專(zhuān)利名稱：一種檢測(cè)和鑒定分枝桿菌菌種的方法及其專(zhuān)用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)和鑒定分枝桿菌菌種的方法及其專(zhuān)用試劑盒。
背景技術(shù)：
在微生物分類(lèi)中，分枝桿菌屬于原核生物界，厚壁菌門(mén)，裂殖菌綱，放線菌目，分枝桿菌科，分枝桿菌屬。分枝桿菌屬內(nèi)菌種繁多，Bergey’s manual of systemativebacteridogy(伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè))所確認(rèn)的分枝桿菌有54種。分枝桿菌屬內(nèi)除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌)和麻風(fēng)分枝桿菌外，其它菌種統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。對(duì)人類(lèi)致病的NTM有20余種，其中慢生長(zhǎng)分枝桿菌包括堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、施氏分枝桿菌，還有過(guò)去通常認(rèn)為非致病性的戈登分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、土地分枝桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌也可見(jiàn)病例報(bào)道；快生長(zhǎng)分枝桿菌包括偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌，甚至過(guò)去認(rèn)為的腐物寄生菌，如恥垢分支桿菌現(xiàn)已報(bào)導(dǎo)病例不下數(shù)10例，且偶有AIDS播散性感染，微黃分枝桿菌也偶爾可引起肺部和關(guān)節(jié)感染。近年來(lái)，在世界范圍內(nèi)由結(jié)核分枝桿菌(MTB)及NTM引起的結(jié)核病及非結(jié)核分枝桿菌病發(fā)病率明顯升高。
目前，結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、鑒定方法有1、涂片染色鏡檢見(jiàn)到抗酸桿菌，報(bào)告抗酸染色陽(yáng)性(+～++++)，不能確定所見(jiàn)抗酸分枝桿菌為MTB還是NTM，需經(jīng)分枝桿菌菌種鑒定方可確定。
2、分離培養(yǎng)采用改良羅氏等固體培養(yǎng)基，見(jiàn)到菌落生長(zhǎng)，報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(+～++++)，采用Bactec-TB960培養(yǎng)系統(tǒng)或Bact ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng)，儀器判定為陽(yáng)性后，取培養(yǎng)物涂片抗酸染色，陽(yáng)性者報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性。分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性不能確定其是MTB還是NTM，需經(jīng)分枝桿菌菌種鑒定方可確定。
3、分枝桿菌菌種鑒定(1)、MTB與NTM鑒別主要依據(jù)PNB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)試驗(yàn)，(-)判定為MTB，(+)判定為NTM。
(2)、分枝桿菌菌種鑒定依掘生長(zhǎng)特性，多種鑒別培養(yǎng)基上生長(zhǎng)試驗(yàn)和多種生化反應(yīng)等近20項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)綜合分析判定結(jié)果。
該分枝桿菌菌種鑒定方法具有以下缺點(diǎn)a、鑒定方法繁雜，需進(jìn)行近20項(xiàng)試驗(yàn)。b、鑒定試驗(yàn)所需細(xì)菌培養(yǎng)物量較大，通常在取得初代分離培養(yǎng)物后需傳代培養(yǎng)，用傳代培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)。初代分離培養(yǎng)物→傳代培養(yǎng)物→鑒定試驗(yàn)→報(bào)告結(jié)果，快速生長(zhǎng)分枝桿菌需3～4周，緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌需8～12周。c、結(jié)果準(zhǔn)確度差同一菌種不同菌株間，伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)報(bào)導(dǎo)約15％生物學(xué)表型存在異質(zhì)性，使菌種難以明確鑒定或鑒定錯(cuò)誤。
用于分枝桿菌基因檢測(cè)及鑒定的商品化試劑盒主要分為以下二類(lèi)
1、用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)及鑒定的試劑盒(李國(guó)利，結(jié)核病分子生物學(xué)檢測(cè)方法的理論與實(shí)踐，見(jiàn)肖和平主編.結(jié)核病防治新進(jìn)展.上海復(fù)旦大學(xué)出版社，2004.128-135；衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心.附錄3有關(guān)PCR試劑、儀器廠家試劑、儀器說(shuō)明.臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員培訓(xùn)班資料匯編104-106，109-111，118-120)(1)、德國(guó)Roche公司生產(chǎn)的Amplicor試劑盒(Amplicor mycobacteriumtuberculosis)以16S rRNA基因(16S rDNA)為靶基因設(shè)計(jì)分枝桿菌屬特異性引物擴(kuò)增分枝桿菌，以擴(kuò)增片段內(nèi)部結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異序列設(shè)計(jì)雜交探針，采用PCR-微孔板雜交法。
(2)、國(guó)內(nèi)多家公司生產(chǎn)熒光PCR試劑盒以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異的IS6110為靶基因序列設(shè)計(jì)引物及探針，分別采用Taqman技術(shù)和分子信標(biāo)(molecular beacon)技術(shù)。
上述兩類(lèi)試劑盒用于檢測(cè)鑒定臨床樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，不能檢出、鑒定NTM。熒光PCR需熒光PCR儀，價(jià)格較貴。
2、用于分枝桿菌菌種鑒定的試劑盒(Tortoli E，Nanetti A，Piersimoni C，et al.Performance assessment of new multiplex probe assay for identification ofmycobacteria.J clin Microbiol，2001，391079-1084；Miller N，Infante S and ClearyT.Evaluation of the LipA MYCOBACTERIA assay for identification of mycobacterialspecies from BACTEC 12 B bottles.J Clin Microbiol，2000，381415-1919)(1)、美國(guó)gen-probe公司生產(chǎn)的Accuprobe Mycobaterium試劑盒以16S rRNA為靶序列，設(shè)計(jì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合群、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和戈登分枝桿菌6種吖啶酯(acridinium ester，AE)標(biāo)記的cDNA探針，采用液相雜交技術(shù)-雜交保護(hù)試驗(yàn)(Hybridization protect assay，HPA)。HPA的基本原理及方法為AE是一種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，AE標(biāo)記的群或種特異性探針在液相中與經(jīng)處理后待測(cè)分枝桿菌釋放的rRNA進(jìn)行雜交；加入選擇試劑，與靶序列互補(bǔ)雜交的探針與未雜交的游離探針在選擇試劑作用下水解速度相差了百萬(wàn)倍，游離探針迅速水解破壞，失去化學(xué)發(fā)光特性，而雜交后的探針受到保護(hù)，在一定時(shí)間內(nèi)不被水解破壞，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)其相對(duì)發(fā)光值判定結(jié)果。
該試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于方法簡(jiǎn)便、快速，2小時(shí)內(nèi)報(bào)告結(jié)果。其局限性在于只適用于對(duì)分枝桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定；試劑盒僅包括6種探針，只能鑒定試劑盒所包括探針的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合群、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和戈登分枝桿菌菌種，臨床可見(jiàn)的其他致病性分枝桿菌菌種必須通過(guò)其他方法鑒定；試驗(yàn)需化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀以及試劑盒售價(jià)較貴。
(2)、比利時(shí)Innogenetics公司生產(chǎn)的LipA(Line Probe assay)Mycobacteria試劑盒以PCR擴(kuò)增和反向核酸分子雜交為原理，采用16S-23S rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)為靶基因序列設(shè)計(jì)了14條分枝桿菌寡核苷酸探針，以橫向線狀縱向水平排列固定于硝酸纖維素膜上，制備LipA測(cè)試條，與用生物素標(biāo)記的分枝桿菌屬引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物雜交，再與堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素結(jié)合，顯色，根據(jù)與相應(yīng)探針雜交線條判定分枝桿菌菌種或復(fù)合群。
