專利名稱：：水稻木質(zhì)素合成基因fc1及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種水稻木質(zhì)素合成基因FC1，同時(shí)還涉及該基因在水稻中的應(yīng)用。利用T-DNA標(biāo)簽(T-DNAtagging)技術(shù)從水稻軟稈突變體中克隆并鑒定了水稻木質(zhì)素合成基因FC1(flexibleculm)，該基因的失活造成植物莖桿強(qiáng)度的降低，出現(xiàn)易倒伏的性狀。通過(guò)共分離檢測(cè)表明T-DNA插入失活的基因與軟稈突變表型是共分離的。對(duì)該基因編碼的氨基酸序列分析證明該基因所編碼的蛋白是一個(gè)肉桂醛脫氫酶(Cinnamyl-alcoholdehydrogenase，CAD)，這個(gè)酶在植物木質(zhì)素的合成過(guò)程中起重要的作用。形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞學(xué)觀察進(jìn)一步證明，本發(fā)明克隆的基因具有調(diào)控植物細(xì)胞壁的厚度和植株莖稈的支撐力的功能。利用該基因可以提高農(nóng)作物的抗倒伏能力，提高水稻秸稈的利用率。
背景技術(shù)：
：植株莖稈的強(qiáng)度是植物，尤其是農(nóng)作物的重要農(nóng)藝性狀之一。而莖稈的強(qiáng)度又與莖稈組織中相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞壁厚度直接相關(guān)。細(xì)胞壁的主要成分包括果膠質(zhì)、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、多糖以及含羥脯氨酸的糖蛋白。植物細(xì)胞壁可以分為中膠層(胞間層)、初生壁和次生壁。中膠層粘合相鄰的細(xì)胞，主要由果膠質(zhì)構(gòu)成。初生壁是最先形成的細(xì)胞壁，正在生長(zhǎng)的細(xì)胞主要以初生壁保護(hù)和支撐它的原生質(zhì)體。次生壁是在細(xì)胞生長(zhǎng)完成后沉積而成的，它能增強(qiáng)細(xì)胞的強(qiáng)度，是莖桿強(qiáng)度的主要決定成分。次生壁主要由木質(zhì)素填充，其機(jī)械強(qiáng)度較高。木質(zhì)素是包圍在纖維組織細(xì)胞和厚壁組織細(xì)胞外的一類物質(zhì)。它與纖維素和半纖維素合稱為組成植物的“三素”。在木本植物中它的含量占大約27％-32％，草本植物中大約占14％-25％。木質(zhì)素在植物中的功能主要有以下幾個(gè)方面1)增加細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和防水性。植物在木質(zhì)化時(shí)，木質(zhì)素不僅可以以共價(jià)鍵的方式與細(xì)胞壁中的半纖維素相接，還可以同樣的方式和細(xì)胞壁蛋白相連，從而增加了細(xì)胞壁的強(qiáng)度和致密度；2)促進(jìn)水分的運(yùn)輸。由于有木質(zhì)素的參與植物細(xì)胞經(jīng)分化才能形成正常的微管系統(tǒng)，才能產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞壁，才能在有壓力的情況下遠(yuǎn)距離輸送水份；3)在植物防御體系中發(fā)揮重要作用。木質(zhì)素保護(hù)了細(xì)胞內(nèi)其他重要的成份，以免受到物理的、化學(xué)的和生物的破壞。同時(shí)木質(zhì)素的低分子量酚類前體以及多聚作用時(shí)產(chǎn)生的游離自由基可以破壞細(xì)菌的膜、酶和毒素，可以作為植物防衛(wèi)反應(yīng)的物質(zhì)來(lái)起作用(付偉等，植物體內(nèi)的木質(zhì)素，生物學(xué)通報(bào)，2004，3912-14)。在木質(zhì)素的合成過(guò)程中，很多酶參與了該生化途徑。木質(zhì)素是由香豆醇、松柏醇和介子醇等三種主要的木質(zhì)醇(monolignol)以多種不同的化學(xué)鍵連接而成的。木質(zhì)素前體(木質(zhì)醇)的生物合成是從苯丙氨酸開(kāi)始的。苯丙氨酸通過(guò)苯丙氨酸裂解酶脫氨(phenylalanineammonia-lyase，PAL)生成肉桂酸，這是苯基丙烷類物質(zhì)代謝的第一步，PAL是生物合成苯基丙烷類類化合物的一種關(guān)鍵酶。肉桂酸被4-羥化酶(C4H)羥基化后形成對(duì)香豆酸。對(duì)香豆酸在4-香豆酰輔酶A連接酶(4-Coumsrate-CoALigase，4CL)的作用下可轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酰輔酶A。這種化合物是合成類黃酮、1，2-二苯乙烯和其他苯基丙烷類物質(zhì)(包括木質(zhì)素)的前體。對(duì)香豆酸在肉桂酸-3羥化酶(cinnamate3-hdroxylase，C3H)的作用下，3位被羥基化生成咖啡酸，該羥基基團(tuán)在O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeateO-methyltransferase，COMT)的作用下可進(jìn)一步被甲基化生成阿魏酸。阿魏酸在阿魏酸5-羥化酶(ferulate5-hydroxylase，F(xiàn)5H)的作用下被羥基化形成5-羥基阿魏酸，5-羥基阿魏酸中5位的羥基被COMT甲基化后形成芥子酸。羥基肉桂酸可被合成位相應(yīng)的輔酶A硫酯。CoA硫酯在肉桂酰輔酶A還原酶的催化作用下被還原為相應(yīng)的醛。這些醛與肉桂醛脫氫酶(Cinnamyl-alcoholdehydrogenase，CAD)反應(yīng)被進(jìn)一步還原形成木質(zhì)醇，木質(zhì)醇就是木質(zhì)素的直接前體物質(zhì)。肉桂醛脫氫酶(CAD)在植物木質(zhì)素的合成過(guò)程中起很重要的作用，它催化木質(zhì)素前體-木質(zhì)醇生物合成的最后一步，同時(shí)在植物抵抗真菌浸染中也起重要的作用。植物一般通過(guò)產(chǎn)生各種酚類物質(zhì)來(lái)抵抗由于機(jī)械、化學(xué)以及病原誘導(dǎo)的損傷，這些酚類物質(zhì)也包括通過(guò)各種生化反應(yīng)從肉桂酸中得到的木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)。因此這些木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)很自然的就被植物用來(lái)合成酚類大分子，這些酚類大分子通過(guò)產(chǎn)生一個(gè)疏水的物理屏障來(lái)抵御病原入侵和增強(qiáng)損傷組織的機(jī)械強(qiáng)度(Vance等，Lignificationasamechanismofdiseaseresistance.AnnuRevPhytopathol.1980，18259-288)。由于木質(zhì)素在植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和修復(fù)機(jī)制上起很重要的作用，因此人們希望通過(guò)基因工程的方法改善木質(zhì)素的含量。例如，在造紙業(yè)制漿過(guò)程中通過(guò)化學(xué)的方法除去紙漿中的木質(zhì)素的過(guò)程是很昂貴的，而且會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重的污染，因此對(duì)植物木質(zhì)素的含量的改善可以使造紙工業(yè)受益很多(Boudet等，Ligningeneticengineering.MolBreeding.1996，225-39；Campbell等，VariationinLigninContentandComposition(MechanismsofControlandImplicationsfortheGeneticImprovementofPlants).PlantPhysiol.1996，1103-13)。再例如，在大豆種子的儲(chǔ)存過(guò)程中，木質(zhì)素單體通常會(huì)被多酚氧化酶氧化，從而使大豆和豆制品中混入比較難看的黃色。而這個(gè)現(xiàn)象也許就可以通過(guò)降低CAD酶的活性得到解決。通過(guò)調(diào)節(jié)植物體中CAD酶的含量來(lái)改變植物體內(nèi)木質(zhì)素的含量，已經(jīng)進(jìn)行了很多有益的嘗試。