專利名稱：合成有機(jī)產(chǎn)物的方法和材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法和材料。
2.背景信息諸如乳酸的有機(jī)產(chǎn)物具有許多重要的工業(yè)用途。例如，有機(jī)酸可用于合成塑料材料以及其它產(chǎn)品。為了滿足對有機(jī)產(chǎn)物不斷增長的需要，有待開發(fā)更有效且成本更實(shí)際的生產(chǎn)方法。一個這類方法涉及使用細(xì)菌。更具體地說，某些細(xì)菌在某些發(fā)酵條件下可產(chǎn)生大量的特定有機(jī)產(chǎn)物。然而，使用活細(xì)菌作為生產(chǎn)者受到隨著有機(jī)產(chǎn)物在生長培養(yǎng)基中的積累細(xì)菌不能生長的限制。為了繞開該限制，在產(chǎn)物合成期間采用了各種產(chǎn)物純化技術(shù)。另外，已經(jīng)嘗試了使用非細(xì)菌的微生物。事實(shí)上，在生產(chǎn)乳酸的嘗試中已經(jīng)遺傳修飾了已知具有酸耐受性的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。具體地說，通過給細(xì)胞提供牛乳酸脫氫酶cDNA并破壞內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶基因(PDC1，PDC5，和PDC6)修飾了釀酒酵母細(xì)胞。盡管這些修飾的釀酒酵母細(xì)胞產(chǎn)生了一些乳酸，但是細(xì)胞生長受到抑制，因此細(xì)胞生長和乳酸生產(chǎn)均需要改進(jìn)。
發(fā)明概述本發(fā)明一般涉及生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法和材料。具體地說，本發(fā)明提供了酵母細(xì)胞，培養(yǎng)酵母細(xì)胞的方法，制備酵母細(xì)胞的方法，核酸構(gòu)建體，和產(chǎn)生各種有機(jī)產(chǎn)物的方法和材料。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即特定微生物(例如，細(xì)菌和真菌微生物)可遺傳構(gòu)建成在特定培養(yǎng)條件下具有生長能力，利用各種碳源用于生長以及產(chǎn)物生產(chǎn)，并產(chǎn)生用于商業(yè)目的的所需有機(jī)產(chǎn)物。例如，本文提供的酵母細(xì)胞在低pH和高溫培養(yǎng)時(shí)可生長并產(chǎn)生有機(jī)產(chǎn)物。具有在例如，低pH和高溫條件下迅速生長并高效產(chǎn)生有機(jī)產(chǎn)物的能力特別具有優(yōu)勢。具體地說，微生物耐受低pH的能力避免了需要在大規(guī)模生產(chǎn)過程中有困難且昂貴的維持中性pH環(huán)境。另外，從低pH培養(yǎng)基回收目的有機(jī)產(chǎn)物所需的方法和材料比從具有更中性pH的培養(yǎng)基中回收相同有機(jī)產(chǎn)物所需的方法和材料更實(shí)際且更有效。例如，某些有機(jī)酸產(chǎn)物隨著pH下降到產(chǎn)物pKa值以下可能在溶液中沉淀出來，使得回收十分簡單。另外，微生物耐受高溫的能力避免了在生長和生產(chǎn)期間需要維持涼爽溫度。很明顯，減少對大規(guī)模生產(chǎn)過程中降低大容積罐溫度的需要使得整個過程更有效且花費(fèi)更低。而且，微生物同時(shí)耐受低pH和高溫的能力提供了在大規(guī)模生產(chǎn)過程中防止被其它耐受性較小的微生物污染的方便方法。
重要的是應(yīng)注意與產(chǎn)生用于商業(yè)目的的所需有機(jī)產(chǎn)物的能力相關(guān)的重要方面可以是產(chǎn)生所需有機(jī)產(chǎn)物的單位生產(chǎn)率(specific productivity)。例如，使用本文所述的方法和材料提供的高單位生產(chǎn)率可允許微生物當(dāng)暴露在諸如低pH和高溫的培養(yǎng)條件下時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞維持所需的能量。該所需能量可在基本上厭氧的條件下通過發(fā)酵途徑產(chǎn)生，而不是依賴于通過呼吸途徑產(chǎn)生能量。當(dāng)產(chǎn)生有機(jī)產(chǎn)物不需要呼吸途徑時(shí)通過發(fā)酵途徑獲得能量特別具有優(yōu)勢，因?yàn)榛旧纤械墓┙o碳源可用于生產(chǎn)所需有機(jī)產(chǎn)物。
本發(fā)明也基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即可控制某些遺傳構(gòu)建的微生物對碳源的利用并主要定向產(chǎn)生生物量或者所需的有機(jī)產(chǎn)物。一般來說，本發(fā)明包含兩種類型的培養(yǎng)方法。一種培養(yǎng)方法涉及依賴于微生物和所需結(jié)果，在促進(jìn)生物量生產(chǎn)的特定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物，而另一培養(yǎng)方法涉及也依賴于微生物和所需結(jié)果，促進(jìn)所需有機(jī)產(chǎn)物生產(chǎn)的一套不同的培養(yǎng)條件。很明顯，在大規(guī)模生產(chǎn)過程中具有控制碳源利用的能力提供了比其它可能具有更大靈活性和更多控制的生產(chǎn)者。
另外，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即可對某些微生物進(jìn)行遺傳操作，以便大多數(shù)(如果不是全部的話)碳源被用于生產(chǎn)生物量或者所需的有機(jī)產(chǎn)物。具體地說，本發(fā)明提供了經(jīng)過修飾以便從生物量或者所需有機(jī)產(chǎn)物的生產(chǎn)轉(zhuǎn)移碳源利用的生物合成途徑被失活的酵母細(xì)胞。失活該生物合成途徑提供了可有效生長并產(chǎn)生所需產(chǎn)物的微生物。
一般來說，本發(fā)明的特征在于含有外源性核酸分子的酵母細(xì)胞，其中外源性核酸分子編碼在細(xì)胞內(nèi)具有酶活性的多肽。該核酸可插入細(xì)胞基因組中。該酶活性導(dǎo)致有機(jī)產(chǎn)物的形成，在某些實(shí)施方案中，該有機(jī)產(chǎn)物從細(xì)胞中分泌出來。該細(xì)胞還具有crabtree-陰性表型且產(chǎn)生該有機(jī)產(chǎn)物。例如，該細(xì)胞可來自克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，畢赤酵母屬(Pichia)，漢遜酵母屬(Hansenula)，假絲酵母屬(Candida)，絲孢酵母屬(Trichosporon)，或Yamadazyma屬。該有機(jī)產(chǎn)物可以是，例如，發(fā)酵產(chǎn)物，丙酮酸鹽衍生的產(chǎn)物，有機(jī)酸，或諸如乳酸鹽(lactate)的羧酸鹽。在一個實(shí)施方案中，該多肽可具有乳酸脫氫酶活性。例如，外源性核酸可編碼細(xì)菌乳酸脫氫酶或諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis)真菌乳酸脫氫酶的真菌乳酸脫氫酶。
在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞含有4個外源性核酸分子，4個外源性核酸分子各編碼一個不同的多肽。例如，4個外源性核酸分子中的第一個可編碼具有乳酸脫氫酶活性的第一多肽，第二核酸分子可編碼具有CoA-轉(zhuǎn)移酶活性的第二多肽，第三核酸分子可編碼具有乳酰-CoA脫水酶活性的第三多肽，且第四核酸分子可編碼具有丙烯?；?CoA水合酶活性的第四多肽。這種細(xì)胞可產(chǎn)生丙烯酸鹽作為羧酸鹽產(chǎn)物。作為選擇，4個外源性核酸分子中的第一個可編碼具有2-脫氫-3-脫氧-D-戊酸醛縮酶活性的第一多肽，第二核酸分子可編碼具有木糖酸(xylonate)脫水酶活性的第二多肽，第三核酸分子可編碼具有木糖酸內(nèi)酯酶(xylonolactonase)活性的第三多肽，且第四核酸分子可編碼具有D-木糖脫氫酶活性的第四多肽。這種細(xì)胞可產(chǎn)生諸如D-木糖的糖類作為有機(jī)產(chǎn)物。
在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞含有6個外源性核酸分子，6個外源性核酸分子各編碼一個不同的多肽。例如，6個外源性核酸分子中的第一個可編碼具有2，5-二氧戊酸(2，5-dioxovalerate)脫氫酶活性的第一多肽，第二核酸分子可編碼具有5-脫氫-4-脫氧-D-葡糖二酸脫氫酶活性的第二多肽，第三核酸分子可編碼具有葡糖二酸(glucarate)脫水酶活性的第三多肽，第四核酸分子可編碼具有乙醛脫氫酶活性的第四多肽，第五核酸分子可編碼具有葡糖醛酸內(nèi)酯還原酶活性的第五多肽，第六核酸分子可編碼具有L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶活性的第六多肽。這種細(xì)胞可產(chǎn)生諸如L-抗壞血酸鹽的維生素作為有機(jī)產(chǎn)物。
該有機(jī)產(chǎn)物可含有3個以上碳原子，例如可以是氨基酸。
在另一實(shí)施方案中，該細(xì)胞能分解代謝諸如核糖，阿拉伯糖，木糖和來蘇糖的戊糖碳。
在另一實(shí)施方案中，該細(xì)胞具有降低的丙酮酸脫羧酶活性或降低的乙醇脫氫酶活性。例如，該細(xì)胞可缺乏所有的丙酮酸脫羧酶活性。丙酮酸脫羧酶活性降低可以是由于遺傳基因座破壞，其中該基因座正常情況下具有編碼丙酮酸脫羧酶的核酸序列。作為選擇，該細(xì)胞可含有相應(yīng)于內(nèi)源性核酸序列的諸如核酶的反義分子，其中該反義分子降低了丙酮酸脫羧酶的活性。細(xì)胞也可含有充當(dāng)殺傷質(zhì)粒的其它外源性核酸分子。
在另一實(shí)施方案中，外源性核酸編碼的多肽的酶活性導(dǎo)致以NADH消耗方式形成有機(jī)產(chǎn)物。
在另一實(shí)施方案中，當(dāng)在生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的最佳條件培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，每消耗100克葡萄糖細(xì)胞產(chǎn)生至少大約60克的有機(jī)產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于含有外源性核酸分子的細(xì)胞，例如，酵母細(xì)胞，其中外源性核酸分子編碼促進(jìn)戊糖碳被細(xì)胞分解代謝的多肽。該多肽可以是，例如，木糖還原酶，木糖醇脫氫酶，或木酮糖激酶，且該戊糖碳可以是，例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和來蘇糖。該細(xì)胞還可分解代謝己糖碳且如果需要，可同時(shí)分解代謝己糖碳和戊糖碳。己糖碳可以是，例如，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，iodose，果糖，半乳糖和塔羅糖。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于含有外源性核酸分子的酵母細(xì)胞，其中外源性核酸分子編碼促進(jìn)乙酰-CoA在細(xì)胞質(zhì)中積累的多肽。
多肽可以是具有檸檬酸裂合酶活性的多肽，或可以是促進(jìn)乙酰-CoA穿透過線粒體膜的線粒體膜多肽。細(xì)胞可具有降低的丙酮酸脫羧酶活性或降低的乙醇脫氫酶活性。另外，酵母細(xì)胞可缺乏乙醇生產(chǎn)，且在缺乏乙醇和乙酸鹽的培養(yǎng)條件下可具有比缺乏乙醇產(chǎn)生的相應(yīng)酵母細(xì)胞觀察到的生長率更高的生長率。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于具有線粒體多肽活性降低的酵母細(xì)胞，其中該細(xì)胞具有crabtree-陰性表型。該細(xì)胞可以是來自，例如，克魯維酵母屬，畢赤酵母屬，漢遜酵母屬，假絲酵母屬，絲孢酵母屬或Yamadazyma屬。細(xì)胞可完全缺乏該活性。細(xì)胞可含有破壞的基因座，其中該基因座正常情況下包含編碼線粒體多肽的核酸序列。該線粒體多肽可以是三羧酸循環(huán)酶。另外，細(xì)胞可積累三羧酸循環(huán)產(chǎn)物。細(xì)胞可包括外源性核酸分子，其中該外源性核酸分子編碼在細(xì)胞內(nèi)具有酶活性的多肽，該酶活性導(dǎo)致形成一種有機(jī)產(chǎn)物，使得細(xì)胞可產(chǎn)生該有機(jī)產(chǎn)物。有機(jī)產(chǎn)物可以是，例如，檸檬酸鹽，α-酮戊二酸鹽，琥珀酸鹽，延胡索酸鹽，蘋果酸鹽，和草酰乙酸鹽。多肽可以是參與乳酸鹽或乙酸鹽分解代謝的多肽。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法。該方法包括提供酵母細(xì)胞，其中該細(xì)胞包含編碼在細(xì)胞內(nèi)具有酶活性的多肽的外源性核酸分子，其中該酶活性導(dǎo)致形成該有機(jī)產(chǎn)物，且其中該細(xì)胞具有crabtree-陰性表型，并用培養(yǎng)基培養(yǎng)該細(xì)胞以便產(chǎn)生該有機(jī)產(chǎn)物。該酵母細(xì)胞可以是來自克魯維酵母屬，畢赤酵母屬，漢遜酵母屬，假絲酵母屬，絲孢酵母屬或Yamadazyma屬。該有機(jī)產(chǎn)物可以是發(fā)酵產(chǎn)物，丙酮酸鹽衍生的產(chǎn)物，含有3個以上碳原子的有機(jī)產(chǎn)物，羧酸鹽，糖類，氨基酸，維生素，或脂類產(chǎn)物。有機(jī)產(chǎn)物還可以是乳酸鹽，甘油，丙烯酸鹽，木糖，抗壞血酸鹽，檸檬酸鹽，異檸檬酸鹽，α-酮戊二酸鹽，琥珀酰-CoA，琥珀酸鹽，延胡索酸鹽，蘋果酸鹽，或草酰乙酸鹽。在一些實(shí)施方案中，該有機(jī)產(chǎn)物由細(xì)胞分泌出來。該方法可導(dǎo)致細(xì)胞具有降低的丙酮酸脫羧酶活性或降低的乙醇脫氫酶活性。該酶活性可導(dǎo)致以NADH-消耗方式形成有機(jī)產(chǎn)物。
以這些方法制備的細(xì)胞當(dāng)培養(yǎng)步驟最適于產(chǎn)生該有機(jī)產(chǎn)物時(shí)每消耗100克葡萄糖可產(chǎn)生至少大約60克有機(jī)產(chǎn)物?？梢允且后w的培養(yǎng)基可包含細(xì)胞呼吸抑制劑，例如，抗霉素A，氰化物，或疊氮化物。培養(yǎng)步驟可包括在需氧生長條件下生長細(xì)胞隨后用細(xì)胞呼吸抑制劑接觸所述細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)步驟包括在厭氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在另一可供選擇的實(shí)施方案中，培養(yǎng)步驟包括在需氧生長條件下生長細(xì)胞隨后在厭氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)步驟也可包括在高于大約35℃的溫度培養(yǎng)該細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，培養(yǎng)基具有低于大約3.0的有機(jī)pH值，和/或低于大約3.0的無機(jī)pH值。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有戊糖碳，例如核糖，阿拉伯糖，木糖，或來蘇糖。培養(yǎng)基也可包含具有例如，大約2.0和大約6.5之間的pH值的玉米纖維水解產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法，該方法包括a)提供含有編碼促進(jìn)細(xì)胞分解代謝戊糖碳的多肽的外源性核酸分子的酵母細(xì)胞，其中該細(xì)胞含有導(dǎo)致形成所述有機(jī)產(chǎn)物的酶活性，和b)用培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞以便生產(chǎn)該有機(jī)產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法，該方法包括a)提供酵母細(xì)胞，其中該細(xì)胞包含編碼促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)積累乙酰-CoA的多肽的外源性核酸分子，且其中該細(xì)胞含有導(dǎo)致形成該有機(jī)產(chǎn)物的酶活性，和b)用培養(yǎng)基培養(yǎng)該細(xì)胞以便生產(chǎn)該有機(jī)產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法，該方法包括a)提供具有降低活性的線粒體酶的酵母細(xì)胞，其中該活性降低導(dǎo)致該有機(jī)產(chǎn)物的積累，和b)用培養(yǎng)基培養(yǎng)所述細(xì)胞以便生產(chǎn)所述的有機(jī)產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種培養(yǎng)具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞的方法，該方法包括用培養(yǎng)基培養(yǎng)該細(xì)胞，其中該培養(yǎng)基具有低于大約3.0的有機(jī)pH值，和/或低于大約3.0的無機(jī)pH值。該培養(yǎng)步驟可包括在高于大約35℃的溫度培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)基可包含細(xì)胞呼吸抑制劑。培養(yǎng)基也可包含戊糖碳。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可包含玉米纖維水解產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種培養(yǎng)具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞的方法，該方法包括用培養(yǎng)基培養(yǎng)該細(xì)胞，其中該培養(yǎng)基包含玉米纖維水解產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種培養(yǎng)具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞的方法，該方法包括用培養(yǎng)基在高于大約35℃的溫度培養(yǎng)該細(xì)胞，該培養(yǎng)基具有低于大約3.0的無機(jī)pH值。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種培養(yǎng)具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞的方法，該方法包括用培養(yǎng)基在高于大約35℃的溫度培養(yǎng)該細(xì)胞，該培養(yǎng)基包含戊糖碳。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種培養(yǎng)具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞的方法，該方法包括用培養(yǎng)基在高于大約35℃的溫度培養(yǎng)該細(xì)胞，該培養(yǎng)基包含玉米纖維水解產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于包含重組序列和選定序列的核酸構(gòu)建體，該重組序列相應(yīng)于具有crabtree-陰性表型的細(xì)胞的基因組序列，該基因組序列編碼細(xì)胞表達(dá)的酶，該選定序列編碼導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)形成有機(jī)產(chǎn)物的酶。選定序列可在重組序列內(nèi)以便選定序列的每一端都是該重組序列側(cè)翼。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于制備該重組酵母細(xì)胞的方法，包括提供具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞，選擇一個最終產(chǎn)物，鑒定需要加入細(xì)胞中以生產(chǎn)該最終產(chǎn)物的一個或多個外源性酶，鑒定其活性在所述細(xì)胞中下降以允許在所述細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)所述最終產(chǎn)物的一個或多個內(nèi)源性酶，將鑒定的一個或多個外源性酶添加到所提供的酵母細(xì)胞中，并降低所鑒定的一個或多個內(nèi)源性酶在所提供的酵母細(xì)胞中的活性以便該細(xì)胞在培養(yǎng)條件下產(chǎn)生該最終產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種玉米纖維水解產(chǎn)物，該水解產(chǎn)物具有大約2.0和大約6.5之間的pH值，該水解產(chǎn)物可含有葡萄糖，木糖，和阿拉伯糖。該水解產(chǎn)物可包含大約40克/L葡萄糖，大約40克/L木糖，和大約20克/L阿拉伯糖。作為選擇，該水解產(chǎn)物可包含大約38.7克/L-葡萄糖，大約39.1克/L-木糖，大約20.7克/L-阿拉伯糖，和1.6克/L-糠醛。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種制備有機(jī)產(chǎn)物的方法，包括a)在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物，其中該微生物具有降低的酶活性；該酶活性可以是丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶，或乙酰-CoA合成酶活性；該微生物在沒有乙醇和乙酸鹽時(shí)表現(xiàn)出的生長率是對相應(yīng)于不具有所述降低的酶活性的微生物所觀察到的生長率的至少大約30％，和b)改變培養(yǎng)條件以促進(jìn)該有機(jī)產(chǎn)物的生產(chǎn)。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種制備有機(jī)產(chǎn)物的方法，包括a)在促進(jìn)細(xì)胞呼吸的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物，其中該微生物具有降低的酶活性；該酶活性可以是丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶，或乙酰-CoA合成酶活性；該微生物在沒有乙醇和乙酸鹽時(shí)表現(xiàn)出的生長率是對相應(yīng)于不具有該降低的酶活性的微生物所觀察到的生長率的至少大約30％，和b)改變培養(yǎng)條件以減少細(xì)胞呼吸，從而促進(jìn)該有機(jī)產(chǎn)物的生產(chǎn)。
除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常的理解具有相同的意義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中可使用相似于或相當(dāng)于本文所述的方法和材料，但是下面也描述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物，專利申請，專利，和其它參考文獻(xiàn)以其整體引用以供參考。如有沖突，本說明書，包括定義將進(jìn)行核對。另外，材料，方法和實(shí)施例都僅僅是說明性的，而不打算作為限制。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢從下面的詳細(xì)描述和從權(quán)利要求書將是顯而易見的。
本發(fā)明包含如下項(xiàng)項(xiàng)1.一種分離的核酸，它編碼具有Seq.ID No.22所示的氨基酸序列的酵母乳酸脫氫酶蛋白。
項(xiàng)2.一種分離的核酸，它編碼具有Seq.ID No.30所示的氨基酸序列的酵母乳酸脫氫酶蛋白。
項(xiàng)3.根據(jù)項(xiàng)1的分離的核酸，它編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白且在高度嚴(yán)格條件下與Seq.ID No.21所示的核酸探針雜交。
項(xiàng)4.根據(jù)項(xiàng)3的分離的核酸，其中在高度嚴(yán)格雜交條件下洗滌后檢測雜交。
項(xiàng)5.根據(jù)項(xiàng)2的分離的核酸，它編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白且在高度嚴(yán)格條件下與Seq.ID No.29所示的核酸探針雜交。
項(xiàng)6.根據(jù)項(xiàng)5的分離的核酸，其中在高度嚴(yán)格雜交條件下洗滌后檢測雜交。
項(xiàng)7.一種重組表達(dá)構(gòu)建體，它含有具有根據(jù)項(xiàng)1或2的編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白的核苷酸序列的核酸，其中該核酸在酵母細(xì)胞中表達(dá)。
項(xiàng)8.根據(jù)項(xiàng)7的重組表達(dá)構(gòu)建體，還含有與編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白的核酸可操作地連接的酵母啟動子。
項(xiàng)9.根據(jù)項(xiàng)7的重組表達(dá)構(gòu)建體，還含有與編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白的核酸可操作地連接的酵母轉(zhuǎn)錄終止子元件。
項(xiàng)10.根據(jù)項(xiàng)7的重組表達(dá)構(gòu)建體，還含有來自酵母2-micron環(huán)狀質(zhì)粒的酵母復(fù)制元件。
項(xiàng)11.用項(xiàng)7的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，其中該轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)酵母乳酸脫氫酶蛋白。
項(xiàng)12.根據(jù)項(xiàng)11的酵母細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞是來自糖酵母屬(Saccharomyces))，克魯維酵母屬，漢遜酵母屬，假絲酵母屬，絲孢酵母屬，Yamadazyma屬，Torulaspora屬或畢赤酵母屬的酵母。
項(xiàng)13.根據(jù)權(quán)利要求11的酵母細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞表達(dá)crabtree-陰性表型。
項(xiàng)14.根據(jù)項(xiàng)11的酵母細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞是選自由C.sonorensis和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)組成的組中的酵母種類。
項(xiàng)15.根據(jù)項(xiàng)11的酵母細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞產(chǎn)生的選自由丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶，和乙酰-CoA合成酶組成的組中的糖酵解酶的量減少。
項(xiàng)16.一種生產(chǎn)乳酸的方法，包括在含有糖類的營養(yǎng)培養(yǎng)基中在至少50％的糖類被酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化成乳酸的條件下發(fā)酵根據(jù)項(xiàng)11的酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟。
項(xiàng)17.項(xiàng)16的方法，其中該酵母細(xì)胞在從大約35℃到大約55℃的溫度生長。
項(xiàng)18.項(xiàng)16的方法，其中該營養(yǎng)培養(yǎng)基具有不超過大約pH 5.0的pH。
項(xiàng)20.項(xiàng)16的方法，其中該酵母細(xì)胞是crabtree-陰性酵母細(xì)胞。
項(xiàng)21.項(xiàng)20的方法，其中該酵母細(xì)胞是馬克斯克魯維酵母或C.sonorensis。
項(xiàng)22.項(xiàng)16的方法，其中該酵母細(xì)胞產(chǎn)生的選自由丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶，和乙酰-CoA合成酶組成的組中的糖酵解酶的量減少。
項(xiàng)23.項(xiàng)16的方法，其中該糖類是葡萄糖，木糖，核糖，阿拉伯糖，甘露糖，半乳糖，果糖，麥芽糖或來蘇糖。


圖1是描述pHES質(zhì)粒的圖示。
圖2是描述pSEH質(zhì)粒的圖示。
圖3是描述產(chǎn)生含有Lh-LDH或者Pa-LDH的pCRII質(zhì)粒的圖示。
圖4是描述LDH/pCRII質(zhì)粒的圖示。
圖5是描述產(chǎn)生含有Lh-LDH或者Pa-LDH的pHES質(zhì)粒的圖示。
圖6A是描述產(chǎn)生丙酮酸脫羧酶(PDC)敲除片段的圖示。
圖6B是描述包含馬克斯克魯維酵母1.7kbp PDC1的5.5kbp片段的圖示。
圖6C是描述缺失5.5kbp PDC同源區(qū)域的400bp并插入卡那霉素抗性基因的圖示。
圖6D是描述含有卡那霉素抗性基因和周圍2.3kbp PDC1的4kb區(qū)域的圖示。
圖6E是描述7.5kbp耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)PDC1和周圍區(qū)域的圖示。
圖6F是描述從1.7kbp PDC1基因缺失750bp且插入卡那霉素抗性基因的圖示。
圖7是在低pH(pH2.5)和高溫(40℃)條件下培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)的生長(光密度；OD)對時(shí)間(小時(shí))的布點(diǎn)圖。
