專利名稱：葡聚糖的生產(chǎn)方法和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)葡聚糖及其衍生物的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及延長α-1，4-葡聚糖鏈的方法。
背景技術(shù)：
葡聚糖是對僅由D-葡萄糖組成其糖類組分的多糖的通稱。代表性葡聚糖的實例包括淀粉、纖維素等。淀粉是通過α-糖苷鍵連接其糖類組分的α-葡聚糖。淀粉中存在直鏈淀粉，即直鏈α-1，4-葡聚糖，和具有分枝結(jié)構(gòu)的支鏈淀粉。直鏈淀粉與支鏈淀粉豐度比例的變化取決于儲存淀粉的植物。因此，很難獲得含有任意組成比例的直鏈淀粉和支鏈淀粉的淀粉。如果可以穩(wěn)定生產(chǎn)直鏈淀粉，這種直鏈淀粉便可與商業(yè)可應(yīng)用淀粉混合，以生產(chǎn)具有任意直鏈淀粉含量的淀粉。
通常，可利用水解酶、轉(zhuǎn)移酶等酶的作用生產(chǎn)直鏈淀粉和具有任意結(jié)構(gòu)的支鏈淀粉。然而，對通過延伸其α-1，4-葡聚糖鏈而結(jié)構(gòu)性改造淀粉的報導(dǎo)是有限的。開發(fā)一種有效延伸α-1，4-葡聚糖鏈的方法是有用的，因為不僅可生產(chǎn)直鏈淀粉，也可任意修飾淀粉的結(jié)構(gòu)。
已知在含淀粉食物中，淀粉中直鏈淀粉的含量和結(jié)構(gòu)對食物的物理屬性有很大影響。然而，淀粉中直鏈淀粉的含量和結(jié)構(gòu)是由被作為原料利用的淀粉決定的。如果直鏈淀粉的含量和結(jié)構(gòu)可以被任意改變，便可期待開發(fā)出具有新口感的食物。
人們希望不溶性直鏈淀粉具有與膳食纖維相同的功能，并也可被利用在健康食品中。此外，直鏈淀粉具有一個特征，即直鏈淀粉可含有，例如碘、脂肪酸、或分子相似物。因此，人們希望直鏈淀粉可應(yīng)用在藥物、化妝品和衛(wèi)生產(chǎn)品領(lǐng)域中。直鏈淀粉也可作為原料用于生產(chǎn)具有與其相同包含能力的環(huán)糊精和環(huán)直鏈淀粉。此外，含直鏈淀粉的薄膜具有不低于多用途塑料的抗拉強度，并且對生物可降解塑料而言，直鏈淀粉是非常有希望的材料。因而人們希望直鏈淀粉有多種用途。然而，獲得基本上純的直鏈淀粉是困難的，并且這種直鏈淀粉非常昂貴。因此，這種直鏈淀粉僅被劃分為試劑級，并且?guī)缀醪蛔鳛楣I(yè)材料應(yīng)用。所以需要一種以穩(wěn)定且便宜的方式生產(chǎn)直鏈淀粉的方法。
已知有一些生產(chǎn)直鏈淀粉的方法。淀粉中存在的直鏈淀粉所占比例約為0～70％。采用沉淀劑，如丁醇，通過T.J.Schoch et al.，J.AmericanChemical Society，64，2957(1942)中描述的方法可從天然原料淀粉中提取直鏈淀粉。然而該提取操作復(fù)雜且產(chǎn)率低。此外，通過提取操作難以獲得不含α-1，6-糖苷鍵的直鏈葡聚糖。而且難以提取具有窄分子量分布的直鏈葡聚糖。
就酶促延伸α-1，4-葡聚糖鏈的方法而言，有一種合成方法，該方法中，以糖核苷酸為底物，通過糖原合成酶、淀粉合成酶等途徑，將糖部分轉(zhuǎn)移到作為引物的麥芽四糖或相似物上。然而該方法的不利之處是作為底物的糖核苷酸非常昂貴，因而不能被工業(yè)利用。
有一種合成α-1，4-葡聚糖鏈的方法是通過來源自馬鈴薯的葡聚糖磷酸化酶(GP)途徑，將α-葡糖-1-磷酸的糖基基團轉(zhuǎn)移到引物，如麥芽七糖等。
此外，有一種公開的方法(US Patent No.5,405,449和EP 0590736)是以葡萄糖-1-氟化物為底物，并使蔗糖磷酸化酶(SP)和葡聚糖磷酸化酶同時作用在引物上。
這些合成方法的有利之處是反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液中底物與引物的比例是任意設(shè)定的，因此可控制獲所得直鏈葡聚糖的分子量。然而底物，α-葡糖-1-磷酸和葡萄糖-1-氟化物是昂貴的，因而對便宜地生產(chǎn)可利用在廣泛工業(yè)領(lǐng)域中的直鏈α-1，4-葡聚糖而言是不適用的。
就以更便宜的方式生產(chǎn)直鏈葡聚糖的方法而言，有一種公開的方法(Waldmann，H.et al.，Carbohydrate Research，157(1986)c4-c7)是使蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶同時作用于引物和蔗糖(下文見SP-GP方法)。Waldmann等人采用來源自明串珠菌屬(腸系膜狀明串珠菌)的蔗糖磷酸化酶和來源自馬鈴薯塊莖的葡聚糖磷酸化酶高產(chǎn)率地從蔗糖合成直鏈葡聚糖。Waldmann等人的SP-GP方法保證了可利用便宜的底物生產(chǎn)直鏈葡聚糖，但是還有一些難題需要改進，如下。
首先，由于采用大量的酶，因此生產(chǎn)成本高，不可能廉價生產(chǎn)。為解決這一難題，需要減少所采用的酶量，或需要研究反應(yīng)條件以改進單位酶的直鏈淀粉產(chǎn)率。
SP-GP方法中，決定所采用的酶量或單位酶的直鏈淀粉產(chǎn)率的諸多因素之一是，例如反應(yīng)開始時溶液中無機磷酸鹽與蔗糖的濃度比例，其中蔗糖是SP的底物。Waldmann等人的現(xiàn)有技術(shù)中，反應(yīng)開始時采用的無機磷酸鹽濃度與溶液中蔗糖濃度相比是相當?shù)偷?，所以才能高產(chǎn)率地生產(chǎn)葡聚糖。SP-GP方法中，蔗糖首先被轉(zhuǎn)化為葡糖-1-磷酸，繼而葡糖-1-磷酸被轉(zhuǎn)化為葡聚糖，如果采用高濃度的無機磷酸鹽，中間產(chǎn)物葡糖-1-磷酸便會積累至高濃度。因此終產(chǎn)物葡聚糖的產(chǎn)率被認為是降低了。所以認為在常規(guī)SP-GP方法中應(yīng)采用低的無機磷酸鹽濃度。在本發(fā)明之前，尚無公開內(nèi)容是關(guān)于反應(yīng)開始時的溶液中，蔗糖與無機磷酸鹽的濃度比例的改變對所采用的酶量或單位酶直鏈淀粉產(chǎn)率的影響，并且更少有對這種改變效果的預(yù)測。
有報導(dǎo)一種將兩種類型磷酸化酶相似地組合到SP-GP方法中，并且通過無機磷酸鹽合成碳水化合物的方法。例如Chaen等人(Journal ofBioscience and Bioengineering，92(2001)177-182)公開的一種利用麥芽糖磷酸化酶和曲二糖磷酸化酶的組合，從麥芽糖合成清酒曲低聚糖的方法。Chaen等人描述反應(yīng)開始時，溶液中的無機磷酸鹽濃度越低，反應(yīng)產(chǎn)物，即清酒曲低聚糖的產(chǎn)率越高。因此，通常認為在一種有兩種磷酸化酶組合的反應(yīng)體系中，為增加終產(chǎn)物產(chǎn)率，反應(yīng)開始時溶液中優(yōu)選地無機磷酸鹽濃度應(yīng)較低。
SP-GP方法中，決定所采用的酶量或單位酶的直鏈淀粉產(chǎn)率的第二個因素是反應(yīng)溫度。通常，在酶反應(yīng)中，反應(yīng)溫度越高，反應(yīng)速率越快。因此，在高溫度條件下進行反應(yīng)是理想的。然而，由于酶蛋白是熱不穩(wěn)定的，因此實際的酶反應(yīng)是在酶蛋白不會熱失活的溫度范圍內(nèi)進行的。Waldmann等人的現(xiàn)有技術(shù)中，采用了來源自明串珠菌屬的蔗糖磷酸化酶，并且考慮該酶的熱穩(wěn)定性，在37℃進行葡聚糖合成反應(yīng)。本發(fā)明之前，尚無公開內(nèi)容是關(guān)于反應(yīng)溶液中蔗糖濃度的改變對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性的影響，并且也沒有對其效果進行預(yù)測。此外，對來源自明串珠菌屬的蔗糖磷酸化酶的熱穩(wěn)定性也沒有公開的內(nèi)容。因此，不可能對在葡聚糖合成中利用該蔗糖磷酸化酶的任何效果作出預(yù)測。
第二個難題是操作性難題。葡聚糖，尤其是直鏈淀粉會老化為不可溶的，導(dǎo)致沉淀或形成凝膠體。眾所周知，老化速率取決于溫度。反應(yīng)溫度低時，操作性難題出現(xiàn)在生產(chǎn)后的后續(xù)階段，如直鏈淀粉溶液的凝膠化。因此，優(yōu)選地反應(yīng)溫度應(yīng)盡可能高。然而Waldmann等人的現(xiàn)有技術(shù)中，生產(chǎn)直鏈淀粉的反應(yīng)溫度有問題地低至37℃。
當從葡聚糖特定生產(chǎn)無支鏈結(jié)構(gòu)的直鏈淀粉時，不得不以直鏈麥芽低聚糖做為引物。Waldmann等人的現(xiàn)有技術(shù)中，將純化的麥芽七糖作為直鏈麥芽-低聚糖利用。然而，純化的麥芽七糖僅被劃分為試劑級，且非常昂貴。便宜引物的選擇物包括通過對淀粉適當水解所得麥芽低聚糖的混合物。然而已知，對諸多葡聚糖磷酸化酶而言，只有聚合度大于或等于麥芽四糖的麥芽低聚糖可被用作引物，而聚合度小于或等于麥芽三糖的麥芽低聚糖則不能被用作引物。除了含有可作為引物起作用，且聚合度大于或等于麥芽六糖的麥芽低聚糖外，麥芽低聚糖混合物還含有不起引物作用的麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖。此外，已知麥芽低聚糖混合物中所含的葡萄糖是蔗糖磷酸化酶的抑制物。因此，含麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖的麥芽低聚糖混合物是否具有引物功能，以及蔗糖磷酸化酶的抑制物葡萄糖在SP-GP方法中是否可以有效發(fā)揮作用，在本發(fā)明以前均未被公開過，并且也不能容易地推測其效果。
本發(fā)明方法的情況中，酶反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)溶液中有大量副產(chǎn)物果糖伴隨葡聚糖產(chǎn)生。因此，采用本發(fā)明方法工業(yè)化生產(chǎn)葡聚糖的情況中，葡聚糖合成反應(yīng)步驟結(jié)束后，有效純化葡聚糖的過程是必要的。Waldmann等人的現(xiàn)有技術(shù)中，純化直鏈淀粉時利用的是一種采用丁醇選擇性沉淀直鏈淀粉的方法。然而工業(yè)化大量生產(chǎn)直鏈淀粉時，利用有機溶劑的方法在成本、對人體安全性、環(huán)境問題方面均不是一種好的方法。還沒有任何采用非有機溶劑的方法被公開過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決上述難題。本發(fā)明的一個目標是提供一種在比常規(guī)方法更實用的條件下，以穩(wěn)定且便宜的方式生產(chǎn)葡聚糖，尤其是直鏈淀粉的方法。更為特定地，本發(fā)明的目標是提供一種在從蔗糖生產(chǎn)直鏈淀粉的過程中盡可能多地減少所需要的酶量，并且在較高溫度下實現(xiàn)反應(yīng)的方法。
本發(fā)明的另一個目標是不采用有機溶劑從生產(chǎn)的直鏈淀粉溶液中有效純化直鏈淀粉。
為解決上述難題，本發(fā)明的發(fā)明人進行了嚴謹?shù)难芯浚K于發(fā)現(xiàn)從反應(yīng)開始到結(jié)束的一段時間內(nèi)，通過在一定范圍內(nèi)，設(shè)定蔗糖摩爾濃度與無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸的總摩爾濃度的比例最大值，可獲得高于常規(guī)方法的產(chǎn)率水平。基于該發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完善了本發(fā)明。
發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)在至少某一濃度蔗糖存在情況下，蔗糖磷酸化酶的耐熱性是增加的，因此反應(yīng)溫度可以升高；結(jié)果可減少所需要的酶量，或提高單位酶的葡聚糖產(chǎn)率；并且進一步地可以在高溫下進行反應(yīng)，使得直鏈淀粉可不老化地被生產(chǎn)?；谠摪l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完善了本發(fā)明。
發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)利用來源自鏈球菌屬的蔗糖磷酸化酶可提高反應(yīng)溫度；結(jié)果是可減少所需要的酶量，或提高單位酶的葡聚糖產(chǎn)率；并且進一步地可在高溫下進行反應(yīng)，使得直鏈淀粉可不老化(aging)地被生產(chǎn)?；谠摪l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完善了本發(fā)明。
發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)在SP-GP方法中，即使以麥芽低聚糖混合物(尤其是一種含有不可作為許多葡聚糖磷酸化酶的引物起作用的麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖的混合物，并且葡萄糖是蔗糖磷酸化酶的抑制物)，而不是以純化的麥芽低聚糖做為引物，也可以進行目標葡聚糖，特別是直鏈淀粉的合成，并且沒有特殊難題。基于該發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完善了本發(fā)明。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過任一下列過程從反應(yīng)溶液中有效除去果糖，以便生產(chǎn)葡聚糖，基于該發(fā)現(xiàn)，完善了本發(fā)明(1)不利用有機溶劑純化已生成的葡聚糖；(2)反應(yīng)結(jié)束后冷卻反應(yīng)溶液以沉淀葡聚糖，并通過固-液分離方法純化沉淀的葡聚糖；(3)于葡聚糖生產(chǎn)反應(yīng)期間或之后冷卻反應(yīng)溶液以凝膠化葡聚糖，回收凝膠狀葡聚糖，并通過選自水洗滌、冷凍-融化、過濾、壓榨、抽吸(suction)和離心的操作從凝膠狀葡聚糖中除去果糖；并(4)于葡聚糖生成反應(yīng)結(jié)束后采用超濾膜或?qū)游龇ǎㄟ^膜分級分離除去果糖，無需使溶解于水中的葡聚糖沉淀。
本發(fā)明第一種生產(chǎn)葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液起反應(yīng)以生產(chǎn)葡聚糖的步驟。從反應(yīng)開始到結(jié)束，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例的最大值不超過約17。
一種實施方案中，最大值可以至少約為0.5，且不超過約15，優(yōu)選至少約為1，且不超過約10，更優(yōu)選至少約為2，且不超過約7。
一種實施方案中，葡聚糖可為直鏈淀粉。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶可來源自屬于鏈球菌屬的細菌。優(yōu)選地，蔗糖磷酸化酶可來源自選自變異鏈球菌、嗜熱鏈球菌、肺炎鏈球菌、和緩癥鏈球菌的屬于鏈球菌屬的細菌。
一種實施方案中，葡聚糖磷酸化酶可來源自植物。更優(yōu)選地葡聚糖磷酸化酶可來源自藻類或馬鈴薯。
一種實施方案中，葡聚糖磷酸化酶可來源自水生棲熱桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一個可通過重組微生物生成。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一個可以被固定在載體上。
一種實施方案中，蔗糖可為未純化的糖類。
一種實施方案中，引物可選自麥芽低聚糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶聯(lián)糖、淀粉及它們的衍生物。
一種實施方案中，麥芽低聚糖可為麥芽低聚糖混合物。
一種實施方案中，除了含有聚合度大于或等于麥芽四糖的麥芽低聚糖外，麥芽低聚糖混合物還可含有麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖中的至少一種。
一種實施方案中，淀粉可選自可溶性淀粉、蠟質(zhì)淀粉、高直鏈淀粉、脫支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、水解酶部分降解的淀粉、已加工淀粉及其衍生物。
一種實施方案中，方法可進一步包括不采用有機溶劑純化已生成的葡聚糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在反應(yīng)結(jié)束后冷卻反應(yīng)溶液以沉淀葡聚糖，并通過固-液分離方法純化已沉淀葡聚糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在葡聚糖生產(chǎn)反應(yīng)期間或之后冷卻反應(yīng)溶液以凝膠化葡聚糖，回收凝膠狀葡聚糖，并通過選自水洗滌、冷凍-融化、過濾、壓榨、抽吸和離心的操作從凝膠狀葡聚糖中除去果糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在葡聚糖生成反應(yīng)結(jié)束后，采用超濾膜或?qū)游龇?，使溶解在水中的葡聚糖通過膜分級分離，無需沉淀除去果糖。超濾膜的截留分子量可以約為30,000。超濾膜可為中空纖維類型。層析法中可采用的載體可為用于凝膠過濾層析法的載體、用于離子交換層析法的載體，或用于疏水層析法的載體。
一種實施方案中，反應(yīng)溶液可進一步含有選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、糖原脫支酶的酶。
本發(fā)明第二種生產(chǎn)葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶、和葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液起反應(yīng)以制得葡聚糖的步驟。反應(yīng)在約40℃到約70℃的溫度下進行。
一種實施方案中，反應(yīng)溫度可以為約45℃到約65℃。
一種實施方案中，反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液的蔗糖濃度可以為約5％到約100％，優(yōu)選地約8％到約80％，更為優(yōu)選地約15％到約50％。
一種實施方案中，葡聚糖可為直鏈淀粉。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶可來源自屬于鏈球菌屬的細菌。優(yōu)選地，蔗糖磷酸化酶可來源自選自變異鏈球菌、嗜熱鏈球菌、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌的屬于鏈球菌屬的細菌。
一種實施方案中，葡聚糖磷酸化酶可來源自植物。更優(yōu)選地，葡聚糖磷酸化酶可來源自藻類或馬鈴薯。
一種實施方案中，葡聚糖磷酸化酶可來源自水生棲熱桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一個可通過重組微生物生成。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一個可以被固定在載體上。
一種實施方案中，蔗糖可為未純化的糖類。
一種實施方案中，引物可選自麥芽低聚糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶聯(lián)糖、淀粉及其衍生物。
一種實施方案中，麥芽低聚糖可為麥芽低聚糖混合物。
一種實施方案中，除了含有聚合度大于或等于麥芽四糖的麥芽低聚糖外，麥芽低聚糖混合物還可含有麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖中的至少一種。
一種實施方案中，淀粉可選自可溶性淀粉、蠟質(zhì)淀粉、高直鏈淀粉、脫支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、水解酶部分降解的淀粉、已加工淀粉及其衍生物。
一種實施方案中，方法可進一步包括不采用有機溶劑純化已生成的葡聚糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在反應(yīng)結(jié)束后冷卻反應(yīng)溶液以沉淀葡聚糖，并通過固-液分離方法純化已沉淀葡聚糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在葡聚糖生產(chǎn)反應(yīng)期間或之后冷卻反應(yīng)溶液以凝膠化葡聚糖，回收凝膠狀葡聚糖，并通過選自水洗滌、冷凍-融化、過濾、壓榨、抽吸和離心的操作從凝膠狀葡聚糖中除去果糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在葡聚糖生成反應(yīng)結(jié)束后，采用超濾膜或?qū)游龇?，使溶解于水中的葡聚糖無需沉淀，通過膜分級分離以除去果糖。超濾膜的截留分子量可約為30,000。超濾膜可為中空纖維類型。層析法中可采用的載體可為用于凝膠過濾層析法的載體、用于離子交換層析法的載體，或用于疏水層析法的載體。
一種實施方案中，反應(yīng)溶液可進一步含有選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、糖原脫支酶的酶。
本發(fā)明的第三種生產(chǎn)葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液起反應(yīng)以制得葡聚糖的步驟。從反應(yīng)開始到結(jié)束，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例最大值不超過約17，并且反應(yīng)在約40℃到約70℃的溫度下進行。
一種實施方案中，最大值可至少約為0.5，且不超過約15，優(yōu)選地至少約為1，且不超過10，更為優(yōu)選地至少約為2，且不超過約7。
一種實施方案中，反應(yīng)溫度可為約45℃到約65℃。
一種實施方案中，反應(yīng)開始時反應(yīng)溶液的蔗糖濃度可約為5％到約100％，優(yōu)選地約8％到約80％，更為優(yōu)選地約15％到約50％。
一種實施方案中，葡聚糖可為直鏈淀粉。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶可來源自屬于鏈球菌屬的細菌。優(yōu)選地蔗糖磷酸化酶可來源自選自變異鏈球菌、嗜熱鏈球菌、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌，屬于鏈球菌屬的細菌。
一種實施方案中，葡聚糖磷酸化酶可來源自植物。更優(yōu)選地，葡聚糖磷酸化酶可來源自藻類或馬鈴薯。
一種實施方案中，葡聚糖磷酸化酶可來源自水生棲熱桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一個可由重組微生物生成。
一種實施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一個可被固定在載體上。
一種實施方案中，蔗糖可為未純化的糖類。
一種實施方案中，引物可選自麥芽低聚糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶聯(lián)糖、淀粉及其衍生物。
一種實施方案中，麥芽低聚糖可為麥芽低聚糖混合物。
一種實施方案中，除了含有聚合度大于或等于麥芽四糖的麥芽低聚糖外，麥芽低聚糖混合物還可含有麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖中的至少一種。
一種實施方案中，淀粉可選自可溶性淀粉、蠟質(zhì)淀粉、高直鏈淀粉、脫支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、水解酶部分降解的淀粉、已加工淀粉及其衍生物。
一種實施方案中，方法可進一步包括不采用有機溶劑純化已生成的葡聚糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在反應(yīng)結(jié)束后冷卻反應(yīng)溶液以沉淀葡聚糖，并通過固-液分離方法純化已沉淀葡聚糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在葡聚糖生產(chǎn)反應(yīng)期間或之后冷卻反應(yīng)溶液以凝膠化葡聚糖，回收凝膠狀葡聚糖，并通過選自水洗滌、冷凍-融化、過濾、壓榨、抽吸和離心的操作從凝膠狀葡聚糖中除去果糖的步驟。
一種實施方案中，方法可進一步包括在葡聚糖生成反應(yīng)結(jié)束后，采用超濾膜或?qū)游龇ǎ谷芙庠谒械钠暇厶菬o需沉淀，通過膜分級分離除去果糖。超濾膜的截留分子量可約為30,000。超濾膜可為中空纖維類型。層析法中可采用的載體可為用于凝膠過濾層析法的載體、用于離子交換層析法的載體，或用于疏水層析法的載體。
一種實施方案中，反應(yīng)溶液可進一步含有選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、糖原脫支酶的酶。
本發(fā)明第四種生產(chǎn)葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液起反應(yīng)以制得葡聚糖的步驟，其中反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例不超過約17。
一種實施方案中，反應(yīng)開始后既不進一步添加無機磷酸鹽，也不進一步添加葡糖-1-磷酸。
一種實施方案中，反應(yīng)可在約40℃到約70℃的溫度下進行。
本發(fā)明第五種生產(chǎn)葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液開始反應(yīng)；進一步將蔗糖、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸添加到反應(yīng)溶液中；進一步繼續(xù)反應(yīng)以生產(chǎn)葡聚糖的步驟，其中添加步驟結(jié)束時，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例不超過約17。
一種實施方案中，反應(yīng)可在約40℃到約70℃的溫度下進行。
本發(fā)明的葡聚糖是通過上述方法中的任意一種生產(chǎn)而得的。
附圖簡述