例如在煙草中進(jìn)行CAD的反義表達(dá)，雖然沒(méi)有使木質(zhì)素含量減少，但卻可導(dǎo)致木質(zhì)素中結(jié)合的肉桂醛的量增加(Halpin等，Manipulationofligninqualitybydown-regulationofcinnamyylalcohol-dehydrogenase.PlantJ.1994，6，339-350.)，并使這些轉(zhuǎn)基因植物的木質(zhì)部呈紅色，而且其中的木質(zhì)素在溫和的堿性條件下很容易被提取。分光光度分析表明，來(lái)自CAD缺乏煙草中木質(zhì)素的縮合程度降低，即交聯(lián)部位較少(Stewart等，F(xiàn)ourier-transforminfraredandRamanspectroscopicevidencefortheincorporationofcinnamaldehydesintotheligninoftransgenictobacco(NicotianatabacumL)plantswithreducedexpressionofcinnamylalcoholdehydrogenase，Planta，1997，201，311-318.)，這對(duì)提高植物組織的消化性有很大的作用(Vailhe等，Cellwalldegradabilityoftransgenictobaccostemsinrelationtotheirchemicalextractionandligninquality，J.Agric.FoodChem.1996，44，1164-1169.)。也有研究表明下調(diào)紫花苜蓿CAD可以導(dǎo)致木質(zhì)素組成發(fā)生相似的變化，消化性提高。這里所描述的肉桂醛脫氫酶基因?qū)儆谝粋€(gè)基因家族，因此通過(guò)同源序列可以找到來(lái)源不同物種的肉桂醛脫氫酶基因?，F(xiàn)在人們對(duì)在木質(zhì)素合成過(guò)程中起作用的基因有很大的興趣，因?yàn)檫@些基因可能可以用來(lái)控制木質(zhì)素的合成。因此，找到編碼在木質(zhì)素合成中起作用的酶的核苷酸序列，對(duì)研究木質(zhì)素的合成是很重要的，同時(shí)這也提供了一種利用遺傳學(xué)的手段來(lái)研究木質(zhì)素的合成以及控制細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的機(jī)制，而且還可以更好地理解植物自身防御和修復(fù)損傷的機(jī)制。水稻(Oryzasativa)是最重要的糧食作物之一，是全球近一半人口賴以生存的基本食糧，在我國(guó)有很大的種植面積。FC1基因的克隆為我們利用基因工程技術(shù)調(diào)控植物的抗逆能力，提高水稻秸稈的利用效率方面有很大的作用。同時(shí)在相關(guān)領(lǐng)域，如林業(yè)、造紙方面也會(huì)起到很多積極的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種水稻木質(zhì)素合成基因FC1，有效地提高了水稻的抗倒伏能力，提高了水稻秸稈的利用效率。本發(fā)明提供了FC1基因的核苷酸序列和氨基酸序列，包括SEQIDNO1所示的DNA序列，也包括與SEQIDNO1所示的DNA序列至少有50％同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物，還含具有相同功能并能達(dá)到本發(fā)明目的的基因序列。本發(fā)明中的SEQIDNO2所示的蛋白質(zhì)屬於肉桂醛脫氫酶，其中進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替換、插入或缺失氨基酸可以獲得功能類似物。該基因的失活可以導(dǎo)致植物莖桿強(qiáng)度的降低，出現(xiàn)易倒伏的性狀。該基因?yàn)檎{(diào)節(jié)植物莖桿的機(jī)械強(qiáng)度、提高禾本科植物的秸稈利用率提供了一個(gè)有用的技術(shù)途徑。本發(fā)明還涉及一種水稻木質(zhì)素合成基因FC1在調(diào)節(jié)水稻莖桿強(qiáng)度中的應(yīng)用，這種調(diào)節(jié)的方法可以是通過(guò)提高或者是降低FC1的表達(dá)。本發(fā)明還提供了一種用FC1基因進(jìn)行高效植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種含有SEQIDNO1所示序列的基因或該基因的部分類似功能片段的載體，其中pCFC1，該載體可以表達(dá)由上述核酸序列編碼的多肽或同源類似物。本發(fā)明還提供了一種含有以上表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞。將本發(fā)明所描述的基因失活可以得到莖桿軟化的水稻，可以降低其中的木質(zhì)素含量，而且可以提高秸稈利用率，此方法切實(shí)可行。具體應(yīng)用可以使用T-DNA插入的方法，或者使用其他使基因失活的方法，如基因敲除等。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施本發(fā)明是使用T-DNA標(biāo)簽的技術(shù)進(jìn)行基因的分離和克隆。使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ.1994，6271-282)得到了大量的有T-DNA插入標(biāo)簽的水稻粳稻品種中花11號(hào)株系，轉(zhuǎn)化使用的載體是pFX-E24.2-R15(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35418-27.)，本文所述的突變體就是在這個(gè)突變體庫(kù)中通過(guò)篩選得到的。篩選方法如下所述，T-DNA轉(zhuǎn)化植株當(dāng)代為T(mén)0代，由T0代種子經(jīng)過(guò)浸種、催芽后得到T1代植株，將此T1植株按5寸×8寸的間距種植于水稻田，按常規(guī)的水稻種植方法(王維金等，作物栽培學(xué)，1998，76-127)進(jìn)行田間管理。通過(guò)觀察篩選得到了表型穩(wěn)定的水稻軟稈突變體，將此突變體命名為fc1，該突變體與正常植株相比莖桿、葉片機(jī)械強(qiáng)度降低，植株略矮，并且容易倒伏，如圖1所示。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)表明fc1是一個(gè)符合單基因控制遺傳規(guī)律的隱性突變體。采用TAIL-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)(Liu等，ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics1995，25，674-681.)的方法分離得到了這個(gè)株系的側(cè)翼序列，進(jìn)行序列分析表明該株系的T-DNA插入在水稻第4染色體上，插入位點(diǎn)所在片斷在公共核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登陸號(hào)為AL731610.4，日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06含有AL731610.4的部分核苷酸片斷。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，這個(gè)T-DNA的插入造成了一個(gè)木質(zhì)素合成基因肉桂醛脫氫酶(CAD)基因內(nèi)。根據(jù)分離得到的側(cè)翼序列在基因組中設(shè)計(jì)引物，所設(shè)計(jì)的引物位于T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)，通過(guò)PCR(polymerasechainreaction)檢測(cè)驗(yàn)證了這個(gè)T-DNA序列的插入和突變表型是共分離的，從而確定了就是這個(gè)基因的失活造成了這種突變表型的出現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有FC1基因具有影響植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度的功能，因此它的發(fā)現(xiàn)使得應(yīng)用基因工程技術(shù)調(diào)控植物莖稈的支撐力、葉片、葉鞘細(xì)胞壁的厚度成為可能，而且對(duì)調(diào)控植物的抗逆能力，提高水稻秸稈的利用效率方面有很大的作用。