圖8是用葡萄糖，木糖，或阿拉伯糖在30℃培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母的生長(OD)對時(shí)間(小時(shí))的布點(diǎn)圖。
圖9是用玉米纖維水解產(chǎn)物在30℃培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母的生長(OD)對時(shí)間(小時(shí))的布點(diǎn)圖。
圖10是在30℃和所示pH培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母的生長(OD)對時(shí)間(小時(shí))的布點(diǎn)圖。
圖11是在40克乳酸存在時(shí)在30℃和所示pH培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母的生長(OD)對時(shí)間(小時(shí))的布點(diǎn)圖。
圖12顯示了在需氧條件下在含有2％葡萄糖的無機(jī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)葡萄汁酵母(S.uvarum)和馬克斯克魯維酵母的(A)生物量生產(chǎn)；(B)葡萄糖消耗；和(C)乙醇生產(chǎn)的3個布點(diǎn)圖。
圖13顯示了在厭氧條件下在含有2％葡萄糖的無機(jī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)葡萄汁酵母和馬克斯克魯維酵母的(A)生物量生產(chǎn)；(B)葡萄糖消耗；和(C)乙醇生產(chǎn)的3個布點(diǎn)圖。
圖14是PDCI啟動子載體的質(zhì)粒圖譜。
圖15是涉及乳酸產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。
圖16分別涉及pM1233，pM1234，pM1238，pM1207，pM1203，pM1205，pvr1，pM1214，pM1227，pM1246，pM1247。
圖17涉及巨大芽孢桿菌LDH。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了涉及有機(jī)產(chǎn)物生產(chǎn)的方法和材料。具體地說，本發(fā)明提供了酵母細(xì)胞，培養(yǎng)酵母細(xì)胞的方法，制備酵母細(xì)胞的方法，核酸構(gòu)建體，和生產(chǎn)各種有機(jī)產(chǎn)物的方法和材料。
本文提供的酵母細(xì)胞可用于生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物。該有機(jī)產(chǎn)物可用于廣泛的應(yīng)用中。例如，本文所述的酵母細(xì)胞生產(chǎn)的有機(jī)產(chǎn)物可用作食品防腐劑或添加劑，藥品，或化妝品，且可用于制備塑料以及其它產(chǎn)品。
為了本發(fā)明的目的，有機(jī)產(chǎn)物是含有碳原子的任意化合物。例如，有機(jī)產(chǎn)物是羧酸鹽(例如，乳酸鹽，丙烯酸鹽，檸檬酸鹽，異檸檬酸鹽，α-酮戊二酸鹽，琥珀酸鹽，延胡索酸鹽，蘋果酸鹽，草酰乙酸鹽)，糖類(例如，D-木糖)，糖醇(例如，木糖醇，阿糖醇，核糖醇)，氨基酸(例如，甘氨酸，色氨酸，谷氨酸)，脂類，酯，維生素(例如，L-抗壞血酸鹽)，多元醇(例如，甘油，1，3-丙二醇，赤蘚醇)，醛，烯烴，炔烴，和內(nèi)酯。因此，有機(jī)產(chǎn)物可含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多個碳原子。另外，有機(jī)產(chǎn)物可具有不超過大約1,000(例如，不超過大約900，800，700，600，500，400，300，200，或100)的分子量。例如，D-木糖(C5H10O5)是分子量為150的有機(jī)產(chǎn)物。另外，有機(jī)產(chǎn)物可以是發(fā)酵產(chǎn)物。本文使用的術(shù)語“發(fā)酵產(chǎn)物”是指由發(fā)酵過程產(chǎn)生的任何有機(jī)化合物。
一般來說，發(fā)酵過程涉及諸如糖類的有機(jī)化合物向諸如乙醇的化合物的厭氧酶促轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生腺苷三磷酸(ATP)形式的能量。因此，發(fā)酵與細(xì)胞呼吸的區(qū)別在于有機(jī)產(chǎn)物而不是分子氧用作電子受體。發(fā)酵產(chǎn)物的例子包括，但不限于乙酸鹽，乙醇，丁酸鹽，和乳酸鹽。
有機(jī)產(chǎn)物也可以是丙酮酸鹽衍生的產(chǎn)物。本文使用的術(shù)語“丙酮酸鹽衍生的產(chǎn)物”是指在不超過15個酶促步驟內(nèi)從丙酮酸鹽合成的任何化合物。酶促步驟是由具有酶活性的多肽催化的任何化學(xué)反應(yīng)或反應(yīng)系列。本文使用的術(shù)語“具有酶活性的多肽”是指催化其它物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)而在反應(yīng)完成時(shí)其本身不被破壞或改變的任何多肽。一般來說，酶多肽催化從一種或多種底物形成一種或多種產(chǎn)物。該多肽可具有任何類型的酶活性，包括，但不限于，與諸如烏頭酸酶，異檸檬酸脫氫酶，酮戊二酸脫氫酶，琥珀酸硫激酶，琥珀酸脫氫酶，延胡索酸酶，蘋果酸脫氫酶，檸檬酸合成酶，2，5-二氧戊酸脫氫酶，5-脫氫-4-脫氧-D-葡糖二酸脫氫酶，葡糖二酸脫水酶，乙醛脫氫酶，葡糖醛酸內(nèi)酯還原酶，L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶，2-脫氫-3-脫氧-D-戊酸醛縮酶，木糖酸脫水酶，木糖酸內(nèi)酯酶，D-木糖脫氫酶，乳酸脫氫酶，CoA-轉(zhuǎn)移酶，乳?；?CoA脫水酶，或丙烯酰-CoA水合酶的一種酶相關(guān)的酶活性。
重要的是應(yīng)注意到具有特定酶活性的多肽可以是一種天然存在的或者非天然存在的多肽。天然存在的多肽是具有天然發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的任何多肽，包括野生型和多態(tài)性多肽。該天然存在的多肽可從任何物種獲得，包括，但不限于哺乳動物，真菌，和細(xì)菌物種。非天然存在的多肽是具有在自然界中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的任何多肽。因此，非天然存在的多肽可以是天然存在的多肽的突變形式，或者構(gòu)建的多肽。例如，具有檸檬酸合成酶活性的非天然存在的多肽可以是保留了至少一些檸檬酸合成酶活性的天然存在的具有檸檬酸合成酶活性的多肽的突變形式。多肽可通過，例如，序列添加，缺失，和/或取代進(jìn)行突變。
有機(jī)產(chǎn)物如果需要超過15個酶促步驟從丙酮酸鹽合成則該產(chǎn)物不是丙酮酸鹽衍生的產(chǎn)物。丙酮酸鹽衍生的產(chǎn)物的例子包括，但不限于，檸檬酸鹽，α-酮戊二酸鹽，琥珀酸鹽，延胡索酸鹽，蘋果酸鹽，草酰乙酸鹽，2-脫氫-3-脫氧-D-木糖酸鹽，D-木糖酸鹽，D-木糖酸內(nèi)酯，D-木糖，丙烯酸鹽，乙酸鹽，乙醇，丁酸鹽，和乳酸鹽。
為了本發(fā)明的目的，可以是“游離酸”或“鹽”形式的羧酸鹽產(chǎn)物將使用鹽形式命名法稱呼。例如，乳酸將稱為乳酸鹽。因此，在這種情況下，可預(yù)料到術(shù)語“乳酸鹽”包括乳酸以及乳酸鹽。
本文使用的術(shù)語“核酸”包含RNA和DNA，包括cDNA，基因組DNA，和合成(例如，化學(xué)合成的)DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈。如果是單鏈，核酸可以是有義鏈或反義鏈。另外，核酸可以是環(huán)型或線型。涉及核酸分子和特定細(xì)胞時(shí)本文使用的術(shù)語“外源性”或“異源性”是指不是來自于天然發(fā)現(xiàn)的該特定細(xì)胞的任何核酸分子。因此，所有非天然存在的核酸分子一旦被導(dǎo)入細(xì)胞則認(rèn)為對該細(xì)胞是外源性的。重要的是應(yīng)注意到非天然存在的核酸分子可含有天然發(fā)現(xiàn)的核酸序列或核酸序列的片段，只要該核酸分子作為整體在自然界中不存在。例如，在表達(dá)載體內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子被認(rèn)為是非天然存在的核酸分子，因此，一旦導(dǎo)入細(xì)胞中則認(rèn)為對細(xì)胞是外源性的，因?yàn)樵摵怂岱肿幼鳛橐粋€整體(基因組DNA加上載體DNA)在自然界中不存在。因此，作為整體在自然界中不存在的任何載體，自主復(fù)制的質(zhì)粒，或病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，或皰疹病毒)都被認(rèn)為是非天然存在的核酸分子。同理通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段以及cDNA也被認(rèn)為是非天然存在的核酸分子，因?yàn)樗鼈円宰匀唤缰形窗l(fā)現(xiàn)的分離分子存在。同理含有以自然界未發(fā)現(xiàn)的方式排列的啟動子序列和多肽編碼序列(例如，cDNA或基因組DNA)的任何核酸分子也認(rèn)為是非天然存在的核酸分子。
術(shù)語“內(nèi)源性”是指不是外源性的基因組材料。一般來說，內(nèi)源性基因組材料在生物體，組織，或細(xì)胞內(nèi)形成，且未通過重組技術(shù)插入或修飾。內(nèi)源性基因組材料的范圍內(nèi)包含天然存在的變異。
重要的是還應(yīng)注意到天然存在的核酸分子對于特定細(xì)胞可能是外源性的。例如，從人X的細(xì)胞分離的整個染色體一旦被導(dǎo)入人Y的細(xì)胞則相對于人Y的細(xì)胞可認(rèn)為是外源性核酸分子。
本文使用的短語“遺傳修飾的”是指其基因組通過例如，添加，取代或缺失遺傳材料被修飾的生物體。添加或缺失遺傳材料的方法是已知的且包括，但不限于，隨機(jī)誘變，點(diǎn)突變，包括插入，缺失和取代，敲除技術(shù)，和使用重組技術(shù)用核酸序列轉(zhuǎn)化生物體，包括穩(wěn)定和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化子。酵母細(xì)胞也可天然或者由于遺傳修飾而分解代謝淀粉，且甚至可通過加入例如，基于真菌的纖維素酶遺傳修飾成分解代謝纖維素。
1.具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞本發(fā)明提供了具有crabtree-陰性表型的各種遺傳修飾的酵母細(xì)胞。該重組酵母細(xì)胞可用于生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物。例如，本發(fā)明提供了具有crabtree-陰性表型，且含有外源性核酸分子的酵母細(xì)胞，該核酸分子編碼具有導(dǎo)致有機(jī)產(chǎn)物形成的酶活性的多肽。只要它們產(chǎn)生該有機(jī)產(chǎn)物則該酵母細(xì)胞在本發(fā)明的范圍內(nèi)。應(yīng)注意產(chǎn)生的有機(jī)產(chǎn)物可從酵母細(xì)胞中分泌出來，這樣排除了需要破碎細(xì)胞膜以回收該有機(jī)產(chǎn)物。一般來說，在生產(chǎn)產(chǎn)物的最佳條件下培養(yǎng)時(shí)本發(fā)明的酵母細(xì)胞產(chǎn)生該有機(jī)產(chǎn)物的產(chǎn)量是每消耗100克葡萄糖產(chǎn)生至少大約40克(例如，至少大約45，50，55，65，70，75，80，85，90，或95克)的有機(jī)產(chǎn)物。當(dāng)測定特定酵母細(xì)胞的有機(jī)產(chǎn)物生產(chǎn)的產(chǎn)量時(shí)，可使用任何方法。例如，參見Kiers等，Yeast，14(5)459-469(1998)。還應(yīng)注意到編碼多肽的酶活性可導(dǎo)致以NADH-消耗方式形成有機(jī)產(chǎn)物。換句話說，該有機(jī)化合物的生產(chǎn)需要NADH作為能源。術(shù)語“NAD”是指在特定氧化-還原反應(yīng)中充當(dāng)電子和氫載體的輔因子，而術(shù)語“NADH”是指NAD的還原形式。其合成需要NADH的有機(jī)產(chǎn)物的例子包括，但不限于，乳酸鹽，乙醇，乙酸鹽，和丙烯酸鹽。一般來說，本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母細(xì)胞分解代謝諸如葡萄糖的己糖碳。然而，該酵母細(xì)胞也可分解代謝戊糖碳(例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和來蘇糖)。換句話說，本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母細(xì)胞可天然利用戊糖碳，或者可以改造成利用戊糖碳。例如，酵母細(xì)胞可接受一種編碼木糖還原酶，木糖醇脫氫酶，和/或木酮糖激酶的外源性核酸分子以便可分解代謝木糖。酵母細(xì)胞也可天然或者由于遺傳修飾而分解代謝淀粉，且甚至可通過加入，例如，基于真菌的纖維素酶而被遺傳修飾成分解代謝纖維素。具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞是不表現(xiàn)出crabtree效應(yīng)的任何酵母細(xì)胞。術(shù)語“crabtree-陰性”是指天然存在的和遺傳修飾的生物體。簡單地說，crabtree效應(yīng)定義為在需氧條件下培養(yǎng)時(shí)由于存在高葡萄糖濃度(例如，50克葡萄糖/L)微生物的氧消耗被抑制。換句話說，具有crabtree-陽性表型的酵母細(xì)胞由于葡萄糖的存在而不論氧是否可得均可繼續(xù)發(fā)酵，而具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞不表現(xiàn)出葡萄糖介導(dǎo)的氧消耗抑制。典型具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞的例子包括，但不限于，來自下列屬的酵母細(xì)胞克魯維酵母屬，畢赤酵母屬，漢遜酵母屬，假絲酵母屬，絲孢酵母屬和Yamadaryrna屬。
如本文所述，本發(fā)明提供了能產(chǎn)生眾多種類的不同有機(jī)產(chǎn)物的許多不同類型的重組酵母細(xì)胞。例如，酵母細(xì)胞可含有編碼具有乳酸脫氫酶活性的多肽的外源性核酸分子以便生產(chǎn)乳酸鹽。該多肽的例子包括，但不限于，牛乳酸脫氫酶，細(xì)菌乳酸脫氫酶，和真菌乳酸脫氫酶(例如，乳酸克魯維酵母或耐熱克魯維酵母真菌乳酸脫氫酶)。另外，具有諸如乳酸脫氫酶活性的酶活性的多肽可以是天然存在的或非天然存在的。重要的是應(yīng)注意到本文所述的酵母細(xì)胞可含有單拷貝或多拷貝(例如，大約5，10，20，35，50，75，100或150個拷貝)的特定外源性核酸分子。例如，酵母細(xì)胞可含有大約50個拷貝的外源性核酸分子X。重要的是還應(yīng)注意到本文所述的酵母細(xì)胞可含有一個以上的特定外源性核酸分子。例如，酵母細(xì)胞可含有大約50個拷貝的外源性核酸分子X以及大約75個拷貝的外源性核酸分子Y。在這些情況下，每個不同的核酸分子可編碼具有其自身獨(dú)特酶活性的不同多肽。例如，酵母細(xì)胞可含有4個不同的外源性核酸分子以便生產(chǎn)丙烯酸鹽。在該例子中，該酵母細(xì)胞可含有編碼具有乳酸脫氫酶活性的多肽的第一外源性核酸分子，編碼具有CoA-轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的第二外源性核酸分子，編碼具有乳?；?CoA脫水酶活性的多肽的第三外源性核酸分子，和編碼具有丙烯?；?CoA水合酶活性的多肽的第四外源性核酸分子。在另一例子中，酵母細(xì)胞可含有4個不同的外源性核酸分子以便產(chǎn)生D-木糖。具體地說，該酵母細(xì)胞可含有編碼具有2-脫氫-3-脫氧-D-戊酸醛縮酶活性的多肽的第一外源性核酸分子，編碼具有木糖酸脫水酶活性的多肽的第二外源性核酸分子，編碼具有木糖酸內(nèi)酯酶活性的多肽的第三外源性核酸分子，和編碼具有D-木糖脫氫酶活性的多肽的第四外源性核酸分子。在另一例子中，酵母細(xì)胞可含有6個不同的外源性核酸分子以便產(chǎn)生維生素，即L-抗壞血酸鹽。具體地說，該酵母細(xì)胞可含有編碼具有2，5-二氧戊酸脫氫酶活性的多肽的第一外源性核酸分子，編碼具有5-脫氫-4-脫氧-D-葡糖二酸脫氫酶活性的多肽的第二外源性核酸分子，編碼具有葡糖二酸脫水酶活性的多肽的第三外源性核酸分子，編碼具有乙醛脫氫酶活性的多肽的第四外源性核酸分子，編碼具有葡糖醛酸內(nèi)酯還原酶活性的多肽的第五外源性核酸分子，編碼具有L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶活性的多肽的第六外源性核酸分子。
重要的是應(yīng)注意到可使用酶多肽以便所需的有機(jī)產(chǎn)物是光學(xué)上純的(例如，大約90，95，99％的純度)。例如，具有(L)-乳酸脫氫酶活性的多肽可用于產(chǎn)生(L)-乳酸鹽。
本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母細(xì)胞也可具有降低的酶活性，例如丙酮酸脫羧酶和/或乙醇脫氫酶活性降低。對于細(xì)胞和特定的酶活性而言本文使用的術(shù)語“降低”是指酶活性的水平比在相同物種的可比酵母細(xì)胞中測量的水平更低。因此，缺乏丙酮酸脫羧酶活性的酵母細(xì)胞被認(rèn)為具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)(如果不是全部的話)可比酵母細(xì)胞具有至少一些丙酮酸脫羧酶活性。該降低的酶活性可以是酶濃度更低，酶比活更小，或者其結(jié)合的結(jié)果?？墒褂迷S多不同的方法制備酶活性降低的酵母細(xì)胞。例如，酵母細(xì)胞可使用常規(guī)誘變或敲除技術(shù)改造成具有被破壞的酶編碼基因座。參見，Methods inYeast Genetics(1997編輯)，Adams，Gottschling，Kaiser，和Stems，冷泉港出版社(1998)。作為選擇，可使用反義技術(shù)降低酶活性。例如，酵母細(xì)胞可改造成含有編碼防止酶制備的反義分子的cDNA。本文所用的術(shù)語“反義分子”包含含有相應(yīng)于內(nèi)源性多肽編碼鏈的序列的任何核酸分子。反義分子也可具有側(cè)翼序列(例如，調(diào)控序列)。因此，反義分子可以是核酶或反義寡核苷酸。核酶可具有任何常規(guī)結(jié)構(gòu)，包括，但不限于，發(fā)夾，錘頭，或斧頭狀結(jié)構(gòu)，只要該分子裂解RNA。
酶活性降低的酵母細(xì)胞可使用任何方法鑒定。例如，使用常規(guī)方法可容易地鑒定丙酮酸脫羧酶活性降低的酵母細(xì)胞。參見，Ulhrich，Methods inEnzymology 18109-115(1970)。
2.具有crabtree-陽性或crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞本發(fā)明還提供了各種遺傳改造的酵母細(xì)胞，該細(xì)胞不必具有crabtree-陰性表型，即該細(xì)胞可以是crabtree-陽性或crabtree-陰性。該重組酵母細(xì)胞可用于產(chǎn)生有機(jī)產(chǎn)物。例如，本發(fā)明提供了含有外源性核酸分子的酵母細(xì)胞，該核酸分子編碼促進(jìn)細(xì)胞戊糖碳(例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和來蘇糖)分解代謝的多肽。具體地說，酵母細(xì)胞可具有編碼木糖還原酶，木糖醇脫氫酶，和/或木酮糖激酶的外源性核酸分子使得木糖以更有效的方式被代謝。另外，能分解代謝戊糖碳的酵母細(xì)胞可還能依次或者同時(shí)分解代謝己糖碳(例如，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，iodose，半乳糖，和塔羅糖)。例如，可修飾酵母細(xì)胞以便同時(shí)分解代謝木糖和葡萄糖。應(yīng)注意分解代謝戊糖碳能力增強(qiáng)的酵母細(xì)胞可用于構(gòu)建能從戊糖碳源產(chǎn)生有機(jī)產(chǎn)物的酵母細(xì)胞。這一特征特別具有優(yōu)勢，因?yàn)橹T如木糖的戊糖碳一般比諸如葡萄糖的己糖碳更廉價(jià)。可被分解代謝的其它碳源包括，但不限于，蜜二糖，蔗糖，果糖，棉子糖，水蘇糖，淀粉(例如，玉米淀粉和小麥淀粉)，和水解產(chǎn)物(例如，玉米纖維水解產(chǎn)物和其它纖維素水解產(chǎn)物)。
另外，本發(fā)明提供了含有外源性核酸分子的酵母細(xì)胞，該核酸分子編碼促進(jìn)乙酰-CoA在細(xì)胞質(zhì)中積累的多肽。例如，酵母細(xì)胞可具有編碼具有檸檬酸裂合酶活性的多肽的外源性核酸分子。作為選擇，酵母細(xì)胞可具有編碼促進(jìn)乙酰-CoA穿透過線粒體膜的線粒體膜多肽的外源性核酸分子。應(yīng)注意到缺乏乙醇生產(chǎn)能力的許多酵母細(xì)胞在缺乏乙醇和乙酸鹽時(shí)不能生長。一般來說，當(dāng)丙酮酸脫羧酶或者乙醇脫氫酶活性以某種方式缺乏時(shí)酵母細(xì)胞缺乏產(chǎn)生乙醇的能力。例如，缺乏丙酮酸脫羧酶活性的crabtree-陽性酵母(例如，糖酵母屬在缺乏乙醇和乙酸鹽時(shí)難以生長。
因此，為了改道利用丙酮酸鹽產(chǎn)生其它有機(jī)產(chǎn)物(例如，乳酸鹽和丙烯酸鹽)，以減少乙醇生產(chǎn)的方式對該crabtree-陽性酵母的改造導(dǎo)致當(dāng)沒有乙醇和乙酸鹽時(shí)生長特性較差，特別是由于當(dāng)存在葡萄糖時(shí)crabtree-陽性酵母限制細(xì)胞呼吸。如本文所述，以非依賴于細(xì)胞質(zhì)乙酸鹽濃度和乙酰-CoA合成酶活性的一些方式可促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)乙酰-CoA積累的酵母細(xì)胞在沒有乙醇和乙酸鹽時(shí)即使不能產(chǎn)生乙醇也可生長。應(yīng)注意到具有在沒有乙醇和乙酸鹽時(shí)的生長能力但缺乏產(chǎn)生乙醇的能力的酵母細(xì)胞可改道利用丙酮酸鹽產(chǎn)生非乙醇的有機(jī)產(chǎn)物。
任何類型的酵母可含有編碼促進(jìn)乙酰-CoA在細(xì)胞質(zhì)中積累的多肽的外源性核酸分子。例如，具有crabtree-陰性或crabtree-陽性表型的酵母細(xì)胞可含有編碼促進(jìn)乙酰-CoA在細(xì)胞質(zhì)中積累的多肽的外源性核酸分子。一般來說，通過(1)改造含有外源性核酸分子的細(xì)胞使其缺乏丙酮酸脫羧酶或乙醇脫氫酶活性，(2)測定細(xì)胞的生長特征，同時(shí)在存在滴定量的呼吸抑制劑(例如，抗霉素A，氰化物，或疊氮化物)時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞，和(3)比較其生長特征與不含外源性核酸分子且也被改造成缺乏丙酮酸脫羧酶或乙醇脫氫酶活性的可比酵母細(xì)胞觀察到的生長特征可鑒定該酵母細(xì)胞。通過該比較由于存在外源性核酸分子測定為具有更良好的生長特征的酵母細(xì)胞被認(rèn)為是含有編碼促進(jìn)乙酰-CoA在細(xì)胞質(zhì)中積累的多肽的外源性核酸分子。
含有編碼促進(jìn)乙酰-CoA在細(xì)胞質(zhì)中積累的多肽的外源性核酸分子的酵母細(xì)胞也可具有降低的酶活性，例如降低的丙酮酸脫羧酶和/或乙醇脫氫酶活性。例如，，酵母細(xì)胞可缺乏產(chǎn)生乙醇的能力。一般來說，該酵母細(xì)胞在缺乏乙醇和乙酸鹽的培養(yǎng)條件下的生長率比不含外源性核酸分子且也在相似條件(即缺乏乙醇和乙酸鹽的培養(yǎng)條件)下培養(yǎng)的可比酵母細(xì)胞(即缺乏乙醇生產(chǎn)能力的酵母細(xì)胞)觀察到的生長率更高(例如，高大約百分之5，10，20，35，50，75，100，150，200，或更高)。
本發(fā)明還提供了具有多肽活性降低的酵母細(xì)胞。該酵母細(xì)胞可具有crabtree-陽性或crabtree-陰性表型。例如，本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母細(xì)胞具有活性降低的胞質(zhì)膜多肽(例如，胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，細(xì)胞質(zhì)多肽(例如，丙酮酸脫羧酶)，和/或線粒體多肽(例如，丙酮酸脫氫酶)。術(shù)語“胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”是指幫助有機(jī)產(chǎn)物移動通過胞質(zhì)膜的多肽。該多肽的例子包括，但不限于諸如釀酒酵母中的JEN1(Genbank登錄號U241 55)的羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。術(shù)語“線粒體多肽”是指在線粒體內(nèi)起作用的任何多肽，包括，但不限于，丙酮酸脫氫酶，參與乳酸鹽或乙酰-CoA分解代謝的多肽(例如，細(xì)胞色素b2多肽)，和三羧酸循環(huán)酶。三羧酸循環(huán)酶包括烏頭酸酶，異檸檬酸脫氫酶，酮戊二酸脫氫酶，琥珀酸硫激酶，琥珀酸脫氫酶，延胡索酸酶，蘋果酸脫氫酶，和檸檬酸合成酶。如本文所述，酶活性降低的酵母細(xì)胞包括完全缺乏特定酶活性的酵母細(xì)胞。重要的是應(yīng)注意本文使用的術(shù)語“降低的”對于酵母細(xì)胞和多肽活性是指比在相似條件下在相同種類的可比酵母細(xì)胞中測量的活性水平更低。因此，如果可比細(xì)胞具有至少一些轉(zhuǎn)運(yùn)活性則缺乏特定轉(zhuǎn)運(yùn)活性的酵母細(xì)胞認(rèn)為是具有降低的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。該降低的多肽活性可以是由于多肽濃度更低，多肽比活更低，或其結(jié)合。可使用各種方法中的任一種制備具有多肽活性降低的酵母細(xì)胞。例如，可使含有編碼線粒體多肽的核酸序列的基因座失活，例如，通過常規(guī)誘變或敲除技術(shù)可使其失活。
應(yīng)注意到線粒體酶活性降低的酵母細(xì)胞可積累三羧酸循環(huán)產(chǎn)物(例如，檸檬酸鹽，異檸檬酸鹽，α-酮戊二酸，琥珀酰-CoA，琥珀酸鹽，延胡索酸鹽，蘋果酸鹽，和草酰乙酸鹽)。例如，延胡索酸酶活性降低的酵母細(xì)胞可積累延胡索酸鹽。另外，酵母細(xì)胞可含有編碼一種多肽的外源性核酸分子，該多肽具有導(dǎo)致形成一種有機(jī)產(chǎn)物的酶活性，以便該細(xì)胞可產(chǎn)生該有機(jī)產(chǎn)物。
重要的是應(yīng)注意有些三羧酸循環(huán)產(chǎn)物不能穿透線粒體膜(例如，α-酮戊二酸，琥珀酰-CoA)。因此，特定三羧酸循環(huán)酶活性降低將導(dǎo)致某些三羧酸循環(huán)產(chǎn)物在線粒體腔內(nèi)積累。在這種情況下，具有三羧酸循環(huán)酶活性降低的酵母細(xì)胞可改造成含有一個或多個不同的外源性核酸分子，每個核酸分子編碼一個具有不同酶活性的多肽，使得所需三羧酸循環(huán)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累。例如，酮戊二酸脫氫酶活性降低將導(dǎo)致α-酮戊二酸積累，后者又將導(dǎo)致異檸檬酸鹽積累。α-酮戊二酸不能穿透線粒體膜，而異檸檬酸鹽可穿透線粒體膜。因此，異檸檬酸鹽可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累。然而，也含有編碼具有異檸檬酸脫氫酶活性的多肽的外源性核酸分子并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)該功能性多肽的酵母細(xì)胞可產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)α-酮戊二酸。因此，降低特定三羧酸循環(huán)酶的活性同時(shí)提供編碼在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有功能的相同(或不同)三羧酸循環(huán)酶的外源性核酸分子可導(dǎo)致在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生各種三羧酸循環(huán)產(chǎn)物(或三羧酸循環(huán)產(chǎn)物的衍生產(chǎn)物)。
另外，本發(fā)明提供了具有降低的酶活性且從生物量或所需有機(jī)產(chǎn)物的生產(chǎn)轉(zhuǎn)移碳源利用的酵母細(xì)胞。例如，可破壞甘油或某些途徑內(nèi)的酶并利用培養(yǎng)基內(nèi)的碳源主要生產(chǎn)生物量或所需有機(jī)產(chǎn)物。甘油途徑酶的例子包括，但不限于，二羥丙酮磷酸還原酶。某些途徑酶的例子包括，但不限于α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脫羧酶。另外，可使用任何方法降低酶活性。
另外，本文提供的任一酵母細(xì)胞可含有充當(dāng)殺傷質(zhì)粒(killer plasmid)的外源性核酸分子。本文使用的術(shù)語“殺傷質(zhì)粒”是指給一種酵母提供殺傷另一種酵母的能力的核酸分子。例如，含有殺傷質(zhì)粒的來自克魯維酵母屬的酵母細(xì)胞可防止來自糖酵母屬的酵母生長。因此，具有殺傷質(zhì)粒的酵母細(xì)胞可用于防止在大規(guī)模生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的污染問題。另外，可給酵母細(xì)胞提供任何類型的殺傷質(zhì)粒。例如，從K.thetis分離的殺傷質(zhì)?？杀惶峁┙o馬克斯克魯維酵母細(xì)胞。使用常規(guī)方法可容易地鑒定含有殺傷質(zhì)粒的酵母細(xì)胞。參見，例如，Gunge等，J.Bacteriol.145382-390(1981)；Gunge和Kitada，Eur.J.Epidemiol.，4409-414(1988)；和Wesolowski-Louvel等，Nonconventional yeasts in Biotechnology；乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)，Klaus Wolf，Springer Verlag編輯，柏林，第138-201頁(1996)。
