基的陪替氏培養(yǎng)皿的中心。在該培養(yǎng)基中孵育4小時(shí)后，立即用粒子加速器(PDS-1000/He)讓愈傷組織接受微粒轟擊。金懸浮液的制備使用的金微粒的大小在1.5-3.0n之間，稱(chēng)出6mg的金微粒置于0.5ml的埃彭道夫管(eppendorftube)內(nèi)。將100ijl的高壓滅菌的雙蒸餾水加至金微粒，并在離心機(jī)中渦旋30秒。將其離心30秒。加入100jil100%的乙醇并渦旋一分鐘。以10000轉(zhuǎn)/分鐘在離心機(jī)中離心30秒。吸移掉上清液。再次重復(fù)乙醇洗滌。將100Ml無(wú)菌蒸餾水加至沉淀顆粒。將其渦旋并將50pl上清轉(zhuǎn)移進(jìn)另一個(gè)0.5ml管中。每個(gè)這種管含有50μl的金懸浮液，并在室溫下或41C下保存直至完成DNA包被。顆粒包被方法以3:1的比率將兩種質(zhì)粒加至5(^1的金懸浮液以便得到10ngDNA的總濃度，所述的質(zhì)粒是包含所關(guān)注基因的質(zhì)粒(含有未編輯的nad9基因或經(jīng)編輯的nad9或反義形式的未編輯的nad9的質(zhì)粒)和pLAU6hph(含可選標(biāo)記潮霉素的質(zhì)粒，見(jiàn)圖4)。將20}il0.1M的亞精胺(Sigma,Aldrich)加入其中并渦旋機(jī)上低速混合。然后加入50p12.5MCaCl2,并充分混合。讓該混合物在室溫下保持IO分鐘。稍后將其在離心機(jī)中離心30秒鐘。在層流罩中移除上清液。制備用于基因槍轉(zhuǎn)化的微載體(microcarrier)、可裂膜以及阻擋網(wǎng)載體膜片(macrocarrier)在進(jìn)行樣品細(xì)胞/組織轟擊前將放置在載體膜片支持物中的栽體膜片進(jìn)行預(yù)裝配和預(yù)消毒。首先將載體膜片浸入100%的乙醇中，然后將其在高壓滅菌的薄紙上干燥。然后在層流罩中讓載體膜片保持UV光下進(jìn)行表面消毒IO分鐘?？闪涯⑦x擇的可裂膜轉(zhuǎn)移至各個(gè)陪替氏培養(yǎng)皿用于早期的處理。在插入保持蓋前才通過(guò)簡(jiǎn)單地將它們浸入70%的異丙醇中來(lái)將可裂膜滅菌。不要浸泡多于幾秒。過(guò)多浸泡可能使該可裂膜分層，導(dǎo)致過(guò)早破裂。所有的可裂膜都是層狀的，除了額定為450、650和1,100psi的那些。因?yàn)闈撛诘姆謱佣煌扑]高壓滅菌。阻擋網(wǎng)將選擇的可裂膜轉(zhuǎn)移至各個(gè)陪替氏培養(yǎng)皿用于早期的處理。推薦通過(guò)高壓滅菌。備選地，這些部分可以通過(guò)在70%乙醇中浸泡，然后在無(wú)菌環(huán)境中干燥來(lái)滅菌?？梢詫⒆钃蹙W(wǎng)進(jìn)行兩次高壓滅菌和再使用。將在微載體涂覆于栽體膜片上將上清液從DNA包被的金微粒除去?；诖Z擊的盤(pán)的數(shù)目，將無(wú)水乙醇加至DNA包被的金微粒——對(duì)于待涂覆的每個(gè)載體膜片(即待轟擊的薄板)加入10.0pl。將該混合物進(jìn)行渦旋直至獲得均勻的懸浮液，并吸移出10.0|Lll并涂覆于載體膜片的中心上。讓乙醇干燥揮發(fā)，留下金顆粒在栽體膜片上。進(jìn)行轟擊轟擊前1.選擇并調(diào)整保持可裂膜保持蓋和微栽體組之間的間隙距這個(gè)轟擊參數(shù)。轟擊在900psi的破裂壓力和9cm的距離下進(jìn)行。將阻擋網(wǎng)支承于微載體送出組(microcarrierlaunchassembly)的固定式巢內(nèi)的正確位置。2.將氦氣供應(yīng)調(diào)整至200psi，超過(guò)所需的破裂壓力。3.用70%乙醇將可裂膜保持蓋、微載體送出組和整個(gè)裝置擦干凈。4.在試驗(yàn)當(dāng)天，用DNA涂覆栽體膜片并裝栽于無(wú)菌載體膜片支持物上。發(fā)射該裝置1.插上從主機(jī)至電源的電源線。2.打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)。3.用70%的乙醇對(duì)轟擊室壁進(jìn)行滅菌。4.將無(wú)菌可裂膜裝栽至無(wú)菌保持蓋中。5.將保持蓋固定于氣體加速管的末端(轟擊室的內(nèi)部頂端)，并用轉(zhuǎn)矩扳手鎖緊。6.將載體膜片和阻擋網(wǎng)裝載進(jìn)微載體送出組中。7.將微載體送出組和耙細(xì)胞放置于轟擊室內(nèi)并將門(mén)關(guān)上。8.抽空轟擊室，將真空保持在所需水平(最小5英寸汞柱)。9.轟擊樣品持續(xù)壓下發(fā)射按鈕直至可裂膜破裂且氦氣壓力降至零。10.放開(kāi)發(fā)射按鈕。轟擊后1.釋放轟擊室的真空。2.將靶細(xì)胞從轟擊室移出。3.從載體膜片送出組取出載體膜片和阻擋網(wǎng)。4.退出用過(guò)的可裂膜。5.將氦氣壓力從系統(tǒng)移除(在完成當(dāng)天的所有試驗(yàn)后)。經(jīng)轟擊細(xì)胞的生長(zhǎng)和選擇16小時(shí)后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有BAP(4.5mg/L)和IBA(0.2mg/L-含有10mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的番茄再生培養(yǎng)基用于選擇和在25t:下光照孵育15天。將抗性愈傷組織每15天繼代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上使之伸長(zhǎng)。