專利名稱：甲醇酵母生產(chǎn)人激肽釋放酶－1的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是采用基因工程的手段，通過甲醇酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)大規(guī)模獲得一種新型重組蛋白-------甲醇酵母表達的重組人激肽釋放酶-1(Recombinant HumanKallikrein-1，r-hK1)，特別對r-hK1分子性質(zhì)的研究，以及體內(nèi)、體外活性的測定和試驗，表明r-hK1可望成為治療腦梗塞的藥物。
背景技術：
早在1926年，F(xiàn)rey等就從人尿液中獲得了一種能引起血壓下降的成分，當時稱之為血管舒緩素，不過，后來的研究者發(fā)現(xiàn)，該蛋白酶類成分也廣泛分布于血漿、胰腺、腎臟、唾液腺、腸、胰液之中，尤其胰腺中含量最高。1930年，希臘的Kraut H.等將從胰腺分離提取的這種成分命名為Kallikrein(希臘語Kallikreas是‘胰腺’，故稱胰腺中獲得的蛋白酶類為Kallikrein)。但是，隨著對這一類蛋白酶功能、分布和作用機理等方面的深入研究，在不同時期，研究人員對Kallikrein有著不同的稱謂，例如Kininogenase、Kallidinogenase和Kininogenin。事實上，在中文譯名中，‘激肽釋放酶’‘激肽原酶’、和‘激肽酶’等稱謂也是混用的。目前，國內(nèi)對Kallikrein的中文譯名的使用也不統(tǒng)一，甚至近年來國內(nèi)發(fā)表的文章中仍對同一種成份使用不同名稱，例如‘尿激肽原酶’、‘尿激肽釋放酶’、‘胰激肽原酶’、‘胰腺激肽釋放酶’、‘組織激肽釋放酶’等。
在本專利中Kallikrein一詞譯為‘激肽釋放酶’，Kininogenase、Kallidinogenase和Kininogenin這三個詞中包含有激肽原或激肽一詞的詞根，似乎應稱為‘激肽原酶’更妥。雖然‘激肽釋放酶’或‘激肽原酶’最早是在胰腺等特定組織器官中發(fā)現(xiàn)的，但是，由于其在動物體內(nèi)分布廣、種類多，所以，在本專利的描述中將不再用組織或器官或來源等詞語來限定提及的某種激肽釋放酶。
早期，研究者將人的激肽釋放酶(Human Kallikrein，下文中簡稱hK)分成血漿型和組織型兩大類。血漿型hK主要是在人的肝臟中表達，再分泌進入血液的，它參與血液的凝固、纖維蛋白的水解、血壓的調(diào)節(jié)和炎癥反應等生理過程；而組織型hK，是在胰腺、腎臟、唾液腺、乳腺、卵巢、睪丸和前列腺等部位產(chǎn)生，能對一些多肽(如，激肽原、胰島素原、腎素原等)進行翻譯后加工，從中釋放出具有生理活性肽類(如，激肽，胰島素、腎素等)。現(xiàn)在，根據(jù)含量的高低以及發(fā)現(xiàn)的先后順序，國際上已經(jīng)統(tǒng)一將除血漿型hK之外的所有組織型hK進行了命名，依次為hK1、hK2、hK3.......hK15等，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名的有15種之多(陳渝春國外醫(yī)學·生理、病理科學與臨床分冊.2003，23(4)386～88；Yousef GM，ObiezuCV，etal Human tissue kallikreinsfrom gene structure to function and clinical applications.Adv.in Clin.Chem.2005，3911-79.)。追溯早期研究者所描述的組織型hK，也就是來自胰腺、腎、唾液腺和尿液中hK不難發(fā)現(xiàn)，它并不包括后來發(fā)現(xiàn)并命名的這些種類的組織型hK。實際上，早年文獻中所說的組織型激肽釋放酶、胰腺激肽釋放酶、唾液腺激肽釋放酶等按新分類標準，都是同一種成分，應該稱之為人激肽釋放酶-1(Human Kallikrein 1，簡稱hK1)，這也是本專利要描述的對象。本專利中將酵母分泌表達的hK1稱為重組人激肽釋放酶-1(Recombinant Human kallikrein-1，簡稱r-hK1)。
hK1屬于絲氨酸蛋白酶類的肽酶S1家族(或稱激肽釋放酶亞族)。它能夠特異性水解低分子量或高分子量激肽原(Kininogen)蛋白分子中的Met-Lys或Arg-Ser氨基酸殘基間的肽鍵，分別釋放出激肽Lys-bradykinin或Kallidin。這些水解釋放出來激肽將對機體的血壓、電解質(zhì)平衡、炎癥反應和細胞增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。特別應該注意的是，hK1能優(yōu)先切開小分子生色底物S-2266(Val-Leu-Arg-pNA)中-Arg-pNA之的間肽鍵，這也是采用S-2266測定天然的hK1和r-hK1活性的基礎。(Gurunathan Laxmikanthan.etal 1.70 A0 X-RayStructure of Human Kallikrein 1Structural Changes Upon Peptide Inhibitor/SubstrateBinding Proteins.Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics 58802-814，2005)。