同樣，本文提供的任一酵母細(xì)胞可含有編碼具有修飾的ATP酶活性的多肽的外源性核酸分子使得該酵母細(xì)胞變得對低pH環(huán)境更有耐受性。例如，酵母細(xì)胞可接受一種ATP酶，當(dāng)細(xì)胞外質(zhì)子濃度高時(shí)它能有效維持低細(xì)胞質(zhì)質(zhì)子濃度。該多肽可按Morsomme等(EMBOJ.155513-5526(1996))所述構(gòu)建。
重要的是應(yīng)注意本文所述的任一重組酵母細(xì)胞可含有任意組合的所述遺傳操作。例如，具有crabtree-陽性表型的酵母細(xì)胞可含有編碼具有檸檬酸裂合酶活性的多肽的外源性核酸分子以及編碼具有導(dǎo)致形成一種有機(jī)產(chǎn)物的酶活性的多肽的外源性核酸分子。
3合適的生物體各種生物體均適合于根據(jù)本發(fā)明的用途。除了諸如包括釀酒酵母(S.Cerevisiae)和葡萄汁酵母的糖酵母種類，包括耐熱克魯維酵母，乳酸克魯維酵母，和馬克斯克魯維酵母的克魯維酵母種類，畢赤酵母種類，包括多形漢遜酵母(H.polymorpha)的漢遜酵母種類，假絲酵母種類，絲孢酵母種類，包括Y.styptic.的Yamadazyma，或Torulaspora pretoriensis的crabtree陰性和crabtree陽性酵母微生物外，來自大批微生物種類的生物體也可用作乳酸生產(chǎn)的宿主。例如，可遺傳修飾諸如米根霉(Rhizopus oryzae)，一種天然乳酸生產(chǎn)菌的生物體的酸耐受性，產(chǎn)量提高，和光學(xué)上純的乳酸。也已知曲霉屬(Aspergillus)種類生產(chǎn)諸如檸檬酸的各種有機(jī)酸且耐受低pH。遺傳修飾曲霉屬種類以生產(chǎn)乳酸的方法是可得到的。另外，諸如根霉菌屬(Rhizopus)和曲霉屬種類的真菌產(chǎn)生使其能將淀粉和其它糖類聚合物降解成單體糖類以用作碳源的酶。
諸如大腸桿菌，Zymomonasmobilis和芽孢桿菌(bacillus)屬種類的原核生物已經(jīng)或者可被遺傳修飾用于乳酸生產(chǎn)。被鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulas)的微生物也是乳酸的天然生產(chǎn)菌，它可被進(jìn)一步經(jīng)遺傳修飾以提高低pH的乳酸生產(chǎn)。另外，來自Archea科的嗜極端菌生物體可耐受極端的低pH和高溫。對來自該科的選定種類的遺傳修飾可提供乳酸生產(chǎn)菌。
4.遺傳學(xué)方面可使用任何方法鑒定并獲得編碼具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，標(biāo)準(zhǔn)核酸測序技術(shù)和根據(jù)遺傳密碼將核酸序列翻譯成氨基酸序列的軟件程序可用于確定特定核酸序列與已知酶多肽是否具有任何序列同源性?？墒褂弥T如MEGALIGN(DNASTAR，Madison，WI，1997)的序列對比軟件來比較各種序列。另外，使用常規(guī)分子克隆技術(shù)(例如，定點(diǎn)誘變)可突變編碼已知酶多肽的核酸分子。可能的突變包括，但不限于，缺失，插入，和堿基取代，以及缺失，插入，和堿基取代的結(jié)合。另外，可使用核酸和氨基酸數(shù)據(jù)庫(例如，GenBank)鑒定編碼具有酶活性的多肽的核酸序列。簡單地說，與具有酶活性的多肽具有一些同源性的任何氨基酸序列，或與編碼具有酶活性的多肽的序列具有一些同源性的任何核酸序列都可用作檢索詞來檢索GenBank。然后可分析鑒定的多肽以測定它們是否表現(xiàn)出酶活性。
使用常規(guī)分子克隆或包括PCR的化學(xué)核酸合成方法和技術(shù)可鑒定并獲得編碼具有酶活性的多肽的核酸分子。PCR是指與美國專利號4,683,195所述，和后來對其所述方法的改良方法以相似的方式擴(kuò)增靶核酸的方法或技術(shù)。一般來說，使用目的區(qū)域末端或更遠(yuǎn)處的序列信息設(shè)計(jì)與待擴(kuò)增的潛在模板的互補(bǔ)鏈在序列上相同或相似的寡核苷酸引物。使用PCR，可從RNA或DNA擴(kuò)增核酸序列。例如，從總細(xì)胞RNA，總基因組DNA，和cDNA以及從噬菌體序列，質(zhì)粒序列，病毒序列等通過PCR擴(kuò)增可分離核酸序列。當(dāng)使用RNA作為模板來源時(shí)，可使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA鏈。
另外，可使用核酸雜交技術(shù)來鑒定并獲得編碼具有酶活性的多肽的核酸分子。簡單地說，可使用編碼已知酶多肽的任何核酸分子，或其片斷作為探針通過在中度至高度嚴(yán)格條件下雜交來鑒定相似的核酸分子。然后可分離，測序，并分析該相似的核酸分子以確定該編碼肽是否具有酶活性。通過Southern或Northern分析可進(jìn)行雜交以分別鑒定與探針雜交的DNA或RNA序列。探針可用諸如32P的放射性同位素，酶，洋地黃毒苷標(biāo)記，或通過生物素標(biāo)記法標(biāo)記。待分析的DNA或RNA可在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，尼龍，或其它合適薄膜上并使用本領(lǐng)域熟知的諸如Sambrook等(1989)，Molecular Cloning，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Plainview，NY的7.39-7.52章節(jié)所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)與探針雜交。一般來說，探針長度為至少大約20個核苷酸。例如，可使用相應(yīng)于編碼哺乳動物檸檬酸裂合酶的20個核苷酸序列的探針來鑒定編碼具有檸檬酸裂合酶活性的真菌多肽的核酸分子。另外，可使用比20個核苷酸更長或更短的探針。
可使用任何方法將外源性核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞。事實(shí)上，將核酸導(dǎo)入酵母細(xì)胞的許多方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如，原生質(zhì)的轉(zhuǎn)化，電穿孔，接合，和融合是將核酸導(dǎo)入酵母細(xì)胞的常規(guī)方法。參見，例如，Ito等，J.Bacterol.153163-168(1983)；Durrens等，Curr Genet.187-12(1990)；和Becker和Guarente，Methods in Enzymology194182-187(1991)。
重要的是應(yīng)注意本發(fā)明的酵母細(xì)胞中包含的外源性核酸分子可以任何方式在該細(xì)胞內(nèi)維持。例如，外源性核酸分子可整合進(jìn)細(xì)胞基因組中或以游離狀態(tài)維持。換句話說，本發(fā)明的細(xì)胞可以是穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化子。另外，本文所述的酵母細(xì)胞可含有單拷貝，或多拷貝(例如，大約5，10，20，35，50，75，100或150個拷貝)的上述特定外源性核酸分子。從外源性核酸分子表達(dá)氨基酸序列的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。該方法包括，但不限于構(gòu)建核酸使得調(diào)控元件啟動編碼多肽的核酸序列表達(dá)。一般來說，調(diào)控元件是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控其它DNA序列表達(dá)的DNA序列。因此，調(diào)控元件包括，但不限于，啟動子，增強(qiáng)子等。另外，在酵母中從外源性核酸分子表達(dá)多肽的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。例如，能在克魯維酵母中表達(dá)外源性多肽的核酸構(gòu)建體是熟知的。參見，例如，美國專利號4,859,596和4,943,529。
如本文所述，本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母細(xì)胞含有外源性核酸分子，例如，編碼具有導(dǎo)致形成一種有機(jī)產(chǎn)物的酶活性的多肽的外源性核酸分子。鑒定含有外源性核酸的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。該方法包括，但不限于，PCR和諸如Northern和Southern分析的核酸雜交技術(shù)。在某些情況下，可使用免疫組織化學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)通過檢測由特定核酸分子編碼的酶多肽的表達(dá)來確定細(xì)胞是否含有特定核酸。例如，可使用對編碼酶具有特異性的抗體鑒定特定酵母細(xì)胞是否含有該編碼酶。另外，可使用生物化學(xué)技術(shù)通過檢測由于酶多肽的表達(dá)而產(chǎn)生的有機(jī)產(chǎn)物來確定細(xì)胞是否含有編碼酶多肽的特定核酸分子。
例如，將編碼具有乳酸脫氫酶活性的多肽的外源性核酸分子導(dǎo)入正常情況下不表達(dá)該多肽的酵母細(xì)胞后檢測乳酸鹽可指示該酵母細(xì)胞不僅含有導(dǎo)入的外源性核酸分子，而且還從該導(dǎo)入的外源性核酸分子表達(dá)編碼的酶多肽。檢測特定酶活性或特定有機(jī)產(chǎn)物的存在的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如，乳酸鹽的存在可按在別處的描述測定。參見，Witte等，J.BasicMicrobiol.29707-716(1989)。
本發(fā)明還提供了含有重組序列和選定序列的核酸構(gòu)建體。本文所用的術(shù)語“重組序列”是指相應(yīng)于在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的基因組序列的任何核酸序列。本文所述的重組序列可用于在產(chǎn)生敲除生物體期間指導(dǎo)重組事件。換句話說，重組序列可用于特異性破壞含有編碼特定酶的核酸序列的基因座。
本文所用的術(shù)語“選定序列”包括任何核酸序列。一般來說，選定序列編碼具有導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)形成有機(jī)產(chǎn)物的酶活性的多肽。因此，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可用于在一個步驟中敲除內(nèi)源性酶活性并加入外源性酶活性。在大多數(shù)情況下，選定序列在重組序列內(nèi)使得選定序列的每一端側(cè)翼是重組序列。
5.有機(jī)產(chǎn)物的生產(chǎn)和培養(yǎng)方法本發(fā)明提供了使用本文提供的任何酵母細(xì)胞或其它微生物細(xì)胞生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的方法。該方法包括提供酵母細(xì)胞和用培養(yǎng)基培養(yǎng)所提供的酵母細(xì)胞以便產(chǎn)生一種有機(jī)產(chǎn)物(例如，甘油，丙烯酸鹽，木糖，抗壞血酸鹽，乳酸鹽，檸檬酸鹽，異檸檬酸鹽，α-酮戊二酸，琥珀酰-CoA，琥珀酸鹽，延胡索酸鹽，蘋果酸鹽，和草酰乙酸鹽)。一般來說，培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件可分類成兩種類型中的一種促進(jìn)細(xì)胞呼吸和/或生物量生產(chǎn)的培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件和減少細(xì)胞呼吸的培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件。一般來說，促進(jìn)細(xì)胞呼吸的培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件在如果需要迅速生長，或者如果生產(chǎn)的有機(jī)產(chǎn)物在沒有細(xì)胞呼吸時(shí)不能產(chǎn)生的情況下使用。該有機(jī)產(chǎn)物可包括，但不限于三羧酸循環(huán)產(chǎn)物。另一方面，減少細(xì)胞呼吸的培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件在如果不需要或者不希望迅速生長，或者如果生產(chǎn)的有機(jī)產(chǎn)物在沒有細(xì)胞呼吸時(shí)可以產(chǎn)生的情況下使用。該有機(jī)產(chǎn)物包括，但不限于，乳酸鹽，丙烯酸鹽，和木糖。
本文使用的短語“促進(jìn)細(xì)胞呼吸”或“促進(jìn)生物量生產(chǎn)”當(dāng)是指培養(yǎng)條件時(shí)，意思是維持該細(xì)胞培養(yǎng)條件以便培養(yǎng)基內(nèi)的碳源主要通過氧化呼吸被代謝或者主要代謝為產(chǎn)生生物量。本文所用的術(shù)語“生物量”是指生物體的干重。本文所用的短語“主要代謝為產(chǎn)生生物量”意思是消耗每克碳源(以糖類形式)產(chǎn)生至少大約0.3克生物量(例如，至少大約0.4，0.45，0.5或0.6克生物量)。一般來說，每克碳源產(chǎn)生的生物量在大約0.3至大約0.6克之間。測定培養(yǎng)物中的生物量(細(xì)胞干重)含量的方法是已知的且包括，例如，Postma等，“釀酒酵母在限制葡萄糖的化學(xué)恒定培養(yǎng)中Crabtree效應(yīng)的酶學(xué)分析”，Appl Environ.Microbiol.53，468-477(1989)；和Kliers等，“Kluyveromyces lactis CBS 2359在分批和化學(xué)恒定培養(yǎng)中乙醇發(fā)酵的調(diào)節(jié)”，Yeast，14，459-469(1998)所述的方法。測定消耗的碳源量的方法是已知的，且包括，例如HPLC方法。
應(yīng)注意到碳源利用的效率依賴于碳源和生物體。因此，盡管可使用包含非糖類碳源的復(fù)合生長培養(yǎng)基，但是每克碳源產(chǎn)生的生物量僅僅是指消耗每克糖類碳源產(chǎn)生的生物量。
一般來說，含有細(xì)胞呼吸抑制劑的培養(yǎng)基(例如，抗霉素A，氰化物，和疊氮化物)可減少細(xì)胞呼吸，而缺乏該抑制劑可促進(jìn)細(xì)胞呼吸。同樣，厭氧培養(yǎng)條件可減少細(xì)胞呼吸，而需氧培養(yǎng)條件可促進(jìn)細(xì)胞呼吸。需氧條件是氧被導(dǎo)入或者天然存在且用作呼吸途徑底物的任何條件。一般來說，術(shù)語“需氧”是指在空氣流速至少0.1VVM(空氣體積/液體體積/分鐘)(例如，大于0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，1.5或2.0VVM)維持培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件。
如果使用非空氣的氣體，那么可根據(jù)氣體的氧含量將名義上的VVM調(diào)節(jié)到與空氣相當(dāng)。另外，“需氧”可定義為具有相對于在大氣壓下空氣飽和狀態(tài)存在的含量的至少百分之2(例如，至少百分之5，10，20，30，40，50，60，75或80)的溶解氧含量的培養(yǎng)基。厭氧條件是其中故意或者天然使得呼吸途徑基本上得不到氧，導(dǎo)致，例如產(chǎn)生諸如乙醇的還原產(chǎn)物的任何條件。一般來說，如果培養(yǎng)基具有不超過大約2.0％(例如，不超過大約1.5，1.0，或0.5％，或等于大約0％)的溶解氧(DO)含量的條件認(rèn)為是厭氧條件。同樣，具有不超過大約0.1(例如，不超過大約0.05，或等于大約0)的VVM(空氣體積/液體體積/分鐘)的條件認(rèn)為是厭氧條件。一般來說，對于VVM，本文使用的術(shù)語“空氣”是指大氣中存在的空氣。可影響細(xì)胞呼吸的其它培養(yǎng)條件包括，但不限于，pH，溫度，和特定碳源(例如，葡萄糖)的存在。重要的是應(yīng)注意在一種酵母內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞呼吸的一些培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件可減少另一種內(nèi)的細(xì)胞呼吸。例如，培養(yǎng)基內(nèi)存在葡萄糖在具有crabtree-陽性表型的酵母細(xì)胞中減少細(xì)胞呼吸而在具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞中對細(xì)胞呼吸具有很小或沒有影響。
商業(yè)生產(chǎn)期間培養(yǎng)條件的定向控制可以是達(dá)到本文所述的所需有機(jī)產(chǎn)物的最佳水平的一個重要步驟。一般來說，本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母細(xì)胞在促進(jìn)細(xì)胞呼吸的培養(yǎng)條件下生長以產(chǎn)生有效的細(xì)胞密度。例如，酵母細(xì)胞可放入培養(yǎng)容器中，并供給充足的葡萄糖和氧。一般來說，在促進(jìn)細(xì)胞呼吸的條件下，本文提供的微生物的倍增時(shí)間不超過大約10小時(shí)(例如，不超過大約8，5，或3小時(shí))。一旦細(xì)胞達(dá)到有效密度，可將培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)換成減少細(xì)胞呼吸的條件以便產(chǎn)生不需要細(xì)胞呼吸的有機(jī)產(chǎn)物。例如，可將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)培養(yǎng)容器中并供給充足的葡萄糖，但沒有氧。在這種情況下，直接控制培養(yǎng)條件使其從需氧轉(zhuǎn)換到厭氧可產(chǎn)生最佳水平的所需有機(jī)產(chǎn)物。另外，在有些情況下，細(xì)胞僅僅在促進(jìn)細(xì)胞呼吸的條件下培養(yǎng)以便產(chǎn)生需要細(xì)胞呼吸的有機(jī)產(chǎn)物。應(yīng)注意生產(chǎn)容器內(nèi)的細(xì)胞量一般高于大約2g/L(例如高于大約4，6，或8g/L)。
培養(yǎng)期間，溫度可高于大約35℃(例如，高于大約36，37，38，39，40，41，42，43，44，或45℃)。另外，培養(yǎng)基可以是液體的。培養(yǎng)基一般含有碳源。一般來說，碳源包括含糖類的原材料。一般來說，營養(yǎng)培養(yǎng)基還含有氮源。優(yōu)選的氮源包括有機(jī)和無機(jī)含氮化合物的組合。在一種操作方式中，需要用培養(yǎng)基填充大型發(fā)酵容器，該培養(yǎng)基包含為生物量生產(chǎn)和目的產(chǎn)物生產(chǎn)足夠的所有必需營養(yǎng)成分和所有糖類。該容器開始可在例如，通過提供需氧條件促進(jìn)生物量生產(chǎn)的條件下運(yùn)轉(zhuǎn)，然后轉(zhuǎn)換成以另一運(yùn)轉(zhuǎn)方式生產(chǎn)目的產(chǎn)物的厭氧條件，較小容器用于生物量生產(chǎn)，以高水平的營養(yǎng)成分和足夠的糖類產(chǎn)生例如，大約100g/L生物量。然后可將該容器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移進(jìn)含有第二培養(yǎng)基的較大容器中，該培養(yǎng)基含有較少的營養(yǎng)成分，例如僅有葡萄糖作碳源或在水中的其它糖類碳源。該容器可在生產(chǎn)所需有機(jī)產(chǎn)物的厭氧條件下運(yùn)轉(zhuǎn)。由于營養(yǎng)水平降低和厭氧條件導(dǎo)致生物量生長降低。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，營養(yǎng)培養(yǎng)基僅維持必需物質(zhì)以簡化目的產(chǎn)物的回收。相對于如果需要在厭氧條件下生長所需的培養(yǎng)基，使用需氧生長允許簡化所用的培養(yǎng)基。許多本文所述的酵母可在需氧條件下，在僅由糖類，無機(jī)氮源，微量礦物質(zhì)，和一些維生素組成的培養(yǎng)基中生長。由于發(fā)酵或其它過程有機(jī)產(chǎn)物加入培養(yǎng)基前，培養(yǎng)基一般具有在大約5.0和7.0之間的pH。然而，隨著諸如有機(jī)酸的有機(jī)產(chǎn)物由微生物分泌進(jìn)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的pH傾向于降低。本文使用的術(shù)語“有機(jī)pH”是指由培養(yǎng)基中存在的諸如羧酸，例如乳酸的有機(jī)化合物產(chǎn)生的培養(yǎng)基的pH。本文所用的術(shù)語“無機(jī)pH”是指諸如HCl和H2SO4的無機(jī)化合物產(chǎn)生的pH。培養(yǎng)基可具有不超過大約3.0(例如，不超過大約2.9，2.8，2.7，2.6，2.5，2.4，2.3，2.2，2.1，2.0，1.9，1.8，1.7，1.6，或1.5)的有機(jī)pH值，或不超過大約3.0(例如，不超過大約2.9，2.8，2.7，2.6，2.5，2.4，2.3，2.2，2.1，2.0，1.9，1.8，1.7，1.6，或1.5)的無機(jī)pH值。培養(yǎng)過程中可使用任何碳源。例如，可使用含有戊糖碳(例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和來蘇糖)的培養(yǎng)基。另外，可使用含有玉米纖維水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基。玉米纖維水解產(chǎn)物可具有2.0和6.5之間的pH值。一般來說，玉米纖維水解產(chǎn)物含有葡萄糖，木糖，和阿拉伯糖。例如，玉米纖維水解產(chǎn)物可含有大約40克/L葡萄糖，大約40克/L木糖，和大約20克/L阿拉伯糖。對于大規(guī)模生產(chǎn)過程，可使用下面的方法。首先，用特定微生物接種含有合適培養(yǎng)基的大發(fā)酵罐(例如，50-，100-，200-，或更大加侖數(shù)的發(fā)酵罐)，其中該培養(yǎng)基含有例如，己糖和/或戊糖碳。接種后，可控制培養(yǎng)條件使得碳源主要用于生產(chǎn)生物量。例如，培養(yǎng)基可調(diào)節(jié)成具有大約7.0的pH值，大約35℃的溫度，在整個發(fā)酵罐中產(chǎn)生需氧環(huán)境的溶氧量。應(yīng)注意到所需的有機(jī)產(chǎn)物可在該生物量生產(chǎn)階段期間產(chǎn)生。一旦達(dá)到足夠的生物量，可將含有微生物的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移進(jìn)第二發(fā)酵罐。該第二發(fā)酵罐可以是任意大小。例如，第二發(fā)酵罐可以更大，更小，或與第一發(fā)酵罐具有相同大小。一般來說，第二發(fā)酵罐比第一發(fā)酵罐更大以便可向來自第一發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中加入另外的培養(yǎng)基。此外，第二發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基可與第一發(fā)酵罐使用的培養(yǎng)基相同或不同。例如，第一發(fā)酵罐可含有帶木糖和阿拉伯糖的培養(yǎng)基，而第二發(fā)酵罐含有帶葡萄糖的培養(yǎng)基。
一旦轉(zhuǎn)移，可控制第二發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件使得碳源主要用于生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物，其中“有機(jī)產(chǎn)物”包括丙酮酸鹽衍生產(chǎn)物和二氧化碳(CO2)等，但不包括生物量(即，細(xì)胞干重)。本文使用的短語“主要生產(chǎn)‘選定的有機(jī)產(chǎn)物’”或“選定的丙酮酸鹽衍生產(chǎn)物”當(dāng)指培養(yǎng)條件時(shí)，意思是培養(yǎng)基內(nèi)的碳源一般通過發(fā)酵過程(盡管不是必須的)被代謝，使得消耗每克碳源形成至少0.5克有機(jī)產(chǎn)物(例如，至少0.6，0.75或0.8克有機(jī)產(chǎn)物)。測定產(chǎn)生的有機(jī)產(chǎn)物和/或消耗的碳源的量的方法是已知的且包括，例如，HPLC。
如以前所述，碳源利用的效率可依賴于底物和生物體而變化。因此，盡管可使用包含非糖類碳源(例如，氨基酸)的復(fù)合生長培養(yǎng)基，但是每克碳源產(chǎn)生的有機(jī)產(chǎn)物或丙酮酸鹽衍生產(chǎn)物的量僅僅是指消耗每克糖類碳源產(chǎn)生的有機(jī)產(chǎn)物或丙酮酸鹽衍生產(chǎn)物的量。優(yōu)選的是，在這一階段，每克碳源產(chǎn)生不超過0.3克的生物量(例如，不超過0.2，0.1，或0.05克生物量)。例如，可將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成具有在整個發(fā)酵罐產(chǎn)生厭氧環(huán)境的溶氧含量，或含有細(xì)胞呼吸抑制劑。另外，可調(diào)節(jié)培養(yǎng)基使其維持特定的pH值(例如，酸性，中性，或堿性pH10的值)。作為選擇，可定期調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH而不維持在任何特定的pH值。一般來說，當(dāng)生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物時(shí)，培養(yǎng)基的pH值維持在至少大約1.5(例如，至少大約2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，或7.0)以上。另外，隨著微生物分解代謝所提供的碳源，發(fā)酵罐內(nèi)的溫度會升高。因此，可調(diào)節(jié)培養(yǎng)基使其維持特定的溫度。作為選擇，可定期調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的溫度而不維持在任何特定的溫度。一般來說，當(dāng)使用熱敏感性微生物時(shí)維持在不超過大約35℃(例如，不超過大約34，33，32，31，或30℃)的溫度，而當(dāng)使用熱不敏感性微生物時(shí)維持在不超過大約45℃(例如，不超過大約44，43，42，41，40，39，38，37，36，或35℃)的溫度。應(yīng)注意到在該有機(jī)產(chǎn)物生產(chǎn)期間可生產(chǎn)生物量。另外，第二發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)條件可一次或多次從促進(jìn)產(chǎn)物生產(chǎn)的條件轉(zhuǎn)換到促進(jìn)生物量生產(chǎn)的條件，反之亦然。例如，第二發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)條件可在大多數(shù)時(shí)間是厭氧的，并有短暫的溶氧脈沖使其定期存在需氧條件。
在另一方法中，可修改厭氧培養(yǎng)條件以便通過，例如，加入末端電子受體來增加培養(yǎng)微生物的代謝能量。本文使用的術(shù)語“代謝能量”是指生物體從能源(例如碳源)產(chǎn)生的能量(以ATP形式)。在有些情況下，生物體從碳源代謝獲得的代謝能量的量高于在不同條件下從相同碳源獲得的能量。
活細(xì)胞是高度有序的且必需在其內(nèi)部建立有序使其存活和生長。為了維持生物體內(nèi)的有序，生物體內(nèi)在任一瞬間會發(fā)生成千次不同的化學(xué)反應(yīng)。例如，細(xì)胞需要能量用于諸如DNA，RNA和蛋白質(zhì)聚合反應(yīng)的生物合成反應(yīng)和形成代謝產(chǎn)物。細(xì)胞也需要能量用于將底物攜帶進(jìn)細(xì)胞，保持細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物，維持合適的膨壓和內(nèi)部pH，以及用于運(yùn)動。由于不能產(chǎn)生或者破壞了能量，細(xì)胞需要從環(huán)境中輸入能量以維持有序。能量一般以電磁輻射或化學(xué)能量的形式從環(huán)境提供。從環(huán)境獲得的能量通過兩個常規(guī)生化機(jī)制之一底物水平磷酸化和電子傳遞被使用的細(xì)胞所駕馭。一般來說，在厭氧條件下，ATP(能量的“細(xì)胞貨幣”)通過底物水平磷酸化產(chǎn)生。在底物水平磷酸化中，能量從化學(xué)鍵釋放且主要以ATP的形式儲存。底物水平形成的一個例子是葡萄糖通過糖酵解轉(zhuǎn)變成丙酮酸
然后丙酮酸可轉(zhuǎn)變成乳酸
上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的凈能量等于2個ATP。
丙酮酸可進(jìn)一步進(jìn)行三羧酸(TCA)循環(huán)并產(chǎn)生另外的能量和氫原子
葡萄糖呼吸的凈反應(yīng)
因此，通過底物水平磷酸化，葡萄糖完全呼吸成CO2將提供相當(dāng)于4個ATP的凈能量和24個氫原子。在“電子傳遞”中，構(gòu)成“電子傳遞鏈”成員的化合物的氧化-還原潛力是平衡的使得各成員可被在前成員的還原形式所還原。因此，還原力以電子形式通過載體分子鏈流向諸如氧(O2)，硝酸鹽(NO3)，和延胡索酸鹽的末端電子受體。向培養(yǎng)基中加入諸如氧，硝酸鹽或延胡索酸鹽的末端電子受體可給微生物提供增加的代謝能量(例如，消耗相同量的碳源增加ATP生產(chǎn))。
氧是最優(yōu)選的末端電子受體。例如，如果使用氧作為末端電子受體，通過電子傳遞鏈可加工氫并給細(xì)胞提供額外的每個氫原子1.5個ATP和每個氧原子3個ATP。一般來說，通過測量耗氧量與消耗的葡萄糖量的比率可測定代謝能量的量。表1列出了生產(chǎn)期間加入氧時(shí)能量產(chǎn)量的預(yù)期最大和最小增加值(每摩爾葡萄糖的ATP摩爾數(shù))與由于進(jìn)入TCA循環(huán)(且隨后進(jìn)行呼吸)的丙酮酸鹽損失而減少的產(chǎn)物產(chǎn)量的函數(shù)。假定P/O比率為3計(jì)算最大增加％，而假定P/O比率為0.5計(jì)算最小增加值％。表2顯示了消耗每摩爾葡萄糖估計(jì)的最大耗氧量。加入氧可啟動最小生長，這將消耗碳用于生物合成而留下少量的碳用于呼吸(且，因此利用氧)。
表1.

表2.


