專利名稱：利用促生拮抗菌m18衍生菌株制備殺菌劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物源殺菌劑的制備方法，尤其涉及一種利用促生拮抗菌M18衍生菌株的代謝產(chǎn)物制備防治植物病害的殺菌劑的方法。屬于微生物源農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物病害引起的農(nóng)作物減產(chǎn)幅度約占總產(chǎn)量的25～75％，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。以我國(guó)的主要糧食作物水稻為例，每年種植面積約4億畝，按畝產(chǎn)量400公斤，水稻病害引起減產(chǎn)10％計(jì)，每年造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)300億元人民幣之巨。目前，生產(chǎn)上控制植物病害除了選用良種和改進(jìn)栽培措施外，主要依靠噴灑化學(xué)殺菌劑。但是，大多化學(xué)殺菌劑對(duì)人體和動(dòng)物具有不同程度的毒害作用，殘留在植物可食部分的有害成份對(duì)人體健康造成的潛在威脅，已經(jīng)引起政府和社會(huì)各階層的關(guān)注；不僅如此，化學(xué)農(nóng)藥一般不易分解，會(huì)長(zhǎng)期地累積在生態(tài)系統(tǒng)中，造成對(duì)環(huán)境的污染，不利于社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展；而且，現(xiàn)有的化學(xué)農(nóng)藥對(duì)某些植物病害并不完全有效。因此，需要發(fā)展新一代高效低毒、對(duì)環(huán)境相容性好的化學(xué)農(nóng)藥，同時(shí)還需要大力研究和發(fā)展生物源農(nóng)藥。
1992年，世界環(huán)境與發(fā)展大會(huì)曾經(jīng)提出，在新世紀(jì)之前，生物源農(nóng)藥的使用量要達(dá)到農(nóng)藥使用總量60％的目標(biāo)，然而，時(shí)至今日，作為發(fā)達(dá)國(guó)家的美國(guó)還只占15％左右，而我國(guó)約占5％。目前，與化學(xué)農(nóng)藥相比，在生產(chǎn)上已經(jīng)推廣使用的生物源農(nóng)藥，品種和數(shù)量都較少，有些品種由于使用年久，已經(jīng)引起植物病原菌產(chǎn)生不同程度的抗藥性，防治效果不夠理想。以水稻紋枯病為例，該病害與稻瘟病、白葉枯病并列為水稻生產(chǎn)中的三大主要病害，防治該病害的藥劑主要依賴于生物源農(nóng)藥井崗霉素，但是，經(jīng)過(guò)30多年來(lái)長(zhǎng)期地單一使用，部分水稻紋枯病菌的融合群已產(chǎn)生抗藥性；而且，井崗霉素僅對(duì)水稻紋枯病菌有效，對(duì)其他病原菌沒(méi)有明顯的防治效果，使用范圍有很大局限性。
生物農(nóng)藥促生拮抗菌M18，對(duì)植物病害的殺菌作用具有高效、安全、廣譜、與環(huán)境相容性好等特征，已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專利，專利號(hào)為00119857.2。該促生拮抗菌M18已于2000年6月27日在中國(guó)專利局指定的保藏單位北京，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO.0462。但是，生物農(nóng)藥促生拮抗菌M18是一種活菌菌劑，其合成抗植物病害的活性成分含量容易受到環(huán)境條件的影響，因而會(huì)影響抗植物病害的能力和防治效果的穩(wěn)定性。
已經(jīng)查明，促生拮抗菌M18防治植物病害的主要機(jī)理是分泌兩種抗菌物質(zhì)，分別是吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素。近年來(lái)，本發(fā)明申請(qǐng)人運(yùn)用分子生物學(xué)的技術(shù)，對(duì)促生拮抗菌M18合成這兩種抗菌物質(zhì)的調(diào)控機(jī)制，開(kāi)展了深入地研究。運(yùn)用基因工程手段，對(duì)促生拮抗菌M18基因組中的雙元調(diào)控基因gacA開(kāi)展了定向突變，獲得了M18衍生菌株M18G，能提高吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量，該研究成果的技術(shù)方法已經(jīng)公開(kāi)于2004年《微生物學(xué)學(xué)報(bào)》44卷第761～765頁(yè)，論文題目為《假單胞菌gacA插入突變對(duì)吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素合成代謝的差異性調(diào)控》。同時(shí)，對(duì)促生拮抗菌M18基因組中的另一個(gè)調(diào)控基因rsmA開(kāi)展定向突變，獲得了M18衍生菌株M18R，能提高藤黃綠菌素的產(chǎn)量，該研究成果的技術(shù)方法也已經(jīng)公開(kāi)于2004年《微生物學(xué)學(xué)報(bào)》44卷第189-193頁(yè)，論文題目為《熒光假單胞菌rsmA突變株的構(gòu)建及其對(duì)藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸合成的區(qū)別性調(diào)控作用》。如何進(jìn)一步利用以上所述兩種M18衍生菌株的特性制備高效的微生物殺菌劑是一項(xiàng)新的研究課題，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種利用促生拮抗菌M18衍生菌株制備殺菌劑的方法，利用微生物的代謝產(chǎn)物而非微生物活體制備殺菌劑，能更加穩(wěn)定、有效的控制植物病害。