hK1在人體中的含量最高，其代謝后大部分又以完整的有活性的糖蛋白形式經(jīng)腎臟排泄。目前，從人尿中分離純化的hK1已經(jīng)用于臨床實踐。例如，廣州天普公司2005年4月獲得SFDA生產(chǎn)批文的人尿激肽原酶(商品名‘凱力康’，注射用尤瑞克林)就是來自人尿的生物提取品。人的hK1屬于熱穩(wěn)定性單鏈糖蛋白，由于糖基化的程度不同，所以分子量變化范圍也比較大(MW27～40kDa)。
國內(nèi)外對采用基因工程的方法生產(chǎn)hK1的工作都進行過不少研究。德國的研究者，1989年就進行了在E.coli中表達人唾液腺hK(即hK1)的研究工作(Angermann，A.etal Cloningand expression of human salivary-gland kallikrein in E.coli.Biochem J 1989，262(3)787-793)，但每升發(fā)酵液中的表達產(chǎn)量只有200～500μg，而Jing Wang等在美國(Jing Wang，Julie Chao etal Purification and characterization of recombinant tissue kallikrein from E.coliand yeast.Biochem.J.1991，27663-71)用E.coli和啤酒酵母(S.cerevisiae)系統(tǒng)表達大鼠組織型激肽釋放酶(類似hK1)，并用DEAE-Sepharose CL-6B結(jié)合Aprotinin-親和介質(zhì)進行分離純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E.coli表達的N-端多一個蛋氨酸(Met)的大鼠激肽釋放酶的活性同天然的并沒有差別。但是，利用酵母α-信號肽分泌表達大鼠激肽釋放酶時，有一部分表達產(chǎn)物不能順利切除信號肽，這樣活性激肽釋放酶產(chǎn)量極低(約0.5～1mg/L發(fā)酵上清液)。另外，他們在E.coli表達的也多是包含體，表達產(chǎn)量很低，采用放射免疫分析法進行定量，包含體的產(chǎn)量大約只有30～50mg/L發(fā)酵液。1993年，德國的研究者Georg Fertig等(GeorgFertig etal Biotech-nological aspects of the production of human pro-kallikrein using theAcNPV-baculovims-expression system Cytotechnology 1167-75，1993)用昆蟲核形多角體病毒(AcNPV)表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中表達人激肽釋放酶原(Human Pro-kallikrein，Pro-hK1)，篩選出的高表達細胞株在連續(xù)培養(yǎng)13天后，5L罐發(fā)酵所獲得的Pro-hK1折算成活性單位總產(chǎn)量也大約有7960U。之后，Lu等(Lu HS，Hsu YR，etal Isolation andcharacterization of human tissue kallikrein produced in E.colibiochemical comparison to theenzymatically inactive prokallikrein and methionyl kallikrein.Protein Expr Purif.1996，8(2)215-26.)在E.coli表達了Pro-hK1和Met-激肽釋放酶(Met-hK1)，Pro-hK1大體經(jīng)過表達、包含體溶解、蛋白折疊復性、嗜熱菌蛋白酶酶切激活、層析分離純化等步驟后，獲得了與天然品具有同樣的生物學活性hK1。Pro-hK1和Met-hK1的結(jié)構(gòu)雖然與hK1相似，但是都沒有生物學活性，這似乎同前面Jing Wang等研究者的結(jié)果是相矛盾的。同時，這些研究者(LuHS，etal Purification and characterization of human tissue prokallikrein and kallikrein isoformsexpressed in Chinese hamster ovary cells.Protein Expr.Purif.1996，8(2)227-37.)又在CHO中表達人的基因組全長前激肽釋放酶原基因(Preprokallikrein，Prepro-hK1)，重組激肽釋放酶原這種無活性的酶原被大量分泌到發(fā)酵液中，在純化過程中，經(jīng)過嗜熱菌蛋白酶酶切激活后，就可以將Pro-hK1和hK1分別純化出來。所獲得的rhK1同天然品比較，其比活性沒有明顯區(qū)別，但是Pro-hK1或hK1的分子本身并不均一，這些蛋白的分子量和電荷有差別。研究者推測是分子的N-糖基化修飾程度以及糖鏈的唾液酸殘基數(shù)目不同所致。
有關hK1基因工程生產(chǎn)的突破性工作應該是Hedy Chan等(Hedy Chan，etal Expressionand Characterization of Human Tissue Kallikrein Variants.Protein Expr & Purif.1998，12361-370)將人的三種激肽釋放酶原變異體(Pro-hK1)基因在甲醇酵母(Pichia pastoris)中分泌表達，獲得了Pro-hK1蛋白，再經(jīng)過胰蛋白酶切割，就可以獲得hK1。研究者從人體不同組織的cDNA文庫中，采用PCR法釣出Pro-hK1基因，獲得了三種氨基酸殘基略有不同的Pro-hK1基因(這中變異是PCR過程中產(chǎn)生的點突變或是組織中實際就有的差異尚未確定)。甲醇酵母表達的產(chǎn)量比以前的研究報道的都要高的多，達到約30mg/L發(fā)酵上清液，但是分泌表達出的rhK1在SDS-PAGE電泳時有兩條帶，產(chǎn)品不均一。
