專(zhuān)利名稱(chēng)：黃色短桿菌突變株及用于發(fā)酵法生產(chǎn)l－亮氨酸的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化工程領(lǐng)域，涉及一種棒桿菌屬(Brevibacterium flavum)菌種以及應(yīng)用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-亮氨酸(L-leucine)的化學(xué)名為L(zhǎng)-α-氨基異己酸，別名L-2-氨基-4-甲基戊酸，L-亮氨酸是人與動(dòng)物自身不能合成而必須依賴(lài)外源供給的八大必需氨基酸之一，又是三種支鏈氨基酸之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，因此，在人類(lèi)生命代謝中具有特別重要的地位。
L-亮氨酸生產(chǎn)方法有提取法、化學(xué)合成法和發(fā)酵法三類(lèi)，但目前在工業(yè)生產(chǎn)上實(shí)施的只有發(fā)酵法。由于提取法和化學(xué)合成法生產(chǎn)的L-亮氨酸與其它異構(gòu)體分離困難，因而均未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)酵法就是利用微生物的代謝作用，生物合成并過(guò)量積累L-亮氨酸，包括添加前體物發(fā)酵法和直接發(fā)酵法兩類(lèi)。
添加前體物發(fā)酵法又稱(chēng)微生物轉(zhuǎn)化法。這種方法使用葡萄糖作為發(fā)酵碳源、能源，再添加特異的前體物質(zhì)即在氨基酸生物合成途徑中的一些合適中間代謝產(chǎn)物，以避免氨基酸生物合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)作用，經(jīng)微生物作用將其有效轉(zhuǎn)化為目的氨基酸。由于其前體物質(zhì)稀少或價(jià)格昂貴，目前已很少采用此法生產(chǎn)L-亮氨酸。
直接發(fā)酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過(guò)對(duì)特定微生物的誘變處理，選育出營(yíng)養(yǎng)缺陷型及氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簦瑥亩_(dá)到過(guò)量積累某種氨基酸的目的。目前，亮氨酸產(chǎn)生菌大多由谷氨酸產(chǎn)生菌黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌誘變選育而來(lái)。
該法具有原料成本低，來(lái)源廣泛，產(chǎn)品純度高，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。
隨著人口老齡化和人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)氨基酸的需求也在不斷的增加。據(jù)報(bào)道，僅氨基酸輸液一項(xiàng)，從1997年到2000年，每年以15％～20％的進(jìn)度遞增，年銷(xiāo)售額達(dá)10億元以上。而目前，L-亮氨酸的生產(chǎn)主要以日本為主。1996年世界氨基酸總產(chǎn)量為165萬(wàn)噸，其中L-亮氨酸為500噸，而日本就占了350噸。
近年來(lái)，隨著亮氨酸在醫(yī)藥、食品等方面應(yīng)用的開(kāi)拓，市場(chǎng)需求量不斷增加。提高亮氨酸發(fā)酵產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)亮氨酸工業(yè)化生產(chǎn)已成為目前一個(gè)重要課題。目前亮氨酸工業(yè)化生產(chǎn)還存在著一些問(wèn)題(1)產(chǎn)酸率低國(guó)內(nèi)產(chǎn)酸率最高達(dá)30g/L，而L-亮氨酸在國(guó)外已經(jīng)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)酸水平已達(dá)到35g/L。(2)轉(zhuǎn)化率低目前發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的最高轉(zhuǎn)化率僅為20％，提高轉(zhuǎn)化率對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)有極其重要的意義。(3)降低提取分離成本尋找最佳的提取途徑，包括所用試劑，提取工藝及效率等。(4)重組菌株的遺傳改造重組菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性以及工程菌工業(yè)化生產(chǎn)的可行性研究。
目前國(guó)內(nèi)雖然已有少數(shù)生產(chǎn)廠家，但菌株產(chǎn)酸水平不高，產(chǎn)量較小，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求?；谀壳拔覈?guó)對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)L-亮氨酸的研究與生產(chǎn)水平與國(guó)際同行有較大差距，因此，開(kāi)展L-亮氨酸高產(chǎn)菌的選育與發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，對(duì)于實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)亮氨酸產(chǎn)業(yè)化，促進(jìn)醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一種新的棒桿菌屬的黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，該菌具有提高L-亮氨酸產(chǎn)率的能力。
