專利名稱：利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片，特別是微流體芯片領(lǐng)域，是一種利用介電電泳輔助細(xì)胞定位，借以提高細(xì)胞電穿孔效率的方法。本發(fā)明利用細(xì)胞介電電泳的手段來提高傳統(tǒng)微流體生物芯片上原位細(xì)胞電穿孔的效率，以期達(dá)到改善由于細(xì)胞不能被定位在有效的電場強度的區(qū)域而造成電穿孔效率低下這一狀況的目的。由于該方法采用利用控制電場來操縱細(xì)胞的方法，因而，非常有利于在微流體生物芯片上進(jìn)行微系統(tǒng)集成，可以實現(xiàn)全自動化的操作。
背景技術(shù)：
在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)正在受到人們越來越多的關(guān)注，把外源基因、蛋白質(zhì)、藥物等導(dǎo)入細(xì)胞(即轉(zhuǎn)染)在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中有著非常重要和廣泛的應(yīng)用，其范圍涵蓋了從研究細(xì)胞的基因調(diào)控，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)以及基因治療。因而尋找一種安全、有效、毒性小而又效率高的轉(zhuǎn)染手段成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域人們非常關(guān)注的課題。
病毒能夠侵染細(xì)胞，因而成為進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一種載體，目前，人們已經(jīng)對多種病毒進(jìn)行處理，使其攜帶外源基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，取得了很好的效果(Kim YC et a1.Oncogene.20，16-23)。不過，利用病毒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染也存在著諸如存在感染和免疫反應(yīng)的風(fēng)險，而且病毒載體的構(gòu)建和大規(guī)模生產(chǎn)也是非常困難的。
由于利用病毒作為轉(zhuǎn)染載體存在其先天的缺陷，人們開發(fā)了一系列化學(xué)轉(zhuǎn)染的方法，利用非病毒系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，例如采用陽離子脂質(zhì)的方法(Felgner et a1.Proc Natl Acad Sci，84，7413-7417)，但是這種轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率一般比較低下，通常低于病毒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率，同時也存在著具有化學(xué)毒性、不利于在微流體生物芯片系統(tǒng)中集成等問題，因而發(fā)展收到很大限制。
利用電場進(jìn)行轉(zhuǎn)染(即電穿孔)是人們提出的又一個解決方案(Leikin et al.Biol.Membr.，3，944-951)，這種方法通過施加電場(對于哺乳動物細(xì)胞而言，通常是1-4KV/cm)，使得細(xì)胞膜內(nèi)外產(chǎn)生一定的電勢差，導(dǎo)致細(xì)胞膜瞬間穿孔，外源的核酸、蛋白質(zhì)以及平時不能進(jìn)入細(xì)胞的藥物分子便可以進(jìn)入細(xì)胞，完成轉(zhuǎn)染。電穿孔相對與其余常規(guī)轉(zhuǎn)染方式具有如下優(yōu)勢相對于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方式，轉(zhuǎn)染效率要高。
這是一種純粹生物物理手段，沒有化學(xué)藥品污染或病毒感染的危險；免去穿孔后洗滌、清洗程序，這一點使得這種方法非常有利于與微流體芯片進(jìn)行系統(tǒng)繼承；操作方便、容易重復(fù)、過程容易控制，并可以用于各種不同細(xì)胞，既包括懸浮生長細(xì)胞，也包括貼壁細(xì)胞。