該試劑盒具有方法簡(jiǎn)便、快速，3小時(shí)～4小時(shí)報(bào)告結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，但僅適用于對(duì)分枝桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，且由于針對(duì)某一菌種有的使用了2～3條探針，因此14條探針僅能對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、戈登分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌和龜分枝桿菌，共8種分枝桿菌進(jìn)行鑒定。8種以外的分枝桿菌需通過(guò)其他方法鑒定至種。
分枝桿菌菌種鑒定在NTM病與結(jié)核病的診斷、鑒別診斷、治療和流行病學(xué)調(diào)查等方面具有重要意義1、診斷涂片抗酸染色鏡檢和分枝桿菌分離培養(yǎng)是結(jié)核病的主要確診方法，但由于方法學(xué)的限制，即使是涂片或/和培養(yǎng)陽(yáng)性也難以確定其是MTB還是NTM，因此，需進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，使結(jié)核病的診斷更趨于科學(xué)。
2、鑒別診斷NTM病與結(jié)核病臨床癥狀及肺部X線表現(xiàn)極為相似，難以鑒別，必須依靠菌種鑒定結(jié)果，才能明確診斷。
3、治療NTM與MTB對(duì)藥物敏感性不同，多數(shù)NTM對(duì)抗結(jié)核藥物天然耐藥，不同NTM菌種對(duì)藥物敏感性亦不同，NTM病與結(jié)核病治療方案應(yīng)有所不同。
4、流行病學(xué)在流行病學(xué)調(diào)查上有重要價(jià)值。
目前國(guó)內(nèi)外研究及使用較多的分枝桿菌檢測(cè)、鑒定的靶基因主要是插入序列(insertion sequence，IS)，蛋白質(zhì)編碼基因序列，16S rRNA基因(16S rDNA)序列和16S-23S rRNA基因(16S-23S rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列。這些基因序列大致可分為兩類(lèi)一類(lèi)是僅存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種高度保守的特異性序列，如IS6110，IS1081，蛋白質(zhì)編碼基因MTP40，MPB70和MPB64，可選擇用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的檢測(cè)和鑒定，其中IS6110是檢測(cè)、鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群試劑盒最常采用的基因序列。另一類(lèi)是分枝桿菌屬菌種共有的既高度保守又有種間多態(tài)性的序列，如分枝桿菌屬菌種共有的蛋白質(zhì)編碼基因序列(65KD蛋白、32KD蛋白、dnaj蛋白和RNA聚合酶β亞單位編碼基因)，16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列，可選擇用于分枝桿菌菌種的檢測(cè)和鑒定。
16S rDNA是在基因水平上細(xì)菌分類(lèi)鑒定的傳統(tǒng)的靶基因序列?，F(xiàn)已完成50余種分枝桿菌菌種16S rDNA的全部或部份核苷酸測(cè)序，通過(guò)分析比較發(fā)現(xiàn)，它們既含有分枝桿菌屬特異核苷酸序列，又含有種水平上的特異可變區(qū)，分枝桿菌16S rDNA含有兩個(gè)可變區(qū)，既位于126～267位核苷酸的A可變區(qū)和位于430～500位核苷酸的B可變區(qū)。A可變區(qū)核苷酸種間變異高于B可變區(qū)，分枝桿菌菌種鑒定多在A可變區(qū)水平上進(jìn)行。但某些臨床上重要的致病性NTM，如堪薩斯分枝桿菌、胃分支桿菌、瘰疬分枝桿菌和猿猴分枝桿菌之間，蘇加分枝桿菌和馬爾摩分枝桿菌之間，海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌之間，龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌之間在此水平上序列完全相同，只能將其鑒定至復(fù)合群水平，不能鑒定至種。
近年來(lái)，16S-23S rDNA ITS序列作為一種新的在基因水平上細(xì)菌分類(lèi)鑒定的靶基因序列為人們所采用。對(duì)50余種分枝桿菌16S-23S rDNA ITS測(cè)序結(jié)果分析表明，分枝桿菌16S-23S rDNA ITS序列依菌種不同其堿基排列順序及長(zhǎng)度均變異較大，核苷酸序列長(zhǎng)度從200多bp～400多bp。在整個(gè)核苷酸序列內(nèi)含2個(gè)分枝桿菌屬保守片段和數(shù)個(gè)高度可變的種特異序列，其種間多態(tài)性明顯高于16S rDNA，與16S rDNA相比較，更適于菌種的鑒定。除海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌間序列完全一致不能鑒別外，能將堪薩斯分枝桿菌、胃分支桿菌、瘰疬分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌鑒定至種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)及鑒定分枝桿菌菌種的方法及其專(zhuān)用試劑盒。
本發(fā)明所提供的分枝桿菌菌種檢測(cè)及鑒定試劑盒，包括分枝桿菌屬特異引物和分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片；所述分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片包括分枝桿菌菌種檢測(cè)探針；所述分枝桿菌菌種檢測(cè)探針由分枝桿菌屬特異探針，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針和以下分枝桿菌種特異探針組成堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍-施氏分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-迪氏-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌特異探針；所述分枝桿菌屬特異引物為具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的兩個(gè)寡核苷酸；所述分枝桿菌屬特異探針是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；所述猿猴分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；所述瘰疬分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；所述戈登分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蘇加分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；所述鳥(niǎo)分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胞內(nèi)分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；所述土地分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述不產(chǎn)色分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胃分支桿菌特異探針是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；所述次要分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；所述亞洲分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；所述施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；所述偶然分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；所述龜分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；所述膿腫分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；所述恥垢分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；所述草分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淡黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淺黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；所述迪氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；所述母牛分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；所述新金色分枝桿菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
上述分枝桿菌屬特異引物、分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片、分枝桿菌菌種檢測(cè)探針均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明所提供的利用上述試劑盒檢測(cè)分枝桿菌的方法，是以待測(cè)分枝桿菌樣品的基因組DNA為模板，利用所述分枝桿菌屬特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與所述分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)確定待測(cè)分枝桿菌的種。
所述待測(cè)分枝桿菌樣品為涂片抗酸染色陽(yáng)性的分枝桿菌培養(yǎng)物或涂片抗酸染色陽(yáng)性的痰標(biāo)本。
所述雜交為導(dǎo)流雜交。