本發(fā)明的目的之二是解決現(xiàn)有法和，無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題，提供用上述菌種發(fā)酵法生產(chǎn)L-亮氨酸的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明提供的黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303，以棒桿菌屬的黃色短桿菌HL41(保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CICC 10135)為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)和紫外線誘變處理定向選育出一株L-亮氨酸生產(chǎn)菌株TK0303(Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr)，其遺傳標(biāo)記為蛋氨酸缺陷(Met-)、異亮氨酸缺陷(IleL)、α-氨基丁酸(α-ABr)抗性、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、β-羥基亮氨酸抗性(β-HLr)、磺胺胍抗性(SGr)、利福平抗性(Rifr)，使其具有L-亮氨酸的生物合成能力。
(注黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303(Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr)曾于2004年3月在《天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)》第19卷第1期發(fā)表，現(xiàn)保藏于天津科技大學(xué)代謝控制發(fā)酵研究室，公眾如有需要，可徑直與該研究室聯(lián)系。)一種利用上述黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-亮氨酸的生產(chǎn)工藝，包括A.將黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)大培養(yǎng)；B.將步驟A中獲得的擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量應(yīng)為1％～30％，氮碳比N∶C應(yīng)介于5∶100～50∶100之間，無(wú)機(jī)鹽含量應(yīng)為0.0001～10％，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH6.0～8.0，培養(yǎng)溫度20℃～40℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)2～5天，接種量為1％～15％(V/V)；發(fā)酵過(guò)程中，添加碳酸鈣和流加尿素、氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.0～8.0；C.L-亮氨酸的提取步驟采用金屬膜過(guò)濾除菌體和蛋白，而后采用活性炭對(duì)濾液進(jìn)行脫色處理，活性炭用量為0.1％～5％，pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，脫色時(shí)間為1～60min；脫色液通過(guò)陽(yáng)離子交換法提取L-亮氨酸，離子交換過(guò)程中的上柱料液的pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，流速為1～6倍床體積/h。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將離子交換洗脫液在60℃～70℃減壓蒸發(fā)至出結(jié)晶，加入一倍體積50％～95％乙醇，冷藏過(guò)夜，進(jìn)行重結(jié)晶，烘干后得L-亮氨酸結(jié)晶。
上述B步發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖，甘露糖，淀粉和糖漿；或糖醇，甘油；或有機(jī)酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳為10％～20％。
上述B步中采用分階段供氧控制模式，發(fā)酵前期溶氧控制在20～60％，后期控制在10～40％。
上述B步發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為氨或銨鹽硫酸銨，醋酸銨，硝酸銨，磷酸銨，乙酸銨或氯化銨；或有機(jī)氮蛋白胨，牛肉膏，玉米漿，或豆餅水解液。
上述B步發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽為磷酸鉀，硫酸鎂，碳酸鈣，硫酸亞鐵，或硫酸錳。
發(fā)酵培養(yǎng)基中可加入營(yíng)養(yǎng)物，氨基酸及維生素。
上述C步中的金屬膜采用不銹鋼管式膜分離系統(tǒng)，其孔徑為50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，操作壓差為0.2～1.0MPa。
上述C步中，洗脫液為0.1～10mol/L氨水，氯化銨溶液，硫酸銨溶液，醋酸銨溶液，乙醇溶液。
上述C步中的離子交換樹(shù)脂采用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，JK006，HD-8，732，D061，D001-CC和HZ014；離子交換柱采用串聯(lián)方式。
上述C步中金屬膜過(guò)濾除菌體和蛋白前，發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，用堿將發(fā)酵液pH調(diào)至9～12，攪拌并加熱到80℃，加入發(fā)酵液0.1％～0.5％硅藻土后注入不銹鋼管式膜分離系統(tǒng)，操作溫度控制在50～60℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差0.3～0.8kg/cm2，濾速控制在200～300ml/min。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明利用黃色短桿(Brevibacterium flavum)突變株TK0303，在10L全自動(dòng)控制發(fā)酵罐采用該生產(chǎn)工藝發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸，可以大大提高L-亮氨酸的產(chǎn)率，最高產(chǎn)量可達(dá)30g/L。本發(fā)明利用金屬膜過(guò)濾法預(yù)處理發(fā)酵液，并以離子交換法提取L-亮氨酸，純度可達(dá)98％以上，提取率55％選育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力減弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突變株，可增大L-亮氨酸生物合成代謝流，節(jié)約碳源，從而有利于L-亮氨酸產(chǎn)量的提高。