在國內(nèi)，中科院大連物理化學所的研究者等描述了(Yang Q.etal Purification of humantissue prokallikrein excreted from insect cells by liquid chromatography.J Pharm Biomed Anal.2005，39848-52.)用三步液相層析法，純化由昆蟲細胞表達的Pro-hK1，得率為57％，產(chǎn)品純度為95％。但是，這項工作也只能視作Georg Fertig等研究者工作的延伸。不過，到目前為止，將昆蟲細胞表達的成分用于治療性藥物的產(chǎn)品尚沒有報道，所以這方面的工作目前尚不具備醫(yī)藥用途。
綜上可見，國外的這些在E.coli、CHO、昆蟲細胞、啤酒酵母或甲醇母中進行的研究，都是Pro-hK1或Prepro-hK1或Met-hK1的表達為主，而進行直接分泌表達hK1蛋白的工作時，發(fā)現(xiàn)信號肽序列并不能順利切除。除了Hedy Chan等獲得了產(chǎn)量稍高的工程菌外，其它研究者的工作基本上都屬于純研究性質(zhì)的，從其產(chǎn)量、制備成本以及活性的等方面來看，也都表明大量制備rhK1極為困難。Hedy Chan等也是先獲得Pro-hK1，在酶切處理后獲得hK1的，盡管他們發(fā)現(xiàn)Pro-hK1在分泌時有一部分會直接以hK1形式分泌，但還有一部分是以Pro-hK1形式分泌入發(fā)酵上清中。因此，這種表達方式從產(chǎn)量和純化過程來看也不具備生產(chǎn)價值。
雖然國內(nèi)的研究者也進行了E.coli中表達hK1的研究，如廣州的李體遠等(李體遠等人組織激肽釋放酶成熟蛋白的純化及活性分析《中國生物制品學雜志》18(1)33～35，2005)，杜珙，李體遠等人胰激肽原酶的表達《中國藥學雜志》38(6)465～467，2003)用pMBP載體，在E.coli中，將hK1同麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)進行融合分泌表達，在6L罐發(fā)酵的條件下，總共只獲得了24mg MBP-hK1融合蛋白，經(jīng)過凝血酶切割，才能獲得有活性hK1。這些研究同國外在E.coli中的工作一樣，不僅表達產(chǎn)量低，也沒有解決純化問題。袁新清等(袁新清 陳勁春 人胰激肽原酶在畢赤酵母中的分泌表達《北京化工大學學報》31(6)33～35，2004)在甲醇酵母表達表達系統(tǒng)中直接表達hK1，發(fā)酵上清中hK1產(chǎn)量約40mg/L，而從研究者提供的信息中也不清楚其表達產(chǎn)量的確定方法，也沒有這項研究的后續(xù)性工作。綜合目前有關hK1的研究，所有r-hK1的制備有面臨工程菌株表達產(chǎn)量底，產(chǎn)品不均一，純化工藝復雜，有效收率很低的缺點。
本專利是根據(jù)Genebank中已經(jīng)公布的人hK1基因序列資料，合成其成熟蛋白基因序列的5`-和3`-引物，從商品化的人腎cDNA中釣取了hK1基因。將該基因插入到Invitrogen公司的pPICZ α A表達載體的限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI位點之間，線性化處理表達載體后，電轉(zhuǎn)化甲醇酵母宿主菌X33，在YPD+Zeocin抗性平板上篩選陽性克隆，并按常規(guī)操作篩選獲得了高表達的工程菌株。該菌株可以利用載體自身的酵母α-信號肽分泌表達r-hK1蛋白，并且沒有發(fā)現(xiàn)α-信號肽無法切除的情況發(fā)生，表達產(chǎn)量高達1.25～1.35g/L發(fā)酵上清液，r-hK1產(chǎn)品雖有糖基化修飾程度的差別，但蛋白的N-、C-端均一，通過純化過程可以獲得糖基化程度一致的r-hK1蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
1.hK1基因的獲得和pPICZα-hK1表達載體的構(gòu)建 綜合GeneBank中已經(jīng)獲得的人激肽釋放酶-1(Homo sapines Kallikrein-1)基因(AY094609、NM-002257、BC005313、X13561、AY890098、AY890097、AY703451)的序列信息，設計擴增hK1基因的5`-和3`-引物，以Panomics公司的人腎cDNA文庫為模板，用PCR法獲得了人hK1基因。
為將目的基因正確地插入到pPICZ α A載體中，5′-引物帶有XhoI位點(CTCGAG)，并在XhoI位點和hK1基因前加入Kex2蛋白酶的識別序列Lys-Arg對應的密碼子AAAAGA，3`-引物是在hK1的羧端最后一個氨基酸殘基的密碼子之后添加終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶NotI位點(GCGGCCGC)，這樣一來，PCR出的hK1基因經(jīng)過XhoI和NotI雙切后就可以插入到pPICZ α A載體的XhoI-NotI位點之間，這樣就獲得了分泌型表達載體pPICZ α-hK1。