導(dǎo)流雜交技術(shù)使傳統(tǒng)的核酸分子雜交法二維平面分子間相互作用，提升到三維平面分子間相互作用，使傳統(tǒng)核酸分子雜交過(guò)程中分子被動(dòng)滲入膜孔相互作用通過(guò)導(dǎo)流變?yōu)橹鲃?dòng)相互作用，提高了核酸分子間雜交效率，縮短了各操作步驟時(shí)間，操作簡(jiǎn)便且節(jié)約試劑，降低試驗(yàn)成本。
本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1、設(shè)計(jì)的1對(duì)分枝桿菌屬引物，經(jīng)研究試驗(yàn)?zāi)軘U(kuò)增所試51種分枝桿菌菌種。
2、經(jīng)研究試驗(yàn)篩選，選擇分枝桿菌屬特異探針、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針和各種NTM種特異探針27種，制備檢測(cè)芯片。根據(jù)雜交信號(hào)，對(duì)分枝桿菌進(jìn)行鑒定。該探針涵蓋了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和臨床可見(jiàn)的各種致病性NTM菌種，同時(shí)為擴(kuò)大鑒定范圍，還涵蓋了偶見(jiàn)致病性NTM菌種及自然界廣泛分布的腐物寄生NTM菌種，探針數(shù)量多。其優(yōu)勢(shì)在于(1)、用于檢測(cè)、鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群根據(jù)顯示分枝桿菌屬探針、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群探針雜交信號(hào)，檢測(cè)、鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。
(2)、用于檢測(cè)、鑒定各種NTM菌種根據(jù)顯示分枝桿菌屬探針，相應(yīng)NTM種探針雜交信號(hào)，可檢測(cè)、鑒定堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌。
(3)、用于檢測(cè)、鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與NTM菌種混合感染根據(jù)顯示分枝桿菌屬探針、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群探針、相應(yīng)NTM種探針雜交信號(hào)，能檢測(cè)、鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與NTM菌種混合感染。
(4)、用于檢測(cè)、鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與NTM當(dāng)檢測(cè)、鑒定膜芯片探針涵蓋之外的NTM菌種時(shí)，則顯示分枝桿菌屬探針雜交信號(hào)，能將其鑒定為NTM，但不能鑒定至種水平。
3、經(jīng)研究試驗(yàn)，建立了待測(cè)標(biāo)本DNA模板制備方法-高溫裂解法。
(1)、固體培養(yǎng)基上分枝桿菌培養(yǎng)物取培養(yǎng)物少許加裂解液，煮沸、離心取上清用于PCR擴(kuò)增。
(2)、液體培養(yǎng)基內(nèi)分枝桿菌培養(yǎng)物取培養(yǎng)液離心后，沉淀加裂解液煮沸、離心取上清用于PCR擴(kuò)增。
(3)、病人痰標(biāo)本液化處理痰標(biāo)本，洗滌后沉淀加裂解液煮沸、離心取上清用于PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明的試劑盒不僅能用于分枝桿菌培養(yǎng)物的鑒定，而且能從病人痰標(biāo)本中直接檢測(cè)、鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及NTM菌種。
4、采用PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù)，經(jīng)研究試驗(yàn)優(yōu)化、確定最佳PCR擴(kuò)增及導(dǎo)流雜交檢測(cè)條件，檢測(cè)分枝桿菌敏感性達(dá)102～103/ml菌細(xì)胞懸液，寡核苷酸探針特異性強(qiáng)，僅與相應(yīng)分枝桿菌雜交，分枝桿菌菌種鑒定準(zhǔn)確度高。
5、與傳統(tǒng)膜核酸分子雜交技術(shù)相比，導(dǎo)流雜交技術(shù)操作更為簡(jiǎn)便、快速，雜交過(guò)程1～1.5小時(shí)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程從PCR擴(kuò)增到雜交完成僅需約3.5小時(shí)～4小時(shí)。且節(jié)約試劑，降低試驗(yàn)成本。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以16S-23S rDNA ITS為靶基因序列，采用分枝桿菌屬共有的靶基因序列設(shè)計(jì)分枝桿菌屬特異引物及屬特異寡核苷酸探針，用所設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增含有菌種變異區(qū)的基因片段。以菌種變異區(qū)設(shè)計(jì)一系列種或群特異寡核苷酸探針，按一定順序排列固定于尼龍膜載體上，制備檢測(cè)芯片(膜芯片)。本發(fā)明采用一種新型的核酸分子雜交技術(shù)方法，即PCR-導(dǎo)流雜交(flow-through hybridization)法，雜交檢測(cè)過(guò)程采用導(dǎo)流雜交儀，雜交過(guò)程可隨時(shí)根據(jù)需要調(diào)節(jié)作用溫度，其基本原理及操作方法為
1、在凱普導(dǎo)流雜交儀(HybriMax)內(nèi)安裝入膜芯片(15孔模具)；2、在檢測(cè)孔內(nèi)加入0.8ml雜交液作用2～3min，導(dǎo)流，預(yù)雜交；3、加入待測(cè)含生物素標(biāo)記變性單鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交液0.5ml作用5～10min，導(dǎo)流，單鏈靶核酸分子通過(guò)膜孔時(shí)，與固定于膜孔內(nèi)相應(yīng)寡核苷酸探針雜交結(jié)合，形成探針生物素標(biāo)記靶核酸分子復(fù)合物；4、加入洗滌劑0.8ml，導(dǎo)流，未雜交結(jié)合分子穿過(guò)膜被洗滌清除，洗滌三次；5、加入阻斷劑0.5ml，導(dǎo)流，再加入阻斷劑0.5ml作用3～5min，導(dǎo)流，阻斷膜芯片上空白點(diǎn)；6、加鏈親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物(SA-AP)0.5ml作用3min，導(dǎo)流，SA-AP分子通過(guò)膜孔時(shí)，與探針-生物素標(biāo)記靶核酸分子復(fù)合物結(jié)合；7、加入洗滌劑0.8ml，導(dǎo)流，未結(jié)合分子穿過(guò)膜被洗滌清除，洗滌四次；8、加入酶底物(NBT/BCIP溶液)0.5ml作用5～10min，導(dǎo)流，底物顯色；9、加入洗滌劑0.8ml，導(dǎo)流，終止顯色反應(yīng)，洗滌二次；10、取出膜芯片，用蒸餾水漂洗后，自然干燥。根據(jù)與相應(yīng)屬、復(fù)合群、種特異探針雜交信號(hào)，鑒定分枝桿菌。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、分枝桿菌菌種檢測(cè)及鑒定試劑盒本試劑盒利用PCR技術(shù)和導(dǎo)流雜交技術(shù)原理，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固定分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和各種NTM菌種特異寡核苷酸探針的低密度膜芯片雜交，對(duì)分枝桿菌培養(yǎng)物，包括固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定；也可直接從涂片抗酸染色(+)痰標(biāo)本中檢測(cè)并鑒定分枝桿菌菌種。
一、試劑盒組成本發(fā)明的分枝桿菌菌種檢測(cè)及鑒定試劑盒由下述PCR試劑和導(dǎo)流雜交試劑組成，具體成分如下(一)PCR試劑

其中，裂解液由以下成分組成20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5％(V/V)TritonX-100，0.5％(V/V)NP-40溶液。
10倍PCR混合液由以下成分組成100mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，500mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1mmol/L EGTA-Na2，0.2％(0.2g/100ml)BSA，1％(V/V)TritonX-100，各2mmol/L dATP、dUTP、dGTP、dCTP，各2μmol/L引物I、引物II，1.5U Taq DNA聚合酶/3μl 10倍PCR混合液，0.5U UNG酶/3ul 10倍PCR混合液。
其中，分枝桿菌屬特異引物I序列5’-ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC-3’5’端生物素標(biāo)記；分枝桿菌屬特異引物II序列5’-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3’陽(yáng)性對(duì)照品滅活的106/ml結(jié)核分支桿菌菌細(xì)胞懸液。
陰性對(duì)照品滅菌去離子水。
上述PCR試劑在-20℃保存。
(二)導(dǎo)流雜交試劑

其中，溶液10.3mol/L NaCl，0.03mol/L檸檬酸三鈉，0.1％(0.g/100ml)SDS，用NaOH調(diào)pH至7.0。
溶液2阻斷劑(Surmodics公司產(chǎn)品)。
溶液30.1mol/L Tris-HCl(pH7.5)，0.15mol/L NaCl，0.1％(V/V)Tween-20。
溶液40.1mol/L Tris-HCl(pH9.5)，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。
酶標(biāo)記液由以下成分組成AP穩(wěn)定劑(Surmodics公司產(chǎn)品)13000倍稀釋鏈親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物(streptavidin-Alkaline Phosphate Conjugate，SA-AP(Amershum公司產(chǎn)品))。
NBT溶液由以下成分組成75mg/ml NBT溶液，70％二甲基甲酰胺溶液配制。