同時(shí)在相關(guān)領(lǐng)域，如林業(yè)、造紙方面也會(huì)起到很多積極的作用。圖1.水稻軟稈突變體fc1的表型圖。左邊是野生型，右邊是突變體。圖2.插入基因的結(jié)構(gòu)和T-DNA插入位點(diǎn)分析圖。起始密碼(ATG)和終止密碼(TGA)已經(jīng)標(biāo)出，黑色方框表示FC1基因的編碼區(qū)，白色方框表示了5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)。方框之間的線條表示內(nèi)含子，T-DNA插入在第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)。a，b，c分別表示用來(lái)驗(yàn)證共分離的引物。圖3.檢測(cè)基因型的結(jié)構(gòu)示意圖。a表示在T-DNA插入位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)的引物，b表示在插入位點(diǎn)T-DNA下游設(shè)計(jì)的引物，c表示根據(jù)T-DNA末端序列設(shè)計(jì)的引物。在T1代植株中，若為T(mén)-DNA插入位點(diǎn)純合單株，由于T-DNA片段為10Kb以上，因此a與b配對(duì)的PCR擴(kuò)增為陰性，但a和c配對(duì)可以擴(kuò)增得到一個(gè)0.8Kb的產(chǎn)物。若擴(kuò)增位點(diǎn)為沒(méi)有T-DNA的插入的野生型單株，由于沒(méi)有c引物結(jié)合的位點(diǎn)，則只有a和b配對(duì)是可以得到一個(gè)1.0kb的產(chǎn)物。而對(duì)于T-DNA插入位點(diǎn)雜合單株，則在a和c配對(duì)以及a和b配對(duì)時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。圖4.20株T1代植株的PCR檢測(cè)T-DNA插入位點(diǎn)基因型結(jié)果圖。根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，判斷1、3、7、8、13、16是T-DNA插入位點(diǎn)純合單株，2、4、6、9、10、12、14、18、19、20是T-DNA插入位點(diǎn)雜合單株，5、11、15、17是野生型單株。圖5.突變體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)特性圖。fc1突變體和野生型的株高和含水量測(cè)定。圖5a株高測(cè)定，突變體與對(duì)照相比矮化大約30厘米。圖5b含水量測(cè)定，突變體的含水量和野生型相比提高8.6％。圖6.fc1突變體與野生型木質(zhì)素染色結(jié)果圖，使用間苯三酚染色，顯微鏡下放大400倍觀察結(jié)果。圖6a.突變體莖桿橫切，圖6b.野生型莖桿橫切，圖6c.突變體葉片橫切，圖6d.野生型葉片橫切。圖7.fc1突變體與野生型莖桿機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果圖，突變體莖桿第一節(jié)間的平均折斷力為22N，野生型莖桿第一節(jié)間的平均折斷力為105N。圖8.互補(bǔ)試驗(yàn)使用的載體pCFC1示意圖。使用限制性內(nèi)切酶HindIII從BAC克隆OSJNBa0022K06上切下一個(gè)8.8kb的核酸片段，這個(gè)核酸片段包含完整的FC1基因ORF區(qū)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、水稻材料水稻(Oryzasativa)T-DNA插入突變體fc1(flexibleculm)來(lái)自原始野生型材料為“中花11”粳稻品種。此突變體的獲得是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化得到了大量的有T-DNA插入標(biāo)簽的中花11號(hào)株系，轉(zhuǎn)化使用的載體是pFX-E24.2-R15(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35(3)418-27)，本文所述的突變體就是在這個(gè)突變體庫(kù)中通過(guò)篩選得到的。篩選方法如下所述，轉(zhuǎn)化植株當(dāng)代為T(mén)0代，T0代植株種子經(jīng)過(guò)浸種、催芽后得到T1代植株，將此T1植株5寸×8寸的間距種植于水稻田，按常規(guī)的水稻種植方法進(jìn)行田間管理。通過(guò)篩選得到了表型穩(wěn)定的水稻軟稈突變體(fc1)，該突變體與正常植株相比莖桿、葉片機(jī)械強(qiáng)度降低，植株變矮，并且容易倒伏。2、T-DNA插入側(cè)翼序列的分離使用TAIL-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)的方法分離得到了這個(gè)突變體的T-DNA側(cè)翼序列。具體操作步驟如下取fc1突變體幼嫩的葉片，使用CTAB法(Liu等，Agenome-widearnalysisofwidecompatibilityinriceandpreciselocationofs5locusinthemolecularmap.TAG，1997，95809-814)抽提其總DNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)轉(zhuǎn)化載體pFX-E24.2-R15的T-DNA左側(cè)末端設(shè)計(jì)的嵌套式特異引物序列和引物在載體上對(duì)應(yīng)的位置如下(后面的數(shù)字表示引物在載體上的位置)LSP25’-GAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC-3’6701-6677；LBT25’-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT-3’6550-6524；LBT35’-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3’6447-6420。用于分離側(cè)翼序列的簡(jiǎn)并引物及其序列為AD2a5’-(AGCT)GTCGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GAA-3’。反應(yīng)體系為第一輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2mMdNTP2.0μl；25mMMgCl22.0μl；10μMLSP20.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaq，Takara公司)1U；加ddH2O至20μl。第二輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2mMdNTP2.0μl；25mMMgCl22.0μl；50％甘油2.0μl；10μMLBT20.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaq，Takara公司)1U；加ddH2O至20μl。第三輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2MmdNTP1.5μl；25MmMgCl21.2μl；50％甘油2.0μl；10μMLBT30.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaq，Takara公司)1U；加ddH2O至20μl。反應(yīng)程序按照Liu的方法進(jìn)行(Liu等，ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics1995，25，674-681.)。反應(yīng)完成后，取第三輪反應(yīng)產(chǎn)物5μl在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。