專利名稱：番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，尤其涉及一種番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體。
背景技術(shù)：
番茄環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus，ToRSV)為豇豆花葉病毒科(Comoviridae)線蟲(chóng)傳多面體病毒屬(Nepovirus)成員，病毒粒子為等徑二十面體，直徑約30nm。基因組含兩條正義單鏈RNA，RNA1編碼復(fù)制酶，RNA2編碼運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)和外殼蛋白(CP)。
ToRSV廣泛分布于歐美及大洋州，能侵染大豆、葡萄、桃、李、蘋果、櫻桃、番茄及煙草等150多種作物，引起多種病害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致絕產(chǎn)。ToRSV有多種傳播方式，在田間介體劍線蟲(chóng)(Xiphinema)和嫁接傳播是ToRSV傳播和流行的重要方式，而遠(yuǎn)距離傳播主要靠種子(苗)調(diào)運(yùn)。種子傳毒的植物很多，有的種傳率很高，如大豆76％、千日紅76％、接骨木11％、蒲公英24％、紅三葉草3～7％、番茄3％。該病毒是一種高風(fēng)險(xiǎn)的病毒，為我國(guó)禁止入境的一類檢疫性有害生物。
由于ToRSV是一種可隨種子苗木調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播的高風(fēng)險(xiǎn)檢疫性有害生物，為防止該病毒進(jìn)入我國(guó)，建立有效的快速檢測(cè)方法十分重要。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)ToRSV的檢疫所使用的手段包括電鏡觀察、鑒別寄主反應(yīng)(生物學(xué)方法)、血清學(xué)試驗(yàn)和分子生物學(xué)手段。由于ToRSV是一種直徑為28nm的球狀病毒，而樣品中的病毒含量低，難以在電鏡下觀察鑒定；接種鑒別寄主則需要專門的隔離溫室，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，更由于病毒的隱癥現(xiàn)象而影響了鑒定結(jié)果。血清學(xué)方法是植物病毒快速檢測(cè)的必要手段，目前口岸的病毒檢測(cè)依賴于購(gòu)置國(guó)外的抗血清，價(jià)格昂貴，而國(guó)內(nèi)還沒(méi)有ToRSV血清檢測(cè)試劑盒用于進(jìn)境植物種苗的報(bào)道。
本發(fā)明針對(duì)我國(guó)大量種苗進(jìn)口可能攜帶番茄環(huán)斑病毒進(jìn)境的現(xiàn)狀，應(yīng)用純化的ToRSV免疫BALB/C小鼠，制備出抗ToRSV單克隆抗體，經(jīng)效價(jià)測(cè)定和酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，特異性較好，為進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)ToRSV血清檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。因此，對(duì)于檢測(cè)ToRSV，ToRSV單克隆抗體就顯得十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其具有與番茄環(huán)斑病毒反應(yīng)的特異性，為進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)番茄環(huán)斑血清檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其與番茄環(huán)斑病毒特異性結(jié)合，并缺乏對(duì)其它病毒和植物組織的結(jié)合特異性，所述番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體由如下步驟制得步驟1，番茄環(huán)斑病毒提純；步驟2，用純化的ToRSV注射免疫BALB/c小鼠(一種近交系小鼠)，取其脾細(xì)胞使之與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合；
步驟3，以ToRSV感染的番杏病葉汁液(1∶10-1∶15稀釋)包被酶聯(lián)板，同時(shí)以健康番杏葉汁液作陰性對(duì)照，取融合細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA方法(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))篩選抗體陽(yáng)性孔；步驟4，選擇強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)孔的雜交瘤細(xì)胞，用HT(次黃嘌呤胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)液培養(yǎng)并做適當(dāng)濃度的稀釋(每孔約0.7個(gè)細(xì)胞)，選取僅含一個(gè)細(xì)胞群的孔檢測(cè)其上清抗體，抗體陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞再經(jīng)過(guò)2-3次克隆操作及檢測(cè)后，得到3株分泌ToRSV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；步驟5，擴(kuò)增培養(yǎng)并離心收集陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，腹腔注射BALB/C雌性小鼠，分別制備3株腹水單抗，以A8、B7和G9表示；步驟6，采用飽和硫酸銨鹽析法粗提，并經(jīng)Sephadex G-200(G-200型葡聚糖凝膠)層析柱純化腹水抗體。用Biophotometer分光光度計(jì)(德國(guó))檢測(cè)A8、B7和G9三者單抗?jié)舛确謩e約為8.04mg/ml、3.36mg/ml和9.41mg/ml；步驟7，將ToRSV感染的番杏病葉汁液(1∶10-1∶15稀釋)包被酶聯(lián)板，分別加入制備的ToRSV單克隆抗體，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(G型免疫球蛋白)為二抗，經(jīng)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色，該3株單克隆抗體腹水效價(jià)在10-5～10-6之間。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個(gè)抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對(duì)不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)來(lái)合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來(lái)生產(chǎn)抗體。