BCIP溶液由以下成分組成50mg/ml BCIP溶液，二甲基甲酰胺溶液配制。
該試劑盒包括膜芯片A，膜芯片A′，膜芯片B，膜芯片B′，膜芯片C和膜芯片C′中的至少一種膜芯片A的分枝桿菌菌種檢測(cè)探針是表1中的探針編號(hào)為1a、2a、3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29a的29個(gè)寡核苷酸探針。
膜芯片A′的分枝桿菌菌種檢測(cè)探針是表1中的探針編號(hào)為1a′、2a′、3a、4a′、5a′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11a′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20a′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29a′的29個(gè)寡核苷酸探針。
膜芯片B′的分枝桿菌菌種檢測(cè)探針是表1中的探針編號(hào)為1a′、2b′、3b′、4a′、5b′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11b′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20b′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29b′的29個(gè)寡核苷酸探針。
膜芯片B的分枝桿菌菌種檢測(cè)探針是表1中的探針編號(hào)為1a、2b、3b、4a、5b、6a、7a、8a、9a、10a、11b、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20b、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29b的29個(gè)寡核苷酸探針。
膜芯片C的分枝桿菌菌種檢測(cè)探針是表1中的探針編號(hào)為1a、2a、3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29c的29個(gè)寡核苷酸探針。
膜芯片C′的分枝桿菌菌種檢測(cè)探針是表1中的探針編號(hào)為1a′、2b′、3b′、4a′、5b′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11b′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20 b′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29c′的29個(gè)寡核苷酸探針。
表1.分枝桿菌菌種檢測(cè)探針



膜芯片按照下述方法制備取5’端氨基修飾寡核苷酸探針定量溶解于NaHCO3(PH8.4)溶液內(nèi)，分別取5～l0pmol按順序排列點(diǎn)于乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)活化處理過(guò)BiodyneC尼龍膜(Pall公司產(chǎn)品)上，待干燥用NaOH溶液浸泡后，蒸餾水洗滌，干燥后封存，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 上述導(dǎo)流雜交試劑在4℃保存。
二、適用儀器各種型號(hào)的PCR擴(kuò)增儀、Hybrimax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠支架板和梳子。
三、標(biāo)本要求(1)改良羅氏等固體培養(yǎng)基培養(yǎng)物涂片抗酸染色(+)的分枝桿菌培養(yǎng)物。
(2)Bactec-T960 MGIT液體培養(yǎng)瓶或BacT ALERT 3D結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)瓶陽(yáng)性培養(yǎng)物涂片抗酸染色(+)的分枝桿菌培養(yǎng)物。
(3)涂片抗酸染色(+)痰標(biāo)本3～5ml，如當(dāng)日不處理，置-20℃保存，保存期1個(gè)月。
四、操作方法(一)、樣品處理1、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)物處理取固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)分枝桿菌物少許至1.5ml離心管內(nèi)，加入裂解液50μl混勻，95℃～100℃加熱15～20min，12000rpm離心5min，取上清液為PCR反應(yīng)模板。
2、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物處理取液體培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)陽(yáng)性培養(yǎng)物1～1.5ml至1.5ml離心管內(nèi)，12000rpm離心10min，盡量除盡上清液，沉淀加入裂解液50μl混勻，95℃～100℃加熱15～20min，12000rpm離心5min，取上清液為PCR反應(yīng)模板。
3、痰標(biāo)本處理(1)、視痰液粘稠度向痰液中加入等量至2倍量液化劑，振蕩后室溫放置30～60min，中間振蕩數(shù)次，使之充分液化至清亮。液化劑自備，配制方法如下4％NaOH溶液及2.94％枸櫞酸三鈉溶液高壓滅菌后備用。使用前根據(jù)用量取4％NaOH溶液及2.94％枸櫞酸三鈉溶液等量混后，加入N-乙酰-L半胱氨酸終濃度5mg/ml，24h內(nèi)使用。
(2)、取液化后痰液1ml至1.5ml離心管內(nèi)，12000rpm離心10min，小心傾去上清液。
(3)、沉淀中加入1ml滅菌生理鹽水，振蕩混勻，12000rpm離心10min，小心傾去上清液。
(4)、重復(fù)步驟(3)，離心后用吸頭盡量吸盡全部上清液。
(5)、沉淀中加入50μl裂解液，充分振蕩混勻，95℃～100℃加熱15min，12000rpm離心5min，取上清液為PCR反應(yīng)模板。
4、陽(yáng)性和陰性對(duì)照品處理取陽(yáng)性和陰性對(duì)照品，待融化后混勻，取5μl分別加至1.5ml離心管內(nèi)，加入裂解液45μl混勻，95℃～100℃加熱15～20min，12000rpm離心5min，取上清液為PCR模板。
(二)、PCR擴(kuò)增根據(jù)樣品數(shù)取10倍PCR混合液管，每管分別加滅菌去離子水24μl混勻，加DNA模板3μl混勻，稍離心后PCR擴(kuò)增。每一批次同時(shí)擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各一份。
擴(kuò)增條件先37℃ 10min；然后94℃ 5min；再94℃ 45sec，59℃ 45sec，72℃ 45sec共35循環(huán)；最后72℃ 7min。
(三)、瓊脂糖凝膠電泳1、試劑自備。
(1)50×Tris-冰乙酸(TAE)電泳緩沖液Tris 242.38克，冰乙酸57.1ml，1M EDTA(PH8.0)50ml，加蒸餾水溶解、定容至1000ml。使用前50倍稀釋(1×TAE電泳緩沖液)。
(2)10mg/ml溴化乙錠(EB)水溶液，置4℃避光保存。
(3)載樣緩沖液0.25％溴酚藍(lán)、40％蔗糖水溶液，置4℃保存。
2、方法(1)取瓊脂糖2克，加1×TAE緩沖液100ml，置微波爐內(nèi)加熱或水浴煮沸溶解。加入10mg/ml EB水溶液10μl(終濃度5μg/ml)，輕輕混勻。
(2)用膠布條將電泳支持板兩端封住，放上梳子，梳子底邊應(yīng)離開(kāi)支持板表面1mm左右，待凝膠溶液冷卻至60℃左右，倒入，厚度約2～3mm。待凝膠完全凝固后，小心取出梳子，去掉膠布條，將其放入電泳槽內(nèi)。倒入1×TAE電泳緩沖液，沒(méi)過(guò)凝膠2～3mm。EB為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴一次性手套。
(3)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，加入載樣緩沖液1μl混勻后，加入凝膠樣品孔內(nèi)。
(4)接通電源，在5V/cm左右電壓下電泳(樣品孔位于負(fù)極端)。
(5)電泳結(jié)束后關(guān)閉電源，取出凝膠，用紫外檢測(cè)儀或凝膠成像儀觀察結(jié)果。紫外線對(duì)人體眼睛和皮膚有損害，應(yīng)使用防紫外線眼鏡和玻璃擋板防護(hù)。
3、結(jié)果陽(yáng)性和陰性對(duì)照品應(yīng)分別(+)和(-)。臨床樣品(+)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行導(dǎo)流雜交。
(四)、導(dǎo)流雜交每個(gè)檢測(cè)樣品占用分隔室一孔，以下試劑用量為單孔用量。
1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
(1)將雜交檢測(cè)試劑平衡至室溫。
(2)溶液1在使用前預(yù)熱至49℃。
(3)檢測(cè)樣品準(zhǔn)備PCR產(chǎn)物98℃加熱變性5min立即至冰浴至少2～5min，在0.5ml溶液1內(nèi)加入15～20μl變性PCR產(chǎn)物。
(4)NBT/BCIP顯色工作液配制根據(jù)用量配制NBT/BCIP顯色工作液。計(jì)算依據(jù)1ml用量1ml溶液4內(nèi)加入4.5μl NBT溶液，混勻，再加入3.5μl BCIP溶液，混勻，24h內(nèi)使用。
2、雜交儀準(zhǔn)備(1)打開(kāi)雜交儀的電源。
(2)在雜交儀后部的廢液出口安裝好廢液缸。
(3)根據(jù)控制板指示，選定[Manual Mode]，按[Enter]鍵進(jìn)入溫度設(shè)定界面，輸入溫度49℃后，按[Enter]鍵確認(rèn)并進(jìn)行升溫。
(4)用蒸餾水充滿反應(yīng)室，放置好金屬多孔板并打開(kāi)水泵，排出多孔板上面的水份后，關(guān)閉水泵。
(5)用鑷子將膜芯片放置在金屬多孔板上。
(6)將相對(duì)應(yīng)孔數(shù)的塑料薄膜放置在膜芯片上。
(7)在塑料薄膜上面放置硅膠封圈和分隔室。
(8)固定好壓扣蓋，固定時(shí)應(yīng)對(duì)準(zhǔn)反應(yīng)室尾部?jī)蓚€(gè)孔按下向前推到底。
(9)開(kāi)泵排走殘留在膜上的水份后關(guān)泵。
3、雜交(1)在雜交儀準(zhǔn)備好條件下，于49℃(±1℃)進(jìn)行雜交。
(2)在檢測(cè)孔內(nèi)加入0.8ml預(yù)熱的溶液1，蓋上蓋板孵育2～3min，開(kāi)泵排出溶液，然后關(guān)泵。
(3)在檢測(cè)孔內(nèi)加入0.5ml已準(zhǔn)備好的檢測(cè)樣品，蓋上蓋板孵育5～10min，開(kāi)泵排出溶液。
