專利名稱：黃色短桿菌突變株及其在發(fā)酵法生產(chǎn)l－異亮氨酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化工程領(lǐng)域，涉及一種棒桿菌屬(Brevibacteriumflavum)菌種以及應(yīng)用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-異亮氨酸(L-Isoleucine)的化學(xué)名為L-a-氨基-β-甲基戊酸，L-異亮氨酸是人體八種必需氨基酸之一，又是三種支鏈氨基酸之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，因此，在人類生命代謝中具有特別重要的地位。
L-異亮氨酸生產(chǎn)方法有提取法、化學(xué)合成法和發(fā)酵法三類，但目前在工業(yè)生產(chǎn)上實(shí)施的只有發(fā)酵法。由于提取法和化學(xué)合成法生產(chǎn)的L-異亮氨酸與其它異構(gòu)體分離困難，因而均未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)酵法就是利用微生物的代謝作用，生物合成并過量積累L-異亮氨酸，包括添加前體物發(fā)酵法和直接發(fā)酵法兩類。
添加前體物發(fā)酵法又稱微生物轉(zhuǎn)化法。這種方法使用葡萄糖作為發(fā)酵碳源、能源，再添加特異的前體物質(zhì)即在氨基酸生物合成途徑中的一些合適中間代謝產(chǎn)物，以避免氨基酸生物合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)作用，經(jīng)微生物作用將其有效轉(zhuǎn)化為目的氨基酸。由于其前體物質(zhì)稀少或價格昂貴，目前已很少采用此法生產(chǎn)L-異亮氨酸。
直接發(fā)酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對特定微生物的誘變處理，選育出營養(yǎng)缺陷型及氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簦瑥亩_(dá)到過量積累某種氨基酸的目的。目前，異亮氨酸產(chǎn)生菌大多由谷氨酸產(chǎn)生菌黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌誘變選育而來。
該法具有原料成本低，來源廣泛，產(chǎn)品純度高，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一種新的棒桿菌屬的黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，該菌具有提高L-異亮氨酸產(chǎn)率的能力。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是提供采用上述菌種發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明提供的黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TC21，具有L-異亮氨酸生產(chǎn)能力，遺傳標(biāo)記為蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)。
(注黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TC21(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)曾于2004年6月在《天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)》第19卷第2期發(fā)表，現(xiàn)保藏于天津科技大學(xué)代謝控制發(fā)酵研究室，公眾如有需要，可徑直與該研究室聯(lián)系。)其誘變方法是，以棒桿菌屬的黃色短桿菌HL41(保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC 10135)為出發(fā)菌種，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)和紫外線誘變處理，定向選育出一株L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株TC21，其遺傳標(biāo)記為蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)，使其具有L-異亮氨酸的生物合成能力。
黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TC21在發(fā)酵法生產(chǎn)L-異亮氨酸中的應(yīng)用，該方法A、將黃色短桿菌突變株加入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量應(yīng)為1％～30％，氮碳比N∶C應(yīng)介于5∶100～50∶100之間，無機(jī)鹽含量應(yīng)為0.0001～10％，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH6.0～8.0，培養(yǎng)溫度20℃～40℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)2～5天，接種量為1％～15％(V/V)；發(fā)酵過程中，添加碳酸鈣和流加尿素、氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.0～8.0，發(fā)酵結(jié)束L-異亮氨酸最大產(chǎn)量可達(dá)24.82g/L；B、L-異亮氨酸的提取步驟將上述培養(yǎng)液采用金屬膜過濾除菌體和蛋白，而后通過陽離子交換樹脂提取，洗脫流速為1～6倍床體積/h，洗脫液為0.1～10mol/L氨水，或氯化銨溶液，或硫酸銨溶液，或醋酸銨溶液，或乙醇溶液，然后采用活性炭對濾液進(jìn)行脫色處理，得到L-異亮氨酸粗品，最后采用95％乙醇精制，得到純品。