2-噻唑丙氨酸(2-TA)是L-亮氨酸和L-纈氨酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，通過(guò)選育2-TAr抗性標(biāo)記，有利于解除乙酰羥基酸合成酶和α-異丙基蘋(píng)果酸合成酶所受到的反饋抑制和阻遏。α-氨基丁酸(α-AB)是纈氨酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，選育α-ABr有利于解除纈氨酸對(duì)乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制。β-羥基亮氨酸(β-HL)是亮氨酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，選育β-HLr等抗性標(biāo)記，有利于解除終產(chǎn)物亮氨酸對(duì)L-亮氨酸生物合成酶系所受到的反饋抑制和阻遏，從而大幅度地提高L-亮氨酸的產(chǎn)量。2-TAr和β-HLr這兩個(gè)標(biāo)記，對(duì)L-亮氨酸高產(chǎn)菌的育種非常重要。
磺胺類(lèi)藥物是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的代謝物對(duì)氨基苯甲酸(PABA)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制物。它們競(jìng)爭(zhēng)性地與二氫葉酸合成酶結(jié)合，阻止或取代了對(duì)氨基苯甲酸摻入到葉酸分子中去，從而阻斷了細(xì)菌細(xì)胞重要組分葉酸的合成。利用磺胺類(lèi)藥物如磺胺胍抗性(SGr)突變株，從而解除磺胺胍的抑制作用，并造成四氫葉酸的大量合成。四氫葉酸是多種酶的輔酶，起一碳基轉(zhuǎn)移作用，因而對(duì)維持菌體的正常代謝十分重要。
篩選利福平抗性(Rifr)菌株有利于L-亮氨酸產(chǎn)量提高，其機(jī)制尚不清楚，可能是通過(guò)改變菌體的正常代謝，使像氨基酸這類(lèi)的代謝產(chǎn)物大量的積累。利福平為半合成廣譜抗菌素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌以及結(jié)核分支桿菌均有明顯抗菌效應(yīng)。
利用金屬膜過(guò)濾預(yù)處理可以有效除去發(fā)酵液中的菌體、雜蛋白質(zhì)等懸浮物，有利于L-亮氨酸的吸附。使用001×7苯乙烯強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，發(fā)酵液用草酸酸化至pH＝2，雙柱串連吸附，用pH＝9的0.5mol/L NH4Cl洗脫，經(jīng)過(guò)活性炭吸附脫色后，用95％乙醇結(jié)晶純化，純度可達(dá)98％以上，提取率55％。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1突變株TK0303的獲得本發(fā)明提供的黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303，以棒桿菌屬的黃色短桿菌HL41為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)和紫外線誘變處理，定向選育出一株L-亮氨酸生產(chǎn)菌株TK0303，其遺傳標(biāo)記為蛋氨酸缺陷(Met-)、異亮氨酸缺陷(IleL)、α-氨基丁酸(α-ABr)抗性、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、β-羥基亮氨酸抗性(β-HLr)、磺胺胍抗性(SGr)、利福平抗性(Rifr)(Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr)，使其具有L-亮氨酸的生物合成能力。
L-亮氨酸生產(chǎn)菌株的具體選育過(guò)程
第一步、誘變初篩將經(jīng)DES常規(guī)誘變后菌株，經(jīng)離心洗滌制成菌懸液，稀釋后涂布于基本培養(yǎng)基平板(葡萄糖20g/L，(NH4)2SO410g/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，VB1100μg/L，瓊脂粉20g/L，PH 7.0～7.2)以及抗性藥物梯度平板或添加了甲硫氨酸或異亮氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基平板，28℃恒溫靜置培養(yǎng)4～6天，挑選在抗性藥物梯度平板上生長(zhǎng)的單菌落或在甲硫氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)而在基本培養(yǎng)基平板不生長(zhǎng)的單菌落，并于斜面內(nèi)保存待篩。
第二步、誘變復(fù)篩搖瓶水平上對(duì)原菌株與各突變株產(chǎn)L-亮氨酸性能比較。
從上步新鮮斜面分別挑取一環(huán)原菌株與各突變株菌苔于種子培養(yǎng)基中(無(wú)水葡萄糖37g/L，豆餅水解液25mL/L，尿素2g/L(分消后補(bǔ)加)，KH2PO4·3H2O 1.3g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，L-Met 0.4g/L，VB1300μG/L，VH200μg/L，pH7.0～7.2)，250mL三角瓶裝液量25mL，9層紗布封口。置于旋轉(zhuǎn)式搖床上(200r/min)，28℃振蕩培養(yǎng)36小時(shí)。以接種量10％，初始pH7.0，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(葡萄糖150g/L，(NH4)2SO420g/L，NH4Ac 15g/L，KH2PO4·3H2O 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4G/L，CaCO330g/L(分消)，MnSO4·H2O 10mg/l，生物素50μg/L，VB1300μg/L，L-Met 0.7g/L，L-Ile 63mg/L，L-Glu 0.42g/L，玉米漿37mL/L)。500mL三角瓶裝液量50mL。28℃振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，轉(zhuǎn)速為220r/min，間歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。在所有的突變株中，L-亮氨酸產(chǎn)量最高的突變株為黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303，其L-亮氨酸產(chǎn)量為19.4g/L。
