專利名稱：：基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增的方法，尤其是基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法。技術(shù)背景核酸聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是由K.Mullis于1985年發(fā)明的一種DNA體外擴增技術(shù)，此技術(shù)可以在生物體外幾個小時內(nèi)將極微量的目的基因成百萬倍擴增，并能夠特異性擴增任何目的基因或DNA片斷。PCR技術(shù)是方法學(xué)上的一次革命，以其顯著的三大優(yōu)點特異性、高效率和忠實性對生命科學(xué)研究領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的影響。PCR被譽為無細胞分子克隆，其發(fā)明人于1992年獲諾貝爾獎。盡管PCR反應(yīng)已發(fā)展成為一項成熟技術(shù)，常規(guī)實驗中失誤率較小，但實際操作中，進行PCR擴增始終存在一些需要改進的問題。最突出的問題就是PCR擴增存在不同程度的非特異性。PCR作為一種體外模擬的生化反應(yīng)，機制非常復(fù)雜，在鏈式反應(yīng)過程中總是會發(fā)生一定程度的干擾副反應(yīng)，如引物模板可能錯配、引物結(jié)合形成二聚體等。這些副反應(yīng)在常規(guī)PCR擴增時對結(jié)果的影響不是很明顯，這是因為常規(guī)PCR擴增的模板數(shù)量較大，通常超過103以上，在指數(shù)級擴增的過程中模板擴增數(shù)遠遠大于副反應(yīng)產(chǎn)物的擴增數(shù)，非特異性擴增比例很低。但是在以下情形中的副反應(yīng)產(chǎn)物擴增則不能忽略，如從高度復(fù)雜的基因組模板中選擇性地擴增特異性的極低拷貝數(shù)DNA、擴增單分子DNA、擴增高GC含量DNA、擴增超長DNA片段、多重PCR擴增、一次擴增不完美而再擴增等。這些副反應(yīng)輕則引起非特異性擴增(在后續(xù)電泳檢測中表現(xiàn)為彌散拖尾條帶和非特異性條帶)，導(dǎo)致擴增效率不高；重則可能導(dǎo)致正常擴增反應(yīng)失敗。而提高PCR擴增的特異性不僅取決于引物序列的優(yōu)化設(shè)計，很大程度上也有賴于反應(yīng)體系和程序的優(yōu)化。多年以來人們對PCR反應(yīng)組分的優(yōu)化已經(jīng)做了大量的研究，如通過向反應(yīng)體系中加入甲酰胺、甘油、二甲基亞砜等，可以在一定程度上改善非特異性擴增問題，但在實際實驗和應(yīng)用中，有些效果并不很顯著，有些添加組分(比如二甲基亞砜)過多甚至抑制聚合酶的活性。經(jīng)對現(xiàn)有科技文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，美國專利(USPATENT)5，646，019公開了"一種利于引發(fā)擴增核酸模板的制備方法"，該方法是在PCR體系里加入了耐熱的單鏈結(jié)合蛋白(SSB，single-strandednucleicacidbindingprotein),SSB蛋白只結(jié)合單鏈DNA，但不結(jié)合雙鏈DNA，通過結(jié)合并抑制含有單鏈的非特異性片段的擴增，從而實現(xiàn)了PCR擴增的優(yōu)化。由于提取純化SSB蛋白技術(shù)復(fù)雜，試劑純度也要求很高，導(dǎo)致制備成本非常高，且商品化試劑盒非常昂貴，價格是常規(guī)PCR試劑的67倍；同時為了保持單鏈結(jié)合蛋白的生物活性，要求嚴格貯存于一20。C，并且其生物活性有較短的時間期限。納米金屬合金是用非晶合金再經(jīng)過處理后獲得直徑為10~20納米的微晶合金，也稱超微晶合金。由于這種特殊結(jié)構(gòu)，使得非晶合金具有一些獨特的性質(zhì)，本發(fā)明嘗試把納米金屬合金應(yīng)用應(yīng)用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增，并取得了良好的擴增效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法。該方法通過在PCR反應(yīng)體系中添加一定量的納米金屬合金以達到對DNA片段的有效擴增，此方法優(yōu)化效果顯著、制備簡便、成本低廉。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法，該方法包括以下步驟(1).納米金屬合金懸浮液的制備；(2).PCR體系的配置；(3).PCR體系的優(yōu)化；(4).PCR條件的設(shè)定與運行；(5).PCR產(chǎn)物檢測；其特征在于所述的PCR體系的優(yōu)化是指在PCR體系中添加納米金屬合金懸浮液。而且，所述的納米金屬合金懸浮液的制備方法為(1).