專利名稱：基于納米微珠在單管內(nèi)完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種通過分離純化樣品中的核酸成分，然后對其進(jìn)行體外特異性擴(kuò)增和實時檢測，以明確樣品中是否存在靶核酸并可確定其濃度的方法。
背景技術(shù)：
在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中經(jīng)常遇到的一個問題是要確認(rèn)在某個樣品(例如獻(xiàn)血者的血液或取自患者的血液或體液樣品)中是否存在與某種疾病病原體相應(yīng)的靶核酸并測定該靶核酸的濃度。但是樣品中的靶核酸常常是微量、并且與多種其它核酸序列同時存在于待測樣品中，使得無法直接檢測樣品中的靶核酸。目前解決這類問題的一個常用方法是通過核酸體外特異性擴(kuò)增增加靶核酸序列的拷貝數(shù)，然后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物及濃度，以間接判定樣品中該靶核酸是否存在及其原始濃度。進(jìn)行特異性擴(kuò)增的序列可以是靶核酸的全長，也可以是靶核酸的部分片段。在對樣品中的核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增之前，另一個必須面對的問題是，待測樣品幾乎是無一例外地還包含有除核酸以外的其它物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)等)，這些物質(zhì)的存在將嚴(yán)重影響到核酸體外擴(kuò)增的效率甚至導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，所以必須將樣品中的核酸與其它物質(zhì)分離才能對其進(jìn)行特異性擴(kuò)增。因此，通過核酸特異性擴(kuò)增來測定樣品中是否存在靶核酸序列并確定其濃度的檢測實驗實際上包括了三個主要步驟核酸的提取——即核酸的分離純化、靶核酸的體外特異性擴(kuò)增、以及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。作為重要的分子生物學(xué)方法，由核酸的提取、靶核酸的體外特異性擴(kuò)增、及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測所組成的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)是臨床診斷(如傳染病、遺傳病和各種類型的癌癥)的重要手段，也常常應(yīng)用于其他領(lǐng)域，例如法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、以及生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究等。
實際上，核酸的擴(kuò)增檢測在傳統(tǒng)上也正是按照上述三個步驟(即核酸提取、靶核酸體外特異性擴(kuò)增、以及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測)依次、分開進(jìn)行的，如此存在著一些顯著的缺點①開放操作多、易污染，包括外源核酸污染、樣品交叉污染、以及核酸酶污染等；②易引起核酸損失導(dǎo)致檢測的敏感性降低包括核酸分離和純化操作所引起的核酸的損失、以及分離純化所回收的核酸不能完全用于后續(xù)的擴(kuò)增檢測；③“終點”測量直接影響了定量的準(zhǔn)確性；④實驗周期長，手工操作多，從而不能有效降低檢測成本；⑤因為影響因素多而導(dǎo)致實驗的重復(fù)性差。這些缺點直接影響到結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，同時也造成在臨床上難以進(jìn)行高通量的檢測。
近年來，核酸提取、體外特異性擴(kuò)增、以及核酸的檢測在各自領(lǐng)域陸續(xù)出現(xiàn)了許多新技術(shù)和新方法，尤其是將核酸的體外特異性擴(kuò)增與實時檢測擴(kuò)增產(chǎn)物相結(jié)合的核酸實時擴(kuò)增檢測技術(shù)發(fā)展迅速，例如實時熒光定量PCR已經(jīng)在基礎(chǔ)研究和臨床診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。
