專(zhuān)利名稱(chēng)：阿斯巴甜生物合成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甜味劑的合成方法，特別是阿斯巴甜生物合成的一種新方法。
背景技術(shù)：
阿斯巴甜是一種新型高效的甜味劑，其甜度約為蔗糖的200倍，熱量?jī)H為蔗糖的1/200。常食不產(chǎn)生齲齒，不影響血糖，不引起肥胖、高血壓、冠心病。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)其的評(píng)價(jià)為安全可靠，并被聯(lián)合國(guó)食品添加劑聯(lián)席委員會(huì)(JECFA)確定為國(guó)際A(I)級(jí)甜味劑。目前該甜味劑已在130多個(gè)國(guó)家和地區(qū)獲準(zhǔn)使用，廣泛用于9000多種飲料、食品及醫(yī)藥等產(chǎn)品中。至今自然界中尚未發(fā)現(xiàn)天然的阿斯巴甜，其生產(chǎn)均采用人工合成法，合成方法大體可分為兩種化學(xué)合成法和生物合成法。目前阿斯巴甜的工業(yè)化生產(chǎn)國(guó)內(nèi)外大部分是通過(guò)化學(xué)法合成的。它是以L(fǎng)-天門(mén)冬氨酸與L-苯丙氨酸為主要原料，通過(guò)氨基保護(hù)、內(nèi)酐、縮合、水解、酯化、中和等反應(yīng)步驟來(lái)合成。而各種化學(xué)合成法區(qū)別在于L-天門(mén)冬氨酸中氨基的保護(hù)基團(tuán)不同；甲酯化次序不同等?；瘜W(xué)合成法反應(yīng)步驟多、產(chǎn)率低、反應(yīng)選擇性差、產(chǎn)物需要多步分離等不足；因此，生物酶法合成相對(duì)化學(xué)合成法專(zhuān)一性強(qiáng)、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高、條件溫和而成為一些科研工作者研究的重點(diǎn)，特別是通過(guò)一步酶法以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯為反應(yīng)底物通過(guò)菌種篩選直接合成阿斯巴甜的研究已被許多科研工作者所注意。
經(jīng)過(guò)檢索，我們查到公開(kāi)文獻(xiàn)有關(guān)合成阿斯巴甜的報(bào)道如下題名阿斯巴甜的生物合成作者林應(yīng)銳刊名微生物學(xué)通報(bào)。1992，19(4).-226-229文摘通?；瘜W(xué)合成包括五步。1.將天冬氨酸的氨基保護(hù)起來(lái)，并制成酸酐。2，苯丙氨酸酯化成苯丙氨酸甲酯。3.將帶保護(hù)基的天冬氨酸酐和苯丙氨酸甲酯縮合成帶保護(hù)基的阿斯巴甜(無(wú)甜昧)。4.脫除保護(hù)基制得阿斯巴甜的鹽。5，中和析出阿斯巴甜除去-APM雜質(zhì)。目前文獻(xiàn)介紹有少量非合成肽鍵的酶反應(yīng)研究工作。如利用枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)，有選擇的只催化酯化天冬氨酰苯丙氨酸中苯丙氨酸上的羧基成為甲酯，生成阿斯巴甜。在有機(jī)溶劑中能起作用的脂肪酶(lipase)，能專(zhuān)一地水解除去阿斯巴甜甲酯(即MAPM)上天冬氨酸羧端上的甲酯基，使其成為阿斯巴甜(APM)。青霉素?；?Penicillin acylase)可水解除去苯乙?；⑺拱吞鹕系谋揭阴；?。
題名阿斯巴甜合成的研究作者馮海峰 鐘潔明機(jī)構(gòu)鄭州糧食學(xué)院食品工程系刊名鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào)。1998，19(2).-15-2文摘研究了以L(fǎng)-天門(mén)冬氨酸和L-苯丙氨酸為主要原料，合成低熱卡高甜度營(yíng)養(yǎng)型甜味劑阿斯甜的生產(chǎn)工藝，通過(guò)正交試驗(yàn)的方法探討了反應(yīng)物量、溫度、PH值、反應(yīng)時(shí)間等諸因素對(duì)合成中各步驟結(jié)果的影響。從而了合成各步驟結(jié)果的影響，從而確立了合成阿斯巴甜的最佳工藝流程和最佳生產(chǎn)工藝條件。
題名L-苯丙氨酸高速高效制造法作者陳曾三機(jī)構(gòu)中國(guó)食協(xié)發(fā)酵工程研究會(huì)，刊名發(fā)酵科技通訊。2001，30(2).-44-48文摘L-苯丙氨酸是一種必須氨基酸，在營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)療上都有重要利用價(jià)值，而且是人工甜味劑α-L-天門(mén)冬酰胺-L-苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜，比蔗糖甜100-200倍)，近年來(lái)其市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外重視，對(duì)其研究開(kāi)發(fā)也不斷進(jìn)展而獲得不少有意義的成果。
題名苯丙氨酸的應(yīng)用與生產(chǎn)作者方巖雄 張維剛等機(jī)構(gòu)廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，刊名廣州化工。2000，28(4).-134-135，11文摘綜述了苯丙氨酸的性質(zhì)及應(yīng)用。苯丙氨酸既可以直接用作醫(yī)藥產(chǎn)品、食品添加劑和飲料添加劑，又可以作制備抗癌藥物的中間體和阿斯巴甜的原料，其市場(chǎng)需求量逐年增加。還綜述了15種生產(chǎn)方法的特點(diǎn)，指出苯胺路線(xiàn)是一種植得發(fā)展的合成路線(xiàn)。
5、中國(guó)專(zhuān)利名稱(chēng)阿斯巴甜的制備方法申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào)200410065783.8申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人常州市牛塘化工廠地址213163江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)牛塘鎮(zhèn)延政路51號(hào)摘要本發(fā)明涉及化學(xué)合成法制備阿斯巴甜。采用硫酰化劑作為保護(hù)劑，對(duì)L-天門(mén)冬氨酸的氨基和α-羧基進(jìn)行保護(hù)和活化，制得L-天門(mén)冬氨酸的酰化物，然后加入成環(huán)試劑發(fā)生成環(huán)反應(yīng)生成環(huán)合物，環(huán)合物再經(jīng)過(guò)縮合而得到阿斯巴甜產(chǎn)品。其中，硫酰化劑與L-天門(mén)冬氨酸反應(yīng)生成?；镞^(guò)程中選擇性高，副反應(yīng)少，得到的酰化物反應(yīng)較為徹底、雜質(zhì)含量少；酰化、成環(huán)、縮合三步主要反應(yīng)都屬于均相反應(yīng)過(guò)程，且在低溫下進(jìn)行，易于操作控制，反應(yīng)后的產(chǎn)物易于分離、提純；可以用甲醇、醋酸乙酯等常規(guī)有機(jī)物作為反應(yīng)溶劑，加工成本低，對(duì)環(huán)境的污染相對(duì)較小，后處理及回用較為方便；制得的阿斯巴甜產(chǎn)品純度高、收率高。