但是，在電穿孔過程中，由于細(xì)胞不能全部集中于具有足夠電場強度的區(qū)域，電穿孔往往難于控制，穿孔效率不容易提高。為了使得多數(shù)細(xì)胞位于電穿孔的有效區(qū)域，往往需要增加穿孔電壓，以擴(kuò)大有效區(qū)域的范圍，使得更多的細(xì)胞被電穿孔。而增加電壓又會使得電場強度比較強的區(qū)域的細(xì)胞由于過度穿孔而死亡，最終使得電穿孔效率難以提高，因而如何使得細(xì)胞能夠有效的集中在電穿孔的有效區(qū)域，然后進(jìn)行電穿孔，成為提高電穿孔效率的重要課題。
介電電泳是一種利用電場對微觀粒子，如細(xì)胞進(jìn)行操縱的方法，當(dāng)細(xì)胞等微觀粒子在溶液中受到由于施加了非均勻交流電場而產(chǎn)生的介電電泳力的作用時，會發(fā)生定向運動，利用介電電泳可以使得細(xì)胞運動并定位在可以產(chǎn)生電穿孔的有效穿孔區(qū)域。
介電電泳力是指在幅值不均勻分布的交流電場作用下微粒上產(chǎn)生的力。當(dāng)一個微粒(如細(xì)胞)受到不均勻電場作用時，由于電場和微粒上感生電偶極矩的相互作用，微粒就受到一個介電電泳力的作用。
介電電泳力的表達(dá)式為 其中r是微粒半徑，εm是微粒懸浮介質(zhì)的介電常數(shù)，Erms是電場均方根值，因子fCM=(ϵp*-ϵm*)/(ϵp*+2ϵm*)]]>是介電極化因子(Clausius-Mossotti因子)。復(fù)式介電常數(shù)定義為ϵx*=ϵx-jσx/(2πf)]]>。介電極化因子與外加電場的頻率f、電導(dǎo)率σx、微粒介電常數(shù)(記為p)、微粒懸浮介質(zhì)的介電常數(shù)(記為m)有關(guān)。
從公式(1)可以看出，介電電泳力一般由兩個分量構(gòu)成即常規(guī)介電電泳(cDEP)力和行波介電電泳(twDEP)力。常規(guī)介電電泳力和與場強梯度(ΔErms2)相互作用的電場感生極化的同步(in-phase)分量有關(guān)，該感生極化項Re(fCM)，即因子fCM的實部，是常規(guī)介電電泳的極化因子。行波介電電泳力與和電場相位梯度(Δx，ΔyΔz)發(fā)生交互作用的電場感生極化的異步(out-of-phase)分量有關(guān)，該感生極化項Im(fCM)，即因子fCM的虛部，是行波介電電泳的極化因子。值得指出的是，若一個電場其場強分量的相位是不均勻分布的，則該電場是一個行波電場。電場沿著隨位置不同而相位值遞減的方向延伸。理想行進(jìn)電場的相位分布沿電場行進(jìn)方向是位置的線性函數(shù)。這樣，常規(guī)介電電泳力是指因交流電場場強不均勻分布而在微粒上產(chǎn)生的力。
半徑為r、受交變電場不均勻分布場強作用的微粒所受的常規(guī)介電電泳力 為
FμcDEP=2πϵmr3xDEP▿Erms2---(2)]]>其中Erms是場強的均方根值，εm是介質(zhì)的介電常數(shù)。表示常規(guī)介電電泳力的公式(2)與上述的介電電泳力的一般表達(dá)式一致。因xcDEP是微粒的常規(guī)介電電泳極化因子，可以表示為xcDEP=Re(ϵp*-ϵm*ϵp*+2ϵm*)---(3)]]>這里Re是復(fù)數(shù)的實部，符號ϵx*=ϵx-jσx/(2πf)]]>是復(fù)式介電常數(shù)。參數(shù)εp、σp分別是微粒的有效介電常數(shù)和電導(dǎo)率(可能與外加頻率有關(guān))。例如，典型的生物細(xì)胞將具有與頻率相關(guān)的電導(dǎo)率和介電常數(shù)(至少部分上是由于細(xì)胞質(zhì)膜極化引發(fā)的)。
當(dāng)一個微粒的常規(guī)介電電泳極化因子為正(xcDEP＞0)時，微粒受常規(guī)介電電泳力作用向強場區(qū)域運動，這稱為正向常規(guī)介電電泳。導(dǎo)致微粒作正向常規(guī)介電電泳運動的常規(guī)介電電泳力稱為正向常規(guī)介電電泳力。當(dāng)一個微粒的常規(guī)介電電泳極化因子為負(fù)(xcDEP＜0)時，微粒受常規(guī)介電電泳力作用遠(yuǎn)離強場區(qū)域向弱場區(qū)域運動，這稱為負(fù)向常規(guī)介電電泳。導(dǎo)致微粒作負(fù)向常規(guī)介電電泳運動的常規(guī)介電電泳力稱為負(fù)向的常規(guī)介電電泳力。
綜上所述，利用介電電泳對即將做電穿孔的細(xì)胞進(jìn)行操縱，可以使其被集中在能夠進(jìn)行電穿孔的有效區(qū)域內(nèi)，這時，再施加電場進(jìn)行電穿孔操作，可以有效的提高電穿孔的穿孔效率。