先精確稱取已滅菌的納米金屬合金置于已滅菌的離心管中；(2).用移液器緩慢加入滅菌水；(3).于40KHz進行超聲波懸浮后即制成納米金屬合金懸浮液。而且，所述的納米金屬合金懸浮液濃度為10mg/mL，其所在PCR體系中的添加量與PCR體系的體積百分比為0.0210%。而且，所述的納米金屬合金為納米銀鉑合金、納米銀銅合金。而且，所述的PCR擴增包括常規(guī)PCR擴增、高度復(fù)雜的基因組模板中選擇性地擴增特異性的極低拷貝數(shù)DNA、擴增高GC含量PCR、長片段PCR和超長片斷PCR擴增、多重PCR擴增、單分子PCR擴增、以及一次擴增之后的再擴增。本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點是1.該基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法優(yōu)化效果顯著、制備簡便、成本低廉，具有較廣的應(yīng)用范圍，可以應(yīng)用于各種PCR擴增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基礎(chǔ)的其他生化方法，尤其適用于一些較難擴增類型的PCR方法諸如高度復(fù)雜的基因組模板中選擇性地擴增特異性的極低拷貝數(shù)DNA、擴增高GC含量PCR、長片段PCR和超長片斷PCR擴增、多重PCR擴增、單分子PCR擴增、以及一次擴增不完美或不足夠而需要再擴增等情形。2.本發(fā)明中使用的優(yōu)化PCR擴增的納米材料一納米金屬合金易于保存，可以長期保存在4'C，且不會失去活性；而且納米金屬合金易于從PCR反應(yīng)體系中分離，給后續(xù)的PCR產(chǎn)物處理及應(yīng)用帶來方便。3.該基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法簡單易于掌握，可廣泛推廣，對基因檢測與克隆、遺傳分析、臨床診斷、基因芯片以及新材料等領(lǐng)域有著潛在而巨大的應(yīng)用價值。圖1納米銀鉑合金對中長片斷PCR反應(yīng)的優(yōu)化擴增效果電泳圖；圖2納米銀銅合金對超長片斷PCR反應(yīng)的優(yōu)化擴增效果電泳圖；圖3納米銀鉑合金對高GC含量PCR擴增的優(yōu)化擴增效果電泳圖。具體實施方式本發(fā)明結(jié)合附圖通過以下實施例進一步詳述，但不局限于下述實施例。本發(fā)明所涉及的PCR技術(shù)的優(yōu)化方法是通過向PCR體系中添加納米金屬合金來實現(xiàn)的，其具體操作方法如下1.納米金屬合金懸浮液的制備納米金屬合金購買于Sigma公司，以配置濃度為(W/V)10mg/mL的納米金屬合金懸浮溶液為例，先精確稱取10mg已滅菌的納米金屬合金置于已滅菌的1.5mL的小離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水至體積為lmL，于40KHz進行超聲波懸浮，超聲時間根據(jù)懸浮狀況而定，一般應(yīng)保證均勻的懸浮狀態(tài)維持10min以上。采用的納米金屬合金包括納米銀鉑合金、納米銀銅合金及類似合金。2.PCR體系的配置PCR體系根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)，因待擴增DNA片斷的不同而各不相同。具體表現(xiàn)在dNTP、模板、Mg、引物的添加量應(yīng)根據(jù)不同的模板和不同的擴增片段長度來選擇。PCR反應(yīng)體系中的H20為雙蒸水及以上級別水，體系中水的添加量應(yīng)根據(jù)納米金屬合金懸浮液添加的體積量進行調(diào)整，即應(yīng)扣除相應(yīng)添加的納米金屬合金懸浮液的體積量。3.PCR體系的優(yōu)化將適量的納米金屬合金懸浮液加入PCR反應(yīng)體系當中進行PCR擴增，所述的適量是指在25pL的PCR反應(yīng)體系當中加入的優(yōu)化材料的用量為納米金屬合金蒸餾水懸浮液(10mg/mL)0.5^iL5^L。4.PCR條件的設(shè)定與運行PCR反應(yīng)條件中的預(yù)變性、變性及退火各階段的溫度和對應(yīng)時間應(yīng)根據(jù)不同模板和引物融解溫度來選擇；其中的延伸溫度根據(jù)所用聚合酶的合適溫度來選擇；其中的延伸時間根據(jù)所擴增片段的長度來選擇；其中的循環(huán)次數(shù)根據(jù)個人試驗?zāi)康暮托枰M行選擇。5.PCR產(chǎn)物的檢測對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，檢查擴增條帶，與對照體系進行比較。一般用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進行檢測，瓊脂糖凝膠的濃度及PCR產(chǎn)物的上樣體積需根據(jù)具體情況而定。