挑出有有效擴(kuò)增的剩余產(chǎn)物5μl用去磷酸化酶(SAP，Takara公司)和核酸外切酶(ExoI，NEB公司)消化，消化產(chǎn)物取2μl使用美國(guó)PerkinElmer公司的測(cè)序試劑盒(BigDyeKit)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物使用DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定(ABI377Sequencher)，測(cè)序引物序列和在載體上的位置為NTLB55’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’6437-6418，具體操作按操作手冊(cè)進(jìn)行(PE公司)。得到序列后，采用BLAST分析方法(Altschul等，GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.1997，253389-3402)將這條側(cè)翼序列與公共核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色體位置的水稻基因組序列進(jìn)行比較分析，定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)這條側(cè)翼序列定位于水稻4號(hào)染色體，位于GenBank中的登陸號(hào)為AL731610.4的克隆中，插入位點(diǎn)是87249，日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06含有AL731610.4的部分核苷酸片斷，通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，這個(gè)T-DNA的插入造成了一個(gè)木質(zhì)素合成基因肉桂醛脫氫酶(CAD)基因的失活。分離得到的側(cè)翼序列如下tacgtgccattccgaatcaaagcgagccgcaatgtgtattagagttgtctaagcgtcatatggggtttacaccacattactagcattttactgagccttaaccttttagcagaactgcagtggttattacttcagcattgagagttcagactctcaagtacacaagaagagagagcctaaacaccttgcttcacctcccaagattttaactaagccatgaactggtagaactgaaatttttcttttattttgctttccctttggttctccattatgactagcaaaaacaccgtatccagcagggccatcagggtacatttgcttacgctgatgaggtggagcgtatgccatgccattgggtgctagttgtgacgttccgtttggcattacaaaaatacctgctggcactgggcaaatagcgtgaatgctggattgcttggaatagttatgaacaggccactggaggcaacatattatggagagaaaccatggtcgatattggcaacgccgttttggataatggcaaattcatgctgggggtacttttggggggcactggggtgctcgagttgttgctgttaacagaaatgtgtctta3、T-DNA插入側(cè)翼序列與突變表型的共分離檢測(cè)。為了研究T-DNA的遺傳分離，將T-DNA標(biāo)記的水稻T1代植株進(jìn)行田間種植，并且進(jìn)行了基因型的檢測(cè)。從總共20株T1代的幼嫩葉中提取的基因組DNA(CTAB法)用作基因型分析，以確定它們?yōu)榧兒匣螂s合體。PCR反應(yīng)條件先94℃3分鐘變性，然后94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1.5分鐘，總共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。下述引物a、b和c用于PCR反應(yīng)。引物a(FC1基因特異性基因組正向引物)5’-GCGACCATTCTGGCTGTGAT-3’引物b(FC1基因特異性基因組反向引物)5’-AACCTGAAACGGCGGTAGTG-3’引物c(T-DNA邊緣特異性反向引物)5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’如圖2的示意圖所示，引物a是來(lái)源于FC1基因內(nèi)含子的正向引物，引物b是來(lái)源于FC1基因內(nèi)含子的反向引物。引物c是來(lái)源于T-DNA邊界區(qū)域的反向引物。T1代純合植株只有引物a和c組合可以得到一個(gè)0.8kb的PCR片段，這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)引物a和b組合擴(kuò)增由于片段太大而不能擴(kuò)增DNA片段(14.3kb)(圖3)。野生型植株由于在基因組中沒(méi)有T-DNA插入，因此能夠利用引物a和b的組合來(lái)得到一個(gè)1.0kb的PCR片段，而不能有引物a和c組合的PCR片段。雜合的T1代植物則可以分別通過(guò)ac和ab的組合來(lái)得到0.8kb和1.0kb的PCR擴(kuò)增物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。在基因型的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，泳道1、3、7、8、13、16是T-DNA插入位點(diǎn)純合基因型單株，而泳道2、4、6、9、10、12、14、18、19、20為T(mén)-DNA插入位點(diǎn)雜合基因型單株，5、11、15、17為該位點(diǎn)不含T-DNA插入的野生型單株。在進(jìn)行田間種植時(shí)發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入位點(diǎn)純合單株，也就是1、3、7、8、13、16這幾個(gè)單株在田間出現(xiàn)了半矮、易倒伏的田間表型，而其他的植株都表現(xiàn)出正常的表型。這個(gè)結(jié)果證明T-DNA插入與突變表型共分離，而且突變體是由于這個(gè)T-DNA插入造成的單位點(diǎn)隱性突變。將T1代植株的子代種植得到T2代，將T2代再次種植到田間進(jìn)行表型與T-DNA共分離的分析，分析發(fā)現(xiàn)T1代T-DNA插入位點(diǎn)純合突變體的子代(T2代)不再分離，表型一致，T1代T-DNA插入位點(diǎn)雜合突變體的子代(T2代)出現(xiàn)了正常植株和突變植株，正常植株和突變植株的比例是3∶1，使用同樣的方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明T-DNA的插入與突變表型仍然是共分離的。由此確證，這個(gè)突變體是由于這個(gè)T-DNA插入造成的單位點(diǎn)隱性突變。4、對(duì)fc1突變體的表型分析。在正常田間種植條件下，fc1突變體與野生型相比，株型略矮，葉片與莖桿的機(jī)械強(qiáng)度也降低了(圖1)。在水稻成熟期對(duì)株高進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)突變體比野生型矮約30厘米。對(duì)突變體和對(duì)照的含水量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，突變體的含水量和野生型相比提高8.6％(圖5)。含水量的具體測(cè)定方法如下將突變體和對(duì)照于正常田間條件進(jìn)行種植，待生長(zhǎng)到成熟期，取突變體和對(duì)照的莖桿活體秤其鮮重M1，然后把莖桿放于烘箱中于80℃烘至衡重，然后再秤其干重M2，(M1-M2)/M1則為植株的含水量。通過(guò)對(duì)突變體和野生型植株的組織切片表明，和野生型相比，在突變體的外皮層厚壁組織細(xì)胞中，木質(zhì)素的含量出現(xiàn)了顯著的降低，而且厚壁組織細(xì)胞的加厚不如野生型那樣多，因此導(dǎo)致突變體的莖桿機(jī)械強(qiáng)度比野生型有顯著的降低。在葉片中也出現(xiàn)了類似的情況，突變體的木質(zhì)素著色較少(圖6)，使突變體的葉片比野生型明顯要軟。染色方法使用間苯三酚進(jìn)行木質(zhì)素染色，間苯三酚主要對(duì)木質(zhì)素中的醛類物質(zhì)特異性染色，反應(yīng)中染色的深淺一般定性地反映木質(zhì)化部位的木質(zhì)素總含量。