因此，為了提高細(xì)胞培養(yǎng)物中微生物的代謝能量，可向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氧作為末端電子受體。盡管從葡萄糖產(chǎn)生乳酸的最大摩爾產(chǎn)量是每摩爾葡萄糖產(chǎn)生2摩爾乳酸鹽，且從葡萄糖產(chǎn)生的ATP摩爾產(chǎn)量是每摩爾葡萄糖產(chǎn)生2摩爾ATP，但是加入氧作為末端電子受體允許一些丙酮酸鹽被引導(dǎo)進(jìn)入檸檬酸循環(huán)(TCA)，其中它被轉(zhuǎn)化成CO2和能量。因此，提供末端電子受體增加了微生物的代謝能量。
丙酮酸轉(zhuǎn)向TCA循環(huán)將導(dǎo)致減少產(chǎn)生的其它丙酮酸鹽衍生產(chǎn)物(例如乳酸)的量。例如，產(chǎn)量降低10％可導(dǎo)致微生物產(chǎn)生增多2.6倍的代謝能量，產(chǎn)量降低20％可導(dǎo)致微生物產(chǎn)生增多4.2-5倍的代謝能量，產(chǎn)量降低50％可導(dǎo)致微生物產(chǎn)生增多9倍的代謝能量。
可預(yù)期在方法的后期階段，當(dāng)存在高水平的諸如乳酸的代謝產(chǎn)物時(shí)，細(xì)胞可能需要更多代謝能量維持功能。
因此，需要使厭氧培養(yǎng)基內(nèi)的微生物接觸短暫脈沖的溶解氧。優(yōu)選的是，短暫脈沖的溶解氧導(dǎo)致培養(yǎng)基具有的溶解氧濃度不超過0.5％，優(yōu)選在大約百分之0.1和0.5之間。作為選擇，通過加入諸如硝酸鹽或延胡索酸鹽的其它末端電子受體可增加厭氧發(fā)酵期間微生物的生長率或細(xì)胞維持。以剛好足以增加微生物的代謝能量而維持所需水平的生產(chǎn)率的水平加入氧。必須細(xì)心以避免過多的產(chǎn)量損失。該技術(shù)也可用于幫助消耗剩余糖類，從而進(jìn)一步簡化回收方法。
6.有機(jī)產(chǎn)物的純化方法一旦生產(chǎn)出來，可使用任何方法分離目的產(chǎn)物。例如，可使用常規(guī)分離技術(shù)從培養(yǎng)液中去掉生物量，且可使用常規(guī)分離方法(例如，提取，蒸餾，和離子交換方法)從無微生物的培養(yǎng)液中獲得該有機(jī)產(chǎn)物。參見，美國專利號4,275,234；美國專利號5,510,526；美國專利號5,831,122；美國專利號5,641,406；和國際專利申請?zhí)朩O 93/00440。另外，可在其生產(chǎn)的同時(shí)分離該所需有機(jī)產(chǎn)物，或者可在產(chǎn)物的生產(chǎn)階段結(jié)束后從培養(yǎng)液中分離它。重要的是應(yīng)注意到可控制第二發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)條件以便改進(jìn)分離方法。例如，可控制第二發(fā)酵罐內(nèi)的pH和溫度使得所需有機(jī)產(chǎn)物從溶液中沉淀出來，或者以更有利于分離的形式存在。具體地說，當(dāng)培養(yǎng)液的pH低于有機(jī)酸的pKa值時(shí)，該有機(jī)酸的pH值可使溶液沉淀。例如，生產(chǎn)谷氨酸時(shí)的培養(yǎng)條件可以是pH低于2.19，它是谷氨酸的pKa值。因此，控制pH，溫度，和培養(yǎng)基的含量可幫助有機(jī)產(chǎn)物分離。另外，可選擇特定遺傳修飾的酵母和/或可控制特定的培養(yǎng)條件使得培養(yǎng)液內(nèi)的任何副產(chǎn)物不干擾所需有機(jī)產(chǎn)物的回收。
可預(yù)料到本文所述的方法和材料可適應(yīng)和用于任何類型的培養(yǎng)方法，包括，但不限于，通常稱為“連續(xù)發(fā)酵”和“分批發(fā)酵”方法的方法。另外，在一個生產(chǎn)過程中使用的微生物可被回收并在后來的生產(chǎn)過程中再利用。例如，微生物可多次再利用以產(chǎn)生所需的有機(jī)產(chǎn)物。另外，可使用任何碳源。例如，可使用阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，iodose，半乳糖，塔羅糖，蜜二糖，蔗糖，果糖，棉子糖，水蘇糖，核糖，阿拉伯糖，木糖，來蘇糖，諸如玉米淀粉和小麥淀粉的淀粉，和諸如玉米纖維水解產(chǎn)物和其它纖維素水解產(chǎn)物的水解產(chǎn)物作為碳源用于生物量或所需有機(jī)產(chǎn)物的生產(chǎn)。另外，可使用任何培養(yǎng)基。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(例如，酵母基本培養(yǎng)基和YP培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，蛋白胨肉湯20g/L))以及諸如玉米浸漬水溶液和玉米漿的培養(yǎng)基。本發(fā)明的重要優(yōu)勢在于優(yōu)選的微生物，特別是在需氧條件下生長時(shí)，可利用基本培養(yǎng)基。厭氧生產(chǎn)一般不需要額外的營養(yǎng)成分，因此可使用各種分離技術(shù)中的任一種從相對清潔的發(fā)酵培養(yǎng)液中分離最終產(chǎn)物。液相-液相萃取是從發(fā)酵培養(yǎng)液分離有機(jī)酸的熟知技術(shù)，且導(dǎo)致較好的純化。根據(jù)本發(fā)明，相信這種更簡單，更廉價(jià)，能耗更少的系統(tǒng)也是有用的。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明在馴養(yǎng)型(train-type)方法中使用具有crabtree-陰性表型的遺傳修飾的酵母，該方法在達(dá)到臨界細(xì)胞密度后且此時(shí)需要顯著增加所需有機(jī)產(chǎn)物的單位生產(chǎn)率時(shí)誘導(dǎo)代謝途徑的“轉(zhuǎn)換”。誘導(dǎo)代謝途徑轉(zhuǎn)換的典型方法是將生物量從高度充氣的容器轉(zhuǎn)移到基本上厭氧的容器中，引起氧饑餓。應(yīng)注意可使用常見糖類(例如，葡萄糖或木糖)作為生長期和生產(chǎn)期的碳源。使用具有crabtree-陰性表型的遺傳修飾的酵母細(xì)胞對該實(shí)施方案的成功是關(guān)鍵性的。另外，所需有機(jī)產(chǎn)物的單位生產(chǎn)率也是成功的關(guān)鍵。本文所用的術(shù)語“單位生產(chǎn)率”反映了產(chǎn)生的產(chǎn)物量且表示為每小時(shí)每克生物量(干重)產(chǎn)生的有機(jī)產(chǎn)物的克數(shù)，即g/(g*小時(shí))。一般來說，諸如乳酸鹽和丙烯酸鹽的有機(jī)產(chǎn)物的單位生產(chǎn)率高于大約0.1g/(g*小時(shí))，例如，高于大約0.2g/(g*小時(shí))，或高于大約0.5g/(g*小時(shí))。通過提供本文所述的高單位生產(chǎn)率，在基本上厭氧的條件下通過發(fā)酵產(chǎn)物途徑可獲得細(xì)胞維持所需的能量，而不是依賴于充氣通過呼吸途徑產(chǎn)生高能量。
應(yīng)注意基本上厭氧的容器以不超過大約0.1VVM的速率通氣。在某些生產(chǎn)情況下，不使用通氣。另外，在該實(shí)施方案中的產(chǎn)量(即，g有機(jī)產(chǎn)物/g消耗的碳源)一般高于大約70wt％，且在沒有加入諸如乙醇和乙酸鹽的碳源的條件下產(chǎn)生。在某些情況下，為了達(dá)到產(chǎn)生細(xì)胞維持所需能量需要的單位生產(chǎn)率，除了提供生產(chǎn)目的產(chǎn)物必需的酶外，增強(qiáng)從葡萄糖到丙酮酸鹽的途徑可能也是必須的。
在另一實(shí)施方案中，可設(shè)計(jì)馴養(yǎng)型方法以便只有高度充氣的生長容器配備有滅菌能力。厭氧型生產(chǎn)容器一般在高于大約35℃(例如，高于大約36，37，38，39，40，41，42，43，44，或45℃)的溫度運(yùn)轉(zhuǎn)。很少有野生型酵母能夠在產(chǎn)物生產(chǎn)期間隨著pH下降在該溫度存活且與遺傳修飾的酵母競爭，特別是因?yàn)樗鼈儧]有可產(chǎn)生能量用于細(xì)胞維持的增強(qiáng)發(fā)酵途徑，另外，該酵母可改造成含有能防止來自其它種類的酵母存活的本文所述的“殺傷質(zhì)?！薄１景l(fā)明還提供了培養(yǎng)酵母細(xì)胞的各種方法。例如，具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞可用具有不超過大約3.0的有機(jī)pH值，或含有玉米纖維水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)酵母細(xì)胞的其它方法包括，但不限于，在高于大約35℃的溫度用具有不超過大約3.0的無機(jī)pH值，或者含有戊糖碳或玉米纖維水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有crabtree-陰性表型的酵母細(xì)胞。
另外，本發(fā)明提供了制備有機(jī)產(chǎn)物的方法。該方法包括在培養(yǎng)條件下生長一種微生物，并改變培養(yǎng)條件以促進(jìn)有機(jī)產(chǎn)物的生產(chǎn)。在該方法中，微生物具有降低的丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶，和/或乙酰-CoA合成酶活性，并表現(xiàn)出在沒有乙醇和乙酸鹽的條件下生長率為在沒有降低丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶，和/或乙酰-CoA合成酶活性的相應(yīng)微生物中觀察到的生長率的至少大約百分之30(例如，大約百分之35，40，50，75，100，150，200，或更大)。一般來說，促進(jìn)細(xì)胞呼吸的培養(yǎng)條件在這樣的情況下使用，即其中需要迅速生長，或其中待生產(chǎn)的有機(jī)產(chǎn)物在沒有細(xì)胞呼吸時(shí)不能生產(chǎn)，而減少細(xì)胞呼吸的培養(yǎng)條件在這樣的情況下使用，即其中不需要迅速生長，或者其中待生產(chǎn)的有機(jī)產(chǎn)物在沒有細(xì)胞呼吸時(shí)能夠生產(chǎn)。
在下面的實(shí)施例中將進(jìn)一步描述本發(fā)明，該實(shí)施例不應(yīng)限制權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1-重組質(zhì)粒pHES/pSEH用限制性酶HindIII消化Chien等(Proc.Natl Acad.Sci.，889578-9582(1991))所述的0.5ug質(zhì)粒pGAD424。通過使用TBE緩沖液在0.8％的瓊脂糖凝膠上凝膠電泳分離消化混合物。然后按Sambrook等，(出處同上)所述從凝膠中純化5.9kbp的片斷。設(shè)計(jì)具有多個限制性酶識別位點(diǎn)的92bp合成寡聚體的互補(bǔ)對。第一個命名為fwd HES寡聚體且具有如下序列5′-CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATCTACTAGTGCGGCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTGGG-3′(SEQ ID NO1)。第二個命名為camp hes寡聚體并具有如下序列5′-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTACGCGTGGTACCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATTCAAGCTTGGG-3′(SEQ ID NO2)。通過煮沸10分鐘并逐漸冷卻到室溫使500nmoles的兩個互補(bǔ)寡聚體互相退火。用HindIII消化該雙鏈92bp DNA并與HindIII消化的5.9kbp pGAD424連接。使用該連接混合物按Sambrook等，(出處同上)所述通過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(electromax細(xì)胞，LifeTechnologies，Rockville，MD)。將重組大腸桿菌涂布在Luria-Bertani肉湯平板上，使用100μg/mL的抗生素氨芐青霉素選擇含有質(zhì)粒的細(xì)胞。從氨芐青霉素抗性大腸桿菌克隆篩選質(zhì)粒DNA以獲得兩個質(zhì)粒pHES和pSEH(圖1和2)。這兩個質(zhì)粒區(qū)別在于合成寡聚體相對于載體上乙醇脫氫酶-ADHI啟動子的方向。
實(shí)施例2-從瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)和乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)PCR擴(kuò)增編碼乳酸脫氫酶的核酸使用PUREGENE基因組DNA分離試劑盒(Gentra systems，Minneapolis，MN)從瑞士乳桿菌(ATCC 10797)和乳酸小球菌(ATCC 25741)的過夜培養(yǎng)物分離基因組DNA。設(shè)計(jì)PCR引物從瑞士乳桿菌(lh-ldh寡聚體)和乳酸小球菌(pa-ldh寡聚體)基因組DNA分離編碼乳酸脫氫酶的核酸。這些引物根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中可得的乳酸脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)，且具有如下序列5’lh-ldh，5’-CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCTC-3’(SEQ ID NO3)；3’lh-ldh，5-CCAAGATCTTTATTGACGAACCTTAACGCCAG-3’(SEQ ID NO4)；5’pa-ldh5’-CCGGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCATC AAAAAG-3’(SEQ IDNO5)；和3’pa-ldh，5’-CCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAG-3’(SEQ IDNO6)。使用可從Sci-ed軟件(Durham，NC)獲得的引物設(shè)計(jì)(Primer Designer)軟件優(yōu)化引物。1umole的基因組DNA與100nmoles的引物一起使用。Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs)用于按Sambrook等，(出處同上)所述PCR擴(kuò)增乳酸脫氫酶(LDH)核酸。
采用相似的策略從諸如芽孢桿菌屬種類，例如巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)(ATCC 6458)或米根霉(ATCC 76275)的微生物，或者任何其它產(chǎn)生乳酸鹽的生物(包括諸如真菌和細(xì)菌的微生物和諸如哺乳動物的多細(xì)胞生物)或者來自產(chǎn)生乳酸鹽的生物的組織的基因組DNA分離編碼L-乳酸脫氫酶的核酸。使用PUREGENE基因組DNA分離試劑盒(Gentra systems，Minneapolis，MN)從生長的生物培養(yǎng)物中分離基因組DNA。根據(jù)可從Genbank獲得的來自這些物種的LDH基因序列設(shè)計(jì)合適的PCR引物分離編碼乳酸脫氫酶的核酸。一般來說，1μmole的基因組DNA與100nmoles的合適引物一起使用。Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs)或任何其它合適的DNA聚合酶用于使用例如按Sambrook等，(出處同上)所述的PCR技術(shù)從各基因組DNA擴(kuò)增乳酸脫氫酶(LDH)核酸。
作為選擇，編碼乳酸脫氫酶的核酸可使用如下任一方法從耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)(ATCC 52709)，Trichodenna reesci(ATCC 13631)，Torulaspora pretoriensis(ATCC 36245)，或任何其它產(chǎn)生乳酸脫氫酶的生物中分離。
1)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等，(出處同上))將來自一種這類生物的基因組cDNA文庫克隆進(jìn)諸如pUC19的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌表達(dá)載體。用該文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌(ldh pfi)突變體菌株NZNI 11(Bunch等，(1997)，“編碼大腸桿菌發(fā)酵乳酸脫氫酶的ldhA基因”，Microbiology，143187-95)且細(xì)胞在補(bǔ)充了酪蛋白氨基酸的M9培養(yǎng)基中在厭氧條件下生長。在這種條件下生長的任何大腸桿菌要么編碼乳酸脫氫酶，要么是ldh或pfl的回復(fù)突變型。使用能區(qū)分(L)-LDH和(D)-LDH的乳酸特異性軟瓊脂覆蓋(LASSO)的比色試驗(yàn)(Witte等，1989，Basic Microbiol.29707-716(1989))篩選LDH活性的陽性集落(在厭氧生長條件下形成的集落)。然后分離和測序來自懷疑表達(dá)1-乳酸脫氫酶的克隆的質(zhì)粒DNA。
2)耐熱克魯維酵母ATCC 52709，Treesei ATCC 13631和Torulasporapretoriensis ATCC 36245都是在厭氧條件下培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生L-乳酸的真核生物(Wine等(Basic Microbiol.29707-716(1989))，因此，根據(jù)該方法，這些菌株中至少一個在厭氧條件下生長以誘導(dǎo)乳酸脫氫酶活性。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得無細(xì)胞提取物并進(jìn)行已知蛋白質(zhì)純化方法以分離乳酸脫氫酶。純化乳酸脫氫酶的方法是已知的(Kelly等，(1978)，“細(xì)菌乳酸脫氫酶的親和層析”，Biochem J.，171543-7)。蛋白質(zhì)純化后，將其部分裂解和測序以測定氨基酸序列。然后使用該氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物以便從基因組DNA分離編碼乳酸脫氫酶的基因。
真核LDH，例如從耐熱克魯維酵母或Trichoderma reesei或Torulasporapretoriensis分離的LDH比來自諸如芽孢桿菌屬或乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌來源的LDH相比在馬克斯克魯維酵母中更好地起作用(對于其轉(zhuǎn)錄效率，翻譯效率和/或蛋白質(zhì)活性)。
3)使用可從Genbank獲得的已知真核乳酸脫氫酶基因序列，設(shè)計(jì)簡并引物從耐熱克魯維酵母ATCC 52709，T.reesei ATCC 13631或Torulosporapretoriensis ATCC 36245的基因組DNA分離乳酸脫氫酶基因。使用LDH基因序列中保守的NAD+結(jié)合位點(diǎn)和丙酮酸鹽結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)簡并引物。1μmole基因組DNA與100nmoles引物一起使用。Pfu DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)或任何其它合適的DNA聚合酶用于按已知PCR方法，例如Sambrook等，(出處同上)所述的方法，擴(kuò)增L-乳酸脫氫酶(LDH)核酸的片斷。實(shí)施例3-將瑞士乳桿菌(L.helbveticus)和乳酸小球菌(P.acidilactici)的LDH基因克隆進(jìn)pCRII載體使用從Invitrogen(CArlsbad，CA)獲得的TA克隆試劑盒將PCR擴(kuò)增的LDH DNA產(chǎn)物與pCRII載體(圖3和4)連接。然后使用Sambrook等，(出處同上)所述的方法用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B。該試劑盒提供的pCRII載體允許按照產(chǎn)品說明書快速克隆該P(yáng)CR產(chǎn)物。含有來自瑞士乳桿菌和乳酸小球菌的LDH基因的pCRII載體在圖4中描繪。
實(shí)施例4-在pHES載體中含有瑞士乳桿菌和乳酸小球菌LDH基因的重組質(zhì)粒pLh ldh-HES/pPa ldh-HES含有瑞士乳桿菌和乳酸小球菌LDH基因的pCRII載體用合適的限制性核酸內(nèi)切酶消化。pHES載體同樣用相同的限制性核酸內(nèi)切酶消化。然后將含有來自pCRII載體的LDH的1kbp插入片斷使用T4 DNA連接酶按Sambrook等，(出處同上)所述連接進(jìn)6.0kbp pHES載體中。使用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(electromax細(xì)胞，Life Technologies，Rockville，MD)，并選擇氨芐青霉素抗性的重組克隆。分析從重組克隆分離的DNA以證實(shí)pLh ldh-HES和pPa ldh-HES載體(圖5)。這些載體含有在酵母乙醇脫氫酶啟動子(ADH1)控制下的pHES載體中編碼瑞士乳桿菌和乳酸小球菌LDH的基因。
實(shí)施例5-克隆芽孢桿菌屬種類，米根霉，耐熱克魯維酵母，Trichodermareesei或Torulaspora pretoriensis LDH基因用于使用酵母屬PDC1基因啟動子的表達(dá)盡管可使用在米根霉，K thermotolerans，Trichoderma reesei或Torulaspora pretoriensis中發(fā)現(xiàn)的乳酸脫氫酶啟動子控制在馬克斯克魯維酵母中克隆的乳酸脫氫酶基因的表達(dá)，但是也可使用來自釀酒酵母的PDC1啟動子控制該分離的乳酸脫氫酶基因的表達(dá)。釀酒酵母的糖酵解啟動子已成功地用于表達(dá)克魯維酵母菌株中的基因。(Gellissen和Hollenberg，(1997)，“基因表達(dá)研究中的酵母應(yīng)用釀酒酵母，Hansenula polymorpha和Kluyveromyces lactis的比較——綜述”，Gene，19087-97)。
因此，來自釀酒酵母的PDC1啟動子通過使用可在Genbank中獲得的釀酒酵母基因組序列設(shè)計(jì)合適的寡聚體引物獲得。通過PCR技術(shù)擴(kuò)增PDC1基因序列和PDC1基因周圍的1Kb區(qū)域。所得的4Kb DNA片斷含有控制PDC1基因表達(dá)的啟動子和終止子。在控制PDC1基因表達(dá)的啟動子和終止子之間包含多個限制性酶位點(diǎn)使得可插入在PDC1啟動子和終止子控制下的各種LDH基因。將4Kb DNA片斷插入合適的載體中，例如以pUC 19為基礎(chǔ)的釀酒酵母或大腸桿菌穿梭載體。然后在該啟動子和終止子控制下的一個多克隆位點(diǎn)處將LDH基因?qū)胼d體中使得乳酸脫氫酶基因的表達(dá)受PDC1啟動子和終止子控制(圖14)。
作為選擇，其它酵母屬糖酵解啟動子，例如控制釀酒酵母甘油醛-3磷酸脫氫酶或磷酸甘油酸激酶基因表達(dá)的啟動子同樣可用于表達(dá)馬克斯克魯維酵母的克隆LDH基因。
實(shí)施例6-擴(kuò)增同源DNA的線型片斷用于丙酮酸脫羧酶的基因破壞設(shè)計(jì)含有與馬克斯克魯維酵母丙酮酸脫羧酶(PDC)5’端相同的51bp和與pHES載體ADH1啟動子5’端相同的30bp的82bp寡聚體引物(5’kmPDC1Ko)。5’kmPDC1Ko的序列如下
5′-TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCAAACCAAATAATTGCAATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3’(SEQ ID NO7)。從提取的Genbank序列獲得酵母(馬克斯克魯維酵母或Y.stipitis或多形漢遜酵母)PDC基因的序列。同樣，設(shè)計(jì)含有與PDC基因3’端相同的54bp和與ADH1終止子3’端相同的22bp的反向79bp寡聚體(3’kmPDC1Ko)。3’kmPDC1Ko的序列如下5’-TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCCCTCTCTACATGCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3’(SEQ ID NO8)。設(shè)計(jì)該引物從pLh-ldh-HES和pPa-ldh-HES質(zhì)粒擴(kuò)增線型DNA片斷，其中該片斷含有與ADH1啟動子和終止子在一起的完整乳酸脫氫酶基因(圖6)。該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物還含有與來自馬克斯克魯維酵母PDC1，Yamadazyma stipitis PDC1和PDC2，以及多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)PDCI和PDC2之一的序列同源的末端。使用Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs；Beverly，MA)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。100ng的pLh-ldh-HES或5pPa-ldh-HES與5單位的聚合酶和100nmoles的寡聚體一起用于反應(yīng)。按Sambrook等，(出處同上)所述的方法進(jìn)行反應(yīng)。圖6描繪了具有所述同源性的最終線型產(chǎn)物。
制備了另一構(gòu)建體以提高獲得馬克斯克魯維酵母的pdc陰性菌株的可能性。為了制備這些構(gòu)建體，使用PCR和基因組步查(genome walking)技術(shù)(Clonetech)分離包含馬克斯克魯維酵母1.7kbp PDC1基因的5.5kbp片斷(圖6b)。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法將該5.5kbp片斷克隆進(jìn)pCRII TA克隆載體(Invitrogen)中。通過限制性消化(Sambrook等，出處同上)從馬克斯克魯維酵母5.5kbp片斷取出靠近1.7kbp PDCI編碼區(qū)的中部的大約370bp的部分。
取出的片斷具有如下序列CCGGTTCTTTCTCTTACTCTTACAAGACCAAGAACATTGTCGAATTCCACTCCGACTACATCAAGGTCAGAAACGCCACTTTCCCAGGTGTCCAAATGAAGTTCGTCTTGCAAAAGTTGTTGACCAAGGTCAAGGATGCTGCTAAGGGTTACAAGCCAGTTCCAGTTCCTCACGCTCCAAGAGACAACAAGCCAGTTGCTGACTCTACTCCATTGAAGCAAGAATGGGTCTGGACTCAAGTCGGTAAGTTCCTACAAGAAGGTGATGTTGTTCTAACTGAAACCGGTACCTCCGCTTTCGGTATCAACCAAACCCACTTCCCAAATGACACCTACGGTATCTCCCAAGTCTTGTGGGGTTCCATTGGTTTCA(序列ID No.10)。
然后使用標(biāo)準(zhǔn)限制性技術(shù)(參見Sambrook等)從pPIC9K載體(Invitrogen)分離卡那霉素抗性基因及其啟動子，并克隆進(jìn)5.5kbp中取出了上述鑒定片斷的位點(diǎn)中。插入pPIC9K(Invitrogen)卡那霉素抗性基因及其啟動子使得插入?yún)^(qū)的序列如下
GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTTTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCA
CAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG(序列ID No.9).
所得的構(gòu)建體含有被大約5kbp的pdc區(qū)包圍的G418抗性基因，如圖6c所示。制備了一個相似的DNA構(gòu)建體，它含有在pCRII載體中被2.3kbp的馬克斯克魯維酵母PDC1包圍的內(nèi)部G418基因，如圖6d所示。
實(shí)施例7使用線型DNA片斷破壞內(nèi)源性PDC編碼序列并同時(shí)插入一個LDH編碼序列使用實(shí)施例5所述的通過PCR產(chǎn)生的線型DNA片斷轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母，Yamadazyma stipitis，或多形漢遜酵母。用于轉(zhuǎn)化的方法如Wesolowski-Louvel等所述(NONCONVENTIONAL YEASTS IN BIOTECHNOLOGYKLUYVEROMYCES LACTIS，編輯Klaus Wolf，Springer Verlag，柏林，第138-201頁(1996))。簡單地說，離心5mL的過夜培養(yǎng)物并用電穿孔緩沖液(10nMTris-HCI，270nM蔗糖，1nM MgCl2，pH 7.5)洗滌。然后將洗滌的細(xì)胞在30℃在培養(yǎng)緩沖液(5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨肉湯，10g/L葡萄糖，25nM DTT，20nM HEPES，pH 8.0)中培養(yǎng)30分鐘。在該階段結(jié)束時(shí)，再次洗滌細(xì)胞并重懸于400uL培養(yǎng)緩沖液中。向這些細(xì)胞中加入DNA(200ng)，并在0.4cm比色杯中使用Bio-Rad基因脈沖儀以1800伏特，1000Cl，和25μF脈沖細(xì)胞。
將細(xì)胞涂布在常規(guī)YPD(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨肉湯，20g/L葡萄糖，15％瓊脂平板)上，允許菌落再生72小時(shí)以上。帶有菌落的各平板復(fù)制涂布在新鮮的YPD平板上并培養(yǎng)48小時(shí)。然后菌落用6.5％軟瓊脂(0.5％瓊脂在300mM Tris-HCl，187mM谷氨酸，pH 8.3中)覆蓋。向覆蓋的平板中加入染色混合物(3.2mL的1％瓊脂，1.6mL的120mM Tris，75mM谷氨酸，pH8.3，0.4mL的2mg/mL吩嗪硫酸甲酯，7單位的谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶，和7單位的L(+)-豬肌肉乳酸脫氫酶)。
具有高L(+)的酵母菌株在10-120分鐘內(nèi)形成藍(lán)色菌環(huán)。該方法類似于Subden等(Canadian J.Microbiol.，28883-886(1982))建議的方法，且由Witte等(J.Basic Microbial.29707-716(1989))修改。選擇該菌落，通過PCR分析試驗(yàn)從該菌落分離的DNA并測序以檢測破壞的丙酮酸脫羧酶基因。
在另一實(shí)施方案中，將上文實(shí)施例6中所述且在圖6c和6d中描繪的克隆用兩個限制性酶消化(參見，Sambrook等；出處同上)以產(chǎn)生大約3微克的含有同源性PDC區(qū)的DNA片斷，該P(yáng)DC區(qū)包含插入卡那霉素抗性基因的中間序列。使用諸如電穿孔的已知技術(shù)用該片斷轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母以破壞馬克斯克魯維酵母的pdc。
一般來說，按如下方法進(jìn)行電穿孔a)以20mL的體積在YPAD中生長微生物的培養(yǎng)物過夜(-15h)；b)從該培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)移500uL到微量離心管中，以離心@4L4mm，棄去上清；c)用1mL冷EB(EB＝電穿孔緩沖液10mM Tris-HCl，pH 7.5；270mM蔗糖；1mM MgCl2)洗滌沉淀；d)重懸于1mL IB(IB＝培養(yǎng)緩沖液YPD；25mM DTT；20mM HEPES，pH8.0)中；e)在Eppendorf Thermomixer中30℃以800rpm搖動30分鐘；f)離心，用EB洗滌一次，重懸于400uL EB中；g)加入3微克DNA片斷(在10mM Tris-Cl，pH 8.5的水中)，在冰上培養(yǎng)30分鐘；h)轉(zhuǎn)移到0.4cm的電穿孔杯中。Bio-Rad基因脈沖儀設(shè)置1000V，1000Cl，50TF。脈沖后恒定時(shí)間-20毫秒；i)轉(zhuǎn)移到3mL Morton Closure管中，在30℃不搖動培養(yǎng)1小時(shí)。加入400uL液體YPAD培養(yǎng)基(YPAD10g酵母提取物；20g蛋白胨；20g葡萄糖；100mg腺嘌呤偏硫酸鹽(AdenineHemisulphate)。體積＝1L。不調(diào)節(jié)pH)，在Eppendorf Thermomixer中在30℃以800rpm搖動1小時(shí)。加入400uL液體YPAD并恢復(fù)46小時(shí)；j)在微量離心管中4K離心4分鐘，棄去上清，重懸于400uL 1M山梨糖醇中；k)涂布到200ug/ml G418選擇性平板上；和1)在30℃培養(yǎng)3到5天。
菌落首先通過第二次接種(patching)到300ug/ml G418上進(jìn)行篩選。通過標(biāo)準(zhǔn)基因組制備法(Sambrook)從二級酵母斑分離基因組DNA。然后通過PCR篩選它們的下列特征1)使用合適的引物和條件(Sambrook)篩選卡那霉素片斷的存在和2)使用合適的引物和PCR條件篩選不存在破壞的pdc區(qū)。
然后生長選擇標(biāo)記陽性且pdc破壞區(qū)陰性的菌落并通過HPLC進(jìn)行生理學(xué)分析。來自這些菌株的基因組DNA通過southern雜交分析進(jìn)一步進(jìn)行分析。
實(shí)施例8-細(xì)胞的生長特征1.低pH/高溫按照Kiers等(Yeast，14(5)459-469(1998))所述將馬克斯克魯維酵母的過夜培養(yǎng)物接種進(jìn)50mL的酵母基本培養(yǎng)基中。葡萄糖(100g/L)用作碳源。過夜培養(yǎng)物在40℃維持，并接種進(jìn)也在40℃維持的培養(yǎng)基中。接種物的加入將培養(yǎng)物的pH從5.5改變成2.5。實(shí)驗(yàn)期間，pH維持在2.5。通過YSI-膜測量葡萄糖濃度，并使用分光光度計(jì)測量光密度(OD)。
葡萄糖在72小時(shí)內(nèi)被利用，表明在該時(shí)間期間在低pH和高溫培養(yǎng)條件下存在代謝活性(圖7)。另外，在48到72小時(shí)的時(shí)間期間生物量略有減少，表明細(xì)胞分解代謝超過了合成代謝(圖7)。
2.戊糖碳源按照Kiers等(Yeast，14(5)459-469(1998))所述將馬克斯克魯維酵母的過夜培養(yǎng)物接種進(jìn)3個含有酵母基本培養(yǎng)基的50mL培養(yǎng)瓶中。3個培養(yǎng)瓶分別含有不同的碳源。第一瓶含有10％的葡萄糖，第二瓶含有10％的D-木糖，第三瓶含有10％的L-阿拉伯糖。培養(yǎng)瓶在30℃培養(yǎng)，定期進(jìn)行OD測量。
40小時(shí)后，用葡萄糖或木糖培養(yǎng)的酵母的生物量產(chǎn)量相似，而用阿拉伯糖培養(yǎng)的酵母的生物量產(chǎn)量較低(圖8)。比較用葡萄糖培養(yǎng)的酵母生長與用木糖或阿拉伯糖培養(yǎng)的酵母生長顯示存在一段起始生長滯后時(shí)間。用阿拉伯糖培養(yǎng)的酵母表現(xiàn)出幾個小時(shí)的滯后時(shí)間，而用木糖培養(yǎng)的酵母的滯后時(shí)間更顯著(圖8)。該滯后時(shí)間的存在表明酵母細(xì)胞需要時(shí)間適應(yīng)木糖和阿拉伯糖碳源。據(jù)推測，需要該時(shí)間誘導(dǎo)正常情況下不表達(dá)的多肽的合成。
3.低pH的玉米纖維水解產(chǎn)物按照Kiers等(Yeast，14(5)459-469(1998))所述將馬克斯克魯維酵母的過夜培養(yǎng)物接種進(jìn)含有酵母基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。每瓶含有30％的玉米纖維水解產(chǎn)物作為碳源。簡單地說，玉米纖維水解產(chǎn)物通過將玉米纖維與1.2％的硫酸在145℃反應(yīng)25分鐘來制備。反應(yīng)期間，半纖維素裂解成單體產(chǎn)物阿拉伯糖，木糖和葡萄糖。由于在反應(yīng)期間溫度高，一些阿拉伯糖和木糖降解成糠醛，而一些葡萄糖降解成羥甲基糠醛。HPLC分析該水解產(chǎn)物顯示存在38.7克/L葡萄糖，39.1克/L木糖，20.7克/L阿拉伯糖，和1.6克/L糠醛。另外，該水解產(chǎn)物的pH為1.51。培養(yǎng)酵母前，將玉米纖維水解產(chǎn)物的pH調(diào)到3.0。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間，定期進(jìn)行OD測量。
當(dāng)用玉米纖維水解產(chǎn)物培養(yǎng)時(shí)酵母細(xì)胞能產(chǎn)生生物量(圖9)。
4.各種pH條件將馬克斯克魯維酵母的過夜培養(yǎng)物接種進(jìn)4個含有50mL酵母YPD培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨肉湯，20g/L葡萄糖)的培養(yǎng)瓶中。各培養(yǎng)瓶具有使用HCl調(diào)節(jié)的不同pH。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間，溫度維持在30℃，定期進(jìn)行OD測量。觀察每瓶內(nèi)的生長(圖10)。
5.各種pH條件/乳酸將馬克斯克魯維酵母的過夜培養(yǎng)物接種進(jìn)4個含有50mL酵母YPD培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨肉湯，20g/L葡萄糖)以及40g/L乳酸的培養(yǎng)瓶中。加入乳酸導(dǎo)致pH為2.8。因此，使用NaOH將3瓶內(nèi)的pH調(diào)到所示的pH。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間，溫度維持在30℃，并定期進(jìn)行OD測量。觀察每瓶內(nèi)的生長(圖11)。