實(shí)施例2以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸從新鮮斜面挑取一環(huán)TK0303菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)及種子與發(fā)酵培養(yǎng)條件均同實(shí)施例1，種子培養(yǎng)基成分同實(shí)施例2。以接種量10％，初始pH7.0，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(葡萄糖70g/L，(NH4)2SO420g/L，NH4Ac 15g/L，KH2PO4·3H2O 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，CaCO330g/L(分消)，MnSO4·H2O10mg/L，生物素50μg/L，VB1300μg/L，Met 0.7g/L，L-Ile 63mg/L，L-Glu 0.42g/L，玉米漿37mL/L)。500mL三角瓶裝液量50mL。28℃振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，轉(zhuǎn)速為220r/min，間歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。當(dāng)殘?zhí)橇肯陆抵?5～20g/L時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，分幾次補(bǔ)完，每次補(bǔ)料后總糖不超過(guò)25～30g/L，發(fā)酵結(jié)束后，L-Leu產(chǎn)量可達(dá)21.8g/L。
實(shí)施例3以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303在10升發(fā)酵罐生產(chǎn)L-亮氨酸從新鮮斜面挑取一環(huán)TK0303菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)及種子培養(yǎng)條件均同實(shí)施例1，種子培養(yǎng)基成分同實(shí)施例2。按10％接種量將種子液600mL接入10L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括葡萄糖150g/L，(NH4)2SO420g/L，NH4Ac 15g/L，玉米漿37mL/L，KH2PO4·3H2O 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，生物素0.05mg/L，VB1300mμg/L，Met 0.7g/L，Glu0.42g/L，Ile 63mg/L。初始裝液量6L，通風(fēng)量500L/h，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，培養(yǎng)溫度28℃，通過(guò)自動(dòng)流加氨水溶液控制pH7.0±0.05，發(fā)酵72h后，L-Leu產(chǎn)量可達(dá)24.52g/L。
實(shí)施例4以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303在10升發(fā)酵罐采用流加方式生產(chǎn)L-亮氨酸從新鮮斜面挑取一環(huán)TK0303菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)及種子與同實(shí)施例1，種子培養(yǎng)基成分同實(shí)施例2。按10％接種量將種子液600mL接入10L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括葡萄糖70g/L，(NH4)2SO420g/L，NH4Ac15g/L，玉米漿37mL/L，KH2PO4·3H2O 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，MnSO4·H2O10mg/L，生物素0.05mg/L，VB1300mμg/L，Met 0.7g/L，Glu 0.42g/L，Ile 63mg/L。初始裝液量6L，通風(fēng)量500L/h，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，培養(yǎng)溫度28℃，通過(guò)自動(dòng)流加氨水溶液控制pH7.0±0.05。發(fā)酵期間，每隔2h取樣測(cè)殘?zhí)?，?dāng)殘?zhí)墙抵?～3g/L即補(bǔ)入濃度80％葡萄糖。根據(jù)耗糖速率確定補(bǔ)料量，維持葡萄糖濃度2～3g/L。補(bǔ)料結(jié)束，殘?zhí)堑陀?g/L結(jié)束發(fā)酵。TK0303菌株在發(fā)酵15h后進(jìn)入產(chǎn)酸期，在大約60h達(dá)到產(chǎn)酸高峰期，其最高產(chǎn)酸量達(dá)29.47g/L。
實(shí)施例5L-亮氨酸的提取和精制用NaOH將10L-亮氨酸發(fā)酵液pH調(diào)至11，攪拌并80℃水溶加熱10min，加入0.1％硅藻土，將發(fā)酵液倒入金屬膜過(guò)濾器，控制溫度50℃～60℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差0.6kg/cm2，當(dāng)進(jìn)出膜壓差明顯降低時(shí)，補(bǔ)入適量去離子水，濾速控制在200～300ml/min，將濾液pH調(diào)至4.5，加入1％粉末狀活性炭，60℃下脫色1h，過(guò)濾后用草酸或鹽酸將過(guò)濾后的發(fā)酵液調(diào)至pH＝2備用。將處理成H+型的001×7樹(shù)脂裝入直徑2.4cm的離子交換柱中，裝柱高12cm，兩柱串連，操作溫度為室溫，上柱速度為0.5BV/h，上柱后，用兩倍發(fā)酵液體積pH＝2的酸性水洗滌樹(shù)脂，流速為1BV/h，將洗滌液收集準(zhǔn)備再次上柱。用氨水將0.5mol/LNH4Cl調(diào)至pH＝9，0.6BV/h洗脫，收集pH＝2～9部分的洗脫液。
