專(zhuān)利名稱(chēng)：差向化生物轉(zhuǎn)化7－差向紫杉烷形成紫杉烷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到用微生物差向化轉(zhuǎn)化7-差向紫杉烷形成紫杉烷的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇是從紅豆杉植物中提取的價(jià)值昂貴的抗癌藥物，生產(chǎn)原料嚴(yán)重不足，導(dǎo)致紫杉醇價(jià)格高昂。通過(guò)生物轉(zhuǎn)化將目前還沒(méi)有藥用價(jià)值、大量存在于紅豆杉枝葉中的7-差向化紫杉烷類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成紫杉醇及能用于半合成紫杉醇的前體，可以增加紫杉醇的得率，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。差向化紫杉烷有多種化合物，含量較多的有7-差向紫杉醇、10-脫乙酰-7-差向紫杉醇、7-差向三尖杉寧堿、10-脫乙酰-7-差向三尖杉寧、10-脫乙酰-7-差向巴卡亭III等。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上的共同特點(diǎn)都是紫杉烷母核上的7位羥基和具有藥用價(jià)值的紫杉烷母核上的7位羥基相比，發(fā)生了差向化變化，不能用于合成以紫杉烷母核為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的抗癌藥物，如紫杉醇或多烯紫杉醇。
生物轉(zhuǎn)化是利用酶或有機(jī)體(細(xì)胞、細(xì)胞器)作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過(guò)程，最常用的有機(jī)體是微生物。生物轉(zhuǎn)化具有高效率、高選擇性、環(huán)境友好等多種優(yōu)點(diǎn)。用生物催化技術(shù)來(lái)生產(chǎn)藥物組分已成為當(dāng)今生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)課題。象紫杉醇這樣價(jià)值昂貴、多手性中心、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、遇熱又容易破壞的藥物，正是生物轉(zhuǎn)化的用武之地。
施貴寶(BMS)公司是最早開(kāi)發(fā)紫杉醇的企業(yè)，在紫杉烷的微生物轉(zhuǎn)化方面也做了深入的研究，獲得了兩株類(lèi)諾卡氏菌(Nocardioides)，具有能脫去紫杉烷C-13位側(cè)鏈的紫杉烷酶和去掉紫杉烷C-10位乙酰基的脫乙酰酶，并達(dá)到了5000L的規(guī)模，C-10位的脫乙酰酶還能將脫乙酰紫杉醇可逆的合成紫杉醇，不需要對(duì)C-7位羥基進(jìn)行保護(hù)(US Patent 5523219)。先后使用紫杉烷酶和紫杉烷脫乙酰酶能夠?qū)⒃S多紫杉烷轉(zhuǎn)化成10-去乙酰巴卡亭III，然后用于紫杉醇的半合成。施貴寶公司還發(fā)現(xiàn)了一株莫拉氏菌(Morexella sp)能產(chǎn)生7-β-木糖甙酶，該酶能將10-脫乙酰-7木糖紫杉烷中的木糖基酶解掉，從而獲得不含木糖基的紫杉烷，經(jīng)8小時(shí)的轉(zhuǎn)化，10-脫乙酰-7木糖紫杉烷幾乎可以100％的被轉(zhuǎn)化(US Patent5700669；Ramesh N.Patel，Annu.Rev.Microbiol，1998，98361-394；Aleksey Zaks，current opinion in Chemical Biology，2001，5130-136)。張君增等從云南紅豆杉樹(shù)皮內(nèi)分離的微生物中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)菌株具有轉(zhuǎn)化天然紫杉烷類(lèi)化合物的能力，其中Microsphaeropsis onychiun和毛霉(Mucor sp)都可水解10-去乙酰-7-差向紫杉醇的13位側(cè)鏈并可使7位羥基差向異構(gòu)化(Zhang JZ et al，J Nat Prod，1998，61(4)497-500)，該轉(zhuǎn)化反應(yīng)獲得了三個(gè)產(chǎn)物，其中一個(gè)產(chǎn)物發(fā)生了差向化轉(zhuǎn)化，但該反應(yīng)在差向化轉(zhuǎn)化的同時(shí)，脫去了10-位側(cè)鏈，10-脫乙酰-7差向紫杉醇變成了10-脫乙酰巴卡亭，而不是其對(duì)映異構(gòu)體10-脫乙酰紫杉醇。由于同時(shí)形成了3個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物，目標(biāo)產(chǎn)物收率低，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)8天，該轉(zhuǎn)化反應(yīng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值不大。