實(shí)施例9-能產(chǎn)生丙烯酰-CoA的重組細(xì)胞用丙酸梭菌(Clostridium propionicum)基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化不能利用丙烯酸鹽作碳源的生物體(例如，大腸桿菌)。使用pHES質(zhì)粒產(chǎn)生丙酸梭菌(C.propionicum)基因組文庫，從而表達(dá)丙酸梭菌基因組的10kbp片段。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布在以丙烯酸作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上。只有具備同化丙烯酸鹽能力的那些細(xì)胞才會生長。丙烯酸鹽正常情況下通過其酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)變成為乳酸鹽而被同化。接著，乳酸鹽可轉(zhuǎn)變成丙酮酸鹽且通過三羧酸循環(huán)被細(xì)胞利用。
一旦選擇轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，從基因組文庫分離DNA質(zhì)粒，并測序插入的片段。一旦測序，掃描該片段的開放閱讀框以測定涉及乳酸鹽和丙烯酸鹽之間轉(zhuǎn)化的酶(例如，乳酰-CoA脫氫酶和CoA轉(zhuǎn)移酶)的編碼序列。
將含有這些酶的編碼序列的分離克隆導(dǎo)入實(shí)施例6所述的酵母細(xì)胞中，該酵母細(xì)胞含有乳酸脫氫酶且缺乏丙酮酸鹽脫羧酶活性。使用G418(300g/L)對含有導(dǎo)入的核酸的重組酵母細(xì)胞進(jìn)行選擇。一旦分離，重組酵母細(xì)胞在葡萄糖上需氧生長，然后轉(zhuǎn)換成厭氧條件。隨后收集培養(yǎng)液并使用Danner等(從生物量經(jīng)生物技術(shù)生產(chǎn)丙烯酸，見Applied Biochemistry andBiotechnology，Vol.70-72(1998))所述的標(biāo)準(zhǔn)HPLC方法測定丙烯酸鹽。
實(shí)施例10-能產(chǎn)生抗壞血酸鹽的重組細(xì)胞構(gòu)建表達(dá)載體以便表達(dá)下列多肽2，5-二氧戊酸脫氫酶，5-脫氫-4-脫氧-D-葡糖二酸脫水酶，葡糖二酸脫水酶，乙醛脫水酶，葡糖醛酸內(nèi)酯還原酶，和L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶。編碼這些多肽的核酸序列可從各種微生物分離。一旦構(gòu)建后，可將表達(dá)載體通過電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母細(xì)胞。一旦轉(zhuǎn)化，可分析酵母細(xì)胞以測定它們是否產(chǎn)生L-抗壞血酸鹽。
實(shí)施例11-能產(chǎn)生D-木糖的重組細(xì)胞構(gòu)建表達(dá)載體以便表達(dá)下列多肽2-脫氫-3-脫氧-D-戊酸醛縮酶，木糖酸脫水酶，木糖酸內(nèi)酯酶(xylonotactonase)，和D-木糖脫氫酶。編碼這些多肽的核酸序列可從假單胞菌屬(Pseudomonas)種類分離。一旦構(gòu)建后，可將表達(dá)載體通過電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母細(xì)胞。一旦轉(zhuǎn)化，可分析酵母細(xì)胞以測定它們是否產(chǎn)生D-木糖或其它戊糖碳化合物。
實(shí)施例12-能產(chǎn)生檸檬酸鹽的重組細(xì)胞根據(jù)釀酒酵母烏頭酸酶(ACO1，Genbank登錄號M33 13t)的核酸序列設(shè)計(jì)PCR引物。這些引物用于從克魯維酵母，Yamadazyma，或漢遜酵母種類克隆編碼烏頭酸酶的核酸。一旦測序，按實(shí)施例5所述制備線型構(gòu)建體，并用于破壞酵母細(xì)胞內(nèi)編碼烏頭酸酶的核酸。使用的選擇標(biāo)記是抗生素G418，代替實(shí)施例5中所述的乳酸鹽生產(chǎn)。提供抗生素G418抗性的核酸是新霉素/卡那霉素基因。該基因從pPIC9K載體(InVitrogen)獲得，并插入pHES載體中。酵母細(xì)胞用PCR產(chǎn)生的線型片段轉(zhuǎn)化，該片段構(gòu)建成具有與上述ACO1同源的末端。該線型片段設(shè)計(jì)成編碼G418抗性基因。只有在編碼烏頭酸酶的核酸的位置具有整合的線型片段的細(xì)胞才具有對該抗生素的抗性。使用PCR分析這些細(xì)胞的合適整合。通過該方法獲得的酵母細(xì)胞具有部分有功能的TCA循環(huán)，因此可過度生產(chǎn)檸檬酸鹽。
檸檬酸鹽穿過線粒體膜運(yùn)輸并進(jìn)入培養(yǎng)液中。另外，這些酵母細(xì)胞可接受編碼諸如ATP-檸檬酸裂合酶的一種酶的外源性核酸分子以便它們可催化積累的檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化成草酰乙酸鹽(見實(shí)施例13)。
實(shí)施例13-能在細(xì)胞溶膠中表達(dá)檸檬酸裂合酶的重組細(xì)胞用pHES質(zhì)粒轉(zhuǎn)化crabtree陽性酵母細(xì)胞，該質(zhì)粒含有編碼具有ATP-檸檬酸裂合酶活性的多肽的核酸序列。該核酸從大腸桿菌，Krebsiellapneumoniae(Genbank登錄號X79817)，或其它公開的來源分離。一旦轉(zhuǎn)化，分析酵母細(xì)胞以測定它們是否利用糖類產(chǎn)生大量脂類積累。另外，按Holdsworth等(J.Gen.Microbiol.，1342907-2915(1998))所述分析酵母細(xì)胞以測定它們是否表現(xiàn)出ATP-檸檬酸裂合酶活性。具有ATP-檸檬酸裂合酶活性的酵母細(xì)胞能在需氧條件下提供細(xì)胞溶膠乙酸鹽，其途經(jīng)不是乙醛通過乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化成乙酸鹽。另外，當(dāng)該酵母缺乏丙酮酸脫羧酶或乙醛脫氫酶活性時(shí)，它們應(yīng)能夠提供乙酸鹽用于通過三羧酸循環(huán)的生物合成。
實(shí)施例14-不能利用乳酸鹽作碳源的重組細(xì)胞構(gòu)建酵母細(xì)胞使得相似于釀酒酵母JENI多肽的羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性降低。該酵母細(xì)胞運(yùn)輸乳酸鹽的能力將降低，且因此利用乳酸鹽的效率較低。通過破壞含有該多肽的編碼序列的基因座可降低酵母細(xì)胞內(nèi)羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。首先，使用根據(jù)JEN1的可得序列(Genbank登錄號U24155)設(shè)計(jì)的簡并引物從宿主細(xì)胞分離JEN1多肽的同源物。一旦該核酸從宿主細(xì)胞中分離，可測序該核酸。使用實(shí)施例11所述的方法對該多肽的編碼序列進(jìn)行破壞。產(chǎn)生編碼JEN1序列同源區(qū)以及完整G418抗性基因的線型片段。將該線型片段整合進(jìn)JEN1基因組序列引起該活性的破壞。缺乏羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的細(xì)胞以其不能運(yùn)輸羧酸，且因此在乳酸鹽中培養(yǎng)時(shí)不能生長來鑒定。
另外，可修飾細(xì)胞使得釀酒酵母細(xì)胞色素b2多肽的功能等價(jià)物的活性降低。細(xì)胞色素b2多肽使得釀酒酵母細(xì)胞能夠在線粒體內(nèi)代謝乳酸鹽。首先，從酵母屬細(xì)胞色素b2序列(Genbank登錄號Z46729)設(shè)計(jì)簡并引物。一旦分離，測序該克隆。使用Methods in Yeast Genetics(編輯Alison等，冷泉港出版社(1997))中所述的方法對細(xì)胞色素b2的酵母宿主同源物進(jìn)行破壞。該重組酵母細(xì)胞將不能利用乳酸鹽作為碳源。
實(shí)施例15-乳酸鹽的大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)生并分離了多個PDC活性降低的馬克斯克魯維酵母細(xì)胞的變異體。各變異體改造成含有不同拷貝數(shù)的編碼具有LDH活性的多肽的外源性核酸分子。LDH多肽來自多種不同的來源。該變異體細(xì)胞在40℃具有不同的乳酸特異性生存率。
各變異體在氣流為1.5VVM且溶解氧含量為30％的需氧條件下在容器中生長到細(xì)胞密度為大約60g/L的干重。一旦該密度足夠，關(guān)掉氣流，且容器內(nèi)的條件轉(zhuǎn)換成厭氧條件。不加入堿。
可發(fā)現(xiàn)厭氧階段期間具有最高單位生產(chǎn)率的變異體與具有較低單位生產(chǎn)率的變異體相比不僅產(chǎn)生乳酸更快，而且在更低的pH下達(dá)到更高的濃度。
生產(chǎn)階段期間對葡萄糖的產(chǎn)物產(chǎn)率可超過90％。選擇確定的變異體且除了氣流降低到0.1VVM而不是完全關(guān)閉外對其使用相同的培養(yǎng)方法。在該條件下，容器內(nèi)的最終pH可能更低，且乳酸鹽濃度可能比沒有氣流的條件下更高。產(chǎn)物對葡萄糖的產(chǎn)率可能減少，但可維持在大約90％。但是用0.5VVM的氣流重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，產(chǎn)物對葡萄糖的產(chǎn)率可下降到不超過80％。
實(shí)施例16-使用一系列分批發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)乳酸鹽缺乏PDC活性且具有LDH活性的馬克斯克魯維酵母培養(yǎng)物用作一系列分批發(fā)酵中的接種物。各發(fā)酵在逐漸變大的容器中進(jìn)行，每個容器在使用前立即滅菌。另外，各容器供給1.5VYM的氣流且充分?jǐn)嚢枰跃S持超過10％的溶解氧含量。最終容器具有6,000L的容積。容器也在45℃的溫度維持以增強(qiáng)遺傳修飾的馬克斯克魯維酵母細(xì)胞相對于野生型酵母和其它微生物的存活率。用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基裝滿各容器用于最佳生長。
將具有細(xì)胞密度為100克細(xì)胞(干重)/L的最終容器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移進(jìn)具有300,000L容積的最近蒸氣滅菌的生產(chǎn)容器中。任選的是，加入從前面生產(chǎn)過程過濾獲得的其它細(xì)胞。生產(chǎn)容器中的細(xì)胞密度是6克細(xì)胞(干重)/L。加入葡萄糖達(dá)到80g/L的水平。容器內(nèi)的條件是溫度為42℃的厭氧條件，維持25小時(shí)的時(shí)間。直到接近該過程結(jié)束時(shí)單位生產(chǎn)率大于0.5克乳酸鹽/(克生物量*小時(shí))，此時(shí)生產(chǎn)率開始下降。一旦生產(chǎn)率開始下降，取出細(xì)胞并保存以便再利用。最終乳酸鹽濃度可為75g/L，pH為2.8。取出生物量后，通過蒸發(fā)將溶液濃縮到50％乳酸鹽的濃度。游離酸(大約為總?cè)樗猁}的86％)通過液體萃取法萃取進(jìn)有機(jī)溶劑中并在更高溫度時(shí)萃取回水中。含乳酸鹽的萃取殘液可純化并再循環(huán)作為生長容器中的緩沖液，或者用例如，硫酸酸化并純化。
實(shí)施例17crabtree陰性(馬克斯克魯維酵母)和crabtree陽性(葡萄汁酵母)生物的需氧生產(chǎn)比較crabtree陰性(馬克斯克魯維酵母)和crabtree陽性(葡萄汁酵母)生物分別在需氧和厭氧分批發(fā)酵罐中生長。分批培養(yǎng)在30℃在工作容積為1.5L的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中進(jìn)行。通過自動加入2mol/L的氫氧化鉀(KOH)將PH維持在5.0±0.1。發(fā)酵罐用空氣(需氧培養(yǎng))或氮?dú)?厭氧培養(yǎng))以0.8L/分鐘的流速通氣并以800rpm攪拌。溶氧濃度用氧電極(Ingold，34 100 3002型)連續(xù)監(jiān)測。在需氧培養(yǎng)中，溶氧濃度維持在60％以上。以合適的間隔取出10mL樣品用于測定干重和代謝產(chǎn)物濃度。向厭氧培養(yǎng)物中加入Tween-80和麥角固醇以提供脂肪酸合成所需的化合物。
在指數(shù)生長期間，以合適的間隔測定酵母培養(yǎng)物的干重和OD660，以及上清中的葡萄糖和乙醇濃度。特異性乙醇生產(chǎn)率(q乙醇mmol/g*h)通過如下公式使用線型回歸分析計(jì)算q乙醇＝(dE/dCx)*μmax其中dE/dt(培養(yǎng)物中乙醇濃度增加的速率；mmol/l*h)和dCx/dt(生物量濃度增加的速率；g/l*h)使用乙醇濃度和生物量濃度對時(shí)間μmax(h-1)的繪圖的微分法計(jì)算。在葡萄糖中的最大比增殖速度從Cx對時(shí)間的繪圖的指數(shù)部分估計(jì)。為了計(jì)算特異性葡萄糖消耗率(q葡萄糖，mmol/g*h)，用dG(每小時(shí)消耗的葡萄糖量)代替dE。
在需氧分批培養(yǎng)中，克魯維酵母和酵母屬菌株表現(xiàn)出對葡萄糖的最大比增殖速度(specific growth rate)分別為0.4h-1和0.28h-1。高葡萄糖濃度和所得的酵母屬培養(yǎng)物的高比增殖速度導(dǎo)致高速率的需氧乙醇發(fā)酵(表3，圖1)。由于劇烈的乙醇發(fā)酵，酵母屬菌株中葡萄糖的比消耗速率比克魯維酵母菌株高大約2倍。從能量學(xué)的觀點(diǎn)出發(fā)，乙醇發(fā)酵是細(xì)胞產(chǎn)生ATP的一種低效途經(jīng)。對葡萄糖的生物量產(chǎn)量克魯維酵母為0.38g/g，而葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)為0.14g/g。對于crabtree-陰性表型的克魯維酵母菌株對葡萄糖的乙醇產(chǎn)率為零，而crabtree-陽性表型的糖酵母培養(yǎng)物為1.83mmol/mmol。
表3在含2％(wt/vol)葡萄糖的無機(jī)培養(yǎng)基中葡萄汁酵母和馬克斯克魯維酵母的分批培養(yǎng)物中指數(shù)生長期間的最大比增殖速度，乙醇生產(chǎn)和葡萄糖比消耗速率(q，mmol(g生物量)-1h-1)，生物量產(chǎn)率(g/g)，產(chǎn)物產(chǎn)率(mmol/mmol)，和碳回收率(表示為％；僅計(jì)算了厭氧培養(yǎng)物)。


在厭氧分批培養(yǎng)中，兩個菌株的比增殖速度和生物量產(chǎn)量與在需氧條件下的所見相比極低(表3，圖I和2)。對于克魯維酵母和酵母屬菌株，生物量產(chǎn)量分別為0.07和0.09g/g。兩個菌株在厭氧條件下的乙醇發(fā)酵特異性速率同等較好。使用CO2生產(chǎn)數(shù)據(jù)證實(shí)了這一點(diǎn)。
一般來說，該實(shí)施例證實(shí)生物量的需氧生產(chǎn)比厭氧快得多，在需氧條件下crabtree陰性生物的生物量產(chǎn)量更高(因?yàn)?，在crabtree陽性生物中，使用葡萄糖發(fā)生了一些乙醇發(fā)酵)。該實(shí)施例還證實(shí)了在厭氧條件下crabtree陽性和陰性生物都以相同的速率產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物(在本例中為乙醇)。因此，需氧生長階段提供高生物量產(chǎn)量，且隨后的厭氧發(fā)酵階段引導(dǎo)代謝能量進(jìn)入產(chǎn)物形成(而不是更多的生長)?？偟膩碚f，生產(chǎn)與生長分開的方法提供了更大的處理靈活性和對全過程產(chǎn)量的更好控制。
實(shí)施例18在天然制備L-乳酸的宿主菌株中提高乳酸鹽產(chǎn)量擴(kuò)增同源性DNA的線型片斷用于丙酮酸脫羧酶的基因破壞耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)是L-乳酸的天然生產(chǎn)菌(Kurtzman和Fell，(1998)，“酵母，分類學(xué)研究”，第240-241頁，ElsevierScience B.V.；Amsterdam，The Netherlands)。耐熱克魯維酵母具有天然存在的允許產(chǎn)生L-乳酸的乳酸脫氫酶(ldh)基因。在厭氧條件下產(chǎn)生的乳酸量是大約4％g/g利用的葡萄糖，而剩余的葡萄糖基本上轉(zhuǎn)化成乙醇(42.5％g/g消耗的葡萄糖)，甘油(3％g/g消耗的葡萄糖)和乙酸鹽(0.3％g/g消耗的葡萄糖)。
表4.在YPDA培養(yǎng)基(豐富培養(yǎng)基)中起始為100g/l葡萄糖時(shí)使用耐熱克魯維酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵的結(jié)果


使用通過比較來自馬克斯克魯維酵母和乳酸克魯維酵母的PDC1基因序列產(chǎn)生的序列構(gòu)建的共有引物從耐熱克魯維酵母分離PDC1的600bp區(qū)域。然后測序(Sanger)該P(yáng)DCI片斷，并用于使用PCR和基因組步查技術(shù)(Clonetech)分離包圍耐熱克魯維酵母pdcl的7.5kbp片斷(圖6e)。然后將該7.5kbp的片斷克隆進(jìn)pCRII TA克隆載體(Invitrogen)。從耐熱克魯維酵母的7.5kbp片斷去掉PDCI編碼區(qū)接近中部的大約730bp的部分。通過限制性消化(Sambrook)去掉的K thermotolerans pdcl的部分含有如下序列TTACCACTGTCTTCGGTCTGCCAGGTGACTTCAATCTGCGTCTGTTGGACGAGATCTACGAGGTCGAGGGTATGAGATGGGCCGGTAACTGTAACGAGTTGAACGCTTCTTACGCTGCCGACGCTTACGCCAGAATCAAGGGTATGTCCTGTTTGATCACCACCTTCGGTGTCGGTGAGTTGTCCGCTTTGAACGGTATCGCCGGTTCTTACGCTGAGCACGTCGGTGTCTTGCACATTGTCGGTGTCCCATCCGTCTCCGCCCAGGCCAAGCAGCTATTGTTGCACCACACCTTGGGTAACGGTGACTTCACTGTCTTCCACAGAATGTCCGCCAACATCTCTGAGACCACTGCTATGATCACTGATCTAGCTACCGCCCCATCTGAGATCGACAGATGTATCAGAACCACCTACATTAGACAGAGACCTGTCTACTTGGGTTTGCCATCTAACTTCGTTGACCAGATGGTCCCAGCCTCTCTATTGGACACCCCAATTGACTTGGCCTTGAAGCCAAACGACCAGCAGGCTGAGGAGGAGGTCATCTCTACTTTGTTGGAGATGATCAAGGACGCTAAGAACCCAGTCATCTTGGCTGACGCTTGCGCTTCCAGACACGATGTCAAGGCTGAGACCAAGAAGTTGATTGACATCACTCAGTTCCCATCTTTCGTTACCCCAATGGGTAAGGGTTCCATTGACOAGAAGCACCCAAGATTCGGTGGTGTCTACGTCGGTACCTTGT(序列ID No.11)。然后通過限制性消化(Sambrook)從pPTC9K載體(Invitrogen)分離包含其啟動子的編碼卡那霉素抗性的基因，并克隆進(jìn)7.5kbp上去掉730bp片斷的位置。來自pPIC9K(Invitrogen)的卡那霉素抗性基因及其啟動子的序列如下
GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCA
CAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGG-TGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG(序列ID No.12)。所得的構(gòu)建體包含被大約6.8kbp的PDC區(qū)域包圍的卡那霉素抗性基因(G418)，如圖6f所示。將圖6f描繪的構(gòu)建體用兩個限制性酶(Sambrook)消化以產(chǎn)生大約3微克含同源性PDC區(qū)域和插入的卡那霉素抗性基因中間序列的DNA片斷。使用諸如電穿孔的已知轉(zhuǎn)化技術(shù)用該片斷轉(zhuǎn)化耐熱克魯維酵母以破壞耐熱克魯維酵母的PDC。電穿孔方法如下a)以20mL的體積在YPAD中生長培養(yǎng)物過夜(-15h)；b)將500uL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移進(jìn)微量離心管中，離心@4K，4mm，棄去上清；c)用1mL冷EB(EB＝電穿孔緩沖液10mM Tris-HCl，pH7.5；270mM蔗糖；1mM MgCl2)洗滌；d)重懸于1mL IB(IB＝培養(yǎng)緩沖液YPD；25mM DTT；20mM HEPES，pH8.0)中；e)在EppendorfThermomixer中30℃以800rpm搖動30分鐘；f)離心，用EB洗滌一次，重懸于400uL EB中；g)加入3微克DNA片斷(在10mM Tris-Cl，pH8.5的水中)，在冰上培養(yǎng)30分鐘；h)轉(zhuǎn)移到0.4cm的電穿孔杯中。Bio-Rad基因脈沖儀設(shè)置1000V，1000A，50TF。脈沖后恒定時(shí)間-20毫秒；i)轉(zhuǎn)移到3mL MortonClosure管中，在30℃不搖動培養(yǎng)1小時(shí)；j)加入400uL液體YPAD培養(yǎng)基(YPAD10g酵母提取物；20g蛋白胨；20g葡萄糖；100mg腺嘌呤偏硫酸鹽(Adenine Hemisulphate)。體積＝1L。不調(diào)節(jié)pH)，在Eppendorf Thermomixer中30℃以800rpm搖動1小時(shí)；k)加入400uL液體YPAD并恢復(fù)4-6小時(shí)；1)在微量離心管中離心@4K，4mm，棄去上清，重懸于400uL 1M山梨糖醇中并涂布到100ug/ml G418選擇性平板上；和m)在30℃培養(yǎng)3到5天。
菌落首先通過第二次接種(patching)到含有200ug/ml 0418的培養(yǎng)皿上進(jìn)行篩選。使用標(biāo)準(zhǔn)基因組制備法(Sambrook)從二級酵母斑分離基因組DNA。然后通過PCR篩選分離的基因組的下列特征1)使用合適的引物和條件(Sambrook)篩選卡那霉素片斷的存在；和2)使用合適的引物和PCR條件篩選不存在破壞的PDC區(qū)。然后生長選擇標(biāo)記陽性且PDC破壞區(qū)陰性的菌落用于進(jìn)一步的研究，例如，來自這些菌株的基因組DNA通過southern雜交分析進(jìn)行進(jìn)一步分析。
實(shí)施例19酵母，真菌和細(xì)菌LDH基因的克隆從兩種酵母，耐熱克魯維酵母和Torulaspora pretoriensis分離LDH-編碼基因。這些種類已知生產(chǎn)乳酸(Witte等，1989，J Basic Microbiol.29707-716)。按照Sambrook等，出處同上提供的方法進(jìn)行所有常規(guī)操作，除非另有說明。
耐熱克魯維酵母LDH從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC保藏號#52709)獲得耐熱克魯維酵母并在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長。使用Invitrogen的“Easy-DNA”試劑盒按照廠商的方案從這些細(xì)胞中純化基因組DNA。通過逆向翻譯保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并擴(kuò)增引物，該保守區(qū)在對來自米根霉，人(Homo sapiens)，果蠅(Drosophilamelanogaster)，擬南芥(Aribidopsis thaliana)，和瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)的L-LDH編碼基因的序列對比中被鑒定。兩個簡并寡核苷酸已成功用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。這些寡核苷酸是EJP4GTBATYGGYTCHGGTAC(SEQ ID No.13)和EJP5SWRTCDCCRTGYTCACC(SEQ ID No.14)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用Perkin Elmer緩沖液II(1.5mM MgCl2)和AmpliTaqGold聚合酶進(jìn)行。各反應(yīng)含有濃度為6ng/uL的耐熱克魯維酵母基因組DNA，濃度各為0.2mM的4種dNTPs，各為1uM的EJP4和EJP5引物。反應(yīng)按照如下循環(huán)條件進(jìn)行95℃10分鐘的起始溫育，接著是由95℃30秒，52℃40秒，72℃40秒組成的35個循環(huán)。使用常規(guī)方法凝膠純化116個堿基對(bp)的微量產(chǎn)物片斷，使用相同條件和本文公開的擴(kuò)增條件再擴(kuò)增，克隆，并測序。
所得的序列可翻譯成與已知L-LDH編碼基因表現(xiàn)出高度同源性的多肽。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)兩個非簡并引物，EJP8和EJP9EJP8GTACAGTTCTGGATACTGCTCG(SEQ ID No.15)和EJP9ACAGGCATCGATGCTGTC(SEQ ID No.16)。
使用耐熱克魯維酵母DNA通過將DNA的部分Sau3A消化產(chǎn)生的隨機(jī)片斷插入質(zhì)粒Yep9T(ref)的BamH1位點(diǎn)構(gòu)建基因組DNA文庫。使用引物EJP8和EJP9結(jié)合載體臂中的引物通過PCR分離完整的耐熱克魯維酵母LDH-編碼基因。這些載體引物是EJP10CTACTTGGAGCCACTATCGAC(SEQ ID No.17)和EJP11GTGATGTCGGCGATATAGG(SEQ ID No.18)。
在這些擴(kuò)增反應(yīng)中，除了延伸時(shí)間增加2分鐘且退火溫度增加到58℃外，條件與上述相同?？寺〔y序擴(kuò)增產(chǎn)物且根據(jù)與已知序列的同源性顯示出含有耐熱克魯維酵母LDH-編碼基因的剩余部分。
最后，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中使用高保真聚合酶(Pfu)直接從耐熱克魯維酵母基因組DNA再分離全長基因，使用的引物EJP12和EJP13為EJP12GATCTCCTGCTAAGCTCTTGC(SEQ ID No.19)和EJP13GCAGTTTTGGATATTCATGC(SEQ ID No.20)。
這些擴(kuò)增反應(yīng)按上述進(jìn)行。這一獨(dú)立產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的編碼序列與AmpliTaq Gold產(chǎn)生的序列完全一致。耐熱克魯維酵母LDH-編碼基因的編碼區(qū)的核酸序列在下面作為SEQ ID No.20提供。
該完整編碼序列的翻譯顯示出與來自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(49.5％)，巨大芽孢桿菌(45.1％)，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)(36.8％)，奶牛(35.3％)，和米根霉(32.6％)等的L-LDH-編碼基因有明顯的序列相同性。
耐熱克魯維酵母乳酸脫氫酶的核苷酸序列(SEQ ID No.21)ATGTTCCAAG ATACAAAGTC TCAAGCAGTA AGAACTGATG CCAAAACAGT AAAAGTTGTG 60GTAGTGGGAG TGGGAAGTGT TGGGTCTGCC ACAGCGTATA CGTTGCTTCT CAGCGGCATC 120GTTTCCGAGA TTGTCCTTAT CGACGTGAAC AAAGACAAAG CAGAGGGTGA AAGCATGGAC 180TTAAACCACG CAGCACCTTC AAATACAAGG TCTCGAGCGG GTGATTATCC TGACTGCGCT 240GGCGCGGCCA TTGTTATTGT CACATGTGGG ATTAACCAAA AAAATGGACA AACAAGGATG 300GATCTTGCTG CAAAAAATGC CAACATTATG CTGGAAATCA TCCCCAATGT TGCCAAATAT 360GCTCCTGATA CCATCCTGCT TATTGCCACG AATCCTGTCG ATGTTTTGAC CTATATTAGC 420TATAAGGCGT CAGGGTTTCC ACTAAGCAGA GTTATCGGCT CAGGTACAGT TCTGGATACT 480GCTCGTTTTA AATACATCCT CGGAGAGCAC TTCAAGATCT CATCGGACAG CATCGATGCC 540TGTGTAATTG GAGAACATGG TGATTCGGGT GTGCCTGTCT GGTCTCTTAC CAACATCGAC 600GGCATGAAGC TCCGGGATTA CTGCGAAAAA GCCAACCACA TATTTGATCA GAATGCGTTC 660CATAGAATCT TTGAGCAAAC GCGAGACGCT GCTTACGATA TACTCAAGCG CAAAGGCTAT 720ACTTCATATG GAATCGCAGC GGGATTACTT CGCATAGTAA AGGCGATTTT AGAGGATACA 780GGATCCACAC TTACAGTTTC AACCGTTGGT GATTATTTTG GGGTTGAACA AATTGCTATA 840AGCGTCCCTA CCAAACTCAA TAAAAGTGGG GCTCATCAAG TGGCTGAACT TTCACTCGAT 900GAGAAGGAAA TAGAATTGAT GGAAAAATCA GCTAGTCAGA TCAAATCAGT GATTGAGCAT 960CTGGAGATCAAT 972
耐熱克魯維酵母乳酸脫氫酶的氨基酸序列(SEQ ID No.22)Met Phe Gln Asp Thr Lys Ser Gln Ala Val Arg Thr Asp Ala Lys Thr1 5 10 15Val Lys Val Val Val Val Gly Val Gly Ser Val Gly Ser Ala Thr Ala20 25 30Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Ser Glu Ile Val Leu Ile Asp35 40 45Val Asn Lys Asp Lys Ala Glu Gly Glu Ser Met Asp Leu Asn His Ala50 55 60Ala Pro Ser Asn Thr Arg Ser Arg Ala Gly Asp Tyr Pro Asp Cys Ala65 70 75 80Gly Ala Ala Ile Val Ile Val Thr Cys Gly Ile Asn Gly Lys Asn Gly85 90 95Gln Thr Arg Met Asp Leu Ala Ala Lys Asn Ala Asn Ile Met Leu Glu100 105 110Ile Ile Pro Asn Val Ala Lys Tyr Ala Pro Asp Thr Ile Leu Leu Ile115 120 125Ala Thr Asn Pro Val Asp Val Leu Thr Tyr Ile Ser Tyr Lys Ala Ser130 135 140Gly Phe Pro Leu Ser Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Thr145 150 155 160Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Leu Gly Glu His Phe Lys Ile Ser Ser Asp165 170 175Ser Ile Asp Ala cys Val Ile Gly Glu His Gly Asp Ser Gly Val Pro180 185 190Val trp Ser Leu Thr Asn Ile Asp Gly Met Lys Leu Arg Asp Tyr Cys195 200 205Glu Lys Ala Asn His Ile Phe Asp Gln Asn Ala Phe His Arg Ile Phe210 215 220Glu Gln Thr Arg Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Ile Lys Arg Lys Gly Thr225 230 235 240
Thr Ser Tyr Gly Ile Ala Ala Gly Leu Leu Arg Ile Val Lys Ala Ile245 250 255Leu Glu Asp Thr Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Thr Val Gly Asp Tyr260 265 270Phe Gly Val Glu Gln Ile Ala Ile Ser Val Pro Thr Lys Leu Asn Lys275 280 285Ser Gly Ala His Gln Val Ala Glu Leu Ser Leu Asp Glu Lys Glu Ile290 295 300Glu Leu Met Glu Lys Ser Ala Ser Gln Ile Lys Ser Val Ile Glu His305 310 315 320Leu Glu Ile AsnTorulaspora pretoriensis LDHT.pretoriensis的L-LDH-編碼基因以與耐熱克魯維酵母基因相同的方式分離。該策略也是使用簡并引物PCR擴(kuò)增T.pretoriensis基因組DNA以分離該基因的一個片斷并通過基于PCR的染色體步查分離該基因的剩余部分。T.pretoriensis從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC保藏號._______)獲得。使用Invitrogen的“Easy-DNA”試劑盒按照廠商的方案從這些細(xì)胞中純化基因組DNA。簡并引物根據(jù)上述的保守序列設(shè)計(jì)。兩個簡并寡核苷酸已成功用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增EJP1GTYGGTGCHGGTGCHGTHGG(SEQ ID No.23)和EJP6SWRTCDCCRTGYTCBCC (SEQ ID No.24)。
除了以20ng/uL的濃度使用T.pretoriensis基因組DNA外，熱循環(huán)參數(shù)和反應(yīng)條件如上所述。克隆并測序508bp的強(qiáng)產(chǎn)物DNA片斷。所得的169個氨基酸翻譯產(chǎn)物與已知L-LDH-編碼基因表現(xiàn)出極好的同源性。
在已知序列的兩個方向通過“步查”分離該基因的剩余部分。使用GenomeWalker試劑盒(Clontech#K1807-1)和Advantage Genomic PolymeraseMix(Clontech#8418-1)按照產(chǎn)品說明書完成該方法。除了該試劑盒中提供的銜接引物外使用4個基因特異性嵌套引物?；蛱禺愋砸锸荅JP20ATCCACAACAGCTTACACGTTATTGAG(SEQ ID No.25)EJP21GTTTGGTTGCTGGAAGTGGTGTTGATAG (SEQ ID No.26)
EJP22AACATTGAATAGCTTGCTCAGGTTGTG(SEQ ID No.27)和EJP23GATAATAAACGCGTTGACATTTCAGATG(SEQ ID No.28)。
克隆并測序該產(chǎn)物且根據(jù)與已知序列的同源性發(fā)現(xiàn)它含有來自T.pretoriensis的LDH-編碼基因的剩余部分。該完整編碼序列的翻譯顯示出與來自粟酒裂殖酵母(48.8％)，巨大芽孢桿菌(42％)，瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)(38.2％)，奶牛(34.9％)，和米根霉(32.2％)等的L-LDH-編碼基因有明顯的序列相同性。T.pretoriensis LDH-編碼基因的編碼區(qū)的核酸序列在下面作為SEQ ID No.28提供，其中編碼的LDH蛋白的推測氨基酸序列作為SEQ ID No.29被鑒定。
T.Pretoriensis乳酸脫氫酶的核苷酸序列(SEQ ID No.29)ATGCATAGAT GTGCTAAAGT GGCCATCGTC GGTGCCGGCC AAGTTGGATC CACAACAGCT 60TACACGTTAT TATTGAGTAG TTTGGTTGCT GAAGTGGTGT TGATAGATGT CGATAAAAGA 120AAGGTCGAAG GCCAATTTAT GGATCTGAAC CACGCGGCTC CTTTAACGAA GGAGTCACGA 180TTCAGTGCTG GGGACTATGA AAGTTGTGCT GATGCTGCGG TTGTAATCGT AACGGGCGGG 240GCTAATCAGA AACCTGGTCA AACTAGAATG GAGCTAGCCG AGAGGAACGT TAAAATCATG 300CAGGAAGTGA TCCCTAAGAT TGTGAAATAC GCCCCCAACG CAATTTTGCT GATTGCAACA 360AACCCTGTCG ATGTACTTAC CTATGCTAGT TTGAAAGCGT CGGGATTCCC AGCAAGCCGG 420GTTATTGGTT CTGGGACAGT TCTCGACTCT GCTCGTATAC AGCACAACCT GAGCAAGCTA 480TTCAATGTTT CATCTGAAAG TGTCAACGCG TTTATTATCG GGGAACATGG TGACTCAAGT 540GTGCCCGTCT GGTCGCTTGC TGAGATTGCC GGCATGAAAG TGGAGGATTA CTGTAGGCAG 600TCCAAGAGAA AGTTTGACCC CAGCATTCTG ACCAAAATAT ATGAGGAGTC GCGTGACGCG 660GCAGCCTACA TCATAGAACG CAAAGGCTAT ACCAATTTCG GGATTGCAGC AGGTTTGGCT 720AGGATAGTGA GAGCTATTCT GAGAGATGAA GGTGCCCTAT TAACTGTGTC TACTGTAGGT 780GAGCACTTTG GCATGAAAGA TGTTTCATTG AGTGTTCCAA CTAGGGTAGA CAGGAGCGGC 840GCTCACCATG TCGTCCACCT TCTGCTAAAC GACAAGGAGC TGGAGCAAAT TAAAACATCT 900GGAGCCAAGA TAAAGTCAGC CTGTGATGAA CTTGGCATT 939T.Pretoriensis乳酸脫氫酶的氨基酸序列(SEQ ID No.30)Met His Arg Cys Ala Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Gln Val Gly1 5 10 15Ser Thr Thr Ala Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Ser Leu Val Ala Glu Val
