專利名稱：人類野生型全長xpd基因真核表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人類野生型全長XPD基因真核表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
人類XPD基因位于19q13.2-3，編碼一個具有ATP依賴的DNA螺旋酶活性的蛋白。XPD蛋白是基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TF II H復(fù)合物的第二大亞基。人類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TF II H是一個由九個亞基(XPB，XPD，p62，p52，p44，p34，cdk7，cyclinHT和MAT1)組成的復(fù)合體，其中XPB，p62，p52，p44和p34組成一個核心亞復(fù)合物，XPD與cdk7，cyclinHT和MAT1組成一個具有CDK活性的激酶(cdk activekinase，CAK)亞復(fù)合物。TF II H在轉(zhuǎn)錄起始和NER中都發(fā)揮著重要作用，而XPD亞基在轉(zhuǎn)錄和修復(fù)中的作用卻不盡相同。在核苷酸切除修復(fù)過程中，它可從5’→3’方向打開受損位置的DNA雙鏈，從而允許損傷特異性核酸酶從兩側(cè)切下受損DNA。而在轉(zhuǎn)錄起啟階段，XPD的作用是介導(dǎo)CAK錨定在TF II H核心亞復(fù)物上，并且與P44亞基的N端相互作用，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。XPD基因的突變與三種人類遺傳性疾病相關(guān)，分別是XP，Cockayne綜合癥(CockayneSyndrome，CS)和毛發(fā)硫性營養(yǎng)不良(Trichothiodystrophy，TTD)。大量研究發(fā)現(xiàn)，XPD除了在TF II H介導(dǎo)的NER和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮生要作用外，還參與了細(xì)胞的增殖，凋亡，腫瘤的發(fā)生甚至化療藥物抗藥性的產(chǎn)生等多種生理及病理機(jī)制。許多研究者已假設(shè)XPD基因可用于一些疾病的治療。當(dāng)然，在此之前，還需要進(jìn)行大量的研究和多方的論證。要研究XPD在各種生理及病理活動中的作用，或是將其用于治療目的，都需要能夠在真核細(xì)胞中大量表達(dá)XPD基因。研究過程中，高表達(dá)XPD的細(xì)胞環(huán)境可以使研究者進(jìn)一步了解XPD的各種生物學(xué)活性和功能，而使病理細(xì)胞中過表達(dá)XPD才可以發(fā)揮它的治療作用。將目的基因克隆，插入可在真核細(xì)胞中表達(dá)的載體，從而構(gòu)建出重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實現(xiàn)目的基因的大量表達(dá)是一種國際上常用的方法，整個實驗流程中多個環(huán)節(jié)都可影響到重組表達(dá)載體的質(zhì)量及表達(dá)效率。但一旦構(gòu)建成功，將會為以后的實驗工作提供非常有效的物質(zhì)支持。目前國內(nèi)對XPD的研究，多還停留在討論XPD基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，或者是某一段XPD基因?qū)?xì)胞的影響，受研究材料的限制，還沒有研究者深入探討XPD基因?qū)?xì)胞生物學(xué)影響的具體機(jī)制。結(jié)合國內(nèi)外對XPD研究現(xiàn)狀來看，這將會是一個熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆人類野生型全長XPD基因，并構(gòu)建能在真核細(xì)胞中高效表達(dá)人類野生型全長XPD基因的pEGFP-N2/XPD重組載體，可用于研究XPD基因在各種正常細(xì)胞或疾病細(xì)胞中的生物學(xué)功能，并最終運用于臨床基因治療。
本發(fā)明是這樣來實現(xiàn)的，人類野生型全長XPD基因的重組載體pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒，是通過以下方法構(gòu)建獲得的1、人類野生型全長XPD基因的cDNA克隆本實驗采用的是人宮頸鱗癌上皮細(xì)胞，即HeLa細(xì)胞。在10％FBS的DMEM(GIBCOTM，US。)培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)兩周后，用Trizol試劑(Invetrogen，US.)提取總RNA，SuperstcriptTM試劑盒(Invetrogen，US.)合成cDNA。
根據(jù)Genebank中公布的人類XPD完整mRNA序列NM_000400.2，設(shè)計引物，并在上下游引物的5’端分別加上Bgl II和Kpn I的限制性內(nèi)切酶位點，引物(正義5-TTAGAATTCCATGAAGCTCAACGTG-3，反義5-GAGTTAGCGGCTCTGTGTGTAG-3)在Taq酶(TaKaRa公司，LaTaq)的作用下，經(jīng)94℃1min預(yù)變性，94℃45sec，54℃1min，72℃1min35循環(huán)，72℃5min總延伸，擴(kuò)增出的目的條帶長度應(yīng)為約2300bp。