上述活性炭用量為0.1％～5％，pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，脫色時間為1～60min。
離子交換過程中的上柱料液的pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，流速為1～6倍床體積/h。離子交換柱是幾根串連而成，將上柱后流出的發(fā)酵液注入另一根離子交換柱。
離子交換樹脂采用強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，JK006，HD-8，001×7，D061，D001-CC和HZ014。
發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖，甘露糖，淀粉和糖漿；或糖醇，甘油；或有機(jī)酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳為10％～20％。
氮源為氨或銨鹽硫酸銨，醋酸銨，硝酸銨，磷酸銨，乙酸銨或氯化銨；或有機(jī)氮蛋白胨，牛肉膏，玉米漿，或豆餅水解液。
無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽，硫酸鎂，碳酸鈣，硫酸亞鐵，或硫酸錳。
發(fā)酵培養(yǎng)基中可加入營養(yǎng)物，氨基酸及維生素。
發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵液預(yù)處理過程中，用堿將發(fā)酵液pH調(diào)至9～14，攪拌并加熱到80℃，加入0.1％～0.5％硅藻土后注入不銹鋼管式膜分離系統(tǒng)，操作溫度控制在50～60℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差0.3～0.8kg/cm2，濾速控制在200～300ml/min。
L-異亮氨酸的提取步驟中的金屬膜采用不銹鋼管式膜分離系統(tǒng)，其孔徑為50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，操作壓差為0.2～1.0MPa。
利用離子交換提取L-異亮氨酸的方法，采用強(qiáng)酸型陽離子樹脂填充于離子交換柱中，在使用前將該樹脂處理成氫型或鈉型，用酸將上述方法預(yù)處理的發(fā)酵液pH調(diào)至2～6上柱交換吸附，操作溫度為0～40℃，流速為1～6倍床體積/h。
提純精制L-異亮氨酸的方法是，將按照上述提取方法處理過的L-異亮氨酸溶液pH調(diào)至4.5，加入0.5％～2％粉末狀活性炭，60℃～80℃下脫色1h，過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃～70℃減壓蒸發(fā)至出結(jié)晶，加入一倍體積95％乙醇，冷藏過夜，過濾后得粗結(jié)晶；用蒸餾水全部溶解粗結(jié)晶，再加入等體積的95％乙醇，冷藏過夜，過濾晶體，烘干后得L-異亮氨酸結(jié)晶。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明利用黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸，在10L全自動控制發(fā)酵罐采用該生產(chǎn)工藝發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸，可以大大提高L-異亮氨酸的產(chǎn)率，最高產(chǎn)量可達(dá)25g/L。本發(fā)明利用金屬膜過濾法預(yù)處理發(fā)酵液，并以離子交換法提取L-異亮氨酸，純度可達(dá)98％以上，提取率50％在L-異亮氨酸生物合成過程中，由于琥珀酰高絲氨酸合成酶活性比高絲氨酸激酶高，代謝優(yōu)先向合成蛋氨酸方向進(jìn)行，利用蛋氨酸缺陷(Met-)可以使生物轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸和異亮氨酸優(yōu)先合成，而且蛋氨酸缺陷，使其對于高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶這兩個反饋?zhàn)瓒艚獬?，也使更多的碳架轉(zhuǎn)向蘇氨酸和異亮氨酸的合成。
選育賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物S-2-氨基乙基L-半胱氨酸抗性(AECr)可解除賴氨酸、蘇氨酸對天冬氨酸激酶的協(xié)同反饋抑制，有利于L-異亮氨酸的前體物蘇氨酸的積累。
α-氨基丁酸(α-AB)是纈氨酸的結(jié)構(gòu)類似物。選育α-AB抗性突變株，可遺傳性的解除支鏈氨基酸對乙酰羥基酸合成酶的協(xié)同反饋?zhàn)瓒艉屠i氨酸對乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制，也可以遺傳性地解除異亮氨酸對蘇氨酸脫水酶的反饋調(diào)節(jié)，從而促使蘇氨酸大量轉(zhuǎn)化為異亮氨酸，結(jié)果有利于異亮氨酸的積累。