圖1是一張顯示從蔗糖合成葡聚糖的生產(chǎn)流程示意圖。
圖2是一張顯示采用4％初始蔗糖、腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶、馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶，于37℃和45℃的反應(yīng)溫度下進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖3是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，45℃的反應(yīng)溫度下進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖4是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，37℃和45℃的反應(yīng)溫度下進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖5是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，45℃和50℃的反應(yīng)溫度下，采用變異鏈球菌(耐熱細菌)來源的蔗糖磷酸化酶和馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖6是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，45℃和50℃的反應(yīng)溫度下，采用酶活總計相當于圖5中采用的酶的一半活性的變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖7是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，45℃的反應(yīng)溫度下，采用腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖8是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，45℃的反應(yīng)溫度下，采用酶活總計相當于圖7中采用的酶的一半活性的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖9是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，50℃的反應(yīng)溫度下，采用變異鏈球菌(耐熱細菌)來源的蔗糖磷酸化酶和水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖10是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，50℃的反應(yīng)溫度下，采用酶活總計相當于圖9中采用的酶的一半活性的變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖11是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，45℃的反應(yīng)溫度下，采用腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖12是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，37℃和45℃的反應(yīng)溫度下，采用酶活總計相當于圖11中采用的酶的一半活性的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖13是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，50℃的反應(yīng)溫度下，采用變異鏈球菌(耐熱細菌)來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖14是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，45℃和50℃的反應(yīng)溫度下，采用酶活總計相當于圖13中采用的酶的一半活性的變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖15是一張顯示在65℃的反應(yīng)溫度下，反應(yīng)開始時初始蔗糖濃度為50％，采用變異鏈球菌(耐熱細菌)來源的蔗糖磷酸化酶和馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶或水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖16是一張顯示在不同初始無機磷酸鹽濃度，37℃的反應(yīng)溫度下，采用腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖17是一張顯示在不同初始無機磷酸鹽濃度，45℃的反應(yīng)溫度下，采用變異鏈球菌(耐熱細菌)來源的蔗糖磷酸化酶和馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶進行反應(yīng)時直鏈淀粉的產(chǎn)率圖。
圖18是一張顯示加熱至55℃時，不同蔗糖濃度的蔗糖溶液中，重組變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶剩余活性的圖。
圖19是一張顯示加熱至55℃時，不同蔗糖濃度的蔗糖溶液中，腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶剩余活性的圖。
圖20是一張顯示蔗糖或果糖對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性影響的圖。
圖21是一張顯示無機磷酸鹽對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性影響的圖。
圖22是一張顯示在不同初始蔗糖濃度，50℃的反應(yīng)溫度下，以出芽短梗霉聚糖為引物進行反應(yīng)時葡聚糖的產(chǎn)率圖。
圖23是一張顯示在不同初始無機磷酸鹽濃度，50℃的反應(yīng)溫度下，以出芽短梗霉聚糖為引物進行反應(yīng)時葡聚糖的產(chǎn)率圖。
圖24是一張顯示以葡糖-1-磷酸為底物時葡聚糖的產(chǎn)率圖。
最佳實施方式下文將詳細描述本發(fā)明。
本發(fā)明方法中生產(chǎn)了葡聚糖。本說明書中，“葡聚糖”指組成單位是D-葡萄糖，且含有至少兩個經(jīng)由α-1，4-糖苷鍵連接的糖單位的糖。葡聚糖可為直鏈、分枝或環(huán)狀分子。直鏈葡聚糖和α-1，4-葡聚糖同義。直鏈葡聚糖中，糖單位僅經(jīng)由α-1，4-糖苷鍵連接。至少包含一個α-1，6-糖苷鍵的葡聚糖是分枝葡聚糖。優(yōu)選地葡聚糖包括一定程度的直鏈部分。無分枝的直鏈葡聚糖是更為優(yōu)選的。
一些情況中，具有少量分枝(即α-1，6-糖苷鍵)的葡聚糖是優(yōu)選的。這些情況中，分枝數(shù)目代表性地是0～10,000，優(yōu)選0～1000，更優(yōu)選0～500，更優(yōu)選0～100，更優(yōu)選0～50，更優(yōu)選0～25，更優(yōu)選0。
本發(fā)明的葡聚糖中，α-1，6-糖苷鍵的數(shù)目為1的情況下，α-1，4-糖苷鍵與α-1，6-糖苷鍵的數(shù)目比例為優(yōu)選1～10000，更優(yōu)選10～5000，更優(yōu)選50～1000，更優(yōu)選100～500。
α-1，6-糖苷鍵可以是任意或均一地分布在葡聚糖中。優(yōu)選地是在葡聚糖中存在至少有5個糖單位長的直鏈部分。
葡聚糖可以僅由D-葡萄糖組成，或者可以是經(jīng)過某種程度修飾后未損害葡聚糖屬性的衍生物。未修飾的葡聚糖是優(yōu)選的。
葡聚糖具有的代表性分子量至少為約8×103，優(yōu)選至少約1×104，更優(yōu)選至少約5×104，更優(yōu)選至少約1×105，更優(yōu)選至少約6×105。葡聚糖具有的代表性分子量不超過1×108，優(yōu)選不超過1×107，更優(yōu)選不超過5×106，更優(yōu)選不超過1×106。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解的是通過適當設(shè)定本發(fā)明生產(chǎn)方法所采用的底物量、酶量、反應(yīng)時間等，可獲得具有預(yù)期分子量的葡聚糖。
<生產(chǎn)葡聚糖的原料>
本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，主要原料采用的是例如蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、緩沖劑、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶和可溶解它們的溶劑。盡管通常是在反應(yīng)開始時添加所有這些原料，這些原料中仍然有一些是可以在反應(yīng)期間進一步添加的。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，如果必要，可采用選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和糖原脫支酶的酶。根據(jù)預(yù)定的葡聚糖結(jié)構(gòu)，可于本發(fā)明生產(chǎn)方法開始或期間將選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和糖原脫支酶的酶添加至反應(yīng)溶液中。
(1)蔗糖
蔗糖被表示為C12H22O11，是分子量約為342的二糖。蔗糖存在于任何可進行光合作用的植物中。蔗糖可分離自植物或化學(xué)合成。根據(jù)成本，蔗糖優(yōu)選地是從植物中分離。含有大量蔗糖的植物實例包括甘蔗、甜菜等。甘蔗的汁液中含有約20％的蔗糖。甜菜的汁液中含有約10～15％的蔗糖。蔗糖可作為從含蔗糖的植物汁液到純化糖的純化過程中任何一個階段所獲的任何原料被提供。
本發(fā)明方法采用的蔗糖優(yōu)選地是純的。不過蔗糖可含有任何其它雜質(zhì)，只要這些雜質(zhì)不抑制蔗糖在本發(fā)明中的效果即可。
溶液中所含的蔗糖濃度代表性地約5％到約100％，優(yōu)選約8％到約80％，更優(yōu)選約8％到約50％。應(yīng)當指出本說明書中，蔗糖濃度是通過重量/體積計算的，即(蔗糖重量)×100/(溶液體積)。
如果蔗糖量過大，未反應(yīng)的蔗糖可能在反應(yīng)期間沉淀。如果采用的蔗糖量過小，在高溫反應(yīng)中可能降低產(chǎn)率。
應(yīng)當指出在上述第一種方法的情況中，即從反應(yīng)開始到結(jié)束，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例的最大值不超過約17，并無必要將蔗糖濃度限定于上述范圍。同樣，在上述第四種方法的情況中，即反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例不超過約17，以及在上述第五種方法的情況中，即包括進一步將蔗糖、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸添加到反應(yīng)溶液中的步驟，并無必要將蔗糖濃度限定于上述范圍。本說明書中，以反應(yīng)溶液中蔗糖的摩爾濃度除以反應(yīng)溶液中無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸的總摩爾濃度，所獲得比例稱作蔗糖-磷酸鹽比例。換言之蔗糖-磷酸鹽比例＝(蔗糖的摩爾濃度)/(無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸的總摩爾濃度)如果在反應(yīng)開始時將待反應(yīng)的所有原料混合，并且在反應(yīng)期間不再添加任何原料，則反應(yīng)開始時，蔗糖-磷酸鹽比例最高。
(2)引物本發(fā)明采用的引物指作為啟動物質(zhì)對合成葡聚糖起作用的分子。如果引物含有至少一個可經(jīng)由α-1，4-糖苷鍵連接糖單位的自由部分，則其它部分可由除糖以外的組成部分構(gòu)成。本發(fā)明方法中，糖單位經(jīng)由α-1，4-糖苷鍵被相繼連接到引物上，從而合成了葡聚糖。引物包括任何可通過葡聚糖磷酸化酶添加糖單位的糖。
對本發(fā)明中的反應(yīng)而言，引物可為任何啟動物質(zhì)。例如，可以本發(fā)明方法合成的葡聚糖為引物，再次通過本發(fā)明方法延伸α-1，4糖苷鏈。
引物可以是僅包含α-1，4-糖苷鍵的α-1，4葡聚糖，或者是部分包含α-1，6-糖苷鍵的α-1，4葡聚糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)目標葡聚糖容易地選擇合適引物。合成直鏈淀粉的情況中，優(yōu)選以僅包含α-1，4-糖苷鍵的α-1，4葡聚糖為引物，因為可以無需采用脫支酶等便合成直鏈淀粉。
引物實例包括麥芽-低聚糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶聯(lián)糖、淀粉及其衍生物。
本說明書中，麥芽-低聚糖指通過2～10個葡萄糖的脫水-濃縮，并由α-1，4鍵連接而生成的物質(zhì)。麥芽-低聚糖優(yōu)選地含4～10個糖單位，更優(yōu)選5～10個糖單位，更優(yōu)選7～10個糖單位。麥芽-低聚糖實例包括麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、麥芽八糖、麥芽九糖、麥芽十糖等。優(yōu)選地麥芽-低聚糖是麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、或麥芽七糖。麥芽-低聚糖可為單一成分產(chǎn)物或多種麥芽-低聚糖的混合物。優(yōu)選麥芽-低聚糖混合物是因為其低廉的成本。一種實施方案中，麥芽-低聚糖混合物除了含有聚合度大于或等于麥芽四糖的麥芽-低聚糖以外，還含有麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖中的至少一種。此處“聚合度大于或等于麥芽四糖的麥芽-低聚糖”指聚合度至少為4的麥芽-低聚糖。低聚糖可為直鏈低聚糖或分枝低聚糖。低聚糖可以在其分子中具有環(huán)狀部分。本發(fā)明中，優(yōu)選的是直鏈低聚糖。
直鏈淀粉是由經(jīng)α-1，4鍵連接的葡萄糖單位組成的直鏈分子。天然生成的淀粉包含直鏈淀粉。
支鏈淀粉是由α-1，4鍵連接的葡萄糖單位組成，并經(jīng)由α-1，6鍵連有葡萄糖單位的分枝分子。天然生成的淀粉中包含支鏈淀粉。就支鏈淀粉而言，例如可采用100％由支鏈淀粉組成的蠟質(zhì)種玉米淀粉。例如可以聚合度至少為約1×105的支鏈淀粉作為原料。
糖原是葡聚糖的一種類型，由葡萄糖組成，并具有高頻分枝。糖原作為耐儲多聚糖，以小顆粒的形式廣泛分布于動物和植物基本上所有的細胞中。例如糖原存在于玉米種子或植物的相似部位。糖原中代表性地，經(jīng)由α-1，6鍵，以大約每三個葡萄糖單位對應(yīng)一條鏈的比例，將平均聚合度為12～18的α-1，4鍵糖鏈連接到葡萄糖的α-1，4鍵糖鏈上。由α-1，6鍵連接的分枝經(jīng)由α-1，6鍵被相似地連接到葡萄糖的α-1，4鍵糖鏈上。因此，糖原具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
糖原的分子量代表性的約為1×105到約1×108，優(yōu)選約1×106到約1×107。
出芽短梗霉聚糖是分子量約為100,000到約300,000(如約200,000)的葡聚糖，其中以階梯方式經(jīng)由α-1，6鍵規(guī)律地連有麥芽三糖。例如，以淀粉為原料，通過培養(yǎng)出芽短梗霉菌生成出芽短梗霉聚糖。例如出芽短梗霉聚糖可獲得自Hayashibara Shoji，Inc.。
偶聯(lián)糖是一種混合物，其主要成分為蔗糖、葡糖基蔗糖和麥芽糖基蔗糖。例如，通過使巨大芽孢桿菌等生成的環(huán)式糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶作用于蔗糖和淀粉的混合溶液，可制得偶聯(lián)糖。偶聯(lián)糖可獲得自例如Hayashibara Shoji，Inc.。
淀粉是直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物。就淀粉而言，可采用任何通常商業(yè)上可提供的淀粉。淀粉所含直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例變化取決于生成淀粉的植物類型。糯米、蠟質(zhì)種玉米等植物所包含的淀粉中大部分為支鏈淀粉。但是，不能從普通植物中獲得僅由直鏈淀粉組成，而不含支鏈淀粉的淀粉。
淀粉被劃分為天然生成的淀粉、淀粉降解產(chǎn)物和已加工淀粉。
根據(jù)其來自的原料，天然生成的淀粉可被劃分為塊莖淀粉和谷物淀粉。塊莖淀粉的實例包括馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、葛藤淀粉、歐洲蕨淀粉等。谷物淀粉的實例包括玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉等。天然生成的淀粉的一個實例是高直鏈淀粉(如高直鏈淀粉玉米淀粉)，作為培育產(chǎn)淀粉植物的結(jié)果，其增加的直鏈淀粉含量可高達50％～70％。天然生成的淀粉的另一個實例是通過對產(chǎn)淀粉植物進行培育而獲得的不含直鏈淀粉的蠟質(zhì)淀粉。
可溶性淀粉指對天然生成的淀粉進行不同處理而獲得的水溶性淀粉。
已加工淀粉是以如水解、酯化、膠凝等方式對天然生成的淀粉進行處理后獲得，并被賦予了更易于利用的屬性的淀粉。有廣泛多種的已加工淀粉是可以利用的，它們具有多種不同組合的屬性，如開始膠凝化的溫度、淀粉糊的粘度、淀粉糊的透明度、老化穩(wěn)定性等。有多種不同類型的已加工淀粉。這種淀粉的實例是通過下述步驟獲得的淀粉，即在不超過淀粉膠凝化溫度的溫度下將淀粉顆粒浸入一種酸中，使淀粉分子裂解，但淀粉顆粒并不破碎。
淀粉降解產(chǎn)物是經(jīng)過諸如酶處理、水解等方式對淀粉進行處理后獲得的低聚糖或多聚糖，其分子量低于處理前的分子量。淀粉降解產(chǎn)物的實例包括脫支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉和水解作用部分降解淀粉。
脫支酶降解淀粉是通過使脫支酶作用于淀粉而獲得的。通過不同程度地改變脫支酶的作用時間，可獲得分枝部分(即α-1，6-糖苷鍵)被裂解為任意大小的脫支酶降解淀粉。脫支酶降解淀粉實例包括含有1～20個α-1，6-糖苷鍵、由4～10,000個糖單位組成的降解產(chǎn)物，無α-1，6-糖苷鍵、由3～500個糖單位組成的降解產(chǎn)物，麥芽-低聚糖和直鏈淀粉。在脫支酶降解淀粉的情況中，根據(jù)降解淀粉類型可改變所獲降解產(chǎn)物的分子量分配。脫支酶降解淀粉可以是具有不同長度的糖鏈的混合物。
磷酸化酶降解淀粉是通過使葡聚糖磷酸化酶(也稱作磷酸化酶)作用于淀粉而獲得的。葡聚糖磷酸化酶將葡萄糖殘基從淀粉的非還原終端轉(zhuǎn)移至位于一個接一個的糖單位基礎(chǔ)上的其它底物。葡聚糖磷酸化酶不能裂解α-1，6-糖苷鍵。因此，如果使葡聚糖磷酸化酶作用于淀粉足夠長的時間，可獲得在α-1，6-糖苷鍵終止裂解的降解產(chǎn)物。本發(fā)明中，磷酸化酶降解淀粉所包含的糖單位數(shù)目優(yōu)選約為10到約100,000，更優(yōu)選約為50到約50,000，更優(yōu)選約為100到約10,000。在磷酸化酶降解淀粉的情況中，根據(jù)待降解淀粉的類型可改變降解產(chǎn)物的分子量分配。磷酸化酶降解淀粉可以是具有不同長度的糖鏈的混合物。
通過水解作用部分降解的糊精和淀粉指通過酸、堿、酶等物質(zhì)作用部分地降解淀粉而獲得的降解產(chǎn)物。本發(fā)明中，通過水解作用部分降解的糊精和淀粉所包含的糖單位數(shù)目優(yōu)選約為10到約100,000，更優(yōu)選約50到約50,000，更優(yōu)選約為100到約10,000。在通過水解作用部分降解的糊精和淀粉的情況中，根據(jù)待降解淀粉的類型可改變所獲降解產(chǎn)物的分子量分配。通過水解作用部分降解的糊精和淀粉可以是具有不同長度的糖鏈的混合物。
淀粉優(yōu)選地選自可溶性淀粉、蠟質(zhì)淀粉、高直鏈淀粉、脫支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、水解作用部分降解淀粉、已加工淀粉及其衍生物。
本發(fā)明方法中，可以上述不同糖的衍生物為引物。例如可采用上述糖中至少有一個醇式羥基團被羥烷基化、烷基化、乙?；?、羧甲基化、硫酸化、磷酸化等而得的衍生物。進一步地，可采用至少包括兩種上述衍生物的混合物作為原料。
(3)無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸本說明書中，無機磷酸鹽指在SP反應(yīng)中可提供磷酸鹽底物的物質(zhì)。此處，磷酸鹽底物指作為提供葡糖-1-磷酸中磷酸鹽部分的原料的物質(zhì)。在蔗糖磷酸化酶催化的蔗糖磷酸解作用中，無機磷酸鹽被認為是以磷酸鹽離子的形式起底物的作用。本領(lǐng)域中，這種底物通常被稱為無機磷酸鹽，所以在本說明書中，該底物被稱為無機磷酸鹽。無機磷酸鹽包括磷酸和磷酸的無機鹽。典型地，在含陽離子，如堿金屬離子的水中采用無機磷酸鹽。該情況中，磷酸、磷酸鹽和磷酸鹽離子達到平衡，所以難以區(qū)分磷酸鹽與磷酸。因此，為方便起見，將磷酸和磷酸鹽統(tǒng)稱為無機磷酸鹽。本發(fā)明中，無機磷酸鹽優(yōu)選地是磷酸的任何金屬鹽，更為優(yōu)選地是磷酸的任何堿金屬鹽。無機磷酸鹽的優(yōu)選特定實例包括磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸三鉀、磷酸(H3PO4)、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨等。
反應(yīng)開始時的SP-GP反應(yīng)體系中，可以僅包含一種類型的無機磷酸鹽，或包含大多數(shù)類型的無機磷酸鹽。
無機磷酸鹽可通過，例如將經(jīng)由物理、化學(xué)或酶反應(yīng)降解而得的濃縮磷酸的降解產(chǎn)物，如多磷酸(如焦磷酸、三磷酸和四磷酸)或其鹽添加至反應(yīng)溶液中而獲得。
本說明書中，葡糖-1-磷酸指葡糖-1-磷酸(C6H13O9P)和其鹽。葡糖-1-磷酸優(yōu)選地是狹義上的葡糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任何金屬鹽，更為優(yōu)選地是葡糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任何堿金屬鹽。葡糖-1-磷酸的優(yōu)選特定實例包括葡糖-1-磷酸二鈉、葡糖-1-磷酸二鉀、葡糖-1-磷酸(C6H13O9P)等。本說明書中，沒有括號化學(xué)式的葡糖-1-磷酸代表廣義上的葡糖-1-磷酸，即狹義上的葡糖-1-磷酸和其鹽。
反應(yīng)開始時的SP-GP反應(yīng)體系中，可以僅包含一種類型的葡糖-1-磷酸，或包含大多數(shù)類型的葡糖-1-磷酸。
本發(fā)明方法中，反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液中磷酸鹽與葡糖-1-磷酸的比例可為任意比例。
反應(yīng)溶液中所含的無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸的總摩爾濃度代表性地約為1mM到約1000mM，優(yōu)選約10mM到約500mM，更優(yōu)選約20mM到約250mM。調(diào)節(jié)無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸各自的摩爾濃度，以使從反應(yīng)開始到結(jié)束，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例的最大值代表性地不超過約17，優(yōu)選至少約0.5，且不超過約15，更優(yōu)選至少約1，且不超過約10，更優(yōu)選至少約2，且不超過約7。發(fā)明的上述第四種方法的情況中，調(diào)節(jié)無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸各自的摩爾濃度，以使反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液中的蔗糖-磷酸鹽比例在上述范圍內(nèi)。發(fā)明的上述第五種方法的情況中，調(diào)節(jié)無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸各自的摩爾濃度，以使在將蔗糖、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸進一步添加至反應(yīng)溶液的步驟結(jié)束時，反應(yīng)溶液中的蔗糖-磷酸鹽比例在上述范圍內(nèi)。如果無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸的量過多，可能降低葡聚糖產(chǎn)率。如果這個量過小，可能花費很長時間才能合成葡聚糖。
可通過下文1.4描述的方法定量SP-GP反應(yīng)體系的無機磷酸鹽含量。SP-GP反應(yīng)體系的葡糖-1-磷酸可通過下文1.3描述的方法定量。在不采用反應(yīng)不涉及的含磷光體物質(zhì)的情況中，可通過原子吸收光譜學(xué)測定無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸的總含量。
應(yīng)當指出在上述第二種方法的情況中，即在約40℃到約70℃的反應(yīng)溫度下進行反應(yīng)時，上述最大值非必要地不超過約17。
(4)蔗糖磷酸化酶(EC.2.4.1.7)本說明書中，“蔗糖磷酸化酶”指任何通過將蔗糖的α-糖基基團轉(zhuǎn)移到磷酸鹽基團，從而實現(xiàn)磷酸解作用的酶。通過蔗糖磷酸化酶催化的反應(yīng)可通過下列公式表示
蔗糖+無機磷酸鹽α-D-葡糖-1-磷酸+D-果糖自然界的多種生物體中均含有蔗糖磷酸化酶。生成蔗糖磷酸化酶的生物體實例包括但不僅限于鏈球菌屬細菌(如嗜溫鏈球菌、變異鏈球菌、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌)、腸系膜狀明串珠菌、假單胞菌種、梭菌種、發(fā)芽霉菌屬、木醋桿菌、土壤桿菌種、Synecococcus sp.、大腸桿菌、李司特菌、青春雙岐桿菌、黑曲霉、Monilia sitophila、Sclerotinea escerotiorum、衣藻。
蔗糖磷酸化酶可來源自任何生成蔗糖磷酸化酶的生物體。優(yōu)選地蔗糖磷酸化酶具有某種程度上的耐熱性。單獨存在的蔗糖磷酸化酶的耐熱性越高，該蔗糖磷酸化酶就更為優(yōu)選。例如，優(yōu)選地蔗糖磷酸化酶是指在4％蔗糖存在情況下加熱至55℃并持續(xù)30分鐘時，與加熱前的蔗糖磷酸化酶活性相比，仍保留至少50％活性的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶優(yōu)選地來源自屬于鏈球菌屬的細菌，更優(yōu)選地是來源自變異鏈球菌、嗜溫鏈球菌、肺炎鏈球菌或緩癥鏈球菌。
本說明書中，一種酶“來源自”某種生物體不僅意味著直接從生物體分離，還指通過以某種方式利用生物體而獲得酶。例如，當將編碼了獲得自某種生物體的某種酶的基因?qū)氪竽c桿菌，并從大腸桿菌中分離該酶時，該酶被稱為“來源”自生物體。
本發(fā)明采用的蔗糖磷酸化酶可直接分離自上述存在于自然界并產(chǎn)生蔗糖磷酸化酶的生物體。本發(fā)明采用的蔗糖磷酸化酶可分離自微生物(如細菌、真菌等)，該微生物是通過利用編碼了分離自上述生物體的蔗糖磷酸化酶的基因進行基因重組而獲得。
如下可制備本發(fā)明方法中采用的蔗糖磷酸化酶。首先，培養(yǎng)產(chǎn)蔗糖磷酸化酶的微生物(如細菌、真菌等)。該微生物可以是直接產(chǎn)生蔗糖磷酸化酶的微生物。可選的，克隆編碼了蔗糖磷酸化酶的基因，并利用獲得的基因，對利于表達蔗糖磷酸化酶的微生物(如細菌、真菌等)進行基因重組，以獲得重組微生物。從該重組微生物可獲得蔗糖磷酸化酶。
通過考慮不同條件，如蔗糖磷酸化酶易表達性、易培養(yǎng)性、生長率、安全性等可容易地選擇出可用于利用蔗糖磷酸化酶基因進行基因重組的微生物。優(yōu)選地蔗糖磷酸化酶不含淀粉酶雜質(zhì)。因此，優(yōu)選地是在基因重組中，采用不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)。對蔗糖磷酸化酶的基因重組而言，優(yōu)選采用的是中溫微生物，如大腸桿菌或枯草桿菌。由不生成或不表達、或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)生成的蔗糖磷酸化酶基本上不含淀粉酶，因而被優(yōu)選地采用在本發(fā)明方法中。
利用克隆基因進行微生物(如細菌、真菌等)的基因重組可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進行。利用克隆基因時，基因被優(yōu)選地可操作地連接到組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子上?！翱刹僮鞯剡B接”表明啟動子和基因被連接到一起，所以基因的表達受啟動子的控制。當采用誘導(dǎo)型啟動子時，培養(yǎng)優(yōu)選地在誘導(dǎo)條件下進行。不同誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
就克隆基因而言，為了在細菌細胞外分泌已生成的蔗糖磷酸化酶，可將編碼了信號肽的基礎(chǔ)序列連接到該基因上。編碼信號肽的基礎(chǔ)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
為生成蔗糖磷酸化酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當確定培養(yǎng)微生物(如細菌、真菌等)的條件。培養(yǎng)微生物的合適培養(yǎng)基、誘導(dǎo)每種誘導(dǎo)型啟動子的合適條件等都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
培養(yǎng)合適的時間后，從培養(yǎng)物中回收蔗糖磷酸化酶。當生成的蔗糖磷酸化酶是于細菌細胞外分泌時，可通過離心作用除去細菌細胞以獲得上清液中的蔗糖磷酸化酶。當細菌細胞內(nèi)生成的蔗糖磷酸化酶不是于細菌細胞外分泌時，可通過超聲處理、機械破壞、化學(xué)破壞等方式破壞微生物以獲得被破壞的細菌細胞的溶液。
本發(fā)明方法中，被破壞的細菌細胞的溶液可以無需純化而被應(yīng)用。其后，可通過對被破壞的細菌細胞的溶液進行離心以除去細菌細胞的碎片，從而獲得上清液?？赏ㄟ^一種眾所周知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性作用層析、親合層析、羥磷灰石層析、和凝集素層析對所獲得的上清液進行處理，以回收本發(fā)明的酶。如必要可對回收產(chǎn)物進行純化。
一種優(yōu)選實施方案中，在蔗糖存在(代表性地為約4％到約30％，優(yōu)選為約8％到約30％，更優(yōu)選為約8％到約25％)的情況下，在純化過程中的任一階段均可加熱蔗糖磷酸化酶。該加熱過程中，優(yōu)選地溶液溫度是在該溫度下加熱溶液30分鐘后，與加熱前溶液所含蔗糖磷酸化酶的活性相比，蔗糖磷酸化酶仍保留至少50％，更優(yōu)選至少80％活性。這樣的溫度優(yōu)選為約50℃到約80℃，更優(yōu)選為約55℃到約70℃。例如，在來源自變異鏈球菌的蔗糖磷酸化酶的情況中，反應(yīng)溫度優(yōu)選為約50℃到約60℃。進行加熱時，通過考慮反應(yīng)溫度可任意確定加熱時間，只要不明顯減弱蔗糖磷酸化酶活性即可。加熱時間代表性地為約10分鐘到約90分鐘，更優(yōu)選為約30分鐘到約60分鐘。
相對于反應(yīng)開始時溶液中的蔗糖而言，反應(yīng)開始時，溶液所含蔗糖磷酸化酶量代表性地為約0.05～1,000U/g蔗糖，優(yōu)選為約0.1～500U/g蔗糖，更優(yōu)選為約0.5～100U/g蔗糖。蔗糖磷酸化酶量過多時，反應(yīng)中變性的酶很可能凝集。采用的量過小時，可能降低葡聚糖產(chǎn)率。
蔗糖磷酸化酶可以被純化，也可以不純化。可以被固定，也可以不固定。蔗糖磷酸化酶優(yōu)選地是固定的。就固定方法而言，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的載體結(jié)合方法(如共價結(jié)合方法、離子結(jié)合方法或物理吸附方法)、交聯(lián)法、包埋法(網(wǎng)格型或微囊型)等。蔗糖磷酸化酶優(yōu)選地被固定在載體上。
(5)葡聚糖磷酸化酶(EC.2.4.1.1)葡聚糖磷酸化酶是對催化α-1，4-葡聚糖的磷酸解作用的酶的通稱，也被稱為磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶、麥芽糖糊精磷酸化酶等。葡聚糖磷酸化酶也催化α-1，4-葡聚糖合成反應(yīng)，該反應(yīng)是相對于磷酸解作用的逆反應(yīng)。其中反應(yīng)進行的方向取決于底物的量。生物體中，無機磷酸鹽的量是豐富的，所以葡聚糖磷酸化酶促使反應(yīng)以磷酸解作用方向進行。本發(fā)明方法中，由于在蔗糖的磷酸解作用中采用的是無機磷酸鹽，所以反應(yīng)溶液中無機磷酸鹽的量少，反應(yīng)以合成α-1，4-葡聚糖的方向進行。
葡聚糖磷酸化酶被認為普遍存在于可儲存淀粉或糖原的多種植物、動物和微生物中。
可生成葡聚糖磷酸化酶的植物實例包括藻類、塊莖蔬菜(如馬鈴薯、甘薯、山藥、天南星科植物、木薯等)、蔬菜(如甘藍、菠菜等)、谷類(如玉蜀黍、稻、小麥、大麥、黑麥、谷子等)、豆類(如豌豆、大豆、赤豆、uzura bean等)等。
可生成葡聚糖磷酸化酶的動物實例包括哺乳動物(如人類、兔、鼠、豬等)等。
可生成葡聚糖磷酸化酶的微生物實例包括水生棲熱桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、抗輻射奇異球菌、海岸熱球菌、藍色鏈霉菌、pyrococcushorikoshi、結(jié)核分枝桿菌、thermotoga maritima、aquifex aeolicus、甲烷球菌、假單胞銅綠菌、肺炎衣原體、小球藻、根瘤土壤桿菌、巴斯德氏梭狀芽孢桿菌、克雷白氏肺炎桿菌、synecococcus sp.、藍細菌、大腸桿菌、粗糙脈孢菌、啤酒酵母、衣藻等。可生成葡聚糖磷酸化酶的生物體并不局限于這些實例。
本發(fā)明采用的葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選地來源自馬鈴薯、水生棲熱桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌，更優(yōu)選馬鈴薯。優(yōu)選地，本發(fā)明采用的葡聚糖磷酸化酶具有高的最佳反應(yīng)溫度。例如，具有高的最佳反應(yīng)溫度的葡聚糖磷酸化酶可來源自極端嗜熱細菌。
本發(fā)明采用的葡聚糖磷酸化酶可直接分離自存在于自然界中，并生成葡聚糖磷酸化酶的上述動物、植物和微生物。
本發(fā)明采用的葡聚糖磷酸化酶可分離自微生物(如細菌、真菌等)，該微生物是通過利用編碼了分離自動物、植物或微生物的葡聚糖磷酸化酶的基因進行基因重組而獲得的。
葡聚糖磷酸化酶可通過與上述蔗糖磷酸化酶相似的方式從重組微生物中獲得。
與上述蔗糖磷酸化酶相似，通過考慮不同條件，如葡聚糖磷酸化酶易表達性、易培養(yǎng)性、生長速率、安全性等，可容易地選擇出用于基因重組的微生物(如細菌、真菌等)。優(yōu)選地葡聚糖磷酸化酶不含淀粉酶雜質(zhì)。因此，優(yōu)選地是在基因重組中，采用不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)。對聚糖磷酸化酶的基因重組而言，優(yōu)選采用的是中溫微生物，如大腸桿菌或枯草桿菌。由不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)生成的葡聚糖磷酸化酶基本上不含淀粉酶，因而被優(yōu)選地采用在本發(fā)明方法中。
通過基因重組獲得的葡聚糖磷酸化酶的生產(chǎn)和純化可通過與上述蔗糖磷酸化酶相似的方式進行。
相對于反應(yīng)開始時溶液所含蔗糖而言，反應(yīng)開始時溶液中所含葡聚糖磷酸化酶量代表性的約為0.05～1,000U/g蔗糖，優(yōu)選約0.1～500U/g蔗糖，更優(yōu)選約0.5～100U/g蔗糖。如果葡聚糖磷酸化酶量過多，反應(yīng)中變性的酶很可能凝集。采用的量過少時，則可能降低葡聚糖產(chǎn)率。
葡聚糖磷酸化酶可以被純化，也可以不純化。可以被固定，也可以不固定。葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選地是固定的。就固定方法而言，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的載體結(jié)合方法(如共價結(jié)合方法、離子結(jié)合方法或物理吸附方法)、交聯(lián)法、包埋法(網(wǎng)格型或微囊型)等。葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選地是被固定在載體上。葡聚糖磷酸化酶也可被固定在與固定蔗糖磷酸化酶的載體相同的載體上，或其它載體上，優(yōu)選地是被固定在與固定蔗糖磷酸化酶的載體相同的載體上。
(6)脫支酶本發(fā)明方法中，當產(chǎn)物中產(chǎn)生分枝時，如當采用含α-1，6-糖苷鍵的起始原料時，如有必要可利用脫支酶。
本發(fā)明可采用的脫支酶是可以裂解α-1，6-糖苷鍵的酶。脫支酶被分為兩類，即良好地作用于支鏈淀粉和糖原的異淀粉酶(EC3.2.1.68)，和作用于支鏈淀粉、糖原和出芽短梗霉聚糖的α-糊精內(nèi)-1，6-α-葡萄糖苷酶(也稱作支鏈淀粉酶)(EC 3.2.1.41)。
脫支酶存在于微生物、細菌和植物中。可生成脫支酶的微生物實例包括釀酒酵母和衣藻?？缮擅撝傅募毦鷮嵗ǘ虠U菌、bacillus acidopullulyticus、浸麻類芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、水生棲熱桿菌、克雷白氏肺炎桿菌、嗜溫高溫放線菌、thermoanaerobacter ethanolicus、pseudomonas amyloderamosa等。可生成脫支酶的植物實例包括馬鈴薯、甘薯、玉蜀黍、稻類、小麥、大麥、燕麥、甜菜等?？缮擅撝傅纳矬w并不局限于這些實例。
本發(fā)明可采用的脫支酶優(yōu)選地來源自克雷白氏肺炎桿菌、短桿菌、bacillus acidopullulyticus、或pseudomonas amyloderamosa，更為優(yōu)選地是克雷白氏肺炎桿菌或pseudomonas amyloderamosa。優(yōu)選地，本發(fā)明采用的脫支酶具有高的最佳反應(yīng)溫度。例如，具有高的最佳反應(yīng)溫度的脫支酶可來源自極端嗜熱細菌。
本發(fā)明可采用的脫支酶可直接分離自存在于自然界中，并生成脫支酶的上述微生物、細菌和植物。
本發(fā)明可采用的脫支酶可分離自微生物(如細菌、真菌等)，該微生物是通過利用編碼了分離自微生物、細菌和植物的脫支酶的基因進行基因重組而獲得的。
脫支酶可以與上述蔗糖磷酸化酶相似的方式從重組微生物中獲得。
與上述蔗糖磷酸化酶相似，通過考慮不同條件，如脫支酶易表達性、易培養(yǎng)性、生長速率、安全性等，可輕易地選擇出用于基因重組的微生物(如細菌、真菌等)。優(yōu)選地脫支酶不含淀粉酶雜質(zhì)。因此，優(yōu)選地是在基因重組中，采用不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)。對脫支酶的基因重組而言，優(yōu)選采用的是中溫微生物，如大腸桿菌或枯草桿菌。由不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)生成的脫支酶基本上不含淀粉酶，因而被優(yōu)選地采用在本發(fā)明方法中。
通過基因重組獲得的脫支酶的生產(chǎn)和純化可通過與上述蔗糖磷酸化酶相似的方式進行。
相對于反應(yīng)開始時溶液所含蔗糖而言，反應(yīng)開始時溶液中所含脫支酶量代表性的為約0.05～1,000U/g蔗糖，優(yōu)選為約0.1～500U/g蔗糖，更優(yōu)選為約0.5～100U/g蔗糖。如果脫支酶量過多，在反應(yīng)中變性的酶很可能凝集。采用的量過少時，則可能降低葡聚糖產(chǎn)率。
脫支酶可以被純化，也可以不純化。可以被固定，也可以不固定。脫支酶優(yōu)選地是固定的。就固定方法而言，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的載體結(jié)合方法(如共價結(jié)合方法、離子結(jié)合方法或物理吸附方法)、交聯(lián)法、包埋法(網(wǎng)格型或微囊型)等。脫支酶優(yōu)選地是被固定在載體上。脫支酶也可被固定在與固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者中至少一個的載體相同的載體上，或另一個載體上，優(yōu)選地是被固定在與固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的載體相同的載體上。