2、XPD基因的酶切純化后的XPD基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行Kpn I和Bgl II的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳純化并回收后用于和pEGFP-N2質(zhì)粒的連接反應(yīng)3、pEGFP-N2質(zhì)粒的提取、酶切提取pEGFP-N2質(zhì)粒后，進(jìn)行Kpn I和Bgl II的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，用回收試劑盒進(jìn)行大片段的回收，并存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 4、連接XPD片段和pEGFP-N2載體片段以1-10∶1摩爾比例，在T4DNA連接酶(Promega，US.)的作用下，置4℃16小時進(jìn)行連接反應(yīng)。
5、轉(zhuǎn)化10ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200ul感受態(tài)大腸桿菌JM-109，取100ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有終濃度為30ug/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18小時后，將單個菌落挑出，加入含30ug/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基置37℃16小時后提取質(zhì)粒，即為重組基因載體pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的有益結(jié)果是所提供的人類野生型全長XPD基因經(jīng)酶切和測序證實與GENE BANK上的公布的序列完全一致。將該重組基因表達(dá)載體pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人類肝癌細(xì)胞Hep3B后48小時即可在熒光顯微鏡下觀察到pEGFP-N2質(zhì)粒自帶的綠色熒光蛋白報導(dǎo)基因的表達(dá)。進(jìn)一步的RT-PCR檢測表明轉(zhuǎn)染了該重組質(zhì)粒的Hep3B細(xì)胞中XPD mmRNA的表達(dá)量高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這表達(dá)該重組質(zhì)粒可在真核細(xì)胞中表達(dá)正常XPD基因。該發(fā)明將為廣大科研人員進(jìn)一步深入研究XPD基因的生物學(xué)特性和功能提供一個方便有效的基本材料。
具體實施例方式
1、人類野生型全長XPD基因的cDNA克隆本實驗采用的是人宮頸鱗癌上皮細(xì)胞，即HeLa細(xì)胞。在10％FBS的DMEM(GIBCOTM，US。)培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)兩周后，用Trizol試劑(Invetrogen，US.)提取總RNA，SuperstcriptTM試劑盒(Invetrogen，US.)合成cDNA。
根據(jù)Genebank中公布的人類XPD完整mRNA序列NM_000400.2，設(shè)計引物，并在上下游引物的5’端分別加上Bgl II和Kpn I的限制性內(nèi)切酶位點，引物(正義5-TTAGAATTCCATGAAGCTCAACGTG-3，反義5-GAGTTAGCGGCTCTGTGTGTAG-3)在Taq酶(TaKaRa公司，LaTaq)的作用下，經(jīng)94℃1min預(yù)變性，94℃45sec，54℃1min，72℃1min35循環(huán)，72℃5min總延伸，擴(kuò)增出的目的條帶長度應(yīng)為約2300bp2、XPD基因的酶切純化后的XPD基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行Kpn I和Bgl II的雙酶切，方法參照酶說明書和《分子克隆》(第三版)(Sambrook，J.and Russell，DW.2002)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳并回收目的片段后用于和pEGFP-N2質(zhì)粒的連接反應(yīng)3、pEGFP-N2質(zhì)粒的提取、酶切pEGFP-N2質(zhì)粒的提取步驟參照Promega Wizard質(zhì)粒提取試劑盒產(chǎn)品說明書，提取出pEGFP-N2質(zhì)粒然后進(jìn)行Kpn I和Bgl II的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，用Promega公司回收試劑盒進(jìn)行大片段的回收，并存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 4、連接XPD片段和pEGFP-N2載體片段以1-10∶1摩爾比例，在T4DNA連接酶(Promega，US.)的作用下，置4℃16小時進(jìn)行連接反應(yīng)，步驟參照產(chǎn)品說明書。