(4)在開(kāi)著泵的條件下，用預(yù)熱的溶液1洗膜3次，每次0.8ml。在第二次洗膜后，按〔ESC〕鍵進(jìn)入溫度修改界面，輸入溫度36℃后，按〔Enter〕鍵確認(rèn)。不必降至36℃就進(jìn)行第三次洗膜。
(5)在檢測(cè)孔內(nèi)加入0.5ml溶液2，開(kāi)泵排出溶液，關(guān)泵，再加入0.5ml溶液2，蓋上蓋板孵育5min，開(kāi)泵排出溶液，關(guān)泵。
(6)溫度為36℃(±1℃)時(shí)，在檢測(cè)孔內(nèi)加入0.5ml酶標(biāo)記液，蓋上蓋板孵育3～5min，開(kāi)泵排出溶液。
(7)在開(kāi)著泵的條件下，用溶液3洗膜4次，每次0.8ml。
(8)關(guān)掉水泵。
(9)在檢測(cè)孔內(nèi)加入0.5ml NBT/BCIP顯色工作液，蓋上蓋板顯色5～10min，開(kāi)泵排出溶液。
(10)在開(kāi)著泵的條件下，用溶液1洗膜2次，每次0.8ml。
(11)關(guān)掉水泵，打開(kāi)壓扣蓋，取出分隔室，用鑷子取出雜交膜置蒸餾水內(nèi)漂洗后，放在吸水紙上。
(四)、結(jié)果分析肉眼觀察，藍(lán)紫色斑點(diǎn)為陽(yáng)性雜交信號(hào)，根據(jù)雜交信號(hào)分析判定結(jié)果。
五、局限性本試劑盒用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及29種NTM菌種檢測(cè)及鑒定。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及29種NTM菌種以外的臨床極為罕見(jiàn)的分枝桿菌僅能初步鑒定為NTM，而不能鑒定至種。
六、試劑規(guī)格PCR試劑34人份/盒，導(dǎo)流雜交試劑30人份/盒。
七、保存條件PCR試劑保存于-20℃，避免多次反復(fù)凍融。導(dǎo)流雜交試劑保存于4℃。有效期8個(gè)月。
實(shí)施例2、利用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)分枝桿菌分枝桿菌及非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)參考菌株來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)和中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)。
分枝桿菌臨床分離菌株固體培養(yǎng)基培養(yǎng)物分別來(lái)自上海市肺科醫(yī)院(上海)，北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所(北京1)，北京市昌平區(qū)疾病控制中心(北京2)，深圳市疾病控制中心(深圳)，廣州市胸科醫(yī)院(廣州)，福建省南平市疾病控制中心(福建)。
液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物分別來(lái)自沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院(沈陽(yáng))，重慶市胸科醫(yī)院(重慶)和解放軍總醫(yī)院第二附屬醫(yī)院(北京3)。
痰標(biāo)本來(lái)自北京市肺科醫(yī)院(北京4)，北京1和北京3。
利用實(shí)施例1的試劑盒(包括膜芯片A，膜芯片A′，膜芯片B，膜芯片B′，膜芯片C和膜芯片C′)按照實(shí)施例1的方法，檢測(cè)表2中的51種分枝桿菌及10種非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)參考菌株，表3中的分枝桿菌臨床分離株。膜芯片A，膜芯片A′，膜芯片B，膜芯片B′，膜芯片C和膜芯片C′的檢測(cè)結(jié)果均和標(biāo)準(zhǔn)參考菌株情況相符，并且與菌株的16S-23S rDNA ITS測(cè)序鑒定結(jié)果相符。
其中膜芯片A的檢測(cè)結(jié)果如表2和表3所示表2分枝桿菌及非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)參考菌株P(guān)CR擴(kuò)增及與特異探針雜交結(jié)果



表3 分枝桿菌臨床分離株(固體培養(yǎng)基培養(yǎng)物)鑒定結(jié)果



利用實(shí)施例1的試劑盒(包括膜芯片A，膜芯片A′，膜芯片B，膜芯片B′，膜芯片C和膜芯片C′)按照實(shí)施例1的方法，檢測(cè)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物和痰標(biāo)本。膜芯片A、膜芯片A′、膜芯片B、膜芯片B′、膜芯片C和膜芯片C′的檢測(cè)結(jié)果均和菌株的16S-23S rDNA ITS測(cè)序鑒定結(jié)果相符液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物81份(沈陽(yáng))，試劑盒鑒定69份是結(jié)核分枝桿菌，12份是胞內(nèi)分枝桿菌；液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物2份(重慶)，試劑盒鑒定1份是膿腫分枝桿菌，1份是偶然分枝桿菌；液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物5份(北京3)，試劑盒鑒定1份是胞內(nèi)分枝桿菌，4份是膿腫分枝桿菌；抗酸染色陽(yáng)性痰標(biāo)本(+～++++)110份(北京1、北京3、北京4)，試劑盒鑒定102份是結(jié)核分枝桿菌，2份是胞內(nèi)分枝桿菌，2份是瘰疬分枝桿菌，4份是膿腫分枝桿菌。
序列表<160>73<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1acctcctttc taaggagcac c21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gatgctcgca accactatcc a21<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3aaacaccaca ccccaccac 19<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4ctcaaacacc acaccccacc accaa25<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5tgtgttggtg gccaactttg 20<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6gtgtgttggt ggccaacttt gttgtcatgc30
<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7cacggcctac gccccacca 19<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8acccctcacg gcctacgccc caccagttgg 30<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>9acaactctcg aacagagccc 20<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10gacaactctc gaacagagc 19<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11gggacaactc tcgaacagag cccgagtgtg30<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12catcccgaaa ccaacagaga 20<210>13<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13acaacatccc gaaaccaaca gagatgttgc 30<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14tgtctggcga ttgcctgttg20<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15gtgtctggcg attgcctgtt gttgt 25<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16cttcaaccga agtcggccg19<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>17acaccacttc aaccgaagtc ggccgagtgt30<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>18caccactcag aacgagccga 20<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>19gagggacacc actcagaacg agccgagtgt 30<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>20ggacagcacc cgagggtg 18<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>21ggggacagca cccgagggtg ttgcc 25<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>22acaacagctc tggccaagcc20<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>23tgggacaaca gctctggcca agcctgagtg 30<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>24cacacggacg gaccgagt 18<210>25<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>25actccacacg gacggaccga gtgtt 25<210>26