核酸實時擴(kuò)增檢測技術(shù)實現(xiàn)了將核酸的體外特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測整合為一個反應(yīng)體系，使特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測得以在單個反應(yīng)管中完成，減少了開放操作步驟和實驗周期，很大程度上降低了污染的幾率，檢測結(jié)果的特異性也因為受特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的雙重控制而顯著提高，并且定量原理更為精確。但是目前的核酸提取技術(shù)還未能與核酸的特異性擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測相整合，隨著核酸實時擴(kuò)增檢測技術(shù)的迅速發(fā)展，核酸提取與核酸實時擴(kuò)增檢測的脫節(jié)已逐漸成為制約實驗靈敏度、準(zhǔn)確性、以及高通量測試的瓶頸。
核酸提取即核酸的分離純化過程，其目的是指將核酸與其它物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子分開。核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性，根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異，可用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法將核酸分離、純化。經(jīng)典的核酸提取方法是酚/氯仿提取法，適用于大多數(shù)生物樣本，目前在基礎(chǔ)科研中仍在被廣泛使用，但是該法實驗操作時間長，易污染，核酸提取的效率和質(zhì)量差異較大，因此在樣本數(shù)量較多或者樣本所含核酸量較少時此法并不適用。近年來另一類被廣泛使用的方法是親和層析法，親和層析法利用了核酸與其它生物大分子對分離載體的親和力的差異來提取核酸。例如玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑，在一定的離子環(huán)境下，核酸可被選擇性地吸附到玻璃或硅土、硅膠表面而與其它生物分子分離，結(jié)合至固相載體的核酸然后用低鹽緩沖液或水洗脫；一些選擇性吸附方法以經(jīng)修飾或包被的磁珠作為固相載體，磁珠可通過磁場分離而無需離心；另外，還有一些方法是以磁性玻璃微珠為載體，即以磁性材料為核心、以硅材料為包被表面的微珠，載體的表面無須修飾即可與核酸直接結(jié)合，同時也能夠通過磁場分離載體，如在美國專利6027945、5945525中所公開的方法。目前已有較多的基于上述方法的臨床或科研用商品試劑盒，如Promega公司的MagneSil Paramagnetic Particles產(chǎn)品，生物梅里埃(Biomerieux)公司的NucliSens miniMAG產(chǎn)品以及QIAGEN公司的MagAttract系列試劑盒。這些方法具有分離和純化同步進(jìn)行，核酸提取效率高，操作相對簡單的優(yōu)點，但是最終都需要一個洗脫的步驟將核酸與固相載體分離，然后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增和檢測系統(tǒng)，洗脫和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致核酸提取與核酸實時擴(kuò)增檢測相脫節(jié)——即不能在單管中連續(xù)地完成核酸的提取、靶核酸的體外特異性擴(kuò)增、以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的原因，其主要的不利影響有i.利用固相載體通過親和層析法提取待測樣本中的核酸，在分離和純化過程中引起的核酸損失較小，核酸提取效率高，但是洗脫不徹底和轉(zhuǎn)移操作將無可避免地造成核酸的損失，導(dǎo)致分離純化后的核酸并不能完全回收用于后續(xù)的擴(kuò)增檢測，造成整個實驗的檢測靈敏度降低、以及不同樣本間或相同樣本重復(fù)實驗時因洗脫效率的誤差而導(dǎo)致檢測誤差。例如在美國專利6027945中所公開的方法，詳細(xì)闡述了洗脫效率為“至少60％”，即檢測效率因為洗脫不徹底可降低至60％。
ii.為了提高洗脫效率，需要用較大體積的低鹽緩沖液或水洗脫，與后續(xù)的擴(kuò)增檢測實驗對待測核酸溶液的體積要求不能很好地銜接，因此常常是取洗脫液的部分而不是全部進(jìn)行擴(kuò)增檢測。例如常用的標(biāo)準(zhǔn)方案是用50μl洗脫緩沖液洗脫，而僅取其中的5μl進(jìn)行擴(kuò)增檢測。如此可同樣導(dǎo)致分離純化后的核酸并沒有完全用于擴(kuò)增檢測。
iii.洗脫和轉(zhuǎn)移步驟不利于進(jìn)一步縮短實驗周期和進(jìn)行多樣本的并行檢測；同時開放式操作成為整個實驗過程中最容易受到污染的環(huán)節(jié)。
