專利名稱：人纖維介素hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其藥學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地說是構(gòu)建一種新的生物制劑hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒，及用于治療病毒誘導(dǎo)的重型肝炎和其它以微循環(huán)障礙損傷為主要病理生理特征疾病的藥學(xué)用途。
背景技術(shù)：
眾所周知，由于病毒性肝炎發(fā)病率高、危害性大，已成為嚴重影響人民健康與生活水平、制約經(jīng)濟發(fā)展的重要疾病。迄今為止，國際上對于重型肝炎尚無確定有效的治療方法，探索重型肝炎的發(fā)病機制和防治方法是應(yīng)用基礎(chǔ)和臨床研究領(lǐng)域的重要課題。
用鼠3型肝炎病毒(mouse hepatitis virus-3，MHV-3)感染不同種系近親繁殖小鼠，已成功建立了類似人類各種不同臨床類型的肝炎，包括暴發(fā)型肝炎、慢性肝炎及臨床健康病毒攜帶者(專利授權(quán)號02115980.7)，這一成果為我們研究病毒性肝炎的發(fā)病機制及防治方法提供了很好的動物模型。MHV-3誘導(dǎo)產(chǎn)生的鼠纖維介素(MouseFibrinogen-like protein 2，mfgl2)在鼠病變肝組織中選擇性高度表達，其基因表達水平與肝組織纖維蛋白沉積及廣泛肝細胞壞死密切相關(guān)；MHV-3感染小鼠接受mfgl2凝血酶原酶中和抗體注射后可減輕肝臟疾病嚴重程度并顯著降低死亡率。以上結(jié)果表明，mfgl2凝血酶原酶在鼠暴發(fā)型肝炎的發(fā)病過程中起重要作用(參見Li C.等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，176689(1992)；寧琴等人，生物化學(xué)雜志，2749930(1999)。)在上述研究的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進一步研究發(fā)現(xiàn)暴發(fā)型乙型肝炎或重癥乙型肝炎病人肝臟組織的枯否氏細胞、血管內(nèi)皮細胞和壞死、纖維化區(qū)域發(fā)現(xiàn)hfgl2的高度表達，說明hfgl2在人病毒性肝炎的惡化進展中起著關(guān)鍵性的作用。因此發(fā)明人提出fgl2在病毒性肝炎中引發(fā)肝臟纖維蛋白沉淀和微血管內(nèi)微循環(huán)障礙，導(dǎo)致肝細胞壞死。該理論在國際上首次提出，并對重型肝炎的分子機制發(fā)表了全新的見解(參見陳悅等人，中華醫(yī)學(xué)雜志，83446(2003)；Marsden PA等人，臨床調(diào)查學(xué)雜志，11258(2003)。)
反義技術(shù)是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計的，它能選擇性地與靶基因特定功能位置結(jié)合(雜交)，抑制該基因表達，而不影響宿主正常功能。本發(fā)明之前已構(gòu)建了mfgl2反義質(zhì)粒，并對其進行了大量細胞和動物水平的實驗，結(jié)果證明了mfgl2反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞后表達反義RNA，并對mfgl2凝血酶原酶基因進行特異性的抑制。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指，導(dǎo)入特異性針對目標(biāo)基因的同源雙鏈RNA(double-strain RNA，dsRNA)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的沉默復(fù)合體將目標(biāo)mRNA降解，從而引起目標(biāo)基因不表達或減效表達。小干擾RNA作為一種新的基因干預(yù)工具，具有高效、特異，快速等優(yōu)點，國際上大量研究表明其基因表達干預(yù)效果優(yōu)于反義技術(shù)，更具臨床應(yīng)用價值。對比，發(fā)明人構(gòu)建了hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒，并對其進行了體外細胞水平的實驗，結(jié)果證明了hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞后表達小發(fā)夾狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)，并對hfgl2凝血酶原酶基因進行特異性的抑制，從而對病毒誘導(dǎo)的重型肝炎和其它以微循環(huán)障礙損傷為主要病理生理特征疾病的治療具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
所以，本發(fā)明的第一個目的是提供獲得hfgl2凝血酶原酶基因的shRNA模板的方法。
本發(fā)明的第二個目的是提供將hfgl2凝血酶原酶基因的shRNA模板插入真核表達載體構(gòu)建hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒的過程。
本發(fā)明的第三個目的是提供利用hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒特異性地抑制細胞系中hfgl2表達的方法。
實現(xiàn)本發(fā)明具體技術(shù)方案是發(fā)明人構(gòu)建了一種新的生物制劑-hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒，用以抑制hfgl2凝血酶原酶的表達，緩解微循環(huán)障礙，減少局部纖維素沉積和細胞壞死，可望在臨床上提高重型肝炎患者的存活率和生存質(zhì)量。我們通過細胞水平實驗，證實hfgl2shRNA干擾質(zhì)?？梢杂行б种苃fgl2基因的表達。