本發(fā)明可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)在優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，利用促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G和M18R，分別生產(chǎn)出高含量吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素的發(fā)酵液，再分別將M18G發(fā)酵液和M18R發(fā)酵液制備成干粉，并以M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黃綠菌素含量的重量百分比為90％～10％和10％～90％進(jìn)行物理復(fù)配，制備成高效防治植物病害的微生物源殺菌劑。
本發(fā)明的方法具體包括以下步驟1、將M18G菌株接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在26～30℃下活化生長(zhǎng)20～24小時(shí)，然后將活化的M18G菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在26～30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)10～14小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為210～230轉(zhuǎn)/分；然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接2～3次，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行多級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)；最后轉(zhuǎn)接到葡萄糖培養(yǎng)液中進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為70～74小時(shí)，得到吩嗪-1-羧酸含量為1500～1700毫克/升的M18G菌株發(fā)酵液。其中，所述甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸鎂0.05～0.1％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％，pH 6.8～7.2；所述葡萄糖培養(yǎng)液的組分重量百分比為黃豆粉4.5～5.5％、葡萄糖3.8～4.2％、豆油0.3～0.5％、尿素0.1～0.3％、其余為水，pH 6.8～7.2。
2、將M18R菌株接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在26～30℃下活化生長(zhǎng)18至24小時(shí)；然后將活化的M18R菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在26～30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)10～14小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為230～250轉(zhuǎn)/分；然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接3～4次，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行多級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)，最后一級(jí)的發(fā)酵時(shí)間為68～72小時(shí)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，得到藤黃綠菌素含量為750～850毫克/升的M18R菌株發(fā)酵液。其中，所述的甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比與步驟1中所述相同。
3、分別將M18G菌株發(fā)酵液和M18R菌株發(fā)酵液，按常規(guī)技術(shù)，干燥成粉，制備成M18G干粉和M18R干粉。
4、將M18G干粉和M18R干粉混合，制成可濕性粉劑，即為本發(fā)明的殺菌劑，其中，M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黃綠菌素重量百分比分別為90％～10％和10％～90％。
利用本發(fā)明制備的微生物源殺菌劑對(duì)植物進(jìn)行噴霧或灌根施用，使用濃度為15毫克/升，畝用量0.3克，可以有效防治水稻紋枯病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、棉花枯萎病、炭疽病、立枯病和各種腐霉和疫霉等引起的多種植物病害。
在上海郊區(qū)、江西、浙江、江蘇等地開(kāi)展的對(duì)水稻紋枯病的防治示范推廣試驗(yàn)，取得了80％以上的防治效果，推廣應(yīng)用面積達(dá)到7萬(wàn)畝。
本發(fā)明制備的殺菌劑保持了促生拮抗菌M18原有的安全、廣譜及與環(huán)境相容性好等特征外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)1、殺菌劑中的活性成分吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素的含量較為穩(wěn)定。與促生拮抗菌M18相比，殺菌劑的上述兩種活性成分是在可控條件下產(chǎn)生的，而促生拮抗菌M18的活性成分是由該活菌在田間使用時(shí)的環(huán)境條件下產(chǎn)生，其活性成分含量容易受環(huán)境條件的影響。