分離純化后的核酸不能完全用于擴(kuò)增檢測而引起的待測核酸的損失，其影響對于靶核酸僅微量存在的樣本尤為突出，例如臨床上檢測病原體的早期感染；而洗脫和轉(zhuǎn)移這一較為費時的開放式操作也是制約實驗?zāi)軌蚋咄窟M(jìn)行的限速環(huán)節(jié)。因此，如何快速簡便地從待測樣品中提取核酸，將其與核酸實時擴(kuò)增檢測技術(shù)整合為一個連續(xù)的過程，實現(xiàn)在單個反應(yīng)管中完成核酸的分離純化、并且分離純化后的核酸無損失地參與靶核酸的特異性擴(kuò)增和檢測，是目前核酸擴(kuò)增檢測領(lǐng)域一個亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種可在單個反應(yīng)管中完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測的方法；同時在所述的單個反應(yīng)管中，所提取的核酸無損失地參與擴(kuò)增和檢測。
為了此目的，本發(fā)明提供一種以納米微珠為平臺的核酸分離、擴(kuò)增和檢測方法，該方法包括①將含有或可能含有核酸的樣品經(jīng)化學(xué)或物理等方法處理后，使核酸釋放并與納米微珠混合；②如果所述樣品中存在核酸，則核酸與納米微珠形成核酸-納米微珠復(fù)合物；③通過離心、或磁力、或抽濾將核酸-納米微珠復(fù)合物與其他成分分離；④將所述被分離的核酸-納米微珠復(fù)合物不經(jīng)洗脫、全部直接用于核酸實時擴(kuò)增檢測系統(tǒng)進(jìn)行靶核酸的特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的實時檢測，以明確所測樣品中是否存在特定的核酸序列并可確定其濃度。
納米粒子具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、界面與表面效應(yīng)、以及宏觀量子隧道效應(yīng)等特性，因此粒子的光、磁、電、熱、力以及化學(xué)活性等性質(zhì)與本體物質(zhì)有顯著差異，表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能。納米粒子由于粒徑很小，具有大量的自由表面，使得納米粒子具有較高的膠體穩(wěn)定性和優(yōu)異的吸附性能，并能較快地達(dá)到吸附平衡，因此納米聚合物粒子可以直接用于生物物質(zhì)的吸附分離。近年來，納米微珠也開始被用于核酸提取，并通過使用不同的材料、結(jié)構(gòu)設(shè)計、表面修飾等方法發(fā)展出一些各具特色的以納米微珠為吸附載體的核酸提取技術(shù)，例如在CN02139817.8、CN02114158.4、WO2003/089906等專利中均有詳細(xì)的描述。
值得注意的是，陸續(xù)有研究報道蛋白質(zhì)吸附于納米粒子時并不會象吸附在本體塊上那樣發(fā)生變性，相反地酶活性能夠得到很好的保存(J Am ChemSoc.1996；118(5)1154-1157.Biotechnol Bioeng.1992；40483-490.)；而將酶固化在納米玻璃微珠上可使酶活性和穩(wěn)定性顯著增加(Chem Commun(Camb).2004；(13)1528-9.Analyst.2001；126(8)1274-8.)。本發(fā)明采用了納米微珠作為分離核酸的吸附載體，被吸附的核酸不需洗脫即作為擴(kuò)增和實時檢測的模板，如此可實現(xiàn)在單個反應(yīng)管中完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測，同時實現(xiàn)了在所述的單個反應(yīng)管中，所提取的核酸被無損失地用于擴(kuò)增和檢測；作為吸附載體，納米微珠不但不影響靶核酸的特異性擴(kuò)增和實時檢測，還能夠促進(jìn)實時擴(kuò)增和檢測的效率。
所述簡單而且快速的方法可以在診斷分析和科學(xué)研究中使用，與傳統(tǒng)的方法相比具有下述主要優(yōu)點1)可在單個反應(yīng)管中完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測，簡化了操作步驟，縮短了實驗周期，也便于實現(xiàn)多個樣品的并行檢測；2)無需將核酸從核酸-納米微珠復(fù)合物上洗脫，可避免傳統(tǒng)方法因洗脫和轉(zhuǎn)移所引起的核酸不能完全回收、以及所回收的核酸不能完全用于擴(kuò)增檢測的缺點，使分離純化后的核酸能夠全部參與擴(kuò)增和檢測，因此提高了檢測的敏感性；3)無需將核酸從核酸-納米微珠復(fù)合物上洗脫，可避免樣本間因洗脫、轉(zhuǎn)移效率的誤差所引起的檢測誤差，使檢測結(jié)果具有更好的可比性和重復(fù)性；4)無需將核酸從核酸-納米微珠復(fù)合物上洗脫，可顯著降低轉(zhuǎn)移核酸這一開放操作引起樣品污染的可能性——包括外源核酸污染、樣品交叉污染、以及核酸酶的污染；5)以納米微珠作為核酸的吸附載體具有巨大的比表面積，核酸提取的效率高；6)在核酸的擴(kuò)增和實時檢測過程中，納米微珠的存在能夠提高擴(kuò)增檢測的效率；