本發(fā)明方法包括以下步驟一、載體的構(gòu)建部分構(gòu)建hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒的方法
1.PCR法擴增U6啟動子，通過下游引物將hfgl2 shRNA的模板DNA序列連接到U6啟動子的下游；2.將目的片段插入載體相應(yīng)酶切位點BamH I和Hind III。
具體步驟如下根據(jù)hfgl2凝血酶原酶cDNA序列及設(shè)計原則篩選出靶序列，根據(jù)靶序列設(shè)計hfgl2 shRNA模板，再將模板設(shè)計于下游引物中，PCR擴增U6啟動子，兩端分別引入酶切位點BamH I和Hind III，將下游帶有hfgl2 shRNA模板的U6啟動子插入pMSCVneo載體相應(yīng)酶切位點BamH I和Hind III；本發(fā)明產(chǎn)生hfgl2凝血酶原酶的shRNA的dsDNA模板序列為序列15’-AGAGGAGATCAATGTACTT TTCAAGAGAAAGTACATTGATCTCCTCTTTTTT-3’序列25’-ATACAGAGGTGTCCGTAAT TTCAAGAGAATTACGGACACCTCTGTATATTTTT-3；構(gòu)建的產(chǎn)生hfgl2 shRNA模板需要通過插入某種載體構(gòu)成一表達體系。
本發(fā)明的藥學(xué)用途在于它包括本發(fā)明所述的構(gòu)建針對nfgl2shRNA干擾質(zhì)粒和藥學(xué)上所接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明提供請求保藏的培養(yǎng)物名稱大腸桿菌JM109/p-mfgl2-shRNA1，/大腸桿菌JM109/p-mfgl2-shRNA2，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM206054/CCTCC NOM206055二、載體的細胞水平試驗hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒對hfgl2基因表達的抑制作用倒置熒光顯微鏡下直接觀察，shRNA干擾質(zhì)粒特異有效抑制hfgl2-EGFP融合蛋白的表達；本發(fā)明的實驗證明，發(fā)明人構(gòu)建了針對hfgl2凝血酶原酶的shRNA，將其用于病毒性肝炎或移植急性排斥反應(yīng)等的治療，以提高重癥型病毒性肝炎患者的存活率、延長移植物存活時間；上述的shRNA對用于以微循環(huán)障礙損傷為病理生理特征的疾病的治療，具有普遍的藥學(xué)價值。


本發(fā)明提供下列附圖圖1hfgl2的2個靶序列及U6啟動子的上、下游引物圖2將下游帶有hfgl2 shRNA模板的U6啟動子插入pMSCVneo載體圖3pMD18-U6P-hfgl2shRNA1和pMD18-U6P-hfgl2shRNA2，雙酶切(BamH I和Hind III)鑒定1DL2000；2pMD18-U6P-hffgl2shRNA1；3pMD18-U6P-hfgl2shRNA2圖4p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2雙酶切(BamH I和HindIII)鑒定1DL2000；2p-hfgl2shRNA1；3p-hfgl2shRNA2圖5 hfgl2-EGFP融合蛋白的表達干預(yù)aTransfection of plasmid pEGFP-N2-hfgl2；bCotransfection ofirrelative shRNA plasmid and pEGFP-N2-hfgl2；cCotransfection ofp-hfgl2shRNA1 and pEGFP-N2-hfgl2；dCotransfection of p-hfgl2shRNA2 and pEGFP-N2-hfgl具體實施方式
以下結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的詳細描述本發(fā)明提出構(gòu)建hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒的方法并在細胞水平證實其干擾效應(yīng)包括以下步驟一、載體的構(gòu)建部分構(gòu)建hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒的方法1.根據(jù)hfgl2凝血酶原酶cDNA序列及設(shè)計原則篩選出靶序列，根據(jù)靶序列設(shè)計hfgl2 shRNA模板，再將模板設(shè)計于下游引物中，PCR擴增U6啟動子，兩端分別引入酶切位點BamH I和Hind III(hfgl2的2個靶序列及U6啟動子的上游引物見圖1)。
2.將下游帶有hfgl2 shRNA模板的U6啟動子插入pMSCVneo載體(圖2)相應(yīng)酶切位點BamH I和Hind III(酶切鑒定見圖3、4)，該重組載體在U6啟動子的啟動下可在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出hfgl2shRNA。
二、載體的細胞水平試驗研究對于發(fā)夾狀shRNA表達體系在導(dǎo)入人體細胞后是否能特異性結(jié)合到靶基因并有效表達的問題，目前國際上尚無能夠提供直接證據(jù)的相關(guān)實驗方法，只能通過最終干預(yù)效果來間接反映上述生物制劑結(jié)合和表達的效率。發(fā)明人構(gòu)建了hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒，并對其進行細胞水平的實驗，現(xiàn)報告如下hfgl2 shRNA對hfgl2基因表達的抑制作用材料p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2插入了hfgl2 dsDNA模板和U6啟動子的pMSCVneo載體，能夠表達hfgl2 shRNA，用于抑制mfgl2凝血酶原酶。