使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將洗脫液在60℃～70℃減壓蒸發(fā)至出結(jié)晶，加入一倍體積95％乙醇，冷藏過(guò)夜，過(guò)濾后得粗結(jié)晶。用一定量的蒸餾水溶解粗結(jié)晶，再加入等體積的95％乙醇，冷藏過(guò)夜，過(guò)濾晶體，烘干后得L-亮氨酸結(jié)晶，純度可達(dá)98％以上，提取率55％。
權(quán)利要求
1.一種黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303，以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)HL41(保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CICC 10135)為出發(fā)菌種，選育具有蛋氨酸缺陷(Met-)、異亮氨酸缺陷(IleL)、α-氨基丁酸抗性(α-ABr)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、β-羥基亮氨酸抗性(β-HLr)、磺胺胍抗性(SGr)、利福平抗性(Rift)的突變株，使其具有L-亮氨酸的生物合成能力。
2.一種利用黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-亮氨酸的生產(chǎn)工藝，包括A.將黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TK0303進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)大培養(yǎng)；B.將步驟A中獲得的擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量應(yīng)為1％～30％，氮碳比N∶C應(yīng)介于5∶100～50∶100之間，無(wú)機(jī)鹽含量應(yīng)為0.0001～10％，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH6.0～8.0，培養(yǎng)溫度20℃～40℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)2～5天，接種量為1％～15％(V/V)；發(fā)酵過(guò)程中，添加碳酸鈣和流加尿素、氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.0～8.0；C.L-亮氨酸的提取步驟采用金屬膜過(guò)濾除菌體和蛋白，而后采用活性炭對(duì)濾液進(jìn)行脫色處理，活性炭用量為0.1％～5％，pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，脫色時(shí)間為1～60min；脫色液通過(guò)陽(yáng)離子交換法提取L-亮氨酸，離子交換過(guò)程中的上柱料液的pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，流速為1～6倍床體積/h。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將離子交換洗脫液在60℃～70℃減壓蒸發(fā)至出結(jié)晶，加入一倍體積50％～95％乙醇，冷藏過(guò)夜，進(jìn)行重結(jié)晶，烘干后得L-亮氨酸結(jié)晶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于C步中的金屬膜采用不銹鋼管式膜分離系統(tǒng)，其孔徑為50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，操作壓差為0.2～1.0MPa。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于C步中，洗脫液為0.1～10mol/L氨水，氯化銨溶液，硫酸銨溶液，醋酸銨溶液，乙醇溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于C步中的離子交換樹(shù)脂采用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，JK006，HD-8，732，D061，D001-CC和HZ014；離子交換柱采用串聯(lián)方式。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步中采用分階段供氧控制模式，發(fā)酵前期溶氧控制在20～60％，后期控制在10～40％。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖，甘露糖，淀粉和糖漿；或糖醇，甘油；或有機(jī)酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳為10％～20％。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為氨或銨鹽硫酸銨，醋酸銨，硝酸銨，磷酸銨，乙酸銨或氯化銨；或有機(jī)氮蛋白胨，牛肉膏，玉米漿，或豆餅水解液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽為磷酸鉀，硫酸鎂，碳酸鈣，硫酸亞鐵，或硫酸錳。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于過(guò)濾前，發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，用堿將發(fā)酵液pH調(diào)至9～12，攪拌并加熱到80℃，加入發(fā)酵液0.1％～0.5％硅藻土后注入不銹鋼管式膜分離系統(tǒng)，操作溫度控制在50～60℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差0.3～0.8kg/cm2，濾速控制在200～300ml/min。
全文摘要
黃色短桿菌突變株及用于發(fā)酵法生產(chǎn)L－亮氨酸的生產(chǎn)工藝。以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)HL41(CICC 10135)為出發(fā)菌種，選育具有遺傳標(biāo)記(Met
文檔編號(hào)C12P13/06GK1834227SQ200610013399
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者陳寧, 劉輝, 劉淑云, 徐慶陽(yáng) 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)