本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明ToRSV單克隆抗體經(jīng)效價(jià)測(cè)定和酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，結(jié)果表明ToRSV單抗具有與ToRSV反應(yīng)的特異性，可作為ToRSV檢測(cè)的重要材料，為進(jìn)一步研制ToRSV血清檢測(cè)試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述實(shí)施例1 ToRSV提純1材料1.1 ToRSV毒源本次試驗(yàn)所用的ToRSV毒源有2個(gè)分離物ToRSV毒源1(以ToRSV-1表示)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局植檢實(shí)驗(yàn)室保存的毒源。
ToRSV毒源2(以ToRSV-2表示)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所病毒檢測(cè)中心惠贈(zèng)。
1.2繁殖植物本次試驗(yàn)所用的ToRSV的繁殖植物番杏(Tetragonia expansa)，購(gòu)自北京陸橋中國(guó)檢驗(yàn)檢疫公司。
2方法2.1植物病毒的純化
2.1.1接種植物的準(zhǔn)備取經(jīng)121℃蒸汽消毒1小時(shí)的營(yíng)養(yǎng)土裝入育苗盆中，播入番杏種子，輕輕覆土，等到苗長(zhǎng)出2～3片真葉時(shí)，作為接種材料。
2.1.2病毒接種將冷凍保存的ToRSV毒源0.5g置于研缽，加入適量接種緩沖液，充分研磨；將少許硅藻土撒至待接種番杏葉片的表面；用手指蘸取少許研磨液，均勻涂抹于葉表，在同一處重復(fù)摩擦2～3次，并用清水沖洗接種過(guò)的葉片，接種后的植株放于22～25℃溫室進(jìn)行培養(yǎng)，接種后7～14天植株顯癥明顯后，采集全株(除根外)用作病毒的提純。
2.1.3 ELISA鑒定稱取帶毒番杏葉片100mg加磷酸緩沖液充分研磨，將研磨所得汁液3000r/min離心5min以去除殘?jiān)?，取病汁液上清進(jìn)行雙抗體夾心(DAS)-ELISA檢測(cè)，堿性磷酸酶標(biāo)記的ToRSV多克隆抗體購(gòu)自Agdia公司。
2.1.4病毒提純選用-70℃保存的接種ToRSV的番杏1000g，按1g葉片加2ml 0.05MPB(pH7.0，含0.2％巰基乙醇)，全部置組織搗碎機(jī)里搗碎，尼龍紗過(guò)濾，濾液低速離心，8000r/min離心15min；上清液加1％TritonX-100(V/W)澄清，低速離心，8000r/min離心15min；上清液加質(zhì)量濃度為8％PEG(Mr6000)，3％NaCl，置4℃冰箱懸浮攪拌4h，8000gr/min離心30min；沉淀以0.01M PB(含0.002M EDTA)懸浮，置4℃冰箱懸浮攪拌4h或過(guò)夜，9000r/min離心15min；將收集的上清液30000r/min離心3h；沉淀懸浮于去離子水中，7000gr/min離心20min，上清液即為病毒粗提液；將上述病毒粗提液經(jīng)25％甘油墊超速離心，即得提純病毒。
實(shí)施例2動(dòng)物免疫與細(xì)胞融合a、主要材料及試劑純化ToRSV樣品由上海市出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心制備保存并提供，見(jiàn)實(shí)施例1。BALB/c小鼠購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，昆明種小鼠購(gòu)自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室保存并提供。HAT及HT培養(yǎng)基購(gòu)自上海美著生物技術(shù)有限公司。
b、動(dòng)物免疫與細(xì)胞融合用純化的ToRSV首次加等體積弗氏完全佐劑注射免疫BALB/c小鼠，隨后用ToRSV加體積弗氏不完全佐劑注射免疫小鼠，共注射免疫6次。用ELISA方法檢測(cè)免疫小鼠血清抗體滴度，篩選ToRSV免疫陽(yáng)性小鼠。最后一次加強(qiáng)免疫后3天取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，除去脂肪和碎片，并用RPMI-1640配成每ml含1×106-2×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。收集培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按5∶1-10∶1的比例混合于錐型塑料離心管中，加入30ml無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1500rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))離心5min后棄上清，將離心管放入37℃水浴。在1min內(nèi)滴加已預(yù)熱至37℃的50％pH約為8.0的PEG(聚乙二醇)(分子量3350)0.5ml，并充分混合均勻，靜置1min，再沿管壁四周輕輕加入無(wú)血清培養(yǎng)液，前30秒內(nèi)加1ml，后30秒內(nèi)加3ml，然后再加入26ml無(wú)血清培養(yǎng)液，1500rpm離心5min。棄去上清，用適量HAT(次黃嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶苷)培養(yǎng)基懸浮沉淀，將懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，最后再分裝入預(yù)先培養(yǎng)有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，然后在5％CO2(二氧化碳)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，中間替換新的HAT和HT培養(yǎng)液各一次(第3天和第7天)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適大小(約1/4孔底面積)時(shí)，檢測(cè)培養(yǎng)上清是否有特異性抗體的產(chǎn)生。