2.工程菌株的篩選 將測序確認為正確的pPICZ α-hK1表達載體用SacI線性化處理，電轉(zhuǎn)線性化后的hK1表達載體至甲醇酵母X33感受態(tài)細胞中，鋪YPDZ(YPD+1.5％Agar+500μg/ml Zeocin)平板，篩選陽性克隆。用YPD培養(yǎng)液增殖陽性克隆，約6～8小時，當菌體OD500達到2～3時，保存一份菌液為原始種子，并將其余菌液4000rpm離心，上清凍存作對照，而將菌體懸浮后轉(zhuǎn)入誘導培養(yǎng)液BMMY，300rpm振蕩培養(yǎng)，每過12小時補無水甲醇至甲醇之終濃度為0.5％，如此維持甲醇誘導狀態(tài)約48小時。用誘導前上清作對照，電泳檢測是否有目的蛋白hK1條帶出現(xiàn)。同時，根據(jù)hK1活性測定的標準方法(見實施例2)測定活性變化，并根據(jù)活性差別，篩選更多數(shù)目的陽性克隆，以便獲得高表達的r-hK1工程菌株。
3.發(fā)酵工藝的確定 甲醇酵母的發(fā)酵可分為菌體增殖、限速生長和誘導表達這三個相輔相成的階段，控制好這三個階段的關鍵性參數(shù)就能獲得目的蛋白的高表達。
菌體增殖階段整個發(fā)酵階段的溫度均為30.0℃。用氨水將初始全鹽培養(yǎng)基的pH值調(diào)為5.0，起始攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量0.5vvm，溶氧DO100％，進行菌體增殖培養(yǎng)。當罐中起始培養(yǎng)基內(nèi)的甘油耗盡后，DO值會急劇上升(DO Spike)，繼續(xù)補充碳源(甘油或葡萄糖等)提高菌體密度，此時，即進入發(fā)酵的限速生長階段。
限速生長階段維持DO≥20％，繼續(xù)流加甘油，使發(fā)酵液中的菌體濕重達到180～200g/L。當菌體濕重達到要求后就用氨水，將發(fā)酵的pH值上調(diào)為6.0，準備進入誘導表達階段。
誘導表達階段暫停碳源補給，饑餓菌體30分鐘后，再開始補給甲醇，并緩慢增加甲醇的量，待菌體適應后，維持DO值≥20％的水平基礎上以最大速率補加誘導物甲醇，并保持此狀態(tài)至發(fā)酵結(jié)束。
4.人激肽釋放酶的活性測定方法 4.1.測定的原理 hK1能特異性水解發(fā)色底物S-2266(Val-Leu-Arg-pNA，Chromogenix)分子中-Arg-pNA之間的化學鍵釋放出pNA，游離的pNA分子的特征性吸收峰是405nm，單位時間內(nèi)釋放的游離的pNA量(A405值)同酶的活性成正比，所以，根據(jù)A405值就可以計算hK1的活性。
4.2.測定所用試劑和溶液 進行該項測定所用的試劑有發(fā)色底物S-2266溶液(2mM)，稀釋緩沖溶液(20mMTris-Cl，pH8.0)，反應緩沖液(0.2M Tris-Cl，pH8.0)及反應終止液(50％醋酸溶液)。
4.3.活性測定的過程 根據(jù)估計的待測樣品濃度，用20mM Tris-Cl，pH8.0緩沖液將待測樣品稀釋成一系列倍數(shù)，如100、200、300等。在潔凈的2ml西林瓶中加入400ul 0.2M pH8.0 Tris-Cl緩沖液，再加入20μl稀釋后的待測定樣品溶液，對照樣則加入20μl稀釋緩沖溶液，混勻后，37℃水浴保溫5分鐘使各測定管中溶液溫度一致，再分別各加入40μl發(fā)色底物S-2266，混勻，精確計時，并于37℃水浴反應15分鐘。然后，各反應樣品中加入40μl 50％乙酸溶液終止反應，分用對照將分光光度計調(diào)零，在405nm波長處測定吸收值A405值，A405值應在0.1～0.2之間，不在此范圍時則增加或減少稀釋倍數(shù)重新進行。
4.4.測定結(jié)果的計算 游離型pNA的A405摩爾消光系數(shù)為9,600 L mol-1 cm-1，根據(jù)bK1活性單位的含義1PNAU是指在37℃，Tris-Cl，pH8.0緩沖體系中，1分鐘內(nèi)能水解底物S-2266釋放1μmol游離pNA的酶量為一個hK1活性單位(PNAU)。按照朗伯-比爾(Beer-Lambert)定律，則每毫升待測樣品中hK1活性單位可按下述公式計算 PNAU/ml＝0.1736*A405*稀釋倍數(shù) 用S-2266發(fā)色底物測定hK1活性是整個研究工作的基礎，采用本方法可以快速、準確地對待測定樣本(發(fā)酵液、原液、純化中間樣品等)中hK1活性進行準確定量。如果r-hK1的準確比活性為5.2PNAU/mg，那么要采用此法測定時，應該將待測定r-hK1樣品的蛋白濃度稀釋在3.2～6.5μg/ml(相當于0.017～0.034PNAU/ml)范圍內(nèi)，這樣就可以減少稀釋樣品的工作量，便于快速獲得結(jié)果。



圖1.試管中對24孔板上初篩的6個高抗Zeocin克隆進行誘導表達 泳道0.是誘導表達前的發(fā)酵上清；泳道1～6.高抗Zeocin抗性(500μg/ml)的克隆誘導48小時的結(jié)果?？梢?，還原(R)和非還原(NR)的SDS-PAGE時，r-hK1的遷移率有差別，且有兩條靠近的帶。MLMW Marker Kit(Amersham Pharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
圖2.30L發(fā)酵誘導階段產(chǎn)生r-hK1的SDS-PAGE還原電泳 整個誘導階段每間隔8小時取樣，每個泳道下面的數(shù)字表示甲醇誘導的小時數(shù)。MLMWMarker Kit(Amersham Pharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