如果芽在再生培養(yǎng)基中沒(méi)有伸長(zhǎng)的話，在再生后切取芽并置于含BAP(4.5mg/L)、IBA(0.2mg/L)和GA(1.0mg/L)的MS培養(yǎng)基上。將伸長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)移至含有IAA(0.1m/L)的MS培養(yǎng)基中用于生根。將生根的小植林轉(zhuǎn)移至經(jīng)高壓滅菌的蒸餾水中以硬化幾天，并然后轉(zhuǎn)移進(jìn)蛭石中。然后將小植林轉(zhuǎn)移至紅土中。植林生長(zhǎng)將土壤中的小植林轉(zhuǎn)移至溫室中。在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)植林以采集變種和果實(shí)?？梢詾樵囼?yàn)?zāi)康幕蛴N目的進(jìn)行異花受精。也可以在溫室中的植物上進(jìn)行遺傳試驗(yàn)。通過(guò)HPLC方法進(jìn)行的番茄樣品中番茄紅素含量的定量分析色i普系統(tǒng)1.配備有自動(dòng)采樣器、除氣器、PDA檢測(cè)器和Millennium32軟件的Waters2695XESeparationsModule2.HPLC級(jí)溶劑-甲醇、二氯甲烷(通過(guò)O.22微米的薄膜過(guò)濾器過(guò)濾)3.HPLC樣品瓶用于樣品制備旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、稱(chēng)重天平、離心機(jī)、試管、試管架和過(guò)濾器。萃取劑己烷丙酮甲醇(2:1:1)，具有2.5%BHT樣品溶劑二氯甲烷曱醇(45:55)從番茄樣品提取番茄紅素稱(chēng)出l克新鮮的番茄(從溫室采集)樣品，并用馬達(dá)和研枰在IOml萃取劑中研磨。轉(zhuǎn)移至離心管，用超聲處理6分鐘并在7500轉(zhuǎn)/分鐘下離心5分鐘。小心收集澄清的有機(jī)層并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中千燥，在-20'C下保存直至使用。所有操作均在暗光下進(jìn)行。避免直接光照和高溫。樣品制備將干燥樣品再溶解于1ml的樣本溶劑中并從該母液配制1:10的稀釋液。將稀釋的樣品通過(guò)0.22微米的過(guò)濾器，然后讓其接受HPLC分析。樣品制備應(yīng)該快速進(jìn)行以避免溶劑損失。色鐠條件流動(dòng)相甲醇二氯甲烷(95:5)甲醇(HPLC級(jí)溶劑用于HPLC分析)泵模式等度洗脫(MeOH:DCM::5)柱BondapakC18,4.6x150mm,5mum檢測(cè)器:Waters2996PDA檢測(cè)器流速1.5ml/分鐘注射體積20ja1注射次數(shù)2次工作時(shí)間15分鐘。檢測(cè)波長(zhǎng)476nm甲醇二氯甲烷("5)的雙溶劑系統(tǒng)用于在15分鐘期間從樣品溶解番茄紅素。將工作時(shí)間減少至15分鐘，使用1.5ml/分鐘的流速，以容納更多的樣品。番茄紅素的檢測(cè)波長(zhǎng)是476nm，其用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線在具有0.1%BHT的HPLC級(jí)樣品溶劑中制備范圍為10-80jag/ml的標(biāo)準(zhǔn)番茄紅素(Sigma)，并讓其接受分析。畫(huà)出校準(zhǔn)曲線-'番茄紅素17Jun05，校準(zhǔn)ID1729，日期17/06/2005,R=0.9948，R2=0.9897。(參見(jiàn)圖5的標(biāo)準(zhǔn)曲線和圖6的代表性色譜曲線)。表1.從番茄的轉(zhuǎn)基因變種和市售變種獲得的番茄紅素的水平每100g果實(shí)的番茄紅素(以mg表示)。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表l:分析的番茄紅素(包括轉(zhuǎn)基因品系和市售變種)的水平。正如可以看到的，通過(guò)本發(fā)明獲得的類(lèi)胡蘿卜素的水平，更顯著的是番茄紅素的水平可以高達(dá)6.5(26.9:4.1)，并且范圍為2.1(14.3:6.7)至6.5，并且包括如下比率4.2(17.4:4.1)、3,0(16.7:5.5)和5.7(23.5:4.1)。說(shuō)明書(shū)第24/27頁(yè)按絕對(duì)值計(jì)算，這么高的水平在別處僅在經(jīng)加工的食品(濃縮番茄醬)中達(dá)到，這可以從下面的表2看出。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表2:食物和食品中番茄紅素的水平(參考文獻(xiàn)Nguyen,M.L.，Schwartz,S.J.1999.Lycopene:Chemicalandbiologicalproperties.FoodTechno1.53:38-45)參考文獻(xiàn)1.AgarwalS,RaoAV(2000)tomatolycopeneanditsroleinhumanhealthandchronicdiseases.CanMedAssocJourn163:739-7442.BertramJS，VineAL(2005)Cancerpreventionbyretinoidsandcarotenoids:independentactiononacommontarget,BiochimBiophysActa1740:170-1783.BhuvaneswariV，NaginiS(2005)Lycopene:areviewofitspotentialasananticanceragent.CurrMedChemAnti-CancAgents5:627-6354.BramleyPM(1997)Theregulationandgeneticmanipulationofcarotenoidbiosynthesisintomatofruit.Pure&ApplChem69:2159-21625.BramleyPM(2002)RegulationofcarotenoidformationduringtomatofruitripeninganddevelopmentJExpBot53:2107-21136.DavuluriGR,vanTuinenAetal(2004)ManipulationofDETlexpressionintomatoresultsinphotomorphogenicphetotypescausedbypost-transcriptionalgenesilencing.PlantJournal46:344-3547.DavuluriGR，vanTuinenA,etal(2005)Fruit-specificRNAi-mediatedsuppressionofZ)五TVenhancescarotenoidandflavonoidcontentintomatoes.NatBiotech23:890-8958.FaulksRM,SouthonS(2005)Challengestounderstandingandmeasuringcarotenoidbioavailability,BiochimBiophysActa1740:9^-1009.FraserPD,BramleyPetal(2001)EffectoftheCnrmutationoncarotenoidformationduringtomatofruitripening.Phytochem58:75-7910.FraserPD,TruesdaleMRetal(1994)Carotenoidbiosynthesisduringtomatofruitdevelopment.PlantPhysiol105:405-41311.FraserPD，RomerSetal(2002)Evaluationoftransgenictomatoplantsexpressinganadditionalphytoenesynthaseinafruit-specificmanner.ProcNatAcadSciUSA99:1092-109712.FrayRG，WallaceAetal(1995)Constitutiveexpressioniofafruitphytoenesynthasegeneintransgenictomatoescausesdwarfismbyredirectingmetabolitesfromthegibberellinpathway.PlantJournal8:693-70113.GiegeP,SweetloveLJeta(2003)IdentificationofmitochondrialproteinicomplexesinArabidopsisusingtwo-dimensionalblue-nativepolyacrylamidegelelectrophoresis.PlantMolBiolRep21:133-14414.GiIJbertoL，PerrottaGetal(2004)Manipulationofthebluelightphotoreceptorcryptochrome2intomatoaffectsvegetativedevelopment,floweringtime,andfruitantioxidantcontent.PlantPhysiol137:199-20815.GiovannoniJJ，DellaPennaDetal(1989)Expressionofachimericpolygalacaturonasegeneintransgenicrin(Ripeninginhibitor)tomatofruitresultsinpolyuronidedegradationbutnotfruitsoftening.PlantCell1:53-6316.GiulianoG，AquilaniRetal(2000)Metabolicengineeringofplantcarotenoids.TrendsinPlantSci5:405-40717.GruszeckiWI，StrzalkaK(2005)Carotenoidsasmodulatorsoflipidmembranephysicalproerties.BiochimBiophysActa1740:108-11518.HirschbergJ(2001)Carotenoidbiosynthesisinfloweringplants.CurrOpPlanBiol4:210-21819.KalioraAC，DedoussisGVZetal(2005)Dietaryantioxidantsmpreventingatherogenesis.Atherosclerosis11:1-1720.LevinI,FrankelPetal(2003)thetomatofiflrA;greewmutationisanovelallelofthetomatohomologofthe￡>￡五770^7^1>7gene.TheorApplGenet106:454-46021.LiuY誦S，GurAetal(2003)Thereismoretotomatofruitcolourthancandidatecarotenoidgenes.PlantBiotechnologyJournal(2003)1:195-20722.LiuY,RoofSetal(2004)Manipulationoflightsignaltransductionasameansofmodifyingfruitnutritionalqualityintomato.ProcNatAcadSciUSA101:9897-990223.LiimmenP(1998)ComplexIinhibitosasinsecticidesandacaricides.BiochimBiophysActa1364:287-29624.MackenzieS,McintoshL(1999)Higherplantmitochondria.PlantCell11:571-58525.MehtaRA,CassolTetal(2002)Engineeredpolyamineaccumulationintomatoenhancesphytonutrentcontent,juicequality,andvinelife.NatureBiotech20:613-ppppppppp26.MuirSR,CollinsGJ(2001)Overexpressionofpetuniachalconeisomeraseintomatoresultsinfruitcontainingincreasedlevelsofflavonols.NatureBiotech19:470-47427.NguyenML,SchwartzSJ(1999)Lycopene:Chemicalandbiologicalproperties.Foodtechnol53:38-45.28.ReynardGB(1956)OriginofWebbSpecial(BlackQueen)intomato.R印TomatoGenetCoop40:44-6429.RomerS，F(xiàn)raserPDetal(2000)ElevationoftheprovitaminAcontentoftransgenictomatoplants.NatureBiotech18:666-66930.RomerS，F(xiàn)raserPD(2005)recentadvancesincarotenoidbiosynthesis,regulationandmanipulation.Planta221:305-30831.RosatiC,AquilaniRetal.(2000)Metabolicengineeringofbeta-caroteneandlycopenecontentintomatofruit.PlantJournal24:413-41932.WashamC(2005)Anounceofpreventionftomatonoftomatoes.EnvironmentalHealthPerspectives113:A178-A18133.YeX,Al-BabiliSetal(2000)EngineeringtheprovitaminA(B-carotene)biosyntheticpathwayinto(carotenoid-free)riceendosperm.Science287:303-30534.Geifmanetal(2005)CleartomatoconcentrateasatasteenhancerUSPatent6,890,57435.Zelkhaetal(2004)CarotenoidExtractionProcessUSPatent6,797,權(quán)利要求1.一種增強(qiáng)植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、果實(shí)、根或植物其它部分中的類(lèi)胡蘿卜素和其它類(lèi)異戊二烯，優(yōu)選番茄紅素和/或β-胡蘿卜素的含量，和/或增加植物的高度的方法，所述方法包括a.損傷植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、果實(shí)、根或植物其它部分中的線粒體功能，優(yōu)選損傷線粒體復(fù)合物I、II、III和/或IV，更優(yōu)選損傷線粒體復(fù)合物I。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述損傷是利用所述植物細(xì)胞線粒體復(fù)合物I的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分，優(yōu)選利用作為未編輯的編碼序列的翻譯產(chǎn)物的線粒體復(fù)合物I的蛋白質(zhì)組分來(lái)進(jìn)行。3.根據(jù)權(quán)利要求l-2任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述損傷是通過(guò)用核酸構(gòu)建體(優(yōu)選DNA構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞，或通過(guò)用核酸構(gòu)建體經(jīng)由農(nóng)桿菌種介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞，或通過(guò)利用合適植物病毒(例如煙草花葉病毒)的病毒轉(zhuǎn)染，或通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行。4.根據(jù)權(quán)利要求2-3任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體(優(yōu)選所述DNA構(gòu)建體)或所述農(nóng)桿菌包含，優(yōu)選二元載體中的編碼所述線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的核酸。