專利名稱：一種定量檢測(cè)未獲培養(yǎng)微生物au126的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種定量檢測(cè)微生物的方法，具體地說，本發(fā)明關(guān)于一種定量檢測(cè)未獲培養(yǎng)微生物AU126的方法。
背景技術(shù)：
自然界中不超過1％的微生物可以通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。通過微生物的16S rRNA基因，可以不使用培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)包括未獲培養(yǎng)微生物在內(nèi)的所有微生物物種的檢測(cè)。近年來，一種被命名為AU126的未獲培養(yǎng)微生物經(jīng)多個(gè)科研機(jī)構(gòu)的研究，被判定為與牙周病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的微生物之一。
對(duì)未獲培養(yǎng)的牙周可疑致病微生物AU126進(jìn)行定性檢測(cè)的方法已經(jīng)公開發(fā)表，這類技術(shù)中使用的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物片段較大，不能應(yīng)用在定量檢測(cè)時(shí)使用的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real TimePCR)。由于微生物與疾病的關(guān)系不僅與特定微生物的存在相關(guān)，還取決于宿主特定部位微生物的定植數(shù)量，因此有必要對(duì)未獲培養(yǎng)的牙周可疑致病微生物AU126進(jìn)行定量檢測(cè)，以深入研究未獲培養(yǎng)的微生物與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種定量檢測(cè)未獲培養(yǎng)微生物AU126的方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實(shí)現(xiàn)的由人類口腔菌斑中提取微生物DNA作為模板，使用特異性引物，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)使用的技術(shù)參數(shù)如下第一步預(yù)變性95℃10秒，第二步PCR反應(yīng)，共40循環(huán)，步驟為95℃5秒、55-65℃31秒，72℃30秒，第三步溶解曲線分析95℃15秒、6060秒，95℃15秒。使用經(jīng)梯度稀釋的已知濃度聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，與待檢測(cè)DNA同時(shí)檢測(cè)，能夠由實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀給出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中直接讀出未獲培養(yǎng)的牙周可疑致病微生物AU126的16S rRNA基因拷貝數(shù)，從而推算獲得微生物的數(shù)量。
一種定量檢測(cè)未獲培養(yǎng)微生物AU126的方法，該方法包括以下步驟(1)標(biāo)本采集(2)標(biāo)本總DNA提取；(3)定量檢測(cè)AU126的16S rRNA基因。
在步驟(3)中AU126的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
在步驟(3)中使用Real Time PCR儀、采用SYBR GREEN I染料模式進(jìn)行標(biāo)本定量檢測(cè)。
SYBR GREEN I染料模式中包括AU126專用引物，菌斑DNA模板，滅菌去離子水。
所述AU126專用引物序列如下
AU126fGTAAACGGAAGAGGCATCTTTTTTGTTAU126rCGTACAGTACTTGCAATAAAACAC。
引物結(jié)合位點(diǎn)為SEQ ID NO.1中第174-200位gtaaacggaagaggcatcttttttgtt，第460-483位gtgttttattgcaagtactgtacg。
Real Time PCR儀的反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃變性30s；95℃變性5s，62℃退火20s，72℃延伸31s，共40個(gè)循環(huán)。
本發(fā)明使用去離子水作為陰性對(duì)照。使用AU126特異片段倍比稀釋物作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本中AU126 16S rRNA基因的含量，此數(shù)值除以AU126中16S rRNA基因啟動(dòng)子數(shù)量，乘以1000換算獲得每個(gè)臨床菌斑標(biāo)本中AU126的數(shù)量。
16S rRNA基因可以比喻為微生物的身份證，每種微生物都有16SrRNA基因，根據(jù)16S rRNA基因進(jìn)行分類是目前微生物分類的新標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明發(fā)明了針對(duì)AU126 16S rRNA基因設(shè)計(jì)的定量PCR引物，能夠定量地特異地檢測(cè)AU126的16S rRNA基因，因此也就能夠定量地特異地檢測(cè)AU126這種未獲培養(yǎng)的微生物。