實(shí)施例3雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆以ToRSV感染的番杏病葉汁液(1∶10-1∶15稀釋)包被ELISA條形孔，同時(shí)以健康番杏葉汁液作陰性對(duì)照，取細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA方法篩選抗體陽(yáng)性孔。選擇強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)孔的雜交瘤細(xì)胞，用HT培養(yǎng)液吹打混勻后，吸出部分細(xì)胞，并做適當(dāng)濃度的稀釋(每孔約0.7個(gè)細(xì)胞)，再分別加入到96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)，選取僅含一個(gè)細(xì)胞群的孔檢測(cè)其上清抗體?？贵w陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞再經(jīng)過(guò)2-3次克隆操作及檢測(cè)后，即可得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
實(shí)施例4腹水抗體制備1500rpm離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，懸浮于生理鹽水中，加適量青霉素和鏈霉素，懸浮細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml。取8周齡健康BALB/C雌性小鼠，腹腔注射0.2-0.5ml降植烷，7天后在腹腔內(nèi)注射0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液。注射后7-10天可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大，用大號(hào)針頭刺入鼠腹部，收集腹水，1500rpm離心10min，收集上清液即為腹水單克隆抗體，加入0.01％疊氮鈉(NaN3)，分裝小瓶，-20℃凍存待用，ELISA法測(cè)定腹水效價(jià)。
實(shí)施例5腹水抗體的純化及效價(jià)測(cè)定采用飽和硫酸銨鹽析法粗提。2ml腹水抗體用飽和硫酸銨沉淀后，將所得沉淀用PBS(磷酸鹽緩沖液)溶解，然后將溶液加至Sephadex G-200層析柱層析，再用0.01M PBS緩沖液洗脫單抗IgG，即得純化的腹水抗體。將純化的腹水抗體按1∶10稀釋后用Biophotometer分光光度計(jì)檢測(cè)A280紫外吸收值，測(cè)定抗體濃度。將ToRSV感染的番杏病葉汁液(1∶10-1∶15稀釋)包被酶聯(lián)板，將單克隆抗體進(jìn)行一系列的倍比稀釋后，以間接ELISA測(cè)定抗體的效價(jià)。
實(shí)施例6間接ELISA將ToRSV感染的番杏病葉用包被液在研缽內(nèi)研磨后，1∶10-1∶15稀釋后，加至酶標(biāo)板，每孔100μl，置37℃溫育2～3h后，加10％BSA封閉液125μl，37℃溫育0.5h。棄封閉液，加ToRSV單克隆抗體(1∶1000-1∶2000稀釋)100μl，37℃溫育1.5h，PBST洗滌三次。隨后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 100μl，37℃溫育1.5h，PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗滌三次。最后經(jīng)TMB顯色，測(cè)定每孔450nm OD(光密度值)值。每個(gè)樣品設(shè)二個(gè)重復(fù)，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，重復(fù)2次。以待測(cè)值/陰性對(duì)照值＞2.0作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下a.雜交瘤細(xì)胞的融合、篩選及克隆用純化ToRSV免疫的BAL B/C小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5∶1-10∶1的比例在50％PEG下融合，用HAT培養(yǎng)基篩選。融合10天后換用HT培養(yǎng)基，當(dāng)每孔雜交瘤細(xì)胞覆蓋孔底10％-50％時(shí)，采用間接ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體分泌情況。選擇1個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行3次有限稀釋法克隆，最后獲得3株(A8、B7和G9)能分泌ToRSV特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)多次體外傳代和凍存復(fù)蘇后，該3株細(xì)胞均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。
b.腹水抗體制備及效價(jià)測(cè)定小鼠腹腔注射0.2-0.5ml降植烷7d后，腹腔內(nèi)注射0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液。7-10天后采集ToRSV單抗腹水。用ELISA分別測(cè)定3株單抗腹水的效價(jià)均在10-5-10-6之間。ToRSV單抗腹水經(jīng)濃縮、透析后，經(jīng)Biophotometer分光光度計(jì)檢測(cè)，3株ToRSV單抗(A8、B7和G9)濃度分別約為8.04mg/ml、3.36mg/ml和9.41mg/ml。
