專利名稱：正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種新型的可用于植物RNAi研究、沉默目的基因表達(dá)的真核表達(dá)載體“正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體”。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是真核生物體內(nèi)由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)的降解同源RNA的現(xiàn)象。在細(xì)胞中，長(zhǎng)的dsRNA被類似RNA酶III的Dicer酶切割成21～26核苷酸(nucleotide，nt)的干擾性小RNA(small interfering RNA或shortinterfering RNA，siRNA)。隨后，siRNA與蛋白復(fù)合物結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，并解鏈。而有活性的RISC在其中的siRNA反應(yīng)鏈指導(dǎo)下同與其互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致RNA的降解。這是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silence，PTGS)，也稱RNA沉默(RNA silence)。
目前，針對(duì)某個(gè)已知的基因，設(shè)計(jì)可誘導(dǎo)其沉默的siRNA，通過(guò)合適的手段導(dǎo)入細(xì)胞或機(jī)體，使該基因表達(dá)水平下降或完全沉默，從而了解該基因的功能，是RNA干擾技術(shù)在目前最廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，借助操作簡(jiǎn)便的RNA干擾技術(shù)，使得在基因組水平批量地沉默眾多基因，短期內(nèi)對(duì)大量基因的功能進(jìn)行鑒定成為可能。Boutros等針對(duì)果蠅基因組設(shè)計(jì)了19470個(gè)不同的siRNA屏蔽果蠅培養(yǎng)細(xì)胞基因組內(nèi)的基因，鑒定出了438個(gè)與細(xì)胞的生長(zhǎng)變異有關(guān)的基因。Kim等則對(duì)果蠅的胚胎進(jìn)行了基因組范圍內(nèi)的RNA干擾分析后，從5800多個(gè)基因中鑒定出在果蠅心臟形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用的一系列編碼轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞信號(hào)蛋白的基因。這些基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于深入了解果蠅的發(fā)育生物學(xué)將起到極大的促進(jìn)作用。在利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行哺乳動(dòng)物基因功能鑒定方面，目前還沒有規(guī)模性鑒定基因功能的報(bào)道，大多只是對(duì)所研究的某一個(gè)基因利用RNA干擾手段了解其作用。最近Berns等和Paddison等進(jìn)行的RNA干擾文庫(kù)的研究工作大大促進(jìn)了哺乳動(dòng)物中大范圍的基因功能遺傳缺失研究。Berns等針對(duì)7914個(gè)人類基因建立了可表達(dá)23742個(gè)不同siRNA的RNA干擾文庫(kù)，并證實(shí)了該文庫(kù)的有效性；而Paddison等不但建立了可作用于9610個(gè)人類基因的RNA干擾文庫(kù)，同時(shí)還建立了針對(duì)5563個(gè)小鼠基因的dsRNA表達(dá)文庫(kù)。這些RNA干擾庫(kù)的建立將為全面而深入地了解哺乳動(dòng)物的基因功能打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行功能基因組分析的巨大優(yōu)勢(shì)是可快速建立基因與表型之間的直接對(duì)應(yīng)關(guān)系，在較短的時(shí)間內(nèi)明確眾多基因的功能。在動(dòng)物及醫(yī)學(xué)研究中，誘導(dǎo)RNAi的起始物多是目的基因的siRNA，主要通過(guò)化學(xué)手段體外合成或通過(guò)載體體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生?？墒?，從目前各公司合成價(jià)格情況來(lái)看，體外合成費(fèi)用很高，一對(duì)siRNA的價(jià)格在2000元(人民幣)左右，而針對(duì)一個(gè)基因要想獲得較高沉默效率的siRNA，至少要合成4對(duì)siRNA來(lái)比較沉默效率，這對(duì)于研究單個(gè)基因來(lái)說(shuō)費(fèi)用還能夠接受，如果在基因組范圍內(nèi)研究眾多基因功能則費(fèi)用根本承受不起，所以這時(shí)人們都采用載體表達(dá)的方法來(lái)產(chǎn)生目的基因的siRNA?？墒沁@也同樣有一個(gè)問題，目前人們導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞、線蟲、果蠅的表達(dá)載體，都有一個(gè)目的小片段(21-26nt)的反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，有時(shí)在中間還插入一段幾個(gè)核苷酸的間隔序列，這就涉及多個(gè)片段的連接或者合成，所以費(fèi)用同樣較高，對(duì)于小片段的操作也需要一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。