利用金屬膜過濾預(yù)處理可以有效除去發(fā)酵液中的菌體、雜蛋白質(zhì)等懸浮物，有利于L-異亮氨酸的吸附。使用HZ014丙烯酸強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，發(fā)酵液用草酸酸化至pH＝2，雙柱串連吸附，用pH＝9的0.5mol/LNH4Cl洗脫，經(jīng)過活性炭吸附脫色后，用95％乙醇結(jié)晶純化，純度可達(dá)98％以上，提取率50％。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1突變株TC21的制備本發(fā)明提供的黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TC21，以棒桿菌屬的黃色短桿菌HL41為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)和紫外線誘變處理，定向選育出兩株L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株TC21，TC21的遺傳標(biāo)記為蛋氨酸缺陷，α-氨基丁酸抗性，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性，乙硫氨酸抗性(Met-+AECr+α-ABr+Ethr)，其具有L-異亮氨酸的生物合成能力。
L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株的選育第一步、誘變初篩將經(jīng)DES常規(guī)誘變后菌株，經(jīng)離心洗滌制成菌懸液，稀釋后涂布于基本培養(yǎng)基平板(葡萄糖20g/L，(NH4)2SO410g/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，VB1100μg/L，瓊脂粉20g/L，PH 7.0～7.2)，再在每塊平板內(nèi)放置一沾有缺陷物質(zhì)液的無菌濾紙片，31℃恒溫靜置培養(yǎng)4～6天，挑選濾紙片周圍抑菌圈內(nèi)的單菌落，并于斜面內(nèi)保存待篩。
第二步、誘變復(fù)篩搖瓶水平上對原菌株與各突變株產(chǎn)L-異亮氨酸性能比較從新鮮斜面分別挑取一環(huán)原菌株與各突變株菌苔于種子培養(yǎng)基中(葡萄糖25g/L，(NH4)2SO43g/L，豆餅水解液21mL/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素0.5mg/L，VB12.5mg/LpH7.0～7.2)，500mL三角瓶裝液量55mL，9層紗布封口。置于旋轉(zhuǎn)式搖床上(200r/min)，31℃振蕩培養(yǎng)36小時。以接種量10％，初始pH7.0，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(葡萄糖160g/L，(NH4)2SO412.5g/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CaCO330g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，，F(xiàn)eSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O15mg/L，生物素140μg/L，VB11mg/L，Met 20mg/L，豆餅水解液20mL/L)。500mL三角瓶裝液量25mL。31℃振蕩培養(yǎng)96小時，轉(zhuǎn)速為200r/min，間歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。對原菌株與各突變株產(chǎn)L-異亮氨酸性能比較見表1。
表1 異亮氨酸高產(chǎn)菌株的篩選及搖瓶發(fā)酵結(jié)果
由表1可見，突變株TC21的產(chǎn)L-異亮氨酸性能最強(qiáng)。
實(shí)施例2利用本發(fā)明的菌種生產(chǎn)L-異亮氨酸通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上述所獲得的黃色短桿菌和在培養(yǎng)基中積累L-異亮氨酸，可以有效的生產(chǎn)L-異亮氨酸。
為了利用本發(fā)明的黃色短桿菌生產(chǎn)L-異亮氨酸，可以利用含有碳源，氮源以及無機(jī)鹽和微量的其它營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸和維生素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
從新鮮斜面挑取一環(huán)TC21菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)及種子與發(fā)酵培養(yǎng)條件均同實(shí)施例1，種子培養(yǎng)基成分包括葡萄糖25g/L，(NH4)2SO43g/L，豆餅水解液21mL/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素0.5mg/L，VB12.5mg/L，pH7.0～7.2。500mL三角瓶裝液量55mL，9層紗布封口。置于旋轉(zhuǎn)式搖床上(200r/min)，31℃振蕩培養(yǎng)36小時。