(7)分支酶(EC.2.4.1.18)
本發(fā)明方法中，當希望在產(chǎn)物中產(chǎn)生分枝時，如必要可利用分支酶。
本發(fā)明可采用的分支酶是可將α-1，4-葡聚糖鏈的一部分轉(zhuǎn)移到α-1，4-葡聚糖鏈中的葡萄糖殘基的第6位，而生成分枝的酶。分支酶也被稱為1，4-α-葡聚糖分支酶，分枝產(chǎn)生酶或Q酶。
分支酶存在于微生物、動物和植物中。生成分支酶的微生物實例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草桿菌、熱容芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、液化淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、bacillus caldovelox、bacillusthermocatenulatus、bacillus smithii、巨大芽孢桿菌、短芽孢桿菌、alkalophillic bacillus sp、藍色鏈霉菌、aquifex aeolicus、synechosystissp.、大腸桿菌、根瘤土壤桿菌、水生棲熱桿菌、rhodothermusobamensis、粗糙脈孢菌、酵母等。生成分支酶的動物實例包括哺乳動物，如人類、兔、鼠、豬等。生成分支酶的植物實例包括藻類、塊莖蔬菜(如馬鈴薯、甘薯、山藥、天南星科植物、木薯等)、蔬菜(如菠菜等)、谷類(如玉蜀黍、稻、小麥、大麥、黑麥、粟等)等。生成分支酶的生物體并不局限于這些實例。
本發(fā)明可采用的分支酶優(yōu)選地來源自馬鈴薯、嗜熱脂肪芽孢桿菌或aquifex aeolicus，更優(yōu)選是嗜熱脂肪芽孢桿菌或Aquifex aeolicus。優(yōu)選地，本發(fā)明采用的分支酶具有高的最佳反應(yīng)溫度。例如，具有高的最佳反應(yīng)溫度的分支酶可來源自極端嗜熱細菌。
本發(fā)明可采用的分支酶可直接分離自存在于自然界中，并生成分支酶的上述微生物、動物和植物。
本發(fā)明可采用的分支酶可分離自微生物(如細菌、真菌等)，該微生物是通過利用編碼了分離自微生物、動物和植物的分支酶的基因進行基因重組而獲得。
分支酶可以與上述蔗糖磷酸化酶相同的方式從重組微生物中獲得。
與上述蔗糖磷酸化酶相似，通過考慮不同條件，如分支酶易表達性、易培養(yǎng)性、生長速率、安全性等，可容易地選擇出用于基因重組的微生物(如細菌、真菌等)。優(yōu)選地分支酶不含淀粉酶雜質(zhì)。因此，優(yōu)選地是在基因重組中采用不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)。對分支酶的基因重組而言，優(yōu)選采用的是中溫微生物，如大腸桿菌或枯草桿菌。由不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)生成的分支酶基本上不含淀粉酶，因而被優(yōu)選地采用在本發(fā)明方法中。
通過基因重組獲得的分支酶的生產(chǎn)和純化可通過與上述蔗糖磷酸化酶相似的方式進行。
相對于反應(yīng)開始時溶液中所含蔗糖而言，溶液中所含分支酶量代表性地為約10到約100,000U/g蔗糖，優(yōu)選為約100到約50,000U/g蔗糖，更優(yōu)選為約1,000到約10,000U/g蔗糖。如果分支酶量過多，反應(yīng)中變性的酶很可能凝集。采用的量過少時，則可能降低葡聚糖產(chǎn)率。
分支酶可以被純化，也可以不純化?？梢员还潭ǎ部梢圆还潭?。分支酶優(yōu)選地是固定的。就固定方法而言，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的載體結(jié)合方法(如共價結(jié)合方法、離子結(jié)合方法或物理吸附方法)、交聯(lián)法、包埋法(網(wǎng)格型或微囊型)等。分支酶優(yōu)選地是被固定在載體上。分支酶也可以被固定在與固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者中至少一個的載體相同的載體上，或另一個載體上，優(yōu)選地是被固定在與固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的載體相同的載體上。
(8)4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(EC.2.4.1.25)本發(fā)明方法中，當希望在產(chǎn)物中產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)時，如必要可利用4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明可采用的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶是可催化麥芽-低聚糖的糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)(歧化反應(yīng))的酶，該酶也被稱為歧化酶、D酶、麥芽糖轉(zhuǎn)葡萄糖基酶、歧化作用酶等。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶是可將糖基基團，或麥芽糖基或麥芽寡基單位從供體分子的非還原末端轉(zhuǎn)移到受體分子的非還原末端。因此，該酶反應(yīng)導(dǎo)致最初提供的麥芽-低聚糖的聚合程度的歧化作用。當供體分子與受體分子相同時，便發(fā)生分子內(nèi)轉(zhuǎn)移，使得產(chǎn)物中具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶存在于微生物和植物中。生成4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的微生物實例包括aquifex aeolicus、肺炎鏈球菌、丁酸梭菌、抗輻射奇異球菌、流感嗜血桿菌、結(jié)核分枝桿菌、海岸熱球菌、thermotogamaritima、thermotoga neapolitana、鸚鵡熱衣原體、火球菌屬、Dictyoglomus thermophilum、伯氏疏螺旋菌、Synechosystis sp.、大腸桿菌、水生棲熱桿菌等。生成4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的植物實例包括塊莖蔬菜(如馬鈴薯、甘薯、山藥、木薯等)、谷類(如玉蜀黍、稻、小麥等)、豆類(如豌豆、大豆等)等。生成4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的生物體并不局限于這些實例。
本發(fā)明可采用的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選地來源自馬鈴薯、水生棲熱桿菌或海岸熱球菌，更優(yōu)選馬鈴薯或水生棲熱桿菌。優(yōu)選地本發(fā)明采用的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶具有高的最佳反應(yīng)溫度。例如，具有高的最佳反應(yīng)溫度的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶可來源自極端嗜熱細菌。
本發(fā)明可采用的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶可直接分離自存在于自然界中，并生成4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的上述微生物和植物。
本發(fā)明可采用的分支酶可分離自微生物(如細菌、真菌等)，該微生物是通過利用編碼了分離自微生物和植物的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的基因進行基因重組而獲得的。
4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶可以與上述蔗糖磷酸化酶相同的方式從重組微生物中獲得。
與上述蔗糖磷酸化酶相似，通過考慮不同條件，如4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶易表達性、易培養(yǎng)性、生長速率、安全性等，可容易地選擇出用于基因重組的微生物(如細菌、真菌等)。優(yōu)選地4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶不含淀粉酶雜質(zhì)。因此，優(yōu)選地是在基因重組中采用不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)。對4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的基因重組而言，優(yōu)選采用的是中溫微生物，如大腸桿菌或枯草桿菌。由不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)生成的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶基本上不含淀粉酶，因而被優(yōu)選地采用在本發(fā)明方法中。
通過基因重組獲得的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)和純化可通過與上述蔗糖磷酸化酶相似的方式進行。
相對于反應(yīng)開始時溶液中所含蔗糖而言，溶液中所含4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶量代表性的為約0.05～1,000U/g蔗糖，優(yōu)選為約0.1～500U/g蔗糖，更優(yōu)選為約0.5～100U/g蔗糖。如果4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶量過多，反應(yīng)中變性的酶很可能凝集。采用的量過少時，則可能降低葡聚糖產(chǎn)率。
4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶可以被純化，也可以不純化?？梢员还潭?，也可以不固定。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選地是固定的。就固定方法而言，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的載體結(jié)合方法(如共價結(jié)合方法、離子結(jié)合方法或物理吸附方法)、交聯(lián)法、包埋法(網(wǎng)格型或微囊型)等。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選地是被固定在載體上。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶也可被固定在與固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者中至少一個的載體相同的載體上，或另一個載體上，優(yōu)選地是被固定在與固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的載體相同的載體上。
(9)糖原脫支酶(EC.2.4.1.25/EC.3.2.1.33)本發(fā)明方法中，當產(chǎn)物中產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)時，如必要可利用糖原脫支酶。
本發(fā)明可采用的糖原脫支酶是具有兩種類型活性的酶，即α-1，6-葡萄糖苷酶活性和4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性。由于4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性是糖原脫支酶所具有的，因此可獲得具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。
糖原脫支酶存在于微生物和動物中。生成糖原脫支酶的微生物實例包括酵母等。生成糖原脫支酶的動物實例包括哺乳動物，如人類、兔、鼠、豬等)。生成糖原脫支酶的生物體并不局限于這些實例。
本發(fā)明可采用的糖原脫支酶優(yōu)選地來源自酵母。優(yōu)選地本發(fā)明采用的糖原脫支酶具有高的最佳反應(yīng)溫度。例如，具有高的最佳反應(yīng)溫度的糖原脫支酶可通過利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對在中溫起作用的酶進行修飾而獲得。
本發(fā)明可采用的糖原脫支酶可直接分離自存在于自然界中，并生成糖原脫支酶的上述微生物和動物。
本發(fā)明可采用的糖原脫支酶可分離自微生物(如細菌、真菌等)，該微生物是通過利用編碼了分離自微生物和動物的糖原脫支酶的基因進行基因重組而獲得的。
糖原脫支酶可以與上述蔗糖磷酸化酶相同的方式從重組微生物中獲得。
與上述蔗糖磷酸化酶相似，通過考慮不同條件，如糖原脫支酶易表達性、易培養(yǎng)性、生長速率、安全性等，可容易地選擇出用于基因重組的微生物(如細菌、真菌等)。優(yōu)選地糖原脫支酶不含淀粉酶雜質(zhì)。因此，優(yōu)選地是在基因重組中采用不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)。對糖原脫支酶的基因重組而言，優(yōu)選采用的是中溫微生物，如大腸桿菌或枯草桿菌。由不生成或不表達，或者生成或表達低水平淀粉酶的微生物(如細菌、真菌等)生成的糖原脫支酶基本上不含淀粉酶，因而被優(yōu)選地采用在本發(fā)明方法中。
通過基因重組獲得的糖原脫支酶的生產(chǎn)和純化可通過與上述蔗糖磷酸化酶相似的方式進行。
相對于反應(yīng)開始時溶液中所含蔗糖而言，溶液中所含糖原脫支酶量代表性的為約0.01～5,000U/g蔗糖，優(yōu)選為約0.1～1,000U/g蔗糖，更優(yōu)選為約1～500U/g蔗糖。如果糖原脫支酶量過多，反應(yīng)中變性的酶很可能凝集。采用的量過少時，則可能降低葡聚糖產(chǎn)率。
糖原脫支酶可以被純化，也可以不純化?？梢员还潭?，也可以不固定。糖原脫支酶優(yōu)選地是固定的。就固定方法而言，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的載體結(jié)合方法(如共價結(jié)合方法、離子結(jié)合方法或物理吸附方法)、交聯(lián)法、包埋法(網(wǎng)格型或微囊型)等。糖原脫支酶優(yōu)選地是被固定在載體上。糖原脫支酶也可以被固定在與固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者中至少一個的載體相同的載體上，或另一個載體上，優(yōu)選地是被固定在與固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的載體相同的載體上。
(10)溶劑本發(fā)明方法中采用的溶劑可以是任何不削弱蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶活性的溶劑。
只要生成葡聚糖的反應(yīng)可以進行，就沒有必要使溶劑完全溶解本發(fā)明方法所采用的原料。例如，當由固體載體攜帶酶時，就沒有必要使酶溶解在溶劑中。此外，沒有必要溶解所有待反應(yīng)的原料，一部分原料溶解至某一可使反應(yīng)進行的程度即可。
代表性的溶劑是水。制備上述蔗糖磷酸化酶或葡聚糖磷酸化酶時，溶劑可為伴隨蔗糖磷酸化酶或葡聚糖磷酸化酶而獲得的被破壞細胞的溶液中的水。
水可為任何軟水、中層水(intermediate water)和硬水。軟水指硬度至少為20°的水。中層水指硬度至少為10°，并低于20°的水。硬水指硬度低于10°的水。優(yōu)選地水是軟水或中層水，更為優(yōu)選地是軟水。
(11)其它組分含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸的溶液可含有任何其它物質(zhì)，只要這些物質(zhì)不干擾蔗糖磷酸化酶和蔗糖之間的相互作用，和葡聚糖磷酸化酶和引物之間的相互作用即可。這種物質(zhì)的實例包括緩沖劑、可生成蔗糖磷酸化酶的微生物(如細菌、真菌等)組分、可生成葡聚糖磷酸化酶的微生物(如細菌、真菌等)組分、鹽類、培養(yǎng)基組分等。
<葡聚糖的生產(chǎn)>
本發(fā)明的葡聚糖是通過在含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液中進行反應(yīng)的步驟而生產(chǎn)的。
圖1用示意圖顯示本發(fā)明所采用的，從蔗糖合成葡聚糖。利用蔗糖磷酸化酶從蔗糖和無機磷酸鹽生成葡糖-1-磷酸。生成的葡糖-1-磷酸和添加至反應(yīng)溶液中的葡糖-1-磷酸被葡聚糖磷酸化酶立即轉(zhuǎn)移到合適的引物上，從而延伸了α-1，4-葡聚糖鏈。進一步地，該情況中生成的無機磷酸鹽被再次循環(huán)在蔗糖磷酸化酶反應(yīng)中。
首先制備反應(yīng)溶液。例如，可通過將固體蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶添加至合適的溶劑中而制得反應(yīng)溶液。可選的，通過將分別含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的諸多溶液混合而制得反應(yīng)溶液?？蛇x的，通過將含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶其中的一些組分的溶液與其它固體組分混合而制得反應(yīng)溶液。任何緩沖劑均可隨意地被添加至反應(yīng)溶液中，只要其不因調(diào)節(jié)pH而抑制酶反應(yīng)即可。選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和糖原脫支酶的酶可被隨意地添加至反應(yīng)溶液中。
其后，通過本領(lǐng)域已知的方法任意加熱使反應(yīng)溶液開始反應(yīng)。只要可獲得本發(fā)明的效果，反應(yīng)溫度可為任意溫度。反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液中蔗糖濃度約為5％到約100％時，反應(yīng)溫度可以代表性地約為40℃到約70℃。該反應(yīng)步驟中溶液溫度優(yōu)選地是在預(yù)定反應(yīng)時間結(jié)束后，溶液中所含蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶中的至少一者，更為優(yōu)選地是二者仍保留反應(yīng)前活性的至少約50％，更優(yōu)選至少約80％的溫度。該溫度優(yōu)選約為40℃到約70℃，更優(yōu)選約為45℃到約70℃，還要優(yōu)選約為45℃到約65℃。
應(yīng)當指出在上述第一種方法的情況中，即從反應(yīng)開始到結(jié)束，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例的最大值不超過約17時，反應(yīng)溫度應(yīng)低于上述范圍。在上述第四種方法的情況中，即反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液中蔗糖-磷酸鹽比例不超過約17時，以及在上述第五種方法的情況中，即包括將蔗糖、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸進一步添加至反應(yīng)溶液的步驟時，反應(yīng)溫度可以低于上述范圍。例如，反應(yīng)可在室溫進行，無需加熱。
通過考慮反應(yīng)溫度、通過反應(yīng)生成的葡聚糖的分子量、酶的剩余活性，可任意確定反應(yīng)時間。反應(yīng)時間代表性地約為1小時到約100小時，更優(yōu)選約為1小時到約72小時，更優(yōu)選約為2小時到約36小時，最為優(yōu)選約為2小時到約24小時。
加熱可通過任何方式進行。優(yōu)選地，邊攪拌邊進行加熱，以使整個溶液均一傳熱。將溶液置于例如，包括熱水夾套和攪拌設(shè)備的不銹鋼反應(yīng)罐中，并進行攪拌。
本發(fā)明方法中，當反應(yīng)進行至某種程度時，可將蔗糖、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶中的至少一種添加至反應(yīng)溶液。
如此，制得含葡聚糖的溶液。
反應(yīng)結(jié)束后，例如可于100℃任意加熱反應(yīng)溶液10分鐘，從而鈍化反應(yīng)溶液中的酶?？蛇x地，可進行其后的步驟，無需使酶鈍化的處理。反應(yīng)溶液可以無需改動地儲存，或經(jīng)過處理以分離生成的葡聚糖。
<純化方法>
如有必要可對制得的葡聚糖進行純化。通過純化除去的雜質(zhì)的一個實例是果糖。就純化葡聚糖方法的實例而言，有采用有機溶液的方法(T.J.Schoch et al.，J.American Chemical Society，64，2957(1942))和采用非有機溶液的方法。
采用有機溶劑純化可采用的有機溶劑實例包括丙酮、正戊醇、五唑、正丙醇、正己醇、2-乙基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、十二醇、環(huán)己醇、正丁醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、d，1-茨醇、α-萜品醇、異丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、3-戊醇、薄荷醇、甲醇、乙醇和乙醚。
下文將描述采用非有機溶劑的純化方法實例。
(1)一種于葡聚糖生成反應(yīng)后，通過冷卻反應(yīng)溶液以沉淀葡聚糖，并通過普通固-液分離方法，如膜分級分離、過濾、離心等方法對沉淀的葡聚糖進行處理，以純化葡聚糖的方法；(2)一種于葡聚糖生成反應(yīng)期間或之后冷卻反應(yīng)溶液以凝膠化葡聚糖，回收凝膠狀葡聚糖，并通過水洗滌、冷凍-融化、過濾等方法從凝膠狀葡聚糖中除去果糖的方法；及(3)一種于葡聚糖生成反應(yīng)后，通過利用超濾膜或?qū)游龇ㄟM行膜分級分離以除去果糖，并且無需使溶解于水中的葡聚糖沉淀的方法。
可被用于純化的超濾膜實例包括具有約1,000到約100,000，優(yōu)選約5,000到約50,000，更優(yōu)選約10,000到約30,000的分子量截留的超濾膜(由Daicel Chemical Industries Ltd.生產(chǎn)的UF膜單位)。
可被用于層析法的載體實例包括用于凝膠過濾層析法的載體、用于配位體交換層析法的載體、用于離子交換層析法的載體、和用于疏水層析法的載體。
(實施例)通過下列實施例將更詳細地描述本發(fā)明。本發(fā)明不僅限于下列實施例。
(1.用于測量和計算的方法)本發(fā)明的每種物質(zhì)均可通過下列測量方法測定。
(1.1葡萄糖的定量)采用商業(yè)可提供的測量試劑盒定量葡萄糖。該測量中，采用了葡萄糖AR-II顯色試劑(由Wako Pure Chemical Industires，Ltd.生產(chǎn))。
(1.2果糖的定量)采用商業(yè)可提供的測量試劑盒定量果糖。該測量中，采用了F-試劑盒D-葡萄糖/D-果糖(由Roche生產(chǎn))。
(1.3葡糖-1-磷酸的定量)采用下述方法定量葡糖-1-磷酸。將600μl含有被適當稀釋的葡糖-1-磷酸的溶液添加至300μl的測量試劑中(200mM Tris-HCl(pH7.0)、3mM NADP、15mM氯化鎂、3mM EDTA、15μM葡萄糖-1，6-二磷酸鹽、6μg/ml葡糖磷酸變位酶、6μg/ml葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶)，繼而進行攪拌以獲得反應(yīng)體系。將該反應(yīng)體系于30℃下保持30分鐘。其后，利用分光光度計在340nm測量吸光度。以相似方式測量已知濃度的葡糖-1-磷酸鈉的吸光度，制得標準曲線。將獲得自樣品的吸光度對照于標準曲線，以測定出樣品的葡糖-1-磷酸濃度。典型地，將每分鐘生成1μmol葡糖-1-磷酸的活性定義為一個單位。該定量方法僅可定量葡糖-1-磷酸，而不適用于定量無機磷酸鹽。
(1.4無機磷酸鹽的定量)無機磷酸鹽是通過下述方法定量的，其中無機磷酸鹽被認為是磷酸鹽離子。使含有無機磷酸鹽的溶液(200μl)與800μl鉬試劑(15mM鉬酸銨、100mM醋酸鋅)混合，并添加200μl 568mM的抗壞血酸維生素C(pH5.0)，繼而進行攪拌，獲得反應(yīng)體系。將該反應(yīng)體系于30℃下保持20分鐘。其后，利用分光光度計在850nm測量吸光度。以相似方式測量已知濃度的無機磷酸鹽的吸光度，制得標準曲線。將獲得自樣品的吸光度對照于標準曲線，以測定出樣品的無機磷酸鹽濃度。該定量方法可定量無機磷酸鹽，而不適用于葡糖-1-磷酸。
(1.5計算葡聚糖產(chǎn)量的方法)以無機磷酸鹽為起始物質(zhì)生產(chǎn)的葡聚糖的產(chǎn)量是從反應(yīng)結(jié)束后溶液中所含蔗糖、果糖和葡糖-1-磷酸的量，并利用下述公式計算而來的。
(葡聚糖(mM葡萄糖當量))＝(果糖(mM))-(葡糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))該公式基于下述原理。
本發(fā)明方法中，最初可發(fā)生下述公式表示的反應(yīng)(A)。
(A)蔗糖+無機磷酸鹽→葡糖-1-磷酸+果糖該反應(yīng)由蔗糖磷酸化酶催化。該反應(yīng)中，蔗糖與無機磷酸鹽反應(yīng)而產(chǎn)生等摩爾量的葡糖-1-磷酸和果糖。產(chǎn)生的果糖不再與其它物質(zhì)反應(yīng)。因此，通過測定果糖的摩爾量，可以測定產(chǎn)生的葡糖-1-磷酸的摩爾量。
除上述反應(yīng)(A)以外，蔗糖磷酸化酶可在作為副反應(yīng)的下述反應(yīng)(B)中催化蔗糖的水解。
(B)蔗糖→葡萄糖+果糖被帶入葡聚糖的葡萄糖的量可通過下述公式計算(被帶入葡聚糖的葡萄糖的量)＝(由反應(yīng)A生成的葡糖-1-磷酸的量)-(未反應(yīng)的葡糖-1-磷酸的量)＝(由反應(yīng)A生成的果糖的量)-(未反應(yīng)的葡糖-1-磷酸的量)。
考慮反應(yīng)(B)中產(chǎn)生的果糖，由反應(yīng)A生成的果糖的量可通過下述公式計算(由反應(yīng)A生成的果糖的量)＝(反應(yīng)結(jié)束后果糖的量)-(反應(yīng)結(jié)束后葡萄糖的量)。
因此，通過下述公式可獲得葡聚糖產(chǎn)量。
(葡聚糖(mM葡萄糖當量))＝(果糖(mM))-(葡糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))以葡糖-1-磷酸為起始物質(zhì)生產(chǎn)的葡聚糖的產(chǎn)量是從葡糖-1-磷酸的初始量，及反應(yīng)結(jié)束后溶液中所含葡萄糖、果糖和葡糖-1-磷酸的量，并利用下述公式計算而來的。
(葡聚糖(mM葡萄糖當量))＝(初始葡糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM))-(葡萄糖(mM))-(反應(yīng)后的葡糖-1-磷酸(mM))該公式基于下述原理。
反應(yīng)溶液中，除了初始葡糖-1-磷酸以外，反應(yīng)A也產(chǎn)生葡糖-1-磷酸。因此，初始葡糖-1-磷酸和生成的葡糖-1-磷酸可用于合成葡聚糖。通過從可合成葡聚糖的葡糖-1-磷酸的量減去反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)溶液中仍保留的葡糖-1-磷酸的量，可計算出反應(yīng)中被利用的葡糖-1-磷酸的量，即帶入葡聚糖的葡萄糖的量。因此，通過上述公式可獲得帶入葡聚糖的葡萄糖的量。應(yīng)當指出，該公式可適用于在SP-GP反應(yīng)體系中，無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸均被用作起始物質(zhì)的情況。
(1.6葡聚糖產(chǎn)率)以無機磷酸鹽為起始物質(zhì)生產(chǎn)的葡聚糖的產(chǎn)率可通過下述公式獲得。
(葡聚糖產(chǎn)率(％))＝(葡聚糖(mM葡萄糖當量))/(初始蔗糖(mM))×100以葡糖-1-磷酸為起始物質(zhì)生產(chǎn)的葡聚糖的產(chǎn)率可通過下述公式獲得。
(葡聚糖產(chǎn)率(％))＝{(初始葡糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM))-(葡萄糖(mM))-(反應(yīng)后的葡糖-1-磷酸(mM))}/{(初始蔗糖(mM))+(初始葡糖-1-磷酸(mM))}×100應(yīng)當指出該公式可適用于在SP-GP反應(yīng)體系中，無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸均被用作起始物質(zhì)的情況中。
(1.7葡聚糖磷酸化酶活性的測量)葡聚糖磷酸化酶的活性單位可通過下述方法測定。
將50μl 4％的成團糊精水溶液與50μl 50mM的葡糖-1-磷酸鈉的水溶液混合，并進一步添加100μl經(jīng)適當稀釋的酶液，以開始反應(yīng)。使混合物于37℃反應(yīng)15分鐘。其后，添加10μl 20％的SDS以終止反應(yīng)。其后，通過上文1.4所描述的方法檢定反應(yīng)溶液中無機磷酸鹽的量。該方法中，每分鐘生成1μmol無機磷酸鹽的活性被定義為一個單位。在來源自水生棲熱桿菌的葡聚糖磷酸化酶的情況中，葡聚糖磷酸化酶的活性是通過在50℃反應(yīng)而測量的，而不是在37℃。
(1.8蔗糖磷酸化酶活性的測量)蔗糖磷酸化酶活性可通過下述方法獲得。
將25μl 10％的蔗糖溶液與20μl 500mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)混合。將5μl經(jīng)適當稀釋，并已除去不溶性蛋白質(zhì)的酶液添加至該混合物中，繼而進行攪拌以獲得反應(yīng)體系。使該反應(yīng)體系在37℃反應(yīng)20分鐘。其后，在100℃加熱該反應(yīng)體系5分鐘，以終止反應(yīng)。其后，對反應(yīng)后溶液中的葡糖-1-磷酸進行定量。典型地，每分鐘生成1μmol葡糖-1-磷酸的活性被定義為一個單位。
(2.酶的制備)本發(fā)明實施例中所采用的各種酶是通過下述相應(yīng)的方法制備而得。
(2.1制備來源自馬鈴薯塊莖的葡聚糖磷酸化酶的方法)將1.4公斤的商業(yè)可應(yīng)用馬鈴薯塊莖削皮。利用榨汁機磨碎去皮的塊莖，以獲得汁液。其后，用紗布過濾汁液以獲得濾清。在該濾清中添加Tris緩沖溶液(pH7.0)至終濃度為100mM，以獲得酶液。將該酶液置于55℃水浴中，液體溫度達到50℃后加熱10分鐘。加熱后，利用離心機(AVANTI J-25I；由Beckman生產(chǎn))在8,500rpm離心該酶液20分鐘，以除去不溶性蛋白質(zhì)等，從而獲得上清液。
向所獲的上清液中添加硫酸銨至100g/L。將混合物于4℃靜置2小時，沉淀蛋白質(zhì)。其后，利用離心機(AVANTI J-25I；由Beckman生產(chǎn))在8,500rpm離心該混合物20分鐘，以除去不溶性蛋白質(zhì)等，從而獲得上清液。進一步地，向所獲得的上清液中添加硫酸銨至終濃度為250g/L。將混合物于4℃靜置2小時，沉淀蛋白質(zhì)。其后，利用離心機(AVANTI J-25I；由Beckman生產(chǎn))在8,500rpm離心該混合物20分鐘，以回收不溶性蛋白質(zhì)。
將回收的不溶性蛋白質(zhì)懸浮于150ml 25mM Tris緩沖溶液中(pH7.0)。在相同緩沖溶液中對懸浮酶液透析過夜。透析后，使預(yù)平衡過的Q-瓊脂糖凝膠陰離子交換樹脂(由Pharmacia生產(chǎn))吸附樣品，繼而采用含200mM氯化鈉的緩沖溶液進行洗滌。其后，采用含400mM氯化鈉的緩沖溶液洗脫蛋白質(zhì)，并回收洗脫液。洗脫液被稱為含有馬鈴薯塊莖來源的、被部分純化的葡聚糖磷酸化酶的溶液。
在一些購買的馬鈴薯中，本發(fā)明可采用的含葡聚糖磷酸化酶的溶液可于該階段獲得，但在大多數(shù)情況中，需要進一步地純化。如有必要，將采用Sephacryl S-200HR(由Pharmacia生產(chǎn))等的凝膠過濾層析法進行分級分離的方法，和采用Phenyl-TOYOPEARL 650M(由Tosoh Corporation生產(chǎn))等的疏水層析法進行分級分離的方法結(jié)合起來，從而有可能獲得純化的含馬鈴薯葡聚糖磷酸化酶的溶液。
(2.2制備重組馬鈴薯葡聚糖磷酸化酶的方法)將馬鈴薯葡聚糖磷酸化酶基因(Nakano et al.，Journal ofBiochemistry(Tokyo)106(1989)691)和可選擇的標記基因Ampr整合進表達載體pET34(由STRATAGENE生產(chǎn))，以獲得質(zhì)粒pET-PGP113。該質(zhì)粒中，在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)啟動子的控制下，可操作地連接葡聚糖磷酸化酶基因。通過適當?shù)募毎椒▽⒃撡|(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌TG-1(由STRATAGENE生產(chǎn))。將該大腸桿菌覆蓋于含有抗生素氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物(均由Difco生產(chǎn))，1％氯化鈉，1.5％瓊脂)上，繼而在37℃培養(yǎng)過夜。通過對該平板上生長的大腸桿菌進行選擇，可獲得具有導(dǎo)入的馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶基因的大腸桿菌。對該導(dǎo)入基因的序列進行的分析證實所獲得的大腸桿菌具有葡聚糖磷酸化酶基因。進一步地，測量葡聚糖磷酸化酶的活性，證實所獲得的大腸桿菌表達葡聚糖磷酸化酶。
將該大腸桿菌接種至含抗生素氨芐青霉素的一升LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物(均由Difco生產(chǎn))，1％氯化鈉)中，繼而于37℃，120rpm震蕩培養(yǎng)3小時。其后，將IPTG和吡哆醇添加至培養(yǎng)基中，所得濃度分別為0.1mM和1mM，繼而進一步于22℃震蕩培養(yǎng)20小時。其后，于5,000rpm離心培養(yǎng)物5分鐘，以收集大腸桿菌細胞。將所獲細胞懸浮在含0.05％ Triton X-100的50ml 20mMTris-HCl緩沖溶液(pH7.0)中。繼而通過超聲處理破壞，以獲得50ml被破壞的細菌細胞的溶液。該被破壞的細菌細胞的溶液含4.7U/mg葡聚糖磷酸化酶。
將該被破壞的細菌細胞的溶液于55℃加熱30分鐘。加熱后，于8,500rpm離心該液體20分鐘以除去不可溶蛋白質(zhì)等，從而獲得上清液。將所獲上清液通過預(yù)平衡過的Q-瓊脂糖陰離子交換樹脂，使得葡聚糖磷酸化酶可被吸附在樹脂上。采用含200mM氯化鈉的緩沖溶液洗滌樹脂，以除去雜質(zhì)。其后，采用含300mM氯化鈉的緩沖溶液洗脫蛋白質(zhì)。所獲洗脫物被稱為重組葡聚糖磷酸化酶溶液。
(2.3制備水生棲熱桿菌葡聚糖磷酸化酶的方法)通過Takaha等人的方法(J.Appl.Glycosci.，48(1)(2001)71)制備的酶被稱為水生棲熱桿菌葡聚糖磷酸化酶。
(2.4制備重組水生棲熱桿菌葡聚糖磷酸化酶的方法)
將水生棲熱桿菌葡聚糖磷酸化酶基因(J.Appl.Glycosci.，48(1)(2001)71)和可選擇的標記基因Ampr和Tetr整合進pKK388-1(由CLONTECH生產(chǎn))，以獲得質(zhì)粒pKK388-GP。該質(zhì)粒中，在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)啟動子的控制下，可操作地連接葡聚糖磷酸化酶基因。通過適當?shù)募毎椒▽⒃撡|(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌MC1061(由Pharmacia生產(chǎn))。將該大腸桿菌覆蓋于含抗生素氨芐青霉素和IPTG的LB培養(yǎng)基平板上，繼而在37℃培養(yǎng)過夜。通過對該平板上生長的大腸桿菌進行選擇，可獲得具有導(dǎo)入的葡聚糖磷酸化酶基因的大腸桿菌。對該導(dǎo)入基因的序列進行的分析證實所獲得的大腸桿菌具有葡聚糖磷酸化酶基因。進一步地，測量葡聚糖磷酸化酶的活性，證實所獲得的大腸桿菌表達葡聚糖磷酸化酶。
將該大腸桿菌接種至含抗生素氨芐青霉素的一升LB培養(yǎng)基中，繼而于37℃，120rpm震蕩培養(yǎng)4-5小時。其后，將IPTG添加至培養(yǎng)基中，所得濃度為0.01mM，繼而進一步于37℃震蕩培養(yǎng)20小時。其后，于5,000rpm離心培養(yǎng)物5分鐘，以收集大腸桿菌細胞。
將所獲細胞懸浮在50ml 20mM Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0)中，繼而通過超聲處理破壞，以獲得50ml被破壞的細菌細胞的溶液。該被破壞的細菌細胞的溶液含4.2U/mg葡聚糖磷酸化酶。
其后，將該被破壞的細菌細胞的液體于70℃加熱30分鐘。加熱后，利用離心機(AVANTI J-25I；由Beckman生產(chǎn))于8,500rpm離心該液體20分鐘以除去不可溶蛋白質(zhì)等，從而獲得上清液。所獲上清液被稱為重組水生棲熱桿菌葡聚糖磷酸化酶溶液。
(2.5制備重組變異鏈球菌蔗糖磷酸化酶的方法)將變異鏈球菌蔗糖磷酸化酶基因(Ferretti，J.J.et al.，Ingbritt.Infect.Immun.561585-88)和可選擇的標記基因Ampr和Tetr整合進pKK388-1，以獲得質(zhì)粒pKK388-SMSP。該質(zhì)粒中，在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)啟動子的控制下，可操作地連接蔗糖磷酸化酶基因。通過適當?shù)募毎椒▽⒃撡|(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌TG-1(由STRATAGENE生產(chǎn))。將該大腸桿菌覆蓋于含抗生素氨芐青霉素和IPTG的LB培養(yǎng)基平板上，繼而在37℃培養(yǎng)過夜。通過對該平板上生長的大腸桿菌進行選擇，可獲得具有導(dǎo)入的蔗糖磷酸化酶基因的大腸桿菌。對該導(dǎo)入基因的序列進行的分析證實所獲得的大腸桿菌具有蔗糖磷酸化酶基因。進一步地，測量蔗糖磷酸化酶的活性，證實所獲得的大腸桿菌表達蔗糖磷酸化酶。
將該大腸桿菌接種至含抗生素氨芐青霉素和四環(huán)素的一升LB培養(yǎng)基中，繼而于37℃，120rpm震蕩培養(yǎng)6-7小時。其后，將IPTG添加至培養(yǎng)基中，所得濃度為0.04mM，繼而進一步于30℃震蕩培養(yǎng)18小時。其后，于5,000rpm離心培養(yǎng)物5分鐘，以收集大腸桿菌細胞。將所獲細胞懸浮在50ml 20mM Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0)中，繼而通過超聲處理破壞，以獲得50ml被破壞的細菌細胞的溶液。該被破壞的細菌細胞的溶液含10U/mg蔗糖磷酸化酶。
其后，將蔗糖添加至該被破壞的細菌細胞的溶液中，以獲得含10％蔗糖的被破壞的細菌細胞的溶液。將該被破壞的細菌細胞的溶液于55℃加熱30分鐘。加熱后，利用離心機(AVANTI J-25I；由Beckman生產(chǎn))于8,500rpm離心該被破壞的細菌細胞的溶液20分鐘，以除去不可溶蛋白質(zhì)等，從而獲得上清液。所獲上清液被稱為重組水生棲熱桿菌葡聚糖磷酸化酶溶液。將所獲上清液通過預(yù)平衡過的Q-瓊脂糖陰離子交換樹脂，使得蔗糖磷酸化酶可被吸附在樹脂上。采用含100mM氯化鈉的緩沖溶液洗滌樹脂，以除去雜質(zhì)。其后，采用含300mM氯化鈉的緩沖溶液洗脫蛋白質(zhì)。所獲洗脫物被稱為變異鏈球菌蔗糖磷酸化酶溶液。
(2.6制備重組嗜熱脂肪芽孢桿菌葡聚糖磷酸化酶)通過Takata等人的方法(J.Ferment.Bioeng.，85(2)，156(1998))制備的酶被稱為重組嗜熱脂肪芽孢桿菌葡聚糖磷酸化酶。
(3.測量葡聚糖的分子量)通過下述方法測量本發(fā)明中合成的葡聚糖的分子量。
將本發(fā)明合成的葡聚糖完全溶解在1N氫氧化鈉中，繼而采用合適量的鹽酸中和。其后，使約300μg葡聚糖經(jīng)過凝膠過濾層析法，和差示折光計與多角度光散射檢測器，以獲得平均分子量。
特定地，以Shodex SB806M-HQ(由Showa Denko K.K.生產(chǎn))為柱。就檢測器而言，采用多角度光散射檢測器(DAWN-DSP，由WyattTechnology生產(chǎn))和差示折光計(Shodex RI-71，由Showa Denko K.K.生產(chǎn))，并以此次序連接。將柱保持在40℃，并以0.1M亞硝酸鈉溶液為洗脫液，流速為1mL/分鐘。收集所獲得的信號，并通過數(shù)據(jù)分析軟件分析，以計算平均分子量。
(比較實施例0-1和0-2反應(yīng)溫度分別為37℃和45℃時，產(chǎn)率之間的比較)比較實施例0-1和0-2中采用的反應(yīng)溶液，在反應(yīng)開始時，反應(yīng)溶液組成如下表1所示。
表1