上述公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道的阿斯巴甜的合成方法是通過(guò)以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯為反應(yīng)底物有的比較復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高，有的阿斯巴甜實(shí)驗(yàn)室結(jié)果還可以，但擴(kuò)大生產(chǎn)后工藝參數(shù)不穩(wěn)定，得率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究和探索，找到了一種新的合成阿斯巴甜的方法。這就是采用一步酶法，由天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇三種物質(zhì)次序發(fā)生反應(yīng)直接合成阿斯巴甜。以往的合成法是以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯為反應(yīng)底物。本方法無(wú)需天冬氨酸的氨基保護(hù)，也無(wú)需事先用化學(xué)法或其他方法將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸甲酯，而且減少了反應(yīng)步驟，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。
本發(fā)明是指在微生物酶的作用下，由天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇直接合成阿斯巴甜。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的先將所篩選的菌株在培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，再將所產(chǎn)酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇的混合液進(jìn)行酶促反應(yīng)。天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下直接合成阿斯巴甜，酶促反應(yīng)的時(shí)間為2～24小時(shí)，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇每種物質(zhì)的重量按分子量計(jì)算出具體含量。
上面所述的菌株有犁頭霉菌(Absidia spp)、裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、短小桿菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和畢赤酵母(P.pastoris)，可以從微生物中心購(gòu)買(mǎi)，也可以自己培養(yǎng)。
上面所述的菌種培養(yǎng)基為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨、豆餅粉、葡萄糖、麥芽糖、土豆汁的其中之一或者它們的混合物。具體是菌種培養(yǎng)基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆餅粉，5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，F(xiàn)eCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風(fēng)量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉(zhuǎn)速250～550r.p.m，培養(yǎng)時(shí)間2～4天。合成阿斯巴甜合成的反應(yīng)條件為溫度20～65℃，pH值為2.5～9.5，反應(yīng)時(shí)間為2～24小時(shí)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)區(qū)別之處是反應(yīng)時(shí)將天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇三種物質(zhì)一起混合在酶液中，在微生物酶的作用下合成阿斯巴甜的，本發(fā)明無(wú)需天冬氨酸的氨基保護(hù)，使得苯丙氨酸甲酯化、二肽的合成次序進(jìn)行，減少了反應(yīng)步驟，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和進(jìn)步之處在于①反應(yīng)過(guò)程無(wú)需用化學(xué)法進(jìn)行苯丙氨酸的甲酯化，只需要苯丙氨酸和甲醇與天冬氨酸進(jìn)行反應(yīng)，直接由微生物酶體系催化合成阿斯巴甜，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。
②反應(yīng)的選擇性較高，幾乎不產(chǎn)生阿斯巴甜的β-異構(gòu)體，簡(jiǎn)化了下游的分離純化步驟，減少了其分離純化費(fèi)用。
③采用的是一步酶法合成阿斯巴甜，與以往的化學(xué)合成法相比，它無(wú)需天冬氨酸的氨基保護(hù)，天冬氨酸無(wú)需以?xún)?nèi)酐或內(nèi)酯的形式進(jìn)行反應(yīng)，減少了反應(yīng)步驟，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施實(shí)例一菌種發(fā)酵培養(yǎng)基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，F(xiàn)eCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。犁頭霉菌(Absidia spp)菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風(fēng)量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉(zhuǎn)速250～550r.p.m，培養(yǎng)時(shí)間2～4天。將上述發(fā)酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設(shè)定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應(yīng)的時(shí)間為2～24小時(shí)，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質(zhì)重量按分子量計(jì)算出具體含量，實(shí)施實(shí)例二菌種發(fā)酵培養(yǎng)基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，F(xiàn)eCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。裂褶菌(Schizophyllumcommune Fr.)菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風(fēng)量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉(zhuǎn)速250～550r.p.m，培養(yǎng)時(shí)間2～4天。將上述發(fā)酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設(shè)定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應(yīng)的時(shí)間為2～24小時(shí)，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質(zhì)重量按分子量計(jì)算出具體含量，實(shí)施實(shí)例三菌種發(fā)酵培養(yǎng)基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，F(xiàn)eCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風(fēng)量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉(zhuǎn)速250～550r.p.m，培養(yǎng)時(shí)間2～4天。