圖3.Phenyl-Sepharose FF層析(A)和Superdex75分子篩層析(B)純化 A用20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0緩沖液平衡Phenyl-Sepharose FF層析介質(zhì)。1.將200mM PB，pH6.0和3M(NH4)2SO4母液加至hK1發(fā)酵液中，使其在發(fā)酵液終濃度為20mMPB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，再用0.45μm膜過濾即成上樣液；2.流出液；3.20mM PB，0.7M(NH4)2SO4，pH6.0時洗脫峰；4.20mM PB，0.35M(NH4)2SO4，pH6.0時洗脫峰，其中分子量偏大的和稍低的hK1各占50％左右；5.20mM PB，pH6.0洗脫峰。
BSuperdex75分子篩層析的平衡和洗脫緩沖液均為20mM PB，0.15M NaCl，pH7.5，對0.5V柱體積時出現(xiàn)的洗脫峰進行分段收集，共分成①、②、③、④、⑤和⑥六段，其中①段分子量最大，量少，質(zhì)譜r-hK1-B測定的實際分子量為32871.16Dalton，④段是hK1主峰部分，量最大，質(zhì)譜r-hK1-A測定其實際分子量是28975.79Dalton。MLMW Marker Kit(AmershamPharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
圖4.凝膠過濾層析純化出不同糖基化程度r-hK1的質(zhì)譜 r-hK1-A是電泳分子量偏低的r-hK1，在整個分泌表達的蛋白中比例最高，r-hK1-B是SDS-PAGE電泳時分子量偏高的部分，所占比例較低。MLMW Marker Kit(AmershamPharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
圖5.r-hK1的等電點測定結(jié)果 泳道M中A和C～L代表的各個pI標準蛋白分子是A.Amylglucosidase(3.50)；C.Trypsininhibitor(4.55)；D.b-Lactoglobulin a(5.20)；E.Bovine carbonic anhydrase b(5.85)；F.Humancarbonic anhydrase b(6.55)；G.Myoglobin，acidic band(6.85)；H.Myoglobin，basic band(7.35)；I.Lentil lectin，acidic(8.15)；J.Lentil lectin，middle(8.45)；K.Lentil lectin，basic(8.65)；L.Trypsinogen(9.30)。泳道r-hK1-A是糖基化程度低的蛋白分子；泳道r-hK1-B是糖基化程度高的蛋白分子。r-hK1-A和r-hK1-B對應的質(zhì)譜如圖4。
圖6.PNGaseF去除r-hK1的N-糖基化修飾后的SDS-PAGE和質(zhì)譜 Ar-hK1是未進行脫糖處理時，De-r-hK1是PNGaseF處理后的r-hK1?？梢钥闯龇肿恿棵黠@變小了。B將De-r-hK1進行質(zhì)譜測定，確定其MW為26404.35Dalton，同按r-hK1理論氨基酸序列計算出的MW非常吻合。
具體實施例方式 實施例1 hK1工程菌株的構(gòu)造 1.hK1基因的獲得和表達載體pPICZa-hK1構(gòu)建 參考GeneBank中公布的有關hK1基因全序列資料，設計并合成(上海生工)能擴增成熟hK1基因的兩條引物Kal5(5`-引物，SEQ-3)Kal3(3`-引物，SEQ-4) Kal5(AA07624) 5`-catctc gag aaa aga att gtg gga ggc tgg gag tgt gag-3` Kal3(AA07625) 5`-cat gcg gcc gct tag gag ttc tcc gct atg gtg tcc tc-3` 以Panomics公司的人腎cDNA文庫(P/N7202，L/NP0260602)為模板，經(jīng)過PCR就獲得hK1基因。引物Kal5將在hK1基因5`-端添加DNA限制性內(nèi)切酶XhoI位點(CTCGAG)，和Kex2蛋白酶的識別序列Lys-Arg對應的密碼子AAA AGA，這將保證插入的hK1基因分泌表達時能順利切除α-信號肽，獲得具有天然N-端序列的hK1蛋白分子；引物Kal3在3`-端加終止密碼子TAA和DNA限制性內(nèi)切酶NotI位點(GCGGCCGC)。
用DNA聚合酶(Pyrobest)進行PCR擴增，體系如下 Human kidney cDNA------------------1μl Kal5(5`-引物)---------------------2μl Kal3(3`-引物)---------------------2μl dNTP Mix -------------------------1μl 10x Pyrobest Buffer----------------------2μl Pyrobest------------------------------0.25μl ddH2O --------------------------------1175μl總20μl PCR條件94℃變性3分鐘，再按94℃、30秒/55℃、30秒/72℃、1分種的方式循環(huán)30次。PCR結(jié)束后，取2μl擴增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖電泳，能獲得長度為約為750bp片段就表明PCR成功。