c.間接ELISA檢測(cè)將ToRSV感染的番杏病葉汁液(1∶10-1∶15稀釋)直接包被酶聯(lián)板，加入ToRSV單抗(1∶1000-1∶2000稀釋)，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗并加TMB顯色，同時(shí)以健康番杏病葉汁液作為對(duì)照，結(jié)果表明所制備的3株ToRSV單抗均只與ToRSV感染的番杏葉汁液呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與健康番杏葉汁液呈陰性反應(yīng)，表明所制備的ToRSV單抗具有與ToRSV反應(yīng)的特異性，可作為ToRSV檢測(cè)的重要材料，為進(jìn)一步研制ToRSV血清檢測(cè)試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其特征在于，其與番茄環(huán)斑病毒特異性結(jié)合，并缺乏對(duì)其它病毒和植物組織的結(jié)合特異性，所述番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體由如下步驟制得步驟1，番茄環(huán)斑病毒提純；步驟2，用純化的番茄環(huán)斑病毒注射免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞使之與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合；步驟3，以番茄環(huán)斑感染的番杏病葉汁液包被酶聯(lián)板，同時(shí)以健康番杏葉汁液作陰性對(duì)照，取融合細(xì)胞培養(yǎng)上清，用間接ELISA方法篩選抗體陽(yáng)性孔；步驟4，選擇強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)孔的雜交瘤細(xì)胞，用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)并做適當(dāng)濃度的稀釋，選取孔檢測(cè)其上清抗體，抗體陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞再經(jīng)過(guò)克隆操作及檢測(cè)后，得到分泌番茄環(huán)斑單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；步驟5，擴(kuò)增培養(yǎng)并離心收集陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，腹腔注射BALB/C雌性小鼠，分別制備腹水單抗；步驟6，粗提，并經(jīng)層析柱純化腹水抗體；步驟7，將番茄環(huán)斑感染的番杏病葉汁液包被酶聯(lián)板，分別加入制備的番茄環(huán)斑單克隆抗體，測(cè)定所述腹水抗體的效價(jià)。
2.如權(quán)利要求1所述的番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其特征在于，步驟4中所述的適當(dāng)濃度的稀釋，該濃度為每孔約0.7個(gè)細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其特征在于，步驟4中所述的克隆操作是2-3次，所述的分泌番茄環(huán)斑單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞是3株。
4.如權(quán)利要求1所述的番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其特征在于，步驟4中所述的選取孔檢測(cè)其上清抗體，該孔是僅含一個(gè)細(xì)胞群的孔。
5.如權(quán)利要求1所述的番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其特征在于，步驟6中所述的粗提采用飽和硫酸銨鹽析法。
6.如權(quán)利要求1所述的番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其特征在于，步驟7中所述的腹水抗體的效價(jià)測(cè)定采用間接ELISA法，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗。
7.如權(quán)利要求1所述的番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其特征在于，步驟3或步驟7所述的番茄環(huán)斑感染的番杏病葉汁液經(jīng)過(guò)1∶10-1∶15稀釋。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，其與番茄環(huán)斑病毒特異性結(jié)合，并缺乏對(duì)其它病毒和植物組織的結(jié)合特異性，其制備方法包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆等步驟。應(yīng)用純化的番茄環(huán)斑病毒免疫BALB/c小鼠，制備出番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體，經(jīng)效價(jià)測(cè)定和酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，特異性較好，為進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)番茄環(huán)斑血清檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101041695SQ200610024888
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2006年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月21日
發(fā)明者楊翠云, 曹潔, 于翠, 鄭建中, 沈禹飛, 陶庭典, 代光輝 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海交通大學(xué), 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)