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>26cacacggatc gaccgagt 18<210>27<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>27actccacacg gatcgaccga gtgtt 25<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>28cggttactgc ctgctgcc 18<210>29<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>29tgccggcggt tactgcctgc tgcccaacac30<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>30tcggcccgac gccacaaca19<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>31aacacctcgg cccgacgcca caacacgccg30<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>32ggacaccacg cggactgg 18<210>33<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>33gggacaccac gcggactggc gagtg 25<210>34<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>34gttgttcgta attcctctgc acc 23<210>35<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>35gcttgttgtt gttcgtaatt cctctgcacc30<210>36<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>36ttgttgctcg taaattttct gcac 24<210>37<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>37tttgttgttg ctcgtaaatt ttctgcacca30<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>38caacactctt ggacgagtcc 20
<210>39<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>39gacaacactc ttggacgagt ccaagacaag30<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>40accacttgat gcgacggttc 20<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>41tcaacaccac ttgatgcgac ggttcgttgt30<210>42<211>18<212>DNA<213>人工序車(chē)列<220>
<223>
<400>42acggcctgca tcccacca 18<210>43<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>43ctccacacgg cctgcatccc accaa 25<210>44<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>44cggctcgact tccgccca 18<210>45<211>25<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>45cctcacggct cgacttccgc ccact 25<210>46<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>46gcaaccggtt cctcacgg 18<210>47<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>47ctacaggcaa ccggttcctc acggc 25<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>48caccaagcga gtaaccacta c 21<210>49<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>49ttcaccaagc gagtaaccac tacag 25<210>50<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>50actatccata agtcaaagac ca22<210>51<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>51
actatccata agtcaaagac cacac 25<210>52<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>52tcaccaagta gatatccact ac22<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>53ttcaccaagt agatatccac tacag 25<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>54tccccaacgg agagtgtctc 20<210>55<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>55gctcacaccc tccccaacgg agagtgtctc30<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>56ccctacctct tatagggcac 20<210>57<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>57ccgcgcaact ccctacctct tatagggcac30<210>58<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>58ttcctcaaag cagtgttccc 20<210>59<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>59gatgattcct caaagcagtg ttcccacacc30<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>60ctgatgactt cgcaccacaa 20<210>61<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>61gtctgatgac ttcgcaccac aaccccggaa30<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>62cgtccgaacc agaatcgctt 20<210>63<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>63cgtccgaacc agaatcgctt ccgggactcg30<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>64tcggccaagt ttgtcatgtg 20<210>65<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>65taccggctcg gccaagtttg tcatgtgcac30<210>66<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>66cgaatcgcct gattcaccg19<210>67<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>67ccaacgaatc gcctgattca ccgaa 25<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>68gaatcgacca aggtcaccga 20<210>69<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>69aacgaatcga ccaaggtcac cgaac 25<210>70<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>70ttctccgtag agcgaaggtc 20<210>71
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>71ccttctccgt agagcgaagg tcccg 25<210>72<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>72gacaacagca accgcctgac 20<210>73<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>73ggcgacaaca gcaaccgcct gaccc 2權(quán)利要求
1.分枝桿菌菌種檢測(cè)及鑒定試劑盒，包括分枝桿菌屬特異引物和分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片；所述分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片包括分枝桿菌菌種檢測(cè)探針；所述分枝桿菌菌種檢測(cè)探針由分枝桿菌屬特異探針，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針和以下27種分枝桿菌種特異探針組成堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍-施氏分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-迪氏-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌特異探針；所述分枝桿菌屬特異引物為具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的兩個(gè)寡核苷酸；所述分枝桿菌屬特異探針是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；所述猿猴分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；所述瘰疬分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；所述戈登分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蘇加分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