專利名稱：人類組織因子途徑抑制因子突變基因mTFPI、包括該基因的重組載體及其宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及組織因子途徑抑制因子突變基因、含有該基因的重組載體，及用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
人類組織因子途徑抑制因子(Tissue Factor Pathway Inhibitor，TFPI)是組織因子途徑的重要抑制因子，作為TF:FVIIa復(fù)合物的生理抑制劑對凝血過程有重要的影響作用。TFPI能抑制血栓形成及血管平滑肌細(xì)胞增殖等，因此，對血管再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗塞等的發(fā)生與發(fā)展有減緩作用。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，人類TFPI重組蛋白(hrTFPI)對血栓形成、感染性休克、血管再狹窄、內(nèi)毒素血癥和DIC(彌散性血管內(nèi)凝血)等有防治作用。因此，TFPI有巨大的藥用價(jià)值，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景。
人類TFPI血漿濃度低(54-124ng/ml)，直接從血漿中純化困難，無法大量獲取。為獲得足量TFPI用于功能研究及臨床應(yīng)用，國內(nèi)外已有許多公司和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基因工程的方法制備TFPI重組蛋白(rTFPI)。然而，TFPI結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在許多表達(dá)體系中都未能實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量的表達(dá)。利用釀酒酵母表達(dá)體系表達(dá)TFPI產(chǎn)量很低，約20ug/L。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系所獲得的重組蛋白，產(chǎn)量約2～6mg/L，生物活性較好，但成本太高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來倍受重視的新型嗜甲醇酵母表達(dá)體系，它表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量高，操作簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，與釀酒酵母相比，它對外源蛋白的修飾作用更近似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在畢赤酵母表達(dá)體系中，外源基因的表達(dá)量主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。外源基因的某些序列可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止，如TTTTTATA、ATTATTTTATAAA(Pichia Expression Kit)。人類TFPI-cDNA第337-346位堿基序列為TATTTTTATA，使TFPI重組蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量低下。因此，突變該序列成為提高TFPI重組蛋白在畢赤酵母中產(chǎn)量的前提，對大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)獲得大量TFPI重組蛋白具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為提高TFPI重組蛋白的產(chǎn)量，提供一種人類組織因子途徑抑制因子突變基因mTFPI。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種包括有TFPI突變基因mTFPI的重組載體。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有TFPI突變基因mTFPI的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種TFPI突變基因mTFPI，它具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一種包括TFPI突變基因mTFPI的重組載體，將序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列用XhoI和EcoRI處理后與pPic9載體(美國Invitrogen公司)，加入T4連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，制成mTFPI-pPic9。
一種含有TFPI突變基因mTFPI的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，它是將mTFPI-pPic9導(dǎo)入到宿主畢赤酵母菌GS115，成為GS115/mTFPI-pPic9。
本發(fā)明中的TFPI突變基因mTFPI特點(diǎn)在于在其他已經(jīng)報(bào)道的TFPI多核苷酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行了部分核苷酸序列的改變；但他們編碼的氨基酸序列相同，即均為野生型的TFPI。