本發(fā)明所公開一種定量檢測(cè)未獲培養(yǎng)微生物AU126的方法，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)一種未獲培養(yǎng)的牙周可疑致病微生物AU126的代表其菌種特異性的16S rRNA基因，其應(yīng)用于定性檢測(cè)的敏感度也遠(yuǎn)高于普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
(2)應(yīng)用本發(fā)明可以拓展牙周病的病因研究，可能輔助牙周病治療療效的研判。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
定量檢測(cè)AU126詳細(xì)步驟一、標(biāo)本采集使用無菌刮匙刮取一定數(shù)量(濕重約1mg)的患者口腔需要檢測(cè)部位的菌斑，立即轉(zhuǎn)入含有1ml無菌傳送液的無菌離心管中，立即保存-20℃冰箱內(nèi)。
二、標(biāo)本總DNA提取菌斑總DNA的提取使用胍去垢劑裂解液DNAzolTMReagent(Invitrogen，美國(guó))。具體步驟如下1.室溫融化菌斑標(biāo)本，將細(xì)菌傳送液中的臨床菌斑標(biāo)本于AllegraTMX-22R Centrifuge離心機(jī)(Beckman Coulter，德國(guó))中4℃條件下12,000g離心3分鐘，棄上清后加入1mlDNAzol液體，輕微振蕩1分鐘，靜置10分鐘，4℃條件下10,000g離心10分鐘，吸取上清液至新離心管中，加入無水乙醇0.5ml，立即振蕩混勻，靜置3分鐘，4℃條件下4,000g離心2分鐘，棄上清。
2.加入1ml 75％乙醇，吹打振蕩洗滌1分鐘，4℃條件下4,000g離心2分鐘，棄上清。75％乙醇洗滌的過程重復(fù)一次。
3.棄上清后靜置1分鐘以揮發(fā)殘余乙醇，最后加入500μl 8mMNaOH溶液振蕩溶解DNA。提取標(biāo)本的總DNA，-20℃保存。
三、定量檢測(cè)AU126的16S rRNA基因使用Real Time PCR儀、采用SYBR GREEN I染料模式進(jìn)行標(biāo)本定量檢測(cè)。
1.Real Time PCR儀器名稱ABI Real Time PCR System7300(Applied Biosystems，美國(guó))。
2.Real Time PCR反應(yīng)采用20μl體系，組成如下SYBRPremixEx TaqTM(2×)(Takara，中國(guó))10μl，ROX Reference Dye(50×)(Takara，中國(guó))0.4μl，10μmol/l本專利發(fā)明的定量特異檢測(cè)AU126專用引物(合成單位sangon，中國(guó))各0.4μl，菌斑DNA模板0.5μl，滅菌去離子水加至20μl。
3.Real Time PCR儀的反應(yīng)條件設(shè)置為預(yù)變性95℃變性30s；95℃變性5s，62℃退火20s，72℃延伸31s，共40個(gè)循環(huán)，在延伸階段收集熒光信號(hào)；循環(huán)結(jié)束后附加溶解曲線分析95℃15s，60℃23s，95℃15s。
4.去離子水作為陰性對(duì)照。AU126特異片段倍比稀釋物作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)標(biāo)本都重復(fù)3次檢測(cè)，以均值作為檢測(cè)結(jié)果。
5.具體操作步驟1)計(jì)算標(biāo)本數(shù)量、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品的總數(shù)量，乘3得到本次檢測(cè)的總反應(yīng)管數(shù)量。
2)根據(jù)20μl體系的組成，將除DNA模板以外的反應(yīng)組份配制成總反應(yīng)液。振蕩2分鐘混勻總反應(yīng)液。
3)按照每管19.5μl，將總反應(yīng)液分裝到MicroAmpTMOptical96-Well Reaction Plate(Applied Biosystems，美國(guó))的單孔中。
4)往每孔內(nèi)加入模板0.5μl。
5)反應(yīng)板表面緊密覆蓋MicroAmpTMOptical Adhesive Film(Applied Biosystems，美國(guó))，保證密封防止反應(yīng)液揮發(fā)。
6)將反應(yīng)板放入Real Time PCR反應(yīng)儀中，啟動(dòng)程序開始反應(yīng)。
6.2小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束，由Real Time PCR儀的隨機(jī)軟件SequenceDetection System V1.2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本中AU126 16S rRNA基因的含量，此數(shù)值除以AU126中16S rRNA基因啟動(dòng)子數(shù)量，乘1000(反應(yīng)使用的模板為標(biāo)本總DNA的千分之一)換算獲得每個(gè)臨床菌斑標(biāo)本中AU126的數(shù)量。