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，將蔗糖、無機磷酸鹽、腸系膜狀明串珠菌蔗糖磷酸化酶(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產(chǎn))、上文2.1中制備的馬鈴薯塊莖來源的葡聚糖磷酸化酶、麥芽七糖溶解在100mM檸檬酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，結(jié)果獲得含4％蔗糖、20mM無機磷酸鹽、10U/g蔗糖的腸系膜狀明串珠菌蔗糖磷酸化酶、10U/g蔗糖的馬鈴薯塊莖來源的葡聚糖磷酸化酶、和2mM麥芽七糖的溶液。使該溶液在37℃(比較實施例0-1)或45℃(比較實施例0-2)反應(yīng)18小時，從而合成直鏈淀粉。反應(yīng)體積為1ml。
反應(yīng)后，以上文1.6中描述的方式測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖2所示。
本說明書中，利用腸系膜狀明串珠菌蔗糖磷酸化酶(購自O(shè)rientalYeast Co.，Ltd.)、馬鈴薯塊莖來源葡聚糖磷酸化酶，和4％蔗糖于37℃生產(chǎn)直鏈淀粉的方法被稱為常規(guī)方法。
如圖2所示，盡管在37℃進行反應(yīng)時直鏈淀粉產(chǎn)率為79％，在45℃進行反應(yīng)時直鏈淀粉產(chǎn)率卻低到33.8％。
因此，常規(guī)方法的底物濃度在工業(yè)上不利于高溫下直鏈淀粉的生產(chǎn)。采用的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶的最佳溫度為約37℃。因此，該酶被認為具有低水平的耐熱性。高溫時直鏈淀粉的低產(chǎn)率被認為應(yīng)歸因于酶的低耐熱性。
(實施例1-1到1-5和比較實施例1-1采用不同蔗糖濃度和高的反應(yīng)溫度合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表2所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表2