將PCR產(chǎn)物用柱回收試劑盒(Sangon)純化，用限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI雙切經(jīng)過柱回收的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過膠回收hK1基因。將pPICZ α A載體(Invitrogen)用XhoI和NotI雙切，回收載體的大片段作為插入目的基因的載體，將回收的hK1基因片段同與pPICZ α載體建立如下連接反應 pPICZ α載體(XhoI-NotI)-----------------2μl hK1基因(XhoI-NotI)------------------4μl 10×Ligation Buffer------------------------1μl T4 DNA Ligase(連接酶)-------------0.5μl ddH2O---------------------------2.5 總10μl 22℃條件下連接反應進行約1小時，取上述連接產(chǎn)物5μl與CaCl2法制備的TOP10F′感受態(tài)100μl小心混勻，4℃，30分鐘，42℃，熱休克90秒種，冰上放3～5分鐘，然后加入500μlLB培養(yǎng)液，于37℃ 200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)45分鐘，取100μl菌液涂布于含LZ(LB+Zeocin25μg/ml)+1.5％瓊脂糖的平板上，37℃過夜培養(yǎng)，將長出轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆。從中隨機挑取6個單菌落接種于5ml LZ培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒(BioAsia公司)抽提質(zhì)粒，用XhoI和NotI雙切篩選，取能酶切出約750bp片段的克隆測序確證序列。測序結(jié)果如SEQ-1，其對應的氨基酸序列如SEQ-2。這同GenBank中已經(jīng)公布的序列沒有區(qū)別。
2.工程菌株獲得 按照Invitrogen公司P.methanolica Expression Kit中方法制備X-33感受態(tài)細胞，質(zhì)粒表達載體用SacI酶切進行線性化，酚-氯仿抽提除去蛋白，乙醇沉淀用去離子水溶解后的線性化載體與X33感受態(tài)細胞混勻，電轉(zhuǎn)化，涂布于含Zeocin 500ug/ml的YPD(1％酵母提取物，2％多聚蛋白胨， 2％葡萄糖)平板上，30℃培養(yǎng)2～3天，直到有酵母單菌落生長出現(xiàn)。根據(jù)Easyselect Pichia Expression Kit中的描述，首先通過提高Zeocin抗生素的抗性來篩選重組子，挑取100個重組子接種于400μl YPD(含Zeocin 600μg/ml)培養(yǎng)液的24孔板中，30℃搖床培養(yǎng)過夜，將篩出的高抗Zeocin孔留種(6個符合要求的克隆)共篩選出并轉(zhuǎn)接到試管中補加2ml YPD培養(yǎng)液繼續(xù)增殖，24小時后離心收集菌體，用含甲醇0.5％的BMMY培養(yǎng)基30℃誘導表達，24小時添加甲醇使其在菌液中的終濃度為0.5％，維持這種誘導狀態(tài)48小時，離心收集菌液上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測誘導前后對比，發(fā)現(xiàn)誘導后的發(fā)酵上清中有30kDa蛋白條帶表達出來。由于電泳觀察蛋白帶型變化很難進行準確判斷表達產(chǎn)量，所以同時也采用前面發(fā)明內(nèi)容4.中描述的方法，以誘導前上清作空白對照，用發(fā)色底物S-2266來準確測定誘導后發(fā)酵上清中r-hK1活性單位產(chǎn)量。最后確定其中一株高表達的hK1工程菌株(圖1)作為發(fā)酵用，并建立三級種子庫。
實施例2 r-hK1工程菌的發(fā)酵 1.種子液準備 取工作種子甘油凍存管，融化后取1ml接種至500ml YPD培養(yǎng)基(1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中，在30℃，300rpm的搖床中培養(yǎng)30小時至OD600值在6.0±1.0，鏡檢正常就得到種子液上罐接種用。配制發(fā)酵用基礎鹽培養(yǎng)基BSM1(K2SO4 60.7克，MgSO424.2克，CaSO4·2H2O 3.9克，H3PO4 89毫升，KOH 13.8克，PTM1 14毫升，甘油400克，泡敵2毫升，以10L為例，以配制1升的微量元素培養(yǎng)基PTM1為例，其中各組份的含量是CuSO4·5H2O 6.0克，NaI 0.008克，MnSO4 3.0克，NaMoO4 0.2克，H3BO3 0.02克，ZnSO4 20.0克，CoCl2 0.5克，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0克，生物素0.2克，H2SO4 5毫升，加水定容為1升)后進行實罐滅菌。滅菌條件為121℃，20分鐘，消后冷至30℃。按1∶15(V/V，種子液基礎罐基培養(yǎng)液BSM1)比例接種。
