專利名稱：水稻gamyb結合復合物1和編碼這種多肽的多核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明描述了一種新的多肽——水稻GAMYB結合復合物1，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的應用。
背景技術：
myb相關基因作為一類轉錄調(diào)節(jié)因子，一直是生物學研究中的熱點課題。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的所有myb相關基因都有一個相當保守的DNA結合區(qū)，使得MYB蛋白能有效地與所調(diào)控基因5’啟動區(qū)相關序列相結合。近年來，不僅對動物中作為原癌基因的myb研究日益活躍，在植物中也發(fā)現(xiàn)了不少與myb相似的轉錄調(diào)節(jié)因子。myb相關基因在植物中組成了一個很大的基因家族，它們調(diào)節(jié)著植物生命活動中的許多重要環(huán)節(jié)，如種子發(fā)育、光形態(tài)建成、抗逆性狀的表達及植物次生代謝等。
GAmyb(GA調(diào)節(jié)的淀粉酶轉錄因子)是myb相關基因的一種，最早在大麥中被發(fā)現(xiàn)，它是一類受GA調(diào)節(jié)的基因。在大麥糊粉層中，GAmyb可能是α2淀粉酶基因表達的正調(diào)控因子，它具備myb相關基因所共有的保守序列R2，R3及一個可能的轉錄激活區(qū)，其作用可能受另外兩個調(diào)控因子GAB1和VP1的競爭性抑制。用玉米的C1 myb作探針，發(fā)現(xiàn)大麥糊粉層存在3組不同分子量且均與GA有關的myb基因，其中2組被GA負調(diào)控，另外1組受GA正調(diào)控。
但是，目前對GAmyb的功能的了解甚少，并且也沒有找到與其特異性結合的物質(zhì)。因此，迫切需要找到一種新的與GAmyb的功能相關的基因，以進一步研究GAmyb的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多核苷酸——水稻GAMYB結合復合物1，所述多核苷酸用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列，或作為轉基因植物鑒定中的內(nèi)參照基因。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，所述的水稻多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與GAMYB結合功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如上所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中225-599位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-645位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，所述的載體含有如上所述的多核苷酸。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞含有如上所述的載體。
在本發(fā)明的第五方面，提供一種多肽的制備方法，該方法包含以下步驟(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)如上所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出如上所述的多肽。
在本發(fā)明的第六方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于(1)作為轉基因植物鑒定中的內(nèi)參照基因；或(2)制備基因芯片或微列陣。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列，或作為轉基因植物鑒定中的內(nèi)參照基因。
在本發(fā)明的第七方面，提供一種基因芯片，包括固相載體和有序固定于所述固相載體的寡核苷酸探針，所述的探針包括與SEQ ID NO1特異性結合的15-60個堿基的寡核苷酸探針。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的基因芯片中有序固定于所述固相載體的探針為30-40個堿基的寡核苷酸探針。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1是本發(fā)明水稻GAMYB結合復合物1和GAMYB氨基酸序列的同源性比較圖。上方序列(Query)是水稻GAMYB結合復合物1的氨基酸序列，下方序列(Subjct)是GAMYB的氨基酸序列。相同氨基酸在兩個序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。可見，兩者的相同性＝118/125(94％)，相似性＝119/125(95％)。
圖2顯示了轉基因植物檢測芯片雜交圖；其中，第一排為水稻GAMYB基因的探針。
圖3為分離的水稻GAMYB結合復合物1的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。12KDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗，找到一種新的基因，其能夠與GAMYB特異性結合，在本發(fā)明中命名為“水稻GAMYB結合復合物1”?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
在本發(fā)明中，除非特別說明，說明書和權利要求書中使用的下列術語具有如下的含義“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因組或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，代表有義鏈或反義鏈。類似地，術語“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分。當本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關的完整的天然氨基酸。
蛋白質(zhì)或多核苷酸“變體”是指一種具有一個或多個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結構或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個或多個氨基酸或核苷酸的缺失。