所述的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)依照已有方法概括如下1)制備0.7%的瓊脂糖凝膠(含染色劑溴乙錠)；2)吸取不同樣本的PCR產(chǎn)物上電泳槽點樣，同時點分子量標記作為參照；3)加以45V/cm的電壓，電泳；4)凝膠成像系統(tǒng)紫外檢測分析結(jié)果。上述的納米金屬合金懸浮液濃度為10mg/mL,其所在PCR體系中的添加量與PCR體系的體積百分比為0.0210%。上述的PCR擴增包括常規(guī)PCR擴增、高度復(fù)雜的基因組模板中選擇性地擴增特異性的極低拷貝數(shù)DNA、擴增高GC含量PCR、長片段PCR和超長片斷PCR擴增、多重PCR擴增、單分子PCR擴增、以及一次擴增之后的再擴增，所述的一次擴增之后的再擴增是指一次擴增不完美或不足夠而需要再擴增的情形。實施例l納米銀鉑合金對PCR反應(yīng)的優(yōu)化，針對一些形成非特異性擴增的PCR擴增的優(yōu)化改進，擴增長度為4249bp的長片段，包括下列步驟1.納米銀鉑合金(silver-platinum)懸浮液的制備silver-platinum購買于Sigma公司，配置濃度為(W/V)10mg/mL的納米銀鉑合金懸浮液，先精確稱取lOmg已滅菌的納米銀鉑合金置于己滅菌的1.5mL的小離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水至體積為lmL,于40KHz進行超聲波懸浮10min。2.PCR體系的配置，具體組成如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其中，模板為J)NA，購自三博遠志生物工程公司，Taq酶購自三博遠志生物工程公司。共配置PCR體系4管，且從2到5編號。3.PCR體系的優(yōu)化從第2管到第5管分別依次加入納米銀鉑合金懸浮液0&，2.0nL,6.0nL,8.0^iL。最后用雙蒸水補足總體積為25pL。4.PCR條件的設(shè)定與運行利用PCR技術(shù)對模板分子進行擴增，擴增條件為93'C預(yù)熱2min，33個循環(huán)，每個循環(huán)包括93。C變性10s,58.rC退火30s，68'C延伸3min，最后68。C延伸10min。5.對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測-結(jié)果見圖1。目的片段為4249bp，從左至右1為分子量標記LambdaDNA/HindlII(MBI公司，由DNA片段由上至下為23，130bp、9,416bp、6，557bp、4，361bp、2，322bp、2，027bp、564bp以及125bp而構(gòu)成)2為普通反應(yīng)體系結(jié)果，3、4、5為普通反應(yīng)體系加入silver-platinum懸浮液的結(jié)果?？梢钥闯黾尤雰?yōu)化材料silver-platinum的體系PCR擴增結(jié)果中非特異性擴增極少，而相應(yīng)的未加入silver-platinum的常規(guī)PCR體系擴增結(jié)果顯示嚴重的后續(xù)拖尾，表明非特異性擴增嚴重。該PCR擴增結(jié)果顯示了本發(fā)明的優(yōu)化方法效果顯著。實施例2納米銀銅合金(silver-copper)對超長片段PCR擴增的優(yōu)化，針對超長片段PCR擴增的優(yōu)化改進，擴增長度為15000bp的長片段，包括下列步驟1.納米銀銅合金(silver-copper)懸浮液的制備silver-copper購買于Sigma公司，配置濃度為(W/V)10mg/mL的納米銀銅合金懸浮液，先精確稱取10mg已滅菌的納米銀銅合金置于已滅菌的1.5mL的小離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水至體積為lmL，于40KHz進行超聲波懸浮10min。2.PCR體系的配置，具體組成如下，<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中，模板為XDNA，購自三博遠志生物工程公司，Taq酶購自三博遠志生物工程公司。共配置PCR體系2管，且從2到3編號。3.PCR體系的優(yōu)化從第2管到第3管分別依次加入納米金屬合金懸浮液OpL，3.0nL。最后用雙蒸水補足總體積為25pL。4.PCR條件的設(shè)定與運行利用PCR技術(shù)對模板分子進行擴增，擴增條件為33個循環(huán)，93'C預(yù)熱2min，93'C變性10s，54.8。C退火30s，72。C延伸20min，最后72*€延伸10min。5.對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2。目的片段為15kb,從左至右1為分子量標記LambdaDNA/HindlII(MBI公司，由DNA片段由上至下為23，130bp、9，416bp、6，557bp、4，361bp、2，322bp、2，027bp、564bp以及125bp而構(gòu)成)2為普通反應(yīng)體系結(jié)果，3為普通反應(yīng)體系加入silver-copper的結(jié)果。