實(shí)驗(yàn)證明，與野生型TFPI基因在畢赤酵母中表達(dá)的重組蛋白量相比，本發(fā)明的TFPI突變基因mTFPI在畢赤酵母中所表達(dá)的重組蛋白量有較大提高(見圖5mTFPI重組蛋白與TFPI重組蛋白的表達(dá)量比較)，從而可以大大降低大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)獲得該重組蛋白的生產(chǎn)成本。


圖1刪除野生型TFPI-cDNA分泌信號(hào)序列策略圖；圖2mTFPI-cDNA構(gòu)建策略圖；圖3一種含有mTFPI-cDNA重組(克隆)載體及含該重組載體的宿主細(xì)胞的構(gòu)建策略圖；圖4mTFPI重組蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜；圖5mTFPI重組蛋白與TFPI重組蛋白的表達(dá)量比較。
具體實(shí)施例方式
制備本發(fā)明的一種TFPI突變基因mTFPI、重組載體及其宿主細(xì)胞的方法包括如下步驟1.通過PCR擴(kuò)增將天然TFPI-cDNA序列中含有一段78個(gè)堿基的分泌信號(hào)肽序列刪除，經(jīng)限制性內(nèi)切酶部分水解，得到DNA片段，連接到pPic9載體(美國Invitrogen公司)上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TB1中。提取TFPI-pPic9質(zhì)粒DNA，用PCR法對TFPI的部分DNA序列進(jìn)行突變。純化PCR產(chǎn)物后，用限制性內(nèi)切酶處理后，連接到pPic9載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TB1，形成的重組質(zhì)粒為mTFPI-pPic9。
2.提取mTFPI-pPic9質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶將其線性化后，轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞GS115(美國Invitrogen公司)中，獲得重組酵母菌GS115/mTFPI-pPic9。
在可使TFPI突變基因mTFPI表達(dá)的條件下培養(yǎng)該重組菌，用底物發(fā)色法測定TFPI蛋白的活性；并經(jīng)SDS-PAGE分析，證明TFPI蛋白大量表達(dá)。
TFPI突變基因mTFPI核苷酸序列SEQ ID No.1。TFPI突變基因mTFPI全長828bp，和其他野生型的TFPI基因比較，其第337-346位核苷酸序列發(fā)生了突變。
根據(jù)核苷酸序列SEQ ID No.1，推測表達(dá)的TFPI蛋白的氨基酸序列見SEQ ID No.2。該TFPI的氨基酸序列由276個(gè)氨基酸組成，分子量為42KDa。通過對本發(fā)明涉及的TFPI突變基因mTFPI推導(dǎo)的氨基酸序列與其他野生型TFPI蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明無任何差別(參見Thomas JG，Roger E，Robin LW，et al.1991.Structure of the humanlipoprotein-associated coagulation inhibitor gene.The Journal of Biological Chemistry.226(8)5036-5041.)下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該理解的是，所述的實(shí)施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1構(gòu)建含TFPI突變基因mTFPI的載體以質(zhì)粒DNA TFPI-pFastBac(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程所基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)為模板，XhoI(gtc agt ctc gag aaa aga gat tct gag gaa gat gaag；含有XhoI酶切位點(diǎn))，EcoI(gct ata acg aat tca cat att ttt aac；含EcoRI酶切位點(diǎn))為正反引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖1刪除野生型TFPI分泌信號(hào)序列策略圖)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)純化PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI處理PCR產(chǎn)物及pPic9載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用上述試劑盒回收后，取200ng pPIC9回收產(chǎn)物，與200ng回收的PCR產(chǎn)物，在20μL連接體系中于16℃過夜進(jìn)行連接反應(yīng)(連接體系含2ul10x連接緩沖液，1ulT4DNA連接酶)。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli(大腸桿菌)TB1，涂布在LB培養(yǎng)基平板上。