5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述線粒體復(fù)合物I的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分是來(lái)自不同于所述植物細(xì)胞的另一植物種的功能障礙性蛋白質(zhì)或是與所述植物細(xì)胞相同的植物種的功能障礙性蛋白質(zhì)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述線粒體復(fù)合物I的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分是選自如下的功能障礙性蛋白質(zhì)NAD1、2、3、4、札、5、6、7、9、核線粒體蛋白76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda和?；d體蛋白。7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中編碼所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的所述核酸選自SEQIDN0:1、2、3。8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體(優(yōu)選所述DNA構(gòu)建體)或所述農(nóng)桿菌(優(yōu)選所述農(nóng)桿菌二元載體)另外包含編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸，該核酸有效連接至編碼所述線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的所述核酸上。9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體(優(yōu)選所述DM構(gòu)建體)或所述農(nóng)桿菌，優(yōu)選所述農(nóng)桿菌二元載體，另外包含啟動(dòng)子和終止子，并且所述啟動(dòng)子和終止子有效連接至編碼所述線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的所述核酸上。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體(優(yōu)選所述DNA構(gòu)建體)或所述農(nóng)桿菌(優(yōu)選所述農(nóng)桿菌二元載體)包含根據(jù)權(quán)利要求9的所述啟動(dòng)子和所述終止子、根據(jù)權(quán)利要求8的編碼所述線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的所述核酸和根據(jù)權(quán)利要求4的編碼所述線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的所述核酸，它們?nèi)康靡杂行нB接。11.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述損傷通過(guò)突變所述植物細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，所述突變是關(guān)于所述植物細(xì)胞中所述線粒體復(fù)合物I的至少一個(gè)組分。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述突變是通過(guò)利用施加至至少一個(gè)植物細(xì)胞，優(yōu)選相同植物的多個(gè)植物細(xì)胞的化學(xué)和/或物理誘變劑隨機(jī)突變所述植物細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，所述的化學(xué)誘變劑優(yōu)選選自甲基磺酸乙酯，而所述物理誘變劑選自快中子、X射線、Y射線和其它誘變射線。13.根據(jù)權(quán)利要求11-12任意一項(xiàng)的方法，所述方法在突變后，另外包括額外的篩選步驟，篩選是針對(duì)所述植物細(xì)胞或多個(gè)植物細(xì)胞中的線粒體復(fù)合物I的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分或其它經(jīng)損傷的線粒體功能。14.根據(jù)權(quán)利要求l-2任意一項(xiàng)的方法，其中所述損傷是通過(guò)施用所述植物細(xì)胞的線粒體功能的化學(xué)抑制劑，優(yōu)選線粒體復(fù)合物I的化學(xué)抑制劑至所述植物細(xì)胞、植物、愈傷組織、組織、所述植物的部分、所述植物全部、果實(shí)、根和/或其它植物器官。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述化學(xué)抑制劑選自魚(yú)藤酮、抗霉素A、乙氧氟草醚、堇菜黃質(zhì)、殺粉蝶菌素、殺粉蝶霉素A、吡唑、峻螨酮、喹唑啉、聚乙酸、thiangazole和抗螨峻。16.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述損傷是所述線粒體復(fù)合物I的抑制。17.