“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改變導致與天然存在的分子相比，一個或多個氨基酸或核苷酸的增加。“替換”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個或多個氨基酸或核苷酸。
“生物活性”是指具有天然分子的結構、調(diào)控或生物化學功能的蛋白質(zhì)。類似地，術語“免疫學活性”是指天然的、重組的或合成蛋白質(zhì)及其片段在合適的動物或細胞中誘導特定免疫反應以及與特異性抗體結合的能力。
“基本上純”是指基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術純化水稻GAMYB結合復合物1。基本上純的水稻GAMYB結合復合物1在非還原性聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。水稻GAMYB結合復合物1多肽的純度可用氨基酸序列分析。
“互補的”或“互補”是指在允許的鹽濃度和溫度條件下通過堿基配對的多核苷酸天然結合。例如，序列“C-T-G-A”可與互補的序列“G-A-C-T”結合。兩個單鏈分子之間的互補可以是部分的或全部的。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈之間雜交的效率及強度有明顯影響。
“同源性”是指互補的程度，可以是部分同源或完全同源?！安糠滞础笔侵敢环N部分互補的序列，其至少可部分抑制完全互補的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過在嚴格性程度降低的條件下進行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來檢測?；旧贤吹男蛄谢螂s交探針可競爭和抑制完全同源的序列與靶序列在的嚴格性程度降低的條件下的結合。這并不意味嚴格性程度降低的條件允許非特異性結合，因為嚴格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結合為特異性或選擇性相互作用。
“相同性百分率”是指在兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同或相似的百分率?？捎秒娮臃椒y定相同性百分率，如通過MEGALIGN程序(Lasergene software package，DNASTAR，Inc.，Madison Wis.)。MEGALIGN程序可根據(jù)不同的方法如Cluster法比較兩種或多種序列(Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73237-244)。Cluster法通過檢查所有配對之間的距離將各組序列排列成簇。然后將各簇以成對或成組分配。兩個氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率通過下式計算 也可以通過Cluster法或用本領域周知的方法如Jotun Hein測定核酸序列之間的相同性百分率(Hein J.，(1990)Methods in emzumology183625-645)。
“相似性”是指氨基酸序列之間排列對比時相應位置氨基酸殘基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，帶負電荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸可包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的頭部基團有相似親水性的氨基酸可包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。
“反義”是指與特定的DNA或RNA序列互補的核苷酸序列?！胺戳x鏈”是指與“有義鏈”互補的核酸鏈。
“衍生物”是指HFP或編碼其的核酸的化學修飾物。這種化學修飾物可以是用烷基、?；虬被鎿Q氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學特性的多肽。
“分離的”一詞指將物質(zhì)從它原來的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán)境)之中移出。比如說，一個自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動物中就是沒有被分離出來，但同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開就是分離的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分。既然載體或組合物不是它天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的水稻GAMYB結合復合物1”是指水稻GAMYB結合復合物1基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術純化水稻GAMYB結合復合物1?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。水稻GAMYB結合復合物1多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明提供了一種新的多肽——水稻GAMYB結合復合物1，其基本上是由SEQID NO2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括水稻GAMYB結合復合物1的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的水稻GAMYB結合復合物1相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認為在本領域技術人員的知識范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還包括具有與水稻GAMYB結合復合物1相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。此外還包括水稻GAMYB結合復合物1的活性片段和活性衍生物。