2、殺菌劑中的活性成分吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素的含量大幅度提高。促生拮抗菌M18菌株合成這兩種抗菌物質(zhì)的效價(jià)都比較低，在通常條件下，每升發(fā)酵液中，吩嗪-1-羧酸的效價(jià)為100至150毫克，藤黃綠菌素的效價(jià)僅為20至40毫克左右。利用本發(fā)明方法，在優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，通過(guò)衍生菌株M18G合成吩嗪-1-羧酸，每升發(fā)酵液中的含量可達(dá)到1500毫克以上，與原技術(shù)相比，發(fā)酵效價(jià)提高了約10倍；同時(shí)，在適宜的培養(yǎng)基和優(yōu)化的發(fā)酵條件下，通過(guò)衍生菌株M18R合成藤黃綠菌素，每升發(fā)酵液中含量可達(dá)到750毫克以上，與原技術(shù)相比，發(fā)酵效價(jià)提高了約20倍。
3、殺菌劑的抗菌效果成倍地提高。將M18G干粉和M18R干粉進(jìn)行復(fù)配，能夠產(chǎn)生加成作用，因而，對(duì)包括水稻紋枯病在內(nèi)的植物病害的抑制作用，比同劑量單劑的藥效提高5至10倍。以防治水稻紋枯病為例，單用吩嗪-1-羧酸對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用，達(dá)到50％效果時(shí)的濃度，即EC50，為8.4毫克/升，單用藤黃綠菌素對(duì)水稻紋枯病菌的EC50為53.4毫克/升，將M18G干粉和M18R干粉進(jìn)行復(fù)配，使吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素的重量百分比為90％∶10％時(shí)，對(duì)水稻紋枯病菌的EC50下降為0.74毫克/升，分別比單用吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素抑制效果提高了10倍和70倍以上。
4、殺菌劑的劑型優(yōu)越，能延長(zhǎng)保存期。本發(fā)明制成的殺菌劑，為可濕性粉劑。其特征在于，其活性成分是在可控條件下產(chǎn)生的微生物代謝產(chǎn)物，而不是活菌，制備成粉劑后，有效成分的含量比較穩(wěn)定，能長(zhǎng)期保存。相比之下，促生拮抗菌M18活菌制劑，其發(fā)酵液中的活菌數(shù)會(huì)隨著保存期的延長(zhǎng)而減少，保存期較短。
5、殺菌劑的使用方便。由于本發(fā)明方法得到的殺菌劑，是穩(wěn)定的可濕性粉劑，而非液體活菌制劑，因而在包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和使用方面簡(jiǎn)便易行。
6、殺菌劑的生產(chǎn)成本和使用成本低。與相關(guān)活菌制劑相比，同劑量的生產(chǎn)成本和使用成本降低50％以上。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)效果作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1將促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在26℃下活化生長(zhǎng)24小時(shí)，然后將活化的M18G菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中，在26℃的搖床中振蕩培養(yǎng)14小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為210轉(zhuǎn)/分。然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行3級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)。最后，轉(zhuǎn)接到葡萄糖培養(yǎng)液中進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為74小時(shí)，得到M18G菌株發(fā)酵液。其中，所述的甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8％、甘油1.3％、硫酸鎂0.07％、磷酸二氫鉀0.03％、pH 7.0；所述的葡萄糖培養(yǎng)液的組分重量百分比為黃豆粉5.0％、葡萄糖3.8％、豆油0.4％、尿素0.2％、余量為水，pH 7.0。測(cè)定74小時(shí)M18G菌株發(fā)酵液中的吩嗪-1-羧酸含量為1500毫克/升。按常規(guī)干燥技術(shù)，將發(fā)酵液制備成M18G干粉。
將促生拮抗菌M18的衍生菌株M18R接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在26℃下活化生長(zhǎng)24小時(shí)；然后將活化的M18R菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在26℃的搖床中振蕩培養(yǎng)14小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分。然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行3級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)，第三級(jí)的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)為72小時(shí)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，得到M18R菌株發(fā)酵液；其中，所述的甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8％、甘油1.3％、硫酸鎂0.07％、磷酸二氫鉀0.03％、pH7.0。測(cè)定72小時(shí)M18R菌株發(fā)酵液中的藤黃綠菌素含量為800毫克/升。按常規(guī)干燥技術(shù)，將發(fā)酵液制備成M18R干粉。
將M18G干粉和M18R干粉混合，制成可濕性粉劑的殺菌劑，其中，M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黃綠菌素重量百分比分別為90％和10％。
在此配比下制備的殺菌劑，對(duì)水稻紋枯病，具有最大的增效作用，比同劑量單劑的藥效提高10倍以上。