常規(guī)電穿孔沒有用介電電泳進(jìn)行輔助，使得其穿孔效率比較低下，當(dāng)利用細(xì)胞的介電性質(zhì)將細(xì)胞定位在能夠產(chǎn)生足夠電場強度以導(dǎo)致細(xì)胞電穿孔的區(qū)域范圍之內(nèi)，再進(jìn)行電穿孔可以有效提高穿孔效率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用介電電泳輔助細(xì)胞定位，借以提高細(xì)胞電穿孔效率的方法。本發(fā)明利用細(xì)胞介電電泳的手段來提高傳統(tǒng)微流體生物芯片上原位細(xì)胞電穿孔的效率，以期達(dá)到改善由于細(xì)胞不能被定位在有效的電場強度的區(qū)域而造成電穿孔效率低下這一狀況的目的。由于該方法采用利用控制電場來操縱細(xì)胞的方法，因而，非常有利于在微流體生物芯片上進(jìn)行微系統(tǒng)集成，可以實現(xiàn)全自動化的操作。
本發(fā)明的特征之一在于在使用該方法的器件上同時存在用于介電電泳和電穿孔的兩種電極，在進(jìn)行電穿孔前，首先在用于介電電泳的電極上施加電信號，使得細(xì)胞在介電電泳力的作用下定位在能夠產(chǎn)生足夠電場強度以導(dǎo)致細(xì)胞電穿孔的區(qū)域范圍之內(nèi)，然后撤銷介電電泳的電極上的電信號，并在用于電穿孔的電極上施加電壓幅值大于介電電泳電壓的電信號，進(jìn)行細(xì)胞電穿孔。之二在于在使用該方法的器件上同時存在用于介電電泳和電穿孔的兩種電極，在進(jìn)行電穿孔前，首先在用于介電電泳的電極上施加電信號，使得細(xì)胞在介電電泳力的作用下定位在能夠產(chǎn)生足夠電場強度以導(dǎo)致細(xì)胞電穿孔的區(qū)域范圍之內(nèi)，然后維持介電電泳電極上的電信號，在介電電泳電場的基礎(chǔ)上借助于電穿孔電極再疊加一個電穿孔電場，使得疊加后的電場的電場強度足以使得細(xì)胞穿孔。
其中，所述的細(xì)胞介電電泳是在溶液中進(jìn)行，該溶液是包含自然培養(yǎng)基或各種其他緩沖溶液體系在內(nèi)的溶液體系。所述細(xì)胞在用介電電泳的方法，使細(xì)胞聚集在預(yù)想的區(qū)域后，在原位培養(yǎng)一段時間后再進(jìn)行電穿孔，或者立即進(jìn)行電穿孔。所述的細(xì)胞介電電泳是負(fù)向常規(guī)介電電泳，或者是正向常規(guī)介電電泳，即在細(xì)胞介電電泳時，或向電場強度最弱的地方聚集，或向電場強度最強的地方聚集。所述的細(xì)胞在介電電泳時，由外界施加交流電壓而導(dǎo)致的非均勻電場，或由導(dǎo)電的電極直接造成，或是由其他絕緣介質(zhì)間接造成。該方法所涉及的器件的電極是包含金屬、或非金屬或他們的組合在內(nèi)的導(dǎo)電體材料。所述的絕緣介質(zhì)的材料是包含玻璃、或硅、或高分子聚合物材料或它們的組合在內(nèi)的生物相容性好的絕緣材料。
由于采用了介電電泳輔助細(xì)胞定位，使得細(xì)胞集中在有效的電穿孔區(qū)域，這種方法可以很大的提高電穿孔的穿孔效率，尤其在微流體生物芯片領(lǐng)域?qū)⒂蟹浅Ｖ匾膽?yīng)用。
圖1，利用介電電泳輔助細(xì)胞定位并進(jìn)行電穿孔的原理圖1、用以實現(xiàn)該發(fā)明的生物芯片器件；2、介電電泳電極；3、電穿孔電極。
具體實施例方式
本發(fā)明的技術(shù)方案是在利用微加工技術(shù)在微流體芯片上加工電極或電極陣列，其電極包含兩組，第一組用于產(chǎn)生介電電泳力，以進(jìn)行細(xì)胞操縱和細(xì)胞定位，第二組用于進(jìn)行細(xì)胞電穿孔。在進(jìn)行細(xì)胞電穿孔之前，首先，將混合好細(xì)胞的培養(yǎng)基或其他緩沖溶液加入微流體芯片，然后在第一組電極上施加一定頻率和幅值的電壓(頻率和幅值取決于細(xì)胞的介電性質(zhì)，隨細(xì)胞種類不同而不同)，促使細(xì)胞集中到設(shè)計好的電穿孔的有效區(qū)域內(nèi)。
這時，有兩個技術(shù)路線可供選擇。第一，是可以直接施加電穿孔電壓，對尚處在懸浮狀態(tài)下的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔操作；第二，是可以讓細(xì)胞在原位生長一段時間，達(dá)到比較好的細(xì)胞生長狀態(tài)，然后再進(jìn)行原位的細(xì)胞電穿孔。兩種技術(shù)路線，可以根據(jù)細(xì)胞種類和具體需要進(jìn)行選擇。
在此所用，“有效的電穿孔區(qū)域”是指電場強度能夠達(dá)到使得細(xì)胞發(fā)生電穿孔的區(qū)域，其包括但不僅限于電穿孔電極區(qū)域。
本發(fā)明中，用于阻抗測量的器件是在玻璃基質(zhì)上用微加工中常用的光刻工藝，刻出電極的圖形，然后用真空蒸鍍工藝將金蒸鍍在玻璃基質(zhì)表面，去處光刻膠后形成器件的電極部分。