多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與水稻GAMYB結合復合物1 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗水稻GAMYB結合復合物1的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含水稻GAMYB結合復合物1或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了水稻GAMYB結合復合物1的可溶性片段。通常，該片段具有水稻GAMYB結合復合物1序列的至少約20個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供水稻GAMYB結合復合物1或多肽的類似物。這些類似物與天然水稻GAMYB結合復合物1的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“水稻GAMYB結合復合物1保守性變異多肽(或水稻GAMYB結合復合物1保守性變異蛋白)”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明還提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是從水稻的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。它包含的多核苷酸序列全長為645個堿基，其開放讀框225-599編碼了125個氨基酸。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與水稻GAMYB有94％的同源性，可推斷出該水稻GAMYB結合復合物1具有水稻GAMYB結合復合物相似的結構和功能。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，”核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少20-30個核苷酸，更好是至少50-60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼水稻GAMYB結合復合物1的多核苷酸。
應理解，雖然本發(fā)明的水稻GAMYB結合復合物1基因優(yōu)選得自水稻，但是得自其它植物的與水稻GAMYB結合復合物1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，例如BLAST。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼水稻GAMYB結合復合物1的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離多核苷酸。這些技術包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結構特征的克隆的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA不太常用。DNA序列的直接化學合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離目的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，等，分子克隆實驗室指南，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結合使用聚合酶反應技術時，即使極少的表達產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測定水稻GAMYB結合復合物1的轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個核苷酸之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測水稻GAMYB結合復合物1基因表達的蛋白產(chǎn)物可用免疫學技術如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，等，Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger等，PNAS，1977，745463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明的蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或水稻GAMYB結合復合物1編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的水稻GAMYB結合復合物1。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼水稻GAMYB結合復合物1的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；
(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，水稻GAMYB結合復合物1多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含水稻GAMYB結合復合物1編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉化植物也可使用農(nóng)桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得葉片形狀發(fā)生改變的植物。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的水稻GAMYB結合復合物1蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進或對抗水稻GAMYB結合復合物1功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組水稻GAMYB結合復合物1篩選多肽庫可用于尋找有價值的能抑制或刺激水稻GAMYB結合復合物1功能的多肽分子。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析。用水稻GAMYB結合復合物1特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測水稻GAMYB結合復合物1的轉錄產(chǎn)物。
水稻GAMYB結合復合物1能夠特異性的和GAMYB相結合，為進一步研究GAMYB的功能提供了一條新途徑。并且編碼水稻GAMYB結合復合物1的核苷酸序列只存在水稻中，是一條特異性很高的序列，為轉基因植物檢測中的水稻物種的特異性檢測提供了一條新思路。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1水稻GAMYB結合復合物1的克隆用酚/SDS法提取水稻總RNA。用Quik mRNA分離試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點上，轉化DH5α細菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cyclereaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5’和3’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)進行比較，結果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆R0328D111的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。