實(shí)施例2將促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G菌株接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在28℃下活化生長(zhǎng)22小時(shí)，然后將活化的M18G菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在28℃的搖床中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分。然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行3級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)接到葡萄糖培養(yǎng)液中進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)為72小時(shí)，得到M18G菌株發(fā)酵液。其中，所述甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.0％、甘油1.7％、硫酸鎂0.1％、磷酸二氫鉀0.05％、pH7.2；所述葡萄糖培養(yǎng)液的組分重量百分比為黃豆粉5.5％、葡萄糖4.0％、豆油0.5％、尿素0.3％、余量為水，pH 7.2。測(cè)定72小時(shí)M18G菌株發(fā)酵液中的吩嗪-1-羧酸含量為1700毫克/升。按常規(guī)干燥技術(shù)，將發(fā)酵液制備成M18G干粉。
將促生拮抗菌M18的衍生菌株M18R接種在含有甘油培養(yǎng)基的平板上，在28℃下活化生長(zhǎng)22小時(shí)，然后將活化的M18R菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在28℃的搖床中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為240轉(zhuǎn)/分；然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行3級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)，第三級(jí)的發(fā)酵時(shí)間為70小時(shí)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，得到M18R菌株發(fā)酵液。其中，所述的甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.0％、甘油1.7％、硫酸鎂0.1％、磷酸二氫鉀0.05％、pH 6.8。
測(cè)定70小時(shí)M18R菌株發(fā)酵液中的藤黃綠菌素含量為850毫克/升。按常規(guī)技術(shù)干燥發(fā)酵液，制備成M18R干粉。
將M18G干粉和M18R干粉混合，制成可濕性粉劑的殺菌劑，其中，M18G干粉中所含的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中所含的藤黃綠菌素的重量百分比分別為16％和84％。
在此配比下制備的殺菌劑，對(duì)瓜果疫霉具有最大的增效作用，比同劑量單劑的藥效提高5倍以上。
實(shí)施例3將促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G菌株接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在30℃下活化生長(zhǎng)20小時(shí)，然后將活化的M18G菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在28℃的搖床中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分；然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行3級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)。最后，轉(zhuǎn)接到葡萄糖培養(yǎng)液中進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為70小時(shí)，得到M18G菌株發(fā)酵液。其中，所述甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.2％、甘油1.7％、硫酸鎂0.05％、磷酸二氫鉀0.01％，pH 6.8；所述葡萄糖培養(yǎng)液的組分重量百分比為黃豆粉4.5％、葡萄糖4.2％、豆油0.3％、尿素0.1％、pH 6.8。測(cè)定70小時(shí)M18G菌株發(fā)酵液中的吩嗪-1-羧酸含量達(dá)1600毫克/升。按常規(guī)技術(shù)干燥，將發(fā)酵液制備成M18G干粉。
將促生拮抗菌M18的衍生菌株M18R菌株接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在32℃下活化生長(zhǎng)18小時(shí)，然后將活化的M18R菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在32℃的搖床中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為2250轉(zhuǎn)/分。然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行3級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)，第三級(jí)的發(fā)酵時(shí)間為68小時(shí)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，得到M18R菌株發(fā)酵液。其中，所述的甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨2.2％、甘油17％、硫酸鎂0.05％、磷酸二氫鉀0.01％，pH6.8。