2.發(fā)酵過程 初期菌體增殖階段的發(fā)酵溫度為30.0±0.5℃，pH5.00±0.05，起始轉(zhuǎn)速300rpm培養(yǎng)，通氣量0.5vvm，DO值100％，添加PTM1。此階段大約20小時左右，維持DO值不低于30％，當碳源消耗完畢時，溶氧值迅速地上升，菌體濕重達到約100g/L，此時進入限速生長階段，此階段的開始2小時期間，以240ml/小時的速率補加濃度為50％的甘油溶液。補料2小時后，補料速率上調(diào)為360ml/小時。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐壓(＜0.8bar)使DO值維持在不低于20％的水平。補加約4小時，菌體濕重約160～180g/L時，停止補料，DO值上升。DO值上升表明培養(yǎng)基中碳源耗盡，應該可以碳源兼誘導物甲醇進行補料，這就進入發(fā)酵的關鍵性階段誘導表達階段用氨水將pH值控制在6.20±0.05，開始補加甲醇。甲醇的起始加入量控制在30ml/小時，緩慢增加甲醇的加入量，約2小時后將補料速度設定為60ml/小時。誘導4小時后將甲醇補料速度設定為120ml/小時，此時甲醇誘導成功，菌體可以正常高速度利用甲醇作為碳源。維持DO值不低于20％，溫度30℃，pH值為6.20±0.05，進行發(fā)酵表達，在整個發(fā)酵期間，每8小時取一次樣，測定活性(表1)并SDS-PAGE電泳(圖2)。誘導60小時時結(jié)束發(fā)酵過程，離心收集上清，SDS-PAGE電泳和S-2266發(fā)色底物法檢測表達產(chǎn)量。
整個發(fā)酵誘導階段中，以1毫升發(fā)酵液為測定標準，測定進入甲醇誘導階段時，發(fā)酵液中菌體濕重增加、發(fā)酵上清減少，表達產(chǎn)物r-hK1蛋白的顯著增加情況。可見，并不是誘導時間越長越好，因為發(fā)酵過程中取樣會減少發(fā)酵液總體積，菌體大量增加會使上清大大減少以及誘導時間長久會使雜蛋白大幅度增加，r-hK1降解增加，權(quán)衡這些因素后將發(fā)酵的誘導時間定為50～60小時。
表1.發(fā)酵誘導階段菌體濕重、上清體積和表達產(chǎn)量比較 實施例3 r-hK1蛋白的純化 純化過程由疏水、陰離子交換和凝膠過濾層析三步組成，其中疏水層析選擇Phenyl-Sepharose FF，陰離子交換介質(zhì)是Q-Sepharose FF，凝膠過濾層析采用Superdex75。
具體過程如下 1.發(fā)酵液的預處理 向發(fā)酵上清液中加入0.2M PB，pH6.0和3.0M(NH4)2SO4溶液至其在發(fā)酵液中的終濃度分別為20mM和1.0M，調(diào)節(jié)pH值至6.0，靜置1小時后0.45微米濾膜過濾即成含有20mMPB，1.0M(H4)2SO4，pH6.0的處理后發(fā)酵液(上樣液)，就可以進行層析過程。
2.Phenyl-Sepharose FF疏水層析 將上述處理后的發(fā)酵液上Phenyl Sepharose FF層析柱，柱型為Index70/500，柱床體積為500ml，平衡緩沖液為20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，洗脫緩沖液為20mM PB，0.7M(NH4)2SO4，pH6.0、20mM PB，0.4M(NH4)2SO4，pH6.0和20mM PB，pH6.0，收集各個洗脫峰。其中目的蛋白r-hK1主要在20mM PB，pH6.0洗脫峰中(圖3A)。
3.Q-Sepharose FF陰離子交換層析 將疏水層析洗脫主峰收集液用1.0M NaOH向上調(diào)節(jié)pH至7.5，稀釋電導≤8.0mS/cm，上Q-Sepharose FF陰離子交換層析柱，柱規(guī)格為5×10cm，柱床體積為200ml，平衡緩沖液20mM PB，pH7.5，洗脫緩沖液為20mM PB，0.2M NaCl，pH7.5和20mM PB，0.5M NaCl，pH7.5，收集各個洗脫峰。目的蛋白r-hK1主要在20mM PB，0.5M NaCl，pH7.5的洗脫峰中。
4.Superdex 75凝膠過濾層析 平衡及洗脫采用的是20mM PB，0.15M NaCl，pH7.5緩沖液，將陰離子交換層析洗脫液分批上Superdex 75，柱規(guī)格為6.0×60cm預裝柱，柱床體積為1700ml，每次上樣量為不超過柱床體積的5％(約85ml)，分段收集主峰，SDS-PAGE電泳確定純度后合并符合要求的部分，過濾除菌，即為r-hK1原液(圖3B)。
實施例4 r-hK1性質(zhì)確證 1.r-hK1比活性測定 對純化出的r-hK1進行蛋白純度(SDS-PAGE電泳、RP-HPLC)測定，將純度不低于98％的r-hK1用Lorry法準確測定濃度，按照發(fā)明內(nèi)容4.中hK1的活性測定方法中描述，用S-2266發(fā)色底物測定活性單位(PNAU)數(shù)。用活性單位(PNAU)/蛋白濃度(mg)，就可以得出r-hK1的比活性，實際結(jié)果約為5.2PNAU/mg。