化學(xué)方法尚未發(fā)現(xiàn)能有效的完成這種差向化轉(zhuǎn)化反應(yīng)。雖然有化學(xué)轉(zhuǎn)化7-差向紫杉烷方法的報(bào)道，但這些報(bào)道中的轉(zhuǎn)化反應(yīng)形成了多個(gè)產(chǎn)物或結(jié)果不明確，所用試劑價(jià)值昂貴(匡云艷等，中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2005，64(2)94-96；張志強(qiáng)等，生物工程學(xué)報(bào)，2000，16(3)378-382)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值不大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用微生物技術(shù)能有效的將7-差向化紫杉烷專(zhuān)一性的轉(zhuǎn)變成其對(duì)映異構(gòu)體，并不會(huì)發(fā)生其它結(jié)構(gòu)上的變化的差向化生物轉(zhuǎn)化形成紫杉烷的方法。
本發(fā)明所述的差向化生物轉(zhuǎn)化形成紫杉烷的方法由以下步驟組成一、將含量大于1％的7-差向紫杉烷類(lèi)化合物完全溶解在能與水無(wú)限混溶的有機(jī)溶劑中；二、將步驟一所得溶液加入到已經(jīng)培養(yǎng)好的微生物培養(yǎng)物或從這些微生物中提取的酶中，或?qū)⑻崛〉拿腹潭ɑ螅偌尤氩襟E一所得溶液，轉(zhuǎn)化3-100個(gè)小時(shí)；三、用常規(guī)方法在步驟二的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中提取紫杉烷。
上述用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的7-差向紫杉烷化合物，純度可以在1％到99.9％之間。所述的微生物如毛霉屬(Mucor sp)，根霉屬(Rhizopus.sp)、桿菌屬(Bacillus.Sp)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella sp)、鏈霉菌屬(Streptomyces.sp)等，具體如枯草桿菌(Bacillus subtilis)，刺囊毛霉(Mucor spinosus)。這些微生物均為已知菌種，其培養(yǎng)方法也是常規(guī)方法。所加入的底物在微生物培養(yǎng)液中的濃度為體積重量比(W/V)萬(wàn)分之一至百分之一。當(dāng)用微生物所提取的酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，所加入的底物在轉(zhuǎn)化酶中的濃度為萬(wàn)分之一至百分之十。所加入的有機(jī)溶劑能與水無(wú)限混溶，如甲醇、乙醇、丙酮、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亞砜(DMSO)等，其加入的量以能完全溶解為度，可以是10-10000重量倍。轉(zhuǎn)化溫度在所采用的微生物的生長(zhǎng)溫度范圍內(nèi)；采用轉(zhuǎn)化酶時(shí)，轉(zhuǎn)化溫度在30-100℃之間。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是將沒(méi)有藥用價(jià)值的7-差向紫杉烷轉(zhuǎn)化成其具有藥用價(jià)值的對(duì)映異構(gòu)體，從而達(dá)到節(jié)約紅豆杉資源的目的。采用本發(fā)明獲得的產(chǎn)生紫杉烷差向化酶的微生物菌株，能有效的將7-差向化紫杉烷專(zhuān)一性的轉(zhuǎn)變成其對(duì)映異構(gòu)體，并不會(huì)發(fā)生其它結(jié)構(gòu)上的變化。例如，若以10-脫乙酰-7-差向紫杉醇為底物，只將10-脫乙酰-7-差向紫杉醇轉(zhuǎn)變成對(duì)映異構(gòu)體10-脫乙酰紫杉醇，而不是變成其它的化合物。
具體實(shí)施方案實(shí)施例1將黃豆粉培養(yǎng)基1000ml平均分裝在10個(gè)500ml的三角瓶中，在28℃160rpm培養(yǎng)3天后，將7-差向紫杉醇0.1克，溶解于100ml的二甲基甲酰胺DMF中。每個(gè)三角瓶中加入含有底物的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶劑10ml，在搖床上28℃160rpm轉(zhuǎn)化3天后，合并轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物，發(fā)酵液離心分離，得到渣和發(fā)酵清液，將發(fā)酵清液用200克Amberlite XAD-16大孔樹(shù)脂吸附，用4倍體積的10-30％的甲醇∶水沖洗大孔樹(shù)脂，再用5倍體積的30％-100％甲醇溶液沖洗大孔樹(shù)脂，將該段沖洗液減壓濃縮得褐色混合物。濕渣約20克，分三次加入100ml的丙酮浸提三次，減壓濃縮，得褐色混合物。合并二種濃縮物，重量約10克，含有轉(zhuǎn)化形成的紫杉醇75mg，轉(zhuǎn)化率為75％。
實(shí)施例2將1000ml培養(yǎng)好的枯草桿菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基離心，獲得濕菌體5克，將菌體用海藻酸鈉包埋后，裝成固定化細(xì)胞柱。用二甲基亞砜(DMSO)100ml溶解1克10-脫乙酰-7-差向紫杉醇，再加入水900ml，葡萄糖10克，從柱子頂端加入樣品溶液，控制流速為每分鐘4滴，前10個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)化液重新加入到柱子的頂端。收集轉(zhuǎn)化液，減壓濃縮揮發(fā)掉溶劑，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物5克，含有10-脫乙酰紫杉醇0.41克，轉(zhuǎn)化率為41％。