7)將核酸的分離、擴(kuò)增和實時檢測整合為一個連續(xù)的系統(tǒng)，如果采用磁性分離或抽濾來替代核酸提取過程中的離心分離操作，可實現(xiàn)整個分析過程的自動化，配合多個樣品的并行檢測，能夠進(jìn)行高通量檢測實驗。
具體實施例方式
除非另外說明，此處所使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中任何普通技術(shù)人員的一般理解相同。
I.基于納米微珠在單管內(nèi)完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測的方法本發(fā)明提供一種以納米微珠為平臺的、可在單個反應(yīng)管中完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測的方法，同時實現(xiàn)了在所述的單個反應(yīng)管中，所提取的核酸被無損失地用于擴(kuò)增和檢測。該方法包括1)將含有或可能含有核酸的樣品經(jīng)化學(xué)或物理等方法處理后使核酸釋放并與納米微珠混合；2)如果所述樣品中存在核酸，則核酸與納米微珠形成核酸-納米微珠復(fù)合物；3)通過離心、或磁力、或抽濾將核酸-納米微珠復(fù)合物與其他成分分離；4)將所述被分離的核酸-納米微珠復(fù)合物不經(jīng)洗脫、全部直接用于核酸實時擴(kuò)增檢測系統(tǒng)進(jìn)行靶核酸的特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的實時檢測，以明確所測樣品中是否存在特定的核酸序列并可確定其濃度。
本方法可以被用來從任何合適的樣品中檢測靶核酸。代表性樣品包括但不局限于臨床樣品(如血清、血漿、全血、唾液、尿液、組織和細(xì)胞培養(yǎng)物等)、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、真菌等。靶核酸包括DNA及其衍生物、RNA及其衍生物、或者DNA及其衍生物與RNA及其衍生物的混合物。
可以用任何合適的物理或化學(xué)方法使核酸釋放，代表性的物理方法包括但不局限于超聲裂解、低滲裂解、凍融裂解等通過機(jī)械力使細(xì)胞破碎的方法，代表性的化學(xué)方法包括但不局限于在一定的pH環(huán)境下加入表面活性劑(SDS、Triton X-100、Tween 20等)或強(qiáng)離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍等)。
可以用任何合適的方法來制備納米微珠，或者是能夠直接獲得的商品。所述納米微珠的直徑在1nm～10000nm之間，優(yōu)選直徑在10nm～1000nm之間。在形成核酸-納米微珠復(fù)合物后，可以對所述的核酸-納米微珠復(fù)合物進(jìn)行必要的洗滌以去處殘留的不合要求的成分。
本方法可以選用磁性納米微珠，也可以選用非磁性納米微珠。磁性納米微珠是指能夠在外加磁場的作用下產(chǎn)生磁性，可通過磁力作用與反應(yīng)體系的其他組分分離的納米微珠。
本方法所選用的磁性納米微珠和非磁性納米微珠，其表面均是由任何能夠與核酸非特異或者特異結(jié)合的材料制成，代表性的材料包括但不局限于氧化硅及其衍生物。磁性納米微珠為核殼式結(jié)構(gòu)的納米微珠由能夠直接或間接與核酸結(jié)合的材料組成微珠的殼層，由磁性材料組成微珠的核層。代表性的磁性材料包括但不局限于順磁物質(zhì)、鐵磁物質(zhì)和亞鐵磁物質(zhì)。
本方法可根據(jù)具體的實施條件選擇人工操作或者是自動化進(jìn)行實驗。如果具備相關(guān)的設(shè)備，采用磁性納米微珠或者將納米微珠固化或吸附在反應(yīng)管內(nèi)的濾膜或隔膜上，相應(yīng)地，可通過磁性分離或者抽濾代替離心進(jìn)行有關(guān)的分離操作，使整個實驗過程的任何步驟都可以程序化自動進(jìn)行，例如此方法結(jié)合生物芯片設(shè)備可建立自動化核酸芯片檢測系統(tǒng)。在不具備相關(guān)設(shè)備的情況下，本方法也可通過人工操作完成。此外，磁性分離替代離心操作實也可通過人工操作完成。自動化分析和手工操作這兩種模式的檢測效率的在敏感性和準(zhǔn)確性方面是一致的，自動化操作更有利于進(jìn)行高通量檢測。
本方法能夠在單個反應(yīng)管中完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測整個實驗過程，所述的單個反應(yīng)管是指對應(yīng)于一個待測樣品進(jìn)行一次檢測所需要的獨立實驗單元，可以是一個獨立的反應(yīng)管如一個PCR薄壁管，也可以是多孔板如96孔板中的一個孔。在單個反應(yīng)管中完成整個實驗過程便于實現(xiàn)多個樣品的并行檢測，配合自動化操作可進(jìn)行高通量的檢測實驗。