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述方法另外包括栽培已經(jīng)經(jīng)受了前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法的所述植物細(xì)胞、植物部分、組織、種子或器官，以產(chǎn)生植物愈傷組織、組織、植物、根和/或果實(shí)的步驟。18.通過(guò)根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法產(chǎn)生植物細(xì)胞、植物愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)，其源自植物起源，所述的植物起源選自茄科種，包括番茄、胡椒、辣椒、馬鈴薯、碧冬茄和/或煙草。20.根據(jù)權(quán)利要求18-19任意一項(xiàng)所迷的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)，其中類(lèi)胡蘿卜素(優(yōu)選番茄紅素)的量增強(qiáng)至每100g鮮重的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根和/或果實(shí)>10mg，優(yōu)選>15mg，甚至更優(yōu)選>16mg并且最優(yōu)選>20mg。21.根據(jù)權(quán)利要求18-20任意一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物或果實(shí)，其中類(lèi)胡蘿卜素(優(yōu)選番茄紅素)的量相對(duì)于沒(méi)有經(jīng)歷根據(jù)權(quán)利要求1-17任意一項(xiàng)所述的方法的植物細(xì)胞/愈傷組織/組織/植物/根或果實(shí)，增強(qiáng)了至少2倍，優(yōu)選3倍。22.獲得類(lèi)胡羅卜素，優(yōu)選番茄紅素和/或p-胡羅卜素的方法，所述方法包括a.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求18-21任意一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)，b.從所述植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實(shí)純化類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選番茄紅素和/或p-胡蘿卜素，優(yōu)選通過(guò)溶劑萃取和純化或通過(guò)超臨界二氧化碳萃取純化。23.核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼線粒體復(fù)合物I的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分的核酸。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸構(gòu)建體，其中線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分選自NAD1、2、3、4、札、5、6、7和9或所述復(fù)合物的其它蛋白質(zhì)性質(zhì)的組分。25.根據(jù)權(quán)利要求23-24任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分來(lái)自選自番茄、馬鈴薯、煙草、稻、玉米、碧冬茄、擬南芥屬和/或蓮屬、苜蓿屬、小麥和/或高粱屬的物種。26.根據(jù)權(quán)利要求23-25任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中線粒體復(fù)合物I的所述經(jīng)修飾蛋白質(zhì)組分具有選自SEQIDNO:4、5和6的序列。27.根據(jù)權(quán)利要求23-26任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體的用途，其用于增強(qiáng)植物細(xì)胞、植物、愈傷組織、組織、果實(shí)、根或所述植物的其它部分中的類(lèi)胡蘿卜素和其它類(lèi)異戊二烯的含量，優(yōu)選番茄紅素和/或P-胡蘿卜素的含量，和/或用于增加植物的高度。全文摘要本發(fā)明涉及增強(qiáng)植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、果實(shí)、根或植物的其它部分中類(lèi)胡蘿卜素和其它類(lèi)異戊二烯(優(yōu)選番茄紅素和β-胡蘿卜素)的含量，和/或涉及增加植物的高度的方法，涉及由這種方法產(chǎn)生的植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、根或果實(shí)，涉及獲得類(lèi)胡蘿卜素(優(yōu)選番茄紅素和β-胡蘿卜素)的方法，涉及核酸構(gòu)建體以及涉及這種核酸構(gòu)建體的使用。文檔編號(hào)C12N15/53GK101360828SQ200580052508公開(kāi)日2009年2月4日申請(qǐng)日期2005年12月23日優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日發(fā)明者H·J·巴達(dá)馬拉納哈里,M·P·巴比塔,S·文卡塔拉曼,V·M·V·南迪,V·M·帕特爾申請(qǐng)人:阿維沙基因有限公司