這些費(fèi)用上困難或者操作上的不便對(duì)于國(guó)內(nèi)外資金投入很高的醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)、功能基因組學(xué)來(lái)說(shuō)或許不是各自研究領(lǐng)域的瓶頸問題，然而對(duì)于資金投入相對(duì)較少的植物功能基因研究來(lái)講，經(jīng)費(fèi)還是很多實(shí)驗(yàn)室不得不考慮的問題。對(duì)于植物中的RNAi技術(shù)應(yīng)用，人們大多采用載體表達(dá)較長(zhǎng)的dsRNA來(lái)達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?，而dsRNA的產(chǎn)生是通過(guò)中間連有間隔序列的基因片段的反向連接結(jié)構(gòu)表達(dá)產(chǎn)生的。該結(jié)構(gòu)的構(gòu)建涉及3個(gè)或2個(gè)片斷的連接，同樣，對(duì)于單個(gè)基因的研究，構(gòu)建一個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)不是一個(gè)難題，可是如果要象線蟲或果蠅中的研究那樣，在基因組范圍內(nèi)大批量的沉默眾多基因，都通過(guò)該種方式反向連接的話，那么工作不僅量大而且繁瑣，費(fèi)用也較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述領(lǐng)域中的空白，提供一種可用于植物RNAi研究、沉默目的基因表達(dá)的真核表達(dá)載體“正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體”，該載體能夠一步插入目的序列后，即可表達(dá)產(chǎn)生其同源基因的dsRNA(圖3)，這不但可減少工作量，也極大降低了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。
正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體，其特征在于含有正、反向真核表達(dá)啟動(dòng)子和終止子。
所述真核表達(dá)啟動(dòng)子為CaMV35S，Emu，Actin，Ubi或Nos。
所述真核表達(dá)啟動(dòng)子為CaMV35S，所述終止子為Nos。
上述表達(dá)載體，其特征在于含有可表達(dá)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因、反向Nos終止子、正向CaMV35S啟動(dòng)、目的基因片段插入替換序列、反向CaMV35S啟動(dòng)子、正向Nos終止子。
本發(fā)明表達(dá)載體通過(guò)將真核表達(dá)啟動(dòng)子正反向連接，使其表達(dá)兩者之間插入的同一段序列的正義、反義兩條鏈而達(dá)到表達(dá)雙鏈RNA的目的。本發(fā)明是以雙元載體pBI121(圖1)為骨架改造而成的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)的新載體，該載體含有可表達(dá)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因、反向Nos終止子、正向CaMV35S啟動(dòng)、目的基因片段插入替換序列、反向CaMV35S啟動(dòng)子、正向Nos終止子及其他雙元載體所必需的基因。
本發(fā)明載體實(shí)現(xiàn)了通過(guò)1個(gè)連接反應(yīng)即可完成傳統(tǒng)方法需2至3個(gè)連接反應(yīng)才可完成的能表達(dá)雙鏈RNA的植物表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程，大大節(jié)約時(shí)間和財(cái)力。
利用本發(fā)明的載體通過(guò)農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)沉默轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因(Greenfluorescence protein，gfp)煙草葉片中的gfp表達(dá)。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染部位，gfp的表達(dá)受到了由載體表達(dá)的dsRNA的抑制，從而不能顯示綠色熒光；對(duì)這些葉片中的gfp mRNA進(jìn)行RT-PCR分析，證實(shí)了在有上述顏色反應(yīng)的葉片中沒有g(shù)fp mRNA的存在，說(shuō)明已經(jīng)被RNAi機(jī)制所降解，從而不能表達(dá)GFP。這個(gè)載體在植物基因功能研究中應(yīng)用潛力很大，尤其應(yīng)用于功能基因組眾多基因的功能鑒定，優(yōu)勢(shì)更加明顯；同時(shí)，在雙啟動(dòng)子dsRNA植物表達(dá)載體中插入植物病毒基因組片段也可應(yīng)用于植物抗病毒基因工程研究。另外，載體表達(dá)框架中每個(gè)元件兩端都有適當(dāng)?shù)膯蚊盖形稽c(diǎn)，可以根據(jù)試驗(yàn)安排用其他適當(dāng)?shù)脑M(jìn)行替換。


圖1pBI121圖譜圖2pGEM-3Z部分酶切位點(diǎn)分布圖3正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體中表達(dá)框架表達(dá)示意圖A載體中CaMV 35S啟動(dòng)子正反向連接構(gòu)成的表達(dá)框架結(jié)構(gòu)B該框架表達(dá)出目的序列的雙鏈RNA形態(tài)圖4利用發(fā)明載體沉默轉(zhuǎn)gfp煙草中的gfp表達(dá)A1，A2，A3，A4分別為對(duì)照在轉(zhuǎn)染煙草葉片后4、7、9、11天的顏色變化B1，B2，B3，B4分別為沉默gfp載體轉(zhuǎn)染煙草葉片a后4、7、9、11天時(shí)的顏色變化C1，C2，C3，C4分別為沉默gfp載體轉(zhuǎn)染煙草葉片b后4、7、9、11天時(shí)的顏色變化圖5轉(zhuǎn)染后葉片gfp的RT-PCR結(jié)果MMarker；CK對(duì)照；a，b分別為葉片a和葉片b