5、轉(zhuǎn)化10ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200ul感受態(tài)大腸桿菌JM-109(方法參照《分子克隆》(第三版)(Sambrook，J.and Russell，DW.2002)，取100ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有終濃度為30ug/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，同時設(shè)未轉(zhuǎn)染的感受態(tài)細(xì)胞(陰性對照)和轉(zhuǎn)化pEGFP-N2空載質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞(陽性對照)，37℃培養(yǎng)18小時。
6、重組質(zhì)粒的酶切鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，提取出的重組質(zhì)粒分別用Kpn I、Bgl II和Sph I三種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后在0.7％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。我們選用的pEGFP-N2質(zhì)粒長度為4737bp，XPD cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為2300bp，因此重組質(zhì)粒經(jīng)Kpn I單酶切后電泳應(yīng)在約7037bp位置有條帶，經(jīng)Kpn I和Bgl II雙酶切后電泳應(yīng)在4737bp位置和約2300bp位置各有一條帶。此外，限制性核酸內(nèi)切酶Sph I在pEGFP-N2純質(zhì)粒的2332bp，2404bp，3167bp位置和XPD的636bp位置各有一酶切位點，同時我們的XPD是在pEGFP-N2質(zhì)粒的612bp和652bp之間以正義方向插入，所以重組質(zhì)粒經(jīng)SphI單酶切后電泳應(yīng)包括2818bp，3344bp，763bp和72bp的位置的四條帶。
7、重組質(zhì)粒的測序鑒定酶切鑒定后的重組質(zhì)粒，送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，測序引物為pEGFP-N5通用引物。
8、pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人類肝癌細(xì)胞Hep3B人類肝癌細(xì)胞Hep3B以105細(xì)胞/孔的密度鋪6孔板上，每孔各加3ml含10％FBS(GIBICO，US。)的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)24小時，待細(xì)胞鋪滿50-80％后，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofectamine 2000TM，Invetrogen，US.)的方法將pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒和pEGFP-N2空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入Hep3B細(xì)胞。因為載體為表達(dá)綠色熒光蛋白的pEGFP-N2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小后，以未轉(zhuǎn)染的純Hep3B為對照，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染96小時后，以上三組細(xì)胞，即無轉(zhuǎn)染空白對照組Hep3B，空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組Hep3B-pEGFP-N2以及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組Hep3B-pEGFP-N2/XPD，1∶1傳代，G418(Geneticin418，Invetrogen，US)篩選濃度為400ug/ml，挑選抗性細(xì)胞克隆種入96孔板中，挑取單克隆集落逐步擴(kuò)增后傳代培養(yǎng)，以300ug/m1G418維持。
9、轉(zhuǎn)染細(xì)胞中XPD表達(dá)水平的RT-PCR相對定量分析三組細(xì)胞分別提取總RNA，以β-actin為內(nèi)對照，進(jìn)行XPD的RT-PCR分析，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4min，94℃40s，退火溫度45s，72℃50s，30個循環(huán)后72℃延伸10min。XPD引物序列為正義5’-GGGATCTGAAACCAAACAACTT-3’；反義5’-AGGTCTGAATCTCCTGGCAAAA-3’。β-actin引物序列為正義5’-CTT CCT GGG CAT GGA GTC-3’；反義5’-GCC GAT CCA CAC GGA GTA-3’10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖(含溴乙錠5μg/mL)電泳，通過FR200圖像分析軟件(上海復(fù)日公司)讀取目的電泳條帶的斑點密度掃描值，將XPD，HBx條帶與β-actin條帶的比值作為XPD和HBx表達(dá)的相對量，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