結果表明，R0328D111克隆所含的全長cDNA為645bp(如SEQID NO1所示)，從第225bp至599bp有一個375bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2所示)。本發(fā)明人將此克隆命名為pBS-R0328D111。
實施例2cDNA克隆的同源檢索將實施例1中獲得的新的蛋白質(zhì)的序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF等，J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等數(shù)據(jù)庫進行同源檢索。與所述的新蛋白質(zhì)同源性最高的基因是一種預測的水稻GAMYB結合復合物。蛋白質(zhì)同源結果示于圖1，兩者高度同源。因此，本發(fā)明人將所述的新的蛋白質(zhì)命名為“水稻GAMYB結合復合物1”。
通過DNA序列同源性檢索，與R0328D111克隆所含的645bp全長cDNA同源性最高的為水稻的基因組序列，blastn的score值為1144，而score值次之的第一個其它物種為豆科作物Medicago truncatula，其score值為44.1。由此可以說明R0328D111克隆所含的645bp全長cDNA為水稻基因組中序列。
通過蛋白質(zhì)序列同源性檢索，與pBS-R0328D111克隆所含的125aa的蛋白序列同源性最高的為一種預測的水稻GAMYB結合復合物，blastx的score值為244，而score值次之的第一個其它物種蛋白為模式生物Arabidopsis thaliana的一種未知蛋白，其score值為123。由此可以說明pBS-R0328D111克隆所含的125aa的蛋白序列僅在水稻中存在，故可以作為檢測水稻物種的Mark基因。
實施例3用RT-PCR方法克隆編碼水稻GAMYB結合復合物1的基因用水稻總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉錄反應合成cDNA，用Qiagen的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增引物15’-GGAAAGGAAGCAAGCAAGGCCGCCC-3’(SEQ ID NO3)引物25’-CCAATGAAGCACAGACTGTGATAGA-3’(SEQ ID NO4)引物1為位于SEQ ID NO1的5’端的第1bp開始的正向序列；引物2為SEQ ID NO1的中的3’端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的TaqDNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃30秒，55℃30秒；72℃2分鐘。在RT-PCR時同時設β-actin(β-肌動蛋白)為陽性對照和模板空白為陰性對照。
擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQ ID NO1所示的1-645bp完全相同。
實施例4Northern印跡法分析水稻GAMYB結合復合物1基因的表達用酚/SDS法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法即用研磨緩沖液和TLE緩沖液平衡酚對組織進行勻漿，加入1倍體積的氯仿，混合后離心。將上層水相用等體積TLE緩沖液平衡酚多次反復抽提，加入LiCl沉淀并將混合物加入乙酸鈉和無水乙醇離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然后轉移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機引物法制備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴增的水稻GAMYB結合復合物1編碼區(qū)序列(225bp至599bp)。將32P-標記的探針(約2×106cpm/ml)與轉移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進行分析和定量。
圖3為分離的水稻GAMYB結合復合物1的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。12KDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
實施例5重組水稻GAMYB結合復合物1的體外表達、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下引物35’-CCCCATATGATGGCGAAGCTGCTGAGCTGCGTC-3’(SEQ ID NO5)引物45’-CATGGATCCCTAGAGGTGCCAGGGCATCTGGAA-3’(SEQ ID NO6)此兩段引物的5’端分別含有NheI和BamHI酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NheI和BamHI酶切位點相應于表達載體質(zhì)粒pET-28b(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-R0328D111質(zhì)粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-R0328D111質(zhì)粒10pg、引物-3和引物-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃20s，60℃30s，68℃2min，共25個循環(huán)。用NheI和BamHI分別對擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-R0328D111)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-R0328D111)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進行層析，得到了純化的目的蛋白水稻GAMYB結合復合物1。
經(jīng)SDS-PAGE電泳，在61kDa處得到一單一的條帶。將該條帶轉移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結果N-端15個氨基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