20 25 30Val Leu Ile Asp Val Asp Lys Arg Lys Val Glu Gly Gln Phe Met Asp35 40 45Leu Asn His Ala Ala Pro Leu Thr Lys Glu Ser Arg Phe Ser Ala Glu50 55 60Asp Tyr Glu Ser cys Ala Asp Ala Ala Val Val Ile Val Thr Gly Gly65 70 75 80Ala Asn Gln Lys Pro Gly Gln Thr Arg Met Glu Leu Ala Glu Arg Asn85 90 95Val Lys Ile Met Gln Glu Val Ile Pro Lys Ile Val Lys Tyr Ala Pro100 105 110Asn Ala Ile Leu Leu Ile Ala Thr Asn Pro Val Asp Val Leu Thr Tyr115 120 125Ala Ser Leu Lys Ala Ser Gly Phe Pro Ala Ser Arg Val Ile Gly Ser130 135 140Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Ile Gln His Asn Leu Ser Lys Leu145 150 155 160Phe Asn Val Ser Ser Glu Ser Val Asn Ala Phe Ile Ile Gly Glu His165 170 175Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Leu Ala Glu Ile Ala Gly Met180 185 190Lys Val Glu Asp Tyr Cys Arg Gln Ser Lys Arg Lys Phe Asp Pro Ser195 200 205Ile Leu Thr Lys Ile Tyr Glu Glu Ser Arg Asp Ala Ala Ala Tyr Ile210 215 220Ile Glu Arg Lys Gly Tyr Thr Asn Phe Gly Ile Ala Ala Gly Leu Ala225 230 235 240Arg Ile Val Arg Ala Ile Leu Arg Asp Glu Gly Ala Leu Leu Thr Val245 250 255Ser Thr Val Gly Glu His Phe Gly Met Lys Asp Val Ser Leu Ser Val260 265 270Pro Thr Arg Val Asp Arg Ser Gly Ala His His Val Val Asp Leu Leu
275 280 285Leu Asn Asp Lys Glu Leu Glu Gln Ile Lys Thr Ser Gly Ala Lys Ile290 295 300Lys Ser Ala Cys Asp Glu Leu Gly Ile305 310巨大芽孢桿菌(B.megaterium)LDH編碼LDH基因的巨大芽孢桿菌DNA分離如下。巨大芽孢桿菌從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC保藏號#6458)獲得并在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長。使用Invitrogen的“Easy-DNA”試劑盒按照廠商的方案從這些細(xì)胞純化基因組DNA。根據(jù)Genbank中可得的來自巨大芽孢桿菌的L-LDH序列(Genbank登錄號#M22305)設(shè)計(jì)引物。使用Perkin Elmer緩沖液II(1.5mM MgCl2)和AmpliTaq Gold聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。各反應(yīng)含有濃度為6ng/uL的巨大芽孢桿菌基因組DNA，濃度各為0.2mM的4種dNTPs，濃度各為1uM的兩種擴(kuò)增引物BM1270和BM179，其中這些引物具有如下序列BM1270CCTGAGTCCACGTCATTATTC(SEQ ID No.31)和BM179 TGAAGCTATTTATTCTTGTTAC(SEQ ID No.32)。
按照如下熱循環(huán)條件進(jìn)行反應(yīng)95℃10分鐘的起始溫育，接著是由95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒組成的35個循環(huán)。使用常規(guī)方法凝膠純化1100個堿基對(bp)的強(qiáng)產(chǎn)物片斷，克隆，并測序。所得的序列可翻譯成與已知L-LDH-編碼基因表現(xiàn)出極好同源性的多肽。
本文公開的巨大芽孢桿菌LDH-編碼基因的編碼序列(SEQ ID No.32)與來自磷酸甘油酸激酶基因的啟動子和來自GAL10基因的轉(zhuǎn)錄終止子(兩者都來自釀酒酵母)可操作地連接。在制備該構(gòu)建體時(shí)，制備如下寡核苷酸并用于從含有鑒定為SEQ ID No.29的序列的插入片斷的質(zhì)粒擴(kuò)增編碼序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)兩個寡核苷酸引物，即Bmeg5’和Bmeg3’，以便在該基因的編碼序列末端導(dǎo)入限制性位點(diǎn)Bmeg5’GCTCTAGATGAAAACACAATTTACACC(SEQ ID No.33)和Bmeg3’ATGGATCCTTACACAAAAGCTCTGTCGC(SEQ ID No.34)。
使用上述濃度的dNTP和引物使用在廠商提供的緩沖液中的Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)進(jìn)行該擴(kuò)增反應(yīng)。通過在95℃起始溫育反應(yīng)混合物3分鐘，然后進(jìn)行20個循環(huán)的95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒，接著在72℃最后溫育9分鐘進(jìn)行熱循環(huán)。產(chǎn)物用限制性酶XbaI和BamHI消化，然后連接進(jìn)質(zhì)粒pNC101(NREL)的XbaI和BamHI位點(diǎn)。該連接導(dǎo)致PGK啟動子和GAL10終止子可操作地連接(即，在酵母細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性地連接)到巨大芽孢桿菌LDH編碼序列上。一旦巨大芽孢桿菌LDH可操作地連接到這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列上，切下NotI-NotI片斷并再克隆進(jìn)能在克魯維酵母種類中復(fù)制的載體(質(zhì)粒pNC003，NREL)中。所得的質(zhì)粒含有包含LDH的NotI-NotI片斷以及來自乳酸克魯維酵母質(zhì)粒pKD1的SphI位點(diǎn)之間的一個4,756bp的序列。
這些質(zhì)粒在圖17中顯示。
米根霉LDH按如下方法從米根霉分離L-LDH。米根霉細(xì)胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC保藏號#9363)獲得且在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長。使用Invitrogen的Easy-DNA試劑盒按照廠商的方案從這些細(xì)胞純化基因組DNA。根據(jù)Genbank中可得的來自米根霉(R.oryzae)的L-LDH序列(Genbank登錄號#AF226154)設(shè)計(jì)引物。使用Perkin Elmer緩沖液II(1.5mM MgCl2)和AmpliTaq Gold聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。各反應(yīng)含有濃度為6ng/uL的米根霉基因組DNA，濃度各為0.2mM的4種dNTPs，各1uM的擴(kuò)增引物Ra1-5’和Ra1-3’引物。
該擴(kuò)增引物具有如下序列Ral-5’CTTTATTTTTCTTTACAATATAATTC(SEQ ID No.35)和Ral-3’ACTAGCAGTGCAAAACATG(SEQ ID No.36)。
按照如下循環(huán)條件進(jìn)行反應(yīng)95℃10分鐘的起始溫育，接著是由95℃30秒，41℃30秒，72℃60秒組成的35個循環(huán)。使用常規(guī)方法凝膠純化1100個堿基對(bp)的強(qiáng)產(chǎn)物片斷，在TA載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中克隆，并測序。所得的序列可翻譯成與Genbank(登錄號#AF226154)中已知米根霉L-LDH-編碼基因序列表現(xiàn)出極好同源性的多肽。
本文公開的米根霉LDH-編碼基因的編碼序列與來自磷酸甘油酸激酶基因的啟動子和來自GAL10基因的轉(zhuǎn)錄終止子(兩者都來自釀酒酵母)可操作地連接。在制備該構(gòu)建體時(shí)，制備如下寡核苷酸并用于從含有根霉菌屬LDH插入片斷的質(zhì)粒擴(kuò)增編碼序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)兩個寡核苷酸引物，即Rapgk5和Papk3’，以便在該基因的編碼序列末端導(dǎo)入限制性位點(diǎn)Rapgk5GCTCTAGATGGTATTACACTCAAAGGTCG(SEQ ID No.37)和Papgk3GCTCTAGATCAACAGCTACTTTTAGAAAAG(SEQ ID No.38)。
使用上述濃度的dNTP和引物使用在廠商提供的緩沖液中的Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)進(jìn)行該擴(kuò)增反應(yīng)。通過在95℃起始溫育反應(yīng)混合物3分鐘，然后進(jìn)行20個循環(huán)的95℃30秒，53℃30秒，72℃60秒，接著在72℃最后溫育9分鐘進(jìn)行熱循環(huán)。產(chǎn)物用限制性酶XbaI消化，然后連接進(jìn)質(zhì)粒pNC101(NREL)的XbaI位點(diǎn)。
該連接導(dǎo)致PGK啟動子和GAL10終止子可操作地連接(即，在酵母細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性地連接)到米根霉L-LDH編碼序列上。一旦米根霉LDH可操作地連接到這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列上，切下NotI-NotI片斷并再克隆進(jìn)能在克魯維酵母種類中復(fù)制的載體(質(zhì)粒pNC003，NREL)中。所得的質(zhì)粒含有包含LDH的NotI-NotI片斷以及來自乳酸克魯維酵母質(zhì)粒pKD1的SphI位點(diǎn)之間的一個4,756bp的序列。
從耐熱克魯維酵母，米根霉或巨大芽孢桿菌分離的編碼LDH基因的G418抗性標(biāo)記載體。
從Invitrogen(Carlsbad，CA)獲得的G418抗生素選擇標(biāo)記經(jīng)過修飾并與丙酮酸脫羧酶基因的啟動子和GAL10基因的轉(zhuǎn)錄終止子(兩者均來自釀酒酵母)可操作地連接。在制備該構(gòu)建體時(shí)，制備如下寡核苷酸并用于從含有G418抗性基因插入片斷的質(zhì)粒擴(kuò)增編碼序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)兩個寡核苷酸引物，即G5’和G3’，以便在該基因的編碼序列末端導(dǎo)入限制性位點(diǎn)。
G5’AAATCTAGATGAGCCATATTCAACGGGA(SEQ ID No.39)和G3’CCGGATCCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT(SEQ ID No.40)。
這些寡核苷酸用于從pPIC9K載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)擴(kuò)增G418基因。使用上述濃度的dNTP和引物使用在廠商提供的緩沖液中的Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)進(jìn)行該擴(kuò)增反應(yīng)。通過在95℃起始溫育反應(yīng)混合物3分鐘，然后進(jìn)行20個循環(huán)的95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒，接著在72℃最后溫育9分鐘進(jìn)行熱循環(huán)。產(chǎn)物用限制性酶XbaI和BamHI消化，然后連接進(jìn)質(zhì)粒pNC104(NREL)的XbaI和BamHI位點(diǎn)。
與來自磷酸甘油酸激酶基因的啟動子和來自GAL10基因的轉(zhuǎn)錄終止子(兩者都來自釀酒酵母)可操作地連接的來自巨大芽孢桿菌的LDH基因在G418基因Gal10終止子3’端的SphI位點(diǎn)導(dǎo)入該載體。這樣基本上連接了G418選擇標(biāo)記基因與巨大芽孢桿菌的LDH基因以產(chǎn)生質(zhì)粒pCA5。限制性消化質(zhì)粒pCA5以切除由G418選擇標(biāo)記基因和巨大芽孢桿菌的LDH基因組成的4千堿基對(Kbp)片斷。該4Kbp片斷用于使用本文所述的化學(xué)和電穿孔方法轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母。
實(shí)施例20.用新的LDHs轉(zhuǎn)化酵母本文公開的耐熱克魯維酵母LDH-編碼基因(SEQ ID No.20)的編碼序列與來自磷酸甘油酸激酶基因的啟動子和來自GAL10基因的轉(zhuǎn)錄終止子(兩者都來自釀酒酵母)可操作地連接。在制備該構(gòu)建體時(shí)，制備如下寡核苷酸并用于從含有該插入片斷的質(zhì)粒擴(kuò)增編碼序列EJP14GCTCTAGAATTATGTTCCAAGATACAAAGTCTCAAG(SEQ ID No.41)和EJP15CCGGAATTCATCCTCAATTGATCTCCAGATGCTC(SEQ ID.No.42)。
使用上述濃度的dNTP和引物使用在廠商提供的緩沖液中的Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)進(jìn)行該擴(kuò)增反應(yīng)。通過在95℃下起始溫育反應(yīng)混合物3分鐘，然后進(jìn)行20個循環(huán)的95℃30秒，60℃40秒，72℃60秒，接著在72℃最后溫育9分鐘進(jìn)行熱循環(huán)。產(chǎn)物用限制性酶XbaI和EcoRI消化，然后連接進(jìn)質(zhì)粒pNC101(SOURCE)的XbaI和EcoRI位點(diǎn)。該連接導(dǎo)致PGK啟動子和GAL10終止子可操作地連接(即，在酵母細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性地連接)到耐熱克魯維酵母LDH編碼序列上。本文公開了含有所得融合的啟動子，耐熱克魯維酵母LDH編碼序列和終止子的該質(zhì)粒的NotI-NotI片斷，鑒定為SEQ ID No.43GCGGCCGCGG ATCGCTCTTC CGCTATCGAT TAATTTTTTT TTCTTTCCTC TTTTTATTAA 60CCTTAATTTT TATTTTAGAT TCCTGACCTT CAACTCAAGA CGCACAGATA TTATAACATC 120TGCACAATAG GCATTTGCAA GAATTACTCG TGAGTAAGGA AAGAGTGAGG AACTATCGCA 180TACCTGCATT TAAAGATGCC GATTTGGGCG CGAATCCTTT ATTTTGGCTT CACCCTCATA 240CTATTATCAG GGCCAGAAAA AGGAAGTGTT TCCCTCCTTC TTGAATTGAT GTTACCCTCA 300TAAAGCACGT GGCCTCTTAT CGAGAAAGAA ATTACCGTCG CTCGTGATTT GTTTGCAAAA 360AGAACAAAAC TGAAAAAACC CAGACACGCT CGACTTCCTG TCTTCCTATT GATTGCAGCT 420TCCAATTTCG TCACACAACA AGGTCCTAGC GACGGCTCAC AGGTTTTGTA ACAAGCAATC 480GAAGGTTCTG GAATGGCGGG AAAGGGTTTA GATCCACATG CTATGATGCC CACTGTGATC 540TCCAGAGCAA AGTTCGTTCG ATCGTACTGT TACTCTCTCT CTTTCAAACA GAATTGTCCG 600AATCGTGTGA CAACAACAGC CTGTTCTCAC ACACTCTTTT CTTCTAACCA AGGGGGTGGT 660TTAGTTTAGT AGAACCTCGT GAAACTTACA TTTACATATA TATAAACTTG CATAAATTGG 720TCAATGCAAG AAATACATAT TTGGTCTTTT CTAATTCGTA GTTTTTCAAG TTCTTAGATG 780
CTTTCTTTTT CTCTTTTTTA CAGATCATCA AGGAAGTAAT TATCTACTTT TTACAACAAA 840TCTAGAATTA TGTTCCAAGA TACAAAGTCT CAAGCAGTAA GAACTGATGC CAAAACAGTA 900AAAGTTGTGG TAGTGGGAGT GGGAAGTGTT GGGTCTGCCA CAGCGTATAC GTTGCTTCTC 960AGCGGCATCG TTTCCGAGAT TGTCCTTATC GACGTGAACA AAGACAAAGC AGAGGGTGAA1020AGCATGGACT TAAACCACGC AGCACCTTCA AATACAAGGT CTCGAGCGGG TGATTATCCT1080GACTGCGCTG GCGCGGCCAT TGTTATTGTC ACATGTGGGA TTAACCAAAA AAATGGACAA1140ACAAGGATGG ATCTTGCTGC AAAAAATGCC AACATTATGC TGGAAATCAT CCCCAATGTT1200GCCAAATATG CTCCTGATAC CATCCTGCTT ATTGCCACGA ATCCTGTCGA TGTTTTGACC1260TATATTAGCT ATAAGGCGTC AGGGTTTCCA CTAAGCAGAG TTATCGGCTC AGGTACAGTT1320CTGGATACTG CTCGTTTTAA ATACATCCTC GGAGAGCACT TCAAGATCTC ATCGGACAGC1380ATCGATGCCT GTGTAATTGG AGAACATGGT GATTCGGGTG TGCCTGTCTG GTCTCTTACC1440AACATCGACG GCATGAAGCT CCGGGATTAC TGCGAAAAAG CCAACCACAT ATTTGATCAG1500AATGCGTTCC ATAGAATCTT TGAGCAAACG CGAGACGCTG CTTACGATAT CATCAAGCGC1560AAAGGCTATA CTTCATATGG AATCGCAGCG GGATTACTTC GCATAGTAAA GGCGATTTTA1620GAGGATACAG GATCCACACT TACAGTTTCA ACCGTTGGTG ATTATTTTGG GGTTGAACAA1680ATTGCTATAA GCGTCCCTAC CAAACTCAAT AAAAGTGGGG CTCATCAAGT GGCTGAACTT1740TCACTCGATG AGAAGGAAAT AGAATTGATG GAAAAATCAG CTAGTCAGAT CAAATCAGTG1800 ATTGAGCATC TGGAGATCAA TTGAGGATGA ATTCGGATCC GGTAGATACATTGATGCTAT 1860
CAATCCAGAG AACTGGAAAG ATTGTGTAGC CTTGAAAAAC GGTGAAACTT ACGGGTCCAA1920GATTGTCTAC AGATTTTCCT GATTTGCCAG CTTACTATCC TTCTTGAAAA TATGCACTCT1980ATATCTTTTA GTTCTTAATT GCAACACATA GATTTGCTGT ATAACGAATT TTATGCTATT2040TTTTAAATTT GGAGTTCAGT GATAAAAGTG TCACAGCGAA TTTCCTCACA TGTAGGGACC2100GAATTGTTTA CAAGTTCTCT GTACCACCAT GGAGACATCA AAAATTGAAA ATCTATGGAA2160AGATATGGAC GGTAGCAACA AGAATATAGC ACGAGCCGCG GATTTATTTC GTTACGCATG2220CGCGGCCGC2229一旦耐熱克魯維酵母LDH可操作地連接到這些轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增序列上，切下該NotI-NotI片斷并再克隆進(jìn)能在克魯維酵母種類中復(fù)制的載體(質(zhì)粒pNC003，Invitrogen，Carlsbad，CA)中。所得的質(zhì)粒含有包含LDH的NotI-NotI片斷(SEQ ID No.43)以及來自乳酸克魯維酵母質(zhì)粒pKD1的SphI位點(diǎn)之間的一個4,756bp的序列(Chen等，1986，Nucleic Acids Res.，144471-4481)。另外，pNC003攜帶酵母TEF啟動子控制下的零霉素(zeocin)抗性基因(Hwang等，1993，EMBO J.122337-2348)。獲得了兩種方向的NotI-NotI片斷并稱為pNC 102和pNC 103。
這些質(zhì)?；旧习聪旅嫠鰧?dǎo)入馬克斯克魯維酵母和乳酸克魯維酵母中。質(zhì)粒pNC102和pNC103通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入酵母細(xì)胞。不含LDH-編碼基因的質(zhì)粒pNC003導(dǎo)入酵母細(xì)胞作為對照。在含有200ug/mL零霉素的YPD平板上選擇轉(zhuǎn)化子并在30℃生長2天。對于馬克斯克魯維酵母的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物，只獲得了一個pNC003轉(zhuǎn)化子和一個pNC103轉(zhuǎn)化子。在乳酸克魯維酵母的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物中，獲得了每個質(zhì)粒的多個轉(zhuǎn)化子。
然后分析轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生L-乳酸的能力。從轉(zhuǎn)化平板上的菌落直接接種含20g/L葡萄糖和300ug/mL零霉素的YPD培養(yǎng)基的培養(yǎng)物(2mL)。在30℃不搖動培養(yǎng)該培養(yǎng)物52小時(shí)。在該時(shí)期結(jié)束時(shí)，離心去掉細(xì)胞并使用YSI測定培養(yǎng)物上清的葡萄糖和L-乳酸。該測定的結(jié)果在下面表5中顯示。含有耐熱克魯維酵母LDH質(zhì)粒的馬克斯克魯維酵母和乳酸克魯維酵母細(xì)胞兩者都能產(chǎn)生明顯水平的L-乳酸，而含空載體的對照細(xì)胞不產(chǎn)生可檢測到的L-乳酸。因此，耐熱克魯維酵母LDH清楚地能夠在其它種類的酵母中起作用以引導(dǎo)碳進(jìn)入乳酸生產(chǎn)。
表5宿主 質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化子# 葡萄糖g/l L-乳酸g/l乳酸克魯維酵母 pNC003110.00.01乳酸克魯維酵母 pNC00329.9 0.02乳酸克魯維酵母 pNC102110.12.4乳酸克魯維酵母 pNC102210.52.4乳酸克魯維酵母 pNC102310.02.5乳酸克魯維酵母 pNC102410.12.4乳酸克魯維酵母 pNC102510.62.4乳酸克魯維酵母 pNC103111.02.2乳酸克魯維酵母 pNC103210.02.4乳酸克魯維酵母 pNC10339.3 2.5乳酸克魯維酵母 pNC103411.02.4乳酸克魯維酵母 pNC10359.9 2.5馬克斯克魯維酵母 pNC00310.010.02馬克斯克魯維酵母 pNC10310.001.3僅含YPD19.0 0.02實(shí)施例21.在馬克斯克魯維酵母中從D-木糖生產(chǎn)乳酸為了證實(shí)非葡萄糖的糖類可用于生產(chǎn)乳酸，通過遺傳改造從馬克斯克魯維酵母1(ATCC保藏號52486)衍生的馬克斯克魯維酵母菌株在250-mL擋板搖瓶中進(jìn)行木糖發(fā)酵成乳酸。更具體地說，在該實(shí)施例中使用的3個菌株如下(i)NC39攜帶多拷貝的含有質(zhì)粒pNC3上的零霉素選擇標(biāo)記和如下所述在磷酸甘油酸激酶啟動子控制下的巨大芽孢桿菌乳酸脫氫酶(LDH)的質(zhì)粒pNC7的馬克斯克魯維酵母1；(ii)NC103攜帶多拷貝的含有質(zhì)粒pNC003上的零霉素選擇標(biāo)記和如上所述在磷酸甘油酸啟動子控制下的耐熱克魯維酵母LDH的質(zhì)粒pNC103的馬克斯克魯維酵母1；和(iii)NC102攜帶多拷貝的含有pKD1載體上的零霉素標(biāo)記的質(zhì)粒pNC102的馬克斯克魯維酵母1。后一菌株用作對照。培養(yǎng)基中存在零霉素使質(zhì)粒丟失最小化。
通過將單個菌落轉(zhuǎn)移進(jìn)含有3mL補(bǔ)充了300μg/mL零霉素的確定成分完全培養(yǎng)基的10mL試管中制備接種物。在所有實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基含有(每升)6.7g Yeast-Nitrogen-Base(YNB；無氨基酸和硫酸銨)，3g尿素和0.3g零霉素。作為碳源和能源，加入20g/L D-葡萄糖或D-木糖。用氫氧化鉀將起始pH調(diào)節(jié)到5.0。在搖床上以250rpm和30℃生長細(xì)胞過夜并隨后轉(zhuǎn)移進(jìn)含有100mL上述YNB培養(yǎng)基的250mL擋板搖瓶中。細(xì)胞在pH 5.0和30℃再次生長過夜，隨后在-80℃貯存在15％(w/v)甘油的懸液中。這些貯存培養(yǎng)物用作下述實(shí)驗(yàn)的接種物。
用NC 39和NC103在葡萄糖上生產(chǎn)乳酸菌株NC102，NC103和NC39的培養(yǎng)物在上述YNB培養(yǎng)基中的2％(w/v)葡萄糖中以250rpm和30℃生長到靜止期。此后，沉淀細(xì)胞并以起始OD600為20轉(zhuǎn)移進(jìn)補(bǔ)充了2％(w/v)葡萄糖的YNB培養(yǎng)基中。細(xì)胞以100rpm和30℃培養(yǎng)以減少補(bǔ)充進(jìn)培養(yǎng)物中的氧。以一定的時(shí)間間隔從培養(yǎng)物中取出液體樣品以測量生長(使用OD600)，代謝產(chǎn)物和pH。使用固定在Waters 410Refractive Index檢測器上的Aminex HPX-87H柱(用10mM H2SO4作移動相以0.5mL/分的流速在55℃操作)通過HPLC進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析。當(dāng)pH下降到3.5以下時(shí)，加入2g無菌CaCO3將pH增加到大約5.5。
將細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)新鮮培養(yǎng)基24小時(shí)后，在所有試驗(yàn)菌株中葡萄糖完全耗盡。在菌株NC39和NC103中，分別產(chǎn)生了6.4g/L(32％產(chǎn)率)和3.8g/L(19％產(chǎn)率)的乳酸。在對照菌株NC102中沒有檢測到乳酸產(chǎn)生。菌株NC39和NC103還分別產(chǎn)生了2.3和2.9g/L乙醇；對照菌株NC102產(chǎn)生了5.8g/L乙醇。在所有培養(yǎng)物中沒有檢測到＞1.0g/L的其它典型發(fā)酵產(chǎn)物(丙酮酸鹽，琥珀酸，甘油和乙酸鹽)。
這些結(jié)果確定了表達(dá)異源性LDH(來自巨大芽孢桿菌或者耐熱克魯維酵母)的馬克斯克魯維酵母(crabtree-陰性酵母菌株)可用于從葡萄糖生產(chǎn)乳酸。
NC39和NC103在木糖上生產(chǎn)乳酸除了用D-木糖代替培養(yǎng)基中的葡萄糖外，使用基本上如上所述的培養(yǎng)和發(fā)酵條件證實(shí)使用木糖作碳源的乳酸生產(chǎn)。發(fā)酵72小時(shí)后在菌株NC39中從20g木糖產(chǎn)生4.8g乳酸的最大量(即，產(chǎn)率為0.23g/g)。在菌株NC103或?qū)φ站闚C102中不產(chǎn)生乳酸。另外，沒有檢測到＞1.0g/L的其它發(fā)酵產(chǎn)物(例如，丙酮酸鹽，乙酸鹽，甘油，乙醇)。
這些結(jié)果確定了表達(dá)異源性LDH(來自巨大芽孢桿菌或者耐熱克魯維酵母)的馬克斯克魯維酵母(crabtree-陰性酵母菌株)可用于從木糖生產(chǎn)乳酸，盡管速率比用葡萄糖更慢。
這些結(jié)果也在圖15中顯示。
實(shí)施例22.在酵母中從戊糖糖類生產(chǎn)L-乳酸將Candida種類遺傳改造成使用戊糖糖類生產(chǎn)乳酸。載體和其它構(gòu)建體在圖16中顯示。
用于C.sonorensis的零霉素抗性載體通過加入提供同源重組靶的C.sonorensis rDNA片斷修飾含有在釀酒酵母TEF1啟動子控制下的零霉素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒pTEF1/Zeo(Invitrogen)。相應(yīng)于C.sonorensis 26 S rRNA(Genbank登錄號U70185)的下列寡核苷酸引物TGGACT AGTAAA CCA ACA GGG ATT GCC TTA GT(SEQ ID No.44)和CTA GTC TAG AGA TCA TTA CGC CAG CAT CCT AGG(SEQ ID No.45)用于擴(kuò)增C.Sonorensis基因組DNA以提供26S rDNA基因的PCR擴(kuò)增片斷。所得的PCR產(chǎn)物片斷用限制性酶SpeI和XbaI消化并與用XbaI消化的pTEF/Zseo連接。所得的質(zhì)粒pMI203在圖16中顯示。
用來自另一種念珠菌屬(Candida)的基因啟動子，即白色念珠菌(C.albicans)PGKI啟動子代替pMI203中所含的TEF1啟動子。根據(jù)可得的白色念珠菌PGK1序列(Genbank登錄號U25180)設(shè)計(jì)下列寡核苷酸引物GCG ATC TCG AGG TCC TAG AAT ATG TAT ACT AAT TTG C(SEQ ID No.46)和ACT TGGCCA TGGTGA TAG TTA TTC TTC TGC AAT TGA(SEQ ID No.47)用于使用白色念珠菌基因組DNA作模板從白色念珠菌PGK1開放閱讀框的上游區(qū)擴(kuò)增700bp片斷。向引物中加入限制性位點(diǎn)XbaI和SpeI(上面的下劃線)以利于該片斷的克隆。擴(kuò)增后，分離該片斷并用限制性酶XhoI和NcoI消化，然后連接到用XhoI和NcoI消化的質(zhì)粒pMI203上。所得的質(zhì)粒pMI205在圖16中顯示。
C.Sonorensis基因的分離為了形成C.sonorensis的合適遺傳工具，從該種類構(gòu)建基因組文庫。根據(jù)相關(guān)酵母基因的已知氨基酸和核苷酸序列從該文庫分離目的基因。分離諸如PGK1和TDH1的強(qiáng)組成型表達(dá)基因的啟動子和終止子并用于表達(dá)異源性基因。分離PDC基因，因?yàn)橄鄳?yīng)的酶進(jìn)行與乳酸生產(chǎn)競爭的反應(yīng)。因此需要從用于乳酸生產(chǎn)的菌株刪除PDC基因。
使用Easy DNA試劑盒(Invitrogen)從YPD中生長過夜的細(xì)胞分離C.sonorensis(ATCC保藏號32109)的基因組DNA。用Sau3A部分消化DNA并通過蔗糖梯度離心(Sambrook等，1989，Molecular Cloning，第二版，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行大小分離，將大約22kb的DNA片斷連接到BamHI消化的，磷酸酶處理的λDASHTM載體臂(Stratagene)上并使用Gigapack II GoldPackaging Extract(Stratagene)將連接混合物包裝進(jìn)λ顆粒中。該λ顆粒用于感染大腸桿菌MRA P2。
使用Dynazyme EXT聚合酶(Finnzymes，Espoo，F(xiàn)inland)，序列特異性引物和如下的釀酒酵母，白色念珠菌或C.sonorensis的基因組DNA作模板通過PCR擴(kuò)增制備用于從該文庫分離C.sonorensis基因的探針●相應(yīng)于釀酒酵母TDH1基因的寡核苷酸TGT CAT CAC TGC TCC ATC TT(SEQID No.48)和TTA AGC CTT GGC AAC ATA TT(SEQ ID No.49)用于從基因組釀酒酵母DNA擴(kuò)增TDH基因的片斷。
●相應(yīng)于白色念珠菌PGK1基因的寡核苷酸GCG ATC TCG AGG TCC TAG AAT ATGTAT ACT AAT TTG C(SEQ ID No.50)和CGC GAA TTCCCA TGGTTA GTTTTT GTT GGA AAG AGC AAC(SEQ ID No.51)用于從基因組白色念珠菌DNA擴(kuò)增PGK1基因的片斷。
●相應(yīng)于C.sonorensis 26 S rRNA的寡核苷酸TGGACT AGTAAA CCA ACAGGG ATT GCC TTA GT(SEQ ID No.52)和CTA GTC TAG AGA TCA TTA CGCCAG CAT CCT AGG(SEQ ID No.53)用于從C.sonorensis基因組DNA擴(kuò)增26S rDNA基因的片斷。
●根據(jù)在釀酒酵母PDC1，樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)PDC1和PDC2，和白色念珠菌PDC1和PDC3的不完全序列之間保守的部分丙酮酸脫羧酶氨基酸序列WAGNANELNA(SEQ ID No.56)和DFNTGSFSYS(SEQ ID No.57)設(shè)計(jì)寡核苷酸CCGGAA TTC GAT ATCTGG GCW GGK AAT GCC AAY GAR TTRAAT GC(SEQ ID No.54)和CGCGGA TTC AGG CCTCAG TAN GAR AAW GAACCN GTR TTR AAR TC(SEQ ID No.55)。這些引物用于從C.sonorensis基因組DNA擴(kuò)增PDC基因的片斷。用這些引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)生了稱為PDC1和PDC2的不同核苷酸序列的兩個片斷。
●根據(jù)真菌乙醇脫氫酶序列中發(fā)現(xiàn)的保守區(qū)設(shè)計(jì)寡核苷酸TCTGTTMCCTACRTAAGA(SEQ ID No.58)和GTYGGTGGTCACGAAGGTGC(SEQ IDNo.59)。這些引物用于從C.sonorensis基因組DNA擴(kuò)增ADH基因的片斷。用這些引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)生了稱為ADH1，ADH2，和ADH3的不同核苷酸序列的3個片斷。
用上述產(chǎn)生的PCR片斷篩選該文庫，使用隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim)用32Pα-dCTP標(biāo)記該產(chǎn)物。通過在含有50％甲酰胺，5x Denha rdt’s，5x SSPE，0.1％SDS，100μg/mL鯡精DNA，1μg/mL polyADNA的溶液中42℃溫育過夜進(jìn)行與放射性探針的雜交。對于TDH1，PGK1，和PDC1探針，雜交后在室溫在2x SSC的溶液中洗滌濾膜5分鐘并重復(fù)，接著在1x SSC-0.1％SDS的溶液中68℃洗滌兩個30分鐘。對于rDNA和PDC2探針的雜交后洗滌在室溫在2x SSC中進(jìn)行兩次5分鐘，接著在68℃在0.1xSSC-0.1％SDS中洗滌兩個30分鐘。
按照廠商的說明書(Stratagene)分離和純化陽性噬菌斑。使用常規(guī)方法(Sambrook等，出處同上)純化噬菌體，對該方法的修改為除出DNAseI處理并使用PEG6000沉淀從裂解的宿主細(xì)胞釋放的噬菌體顆粒，然后將該噬菌體顆粒溶于SM緩沖液中并用氯仿萃取，通過在Kontron TST41.14離心機(jī)中以25,000rpm離心2小時(shí)沉淀，并再次溶于SM緩沖液中。通過用蛋白酶K消化噬菌體顆粒接著苯酚提取和乙醇沉淀分離λDNA。
使用序列特異性引物部分測序C.sonorensis基因組DNA插入片斷。將該核苷酸序列和從其推斷的氨基酸序列與序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，通過與已知基因或蛋白質(zhì)的同源性鑒定由噬菌體插入片斷全部或部分編碼的基因。依賴于用于分離各克隆的探針，所獲得的序列與真菌rDNA，磷酸甘油酸激酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，或丙酮酸脫羧酶具有顯著的相似性。從而鑒定了C.sonorensis PGK1，PDC1和TDH1開放閱讀框編碼序列的起始和終止點(diǎn)。
MEL5基因選擇用于選擇C.sonorensis轉(zhuǎn)化子為了建立對C.sonorensis轉(zhuǎn)化子的陽性選擇，從質(zhì)粒pMEL5-39以2160bp的EcoRI-SpeI片斷獲得釀酒酵母MEL5基因(Naumov等，1990，MGG224119-128；Turakainen等，1994，Yeast101559-1568；Genbank登錄號Z37511)并與用EcoRI和SpeI酶切消化的pBluescript II KS(-)(Stratagene)連接。MEL5基因中的EcoRI位點(diǎn)位于起始密碼子ATG上游510bp處，SpeI位點(diǎn)位于MEL5終止密碼子下游250bp處。所得的質(zhì)粒命名為pMI233，且在圖16中顯示。