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖3所示。
蔗糖濃度從常規(guī)方法所采用的4％(比較實施例1-1)增加到至少8％(實施例1-1到1-5)，使得在45℃實現(xiàn)反應(yīng)是可能的。因此，直鏈淀粉的產(chǎn)率增加了。
特定地，在上述條件下，不改變底物(即蔗糖、麥芽七糖和無機磷酸鹽)之間的比例和酶量，而蔗糖濃度在8％和25％之間變化，以使直鏈淀粉產(chǎn)率增加。如圖3所示，在45℃，蔗糖濃度為8％時，產(chǎn)率為76.4％。這一產(chǎn)率是在45℃、蔗糖濃度為4％時所得產(chǎn)率的至少兩倍，以致獲得了基本上與常規(guī)方法所得相同的產(chǎn)率。當蔗糖濃度至少為15％時，直鏈淀粉產(chǎn)率基本上為100％。因此在45℃，從蔗糖合成直鏈淀粉的情況中，低的蔗糖濃度導(dǎo)致低的產(chǎn)率和低效率，而較高的蔗糖濃度可使工業(yè)生產(chǎn)在45℃進行。
(實施例2-1到2-5和比較實施例2-1到2-7采用少量的酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表3所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表3

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，在實施例2-1到2-5和比較實施例2-1到2-7中，酶量是比較實施例1-1和實施例1-1到1-5中酶量的一半，并且反應(yīng)在37℃和45℃進行。除此而外，以與比較實施例1-1和實施例1-1到1-5相同的方式進行每例直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖4所示。
當蔗糖濃度至少為15％時，45℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率不低于37℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率。
如圖4所示，在這些條件下，盡管常規(guī)方法所得直鏈淀粉的產(chǎn)率約為60％，而蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為45℃時，產(chǎn)率卻低至22.1％。然而不改變底物(即蔗糖、麥芽七糖和無機磷酸鹽)之間的比例和酶量，而蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，45℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。在蔗糖濃度至少為15％，反應(yīng)溫度為45℃的反應(yīng)情況中，直鏈淀粉的產(chǎn)率高于37℃時所得產(chǎn)率。因此，當反應(yīng)在蔗糖濃度至少為15％的條件下進行時，不僅可使反應(yīng)在45℃進行，也可實現(xiàn)比37℃反應(yīng)所得產(chǎn)率高的產(chǎn)率。
(實施例3-1-1到3-2-5和比較實施例3-1-1和3-2-1采用耐熱蔗糖磷酸化酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表4所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表4


