專利名稱：前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞psa基因表達(dá)的特異克隆分子及其克隆方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子及其克隆方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在美國前列腺癌占男性惡性腫瘤死亡率的第二位。雖然我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率比歐美國家低，但近年來有迅速上升的趨勢。而且隨著人口老齡化及飲食結(jié)構(gòu)的改變其發(fā)病率將會進(jìn)一步升高。
前列腺癌與前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)關(guān)系密切，多數(shù)前列腺癌患者無論早期或晚期均有PSA持續(xù)表達(dá)，高度表達(dá)者占90％以上，因此PSA已作為前列腺癌臨床診斷和治療監(jiān)測的敏感指標(biāo)之一。1985年得到PSA的cDNA克隆和定序，其基因位于染色體9q13.2，全長約為6kb，由5個(gè)外顯子和六個(gè)內(nèi)含子組成，可轉(zhuǎn)錄成1.6kb含五個(gè)外顯子mRNA。在基因啟動子的-640bp序列含有一個(gè)TATA盒(TATABox)TTTATA(-28--23)，一個(gè)GC盒(GC Box)GGGCGGAGT(-170--156)和一個(gè)雄激素應(yīng)答元件(ARE)AGAACAgcaAGTGCT(-170--156)。啟動子有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(+1-+7)，開放閱讀框架從+44開始。由于PSA幾乎只在前列腺組織中表達(dá)，該基因啟動子具有前列腺組織特異性，適用于構(gòu)建前列腺組織特異性載體，在產(chǎn)生PSA的前列腺癌細(xì)胞中選擇性表達(dá)治療基因。
雄激素及其受體在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。PSA的表達(dá)受雄激素調(diào)節(jié)，雄激素進(jìn)入前列腺上皮細(xì)胞后首先與細(xì)胞核內(nèi)雄激素受體(androgen receptor，AR)結(jié)合，引起AR構(gòu)象改變，隨后AR與熱休克蛋白解離，受體磷酸化形成二聚體，二聚體與PSA啟動子中雄激素應(yīng)答元件(ARE)結(jié)合，誘導(dǎo)PSA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。有些物質(zhì)可調(diào)節(jié)AR的表達(dá)，例如生長因子使AR增加五倍等。有研究發(fā)現(xiàn)雄激素非依賴的前列腺癌中AR同樣是非常重要的分子，其作用有待進(jìn)一步研究。
與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因有很多，但是由于PSA在前列腺癌表達(dá)的特異性最強(qiáng)，因此，欲判斷外源性藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞是否具有抑制作用時(shí)，可以考慮到尋找特異的靶標(biāo)基因PSA作為研究對象，并構(gòu)建含PSA啟動子的雄激素受體表達(dá)系統(tǒng)和熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，在重組質(zhì)粒中熒光素酶的表達(dá)受上游PSA啟動子序列的調(diào)節(jié)，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞后，熒光素酶活性的高低能夠直接反映啟動子作用的強(qiáng)度，依此來判斷外源性藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞是否有抑制作用、抑制程度如何以及是否主要通過對PSA的作用影響前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞。PSA啟動子基因序列的克隆可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，又稱體外酶促基因擴(kuò)增，是一種在體外模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的基因擴(kuò)增技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞PSA靶標(biāo)基因表達(dá)的特異性克隆分子及其克隆方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用所述特異克隆分子檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞是否有抑制作用及其作用是否與PSA相關(guān)方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的一種檢測前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子是以pGL3-Basic質(zhì)粒作為載體，該質(zhì)粒含有熒光素酶報(bào)告基因，PSA啟動子基因插入載體的Sac I和Kpn I酶切位點(diǎn)部位，并位于熒光素酶報(bào)告基因上游。
所述的pGL3-Basic質(zhì)粒也可以是pGL2-Basic質(zhì)粒。