SEQUENCE LISTING<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院<120>一種定量檢測(cè)未獲培養(yǎng)微生物AU126的方法<130>/<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1481<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgataggc ttaacacatg caagtcgagg 60ggcatcacga attagcaata gtttggtggc gaccggcgca cgggtgcgta acacgtatac120aacctacctt caattgggga ataacctgga gaaatttgga ctaatacccc atagtaaacg180gaagaggcat cttttttgtt ttaaagattt attgattgga gatgggtatg cgtaggatta240gctagttggt aaggtaacgg cttaccaagg cgacgatcct taggggttct gagaggaagg300tcccccacac tggtactgag acacggacca gactcctacg ggaggcagca gtgaggaata360ttggtcaatg gtcgagagac tgaaccagcc aagtcgcgtg aaggaagacg gctctatgag420
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1.一種定量檢測(cè)未獲培養(yǎng)微生物AU126的方法，該方法包括以下步驟(1)標(biāo)本采集(2)標(biāo)本總DNA提??；(3)定量檢測(cè)AU126的16S rRNA基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物AU126的檢測(cè)方法，其特征在于在步驟(3)中AU126的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物AU126的檢測(cè)方法，其特征在于在步驟(3)中使用Real Time PCR儀、采用SYBR GREEN I染料模式進(jìn)行標(biāo)本定量檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的AU126微生物的檢測(cè)方法，其特征在于SYBRGREEN I染料模式中包括AU126專用引物，菌斑DNA模板，滅菌去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物AU126的檢測(cè)方法，其特征在于AU126專用引物序列如下AU126rGTAAACGGAAGAGGCATCTTTTTTGTTAU126rCGTACAGTACTTGCAATAAAACAC。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物AU126的檢測(cè)方法，其特征在于引物結(jié)合位點(diǎn)為SEQ ID NO.1中第174-200位gtaaacggaagaggcatcttttttgtt，第460-483位gtgttttattgcaagtactgtacg。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物AU126的檢測(cè)方法，其特征在于RealTime PCR儀的反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃變性30s；95℃變性5s，62℃退火20s，72℃延伸31s，共40個(gè)循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物AU126的檢測(cè)方法，其特征在于去離子水作為陰性對(duì)照。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物AU126的檢測(cè)方法，其特征在于AU126特異片段倍比稀釋物作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的微生物AU126的檢測(cè)方法，其特征在于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本中AU126 16S rRNA基因的含量，此數(shù)值除以AU126中16S rRNA基因啟動(dòng)子數(shù)量，乘以1000換算獲得每個(gè)臨床菌斑標(biāo)本中微生物AU126的數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)未獲培養(yǎng)微生物AU126的方法，該方法包括以下步驟標(biāo)本采集、標(biāo)本總DNA提取、定量檢測(cè)AU126的16S rRNA基因。該定量檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)一種未獲培養(yǎng)的牙周可疑致病微生物AU126的代表其菌種特異性的16S rRNA基因，其應(yīng)用于定性檢測(cè)的敏感度也遠(yuǎn)高于普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。應(yīng)用本發(fā)明可以拓展牙周病的病因研究，可能輔助牙周病治療療效的研判。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1880475SQ20061002634
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月8日
發(fā)明者梁景平, 李超倫, 姜云濤 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院