G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，采用根據(jù)上文2.5的內(nèi)容所得10U/g蔗糖(活性單位)的變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶替代腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶，采用10U/g蔗糖(活性單位)的葡聚糖磷酸化酶，在45℃或50℃進行酶反應(yīng)。除此而外，以與比較實施例2-1和實施例2-1到2-5相同的方式進行比較實施例3-1-1和3-2-1和實施例3-1-1到3-2-5中直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖5所示。
即使蔗糖磷酸化酶從常規(guī)方法所采用的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶改變?yōu)樽儺愭溓蚓鷣碓吹恼崽橇姿峄笗r，反應(yīng)溫度為45℃時仍可生成直鏈淀粉。
進一步地，當蔗糖磷酸化酶從常規(guī)方法所采用的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶改變?yōu)樽儺愭溓蚓鷣碓吹恼崽橇姿峄?，并且蔗糖濃度?％增加到至少8％時，50℃下高效的反應(yīng)是可能的，從而增加直鏈淀粉的產(chǎn)率。
如圖5所示，當反應(yīng)溫度為45℃，蔗糖濃度為4％時，直鏈淀粉產(chǎn)率為97.4％。進一步地，即使不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，直鏈淀粉的產(chǎn)率始終處于較高的水平上。因此，當蔗糖磷酸化酶為變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶時，在45℃進行高效的直鏈淀粉生產(chǎn)是可能的。
進一步地，如圖5所示，當反應(yīng)溫度為50℃，蔗糖濃度為4％時，直鏈淀粉的產(chǎn)率低至21.8％。然而，當不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，直鏈淀粉的產(chǎn)率是增加的。蔗糖濃度為8％時，產(chǎn)率為55.4％，該產(chǎn)率是蔗糖濃度為4％時所得產(chǎn)率的至少兩倍。當蔗糖濃度為至少15％時，直鏈淀粉產(chǎn)率基本上為100％。因此，盡管蔗糖濃度為4％，且反應(yīng)溫度為50℃時，合成直鏈淀粉的產(chǎn)率低且無效，但是通過利用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶，并增加蔗糖濃度，仍可能在50℃進行高效的直鏈淀粉生產(chǎn)。
(實施例4-1-1到4-2-5，和比較實施例4-1-1和4-2-1采用少量酶和耐熱蔗糖磷酸化酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表5所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表5