具體操作如下，取突變體和野生型植株的第二節(jié)的節(jié)間，使用FAA固定液固定24小時(shí)，然后對(duì)固定的組織進(jìn)行徒手切片，得到大約20μm厚的切片，將切片使用2％的間苯三酚溶液染色2分鐘，然后在玻片上加入一滴濃鹽酸進(jìn)行顯色1分鐘，然后于光學(xué)顯微鏡(Olympus，Japan)下放大400倍進(jìn)行觀察。使用微力材料試驗(yàn)機(jī)(Instron5848MicroforceTester)對(duì)突變體和對(duì)照的機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定時(shí)分別取突變體和對(duì)照的主莖的第一節(jié)，從第一節(jié)上截取5cm長(zhǎng)的一段，使用微力材料試驗(yàn)機(jī)的夾具夾住材料的兩端，然后進(jìn)行拉伸，讀取將試驗(yàn)材料拉斷所需要的力。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體的莖桿機(jī)械強(qiáng)度與對(duì)照相比有很顯著的降低(圖7)。5、基因的分析。根據(jù)BLAST(Altschul等，GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.1997，253389-3402)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FC1基因編碼的蛋白質(zhì)與肉桂醛脫氫酶(CAD)有60％同源性。將這個(gè)基因的序列在日本全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中進(jìn)行搜索，找到了這個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA，克隆編號(hào)是AK102452，這個(gè)全長(zhǎng)cDNA有1329bp，功能預(yù)測(cè)是一個(gè)肉桂醛脫氫酶(CAD)基因。這個(gè)全長(zhǎng)cDNA的序列如下GGCATAGACCTAGCCAGCTAGCAACCGACAAGCCAAGGCGACGGCAATGGCGCCGACGACGACGGCCACGGCGGCGGCGGAGCAGGCGCCGCCGCCGCAGCATACGAGGAAGGCGGTGGGGCTCGCCGCGCACGACGACTCCGGCCACCTCACACCCATCCGCATCTCGCGCAGGAAAACTGGAGATGACGACGTCGCTATAAAGGTGCTGTACTGTGGGATTTGTCACTCTGACCTGCACACCATCAAGAATGAGTGGAGAAACGCTGTCTACCCAGTTGTTGCAGGGCACGAGATCACCGGGGTGGTGACCGAGGTGGGGAAGAACGTGGCGAGGTTCAAGGCCGGCGACGAGGTCGGCGTCGGGTGCATCGTGAACACCTGCGGCGGCTGCGAGAGCTGCCGGGACGGCTGCGAGAACTACTGCTCCGGCGGGGTCGTCTTCACCTACAACTCCGTCGACCGGGACGGCACGCGCACCTACGGCGGCTACTCCGACGCGGTGGTCGTCAGCCAGCGCTTCGTCGTGCGCTTCCCCTCCTCCGCCGGCGGCGGCGCCGGCGCCGCGCTGCCGCTGGACAGCGGCGCGCCGCTGCTGTGCGCCGGGGTGACGGTGTACGCGCCGATGAGGCAGCATGGGCTGTGCGAGGCCGGGAAGCACGTCGGCGTGGTGGGGCTCGGCGGGCTCGGCCACGTCGCCGTCAAGTTCGCCAGGGCGTTCGGGATGAGGGTGACGGTGATCAGCACGTCGCCGGTGAAGAGGCAGGAGGCCCTGGAGAGGCTCGGCGCCGACGGCTTCATCGTCAGCACCAACGCCAGTGAGATGAAGGCTGCGATGGGCACCATGCATGGCATCATCAACACGGCCTCTGCAAGCACATCCATGCACTCTTACCTGGCACTCTTGAAGCCCAAGGGCAAGATGATCTTGGTTGGCCTGCCTGAGAAGCCTCTCCAGATCCCAACCTTCGCTTTGGTTGGAGGGGGCAAGATACTAGCTGGGAGCTGCATGGGGAGCATCAGTGAAACGCAGGAGATGATCGACTTCGCCGCCGAGCACGGGGTGGCCGCCGACATCGAGCTGATCGGCGCCGACGAGGTGAACACGGCCATGGAGCGCCTCGCCAAGGGCGACGTCAGGTACCGCTTCGTCGTCGACATCGGCAACACCCTCAGGTCGGATTGACTAGGGAGCTCACTGTCACTGGTCTCAGCTCTGTAGCATACCGGACCTGCAATCCTGCAAAGTAGTGCAATCTTCTTGCTACAAGACATACATATCACCTCTACTTGGTGTCAATAAATGTAGCAAAAGAGGTACATTGTTGT實(shí)施例2轉(zhuǎn)化植物(水稻為例)提取日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06質(zhì)粒5μg，使用限制性內(nèi)切酶HindIII(Takara公司)完全消化質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物使用0.8％瓊脂糖凝膠電泳(40V，10小時(shí))，挖取8.8kb的DNA片斷回收。取回收產(chǎn)物100ng，與經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶HindIII(Takara公司)消化過(guò)的雙元載體pCABIA2301(http://www.cambia.org)50ng使用T4DNA連接酶(NEB公司)于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)，pCAMBIA2301載體由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoIntemationalAgriculture)惠贈(zèng)。反應(yīng)進(jìn)行16小時(shí)后，取連接產(chǎn)物2μl電轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli)感受態(tài)細(xì)胞DH10B(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行蘭白斑篩選。挑取白色轉(zhuǎn)化子，使用FC1基因特異的引物a和b組合進(jìn)行PCR陽(yáng)性克隆的篩選，PCR反應(yīng)條件先94℃5分鐘變性，然后94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1.5分鐘，總共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。獲得了用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pCFC1(圖7)，這個(gè)核酸片段包含完整的FC1基因ORF區(qū)，將這個(gè)質(zhì)粒20ng通過(guò)電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化fc1突變體(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ，1994，6271-282)的愈傷組織，同時(shí)將不含F(xiàn)C1基因的空載體轉(zhuǎn)化FC1突變體愈傷組織，得到的轉(zhuǎn)基因植株作為對(duì)照。本發(fā)明共獲得獨(dú)立的轉(zhuǎn)FC1基因水稻植株60株，PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為51株，轉(zhuǎn)空載體的轉(zhuǎn)基因植株32株。