；所述鳥(niǎo)分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胞內(nèi)分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；所述土地分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；所述不產(chǎn)色分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胃分支桿菌特異探針是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；所述次要分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；所述亞洲分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；所述施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；所述偶然分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；所述龜分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；所述膿腫分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；所述恥垢分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；所述草分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淡黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淺黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；所述迪氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；所述母牛分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；所述新金色分枝桿菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述分枝桿菌屬特異探針是序列表中序列3或序列4；所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針是下述1)至4)中的任一種1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是下述5)至6)中的任一種5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是序列表中序列12或序列13；所述猿猴分枝桿菌特異探針是下述7)至10)中的任一種7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；所述瘰疬分枝桿菌特異探針是序列表中序列18或序列19；所述戈登分枝桿菌特異探針是序列表中序列20或序列21；所述蘇加分枝桿菌特異探針是序列表中序列22或序列23；所述鳥(niǎo)分枝桿菌特異探針是序列表中序列24或序列25；所述胞內(nèi)分枝桿菌特異探針是序列表中序列26或序列27；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是下述11)至14)中的任一種11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是序列表中序列32或序列33；所述土地分枝桿菌特異探針是序列表中序列34或序列35；所述不產(chǎn)色分枝桿菌特異探針是序列表中序列36或序列37；所述胃分支桿菌特異探針是序列表中序列38或序列39；所述次要分枝桿菌特異探針是序列表中序列40或序列41；所述亞洲分枝桿菌特異探針是序列表中序列42或序列43；所述施氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列44或序列45；所述偶然分枝桿菌特異探針是序列表中序列46或序列47；所述龜分枝桿菌特異探針是下述15)至18)中的任一種15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；所述膿腫分枝桿菌特異探針是序列表中序列52或序列53；所述恥垢分枝桿菌特異探針是序列表中序列54或序列55；所述草分枝桿菌特異探針是序列表中序列56或序列57；所述淡黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列58或序列59；所述淺黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列60或序列61；所述迪氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列62或序列63；所述母牛分枝桿菌特異探針是序列表中序列64或序列65；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是序列表中序列66或序列67；所述新金色分枝桿菌是是下述19)至22)中的任一種19)序列表中序列68和/或序列70和/或序列72；20)序列表中序列69和/或序列70和/或序列72；21)序列表中序列68和/或序列71和/或序列73；22)序列表中序列69和/或序列71和/或序列73。
3.分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片，包括分枝桿菌屬特異探針，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針和以下分枝桿菌種特異探針堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍-施氏分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-迪氏-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌種特異探針；所述分枝桿菌屬特異探針是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；所述猿猴分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；所述瘰疬分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；所述戈登分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蘇加分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；所述鳥(niǎo)分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胞內(nèi)分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；所述土地分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；所述不產(chǎn)色分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胃分支桿菌特異探針是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；所述次要分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；所述亞洲分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；所述施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；所述偶然分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；所述龜分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；所述膿腫分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；所述恥垢分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；所述草分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淡黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淺黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；所述迪氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；所述母牛分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；所述新金色分枝桿菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片，其特征在于所述分枝桿菌屬特異探針是序列表中序列3或序列4；所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針是下述1)至4)中的任一種1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是下述5)至6)中的任一種5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是序列表中序列12或序列13；所述猿猴分枝桿菌特異探針是下述7)至10)中的任一種7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；所述瘰疬分枝桿菌特異探針是序列表中序列18或序列19；所述戈登分枝桿菌特異探針是序列表中序列20或序列21；所述蘇加分枝桿菌特異探針是序列表中序列22或序列23；所述鳥(niǎo)分枝桿菌特異探針是序列表中序列24或序列25；所述胞內(nèi)分枝桿菌特異探針是序列表中序列26或序列27；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是下述11)至14)中的任一種11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是序列表中序列32或序列33；所述土地分枝桿菌特異探針是序列表中序列34或序列35；所述不產(chǎn)色分枝桿菌特異探針是序列表中序列36或序列37；所述胃分支桿菌特異探針是序列表中序列38或序列39；所述次要分枝桿菌特異探針是序列表中序列40或序列41；所述亞洲分枝桿菌特異探針是序列表中序列42或序列43；所述施氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列44或序列45；所述偶然分枝桿菌特異探針是序列表中序列46或序列47；所述龜分枝桿菌特異探針是下述15)至18)中的任一種15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；所述膿腫分枝桿菌特異探針是序列表中序列52或序列53；所述恥垢分枝桿菌特異探針是序列表中序列54或序列55；所述草分枝桿菌特異探針是序列表中序列56或序列57；所述淡黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列58或序列59；所述淺黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列60或序列61；所述迪氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列62或序列63；所述母牛分枝桿菌特異探針是序列表中序列64或序列65；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是序列表中序列66或序列67；所述新金色分枝桿菌是是下述19)至22)中的任一種19)序列表中序列68和/或序列70和/或序列72；20)序列表中序列69和/或序列70和/或序列72；21)序列表中序列68和/或序列71和/或序列73；22)序列表中序列69和/或序列71和/或序列73。