將上述發(fā)酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設(shè)定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應(yīng)的時(shí)間為2～24小時(shí)，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質(zhì)重量按分子量計(jì)算出具體含量，實(shí)施實(shí)例四菌種發(fā)酵培養(yǎng)基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，F(xiàn)eCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。短小桿菌(Bacilluspumilus)菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風(fēng)量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉(zhuǎn)速250～550r.p.m，培養(yǎng)時(shí)間2～4天。將上述發(fā)酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設(shè)定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應(yīng)的時(shí)間為2～24小時(shí)，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質(zhì)重量按分子量計(jì)算出具體含量，實(shí)施實(shí)例五菌種發(fā)酵培養(yǎng)基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，F(xiàn)eCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風(fēng)量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉(zhuǎn)速250～550r.p.m，培養(yǎng)時(shí)間2～4天。將上述發(fā)酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設(shè)定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應(yīng)的時(shí)間為2～24小時(shí)，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質(zhì)重量按分子量計(jì)算出具體含量，實(shí)施實(shí)例六菌種發(fā)酵培養(yǎng)基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，F(xiàn)eCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。畢赤酵母(P.pastoris)菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風(fēng)量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉(zhuǎn)速250～550r.p.m，培養(yǎng)時(shí)間2～4天。將上述發(fā)酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設(shè)定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應(yīng)的時(shí)間為2～24小時(shí)，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質(zhì)重量按分子量計(jì)算出具體含量。
權(quán)利要求
1.一種阿斯巴甜生物合成的方法，其特征在于微生物發(fā)酵所得到的發(fā)酵液以天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇為底物直接合成阿斯巴甜，具體工藝是先將所篩選微生物菌株在培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，再將所產(chǎn)酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇的混合液進(jìn)行酶促反應(yīng)，天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下直接合成阿斯巴甜，酶促反應(yīng)的時(shí)間為2～24小時(shí)，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇每種物質(zhì)的重量按分子量計(jì)算出具體含量；所述的產(chǎn)生發(fā)酵酶液的微生物是犁頭霉菌(Absidia spp)、裂褶菌(Schizophyllumcommune Fr.)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、短小桿菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、畢赤酵母(P.pastoris)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿斯巴甜生物合成的方法，其特征在于所述的菌種培養(yǎng)基為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨、豆餅粉、葡萄糖、麥芽糖、土豆汁的其中之一或者它們的混合物，具體的成分和重量百分含量是菌種培養(yǎng)基為麩皮、玉米粉、淀粉、蛋白胨或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，F(xiàn)eCl30.0005％～0.005％，酵母膏或酵母粉0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿斯巴甜生物合成的方法，其特征在于菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風(fēng)量1∶0.1～1∶1，PH5.5～7.5，轉(zhuǎn)速250～550r.p.m，培養(yǎng)時(shí)間2～4天；合成阿斯巴甜合成的反應(yīng)條件為溫度20～65℃，pH值為2.5～9.5，反應(yīng)時(shí)間為2～24小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明是在生物法合成阿斯巴甜的基礎(chǔ)上，采用一步酶法合成阿斯巴甜的工藝，具體方法是用菌株發(fā)酵得到酶，再以天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇為底物直接合成阿斯巴甜。本發(fā)明反應(yīng)過(guò)程無(wú)需用化學(xué)法進(jìn)行苯丙氨酸的甲酯化，無(wú)需天冬氨酸的氨基保護(hù)，使得苯丙氨酸甲酯化、二肽的合成在微生物酶的作用下一步合成，減少了反應(yīng)步驟，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/65GK1900302SQ200610019678
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月17日
發(fā)明者梁智群, 吳滿(mǎn)剛, 陳桂光, 張?jiān)崎_(kāi), 黃時(shí)海, 李楠, 陳山嶺 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)