可以用任何合適的方法擴(kuò)增和實時檢測所述的核酸-納米微珠復(fù)合物中是否存在靶核酸。核酸特異性擴(kuò)增的方法包括但不局限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄依賴的放大系統(tǒng)(TAS)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增(LAMP)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)等。核酸的特異性擴(kuò)增與實時檢測相結(jié)合的代表性方法包括但不局限于熒光實時定量PCR、實時NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)與分子信標(biāo)(Molecular Beacon)相結(jié)合的核酸實時等溫擴(kuò)增檢測技術(shù))等。
本方法要求的溫度主要取決于形成核酸-納米微珠復(fù)合物之后所采用的核酸擴(kuò)增和實時檢測的方法。例如用熒光實時定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，擴(kuò)增和檢測過程需要溫度循環(huán)；如果用實時NASBA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，則擴(kuò)增和檢測過程需要控制在41℃±1℃進(jìn)行。從樣本提取核酸并形成核酸-納米微珠復(fù)合物的過程可以在室溫下進(jìn)行。
本方法可以用任何合適的樣品體積進(jìn)行。
II.代表性實施方案通過裂解待測樣品中的細(xì)胞(如病毒、細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞等)，釋放出核酸被納米微珠吸附形成核酸-納米微珠復(fù)合物，離心或通過磁力或抽濾將核酸-納米微珠復(fù)合物與其它成分分離，通過進(jìn)一步的洗滌去處殘余的不必要的組分后，將所獲得的核酸-納米微珠復(fù)合物直接與靶核酸的擴(kuò)增和實時檢測反應(yīng)體系混合，進(jìn)行靶核酸的特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的實時檢測。
實施方案的一個重要方面是采用納米微珠作為分離核酸的載體，在形成核酸-納米微珠復(fù)合物后直接將復(fù)合物用于擴(kuò)增和檢測，而無須如傳統(tǒng)方法那樣要先通過洗脫步驟使核酸從核酸-納米復(fù)合物中釋放出來、再對核酸進(jìn)行擴(kuò)增檢測，如此就實現(xiàn)了在一個反應(yīng)管中完成核酸的提取、擴(kuò)增和檢測，并且反應(yīng)體系中的納米微珠能夠促進(jìn)核酸的特異性擴(kuò)增和檢測的效率。
操作程序如下1)納米微珠，保存于無核酸酶的超純水中；2)將少量納米微珠與待測樣品、提取核酸所用的裂解緩沖液混合，用振蕩器充分振蕩、混勻，使核酸釋放并與納米微珠結(jié)合，形成核酸-納米微珠復(fù)合物；3)離心或利用磁場、或抽濾分離核酸-納米微珠復(fù)合物，棄去上清液，沖洗核酸-納米微珠復(fù)合物；4)沖洗后的核酸-納米微珠復(fù)合物經(jīng)風(fēng)干后加入核酸擴(kuò)增和檢測體系的反應(yīng)組分進(jìn)行擴(kuò)增和實時檢測。
實施例一利用納米玻璃微珠在單管內(nèi)擴(kuò)增檢測人血清HIV-1RNA反應(yīng)在200μl PCR薄壁管(RNase Free)中進(jìn)行，采用多孔納米玻璃微珠作為核酸分離純化載體，酶標(biāo)儀中進(jìn)行靶核酸的特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的實時檢測，核酸的實時擴(kuò)增檢測方法參照(NucleicAcids Res.1998；26(9)2150-2155.)。
樣本為血清學(xué)檢測已確認(rèn)的HIV-1感染者的血清以及無HIV-1感染的正常人血清。每個待測樣本取100μl血清，在PCR薄壁管中與裂解液(5M異硫氰酸胍，0.1MTris·HCl(pH6.4)，1％TritonX-100)60μl充分混勻，然后加入納米玻璃微珠(400mg/mlH2O)2.5μl，充分震蕩混勻，室溫靜置10min后離心(12000rpm，1min)，棄上清。洗滌緩沖液I(5M異硫氰酸胍，0.1M Tris·HCl(pH6.4))和洗滌緩沖液II(75％乙醇)依次沖洗微珠各2次。沖洗結(jié)束棄上清后，加入超純水(RNase Free)5μl，與預(yù)先準(zhǔn)備好的實時擴(kuò)增檢測的反應(yīng)體系(10μl)混合。65℃孵育5min后再于41℃孵育5min，加入5μl酶混合液后置于酶標(biāo)儀進(jìn)行恒溫(41℃)擴(kuò)增檢測，儀器設(shè)定每分鐘檢測1次熒光信號的變化，反應(yīng)持續(xù)90分鐘。