結(jié)果分析1、準(zhǔn)確克隆了人野生型全長XPD基因我們構(gòu)建的XPD真核表達(dá)載體即pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果完全一致，測序結(jié)果也證實與GeneBank上公布的序列一致。
2、該重組質(zhì)粒可在真核細(xì)胞中正常表達(dá)因為我們所選用的載體體質(zhì)粒pEGFP-N2在其多克隆位點后帶有綠色熒光蛋白(GFP)報導(dǎo)基因，如果我們插入的基因序列導(dǎo)致質(zhì)粒本身讀碼框移位，則不能正常表達(dá)出綠色熒光蛋白。我們所構(gòu)建的pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人類肝癌細(xì)胞Hep3B 48小時后，即可看到載體上帶有的綠色熒光蛋白順利表達(dá)。
3、重組質(zhì)粒上的XPD基因可在真核細(xì)胞中正常表達(dá)對轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞分別進(jìn)行RT-PCR分析證實，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的XPD轉(zhuǎn)錄水平明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這說明我們成功構(gòu)建了XPD真核表達(dá)系統(tǒng)，重組質(zhì)粒所帶的XPD基因可在真核細(xì)胞中正常表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種人類野生型全長XPD基因真核表達(dá)載體，其特征在于人類野生型全長XPD基因的重組載體pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒，是通過以下方法構(gòu)建獲得的(1)人類野生型全長XPD基因的cDNA克隆取人宮頸鱗癌上皮細(xì)胞，在10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)兩周后，用Trizol試劑提取總RNA，Superstcript試劑盒合成cDNA；(2)XPD基因的酶切純化后的XPD基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行Kpn I和BglII的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳純化并回收后用于和pEGFP-N2質(zhì)粒的連接反應(yīng)；(3)pEGFP-N2質(zhì)粒的提取、酶切提取pEGFP-N2質(zhì)粒后，進(jìn)行KpnI和Bgl II的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，用回收試劑盒進(jìn)行大片段的回收，并存于-20℃?zhèn)溆茫?4)連接XPD片段和pEGFP-N2載體片段以1-10∶1摩爾比例，在T4DNA連接酶的作用下，置4℃16小時進(jìn)行連接反應(yīng)；(5)轉(zhuǎn)化10ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200ul感受態(tài)大腸桿菌JM-109，取100ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有終濃度為30ug/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18小時后，將單個菌落挑出，加入含30ug/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基置37℃16小時后提取質(zhì)粒，即為重組基因載體pEGFP-N2/XPD重組質(zhì)粒。
全文摘要
一種人類野生型全長XPD基因真核表達(dá)載體，其特征在于人類野生型全長XPD基因的重組載體pEGFP－N2/XPD重組質(zhì)粒，是通過以下方法構(gòu)建獲得的(1)人類野生型全長XPD基因的cDNA克隆；(2)XPD基因的酶切；(3)pEGFP－N2質(zhì)粒的提取、酶切；(4)連接；(5)轉(zhuǎn)化。本發(fā)明所提供的人類野生型全長XPD基因經(jīng)酶切和測序證實與GENE BANK上的公布的序列完全一致，該發(fā)明將為廣大科研人員進(jìn)一步深入研究XPD基因的生物學(xué)特性和功能提供一個方便有效的基本材料。
文檔編號C12N15/12GK1831135SQ20061001859
公開日2006年9月13日 申請日期2006年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月16日
發(fā)明者張吉翔, 湯雷, 羅忠金, 杜芳騰, 朱水山, 熊瑛 申請人:張吉翔