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶
GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，酶量是比較實施例3-1-1和實施例3-2-1及實施例3-1-1到3-2-5中酶量的一半。除此而外，以與比較實施例3-1-1和3-2-1及實施例3-1-1到3-2-5相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖6所示。
當蔗糖磷酸化酶從常規(guī)方法所采用的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶改變?yōu)樽儺愭溓蚓鷣碓吹恼崽橇姿峄?，并且酶量是常?guī)方法中酶量的一半時，在50℃反應(yīng)所得直鏈淀粉的產(chǎn)率不低于在45℃反應(yīng)，且蔗糖濃度至少為15％時所得直鏈淀粉的產(chǎn)率。
如圖6所示，盡管在45℃，蔗糖濃度為4％時所得直鏈淀粉產(chǎn)率約為50％，但是在50℃，蔗糖濃度為4％時所得直鏈淀粉產(chǎn)率卻低至9.2％。然而，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，在50℃進行反應(yīng)所獲得直鏈淀粉的產(chǎn)率是增加的。當蔗糖濃度至少為15％時，在50℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率高于在45℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。如此，當采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶，并且蔗糖濃度至少為15％時，不僅可使反應(yīng)在50℃進行，還可實現(xiàn)比在45℃反應(yīng)所得產(chǎn)率高的產(chǎn)率。
(實施例5-1到5-5和比較實施例5-1采用腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和極端嗜熱細菌來源的葡聚糖磷酸化酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表6所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表6


G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶GP水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，采用水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶取代馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶。除此而外，以與比較實施例1-1和實施例1-1到1-5相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖7所示。
當采用水生棲熱桿菌來源的蔗糖磷酸化酶，且蔗糖濃度從常規(guī)方法中的4％增加到至少8％時，反應(yīng)可以在45℃進行，以致直鏈淀粉的產(chǎn)率是增加的。
特定地，在上述條件下，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，直鏈淀粉的產(chǎn)率是增加的。如圖7所示，盡管當蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為45℃時，產(chǎn)率為28.0％，但蔗糖濃度為8％時，產(chǎn)率為69.0％。進一步地，當蔗糖濃度至少為15％時，直鏈淀粉產(chǎn)率基本上為100％。因此，證實當采用水生棲熱桿菌(極端嗜熱細菌)來源的葡聚糖磷酸化酶取代馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶時，直鏈淀粉可在45℃生成。
(實施例6-1到6-5和比較實施例6-1到6-7采用腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和極端嗜熱細菌來源的葡聚糖磷酸化酶，及少量的酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表7所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表7

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶GP水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，在實施例6-1到6-5和比較實施例6-1到6-7中，酶量為實施例5-1到5-5和比較實施例5-1中酶量的一半，并且反應(yīng)在37℃和45℃進行。除此而外，以與實施例5-1到5-5和比較實施例5-1相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖8所示。
當采用水生棲熱桿菌來源的蔗糖磷酸化酶，且蔗糖濃度至少為15％，反應(yīng)溫度為45℃時，所得直鏈淀粉產(chǎn)率高于在37℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。
如圖8所示，在這些條件下，盡管對常規(guī)方法而言，直鏈淀粉產(chǎn)率為34.2％，但是蔗糖濃度為4％，且反應(yīng)溫度為45℃時，產(chǎn)率卻低至15.6％。然而，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化，反應(yīng)溫度為45℃時，直鏈淀粉的產(chǎn)率是增加的。當蔗糖濃度至少為15％，且反應(yīng)溫度為45℃時，反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率高于在37℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。因此，當采用水生棲熱桿菌(極端嗜熱細菌)來源的葡聚糖磷酸化酶取代馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖濃度至少為15％時進行反應(yīng)，不僅可使反應(yīng)在45℃進行，還可實現(xiàn)比在37℃反應(yīng)所得產(chǎn)率高的產(chǎn)率。
(實施例7-1到7-5和比較實施例7-1采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和極端嗜熱細菌來源的葡聚糖磷酸化酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表8所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表8

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，采用根據(jù)上文2.4內(nèi)容所獲得的水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶取代馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶。除此而外，在比較實施例7-1和實施例7-1到7-5中，以與比較實施例3-2-1和實施例3-2-1到3-2-5相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖9所示。
當蔗糖磷酸化酶從常規(guī)方法所采用的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶改變?yōu)樽儺愭溓蚓鷣碓吹恼崽橇姿峄?，而馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶改變?yōu)樗鷹珶釛U菌來源的葡聚糖磷酸化酶，并且蔗糖濃度從4％增加到至少8％時，反應(yīng)可在50℃進行，并且直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。
特定地，在上述條件下，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。如圖9所示，盡管蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為50℃時，產(chǎn)率為56.2％，但是蔗糖濃度為8％，反應(yīng)溫度為50℃時，產(chǎn)率為78.4％，蔗糖濃度為15％時，產(chǎn)率基本上為100％。因此，當蔗糖磷酸化酶改變?yōu)樽儺愭溓蚓鷣碓吹恼崽橇姿峄福暇厶橇姿峄父淖優(yōu)樗鷹珶釛U菌來源的葡聚糖磷酸化酶時，直鏈淀粉的生產(chǎn)是可能在50℃進行的。
(實施例8-1-1到8-2-5及比較實施例8-1-1和8-2-1采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和極端嗜熱細菌來源的葡聚糖磷酸化酶，以及少量的酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表9所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表9


G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，酶量是比較實施例7-1和實施例7-1到7-5中酶量的一半，并且反應(yīng)溫度為45℃和50℃。除此而外，以與比較實施例7-1和實施例7-1到7-5相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖10所示。
當蔗糖磷酸化酶從常規(guī)方法所采用的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶改變?yōu)樽儺愭溓蚓鷣碓吹恼崽橇姿峄?，而馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶改變?yōu)樗鷹珶釛U菌來源的葡聚糖磷酸化酶，并且酶量為常規(guī)方法中所采用酶量的一半，蔗糖濃度至少為15％，在50℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率高于在45℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。
如圖10所示，盡管蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為45℃時，產(chǎn)率為48.9％，但是蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為50℃時，產(chǎn)率卻低至21.5％。然而，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，在50℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。當蔗糖濃度至少為15％時，在50℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率高于在45℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。因此，當采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶，蔗糖濃度至少為15％時進行反應(yīng)，不僅可使反應(yīng)在50℃進行，還可實現(xiàn)比在45℃反應(yīng)所得產(chǎn)率高的產(chǎn)率。
(實施例9-1到9-5和比較實施例9-1采用腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶合成直鏈淀粉)
采用組成(反應(yīng)開始時)如下表10所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表10

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶GP嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，采用嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶取代水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶。除此而外，以與比較實施例5-1和實施例5-1到5-5相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖11所示。
當采用嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖濃度從常規(guī)方法所采用的4％增加到至少8％時，反應(yīng)可以在45℃進行，并且直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。
特定地，在上述條件下，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。如圖11所示，盡管蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為45℃時，產(chǎn)率為40.7％，但是蔗糖濃度為8％，反應(yīng)溫度為45℃時，產(chǎn)率卻為70.6％。進一步地，當蔗糖濃度至少為15％時，直鏈淀粉產(chǎn)率約為90％。如此證實當采用嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶取代馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶時，直鏈淀粉合成可以在45℃進行。
(實施例10-1到10-5和比較實施例10-1到10-7采用腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶，以及少量的酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表11所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表11

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶GP嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，在實施例10-1到10-5和比較實施例10-1到10-7中，酶量為比較實施例9-1和實施例9-1到9-5中酶量的一半，在反應(yīng)溫度為37℃和45℃進行反應(yīng)。除此而外，以與比較實施例9-1和實施例9-1到9-5相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖12所示。
當采用嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖濃度至少為15％時，在45℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率不低于在37℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。
如圖12所示，在這些條件下，盡管對常規(guī)方法而言，直鏈淀粉產(chǎn)率為60.2％，但是蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為45℃時，產(chǎn)率卻低至22.1％。然而，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，在45℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。當蔗糖濃度至少為15％時，在45℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率高于在37℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。因此，當采用嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶取代馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖濃度至少為15％時，不僅可以在45℃進行反應(yīng)，還可實現(xiàn)比在37℃反應(yīng)所得產(chǎn)率高的產(chǎn)率。
(實施例11-1到11-5和比較實施例11-1采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表12所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表12

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶
GP嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，采用根據(jù)上文2.5中內(nèi)容獲得的變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶取代腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶，在50□進行酶反應(yīng)。除此而外，在比較實施例11-1和實施例11-1到11-5中，以與比較實施例9-1和實施例9-1到9-5相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖13所示。
當蔗糖磷酸化酶從常規(guī)方法所采用的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶改變?yōu)樽儺愭溓蚓鷣碓吹恼崽橇姿峄福荫R鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶改變?yōu)槭葻嶂狙挎邨U菌來源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖濃度從4％增加到至少8％，在50℃進行反應(yīng)時，直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。
特定地，在上述條件下，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。如圖13所示，盡管蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為50℃時，產(chǎn)率為39.1％，但是蔗糖濃度為8％，反應(yīng)溫度為50℃時，產(chǎn)率卻為70.4％，并且蔗糖濃度為15％時，直鏈淀粉產(chǎn)率至少為90％。因此，當以變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶為蔗糖磷酸化酶，以嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶為葡聚糖磷酸化酶時，在50℃進行直鏈淀粉的生產(chǎn)是可能的。
(實施例12-1-1到12-2-5和比較實施例12-1-1和12-2-1采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶，以及少量的酶合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表13所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表13

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，酶量是比較實施例11-1和實施例11-1到11-5中酶量的一半，反應(yīng)溫度為45℃和50℃。除此而外，以與比較實施例11-1和實施例11-1到11-5相同的方式進行直鏈淀粉的合成。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖14所示。
當蔗糖磷酸化酶從常規(guī)方法所采用的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶改變?yōu)樽儺愭溓蚓鷣碓吹恼崽橇姿峄?，馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶改變?yōu)槭葻嶂狙挎邨U菌來源的葡聚糖磷酸化酶，且酶量為常規(guī)方法所采用酶量的一半，蔗糖濃度至少為15％，在50℃反應(yīng)時直鏈淀粉產(chǎn)率高于在45℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。
如圖14所示，盡管蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為45℃時，直鏈淀粉產(chǎn)率為32.9％，但蔗糖濃度為4％，反應(yīng)溫度為50℃時，產(chǎn)率低至19.6％。然而，不改變底物之間的比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，在50℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率是增加的。蔗糖濃度至少為15％時，在50℃反應(yīng)所得直鏈淀粉產(chǎn)率高于在45℃反應(yīng)所得產(chǎn)率。因此，當采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶，蔗糖濃度至少為15％時進行反應(yīng)，不僅可使反應(yīng)在50℃進行，還可實現(xiàn)比在45℃反應(yīng)所得產(chǎn)率高的產(chǎn)率。
(實施例13高溫條件下合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表14所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表14

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶(比較實施例13-1和實施例13-1)水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶(比較實施例13-2和實施例13-2)特定地，酶量是比較實施例3-1-1中酶量的五倍，且反應(yīng)溫度為65℃。除此而外，在比較實施例13-1中，以與比較實施例3-1-1相同的方式進行直鏈淀粉的合成。在實施例13-1中，不改變比較實施例3-1-1中的底物之間比例和酶量，且蔗糖濃度增加到50％時，進行直鏈淀粉合成。進一步地，在比較實施例13-2和實施例13-2中，采用根據(jù)上文2.4內(nèi)容制備的水生棲熱桿菌來源的葡聚糖磷酸化酶進行直鏈淀粉合成，以取代在比較實施例13-1和實施例13-1中采用的馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖15所示。
在常規(guī)方法中，不管采用何種葡聚糖磷酸化酶，在65℃反應(yīng)均不能合成直鏈淀粉。當蔗糖濃度增加時，直鏈淀粉可以在65℃生成。
(實施例14以麥芽四糖為引物生產(chǎn)直鏈淀粉)上述實施例中，直鏈淀粉生產(chǎn)是以麥芽七糖為引物。然而，高純度的麥芽低聚糖昂貴且沒有被劃分為工業(yè)可利用的范圍。含麥芽四糖的糖漿是便宜的麥芽低聚糖。然而，這種糖漿含有不被認為具有引物功能的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等。此外，麥芽四糖對葡聚糖磷酸化酶的親和性低于麥芽七糖對葡聚糖磷酸化酶的親和性。這種糖漿是否可以被用于進行葡聚糖合成反應(yīng)還尚不清楚。這種研究還未有報導(dǎo)。因此，本發(fā)明人對取代麥芽七糖的含麥芽四糖的糖漿是否可以被用于合成直鏈淀粉進行了研究。
特定地，采用至少含70％麥芽四糖的Tetrup H(Hayashibara Shoji，Inc.)。除此而外，以與實施例7-2相同的方式合成直鏈淀粉。結(jié)果證實即使采用Tetrup H也可生成高分子量的直鏈淀粉。
(實施例15采用膜過濾純化直鏈淀粉)采用2％蔗糖、10mM無機磷酸鹽、50U/g蔗糖的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產(chǎn))、根據(jù)上文2.2內(nèi)容制備的50U/g蔗糖的重組馬鈴薯塊莖來源的葡聚糖磷酸化酶，并以麥芽七糖為引物，在37℃反應(yīng)18小時以合成直鏈淀粉。該情況中，反應(yīng)體積為2,000ml。
采用截留分子量為30,000的超濾膜(UF膜單位；由DaicelChemical Industries Ltd.生產(chǎn))將反應(yīng)后2,000ml的直鏈淀粉溶液濃縮為1,200ml。其后，對10L蒸餾水進行透濾，并將透濾過的蒸餾水添加至濃縮后的溶液中，以得到2,000ml。在膜過濾前后測量果糖含量和直鏈淀粉的平均分子量。結(jié)果如表15所示。
表15通過膜過濾除去果糖