p-mfgl2shRNA插入了mfgl2 dsDNA模板和U6啟動子的pMSCVneo載體，能夠表達mfgl2 shRNA，作為非相關(guān)對照。
pEGFP-N2-hfgl2GFP(綠色熒光蛋白)與hfgl2的融合基因表達載體，可通過GFP表達所產(chǎn)生的熒光強弱來直接反映mfgl2表達的多少。
CHO細胞中國倉鼠卵巢細胞。
方法p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2分別與pEGFP-N2-hfgl2共轉(zhuǎn)染CHO細胞，作為試驗組，另僅轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-hfgl2或共轉(zhuǎn)染p-mfgl2shRNA和pEGFP-N2-hfgl2作為對照組。轉(zhuǎn)染后48h倒置熒光顯微鏡下觀察hfgl2-EGFP融合蛋白在CHO細胞中的表達情況。
結(jié)果熒光顯微鏡下觀察到CHO細胞內(nèi)hfgl2shRNAl和hfgl2shRNA2對hfgl2-EGFP融合蛋白表達的特異性抑制作用(圖5)。
綜上所述，系列體外試驗均表明本發(fā)明涉及的新的生物制劑hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒可有效地干預(yù)hfgl2凝血酶原酶的表達。我們研究發(fā)現(xiàn)，在血竇微血栓周圍和局部纖維素沉積區(qū)域的巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞高表達凝血酶原酶，推測fgl2凝血酶原酶不僅在病毒誘導(dǎo)的重型肝炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且在移植急性排斥反應(yīng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等以微循環(huán)障礙為主要病理生理特征的疾病的發(fā)生中也起著重要作用。因此，本發(fā)明對于探討這些以微循環(huán)障礙損傷為病理生理特征的病癥的發(fā)病機理及治療，尤其是在提高重型肝炎患者的存活率、延長移植物存活時間等方面具有實際的藥學(xué)用途。
權(quán)利要求
1.人纖維介素hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其步驟如下根據(jù)hfgl2凝血酶原酶cDNA序列及設(shè)計原則篩選出靶序列，根據(jù)靶序列設(shè)計hfgl2 shRNA模板，再將模板設(shè)計于下游引物中，PCR擴增U6啟動子，兩端分別引入酶切位點BamH I和Hind III，將下游帶有hfgl2 shRNA模板的U6啟動子插入pMSCVneo載體相應(yīng)酶切位點BamH I和Hind III，產(chǎn)生hfgl2凝血酶原酶的shRNA的dsDNA模板序列為序列15’-AGAGGAGATCAATGTACTT TTCAAGAGAAAGTACATTGATCTCCTCTTTTTT-3’序列25’-ATACAGAGGTGTCCGTAAT TTCAAGAGAATTACGGACACCTCTGTATATTTTT-3’
2.按權(quán)利要求1所述的人纖維介素hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒藥物組合物，它包括本發(fā)明所述的構(gòu)建針對hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒和藥學(xué)上所接受的載體或賦形劑。按權(quán)利要求1所述的人纖維介素hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒保藏的培養(yǎng)物名稱大腸桿菌JM109/p-mfgl2-shRNA1/大腸桿菌JM109/p-mfgl2-shRNA2，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM206054/CCTCC NOM206055。
全文摘要
人纖維介素hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其藥學(xué)用途，本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地說是構(gòu)建一種新的生物制劑hfgl2shRNA干擾質(zhì)粒，實現(xiàn)本發(fā)明具體技術(shù)方案是發(fā)明人構(gòu)建了一種新的生物制劑－h(huán)fgl2 shRNA干擾質(zhì)粒，根據(jù)hfgl2凝血酶原酶cDNA序列及設(shè)計原則篩選出靶序列，根據(jù)靶序列設(shè)計hfgl2 shRNA模板，再將模板設(shè)計于下游引物中，PCR擴增U6啟動子，兩端分別引入酶切位點BamH I和Hind III，將下游帶有hfgl2 shRNA模板的U6啟動子插入pMSCVneo載體相應(yīng)酶切位點BamH I和Hind III，我們通過細胞水平實驗，證實hfgl2 shRNA干擾質(zhì)粒可以有效抑制hfgl2基因的表達。
文檔編號C12R1/19GK1958801SQ200610019489
公開日2007年5月9日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者寧琴, 羅小平, 李黎, 習(xí)東, 朱傳龍, 嚴偉明 申請人:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院