實施例6DNA微矩陣分析基因芯片或基因微矩陣(DNA Microarray)是指將大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等載體上，然后用熒光檢測和計算機軟件進行數(shù)據(jù)的比較和分析，以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。本發(fā)明的多核苷酸可作為水稻特異探針用于轉基因植物鑒定的內(nèi)參照基因，其具體方法步驟在文獻中已有多種報道，如可參閱文獻DeRisi，J.L.，Lyer，V.&Brown，P.O.(1997)Science278，680-686；及文獻Helle，R.A.，Schema，M.，Chai，A.，Shalom，D.，(1997)PNAS942150-2155。
(一)點樣根據(jù)水稻GAMYB結合復合物1基因全長cDNA序列設計30-40個堿基的寡核苷酸探針，序列來自于SEQ ID NO1中255-599中間的一段互補序列，在實際設計中考慮到與其他基因探針的Tm保持一致，具體序列如下所示。
探針5’-TCTTCTTTGGACTCTATAGGTTGTCCGTACTCGTCGTCGT-3’(SEQ ID NO7)將上述寡核苷酸探針與其他基因探針一起，分別配制成10uM的濃度，用Cartesian 7500點樣儀(購自美國Cartesian公司)點于玻璃介質(zhì)上，點與點之間的距離為280μm。將點樣后的玻片進行水合、干燥、置于紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)，洗脫后干燥使DNA固定在玻璃片上制備成芯片。其具體方法步驟在文獻中已有多種報道，其具體方法步驟在文獻中已有多種報道，本實施例的點樣后處理步驟如下1.潮濕環(huán)境中水合4小時；2.0.2％SDS洗滌1分鐘；3.ddH2O洗滌兩次，每次1分鐘；4.NaBH4封閉5分鐘；
5.95℃水中2分鐘；6.0.2％SDS洗滌1分鐘；7.ddH2O沖洗兩次；8.涼干，25℃儲存于暗處備用。
(二)探針標記用一步法分別從待測轉基因植物中抽提DNA，用熒光試劑Cy5dUTP(5-氨基-炔丙基-2’-脫氧尿苷5’-三磷酸偶聯(lián)于Cy5熒光染料，購自Amersham PhamaciaBiotech公司)標記DNA，經(jīng)純化后制備出探針。具體步驟參照及方法參照Schena，M.，Shalon，D.，Heller，R.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.9310614-10619.Schena，M.，Shalon，Dari.，Davis，R.W.(1995)Science.270.(20)467-480。
(三)雜交分別將來自以上待測轉基因植物和已知水稻樣品的探針與芯片一起在UniHybTMHybridization Solution(購自TeleChem公司)雜交液中進行雜交16小時，室溫用洗滌液(1×SSC，0.2％SDS)洗滌后用ScanArray 3000掃描儀(購自美國General Scanning公司)進行掃描，掃描的圖象用Imagene軟件(美國Biodiscovery公司)進行數(shù)據(jù)分析處理，該基因的雜交陽性點代表待檢植物是水稻品種。
雜交結果見圖2，其中第一排為水稻GAMYB結合復合物1基因的探針，雜交結果為陽性。
實施例7GAMYB結合復合物1與GAMYB的結合作用酵母雙雜合系統(tǒng)是在酵母細胞中研究蛋白-蛋白相互作用的新技術。應用該技術，以GAMYB蛋白為“誘餌”，對GAMYB結合復合物1與GAMYB蛋白結合的進行了研究。
酵母雙雜合系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)系由Fields等發(fā)明的一種在酵母細胞中檢測蛋白-蛋白相互作用的實驗方法。
酵母雙雜交的基本原理為真核細胞的轉錄因子由DNA結合域(DNA-binding domain，DNA-BD)和轉錄激活域(Activation domain，AD)兩個獨立的功能域組成，它們可存在于不同的蛋白分子中，只要空間距離靠近至一定范圍就能起反式作用。在酵母雙雜合系統(tǒng)中，“誘餌”蛋白X克隆至DNA-BD載體中，表達DNA-BD/X融合蛋白；待測試蛋白Y克隆至AD載體中，表達AD/Y融合蛋白。一旦X與Y蛋白間有相互作用，則DNA-BD和AD也隨之被牽拉靠近，恢復行使功能，激活報告重組體中LacZ和HIS 3基因的表達。該系統(tǒng)自創(chuàng)建以來，因其能快速、敏感地在真核細胞體內(nèi)檢測蛋白生理狀態(tài)下的相互作用而受到了日益廣泛的應用。
1.質(zhì)粒的構建GAMYB基因由EcoR I和Sal I酶切位點克隆至pGBT9載體(購自Clontech公司)GAL4 DNA-BD下游，構建成p GBT9/GAMYB重組體，用以在酵母中表達與GAL4 DNA-BD融合的GAMYB。利用同樣的辦法構建成p GAD10/GAMYB(pGAD10購自Clontech)結合復合物1重組體，用以在酵母中表達與GAL4 DNA-AD融合的GAMYB結合復合物1。
2.酵母的質(zhì)粒DNA轉化以氯化鋰方法將p GBT9/GAMYB質(zhì)粒轉入釀酒酵母Y190。選擇數(shù)個已獲質(zhì)粒轉化的菌落接種至50ml SD-Trp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日轉種400mlSD/-Trp培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6小時至OD600達到0.8。離心收獲細胞，沉淀懸浮于115ml 1×TE/LiAc(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，100mmol/LLiAc)溶液中制成感受態(tài)酵母，再加入GAMYB結合復合物1 100μg、單鏈魚精DNA750μg以及PEG/LiAc(40％PEG4000，100mmol/L LiAc)溶液9ml，振蕩充分混勻。30℃振蕩作用30分鐘。加入DMSO 1ml，42℃熱休克30分鐘。置冰上3分鐘。離心收集細胞，沉淀懸浮于10mi H2O中，平均涂布50塊直徑150mm的SD/-Trp/-Leu/-His/25mM3-AT平板。30℃培養(yǎng)一周觀察結果。
3.β-半乳糖苷酶活性檢測將直徑150mm的尼龍膜(Amersham公司)置于生長酵母菌落的平板上，揭膜使菌落附著其上。膜置液氮和室溫中交替凍融3次裂解細胞，隨后平放于兩層浸透Z緩沖液/X-gal(60mmol/L Na2HPO4，40mmol/L NaH2PO4，10mmol/LKCl，1mmol/L MgSO4，0.033％X-gal，0.27％β-巰基乙醇)的濾紙上，30℃滲透反應8小時，觀察結果。