測(cè)定68小時(shí)M18R菌株發(fā)酵液中的藤黃綠菌素含量為750毫克/升。按常規(guī)技術(shù)干燥，將發(fā)酵液制備成M18R干粉。
將M18G干粉和M18R干粉混合，制成可濕性粉劑殺菌劑，其中，M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黃綠菌素的重量百分比均為50％。
在此配比下制備的殺菌劑，對(duì)各種枯萎病，具有最大的增效作用，比同劑量單劑的藥效提高8倍以上。
權(quán)利要求
1.一種利用促生拮抗菌M18衍生菌株制備殺菌劑的方法，其特征在于包括如下步驟1)將M18G菌株接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在26～30℃下活化生長(zhǎng)20～24小時(shí)，然后將活化的M18G菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在26～30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)10～14小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為210～230轉(zhuǎn)/分；然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接2～3次，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行多級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)；最后轉(zhuǎn)接到葡萄糖培養(yǎng)液中進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵時(shí)間為70～74小時(shí)，得到吩嗪-1-羧酸含量為1500～1700毫克/升的M18G菌株發(fā)酵液；其中，所述甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比為蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸鎂0.05～0.1％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％、pH 6.8～7.2；所述葡萄糖培養(yǎng)液的組分重量百分比為黃豆粉4.5～5.5％、葡萄糖3.8～4.2％、豆油0.3～0.5％、尿素0.1～0.3％、余量為水，pH 6.8～7.2；2)將M18R菌株接種在甘油培養(yǎng)基的平板上，在26～30℃下活化生長(zhǎng)18至24小時(shí)；然后將活化的M18R菌株轉(zhuǎn)接到含有甘油培養(yǎng)液的三角瓶中放大，在26～30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)10～14小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為230～250轉(zhuǎn)/分；然后繼續(xù)轉(zhuǎn)接3～4次，在甘油培養(yǎng)液中進(jìn)行多級(jí)放大發(fā)酵培養(yǎng)，最后一級(jí)的發(fā)酵時(shí)間為68～72小時(shí)，溫度和轉(zhuǎn)速不變，得到藤黃綠菌素含量為750～850毫克/升的M18R菌株發(fā)酵液；其中，所述的甘油培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)液中含有的組分重量百分比與步驟1中所述相同；3)分別將M18G菌株發(fā)酵液和M18R菌株發(fā)酵液，干燥成粉，制備成M18G干粉和M18R干粉；4)將M18G干粉和M18R干粉混合，制成可濕性粉劑，即為殺菌劑，其中，M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黃綠菌素的重量百分比分別為90％～10％和10％～90％。
2.一種采用權(quán)利要求1的方法制備的殺菌劑的應(yīng)用，其特征在于用于對(duì)植物進(jìn)行噴霧或灌根施用，防治水稻紋枯病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、棉花枯萎病、炭疽病、立枯病和各種腐霉和疫霉引起的植物病害。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用促生拮抗菌M18衍生菌株制備殺菌劑的方法，在優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，利用促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G和M18R，分別生產(chǎn)出高含量吩嗪－1－羧酸和藤黃綠菌素的發(fā)酵液，再分別將M18G發(fā)酵液和M18R發(fā)酵液制備成干粉，并以M18G干粉中的吩嗪－1－羧酸和M18R干粉中的藤黃綠菌素的重量百分比為90％～10％和10％～90％進(jìn)行物理復(fù)配，制備成高效防治植物病害的微生物源殺菌劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的殺菌劑是以微生物代謝產(chǎn)物為活性成分的可濕性粉劑而非活菌制劑，因而具有高穩(wěn)定性，其藥效不易受環(huán)境條件的影響，同時(shí)在低劑量使用的前提下，對(duì)植物的多種病害具有更高的防治效果。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1802927SQ200610023459
公開(kāi)日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2006年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月19日
發(fā)明者許煜泉 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)