提取TFPI-pPic9質(zhì)粒DNA挑取一單菌落接種于10ml LB培養(yǎng)基中37℃250rpm過夜培養(yǎng)；離心收集菌體，用1ml TE緩沖液(Tris-HCl 10mmol/L，EDTA 1mmol/L，pH8.0)重懸，再次離心收集菌體，用GTE緩沖液重懸后加入15ul濃度為10mg/ml的溶菌酶，混勻后30℃水浴30min；然后加入300ul裂解液(0.2N NaOH/1％SDS，新鮮制備)，輕柔地顛倒混勻后靜置5min；加入225ul 5M的乙酸鉀溶液(3M乙酸鉀，2M乙酸，pH 5.5)，混勻后冰浴10min；13000rpm離心15min，取上清，加入2ul 10mg/ml的RNaseA(核糖核酸酶A)溶液，混勻后37℃水浴20min；等體積的酚-氯仿混合液(酚∶氯仿＝24∶1)抽提一次；加入等體積的PEG(聚乙二醇)溶液(13％PEG 8000，0.8M NaCl)混勻，4℃靜置30min，13000rpm離心20min，棄上清。沉淀用冰冷的70％的乙醇漂洗兩遍，溶于適當(dāng)體積的TE緩沖液中。用OE-PCR定點(diǎn)突變法，以質(zhì)粒DNA TFPI-pPic9為模板，以5’Aox(GCA AAT GGC ATT CTGACA TCC)和突變引物m2(tgt ctg att gtt gta gaa gta cct ggt aat ata ac)；3’Aox(GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC)及突變引物m1(tat att acc agg tac ttc tacaac aat cag aca aaa c)為引物，進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增(見圖2刪除分泌信號(hào)序列的野生型TFPI基因定點(diǎn)突變策略圖)。用上述方法純化PCR產(chǎn)物(mTFPI)，酶切PCR產(chǎn)物并連接到pPic9載體上，并用上述方法轉(zhuǎn)化mTFPI-pPic9到大腸桿菌TB1。
實(shí)施例2構(gòu)建及鑒定重組酵母菌GS115，(酵母菌GS115，美國Invitrogen公司)取50ug提取的質(zhì)粒DNA(mTFPI-pPic9)用50u Sac1酶切1小時(shí)。將質(zhì)粒用無水乙醇沉淀后，溶于20ul無菌水中。用PEG1000法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。將50ug DNA直接加入尚處于冷凍狀態(tài)的感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃水浴5分鐘，然后加入1.2mlPEG溶液(40％PEG 1000，0.2M Bicine，pH 8.35)，30℃水浴1h。離心，用1.5ml NaCl溶液(0.15M NaCl，10mM Bicine，pH 8.35)重懸菌體。再次離心，用0.2ml NaCl溶液(0.15M NaCl，10mMBicine，pH 8.35)重懸菌體后涂布于RDB選擇平板上，30℃孵育4-6日。從RDB選擇平板上挑取克隆接種于10ml YPD培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)18-24小時(shí)。用玻璃珠裂解法提取酵母基因組DNA。取5ul酵母基因組DNA作為摸板，以5`Aox和3`Aox.作為正，反引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并根據(jù)擴(kuò)增片段的大小來判斷mTFPI-pPIC9質(zhì)粒是否插入酵母宿主菌基因組中。篩選mTFPI-pPic9質(zhì)粒已插入的重組酵母菌GS115(圖3一種含有mTFPI-cDNA重組(克隆)載體及含該重組載體的宿主細(xì)胞的構(gòu)建策略圖)。
實(shí)施例3TFPI重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將陽性克隆接種到10ml YPD培養(yǎng)基中，30℃250rpm培養(yǎng)18h；取100ul菌液接種于10ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃250rpm培養(yǎng)至OD600≈3(約16-18h)；離心收集細(xì)胞，重懸于30ml BMMY培養(yǎng)基中。加100％的甲醇至終濃度為0.5％，30℃250rpm培養(yǎng)36h，并每隔12h補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5％。并取上清進(jìn)行生物活性分析及SDS-PAGE電泳(見圖4SDS-PAGE分析mTFPI重組蛋白的表達(dá)，圖中l(wèi)ane1為mTFPI-pPic9-GS115培養(yǎng)上清；lane2為TFPI-pPic9-GS115培養(yǎng)上清；lane3為pPic9-GS115培養(yǎng)上清；lane 4為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))。
證明mTFPI重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量較TFPI重組蛋白的有較大提高(見圖5不同TFPI在畢赤酵母菌中的表達(dá))。
SEQ ID No.1gattctgagg aagatgaaga acacacaatt atcacagata cggagttgcc accactgaaa 60cttatgcatt cattttgtgc attcaaggcg gatgatggcc catgtaaagc aatcatgaaa 120agatttttct tcaatatttt cactcgacag tgcgaagaat ttatatatgg gggatgtgaa 180ggaaatcaga atcgatttga aagtctggaa gagtgcaaaa aaatgtgtac aagagataat 240