如表15所示，證實超濾膜可被用于純化直鏈淀粉，以除去反應(yīng)溶液中存在的果糖。證實膜過濾對直鏈淀粉的平均分子量沒有很多改變。
因此，采用超濾膜純化直鏈淀粉，可以無需許多被常規(guī)地應(yīng)用在直鏈淀粉純化中的有機溶劑，如丁醇、甲醇、乙醇、乙醚等，便可將直鏈淀粉純化。
(實施例16-1到16-7和比較實施例16-1采用腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶和馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶，并改變蔗糖濃度與無機磷酸鹽濃度的比例，合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表16所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表16


G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，將蔗糖、無機磷酸鹽、腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶、根據(jù)上文2.1內(nèi)容制備的馬鈴薯塊莖來源的葡聚糖磷酸化酶和麥芽七糖溶解于100mM檸檬酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，以獲得含125mM蔗糖、20U/g蔗糖的腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶、20U/g蔗糖的馬鈴薯塊莖來源的葡聚糖磷酸化酶、0.35mM麥芽七糖、7.2mM無機磷酸鹽(比較實施例16-1)或10～125mM無機磷酸鹽(實施例16-1到16-7)的溶液。使該溶液在37℃反應(yīng)4小時以合成直鏈淀粉。反應(yīng)體積為1ml。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖16所示。
如圖16所示，當添加7.2mM無機磷酸鹽，使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，直鏈淀粉產(chǎn)率低至20.1％，但當添加至少10mM無機磷酸鹽，并使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，產(chǎn)率增加了。進一步地，當添加20～75mM無機磷酸鹽，并使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，產(chǎn)率至少為40％。
(實施例17-1到17-7和比較實施例17-1采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶和馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶，并改變蔗糖濃度與無機磷酸鹽濃度的比例時，合成直鏈淀粉)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表17所示的反應(yīng)混合物進行直鏈淀粉的合成。
表17

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，在實施例17-1到17-7和比較實施例17-1中，采用變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶取代腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶，反應(yīng)溫度為45℃。除此而外，以與實施例16-1到16-7和比較實施例17-1相同的方式合成直鏈淀粉。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6的內(nèi)容測定合成的直鏈淀粉的產(chǎn)率。結(jié)果如圖17所示。
如圖17所示，當添加7.2mM無機磷酸鹽，使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，直鏈淀粉產(chǎn)率低至26.7％，但當添加至少10mM無機磷酸鹽，并使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，產(chǎn)率增加了。進一步地，當添加20～75mM無機磷酸鹽，并使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，產(chǎn)率至少為50％～60％。
因此，盡管常規(guī)方法采用的蔗糖-磷酸鹽比例的最大值不僅不導(dǎo)致高水平的產(chǎn)率，還對工業(yè)生產(chǎn)不利，但通過在預(yù)定范圍內(nèi)設(shè)定蔗糖-磷酸鹽比例的最大值，可以實現(xiàn)常規(guī)方法所得產(chǎn)率水平的約兩倍。
(實施例18蔗糖存在條件下變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶的耐熱性)在根據(jù)上文2.5內(nèi)容通過破壞生成蔗糖磷酸化酶的大腸桿菌而制備的溶液中添加蔗糖，并使其溶解，相對于溶解后的溶液而言，獲得最終蔗糖濃度分別為4％、8％、12％、16％、20％、25％或30％的溶液。以無蔗糖的蔗糖磷酸化酶酶液為對照(0％蔗糖)。在55℃水浴中加熱這些溶液。在加熱開始(0分鐘)，加熱開始后30分鐘，60分鐘和90分鐘對這些溶液取樣，根據(jù)此處描述的方法檢測蔗糖磷酸化酶的活性。
基于測定的活性，計算剩余活性。
如下計算剩余活性(剩余活性(％))＝{(每一樣品的蔗糖磷酸化酶活性)/(加熱0分鐘時蔗糖磷酸化酶活性)}×100剩余活性結(jié)果如圖18所示。發(fā)現(xiàn)下列結(jié)果。當不存在蔗糖(0％)時，在55℃加熱30分鐘后活性減少為約10％。
當存在至少4％蔗糖時，加熱30分鐘后剩余活性至少為50％。特定地，當存在至少8％蔗糖時，即使加熱30分鐘仍有至少80％的剩余活性。
(實施例19蔗糖存在條件下腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶的耐熱性)在含有腸系膜狀明串珠菌來源的蔗糖磷酸化酶(購自O(shè)rientalYeast Co.，Ltd.)的酶液中添加蔗糖，并使其溶解，相對于溶解后的溶液而言，獲得最終蔗糖濃度分別為12％、16％、20％、25％或30％的溶液。以無蔗糖的蔗糖磷酸化酶酶液為對照(0％蔗糖)。在50℃水浴中加熱這些溶液。在加熱開始(0分鐘)，加熱開始后30分鐘，60分鐘和90分鐘對這些溶液取樣，根據(jù)此處描述的方法檢測蔗糖磷酸化酶的活性。
基于測定的活性，根據(jù)上述公式計算剩余活性。
剩余活性結(jié)果如圖19所示。發(fā)現(xiàn)下列結(jié)果。當不存在蔗糖(0％)時，在50℃加熱30分鐘后活性減少為約10％。
當存在至少12％蔗糖時，加熱30分鐘后剩余活性至少為50％。特定地，當存在至少20％蔗糖時，即使加熱30分鐘仍有至少80％的剩余活性。
(比較實施例20果糖對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性的影響)除蔗糖以外，果糖、無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸都是蔗糖磷酸化酶的底物。以下述方式研究果糖對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性的影響。
在根據(jù)上文2.5內(nèi)容制備的含有變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶的蔗糖磷酸化酶酶液中添加果糖，并使其溶解，相對于溶解后的溶液而言，獲得最終果糖濃度為5％或10％的溶液。以無果糖的蔗糖磷酸化酶酶液為對照(0％蔗糖)。同樣，就對照而言，也研究了將蔗糖添加至相同濃度的情況。在55℃水浴中加熱這些溶液。在加熱開始(0分鐘)，加熱開始后30分鐘，60分鐘和90分鐘對這些溶液取樣，根據(jù)此處描述的方法檢測蔗糖磷酸化酶的活性。
基于測定的活性，計算剩余活性。
剩余活性結(jié)果如圖20所示。結(jié)果是沒有發(fā)現(xiàn)果糖具有如蔗糖所顯示的對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性的影響。
(比較實施例21無機磷酸鹽對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性的影響)以下述方式研究無機磷酸鹽對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性的影響。
在根據(jù)上文2.5內(nèi)容制備的含有變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶的蔗糖磷酸化酶酶液中添加磷酸鈉，并使其溶解，相對于溶解后的溶液而言，獲得最終濃度為40mM、100mM和400mM的溶液。以無添加磷酸鈉的蔗糖磷酸化酶酶液為對照(無添加)。同樣，就對照而言，也研究了將蔗糖添加至10％濃度的情況。在55℃水浴中加熱這些溶液。在加熱開始(0分鐘)，加熱開始后30分鐘，60分鐘和90分鐘對這些溶液取樣，根據(jù)此處描述的方法檢測蔗糖磷酸化酶的活性。
基于測定的活性，計算剩余活性。
剩余活性結(jié)果如圖21所示。結(jié)果是沒有發(fā)現(xiàn)無機磷酸鹽具有如蔗糖所顯示的對蔗糖磷酸化酶穩(wěn)定性的影響。
(實施例22-1到22-5和比較實施例22-1以出芽短梗霉聚糖為引物合成葡聚糖)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表18所示的反應(yīng)混合物進行葡聚糖的合成。
表18

P-5出芽短梗霉聚糖(平均分子量約為5,000)；％是通過重量/體積計算。
Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，采用0.2～1.25％出芽短梗霉聚糖P-5(平均分子量約為5,000；購自Shoko Co.，Ltd.)取代麥芽七糖，采用的蔗糖磷酸化酶活性為20U/g蔗糖，采用的葡聚糖磷酸化酶活性為20U/g蔗糖。除此而外，在比較實施例22-1和實施例22-1到22-5中，以與比較實施例3-2-1和實施例3-2-1到3-2-5相同的方式合成葡聚糖。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6內(nèi)容測定合成的葡聚糖產(chǎn)率。結(jié)果如圖22所示。
即使采用出芽短梗霉聚糖取代麥芽七糖，通過將蔗糖濃度從4％增加到8％，仍然可以在50℃進行高效的反應(yīng)，并且葡聚糖產(chǎn)率是增加的。
如圖22所示，當反應(yīng)溫度為50℃，蔗糖濃度為4％時，葡聚糖產(chǎn)率低至9.8％。然而當不改變底物之間比例和酶量，并且蔗糖濃度在8％和25％之間變化時，葡聚糖產(chǎn)率是增加的。當蔗糖濃度為8％，產(chǎn)率為32.0％，該產(chǎn)率是蔗糖濃度為4％時所得產(chǎn)率的至少三倍。當蔗糖濃度至少為15％時，葡聚糖產(chǎn)率約為80％。如此，即使采用出芽短梗霉聚糖取代麥芽低聚糖，仍能獲得與采用麥芽低聚糖等同的效果。
(實施例23-1到23-7和比較實施例23-1以出芽短梗霉聚糖為引物合成葡聚糖)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表19所示的反應(yīng)混合物進行葡聚糖的合成。
表19

P-5出芽短梗霉聚糖(平均分子量約為5,000)；％是通過重量/體積計算。
Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，采用0.2％出芽短梗霉聚糖P-5(平均分子量約為5,000；購自Shoko Co.，Ltd.)取代麥芽七糖。除此而外，在比較實施例23-1和實施例23-1到23-7中，以與比較實施例17-1和實施例17-1到17-7相同的方式合成葡聚糖。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6內(nèi)容測定合成的葡聚糖產(chǎn)率。結(jié)果如圖23所示。
如圖23所示，當添加7.2mM無機磷酸鹽，使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，葡聚糖產(chǎn)率低至5.3％。然而，當添加10mM無機磷酸鹽，并使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，產(chǎn)率為11.7％，該產(chǎn)率為上一產(chǎn)率的至少兩倍。進一步地，當添加20～75mM無機磷酸鹽，并使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，產(chǎn)率至少為20～25％。
如此，即使采用出芽短梗霉聚糖取代麥芽低聚糖，仍能獲得與采用麥芽低聚糖等同的效果。
(實施例24-1到24-7和比較實施例24-1采用G-1-P合成葡聚糖)采用組成(反應(yīng)開始時)如下表20所示的反應(yīng)混合物進行葡聚糖的合成。
表20

G7麥芽七糖G-1-P葡糖-1-磷酸二鈉SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶特定地，采用葡糖-1-磷酸取代無機磷酸鹽，并且采用醋酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液為pH7.0。除此而外，在比較實施例24-1和實施例24-1到24-7中，以與比較實施例17-1和實施例17-1到17-7相同的方式合成葡聚糖。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6內(nèi)容測定合成的葡聚糖產(chǎn)率。結(jié)果如圖24所示。
如圖24所示，當添加7.2mM葡糖-1-磷酸，使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，葡聚糖產(chǎn)率低至16.4％。然而，當添加10mM葡糖-1-磷酸，并使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，產(chǎn)率為35.3％，該產(chǎn)率為上一產(chǎn)率的至少兩倍。進一步地，當添加20～75mM葡糖-1-磷酸，并使其與125mM蔗糖反應(yīng)時，產(chǎn)率至少為40～60％。
因此，合成葡聚糖即使采用了出芽短梗霉聚糖取代麥芽低聚糖，常規(guī)方法采用的蔗糖-磷酸鹽比例的最大值情況中，產(chǎn)率是低的。然而通過在預(yù)定范圍內(nèi)設(shè)定蔗糖-磷酸鹽比例的最大值，仍可獲得至少兩倍的產(chǎn)率。
(實施例25-1到25-5采用含分支酶的SP-GP反應(yīng)體系合成葡聚糖)采用組成如下表21所示的反應(yīng)混合物進行葡聚糖的合成。應(yīng)當指出采用的分支酶是根據(jù)在Japanese Laid-Open Publication No.2000-316581(Japanese Patent Application No.11-130833)中公開的方法制備的。
表21

G7麥芽七糖Pi磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液SP變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶GP馬鈴薯來源的葡聚糖磷酸化酶BEAquifex aeolicus來源的分支酶使該溶液在45℃反應(yīng)18小時以合成葡聚糖。反應(yīng)體積為1ml。
反應(yīng)后，根據(jù)上文1.6描述方式測定合成葡聚糖產(chǎn)率。進一步地，通過Takata等人描述的方法(Carbohydr.Res.，Vol.295，pp.91～101(1996))測定所合成的葡聚糖的平均單位鏈長度。結(jié)果如下表22所示。
表22

N/A未分析發(fā)現(xiàn)在這些條件下可以高產(chǎn)率地合成高度分枝的葡聚糖。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，可以生產(chǎn)葡聚糖。通過在某個范圍內(nèi)，在從反應(yīng)開始到結(jié)束的時間段內(nèi)，設(shè)定蔗糖的摩爾濃度與無機磷酸鹽和葡糖-1-磷酸的總摩爾濃度的比例的最大值，可獲得的葡聚糖生產(chǎn)產(chǎn)率水平高于常規(guī)方法的產(chǎn)率水平。本發(fā)明人通過在改進蔗糖磷酸化酶熱穩(wěn)定性、或開發(fā)和采用具有較高水平耐熱性的蔗糖磷酸化酶的條件下進行反應(yīng)，可以在高溫生產(chǎn)葡聚糖(優(yōu)選直鏈淀粉)。
對作為淀粉加工工業(yè)、膳食組合物、用于食品添加劑的組合物、粘合組合物、包埋化合物和吸收化合物、醫(yī)藥和化妝品組合物、薄膜類型產(chǎn)物組合物的原料而言，這些葡聚糖是有用的，并且還可作為生物可降解塑料所用淀粉的替代物。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)葡聚糖的方法，包括以下步驟使含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液起反應(yīng)以生成葡聚糖，其中反應(yīng)在約40℃到約70℃的溫度下進行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)溫度約為45℃到約65℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)開始時反應(yīng)溶液中的蔗糖濃度約為5％到約100％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中反應(yīng)開始時反應(yīng)溶液中的蔗糖濃度約為8％到約80％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中反應(yīng)開始時反應(yīng)溶液中的蔗糖濃度約為15％到約50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中葡聚糖是直鏈淀粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中蔗糖磷酸化酶來源自屬于鏈球菌屬的細菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中蔗糖磷酸化酶來源自選自變異鏈球菌、嗜熱鏈球菌、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌的屬于鏈球菌屬的細菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中葡聚糖磷酸化酶來源自植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中葡聚糖磷酸化酶來源自藻類。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中葡聚糖磷酸化酶來源自馬鈴薯。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中葡聚糖磷酸化酶來源自水生棲熱桿菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中葡聚糖磷酸化酶來源自嗜熱脂肪芽孢桿菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一個是通過重組微生物生成的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一個被固定在載體上。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中引物選自麥芽低聚糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶聯(lián)糖、淀粉及它們的衍生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中麥芽低聚糖是麥芽低聚糖混合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中除了含有聚合度大于或等于麥芽四糖的麥芽低聚糖外，麥芽低聚糖混合物還含有麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖中的至少一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中淀粉選自可溶性淀粉、蠟質(zhì)淀粉、高直鏈淀粉、脫支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、通過水解部分降解的淀粉、已加工淀粉及它們的衍生物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進一步包括不采用有機溶劑純化已生成的葡聚糖的步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進一步包括于反應(yīng)后冷卻反應(yīng)溶液以沉淀葡聚糖，并通過固-液分離方法純化已沉淀葡聚糖的步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進一步包括以下步驟于葡聚糖生成反應(yīng)期間或之后冷卻反應(yīng)溶液以凝膠化葡聚糖；回收凝膠狀葡聚糖；并通過選自水洗滌、冷凍-融化、過濾、壓榨、抽吸和離心的操作從凝膠狀葡聚糖中除去果糖。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進一步包括于葡聚糖生成反應(yīng)之后，利用超濾膜或?qū)游龇?，使溶解在水中的葡聚糖無需沉淀，經(jīng)過膜分級分離除去果糖的步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)溶液進一步含有選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和糖原脫支酶的酶。
25.通過權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的葡聚糖。
全文摘要
第一種生產(chǎn)葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖－1－磷酸、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液起反應(yīng)以生產(chǎn)葡聚糖的步驟。從反應(yīng)開始到結(jié)束，反應(yīng)溶液中蔗糖－磷酸鹽比例最大值不超過約17。第二種生產(chǎn)葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、無機磷酸鹽或葡糖－1－磷酸、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶的反應(yīng)溶液起反應(yīng)以生產(chǎn)葡聚糖的步驟。反應(yīng)在約40℃到約70℃的溫度下進行。
文檔編號C12R1/46GK1840679SQ20061000372
公開日2006年10月4日 申請日期2002年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月28日
發(fā)明者藤井和俊, 寺田喜信, 柳瀨美千代, 大段光司, 高田洋樹, 鷹羽武史, 栗木隆, 岡田茂孝 申請人:江崎格力高株式會社