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體構(gòu)建本發(fā)明是以雙元載體pBI121(圖1)為骨架改造而成的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)的新載體，其構(gòu)建方法如下1.含不同酶切位點(diǎn)的CaMV35S啟動(dòng)子和Nos終止子序列的獲得①設(shè)計(jì)不同CaMV35S啟動(dòng)子兩端PCR擴(kuò)增引物如下第一對(duì)引物(S1)上游ATCTAGAAGATTAGCCTTTTCAATTTCXbaI位點(diǎn)(劃線部分)下游AGGATCCCGTGTTCTCTCCAAATGAAABamHI位點(diǎn)(劃線部分)第二對(duì)引物(S2)上游AGAGCTCAGATTAGCCTTTTCAATTTC SacI位點(diǎn)(劃線部分)下游AGGATCCCTCGAGCGTGTTCTCTCCAAATGAAA BamHI(單劃線部分)，XhoI位點(diǎn)(雙劃線部分)②設(shè)計(jì)不同Nos終止子兩端PCR擴(kuò)增引物如下第一對(duì)引物(N1)上游AGAGCTCGATCGTTCAAACATTTGGCASacI位點(diǎn)(劃線部分)下游AGAATTCCCCGATCTAGTAACATAGATEcoRI位點(diǎn)(劃線部分)第二對(duì)引物(N2)上游ATCTAGAGATCGTTCAAACATTTGGCAXbaI位點(diǎn)(劃線部分)下游AAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATHindIII位點(diǎn)(劃線部分)③根據(jù)gus基因片斷設(shè)計(jì)插入片段序列為了避免反向重復(fù)結(jié)構(gòu)直接相連導(dǎo)致的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的問題，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一個(gè)與啟動(dòng)子和終止子無(wú)關(guān)的插入片段將反向重復(fù)的35S啟動(dòng)子隔開，從而穩(wěn)定質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。該片段是gus基因的一段序列引物(I)上游ACTCGAGTGCGTCACAGCCAAAAGCCAGXhoI位點(diǎn)(劃線部分)下游AGGATCCCGTTGCTTCCGCCAGTGGCGCBamHI位點(diǎn)(劃線部分)④用上述5對(duì)引物以質(zhì)粒pBI121為模板擴(kuò)增獲得5個(gè)片斷擴(kuò)增體系如下95℃預(yù)變性3min，95℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
回收PCR擴(kuò)增目的條帶后，分別以擴(kuò)增引物名稱將它們命名為S1，S2，N1，N2，I，將5個(gè)片斷分別連入pGEM-T載體，分別命名為pGEM-T-S1，pGEM-T-S2，pGEM-T-N1，pGEM-T-N2，pGEM-T-I。熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單克隆測(cè)序，使用測(cè)序正確的克隆作下一步試驗(yàn)。
2.順序連接5個(gè)片斷獲得表達(dá)框架首先用SacI/BamHI雙酶切將pGEM-T-S2的S2片段切下，連入同樣酶切的pGEM-3Z(圖2)中，將該載體命名為pGEM-3Z-S2。
第二步，用BamHI/XhoI雙酶切將pGEM-T-I的I片段切下，連入同樣酶切的pGEM-3Z-S2中，將該載體命名為pGEM-3Z-S2-I。
第三步，用XbaI/BamHI雙酶切將pGEM-T-S1的S1片段切下，連入同樣酶切的pGEM-3Z-S2-I中，將該載體命名為pGEM-3Z-S2-I-S1。
第四步，用XbaI/HindIII雙酶切將pGEM-T-N2的N2片段切下，連入同樣酶切的pGEM-3Z-S2-I-S1中，將該載體命名為pGEM-3Z-S2-I-S1-N2。
第五步，用SacI/EcoRI雙酶切將pGEM-T-N1的N1片段切下，連入同樣酶切的pGEM-3Z-S2-I-S1-N2中，將該載體命名為pGEM-3Z-N1-S2-I-S1-N2。
在每一步連接反應(yīng)中，都對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定以保證連接的正確性。最后得到連接正確的“反向Nos終止子(N1)-正向35S啟動(dòng)子(S2)-插入序列(I)-反向35S啟動(dòng)子(S1)-正向Nos終止子(N2)”表達(dá)框架(圖3A)。
3.正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體的獲得將⑤中的表達(dá)框架“N1-S2-I-S1-N2”用EcoRI/HindIII雙酶切切下，連入同樣酶切的pBI121(pBI121經(jīng)雙酶切后去除了原來(lái)存在的35S啟動(dòng)子、gus基因、Nos終止子)中，獲得正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體的。
實(shí)驗(yàn)例利用發(fā)明的載體通過(guò)農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)沉默轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因(Greenfluorescence protein，gfp)煙草葉片中的gfp表達(dá)。