gcaaacagga ttataaagac aacattgcaa caagaaaagc cagatttctg ctttttggaa 300gaagatcctg gaatatgtcg aggttatatt accaggtact tctacaacaa tcagacaaaa 360cagtgtgaac gtttcaagta tggtggatgc ctgggcaata tgaacaattt tgagacactg 420gaagaatgca agaacatttg tgaagatggt ccgaatggtt tccaggtgga taattatgga 480acccagctca atgctgtgaa taactccctg actccgcaat caaccaaggt tcccagcctt 540tttgaatttc acggtccctc atggtgtctc actccagcag acagaggatt gtgtcgtgcc 600aatgagaaca gattctacta caattcagtc attgggaaat gccgcccatt taagtacagt 660ggatgtgggg gaaatgaaaa caattttact tccaaacaag aatgtctgag ggcatgtaaa 720aaaggtttca tccaaagaat atcaaaagga ggcctaatta aaaccaaaag aaaaagaaag 780aagcagagag tgaaaatagc atatgaagaa atttttgtta aaaatatg 828SEQ ID No.2AspSerGluGluAspGluGluHisThrIleIleThrAspThrGluLeuProProLeuLys15 10 15 20LeuMetHisSerPheCysAlaPheLysAlaAspAspGlyProCysLysAlaIleMetLys25 30 35 40ArgPhePhePheAsnIlePheThrArgGlnCysGluGluPheIleTyrGlyGlyCysGlu45 50 55 60GlyAsnGlnAsnArgPheGluSerLeuGluGluCysLysLysMetCysThrArgAspAsn65 7075 80AlaAsnArgIleIleLysThrThrLeuGlnGlnGluLysProAspPheCysPheLeuGlu85 90 95 100GluAspProGlyIleCysArgGlyTyrIleThrArgTyrPheTyrAsnAsnGlnThrLys105110115120GlnCysGluArgPheLysTyrGlyGlyCysLeuGlyAsnMetAsnAsnPheGluThrLeu125130135140GluGluCysLysAsnIleCysGluAspGlyProAsnGlyPheGlnVlaAspAsnTyrGly145150 155 160ThrGlnLeuAsnAlaVlaAsnAsnSerLeuThrProGlnSerThrLysVlaProSerLeu165170175180PheGluPheHisGlyProSerTrpCysLeuThrProAlaAspArgGlyLeuCysArgAla185190195200AsnGluAsnArgPheTyrTyrAsnSerVlaIleGlyLysCysArgProPheLysTyrSer205210 215 220GlyCysGlyGlyAsnGluAsnAsnPheThrSerLysGlnGluCysLeuArgAlaCysLys225230 235 240LysGlyPheIleGlnArgIleSerLysGlyGlyLeuIleLysThrLysArgLysArgLys245250255260LysGlnArgVlaLysIleAlaTyrGluGluI lePheVlaLysAsnMet265270 27權(quán)利要求
1.一種人類組織因子途徑抑制因子突變基因mTFPI，其特征是它具有序列表中SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列。
2.一種包括權(quán)利要求1突變基因的重組載體，其特征是將序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列用XhoI和EcoRI處理后與pPic9載體，加入T4連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，制成mTFPI-pPic9。
3.一種含有權(quán)利要求1的TFPI突變基因mTFPI的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，它是將mTFPI-pPic9導(dǎo)入到宿主畢赤酵母菌GS115，成為GS115/mTFPI-pPic9。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類組織因子途徑抑制因子突變基因mTFPI、包括該基因的重組載體及其宿主細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明，與野生型TFPI基因在畢赤酵母中表達(dá)的重組蛋白量相比，本發(fā)明的TFPI突變基因mTFPI在畢赤酵母中所表達(dá)的重組蛋白量有較大提高，從而可以大大降低大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)獲得該重組蛋白的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N15/67GK1920029SQ20061001565
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日
發(fā)明者冷希崗, 羅師平, 宋麗萍, 劉蘭霞, 余波 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所