結(jié)果轉(zhuǎn)空載體的轉(zhuǎn)基因植株全部表現(xiàn)為軟桿，而陽(yáng)性的轉(zhuǎn)FC1基因水稻植株有41株表型恢復(fù)了正常，而陰性的轉(zhuǎn)FC1基因水稻植株仍然表現(xiàn)為軟桿，部分轉(zhuǎn)基因莖桿機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表2。由此可見(jiàn)，通過(guò)基因互補(bǔ)轉(zhuǎn)化，F(xiàn)C1基因使FC1突變體的軟桿表型得到了恢復(fù)，更進(jìn)一步的證明了FC1基因具有控制水稻莖桿強(qiáng)度的功能。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫(xiě)6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧芐青霉素)；KT(Kinetin，激動(dòng)素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；G418(卡拉霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)(2)組織培養(yǎng)的溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然后20-25℃下定容至1000ml。2)N6mix母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g20-25℃下下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個(gè)大三角瓶中加/入300ml蒸餾水并加熱至70℃，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素B1(ThiamineHCl)0.1g維生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g20-25℃下溶解并定容至1000ml。6)MSmix母液(100X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g20-25℃下溶解并定容至1000ml。7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，20-25℃下保存。8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，20-25℃下保存。9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?0)IAA貯存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?3)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，20-25℃下保存?zhèn)溆谩?4)KT貯存液(1mg/ml)KT100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。(3)培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X)5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)1ml2，4-D貯存液0.2mlCH0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μlAS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液50μlIAA貯存液50μlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液2mlNAA貯存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10)LA培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基不含瓊脂粉)蛋白胨2.5g酵母粉1.25g氯化鈉2.5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝于500ml三角瓶，滅菌后20-25℃保存?zhèn)溆谩?4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟4.1愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度24-26℃。4.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度24-26℃。4.3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度24-26℃。4.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。4.5農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。4.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(G418篩選濃度為50μm)4.7分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)(20001x)，溫度26℃。4.8生根(1)拔出分化好的幼苗，剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。4.9移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。表1.FC1突變體和對(duì)照莖桿強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果p＝0.00091，t＝8.8247，t0.05＝4.6041，平均值＝樣品平均折斷力±標(biāo)準(zhǔn)偏差表2.T0代轉(zhuǎn)基因植株莖桿強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果注MpC1-1到MpC1-10這10株是使用PC1301空載體轉(zhuǎn)化突變體愈傷所得到的植株，MpCFC1-1到MpCFC1-20這20株是使用互補(bǔ)載體pCFC1轉(zhuǎn)化突變體愈傷所得到的植株，*表示沒(méi)有數(shù)據(jù)。SEQ.IDNo.1<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻木質(zhì)素合成基因FC1及用途<130><140><141><160>2<170>PatentInversion3.1<210>1<211>4106<212>DNA<213>Oryzasativa<220><221>CDS<222>(47)..(174)<223><220><221>CDS<222>(1696)..(1809)<223><220><221>CDS<222>(2371)..(2911)<223><220><221>CDS<222>(3506)..(3659)<223><220><221>CDS<222>(3761)..(3960)<223><400>1ggcataaacctagccagctagcaaccgacaagccaaggcgacggcaatggcgccg55MetAlaPro1acgacgacggccacggcggcggcggagcaggcgccgccgccgcagcat103ThrThrThrAlaThrAlaAlaAlaGluGlnAlaProProProGlnHis51015acgaggaaggcggtggggctcgccgcgcacgacgactccggccacctc151ThrArgLysAlaValGlyLeuAlaAlaHisAspAspSerGlyHisLeu20253035acacccatccgcatctcgcgcaggtatgaacagccaaccgtataccgctccat204ThrProIleArgIleSerArgArg40gctaagaggatctttgtcgtgctcgatgattgctcgatgattctcccgcgccatggcgcc264attgatgggagattgggagacatatggagcttttttttttctctccagagtttaagatga324tctatcgtgtttgaatttgactgttactctcgtagcaacaatagtttacaggatgtccac384atcgaattagtgaaaatcgccgtttggttcatggagttaatagaatctgaagctctcatg444agccagcgtcacttgagctttcgatttttgttttccccttccatttccagtcatttccag504ccttctcatcggatttgtagattgtagttttgcatttgatttccctgcgagcaacggtgc564tcagcatttgcacatcgaatttcggtcatccatgtgcaaaggaagcaaaattcaccactt624tttgaaactgttcttttttaaaaatcttttagagaagtgtatttattacctggcctcgtt684caaccggatatatgcagccatttaaattggttctgaaactgttcttgatcaaatggagta744tctcaaccaagccctttcgtgccaaatcaacaaacaacagcaaaatctttccccagacgt804ctacagtacaaaaaccctgaccatccagcaccagccagcgctggctcactgacctgcagc864aaccagctttaaaaaccatgcgcatttgcagcacgtattctgtaccaggaatacgggatc924cgtcagatctcaactgcaaggcaccctttcttcaattgtttttggtggtgagttaatact984gttcaacagtgaccatactgggcatgcctcagctgcaagaatttatggtgctcgatcgct1044actacgtcatccatcttcttttcatgtgcgaccattctggctgtgattggctggctgctg1104ctgtcaaagtaacaggagtgatttactttcacagtctggttgtatggtacataattcagt1164tatccttctggaatctgaactcctcctggcttagtcatagcagtaaaaatgttcattcaa1224gaaacaggctttcaagcagtaggcggcttgctgcacatggcttgtttttgttaccagttt1284ttttgtcgagcctatgtgaattttcacaagtttacagccatctgtgtgatggtaaattga1344ggatcttgctgtatgccaattcacttgctagtgttgtaagcatgcatcttctttcagctt1404cagcagttcaaggctgttgatttgatggtactgaattagttccctgaaatacttcagata1464aagtaaaagggaaagcaaaataaaagaaaaatttcagttctaccagttcatggcttagtt1524aaaatcttgggaggtgaagcatggtgtttaggctctctcttcttgtgtacttgagagtct1584gaactctcaatgctgaagtaataaccactgcagttctgctaaaaggttattggctcagta1644gagaaatagtatatgtttctgacttgtgttctatatattgccatttttcaggaaa1699Lysactggagatgacgacgtcgctataaaggtgctgtactgtgggatttgt1747ThrG1yAspAspAspValAlaIleLysValLeuTyrCysG1yI1eCys45505560cactctgacctgcacaccatcaagaatgagtggagaaacgctgtctac1795HisSerAspLeuHisThrIleLysAsnGluTrpArgAsnAlaValTyr657075ccagttgttgcagggtacatccttcttattgcatcaccaatttatcaatcaatc1849ProValValAlaGly80gtttttcttttcttcttggttctgtgcgcatccagatggaaaggctggatgcaatttcat1909tgcttagtgaaatatccattatcagttcatactttcttccggcaaagctgaattatcata1969ctgtaaactgcaaatcttgtcagttttttttcacgataatgaaattcattttgtttttac2029ttcaaagaagctacaaccaaccactaccgccgtttcaggttataagacgttttaacttta2089gtcaaagtcaaactgcttcaagtttgactaagtttgtagaaaaaataataataacatttt2149caacccaagacaaatttattatgaaaatatattcagttattaatttaataaaactaattt2209ggtattacaaatattactatatttgtttataaacttagtcagactttatcaaagtcaaaa2269catcctgtaacctaaaacggagggagtattactctaaagtgctttcaacttacttggaaa2329aaagaaatgcaaactttggctgcatggtttgattgatgcaggcacgagatcacc2383HisGluIleThr85ggggtggtgaccgaggtggggaagaacgtggcgaggttcaaggccggc2431GlyValValThrGluValGlyLysAsnValAlaArgPheLysAlaGly9095100gacgaggtcggcgtcgggtgcatggtgaacacctgcggcggctgcgag2479AspGluValGlyValGlyCysMetValAsnThrCysGlyGlyCysGlu105110115agctgccgggacggctgcgagaactactgctccggcggggtcgtcttc2527SerCysArgAspGlyCysGluAsnTyrCysSerGlyGlyValValPhe120125130acctacaactccgtcgaccgggacggcacgcgcacctacggcggctac2575ThrTyrAsnSerValAspArgAspGlyThrArgThrTyrGlyGlyTyr135140145tccgacgcggtggtcgtcagccagcgcttcgtcgtgcgcttcccctcc2623SerAspAlaValValValSerGlnArgPheValValArgPheProSer150155160165tccgccggcggcggcgccggcgccgcgctgccgctggacagcggcgcg2671SerAlaGlyGlyGlyAlaGlyAlaAlaLeuProLeuAspSerGlyAla170175180ccgctgctgtgcgccggggtgacggtgtacgcgccgatgaggcagcat2719ProLeuLeuCysAlaGlyValThrValTyrAlaProMetArgGlnHis185190195gggctgtgcgaggccgggaagcacgtcggcgtggtggggctcggcggg2767GlyLeuCysGluAlaGlyLysHisValGlyValValGlyLeuGlyGly200205210ctcggccacgtcgccgtcaagttcgccagggcgttcgggatgagggtg2815LeuGlyHisValAlaValLysPheAlaArgAlaPheGlyMetArgVal215220225acggtgatcagcacgtcgccggtgaagaggcaggaggccctggagagg2863ThrValIleSerThrSerProValLysArgGlnGluAlaLeuGluArg230235240245ctcggcgccgacggcttcatcgtcagcaccaacgccagtgagatgaag2911LeuGlyAlaAspGlyPheIleValSerThrAsnAlaSerGluMetLys250255260gtaattttaaagctagtttgatcaagtcaagagattattaaatgaactttaagaacggat2971tacacgatagtaattacaatctacaactcctgtacaagtagtaaattaataggaccactt3031tggactgagttaagaagagatcaatgaactattcagttctacattaatcgtgtagtcata3091tggaaggacatcctactgatgcagatgcagtaatatggcacatcacaaacatacaatttc3151aaatttgacttttacaagttgcgtttgatatgttatttttgttacaaattatagaagtcg3211aatttgaatttgcatgtttgtggagtgttatattagtagatgtcaatctattttttcaat3271tttttttaatatttttataatcgtttaattaacatgcaataaacgggttaacatccactc3331aagtggttataatccatctccatcaatttattgatgtgctgcagtgcaactttgcaaggc3391tatgcaagccgaagaaatctttgaatacaactgatgcacctcattgccgacagagcatct3451taagattgtttggtcaagtatctgaatttgcattttggacttgtgtttttgcaggct3508Alagcgatgggcaccatgcatggcatcatcaacacggcctctgcaagcaca3556AlaMetGlyThrMetHisGlyIleIleAsnThrAlaSerAlaSerThr265270275tccatgcactcttacctggcactcttgaagcccaagggcaagatgatc3604SerMetHisSerTyrLeuAlaLeuLeuLysProLysGlyLysMetIle280285290ttggttggcctgcctgagaagcctctccagatcccaaccttcgctttg3652LeuValGlyLeuProGluLysProLeuGlnIleProThrPheAlaLeu295300305310gttggaggtaatttactagtttgtctgacgctgcatcgtctgattccttctcaaatt3709ValGlycatggcaaaatttgacagtttgttttgtgacaaatctttgcaaatcaacagggggc3765GlyGlyaagatactagctgggagctgcatggggagcatcagtgaaacgcaggag3813LysIleLeuAlaGlySerCysMetGlySerIleSerGluThrGlnGlu315320325330atgatcgacttcgccgccgagcacggggtggccgccgacatcgagctg3861MetIleAspPheAlaAlaGluHisGlyValAlaAlaAspIleGluLeu335340345atcggcgccgacgaggtgaacacggccatggagcgcctcgccaagggc3909IleGlyAlaAspGluValAsnThrAlaMetGluArgLeuAlaLysGly350355360gacgtcaggtaccgcttcgtcgtcgacatcggcaacaccctcaggtcg3957AspValArgTyrArgPheValValAspIleGlyAsnThrLeuArgSer365370375gattgactagggagctcactgtcactggtctcagctctgtagcataccggacc4010Asptgcaatcctgcaaagtagtgcaatcttcttgctacaagacatacatatcacctctacttg4070gtgtcaataaatgtagcaaaagtggtacattgttgt4106SEQ.IDNo.2<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻木質(zhì)素合成基因FC1及用途<130><141><170>PatentInversion3.1<210>2<211>379<212>PRT<213>Oryzasativa<400>2MetAlaProThrThrThrAlaThrAlaAlaAlaGluGlnAlaProPro151015ProGlnHisThrArgLysAlaValGlyLeuAlaAlaHisAspAspSer202530GlyHisLeuThrProIleArgIleSerArgArgLysThrGlyAspAsp354045AspValAlaIleLysValLeuTyrCysGlyIleCysHisSerAspLeu505560HisThrIleLysAsnGluTrpArgAsnAlaValTyrProValValAla65707580GlyHisGluIleThrGlyValValThrGluValGlyLysAsnValAla859095ArgPheLysAlaGlyAspGluValGlyValGlyCysMetValAsnThr100105110CysGlyGlyCysGluSerCysArgAspGlyCysGluAsnTyrCysSer115120125GlyGlyValValPheThrTyrAsnSerValAspArgAspGlyThrArg130135140ThrTyrGlyGlyTyrSerAspAlaValValValSerGlnArgPheVal145150155160ValArgPheProSerSerAlaGlyGlyGlyAlaGlyAlaAlaLeuPro165170175LeuAspSerGlyAlaProLeuLeuCysAlaGlyValThrValTyrAla180185190ProMetArgGlnHisGlyLeuCysGluAlaGlyLysHisValGlyVal195200205ValGlyLeuGlyGlyLeuGlyHisValAlaValLysPheAlaArgAla210215220PheGlyMetArgValThrValIleSerThrSerProValLysArgGln225230235240GluAlaLeuGluArgLeuGlyAlaAspGlyPheIleValSerThrAsn245250255AlaSerGluMetLysAlaAlaMetGlyThrMetHisGlyIleIleAsn260265270ThrAlaSerAlaSerThrSerMetHisSerTyrLeuAlaLeuLeuLys275280285ProLysGlyLysMetIleLeuValGlyLeuProGluLysProLeuGln290295300IleProThrPheAlaLeuValGlyGlyGlyLysIleLeuAlaGlySer305310315320CysMetGlySerIleSerGluThrGlnGluMetIleAspPheAlaAla325330335GluHisGlyValAlaAlaAspIleGluLeulleGlyAlaAspGluVal340345350AsnThrAlaMetGluArgLeuAlaLysGlyAspValArgTyrArgPhe355360365ValValAspIleGlyAsnThrLeuArgSerAsp37037權(quán)利要求1.一種分離的水稻木質(zhì)素合成基因FC1，它具有SEQ.IDNo.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。2.一種分離的水稻木質(zhì)素合成基因FC1編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ.IDNo.2所示氨基酸序列至少50％同源性的序列。3.一種水稻木質(zhì)素合成基因在調(diào)節(jié)水稻莖桿強(qiáng)度中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了水稻木質(zhì)素合成基因FC1及應(yīng)用。本發(fā)明利用T－DNA標(biāo)簽技術(shù)從水稻軟稈突變體中克隆并鑒定了控制水稻木質(zhì)素合成基因FC1，通過(guò)共分離檢測(cè)表明T－DNA插入失活的基因與軟桿突變表型是共分離的。對(duì)該基因編碼的氨基酸序列分析證明該基因所編碼的蛋白是一個(gè)肉桂醛脫氫酶，該酶在植物木質(zhì)素的合成過(guò)程中起重要的作用。本發(fā)明克隆的基因具有調(diào)控植物厚壁組織細(xì)胞壁的厚度和植株莖稈的支撐力的功能。本發(fā)明還在利用基因工程技術(shù)有目的地提高農(nóng)作物的抗倒伏、抗逆和抗病蟲(chóng)害能力；改善木本植物的材質(zhì)；提高秸稈資源的利用率等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N9/04GK1995346SQ20061001810公開(kāi)日2007年7月11日申請(qǐng)日期2006年1月5日優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日發(fā)明者吳昌銀,李向俊,張啟發(fā)申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)