本發(fā)明的一種檢測前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞PSA基因表達(dá)特異克隆分子的克隆方法由以下步驟組成(1)PCR擴(kuò)增PSA基因5’側(cè)啟動子中640bp的DNA片段；(2)擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)電泳純化后用限制性內(nèi)切酶Sac I和Kpn I消化，然后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶切割的pGL3-Basic質(zhì)粒上，DNA片段連至質(zhì)粒中熒光素酶基因上游而構(gòu)建重組質(zhì)粒，并命名為pGL3-PSA。
本發(fā)明的前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子在檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞抑制作用的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是1.與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因有很多，但是由于PSA在前列腺癌表達(dá)的特異性最強(qiáng)，因此，欲判斷外源性藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞是否有抑制作用時(shí)，以特異的靶標(biāo)基因PSA作為研究對象，構(gòu)建含PSA啟動子的雄激素受體表達(dá)元件和熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，在重組質(zhì)粒中熒光素酶的表達(dá)受上游PSA啟動子序列的調(diào)節(jié)，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞后，熒光素酶活性的高低直接反映了啟動子作用的強(qiáng)度，依此來判斷外源性藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞是否有抑制作用、抑制程度如何以及是否主要通過對PSA的作用影響前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞。
2.本方法提供的特異克隆分子及其應(yīng)用為研究或檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞的抑制作用及分子機(jī)制提供一個(gè)具有靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)的檢測平臺，能夠在外源性藥物抗腫瘤活性篩選方面推廣應(yīng)用。


圖1 pGL3-PSA重組質(zhì)粒圖譜示意圖。
圖1中1熒光素酶報(bào)告基因，2 SV40病毒多聚腺苷A標(biāo)記位點(diǎn)，3氨芐青霉素抗性標(biāo)記，4起始位點(diǎn)，5合成多聚腺苷A信號轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，6Kpn I酶切點(diǎn)，7 PSA啟動子，8雄激素應(yīng)答元件，9 Sac I酶切點(diǎn)。
圖2 pGL3-PSA酶切鑒定電泳圖。
圖2中M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1表示pGL3-PSA質(zhì)粒，2表示SacI和Kpn I對pGL3-PSA質(zhì)粒酶切鑒定。
圖3不同劑量的姜黃素處理LNCap細(xì)胞后熒光素酶活性測定值。
圖4不同劑量的槲皮素處理LNCap細(xì)胞后熒光素酶活性測定值。
圖5不同劑量的兒茶素處理LNCap細(xì)胞后熒光素酶活性測定值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
應(yīng)當(dāng)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法的部分，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或按照制造廠商所建議的條件。
以下是本發(fā)明的前列腺癌細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異分子克隆方法及特異克隆分子實(shí)施例實(shí)施例1(1)PCR擴(kuò)增PSA基因5’側(cè)啟動子中640bp的DNA片段PCR反應(yīng)體系50.0μL，其中含10xbuffer5.0μL，pGL3-640bp-PSA噬菌粒模板10ng2.5mmol/L，dNTPs4.0μL，Taq PlusI酶1.25u，正反向引物各2μL。
反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性94℃4min 完全延伸72℃ 10min(2)將擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)電泳純化后用限制性內(nèi)切酶Sac I和Kpn I消化，然后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶切割的pGL3-Basic質(zhì)粒上，所述連接體系為10.0μL，其中含10xbuffer1.0μL，pGL3-Basic載體25ng，T4連接酶1u，其余為蒸餾水，在環(huán)境溫度4℃下反應(yīng)得連接產(chǎn)物。DNA片段連至質(zhì)粒中熒光素酶基因上游，構(gòu)建重組質(zhì)粒并命名為pGL3-PSA，其圖譜如圖1所示。