反應(yīng)體系的組成參照(Nucleic Acids Res.1998；26(9)2150-2155.)，各組分及終濃度如下Tris-HCl(40mM，pH 8.5)，MgCl2(12mM)，KCl(70mM)，DTT(0.5mM)，dNTP(各1mM)，ATP/UTP/CTP(各2mM)，GTP(1.5mM以及ITP(0.5mM)，引物1和引物2各1μM，探針50nM。引物和設(shè)計參照(J Clin Microbiol.2001；39(4)1378-1384.)，序列如下引物1(5′-aattctaatacgactcactatagggagagGGGCGCCACTGCTAGAGA)，引物2(5′-CTCAATAAAGCTTGCCTTGA)，探針(5′-FAM-cgtacgagtagtgtgtgcccgtctgtcgtacg-DABCYL)。
酶混合液的組成亦參照(Nucleic Acids Res.1998；26(9)2150-2155.)，成份如下山梨醇(375mM)，BSA(2.1μg)，RNase H(0.08U)，T7RNA聚合米(32U)以及AMV反轉(zhuǎn)錄酶(6.4U)。
實施例二利用磁性納米玻璃微珠在單管內(nèi)擴(kuò)增檢測人血清HIV-1RNA反應(yīng)在可進(jìn)行熒光檢測的96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，采用磁性納米玻璃微珠作為核酸分離純化載體，酶標(biāo)儀中進(jìn)行靶核酸的特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的實時檢測，核酸的實時擴(kuò)增檢測方法參照(Nucleic Acids Res.1998；26(9)2150-2155.)。
樣本為血清學(xué)檢測已確認(rèn)的HIV-1感染者的血清以及無HIV-1感染的正常人血清。每個待測樣本取100μl血清，在酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中與裂解液(5M異硫氰酸胍，0.1M Tris·HCl(pH6.4)，1％Triton X-100)60μl充分混勻，然后加入磁性納米玻璃微珠(400mg/ml H2O)2.5μl，輕柔振搖10min后，磁性分離器上固定微珠，棄上清。洗滌緩沖液I(5M異硫氰酸胍，0.1M Tris·HCl(pH6.4))和洗滌緩沖液II(75％乙醇)依次沖洗微珠各2次。沖洗結(jié)束棄上清后，加入超純水(RNase Free)5μl，與預(yù)先準(zhǔn)備好的實時擴(kuò)增檢測的反應(yīng)體系(10μl)混合。65℃孵育5min后再于41℃孵育5min，加入5μl酶混合液后置于酶標(biāo)儀進(jìn)行恒溫(41℃)擴(kuò)增檢測，儀器設(shè)定每分鐘檢測1次熒光信號的變化，反應(yīng)持續(xù)90分鐘。
反應(yīng)體系的組成參照(Nucleic Acids Res.1998；26(9)2150-2155.)，各組分及終濃度如下Tris-HCl(40mM，pH 8.5)，MgCl2(12mM)，KCl(70mM)，DTT(0.5mM)，dNTP(各1mM)，ATP/UTP/CTP(各2mM)，GTP(1.5mM以及ITP(0.5mM)，引物1和引物2各1μM，探針50nM。引物和設(shè)計參照(J Clin Microbiol.2001；39(4)1378-1384.)，序列如下引物1(5′-aattctaatacgactcactatagggagagGGGCGCCACTGCTAGAGA)，引物2(5′-CTCAATAAAGCTTGCCTTGA)，探針(5′-FAM-cgtacgagtagtgtgtgcccgtctgtcgtacg-DABCYL)。
酶混合液的組成亦參照(Nucleic Acids Res.1998；26(9)2150-2155.)，成份如下山梨醇(375mM)，BSA(2.1μg)，RNase H(0.08U)，T7RNA聚合米(32U)以及AMV反轉(zhuǎn)錄酶(6.4U)。
權(quán)利要求