實(shí)施例3將培養(yǎng)好的3000ml刺囊毛霉，經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎后，20％-500％重量倍的硫酸銨沉淀，獲得轉(zhuǎn)化酶25克，將獲得的轉(zhuǎn)化酶用大孔樹(shù)脂吸附后，裝柱。將1克10-脫乙酰-7差向紫杉醇溶解于100ml甲醇中，再加入900ml水，將含有底物的溶劑從固定化柱子頂端加入，從下端流出，流速控制為每分鐘2滴。將流出的溶液減壓濃縮后得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和未轉(zhuǎn)化底物的混合物2克，含10-脫乙酰紫杉醇0.35克，經(jīng)乙酰化后即成為紫杉醇。未經(jīng)轉(zhuǎn)化的底物可以重新配制溶液繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例4培養(yǎng)鏈霉菌發(fā)酵液5000ml，將含有10％的10-脫乙酰-7-差向紫杉醇的紅豆杉浸膏2克溶解于200ml甲醇溶劑中，溶解后的浸膏溶液直接加入到培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)鏈霉菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，5天后，分離固體成分和發(fā)酵清液，發(fā)酵清液用大孔樹(shù)脂吸附后用4倍體積的10-30％的甲醇∶水沖洗大孔樹(shù)脂，再用5倍體積的30％-100％甲溶液沖洗大孔樹(shù)脂，將該段沖洗液減壓濃縮得褐色混合物。固體成分用丙酮萃取。減壓濃縮甲醇洗脫液和丙酮萃取液，合并二者的提出物38克，含有10-脫乙酰紫杉醇1.4克。轉(zhuǎn)化率為70％。
權(quán)利要求
1.一種差向化生物轉(zhuǎn)化7-差向化紫杉烷形成紫杉烷的方法，其特征在于由以下步驟組成一、將含量大于1％的7-差向紫杉烷類(lèi)化合物完全溶解在能與水無(wú)限混溶的有機(jī)溶劑中；二、將步驟一所得溶液加入到已經(jīng)培養(yǎng)好的微生物培養(yǎng)物或從這些微生物中提取的酶中，或?qū)⑻崛〉拿腹潭ɑ?，再加入步驟一所得溶液，轉(zhuǎn)化3-100個(gè)小時(shí)；三、用常規(guī)方法在步驟二的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中提取紫杉烷。
2.如權(quán)利要求1所述的差向化生物轉(zhuǎn)化7-差向紫杉烷形成紫杉烷的方法，其特征在于所述的能與水無(wú)限混溶的有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、丙酮、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亞砜中的一種。
3.如權(quán)利要求1所述的差向化生物轉(zhuǎn)化7-差向紫杉烷形成紫杉烷的方法，其特征在于所述的微生物是毛霉屬，根霉屬、桿菌屬、小克銀漢霉屬、鏈霉菌屬中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述的差向化生物轉(zhuǎn)化形成紫杉烷的方法，其特征在于所述的7-差向紫杉烷化合物在微生物培養(yǎng)液中的濃度為體積重量比萬(wàn)分之一至百分之一。
5.如權(quán)利要求1所述的差向化生物轉(zhuǎn)化形成紫杉烷的方法，其特征在于所述的7-差向紫杉烷化合物在轉(zhuǎn)化酶中的濃度為萬(wàn)分之一至百分之十。
全文摘要
本發(fā)明涉及到用微生物差向化轉(zhuǎn)化7－差向紫杉烷形成紫杉烷的方法。本發(fā)明所述方法由以下步驟組成1.將含量大于1％的7－差向紫杉烷類(lèi)化合物完全溶解在能與水無(wú)限混溶的有機(jī)溶劑中；2.將步驟一所得溶液加入到已經(jīng)培養(yǎng)好的微生物培養(yǎng)物或從這些微生物中提取的酶中，或?qū)⑻崛〉拿腹潭ɑ?，再加入步驟一所得溶液，轉(zhuǎn)化3－100個(gè)小時(shí)；3.用常規(guī)方法在步驟二的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中提取紫杉烷。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是將沒(méi)有藥用價(jià)值的7－差向紫杉烷轉(zhuǎn)化成其具有藥用價(jià)值的對(duì)映異構(gòu)體，從而達(dá)到節(jié)約紅豆杉資源的目的。
文檔編號(hào)C12P17/02GK101078022SQ20061001091
公開(kāi)日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2006年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月23日
發(fā)明者王興紅, 李松 申請(qǐng)人:云南大學(xué)