以接種量10％，初始pH7.0，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，成分包括葡萄糖160g/L，(NH4)2SO412.5g/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO330g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，，F(xiàn)eSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O 15mg/L，生物素140μg/L，VB11mg/L，Met 20mg/L，豆餅水解液20mL/L。500mL三角瓶裝液量25mL。31℃振蕩培養(yǎng)96小時，轉(zhuǎn)速為200r/min，間歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。發(fā)酵結(jié)束L-異亮氨酸最大產(chǎn)量為21.45g/L實(shí)施例3從新鮮斜面挑取一環(huán)TC21菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)及種子培養(yǎng)條件均同實(shí)施例1，種子培養(yǎng)基成分包括葡萄糖35g/L，(NH4)2SO43g/L，豆餅水解液15mL/L，玉米漿15mL/L，KH2PO4.3H2O 1.5gg/L，MgSO4·7H2O 0.4gg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素0.5mg/L，VB12.5mg/L，尿素2g/L，pH7.0～7.2。按15％接種量將種子液450mL接入5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括葡萄糖160g/L，(NH4)2SO412.5g/L，玉米漿30mL/L，KH2PO4·3H2O1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，，F(xiàn)eSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O 15mg/L，生物素0.1mg/L，VB11mg/L，Met 20mg/L，豆餅水解液20mL/L。初始裝液量3L，通風(fēng)量500L/h，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，培養(yǎng)溫度31℃，通過自動流加氨水溶液控制pH7.0±0.05。發(fā)酵結(jié)束后L-異亮氨酸最大產(chǎn)量為22.8g/L實(shí)施例4從新鮮斜面挑取一環(huán)TC21菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)及種子均同實(shí)施例3，按15％接種量將種子液450mL接入5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括葡萄糖70g/L，(NH4)2SO412.5g/L，玉米漿30mL/L，KH2PO4·3H2O1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，，F(xiàn)eSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O 15mg/L，生物素0.1mg/L，VB11mg/L，Met 20mg/L，豆餅水解液20mL/L。初始裝液量3L，通風(fēng)量500L/h，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，培養(yǎng)溫度31℃，通過自動流加氨水溶液控制pH7.0±0.05。發(fā)酵期間，每隔2h取樣測殘?zhí)牵?dāng)殘?zhí)墙抵?～3g/L即補(bǔ)入濃度80％葡萄糖。根據(jù)耗糖速率確定補(bǔ)料量，維持葡萄糖濃度2～3g/L。補(bǔ)料結(jié)束，殘?zhí)堑陀?g/L結(jié)束發(fā)酵。TC21菌株在發(fā)酵15h后進(jìn)入產(chǎn)酸期，在大約60h達(dá)到產(chǎn)酸高峰期，其最高產(chǎn)酸量達(dá)24.82g/L。
實(shí)施例5 L-異亮氨酸的提取純化用NaOH將10L異亮氨酸發(fā)酵液pH調(diào)至11，攪拌并80℃水浴加熱10min，加入0.1％硅藻土，將發(fā)酵液倒入金屬膜過濾器，控制溫度50℃～60℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差0.6kg/cm2，當(dāng)進(jìn)出膜壓差明顯降低時，補(bǔ)入適量去離子水，濾速控制在200～300ml/min，用草酸或鹽酸將過濾后的發(fā)酵液調(diào)至pH＝2備用。將處理成H+型的HZ014樹脂裝入直徑2.4cm的離子交換柱中，裝柱高12cm，兩柱串連，操作溫度為室溫，上柱速度為0.5BV/h，上柱后，用兩倍發(fā)酵液體積pH＝2的酸性水洗滌樹脂，流速為1BV/h，將洗滌液收集準(zhǔn)備再次上柱。用氨水將0.5mol/LNH4Cl調(diào)至pH＝9，0.6BV/h洗脫，收集pH＝2～9部分的洗脫液。
將洗脫液pH調(diào)至4.5，加入1％粉末狀活性炭，60℃下脫色1h，過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃～70℃減壓蒸發(fā)至出結(jié)晶，加入一倍體積95％乙醇，冷藏過夜，過濾后得粗結(jié)晶。用一定量的蒸餾水溶解粗結(jié)晶，再加入等體積的95％乙醇，冷藏過夜，過濾晶體，烘干后得L-異亮氨酸結(jié)晶。
權(quán)利要求
1.一種黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)突變株TC21，具有L-異亮氨酸生產(chǎn)能力；突變株TC21遺傳標(biāo)記為蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)。