以上反應(yīng)條件相同，可以看出2樣本擴增條帶出現(xiàn)較寬的非特異性擴增產(chǎn)物彌散等，3彌散明顯減輕，擴增質(zhì)量明顯改觀。實施例3silver-platinum對高GC含量PCR擴增的優(yōu)化，針對高GC含量擴增的優(yōu)化改進，擴增長度為2872bp的DNA分子，包括下列步驟1.納米銀鉑合金(silver-platinum)懸浮液的制備同實施例1。2.PCR體系的配置，具體組成如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>引物2(2闊3.75nL模板1^iL其中，模板為XDNA，購自三博遠志生物工程公司，T叫酶購自三博遠志生物工程公司。共配置PCR體系3管，且從2到4編號。3.PCR體系的優(yōu)化從第2管到第4管分別依次加入納米銀鉑合金懸浮液，3.0pL，4.0nL。最后用雙蒸水補足總體積為25^L。4.PCR條件的設(shè)定與運行利用PCR技術(shù)對模板分子進行擴增，擴增條件為33個循環(huán)，93'C預(yù)熱2min，93。C變性10s,54.8。C退火30s，72'C延伸20min,最后72'C延伸10min。5.對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3。從左至右2為常規(guī)PCR體系擴增結(jié)果；3、4為加入本發(fā)明優(yōu)化材料納米銀鉑合金懸浮液對高GC含量的PCR體系擴增結(jié)果。1為分子量標記(從上至下為23,130bp、9,416bp、6,557bp、4,361bp、2，322bp、2,027bp、564bp以及125bp)。可以看出2樣本擴增結(jié)果中有多條帶出現(xiàn)非特異性擴增或者產(chǎn)物拖尾等，3、4樣本條帶清晰，得到明顯優(yōu)化。權(quán)利要求1.一種基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法，該方法包括以下步驟(1).納米金屬合金懸浮液的制備；(2).PCR體系的配置；(3).PCR體系的優(yōu)化；(4).PCR條件的設(shè)定與運行；(5).PCR產(chǎn)物檢測；其特征在于所述的PCR體系的優(yōu)化是指在PCR體系中添加納米金屬合金懸浮液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法，其特征在于所述的納米金屬合金懸浮液的制備方法為(1).先精確稱取已滅菌的納米金屬合金置于已滅菌的離心管中；(2).用移液器緩慢加入滅菌水；(3).于40KHz進行超聲波懸浮后即制成納米金屬合金懸浮液。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法，其特征在于所述的納米金屬合金懸浮液濃度為10mg/mL，其所在PCR體系中的添加量與PCR體系的體積百分比為0.0210°%。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法，其特征在于所述的納米金屬合金為納米銀鉑合金、納米銀銅合金。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法，其特征在于所述的PCR擴增包括常規(guī)PCR擴增、高度復(fù)雜的基因組模板中選擇性地擴增特異性的極低拷貝數(shù)DNA、擴增高GC含量PCR、長片段PCR和超長片斷PCR擴增、多重PCR擴增、單分子PCR擴增、以及一次擴增之后的再擴增。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增的方法，是一種基于納米金屬合金的核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法。該方法是在現(xiàn)有的PCR擴增方法基礎(chǔ)上通過向體系中添加一定量的納米金屬合金懸浮液來實現(xiàn)的。此方法優(yōu)化效果顯著、制備簡便、成本低廉，具有較廣的應(yīng)用范圍，可以應(yīng)用于各種PCR擴增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基礎(chǔ)的其他生化方法，尤其適用于一些較難擴增類型的PCR方法，諸如從高度復(fù)雜的基因組模板中選擇性地擴增特異性的極低拷貝數(shù)DNA，擴增高GC含量的DNA、擴增單分子DNA，超長DNA片段擴增，多重PCR擴增，一次擴增不完美而再擴增等。文檔編號C12P19/00GK101153308SQ200610016039公開日2008年4月2日申請日期2006年9月28日優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日發(fā)明者張治洲,曹小紅,汪名春,群王,林賀申請人:天津科技大學(xué)