5.用于分枝桿菌菌種檢測(cè)的探針，由分枝桿菌屬特異探針，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針和分枝桿菌種特異探針組成；所述分枝桿菌種特異探針由以下探針組成堪薩斯分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍-施氏分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、胃分支桿菌、次要分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、金色-迪氏-楚布分枝桿菌、新金色分枝桿菌種特異探針；所述分枝桿菌屬特異探針是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；所述猿猴分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；所述瘰疬分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；所述戈登分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蘇加分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；所述鳥(niǎo)分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胞內(nèi)分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；所述土地分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；所述不產(chǎn)色分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；所述胃分支桿菌特異探針是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；所述次要分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；所述亞洲分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；所述施氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；所述偶然分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；所述龜分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；所述膿腫分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；所述恥垢分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；所述草分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淡黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；所述淺黃分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；所述迪氏分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；所述母牛分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；所述新金色分枝桿菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其特征在于所述分枝桿菌屬特異探針是序列表中序列3或序列4；所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針是下述1)至4)中的任一種1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；所述堪薩斯分枝桿菌特異探針是下述5)至6)中的任一種5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；所述海-潰瘍分枝桿菌特異探針是序列表中序列12或序列13；所述猿猴分枝桿菌特異探針是下述7)至10)中的任一種7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；所述瘰疬分枝桿菌特異探針是序列表中序列18或序列19；所述戈登分枝桿菌特異探針是序列表中序列20或序列21；所述蘇加分枝桿菌特異探針是序列表中序列22或序列23；所述鳥(niǎo)分枝桿菌特異探針是序列表中序列24或序列25；所述胞內(nèi)分枝桿菌特異探針是序列表中序列26或序列27；所述蟾蜍-施氏分枝桿菌特異探針是下述11)至14)中的任一種11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；所述馬爾摩分枝桿菌特異探針是序列表中序列32或序列33；所述土地分枝桿菌特異探針是序列表中序列34或序列35；所述不產(chǎn)色分枝桿菌特異探針是序列表中序列36或序列37；所述胃分支桿菌特異探針是序列表中序列38或序列39；所述次要分枝桿菌特異探針是序列表中序列40或序列41；所述亞洲分枝桿菌特異探針是序列表中序列42或序列43；所述施氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列44或序列45；所述偶然分枝桿菌特異探針是序列表中序列46或序列47；所述龜分枝桿菌特異探針是下述15)至18)中的任一種15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；所述膿腫分枝桿菌特異探針是序列表中序列52或序列53；所述恥垢分枝桿菌特異探針是序列表中序列54或序列55；所述草分枝桿菌特異探針是序列表中序列56或序列57；所述淡黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列58或序列59；所述淺黃分枝桿菌特異探針是序列表中序列60或序列61；所述迪氏分枝桿菌特異探針是序列表中序列62或序列63；所述母牛分枝桿菌特異探針是序列表中序列64或序列65；所述金色-迪氏-楚布分枝桿菌特異探針是序列表中序列66或序列67；所述新金色分枝桿菌是是下述19)至22)中的任一種19)序列表中序列68和/或序列70和/或序列72；20)序列表中序列69和/或序列70和/或序列72；21)序列表中序列68和/或序列71和/或序列73；22)序列表中序列69和/或序列71和/或序列73。
7.用于分枝桿菌菌種檢測(cè)的引物，是具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的兩個(gè)寡核苷酸。
8.一種利用權(quán)利要求1或2所述的試劑盒檢測(cè)分枝桿菌的方法，是以待測(cè)分枝桿菌樣品的基因組DNA為模板，利用所述分枝桿菌屬特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與所述分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)確定待測(cè)分枝桿菌的種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述待測(cè)分枝桿菌樣品為涂片抗酸染色陽(yáng)性的分枝桿菌培養(yǎng)物或涂片抗酸染色陽(yáng)性的痰標(biāo)本。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述雜交為導(dǎo)流雜交。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)和鑒定分枝桿菌菌種的方法及其專(zhuān)用試劑盒。該分枝桿菌菌種檢測(cè)及鑒定試劑盒，包括分枝桿菌屬特異引物和分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片；所述分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片包括分枝桿菌菌種檢測(cè)探針；所述分枝桿菌菌種檢測(cè)探針由分枝桿菌屬特異探針，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異探針和27個(gè)分枝桿菌種特異探針組成。本發(fā)明所提供的利用上述試劑盒檢測(cè)分枝桿菌的方法，是以待測(cè)分枝桿菌樣品的基因組DNA為模板，利用所述分枝桿菌屬特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與所述分枝桿菌菌種檢測(cè)芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)判定待測(cè)分枝桿菌。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1995380SQ20061000049
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日
發(fā)明者李國(guó)利, 莊玉輝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第二附屬醫(yī)院