1.一種基于納米微珠、能夠在單個反應(yīng)管內(nèi)完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測全部過程的方法；同時在所述的單個反應(yīng)管中，所提取的核酸無損失地參與擴(kuò)增和檢測。該方法包括將含有或可能含有核酸的樣品經(jīng)化學(xué)或物理等方法處理后，使核酸釋放并與納米微珠混合；如果所述樣品中存在核酸，則核酸與納米微珠形成核酸-納米微珠復(fù)合物；通過離心、或磁力、或抽濾將核酸-納米微珠復(fù)合物與其他成分分離；所述被分離的核酸-納米微珠復(fù)合物不經(jīng)洗脫、全部直接用于核酸實時擴(kuò)增檢測系統(tǒng)進(jìn)行靶核酸的特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的實時檢測，以明確所測樣品中是否存在特定的核酸序列并可確定其濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法能夠在單個反應(yīng)管中完成核酸的提取、靶核酸的特異性擴(kuò)增、以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的全部過程。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的單個反應(yīng)管是指對應(yīng)于一個樣品進(jìn)行一次檢測所需要的獨立實驗單元，可以是一個獨立的反應(yīng)管如一個PCR薄壁管，也可以是多孔板如96孔板中的一個孔。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，能夠在單個反應(yīng)管中完成核酸的提取、靶核酸的特異性擴(kuò)增、以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的全部過程，當(dāng)利用多個所述單反應(yīng)管時就便于實現(xiàn)多樣本的并行檢測。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法在核酸與納米微珠形成核酸-納米微珠復(fù)合物后，無須將核酸從核酸-納米微珠復(fù)合物上洗脫、轉(zhuǎn)移或分離，核酸及其納米微珠載體以復(fù)合物的形式全部直接進(jìn)入核酸的特異性擴(kuò)增和實時檢測。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述核酸-納米微珠復(fù)合物全部直接用于核酸實時擴(kuò)增檢測系統(tǒng)時，核酸在擴(kuò)增和實時檢測過程中的存在形式可以是仍舊吸附在納米微珠上，也可以是與納米微珠分離而游離于反應(yīng)體系中。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法的整個實驗過程可以在自動化設(shè)備上完成，也可以通過手工操作完成。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品是指任何可能含有可用本方法分離、擴(kuò)增和檢測的靶核酸的物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述靶核酸可以是DNA及其衍生物、RNA及其衍生物、或者DNA及其衍生物與RNA及其衍生物的混合物。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠其表面可以是由任何能夠與核酸非特異或者特異結(jié)合的材料制成。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠可以是磁性納米微珠，也可以是非磁性納米微珠。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述磁性納米微珠是指能夠在外加磁場的作用下產(chǎn)生磁性，可通過磁力作用與反應(yīng)體系其他組分分離的納米微珠。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述磁性納米微珠為核殼式結(jié)構(gòu)的納米微珠由磁性材料組成微珠的核層，由能夠直接或間接與核酸結(jié)合的材料組成微珠的殼層。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，如果采用磁性納米微珠，以磁性分離代替離心便于使整個實驗過程自動化進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠的直徑在1nm～10000nm之間，優(yōu)選直徑在10nm～1000nm之間。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠的的幾何形狀可以是規(guī)則的，也可以是不規(guī)則的。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠的表面可以是光滑的，也可以是具有許多微孔的。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述表面具有微孔的納米微珠，其微孔可以貫穿納米微珠而形成孔道，也可以是不貫穿微珠的微孔。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述組成磁性納米微珠核層的磁性材料包括但不局限于順磁物質(zhì)、鐵磁物質(zhì)和亞鐵磁物質(zhì)等可磁化物質(zhì)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述可磁化物質(zhì)主要是由納米級的金屬組合物組成，包括但不局限于鐵、鈷、鎳等金屬的氧化物。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠其表面可以根據(jù)具體需要進(jìn)行必要的修飾或標(biāo)記。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠可以是懸浮在反應(yīng)管中的。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠可以是固化在反應(yīng)管內(nèi)壁的，反應(yīng)管內(nèi)壁可以是規(guī)則光滑的，也可以是不規(guī)則不光滑的。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠也可以是固化或吸附在反應(yīng)管內(nèi)的濾膜或隔膜上的。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，如果采用濾膜或隔膜固化或吸附納米微珠，可以用抽濾分離代替離心或磁力進(jìn)行分離操作，便于使整個實驗過程自動化進(jìn)行。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米微珠可以使用任何合適的方法自行制備，也可以是能夠直接獲得的商品。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的確定樣品中靶核酸濃度的方法取決于核酸實時擴(kuò)增檢測系統(tǒng)所采用的定量檢測方法。
28.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸實時擴(kuò)增檢測系統(tǒng)可以是任何一種核酸特異性擴(kuò)增和實時檢測方法。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述的核酸特異性擴(kuò)增可以是需要溫度循環(huán)的核酸擴(kuò)增方法，也可以是核酸的等溫擴(kuò)增方法，這些方法包括但不局限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄依賴的放大系統(tǒng)(TAS)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增(LAMP)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)等。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域。發(fā)明公開了一種以納米微珠為平臺、可在單個反應(yīng)管中完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測的方法，其目的是將核酸提取、擴(kuò)增和檢測整合為一個連續(xù)的過程，從而實現(xiàn)所提取的核酸無損失地參與擴(kuò)增和檢測，并且便于進(jìn)行高通量的核酸檢測實驗。技術(shù)方案包括將待測樣品中的核酸釋放并與納米微珠混合；如果樣品中存在核酸，則核酸與納米微珠形成核酸－納米微珠復(fù)合物；將核酸－納米微珠復(fù)合物與其他成分分離；所述被分離的核酸－納米微珠復(fù)合物全部直接用于核酸的實時擴(kuò)增檢測系統(tǒng)進(jìn)行靶核酸檢測，以明確樣品中是否存在特定的核酸序列并可確定其濃度。本方法可用于臨床醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等涉及生物診斷的領(lǐng)域以及生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究。
文檔編號C12Q1/68GK101033484SQ20061002067
公開日2007年9月12日 申請日期2006年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月10日
發(fā)明者萬強(qiáng), 郭建輝, 嚴(yán)俊, 周裕程 申請人:成都愛特科生物技術(shù)有限公司