(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，分離純化后，雙酶切和電泳鑒定后進(jìn)行基因測序其具體操作為取重組質(zhì)粒3.0μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽性重組子，從陽性重組子中小量提取pGL3-PSA重組質(zhì)粒，用于SacI和Kpn I雙酶切鑒定有無插入片段，其電泳圖見圖2，從圖2可以看出在pGL3-Basic載體中成功插入了PSA基因5’側(cè)啟動子中640bp的DNA片段。
隨后用Sac I和Kpn I雙酶切pGL3-Basic載體及pGL3-PSA特異克隆分子，玻璃奶回收純化PGL3-Basic載體，與純化后的目的基因克隆片段定向連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選重組質(zhì)粒，進(jìn)行基因測序，以便進(jìn)一步證明本方法所獲得的特異克隆分子基因序列的準(zhǔn)確性。
實(shí)施例2將實(shí)施例1中pGL3-Basic質(zhì)粒用pGL2-Basic質(zhì)粒替代，實(shí)施例2所有特異分子克隆方法與實(shí)施例1相同。
以下是本發(fā)明的前列腺癌細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子在檢測外源性中藥藥物應(yīng)用方面的實(shí)施例實(shí)施例1是前列腺癌細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子檢測姜黃素對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞抑制作用的實(shí)施例。
(1)脂質(zhì)體法將pGL3-PSA質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞，pRL-TK質(zhì)粒作為內(nèi)參照，內(nèi)參照與各表達(dá)質(zhì)粒的比值為1∶25；(2)轉(zhuǎn)染前1d，接種2×105個(gè)細(xì)胞于12孔板中，于環(huán)境溫度30C培養(yǎng)20h，待細(xì)胞匯合至93％，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次；(3)將步驟(1)所述比值的兩種質(zhì)粒1.1μg和3μL脂質(zhì)體LipofectaminTM2000在無血清培養(yǎng)基中混勻，室溫放置20min后加到前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞上，6h后換含血清培養(yǎng)基時(shí)在12孔板中分別加入濃度為0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L的姜黃素，其中0μmol/L的為4孔，其余濃度各2孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h收集細(xì)胞，測定熒光素酶活性，測定結(jié)果見圖3。
其中，對檢測結(jié)果有影響的主要是姜黃素濃度，劑量在0～50μmol/L范圍內(nèi)選擇，50μmol/L為最大非毒性劑量。
所述的熒光素酶活性的測定方法為(1)吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS(Na2HPO41.15g/L，KH2PO40.2g/L，NaCl8g/L，KCl0.2g/L，PH7.4)洗滌細(xì)胞1次，每孔加入100μL lxPLB(裂解緩沖液Passive Lysis Buffer)，輕輕晃動5min，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管內(nèi)。
(2)化學(xué)發(fā)光儀設(shè)置如下測量前延擱時(shí)間2s，測量時(shí)間10s，手動操作。
(3)在測量管中加入100μL LAR(熒光素酶分析試劑Luciferase AssayReagent)，吸取20μL細(xì)胞裂解液與之混勻，并放入發(fā)光儀，讀取樣品中載體攜帶的螢火蟲熒光素酶激發(fā)底物所釋放熒光的數(shù)值(M1)然后在同一測量管中加入100μL反應(yīng)終止劑Stop&GloReagent，混勻后讀取樣品中內(nèi)參照質(zhì)粒攜帶的水母熒光素酶激發(fā)底物所釋放熒光的數(shù)值(M2)。
(4)為消除轉(zhuǎn)染效率帶來的影響，以螢火蟲熒光素酶與水母熒光素酶活性的比值(M1/M2)表示熒光素酶重組質(zhì)粒的相對表達(dá)活性。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩均數(shù)間的差異性分析，p≤0.05認(rèn)為有顯著性差異。采用復(fù)孔處理，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
從圖3可以看出濃度為40μmol/L的姜黃素其螢火蟲熒光素酶與水母熒光素酶活性的比值(M1/M2)在0.1以下，對PSA基因5’側(cè)啟動子區(qū)640bp區(qū)域的抑制作用最強(qiáng)，即反映出姜黃素對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞有抑制作用最強(qiáng)。
實(shí)施例2是前列腺癌細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子檢測槲皮素對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞抑制作用的實(shí)施例。