2.一種權(quán)利要求1所述的黃色短桿菌突變株TC21的誘變方法，其特征在于以棒桿菌屬的黃色短桿菌HL41(保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC 10135)為出發(fā)菌種，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)和紫外線誘變處理，定向選育出一株L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株TC21，其遺傳標(biāo)記為蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)，使其具有L-異亮氨酸的生物合成能力。
3.一種權(quán)利要求1所述的黃色短桿菌突變株TC21在發(fā)酵法生產(chǎn)L-異亮氨酸中的應(yīng)用，其特征在于A、將黃色短桿菌突變株加入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量應(yīng)為1％～30％，氮碳比N∶C應(yīng)介于5∶100～50∶100之間，無機(jī)鹽含量應(yīng)為0.0001～10％，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH6.0～8.0，培養(yǎng)溫度20℃～40℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)2～5天，接種量為1％～15％(V/V)；發(fā)酵過程中，添加碳酸鈣和流加尿素、氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.0～8.0；B、L-異亮氨酸的提取步驟將上述培養(yǎng)液采用金屬膜過濾除菌體和蛋白，而后通過陽離子交換樹脂提取，洗脫流速為1～6倍床體積/h，洗脫液為0.1～10mol/L氨水，或氯化銨溶液，或硫酸銨溶液，或醋酸銨溶液，或乙醇溶液，然后采用活性炭對濾液進(jìn)行脫色處理，得到L-異亮氨酸粗品，最后采用95％乙醇精制，得到純品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖，甘露糖，淀粉和糖漿；或糖醇，甘油；或有機(jī)酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳為10％～20％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為氨或銨鹽硫酸銨，醋酸銨，硝酸銨，磷酸銨，乙酸銨或氯化銨；或有機(jī)氮蛋白胨，牛肉膏，玉米漿，或豆餅水解液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽，硫酸鎂，碳酸鈣，硫酸亞鐵，或硫酸錳。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵液預(yù)處理過程中，用堿將發(fā)酵液pH調(diào)至9～14，攪拌并加熱到80℃，加入0.1％～0.5％硅藻土后注入不銹鋼管式膜分離系統(tǒng)，操作溫度控制在50～60℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差0.3～0.8kg/cm2，濾速控制在200～300ml/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于采用不銹鋼管式膜分離系統(tǒng)，其孔徑為50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范圍0～14，操作溫度為0～40℃，操作壓差為0.2～1.0MPa。
9.根據(jù)權(quán)利要求3、7所述的應(yīng)用，其特征在于利用離子交換提取L-異亮氨酸的方法，采用強(qiáng)酸型陽離子樹脂填充于離子交換柱中，在使用前將該樹脂處理成氫型或鈉型，，用酸將權(quán)利要求7所述方法處理的發(fā)酵液pH調(diào)至2～6上柱交換吸附，將上柱后流出的發(fā)酵液注入串連的另一根離子交換柱。操作溫度為0～40℃，流速為1～6倍床體積/h。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于提純精制L-異亮氨酸的方法是，將按照權(quán)利9所述方法處理過的L-異亮氨酸溶液pH調(diào)至4.5，加入0.5％～2％粉末狀活性炭，60℃～80℃下脫色1h，過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃～70℃減壓蒸發(fā)至出結(jié)晶，加入一倍體積95％乙醇，冷藏過夜，過濾后得粗結(jié)晶；用蒸餾水全部溶解粗結(jié)晶，再加入等體積的95％乙醇，冷藏過夜，過濾晶體，烘干后得L-異亮氨酸結(jié)晶。
全文摘要
以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)HL41(保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC 10135)為出發(fā)菌種，選育具有蛋氨酸缺陷(Met
文檔編號C12P13/06GK1834228SQ200610013400
公開日2006年9月20日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者陳寧, 楊寧, 劉淑云, 徐慶陽 申請人:天津科技大學(xué)