用引物GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG(SEQ ID No.60)和TGGACT AGTACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACA TTG TAT ATAGTC TTT TCT ATT ATT AG(SEQ ID No.61)并使用上述分離的PGK1λ克隆的DNA作模板擴(kuò)增1500bp的C.sonorensis PGK1啟動子。3’引物(SEQ IDNo.61)可產(chǎn)生C.sonorensis PGK1啟動子和釀酒酵母MEL5之間的融合，因?yàn)樗鄳?yīng)于緊靠開放閱讀框上游的PGK1啟動子上存在的核苷酸和相應(yīng)于MEL5開放閱讀框5’端的核苷酸。所得的擴(kuò)增片斷用限制性酶SphI和XhoI消化并連接到用SphI和XhoI消化的質(zhì)粒pMI233上。在該質(zhì)粒中所得的構(gòu)建體含有MEL5開放閱讀框上游且可操作地連接到其上的C.sonorensis PGK1啟動子，且鑒定為圖16中所示的pMI234。
以相似的方式，使用上述分離的TDH1λ克隆的DNA作模板用引物GCG ATCTCG AGA AAA TGT TAT TAT AAC ACT ACA C(SEQ ID No.62)和TGGACT AGTACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACA TTT TGT TTG ATT TGT TTGTTT TGT TTT TGT TTG(SEQ ID No.63)擴(kuò)增650bp的C.sonorensis TDH1啟動子。3’引物(SEQ ID No.63)可產(chǎn)生C.sonorensis TDH1啟動子和釀酒酵母MEL5之間的融合，因?yàn)樗鄳?yīng)于緊靠開放閱讀框上游的TDH1啟動子上存在的核苷酸和相應(yīng)于MEL5開放閱讀框5’端的核苷酸。用SphI和XhoI酶切擴(kuò)增片斷并連接到用SphI和XhoI消化的質(zhì)粒pMI233上。鑒定為圖16中所示的pMI238的所得質(zhì)粒含有MEL5開放閱讀框上游且可操作地連接到其上的C.sonorensis TDH1啟動子。
通過用SpeI和XhoI限制性酶消化可從載體序列釋放MEL5表達(dá)序列盒，且按照Backer等(1999，Yeast151609-1618)的方法通過電穿孔將1μg的該線型DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)C.sonorensis中。細(xì)胞在50mL的YPD中生長過夜，離心收獲并重懸于0.1M LiAc/10mM DTT/10mM Tris-HCl溶液中及在室溫培養(yǎng)1小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。離心收集細(xì)胞并用冷水和1M山梨醇洗滌并重懸于冷的1M山梨醇中。將DNA(1-3μg)加入40μL的細(xì)胞懸液中并將該混合物吸入0.2cm電穿孔杯中。Bio-Rad基因脈沖儀設(shè)置為1.5kV，25F，200Ω用于電穿孔。電脈沖后，將1mL冷的1M山梨醇加到細(xì)胞上。然后細(xì)胞在30℃不搖動培養(yǎng)1小時(shí)；作為選擇，可加入2mL YPD且在30℃繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時(shí)。將細(xì)胞涂布到合適的瓊脂平板上用于再生。
在另一選擇方案中，按照Gietz等(1992，Nucleic Acids Res.201425)的方案轉(zhuǎn)化細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子在以40μg/mL的濃度補(bǔ)充了α-半乳糖苷酶的產(chǎn)色底物，即5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal；ICNBiochemicals)的YPD瓊脂平板(含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖和2％瓊脂)上生長。平板在30℃培養(yǎng)1-3天，然后轉(zhuǎn)移到4℃。存在X-gal時(shí)，用有功能的MEL5表達(dá)序列盒轉(zhuǎn)化的酵母菌落變藍(lán)，而未轉(zhuǎn)化的菌落為白色。在這些實(shí)驗(yàn)中獲得的轉(zhuǎn)化頻率為2-20個轉(zhuǎn)化子/μg DNA。通過將它們在新鮮指示劑平板上再劃線培養(yǎng)來純化藍(lán)色菌落。
轉(zhuǎn)化子還獲得了在作為唯一碳源的蜜二糖上生長的能力。這表明蜜二糖通過分泌進(jìn)培養(yǎng)基的MEL5-編碼的α-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖。
在含有X-gal的培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子的平行策略是在含有蜜二糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上選擇它們。轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞涂布到含有0.67％Yeast Nitrogenbase(Difco)和2％蜜二糖的瓊脂平板上，平板在30℃培養(yǎng)5-10天。在這些條件下，未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能長出可見菌落，而MEL5轉(zhuǎn)化子形成菌落。含有C.sonorensis的MEL5標(biāo)記的瑞士乳桿菌LDH表達(dá)盒和載體質(zhì)粒pMI205用于產(chǎn)生含有作為選擇標(biāo)記的MEL5基因和用于使得能夠在C.soronensis中產(chǎn)生乳酸的LDH基因的質(zhì)粒。在所得的質(zhì)粒中，用瑞士乳桿菌LDH基因取代pMI205中的零霉素抗性基因。
將含有LDH基因和CYC1終止子的pVR1的1329bp NcoI-BamHI片斷連接到pMI205的3413bp NcoI-BamHI片斷上，導(dǎo)致瑞士乳桿菌LDH基因在白色念珠菌PGK1啟動子的控制下；所得的質(zhì)粒稱為pMI214且在圖16中表示。在第二個步驟中，用C.sonorensis PGK1啟動子取代白色念珠菌PGK1啟動子。使用引物GCG ATC TCG AGA AAG.AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG(SEQ IDNo.64)和ACT TGGCCA TGGTAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG(SEQ ID No.65)從上述分離的λ克隆通過擴(kuò)增分離C.sonorensis PGK1啟動子，用XhoI和NcoI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物并連接進(jìn)用XhoI和NcoI消化的pMI214中。該質(zhì)粒命名為pMI277且在圖16中表示。
通過將pMI227的3377bp Avr II-NheI片斷與SpeI-消化的pMI234連接將pMI227的LDH表達(dá)盒和pMI234的MEL5標(biāo)記序列盒組合進(jìn)同一載體中。所得的質(zhì)粒命名為pMI246且在圖16中表示。
通過將pMI227的3377bp Avr II-NheI片斷與SpeI-消化的pMI238連接將pMI227的LDH表達(dá)盒和pMI238的MEL5標(biāo)記序列盒組合進(jìn)同一載體中。所得的質(zhì)粒命名為pMI247且在圖16中表示。
用于乳酸生產(chǎn)的C.sonorensis轉(zhuǎn)化使用本領(lǐng)域中對于其它酵母種類形成的轉(zhuǎn)化方法將編碼LDH的載體導(dǎo)入C.sonorensis細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化前，質(zhì)粒pMI246和pMI247通過用在rDNA序列內(nèi)酶切的限制性酶BstBI消化被線型化，從而定向整合進(jìn)rDNA基因座。作為選擇，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒用ApaI和BamHI消化，接著從瓊脂糖凝膠純化，從而從載體序列釋放該標(biāo)記和LDH序列盒并有利于隨機(jī)整合進(jìn)基因組。
通過醋酸鋰方法(Gietz等，1992，Nucleic Acids Res.201425)或者通過上述電穿孔方法用pMI246或pMI247轉(zhuǎn)化C.sonorensis且根據(jù)在補(bǔ)充了X-gal的YPD平板上形成的藍(lán)色篩選并純化轉(zhuǎn)化子。
檢測產(chǎn)生α-半乳糖苷酶的菌落的乳酸生產(chǎn)。轉(zhuǎn)化子在YPD液體培養(yǎng)基中30℃生長過夜，取出等分試樣的培養(yǎng)基并使用L-乳酸測定試劑盒(Boehringer Mannheim)酶促分析乳酸的存在。在轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物上清中檢測到的乳酸比宿主菌株多至少10倍。
用BstBI酶切的pMI246轉(zhuǎn)化C.sonorensis產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子命名為246-1到246-9。用BstBI酶切的pMI247轉(zhuǎn)化C.sonorensis產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子命名為247-1到247-4。用ApaI-BamHI酶切的pMI246轉(zhuǎn)化C.sonorensis產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子命名為246-10到246-15。用ApaI-BamHI酶切的pMI247轉(zhuǎn)化C.sonorensis產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子命名為247-5到247-10。
含有整合進(jìn)基因組的瑞士乳桿菌LDH基因的C.sonorensis在豐富培養(yǎng)基中的L-乳酸生產(chǎn)C.sonorensis細(xì)胞和上述轉(zhuǎn)化子(246-1，246-2，246-3，247-1，247-2，247-3和247-4)在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物在YPD培養(yǎng)基中生長到OD600為11-17，然后重懸于50mL的YPD中達(dá)到OD600為0.5用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)開始時(shí)，酵母細(xì)胞在以250rpm搖動的250mL錐形瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)4小時(shí)后，將酵母細(xì)胞移進(jìn)100mL錐形瓶中并加入額外的葡萄糖(相應(yīng)于20g/L的終濃度)并以40rpm搖動繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間取出樣品，測量OD600，通過離心收獲細(xì)胞并以HPLC分析生長培養(yǎng)基的乳酸和葡萄糖(使用BoehringerMannheim的L-乳酸UV法和葡萄糖/GOD-過碘酸鹽方法)。
培養(yǎng)24小時(shí)后，轉(zhuǎn)化子從葡萄糖產(chǎn)生2.4-3.3g/L乳酸(相當(dāng)于11-63％的產(chǎn)率)，而對照菌株產(chǎn)生0.05g/L乳酸(0.1％的產(chǎn)率)。
本實(shí)施例證實(shí)了LDH在C.sonorensis細(xì)胞中的超表達(dá)增強(qiáng)了含葡萄糖的培養(yǎng)基中的L-乳酸生產(chǎn)。
含有整合進(jìn)基因組中的瑞士乳桿菌LDH基因的C.sonorensis在基本葡萄糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-乳酸C.sonorensis細(xì)胞和上述轉(zhuǎn)化子(246-1，246-3，247-2)在YD培養(yǎng)基(補(bǔ)充了2％葡萄糖的無氨基酸的酵母氮源)中培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物在YD培養(yǎng)基中生長到OD600為10-13，離心收集細(xì)胞，用YD培養(yǎng)基洗滌一次，然后重懸于50mL的YD中達(dá)到OD600為0.4用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。酵母在100mL錐形瓶中以40rpm搖動培養(yǎng)(微需氧條件)。培養(yǎng)期間取出樣品，測量OD600，通過離心收獲細(xì)胞并以HPLC分析生長培養(yǎng)基的乳酸和葡萄糖。HPLC分析用Waters 510HPLC泵，Waters 717+自動取樣器和Water System Interphase Module液相色譜法與折光率檢測器(Waters 410示差折射計(jì))和UV-檢測器(Waters 2487雙重λUV檢測器)組合進(jìn)行。使用的Aminex HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃用水中的5mM H2SO4平衡，樣品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脫。用Waters Millennium軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和控制。
培養(yǎng)70小時(shí)后，轉(zhuǎn)化子從葡萄糖產(chǎn)生2.2-2.5g/L乳酸(相當(dāng)于10-13％的產(chǎn)率)，而對照菌株不產(chǎn)生能檢測到的乳酸。
本實(shí)施例證實(shí)了超表達(dá)異源性LDH基因的C.sonorensis細(xì)胞能從葡萄糖產(chǎn)生乳酸。
含有整合進(jìn)基因組中的瑞士乳桿菌LDH基因的C.sonorensis細(xì)胞在厭氧條件下在基本葡萄糖培養(yǎng)基(minimal glucose media)中生產(chǎn)L-乳酸C.sonorensis細(xì)胞和上述轉(zhuǎn)化子(246-1)在YD培養(yǎng)基(補(bǔ)充了2％葡萄糖的無氨基酸的酵母氮源)中在厭氧搖瓶中培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物在YD培養(yǎng)基中生長到OD600為22-24，離心收集細(xì)胞，用YD培養(yǎng)基洗滌一次，然后重懸于100mL的YD中達(dá)到OD600為0.75用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。在裝備有以40rpm搖動的鎖水器(waterlocks)的100mL錐形瓶中(厭氧條件)培養(yǎng)酵母。培養(yǎng)期間取出樣品，測量OD600，通過離心收獲細(xì)胞并以HPLC分析生長培養(yǎng)基的乳酸和葡萄糖。HPLC分析用Waters 510HPLC泵，Waters717+自動取樣器和Water SystemInterphase Module液相色譜法與折光率檢測器(Waters410示差折射計(jì))和UV-檢測器(Waters2487雙重λUV檢測器)組合進(jìn)行。使用的Aminex HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃用水中的5mM H2SO4平衡，樣品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脫。用Waters Millennium軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和控制。
培養(yǎng)160小時(shí)后，菌株246-1從葡萄糖產(chǎn)生1.1g/L乳酸(相當(dāng)于16％的產(chǎn)率)，而對照菌株產(chǎn)生0.03g/L乳酸(0.1％的產(chǎn)率)。
本實(shí)施例證實(shí)了超表達(dá)異源性LDH基因的C.sonorensis細(xì)胞能在厭氧條件下從葡萄糖產(chǎn)生乳酸。
含有整合進(jìn)基因組中的瑞士乳桿菌LDH基因的C.sonorensis在基本木糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-乳酸C.sonorensis細(xì)胞和上述轉(zhuǎn)化子(246-1，246-3，247-2)在YX培養(yǎng)基(無氨基酸且補(bǔ)充了2％木糖的酵母氮源(base))中培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物在YPD培養(yǎng)基中生長到OD600為10-13，隨后離心收集細(xì)胞，用YX培養(yǎng)基洗滌一次并重懸于50mL的YX培養(yǎng)基中達(dá)到OD600為0.75用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。酵母培養(yǎng)物在100mL錐形瓶中以40rpm搖動培養(yǎng)。培養(yǎng)期間取出樣品，測量OD600，通過離心收獲細(xì)胞并以HPLC分析生長培養(yǎng)基的乳酸和木糖。HPLC分析用Waters 510HPLC泵，Waters 717+自動取樣器和Water System Interphase Module液相色譜法與折光率檢測器(Waters 410示差折射計(jì))和UV-檢測器(Waters 2487雙重λUV檢測器)組合進(jìn)行。Aminex HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃用水中的5mM H2SO4平衡，樣品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脫。用Waters Millennium軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和控制。以Boehringer Mannheim的L-乳酸UV法分析L-乳酸。
培養(yǎng)70小時(shí)后，轉(zhuǎn)化子從木糖產(chǎn)生0.1g/L乳酸(相當(dāng)于9-17％的產(chǎn)率)，而對照菌株產(chǎn)生0.003g/L乳酸(0.2％的產(chǎn)率)。
本實(shí)施例證實(shí)了超表達(dá)異源性乳酸脫氫酶編碼基因的C.sonorensis能從木糖產(chǎn)生乳酸。
含有整合進(jìn)基因組中的瑞士乳桿菌LDH基因的C.sonorensis在基本木糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-乳酸C.sonorensis細(xì)胞和上述轉(zhuǎn)化子(246-1，246-3，247-2)在YX培養(yǎng)基(無氨基酸且補(bǔ)充了2％木糖的酵母氮源)中培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物在YPD培養(yǎng)基中生長到OD600為12-18，隨后離心收集細(xì)胞，用YX培養(yǎng)基洗滌一次并重懸于50mL的YX培養(yǎng)基中達(dá)到OD600為2.0用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。酵母培養(yǎng)物在100mL錐形瓶中以40rpm搖動(微需氧條件)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間取出樣品，測量OD600，通過離心收獲細(xì)胞并以HPLC分析生長培養(yǎng)基的乳酸和木糖。HPLC分析用Waters 510HPLC泵，Waters 717+自動取樣器和Water System InterphaseModule液相色譜法與折光率檢測器(Waters 410示差折射計(jì))和UV-檢測器(Waters 2487雙重λUV檢測器)組合進(jìn)行。Aminex HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃用水中的5mM H2SO4平衡，樣品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脫。用Waters Millennium軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和控制。以Boehringer Mannheim的L-乳酸UV法分析L-乳酸。
培養(yǎng)165小時(shí)后，轉(zhuǎn)化子從木糖產(chǎn)生0.2g/L乳酸(相當(dāng)于5-6％的產(chǎn)率)，而對照菌株不產(chǎn)生可檢測的乳酸。
本實(shí)施例證實(shí)了超表達(dá)異源性乳酸脫氫酶編碼基因的C.sonorensis能從木糖產(chǎn)生乳酸。
含有整合進(jìn)基因組中的瑞士乳桿菌LDH基因的C.sonorensis在基本阿拉伯糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-乳酸C.sonorensis細(xì)胞和轉(zhuǎn)化子(246-1，246-3，247-2)在YA培養(yǎng)基(無氨基酸且補(bǔ)充了2％L-阿拉伯糖的酵母氮源)中培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物在YPD培養(yǎng)基中生長到OD600為12-18，隨后離心收集細(xì)胞，用YA培養(yǎng)基洗滌一次并重懸于50mL的YA培養(yǎng)基中達(dá)到OD600為2.0用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。酵母培養(yǎng)物在100mL錐形瓶中以40rpm搖動(微需氧條件)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間取出樣品，測量OD600，通過離心收獲細(xì)胞并以HPLC分析生長培養(yǎng)基的乳酸和阿拉伯糖。HPLC分析用Waters 510HPLC泵，Waters 717+自動取樣器和Water System InterphaseModule液相色譜法與折光率檢測器(Waters 410示差折射計(jì))和UV-檢測器(Waters 2487雙重λUV檢測器)組合進(jìn)行。Aminex HPX-87H離子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)在35℃用水中的5mM H2SO4平衡，樣品用在水中的5mM H2SO4以0.6mL/分的流速洗脫。用Water s Millennium軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和控制。
培養(yǎng)165小時(shí)后，轉(zhuǎn)化子從阿拉伯糖產(chǎn)生0.04-0.05g/L乳酸(相當(dāng)于2-3％的產(chǎn)率)，而對照菌株產(chǎn)生0.007g/L乳酸(0.5％的產(chǎn)率)。
本實(shí)施例證實(shí)了超表達(dá)異源性乳酸脫氫酶編碼基因的C.sonorensis能從阿拉伯糖產(chǎn)生乳酸。
含有整合進(jìn)基因組中的瑞士乳桿菌LDH基因的C.sonorensis菌株在基本蜜二糖培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-乳酸C.sonorensis細(xì)胞和上述轉(zhuǎn)化子(246-1，246-10，247-2，247-5)在YM培養(yǎng)基(無氨基酸且補(bǔ)充了2％蜜二糖的酵母氮源)中培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)物在YPD培養(yǎng)基中生長到OD600為18-25，離心收集細(xì)胞并用YM培養(yǎng)基洗滌一次并重懸于50mL的YM培養(yǎng)基中達(dá)到OD600為1.5用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。酵母在100mL錐形瓶中以40rpm搖動(微需氧條件)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間取出樣品，測量OD600，通過離心收獲細(xì)胞并以HPLC分析生長培養(yǎng)基中的乳酸(以BoehringerMannheim的L-乳酸UV法)。
培養(yǎng)165小時(shí)后，轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生0.8-2.6g/L乳酸。
本實(shí)施例揭示了超表達(dá)異源性LDH基因的C.sonorensis細(xì)胞能從蜜二糖產(chǎn)生乳酸。
其它實(shí)施方案應(yīng)理解盡管結(jié)合其詳細(xì)描述已經(jīng)描述了本發(fā)明，但是前面的描述的意圖是舉例說明性的而不是限制本發(fā)明的范圍，該范圍由所附的權(quán)利要求書的范圍來限定。其它方面，優(yōu)點(diǎn)，和修改均在下面權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表<110>文杰特·拉杰拉希亞(Rajgarhia，Vineet)默加·潘蒂拉(Penttila，Merja)勞拉·勞霍南(Ruohonen，Laura)馬加·伊爾曼(Ilmen，Marja)卡里·科伊沃蘭塔(Koivuranta，Kari)<120>合成有機(jī)產(chǎn)物的方法和材料<130>MBHB00-1237-A<140>09/992,430<141>2001-11-23<150>60/252541<151>2000-11-22<160>65<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>92<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多克隆位點(diǎn)<400>1
cccaagcttg aattccccgg gggatccctg cagggtacca cgcgtagatc tactagtgcg60gccgcctcga gtctagaggg cccaagcttg gg 92<210>2<211>91<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多克隆位點(diǎn)<400>2ccaagcttgg gccctctaga ctcgaggcgg ccgcactagt agatctacgc gtggtaccct60gcagggatcc cccggggaat tcaagcttgg g 91<210>3<211>31<212>DNA<213>瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)<400>3ccgggatcca tggcaagaga ggaaaaacct c 31<210>4<211>32<212>DNA<213>瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)<400>4ccaagatctt tattgacgaa ccttaacgcc ag 32<210>5<211>37<212>DNA
<213>乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)<400>5ccgggatcca tgtctaatat tcaaaatcat caaaaag 37<210>6<211>33<212>DNA<213>乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)<400>6ccaagatctt tatttgtctt gtttttcagc aag 33<210>7<211>82<212>DNA<213>馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)<400>7taaacagtac aatcgcaaag aaaagctcca cacccaaacc aaataattgc aatgcaactt60cttttctttt tttttctttt ct 82<210>8<211>79<212>DNA<213>馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)<400>8ttataaaatc attaaaatcc aaaatcgtaa tttatctctt tatcctctcc ctctctacat60gccggtagag gtgtggtca 79<210>9<211>1736
<212>DNA<213>未知<220>
<223>卡那霉素抗性基因<400>9gtacaacttg agcaagttgt cgatcagctc ctcaaattgg tcctctgtaa cggatgactc60aacttgcaca ttaacttgaa gctcagtcga ttgagtgaac ttgatcaggt tgtgcagctg120gtcagcagca tagggaaaca cggcttttcc taccaaactc aaggaattat caaactctgc180aacacttgcg tatgcaggta gcaagggaaa tgtcatactt gaagtcggac agtgagtgta240gtcttgagaa attctgaagc cgtattttta ttatcagtga gtcagtcatc aggagatcct300ctacgccgga cgcatcgtgg ccgacctgca gggggggggg gggcgctgag gtctgcctcg360tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt420gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt480ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc540agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc600cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac660tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat720gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg780attccgactc gtccaacatc aatacaacct ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat840caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agcttatgca900ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc960aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt1020aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc1080aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttcccggg1140gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg1200aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc1260aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg1320atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc1380
agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac gtttcccgtt gaatatggct1440cataacaccc cttgtattac tgtttatgta agcagacagt tttattgttc atgatgatat1500atttttatct tgtgcaatgt aacatcagag attttgagac acaacgtggc tttccccccc1560ccccctgcag gtcggcatca ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga1620catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt1680gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg actgttgggc gccatctcct tgcatg1736<210>10<211>372<212>DNA<213>馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)<400>10ccggttcttt ctcttactct tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgactaca60tcaaggtcag aaacgccact ttcccaggtg tccaaatgaa gttcgtcttg caaaagttgt120tgaccaaggt caaggatgct gctaagggtt acaagccagt tccagttcct cacgctccaa180gagacaacaa gccagttgct gactctactc cattgaagca agaatgggtc tggactcaag240tcggtaagtt cctacaagaa ggtgatgttg ttctaactga aaccggtacc tccgctttcg300gtatcaacca aacccacttc ccaaatgaca cctacggtat ctcccaagtc ttgtggggtt360ccattggttt ca372<210>11<211>747<212>DNA<213>馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)<400>11ttaccactgt cttcggtctg ccaggtgact tcaatctgcg tctgttggac gagatctacg60aggtcgaggg tatgagatgg gccggtaact gtaacgagtt gaacgcttct tacgctgccg120acgcttacgc cagaatcaag ggtatgtcct gtttgatcac caccttcggt gtcggtgagt180tgtccgcttt gaacggtatc gccggttctt acgctgagca cgtcggtgtc ttgcacattg240
tcggtgtccc atccgtctcc gcccaggcca agcagctatt gttgcaccac accttgggta300acggtgactt cactgtcttc cacagaatgt ccgccaacat ctctgagacc actgctatga360tcactgatct agctaccgcc ccatctgaga tcgacagatg tatcagaacc acctacatta420gacagagacc tgtctacttg ggtttgccat ctaacttcgt tgaccagatg gtcccagcct480ctctattgga caccccaatt gacttggcct tgaagccaaa cgaccagcag gctgaggagg540aggtcatctc tactttgttg gagatgatca aggacgctaa gaacccagtc atcttggctg600acgcttgcgc ttccagacac gatgtcaagg ctgagaccaa gaagttgatt gacatcactc660agttcccatc tttcgttacc ccaatgggta agggttccat tgacgagaag cacccaagat720tcggtggtgt ctacgtcggt accttgt747<210>12<211>1738<212>DNA<213>未知<220>
<223>卡那霉素抗性基因片斷<400>12gtacaacttg agcaagttgt cgatcagctc ctcaaattgg tcctctgtaa cggatgactc60aacttgcaca ttaacttgaa gctcagtcga ttgagtgaac ttgatcaggt tgtgcagctg120gtcagcagca tagggaaaca cggcttttcc taccaaactc aaggaattat caaactctgc180aacacttgcg tatgcaggta gcaagggaaa tgtcatactt gaagtcggac agtgagtgta240gtcttgagaa attctgaagc cgtattttta ttatcagtga gtcagtcatc aggagatcct300ctacgccgga cgcatcgtgg ccgacctgca gggggggggg gggcgctgag gtctgcctcg360tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt420gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt480ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc540agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc600cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac660tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat720gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta teggtctgcg780
attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta840tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc900atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca960tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg1020ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca1080tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg1140gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc1200ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg1260gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat1320cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa1380tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg1440ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat1500atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttccccc1560ccccccctgc aggtcggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc1620gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc1680gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatg 1738<210>13<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并擴(kuò)增引物<400>13gtbatyggyt chggtac 17<210>14<211>17<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>簡并擴(kuò)增引物<400>14swrtcdccrt gytcacc 17<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>15gtacagttct ggatactgct cg 22<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>16acaggcatcg atgctgtc 18<210>17<211>21<212>DNA<213>Kluyveromyces thermotolerans<400>17ctacttggag ccactatcga c 21
<210>18<211>19<212>DNA<213>Kluyveromyces thermotolerans<400>18gtgatgtcgg cgatatagg 19<210>19<211>21<212>DNA<213>Kluyveromyces thermotolerans<400>19gatctcctgc taagctcttg c 21<210>20<211>20<212>DNA<213>Kluyveromyces thermotolerans<400>20gcagttttgg atattcatgc20<210>21<211>972<212>DNA<213>Kluyveromyces thermotolerans
<220>
<221>CDS<222>(1)..(972)<223>
<400>21atg ttc caa gat aca aag tct caa gca gta aga act gat gcc aaa aca48Met Phe Gln Asp Thr Lys Ser Gln Ala Val Arg Thr Asp Ala Lys Thr1 5 10 15gta aaa gtt gtg gta gtg gga gtg gga agt gtt ggg tct gcc aca gcg96Val Lys Val Val Val Val Gly Val Gly Ser Val Gly Ser Ala Thr Ala20 25 30tat acg ttg ctt ctc agc ggc atc gtt tcc gag att gtc ctt atc gac144Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Ser Glu Ile Val Leu Ile Asp35 40 45gtg aac aaa gac aaa gca gag ggt gaa agc atg gac tta aac cac gca192Val Asn Lys Asp Lys Ala Glu Gly Glu Ser Met Asp Leu Asn His Ala50 55 60gca cct tca aat aca agg tct cga gcg ggt gat tat cct gac tgc gct240Ala Pro Ser Asn Thr Arg Ser Arg Ala Gly Asp Tyr Pro Asp Cys Ala65 70 75 80ggc gcg gcc att gtt att gtc aca tgt ggg att aac caa aaa aat gga288Gly Ala Ala Ile Val Ile Val Thr Cys Gly Ile Asn Gln Lys Asn Gly85 90 95caa aca agg atg gat ctt gct gca aaa aat gcc aac att atg ctg gaa336Gln Thr Arg Met Asp Leu Ala Ala Lys Asn Ala Asn Ile Met Leu Glu100 105 110atc atc ccc aat gtt gcc aaa tat gct cct gat acc atc ctg ctt att384Ile Ile Pro Asn Val Ala Lys Tyr Ala Pro Asp Thr Ile Leu Leu Ile115 120 125gcc acg aat cct gtc gat gtt ttg acc tat att agc tat aag gcg tca432Ala Thr Asn Pro Val Asp Val Leu Thr Tyr Ile Ser Tyr Lys Ala Ser130 135 140ggg ttt cca cta agc aga gtt atc ggc tca ggt aca gtt ctg gat act480Gly Phe Pro Leu Ser Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Thr145 150 155 160gct cgt ttt aaa tac atc ctc gga gag cac ttc aag atc tca tcg gac528Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Leu Gly Glu His Phe Lys Ile Ser Ser Asp165 170 175agc atc gat gcc tgt gta att gga gaa cat ggt gat tcg ggt gtg cct576Ser Ile Asp Ala Cys Val Ile Gly Glu His Gly Asp Ser Gly Val Pro
180185 190gtc tgg tct ctt acc aac atc gac ggc atg aag ctc cgg gat tac tgc624Val Trp Ser Leu Thr Asn Ile Asp Gly Met Lys Leu Arg Asp Tyr Cys195 200 205gaa aaa gcc aac cac ata ttt gat cag aat gcg ttc cat aga atc ttt672Glu Lys Ala Asn His Ile Phe Asp Gln Asn Ala Phe His Arg Ile Phe210 215 220gag caa acg cga gac gct gct tac gat atc atc aag cgc aaa ggc tat720Glu Gln Thr Arg Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Ile Lys Arg Lys Gly Tyr225 230 235 240act tca tat gga atc gca gcg gga tta ctt cgc ata gta aag gcg att768Thr Ser Tyr Gly Ile Ala Ala Gly Leu Leu Arg Ile Val Lys Ala Ile245 250 255tta gag gat aca gga tcc aca ctt aca gtt tca acc gtt ggt gat tat816Leu Glu Asp Thr Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Thr Val Gly Asp Tyr260 265 270ttt ggg gtt gaa caa att gct ata agc gtc cct acc aaa ctc aat aaa864Phe Gly Val Glu Gln Ile Ala Ile Ser Val Pro Thr Lys Leu Asn Lys275 280 285agt ggg gct cat caa gtg gct gaa ctt tca ctc gat gag aag gaa ata912Ser Gly Ala His Gln Val Ala Glu Leu Ser Leu Asp Glu Lys Glu Ile290 295 300gaa ttg atg gaa aaa tca gct agt cag atc aaa tca gtg att gag cat960Glu Leu Met Glu Lys Ser Ala Ser Gln Ile Lys Ser Val Ile Glu His305 310 315 320ctg gag atc aat972Leu Glu Ile Asn<210>22<211>324<212>PRT<213>Kluyveromyces thermotolerans<400>22Met Phe Gln Asp Thr Lys Ser Gln Ala Val Arg Thr Asp Ala Lys Thr1 5 10 15Val Lys Val Val Val Val Gly Val Gly Ser Val Gly Ser Ala Thr Ala
20 25 30Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Ser Glu Ile Val Leu Ile Asp35 40 45Val Asn Lys Asp Lys Ala Glu Gly Glu Ser Met Asp Leu Asn His Ala50 55 60Ala Pro Ser Asn Thr Arg Ser Arg Ala Gly Asp Tyr Pro Asp Cys Ala65 70 75 80Gly Ala Ala Ile Val Ile Val Thr Cys Gly Ile Asn Gln Lys Asn Gly85 90 95Gln Thr Arg Met Asp Leu Ala Ala Lys Asn Ala Asn Ile Met Leu Glu100 105 110Ile Ile Pro Asn Val Ala Lys Tyr Ala Pro Asp Thr Ile Leu Leu Ile115 120 125Ala Thr Asn Pro Val Asp Val Leu Thr Tyr Ile Ser Tyr Lys Ala Ser130 135 140Gly Phe Pro Leu Ser Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Thr145 150 155 160Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Leu Gly Glu His Phe Lys Ile Ser Ser Asp165 170 175Ser Ile Asp Ala Cys Val Ile Gly Glu His Gly Asp Ser Gly Val Pro180 185 190Val Trp Ser Leu Thr Asn Ile Asp Gly Met Lys Leu Arg Asp Tyr Cys195 200 205Glu Lys Ala Asn His Ile Phe Asp Gln Asn Ala Phe His Arg Ile Phe210 215 220Glu Gln Thr Arg Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Ile Lys Arg Lys Gly Tyr225 230 235 240Thr Ser Tyr Gly Ile Ala Ala Gly Leu Leu Arg Ile Val Lys Ala Ile245 250 255
Leu Glu Asp Thr Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Thr Val Gly Asp Tyr260 265 270Phe Gly Val Glu Gln Ile Ala Ile Ser Val Pro Thr Lys Leu Asn Lys275 280 285Ser Gly Ala His Gln Val Ala Glu Leu Ser Leu Asp Glu Lys Glu Ile290 295 300Glu Leu Met Glu Lys Ser Ala Ser Gln Ile Lys Ser Val Ile Glu His305 310 315 320Leu Glu Ile Asn<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并擴(kuò)增引物<400>23gtyggtgchg gtgchgthgg20<210>24<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并擴(kuò)增引物<400>24swrtcdccrt gytcbcc 17<210>25
<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>25atccacaaca gcttacacgt tattgag27<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>26gtttggttgc tggaagtggt gttgatag 28<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>27aacattgaat agcttgctca ggttgtg27<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>28gataataaac gcgttgacat ttcagatg 28<210>29<211>939<212>DNA<213>Torulaspora pretoriensis<220>
<221>CDS<222>(1)..(939)<223>
<400>29atg cat aga tgt gct aaa gtg gcc atc gtc ggt gcc ggc caa gtt gga 48Met His Arg Cys Ala Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Gln Val Gly1 5 10 15tcc aca aca gct tac acg tta tta ttg agt agt ttg gtt gct gaa gtg 96Ser Thr Thr Ala Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Ser Leu Val Ala Glu Val20 25 30gtg ttg ata gat gtc gat aaa aga aag gtc gaa ggc caa ttt atg gat 144Val Leu Ile Asp Val Asp Lys Arg Lys Val Glu Gly Gln Phe Met Asp35 40 45ctg aac cac gcg gct cct tta acg aag gag tca cga ttc agt gct ggg 192Leu Asn His Ala Ala Pro Leu Thr Lys Glu Ser Arg Phe Ser Ala Gly50 55 60gac tat gaa agt tgt gct gat gct gcg gtt gta atc gta acg ggc ggg 240Asp Tyr Glu Ser Cys Ala Asp Ala Ala Val Val Ile Val Thr Gly Gly65 70 75 80gct aat cag aaa cct ggt caa act aga atg gag cta gcc gag agg aac 288Ala Asn Gln Lys Pro Gly Gln Thr Arg Met Glu Leu Ala Glu Arg Asn85 90 95gtt aaa atc atg cag gaa gtg atc cct aag att gtg aaa tac gcc ccc 336Val Lys Ile Met Gln Glu Val Ile Pro Lys Ile Val Lys Tyr Ala Pro100 105 110
aac gca att ttg ctg att gca aca aac cct gtc gat gta ctt acc tat384Asn Ala Ile Leu Leu Ile Ala Thr Asn Pro Val Asp Val Leu Thr Tyr115 120 125gct agt ttg aaa gcg tcg gga ttc cca gca agc cgg gtt att ggt tct432Ala Ser Leu Lys Ala Ser Gly Phe Pro Ala Ser Arg Val Ile Gly Ser130 135 140ggg aca gtt ctc gac tct gct cgt ata cag cac aac ctg agc aag cta480Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Ile Gln His Asn Leu Ser Lys Leu145 150 155 160ttc aat gtt tca tct gaa agt gtc aac gcg ttt att atc ggg gaa cat528Phe Asn Val Ser Ser Glu Ser Val Asn Ala Phe Ile Ile Gly Glu His165 170 175ggt gac tca agt gtg ccc gtc tgg tcg ctt gct gag att gcc ggc atg576Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Leu Ala Glu Ile Ala Gly Met180 185 190aaa gtg gag gat tac tgt agg cag tcc aag aga aag ttt gac ccc agc624Lys Val Glu Asp Tyr Cys Arg Gln Ser Lys Arg Lys Phe Asp Pro Ser195 200 205att ctg acc aaa ata tat gag gag tcg cgt gac geg gca gcc tac atc672Ile Leu Thr Lys Ile Tyr Glu Glu Ser Arg Asp Ala Ala Ala Tyr Ile210 215 220ata gaa cgc aaa ggc tat acc aat ttc ggg att gca gca ggt ttg gct720Ile Glu Arg Lys Gly Tyr Thr Asn Phe Gly Ile Ala Ala Gly Leu Ala225 230 235 240agg ata gtg aga gct att ctg aga gat gaa ggt gcc cta tta act gtg768Arg Ile Val Arg Ala Ile Leu Arg Asp Glu Gly Ala Leu Leu Thr Val245 250 255tct act gta ggt gag cac ttt ggc atg aaa gat gtt tca ttg agt gtt816Ser Thr Val Gly Glu His Phe Gly Met Lys Asp Val Ser Leu Ser Val260 265 270cca act agg gta gac agg agc ggc gct cac cat gtc gtc gac ctt ctg864Pro Thr Arg Val Asp Arg Ser Gly Ala His His Val Val Asp Leu Leu275 280 285cta aac gac aag gag ctg gag caa att aaa aca tct gga gcc aag ata912Leu Asn Asp Lys Glu Leu Glu Gln Ile Lys Thr Ser Gly Ala Lys Ile290 295 300aag tca gcc tgt gat gaa ctt ggc att939Lys Ser Ala Cys Asp Glu Leu Gly Ile305 310<210>30<211>313<212>PRT
<213>Torulaspora pretoriensis<400>30Met His Arg Cys Ala Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Gln Val Gly1 5 10 15Ser Thr Thr Ala Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Ser Leu Val Ala Glu Val20 25 30Val Leu Ile Asp Val Asp Lys Arg Lys Val Glu Gly Gln Phe Met Asp35 40 45Leu Asn His Ala Ala Pro Leu Thr Lys Glu Ser Arg Phe Ser Ala Gly50 55 60Asp Tyr Glu Ser Cys Ala Asp Ala Ala Val Val Ile Val Thr Gly Gly65 70 75 80Ala Asn Gln Lys Pro Gly Gln Thr Arg Met Glu Leu Ala Glu Arg Asn85 90 95Val Lys Ile Met Gln Glu Val Ile Pro Lys Ile Val Lys Tyr Ala Pro100 105 110Asn Ala Ile Leu Leu Ile Ala Thr Asn Pro Val Asp Val Leu Thr Tyr115 120 125Ala Ser Leu Lys Ala Ser Gly Phe Pro Ala Ser Arg Val Ile Gly Ser130 135 140Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Ile Gln His Asn Leu Ser Lys Leu145 150 155 160Phe Asn Val Ser Ser Glu Ser Val Asn Ala Phe Ile Ile Gly Glu His165 170 175Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Leu Ala Glu Ile Ala Gly Met180 185 190Lys Val Glu Asp Tyr Cys Arg Gln Ser Lys Arg Lys Phe Asp Pro Ser195 200 205
Ile Leu Thr Lys Ile Tyr Glu Glu Ser Arg Asp Ala Ala Ala Tyr Ile210 215 220Ile Glu Arg Lys Gly Tyr Thr Asn Phe Gly Ile Ala Ala Gly Leu Ala225 230 235 240Arg Ile Val Arg Ala Ile Leu Arg Asp Glu Gly Ala Leu Leu Thr Val245 250 255Ser Thr Val Gly Glu His Phe Gly Met Lys Asp Val Ser Leu Ser Val260 265 270Pro Thr Arg Val Asp Arg Ser Gly Ala His His Val Val Asp Leu Leu275 280 285Leu Asn Asp Lys Glu Leu Glu Gln Ile Lys Thr Ser Gly Ala Lys Ile290 295 300Lys Ser Ala Cys Asp Glu Leu Gly Ile305 310<210>31<211>21<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)<400>31cctgagtcca cgtcattatt c 21<210>32<211>22<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)<400>32tgaagctatt tattcttgtt ac 22
<210>33<211>27<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)<400>33gctctagatg aaaacacaat ttacacc27<210>34<211>28<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)<400>34atggatcctt acacaaaagc tctgtcgc 28<210>35<211>26<212>DNA<213>米根霉(Rhizopus oryzae)<400>35ctttattttt ctttacaata taattc 26<210>36<211>19<212>DNA<213>米根霉(Rhizopus oryzae)<400>36actagcagtg caaaacatg 19<210>37
<211>29<212>DNA<213>米根霉(Rhizopus oryzae)<400>37gctctagatg gtattacact caaaggtcg 29<210>38<211>30<212>DNA<213>米根霉(Rhizopus oryzae)<400>38gctctagatc aacagctact tttagaaaag 30<210>39<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆位點(diǎn)序列<400>39aaatctagat gagccatatt caacggga 28<210>40<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆位點(diǎn)序列<400>40
ccggatcctt agaaaaactc atcgagcat 29<210>41<211>36<212>DNA<213>Kluyveromyces thermotolerans<400>41gctctagaat tatgttccaa gatacaaagt ctcaag 36<210>42<211>34<212>DNA<213>Kluyveromyces thermotolerans<400>42ccggaattea tcctcaattg atctccagat gctc34<210>43<211>2229<212>DNA<213>Kluyveromyces thermotolerans<400>43gcggccgcgg atcgctcttc cgctatcgat taattttttt ttctttcctc tttttattaa60ccttaatttt tattttagat tcctgacctt caactcaaga cgcacagata ttataacatc120tgcacaatag gcatttgcaa gaattactcg tgagtaagga aagagtgagg aactatcgca180tacctgcatt taaagatgcc gatttgggcg cgaatccttt attttggctt caccctcata240ctattatcag ggccagaaaa aggaagtgtt tccctccttc ttgaattgat gttaccctca300taaagcacgt ggcctcttat cgagaaagaa attaccgtcg ctcgtgattt gtttgcaaaa360agaacaaaac tgaaaaaacc cagacacgct cgacttcctg tcttcctatt gattgcagct420
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<400>47acttggccat ggtgatagtt attcttctgc aattga 36<210>48<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>48tgtcatcact gctccatctt20<210>49<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>49ttaagccttg gcaacatatt20<210>50<211>37<212>DNA<213>白色念珠菌(Candida albicans)<400>50gcgatctcga ggtcctagaa tatgtatact aatttgc 37<210>51<211>39<212>DNA<213>白色念珠菌(Candida albicans)<400>51cgcgaattcc catggttagt ttttgttgga aagagcaac 39
<210>52<211>32<212>DNA<213>Candida sonorensis<400>52tggactagta aaccaacagg gattgcctta gt 32<210>53<211>33<212>DNA<213>Candida sonorensis<400>53ctagtctaga gatcattacg ccagcatcct agg 33<210>54<211>44<212>DNA<213>Candida sonorensis<400>54ccggaattcg atatctgggc wggkaatgcc aaygarttra atgc 44<210>55<211>44<212>DNA<213>Candida sonorensis<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)
<223>不編碼氨基酸的引物<220>
<221>misc_feature<222>(33)..(33)<223>不編碼氨基酸的引物<400>55cgcggattca ggcctcagta ngaraawgaa ccngtrttra artc 44<210>56<211>10<212>PRT<213>Candida sonorensis<400>56Trp Ala Gly Asn Ala Asn Glu Leu Asn Ala1 5 10<210>57<211>10<212>PRT<213>Candida sonorensis<400>57Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser1 5 10<210>58<211>18<212>DNA<213>Candida sonorensis
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<400>62gcgatctcga gaaaatgtta ttataacact acac34<210>63<211>75<212>DNA<213>Candida sonorensis<400>63tggactagta catgcatgcg gtgagaaagt agaaagcaaa cattttgttt gatttgtttg60ttttgttttt gtttg 75<210>64<211>36<212>DNA<213>Candida sonorensis<400>64gcgatctcga gaaagaaacg acccatccaa gtgatg 36<210>65<211>35<212>DNA<213>Candida sonorensis<400>65acttggccat ggtatatagt cttttctatt attag 3權(quán)利要求
1.一種分離的核酸，它編碼具有Seq.ID No.30所示的氨基酸序列的酵母乳酸脫氫酶蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸，它編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白且在高度嚴(yán)格條件下與Seq.ID No.29所示的核酸探針雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸，其中在高度嚴(yán)格雜交條件下洗滌后檢測雜交。
4.一種重組表達(dá)構(gòu)建體，它含有具有根據(jù)權(quán)利要求1-3任一的編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白的核苷酸序列的核酸，其中該核酸在酵母細(xì)胞中表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的重組表達(dá)構(gòu)建體，還含有與編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白的核酸可操作地連接的酵母啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的重組表達(dá)構(gòu)建體，還含有與編碼酵母乳酸脫氫酶蛋白的核酸可操作地連接的酵母轉(zhuǎn)錄終止子元件。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的重組表達(dá)構(gòu)建體，還含有來自酵母2-micron環(huán)狀質(zhì)粒的酵母復(fù)制元件。
8.用權(quán)利要求4的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，其中該轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)酵母乳酸脫氫酶蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的酵母細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞是來自糖酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、絲孢酵母屬、Yamadazyma屬、有孢圓酵母屬或畢赤酵母屬的酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的酵母細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞表達(dá)crabtree-陰性表型。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的酵母細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞是選自C.sonorensis和馬克斯克魯維酵母組成的組中的酵母種類。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的酵母細(xì)胞，其中該酵母細(xì)胞產(chǎn)生的選自由丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶，和乙酰-CoA合成酶組成的組中的糖酵解酶的量減少。
13.一種生產(chǎn)乳酸的方法，包括在含有糖類的營養(yǎng)培養(yǎng)基中在至少50％的糖類被酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化成乳酸的條件下發(fā)酵根據(jù)權(quán)利要求8的酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中該酵母細(xì)胞在從大約35℃到大約55℃的溫度生長。
15.權(quán)利要求13的方法，其中該營養(yǎng)培養(yǎng)基具有不超過大約pH 5.0的pH。
16.權(quán)利要求13的方法，其中酵母在基本上厭氧的條件下生長。
17.權(quán)利要求13的方法，其中該酵母細(xì)胞是crabtree-陰性酵母細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中該酵母細(xì)胞是馬克斯克魯維酵母或C.sonorensis。
19.權(quán)利要求13的方法，其中該酵母細(xì)胞產(chǎn)生的選自由丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶，和乙酰-CoA合成酶組成的組中的糖酵解酶的量減少。
20.權(quán)利要求13的方法，其中該糖類是葡萄糖、木糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、果糖、麥芽糖或來蘇糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)乳酸鹽的生物催化劑，它是含有重組表達(dá)載體的重組酵母細(xì)胞，該載體編碼異源性乳酸脫氫酶基因。
文檔編號C12N15/63GK1955299SQ20061000857
公開日2007年5月2日 申請日期2001年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月22日
發(fā)明者文尼特·拉杰加希亞, 默加·潘蒂拉, 勞拉·勞霍南, 馬加·伊爾曼, 卡里·科伊沃蘭塔 申請人:內(nèi)特爾沃克公司