本實(shí)施例的檢測方法同于實(shí)施例1，檢測結(jié)果如圖4所示，從圖4可以看出濃度為40μmol/L的槲皮素其螢火蟲熒光素酶與水母熒光素酶活性的比值(M1/M2)在0.1以下，對PSA基因5’側(cè)啟動子區(qū)640bp區(qū)域的抑制作用最強(qiáng)，即反映出槲皮素對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞有抑制作用最強(qiáng)。
實(shí)施例3是前列腺癌細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子檢測兒茶素對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞抑制作用的實(shí)施例。
本實(shí)施例的檢測方法同于實(shí)施例1，檢測結(jié)果如圖5所示，從圖5可以看出濃度為40μmol/L的兒茶素其螢火蟲熒光素酶與水母熒光素酶活性的比值(M1/M2)在0.1以下，對PSA基因5’側(cè)啟動子區(qū)640bp區(qū)域的抑制作用最強(qiáng)，即反映出兒茶素對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞有抑制作用最強(qiáng)。
各種酶均購自Takara公司；(1640培養(yǎng)液)RPMI1640為Hyclone產(chǎn)品；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)Dual-luceferase Reporter Assay System購自Promega公司；姜黃素(Curcurmin)購自Sigma公司；前期構(gòu)建并保存含PSA基因5’側(cè)啟動子區(qū)640bp序列(目的基因)的重組質(zhì)粒pGL3-640，質(zhì)粒pGL3-Basic、pRL-TK質(zhì)粒、脂質(zhì)體LipofectaminTM2000購自GIBCO公司；前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞LNCap由美國西部林業(yè)大學(xué)泌尿研究所Mayo Clinic/Foudation的Dr.Young實(shí)驗(yàn)室惠贈。
權(quán)利要求
1.一種前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子，是以pGL3-Basic質(zhì)粒作為載體，該質(zhì)粒含有熒光素酶報(bào)告基因，其特征在于PSA啟動子基因插入載體的Sac I和Kpn I酶切位點(diǎn)部位，并位于熒光素酶報(bào)告基因上游。
2.如權(quán)利要求1所述的特異克隆分子，其特征在于所述的pGL3-Basic質(zhì)粒也可以是pGL2-Basic質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求1所述的前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞PSA基因表達(dá)特異克隆分子的克隆方法，其特征在于由以下步驟組成(1)PCR擴(kuò)增PSA基因5’側(cè)啟動子中640bp的DNA片段；(2)擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)電泳純化后用限制性內(nèi)切酶Sac I和Kpn I消化，然后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶切割的pGL3-Basic質(zhì)粒上，DNA片段連至質(zhì)粒中熒光素酶基因上游而構(gòu)建重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子在檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞抑制作用的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種前列腺癌細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子及其方法和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。該前列腺癌細(xì)胞PSA基因表達(dá)的特異克隆分子是含有PSA啟動子的雄激素受體表達(dá)系統(tǒng)和熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒。利用該技術(shù)可以準(zhǔn)確地判斷外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞是否有抑制作用及其作用是否與PSA相關(guān)。本方法提供的特異克隆分子及其應(yīng)用為研究或檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞的抑制作用及分子機(jī)制提供一個(gè)具有靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)的檢測平臺，能夠在外源性藥物抗腫瘤活性篩選方面推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N15/64GK1995344SQ20061001618
公開日2007年7月11日 申請日期2006年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月20日
發(fā)明者楊磊, 呼文亮, 陳立軍, 王洪敏, 牟心紅, 靳秋月, 姚麗, 鎖江蕊, 謝紅, 王瑞岷, 王瑋, 程世翔, 樊嶸 申請人:中國人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)院