結果顯示為陽性。這表明，由于GAMYB結合復合物1與GAMYB發(fā)生結合作用，將GAL4的BD和AD又連在一起，激活轉錄下游GAL1-LacZ基因的表達。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海聯(lián)眾基因科技研究院<120>水稻GAMYB結合復合物1和編碼這種多肽的多核苷酸<130>05A282<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>645<212>DNA<213>水稻<220>
<221>misc_feature<222>(225)..(599)<223>ORF<400>1gggcggcctt gcttgcttcc tttccagatt cctccatagc tcacagaaac ctcacaaccc 60tagttcggcg agagccggaa gctatcaagc taagcgagat acgaaggaaa gcggttcttg 120cagcagaaat ttcaaggctt tgccgccaaa tttggcccaa gtttggctca aaatccacca 180ttgcaggccc ctgcccctcg ggaggctaaa gcgagacgaa ggccatgtcg cggcggtctg 240ggtatcgcgc ggcggagcag gaagaccgcc aggttgatct gatgggcgac tccgacttcg 300acgacgacga gtacggacaa cctatagagt ccaaagaaga tacgtcggcg gtggatgtga 360agaaagggaa ggacatacaa ggaattccat gggataattt gagcttctca agggacaggt 420ataggaagac taggatggta cagtacgcga actttgagaa tgtacccaac tccgggaaaa 480attcagagaa ggtatgcaca cctgtagata aaggggcact ctactatgag tttcagtaca 540acacaagatc ggtgaaaccg accaattctt catttccagt tgagaaatta gtatgggcaa 600tactaacatg atgtgtatct tctatcacag tctgtgcttc attgg 645<210>2<211>125<212>PRT<213>水稻
<400>2Met Ser Arg Arg Ser Gly Tyr Arg Ala Ala Glu Gln Glu Asp Arg Gln1 5 10 15Val Asp Leu Met Gly Asp Ser Asp Phe Asp Asp Asp Glu Tyr Gly Gln20 25 30Pro Ile Glu Ser Lys Glu Asp Thr Ser Ala Val Asp Val Lys Lys Gly35 40 45Lys Asp Ile Gln Gly Ile Pro Trp Asp Asn Leu Ser Phe Ser Arg Asp50 55 60Arg Tyr Arg Lys Thr Arg Met Val Gln Tyr Ala Asn Phe Glu Asn Val65 70 75 80Pro Asn Ser Gly Lys Asn Ser Glu Lys Val Cys Thr Pro Val Asp Lys85 90 95Gly Ala Leu Tyr Tyr Glu Phe Gln Tyr Asn Thr Arg Ser Val Lys Pro100 105 110Thr Asn Ser Ser Phe Pro Val Glu Lys Leu Val Trp Ala115 120 125<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3ggaaaggaag caagcaaggc cgccc25<220>
<221>misc_feature<223>引物<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>4ccaatgaagc acagactgtg ataga 25<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5ccccatatga tggcgaagct gctgagctgc gtc 33<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6catggatccc tagaggtgcc agggcatctg gaa 33<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>7tcttctttgg actctatagg ttgtccgtac tcgtcgtcgt 40
權利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與GAMYB結合功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中225-599位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-645位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出權利要求1所述的多肽。
9.權利要求3-5任一所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于(1)作為轉基因植物鑒定中的內(nèi)參照基因；(2)制備基因芯片或微列陣；或(3)檢測水稻物種。
10.一種基因芯片，包括固相載體和有序固定于所述固相載體的寡核苷酸探針，其特征在于，所述的探針包括與SEQ ID NO1特異性結合的15-60個堿基的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的多肽——水稻GAMYB結合復合物1，編碼此多肽的多核苷酸。本發(fā)明還公開了編碼這種新的水稻GAMYB結合復合物1的多核苷酸的用途。本發(fā)明的水稻GAMYB結合復合物1能夠與水稻GAMYB特異性結合，為進一步研究GAMYB的功能提供了新途徑，也為轉基因植物檢測中的水稻物種的特異性檢測提供了新途徑。
文檔編號C12P21/02GK101020712SQ200610023908
公開日2007年8月22日 申請日期2006年2月16日 優(yōu)先權日2006年2月16日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅, 李瑤, 許嘉, 裘敏燕 申請人:上海聯(lián)眾基因科技研究院