1實(shí)施方法①根據(jù)gfp基因序列設(shè)計(jì)上游引物P1(5’-AGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’)含有BamHI酶切位點(diǎn)和下游引物P2(ACTCGAGTTACTTGTACAGCTTGTCCA)含有XhoI酶切位點(diǎn)，以轉(zhuǎn)gfp基因煙草的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的600bp片段連入pGEM-T載體，通過(guò)BamHI/XhoI雙酶切連入同樣雙酶切的本發(fā)明載體中，酶切鑒定載體連接正確后構(gòu)建成gfp沉默載體。
②將構(gòu)建好的gfp沉默載體0.1μg加入到100μl農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，液氮冷凍5min后取出融化，加入500μl YEB培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)4h后離心，去除上清400μl，剩余200μl重懸菌體，全部涂布于含有鏈霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEB固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3天。
③挑取單菌落于液體YEB培養(yǎng)基(含鏈霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L)中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；次日按1∶100的比例重新加入到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L)中，等到OD600達(dá)0.5時(shí)取出，離心收集菌體，重懸于MgCl2(0.01mmol/L)和MES(0.01mmol/L)中；利用1ml注射器對(duì)含有g(shù)fp基因的煙草葉片進(jìn)行注射轉(zhuǎn)染，分別在4天、7天、9天、11后在長(zhǎng)波紫外燈下觀察葉片變化情況，拍照。同時(shí)，以未連入gfp片段的本發(fā)明載體為對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
④提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄后以P1/P2為引物作RT-PCR，檢測(cè)gfp mRNA的存在情況。
2實(shí)施結(jié)果與對(duì)照相比，處理的葉片在7dpi時(shí)開始變紅，到第11dpi時(shí)葉片轉(zhuǎn)染部分完全變紅，而對(duì)照沒有明顯變化。這樣的結(jié)果說(shuō)明在轉(zhuǎn)染部位，gfp的表達(dá)受到了由載體表達(dá)的dsRNA的抑制，從而不能顯示綠色熒光(圖4)。對(duì)這些葉片中的gfp mRNA進(jìn)行RT-PCR分析(圖5)，證實(shí)了在有顏色反應(yīng)的葉片中沒有g(shù)fp mRNA的存在，說(shuō)明已經(jīng)被RNAi機(jī)制所降解，從而不能表達(dá)GFP。
權(quán)利要求
1.正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體，其特征在于含有正、反向真核表達(dá)啟動(dòng)子和終止子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體，所述真核表達(dá)啟動(dòng)子為CaMV35S，Emu，Actin，Ubi或Nos。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體，所述啟動(dòng)子為CaMV35S，所述終止子為Nos。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體，其特征在于含有可表達(dá)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因、反向Nos終止子、正向CaMV35S啟動(dòng)、目的基因片段插入替換序列、反向CaMV35S啟動(dòng)子、正向Nos終止子。
5.權(quán)利要求1-4所述的任一正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體在沉默目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及“正反向雙啟動(dòng)子植物RNAi雙元表達(dá)載體”，其特征在于含有正、反向真核表達(dá)啟動(dòng)子。該載體實(shí)現(xiàn)了通過(guò)1個(gè)連接反應(yīng)即可完成傳統(tǒng)方法需2至3個(gè)連接反應(yīng)才可完成的能表達(dá)雙鏈RNA的植物表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程，大大節(jié)約時(shí)間和財(cái)力?？蓱?yīng)用于植物功能基因組學(xué)研究、病毒沉默抑制蛋白研究和植物抗病毒基因工程研究；尤其適用于在基因組范圍沉默眾多基因表達(dá)的植物功能基因RNA干擾庫(kù)的建立。同時(shí)，載體表達(dá)框架中每個(gè)元件兩端都有適當(dāng)?shù)膯蚊盖形稽c(diǎn)，可以根據(jù)試驗(yàn)安排用其他適當(dāng)?shù)脑M(jìn)行替換。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1844403SQ200610011669
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者燕飛, 成卓敏, 張文蔚, 肖紅, 李世訪 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所