權(quán)利要求
1.利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法，該方法的特征在于在使用該方法的器件上同時存在用于介電電泳和電穿孔的兩種電極，在進(jìn)行電穿孔前，首先在用于介電電泳的電極上施加電信號，使得細(xì)胞在介電電泳力的作用下定位在能夠產(chǎn)生足夠電場強度以導(dǎo)致細(xì)胞電穿孔的區(qū)域范圍之內(nèi)，然后撤銷介電電泳的電極上的電信號，并在用于電穿孔的電極上施加電壓幅值大于介電電泳電壓的電信號，進(jìn)行細(xì)胞電穿孔。
2.利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法，該方法的特征在于在使用該方法的器件上同時存在用于介電電泳和電穿孔的兩種電極，在進(jìn)行電穿孔前，首先在用于介電電泳的電極上施加電信號，使得細(xì)胞在介電電泳力的作用下定位在能夠產(chǎn)生足夠電場強度以導(dǎo)致細(xì)胞電穿孔的區(qū)域范圍之內(nèi)，然后維持介電電泳電極上的電信號，在介電電泳電場的基礎(chǔ)上借助于電穿孔電極再疊加一個電穿孔電場，使得疊加后的電場的電場強度足以使得細(xì)胞穿孔。
3.如權(quán)利要求1、2中任何一項所述的利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞介電電泳是在溶液中進(jìn)行，該溶液是包含自然培養(yǎng)基或各種其他緩沖溶液體系在內(nèi)的溶液體系。
4.如權(quán)利要求1、2中任何一項所述的利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法，其特征在于，所述細(xì)胞在用介電電泳的方法，使細(xì)胞聚集在預(yù)想的區(qū)域后，在原位培養(yǎng)一段時間后再進(jìn)行電穿孔，或者立即進(jìn)行電穿孔。
5.如權(quán)利要求1、2中任何一項所述的利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞介電電泳是負(fù)向常規(guī)介電電泳，或者是正向常規(guī)介電電泳，即在細(xì)胞介電電泳時，或向電場強度最弱的地方聚集，或向電場強度最強的地方聚集。
6.如權(quán)利要求1、2中任何一項所述的利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞在介電電泳時，由外界施加交流電壓而導(dǎo)致的非均勻電場，或由導(dǎo)電的電極直接造成，或是由其他絕緣介質(zhì)間接造成。
7.如權(quán)利要求1、2中任何一項所述的利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法，其特征在于，該方法所涉及的器件的電極是包含金屬、或非金屬或他們的組合在內(nèi)的導(dǎo)電體材料。
8.如權(quán)利要求1、2中任何一項所述的利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法，其特征在于，所述的絕緣介質(zhì)的材料是包含玻璃、或硅、或高分子聚合物材料或它們的組合在內(nèi)的生物相容性好的絕緣材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域用的利用介電電泳輔助細(xì)胞定位借以提高電穿孔效率的方法。該方法的特征在于在施加電穿孔電場導(dǎo)致細(xì)胞電穿孔之前，首先利用細(xì)胞的介電性質(zhì)，用介電電泳的方法將細(xì)胞定位在能夠產(chǎn)生足夠電場強度以導(dǎo)致細(xì)胞電穿孔的有效電極區(qū)域，借以提高細(xì)胞電穿孔時的穿孔效率。本發(fā)明是利用細(xì)胞介電電泳的手段來提高傳統(tǒng)微流體生物芯片上原位細(xì)胞電穿孔的效率，以期達(dá)到改善由于細(xì)胞不能被定位在有效的電場強度的區(qū)域而造成電穿孔效率低下這一狀況的目的。由于該方法采用利用控制電場來操縱細(xì)胞的方法，因而，非常有利于在微流體生物芯片上進(jìn)行微系統(tǒng)集成，可以實現(xiàn)全自動化的細(xì)胞操縱和細(xì)胞電穿孔操作。
文檔編號C12N15/87GK1995361SQ20061001111
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者王磊, 郭旻, 程京 申請人:博奧生物有限公司, 清華大學(xué)