2.r-hK1蛋白的質(zhì)譜和N-端和C-端序列測定 將凝膠過濾層析分段收集純化出的r-hK1蛋白取分子量偏低的和分子量偏高作為兩組，委托中國科學院上海生命科學研究院生化與細胞研究所蛋白質(zhì)組學研究中心按照標準方法進行蛋白N-端序列分析，結(jié)果表明兩者雖然在分子量上有差別，但是用S-2266發(fā)色底物法測定其體外活性時并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差別，它們多肽鏈的N-端序列完全一致，N-端前15個氨基酸殘基均為I-V-G-G-W-E-C-E-Q-H-S-Q-P-W-Q-。利用羧肽酶水解法測定這兩組r-hK1的羧端三個氨基酸殘基是-E-N-S。這表明我們利用甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達r-hK1時并沒有以前的研究者所描述的N-端不均一現(xiàn)象，電泳顯示的分子不均一是糖基化修飾程度不同所致，但是通過純化可以分開糖基化程度不同的r-hK1蛋白分子。
3.r-hK1蛋白的等電點測定 采用等電聚焦法測定r-hK1蛋白的等電點，所用pI標準蛋白是GE Healthcare LifeScience公司的Broad pI Kit pH3～10，高糖基化和低糖基化修飾的r-hK1蛋白的pI也沒有明顯區(qū)別，都在pI標準蛋白的3.5～4.5位置中間區(qū)域?qū)?圖5)，這表明甲醇酵母表達的r-hK1的pI約為4.0。
4.r-hK1蛋白的去糖基化試驗 按理論推測，hK1蛋白的氨基酸序列中有三個可能的N-型糖基化修飾位點，是否這些位點在酵母分泌表達r-hK1蛋白時都發(fā)生了糖基化修飾了呢？根據(jù)hK1蛋白的氨基酸序列計算不發(fā)生修飾的hK1多肽鏈的分子量應該是26405.74Dalton，而實際純化出的r-hK1蛋白的分子量并不均一，從SDS-PAGE電泳可以看出(圖1、圖2、圖3)，但是更準確的是用質(zhì)譜測定純化的r-hK1蛋白的分子量，根據(jù)圖4從28975.79Dalton到31871.16Dalton，那么甲醇酵母分泌表達的r-hK1蛋白在分子量上凈增加的2570.05～5465.42Dalton就應該是甲醇酵母分泌表達時對蛋白進行翻譯后修飾時添加上去修飾成分的分子量，也就是說修飾增加的N-糖鏈部分占蛋白分子的8.86～17.15％。
用PNGase F蛋白酶(New England BioLabs)按使用手冊中的標準操作處理r-hK1，SDS-PAGE電泳可以看出除去N-糖鏈后r-hK1分子變小了(圖6A)，將除去N-型糖鏈的r-hK1(De-r-hK1)進行質(zhì)譜測定(圖6B)，此時的分子量為26404.35Dalton，同理論計算出的26405.74Dalton非常接近，這表明甲醇酵母表達出的r-hK1蛋白中并無其他的修飾方式，只有酵母的N-型糖基化修飾。
實施例5 r-hK1對大鼠局灶性腦缺血的影響 本試驗委托中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥理學教研究室進行，初步結(jié)果如下 1.實驗材料 1.1藥品 受試藥批號為20060218的r-hK1原液，純度之98％，蛋白濃度4.8mg/ml、活性濃度25PNAU/ml。臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。陽性對照藥尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號0411022)，每50ml注射液中含尼莫地平10mg。溶劑對照0.9％氯化鈉注射液(上海百特醫(yī)療用品有限公司，產(chǎn)品批號A6B11307)。
1.2試劑 紅四氮唑(TTC)(上海生工生物工程有限公司，批號2803B19)，臨用前用PBS緩沖液配成濃度為2％，避光備用。
1.3實驗動物 雄性SD大鼠，體重從280克至350克，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。
1.4儀器 圖像分析系統(tǒng)(Germany，Leica Microsystems，Type DM LB2)。
2.實驗方法 2.1局部腦缺血模型制備 取雄性大鼠，腹腔注射15％水合氯醛(300mg/kg)麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，小心分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)和枕動脈，在CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。在距CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，這時用繞在CCA遠心端的細線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當插入深度在20mm時，緊緊系牢CCA遠心端的細線，逐層縫合切口。
2.2頸靜脈插管給藥 分離頸外靜脈，穿線兩道備用。遠心端結(jié)扎，近心端動脈夾夾閉。斜行剪一切口，將充滿藥液或生理鹽水的靜脈管45度角插入。近心端結(jié)扎導管，除去動脈夾。稍稍回抽檢查是否成功，于腦梗模型造成后30min按0.1ml/100g體重給藥。另穿一線于導管下方，將導管末端靜脈結(jié)扎，拔出導管，逐層縫合?；鼗\飼養(yǎng)。室溫嚴格控制在24～25℃。24h后斷頭去腦，測定梗死區(qū)面積及梗死區(qū)重量。
2.3實驗分組及給藥劑量 實驗分三組(模型組，陽性對照組，受試藥組)，每組約15只雄性SD大鼠。模型組造模并給予等體積的生理鹽水0.1ml/100g。陽性藥對照組給予尼莫地平注射液0.5mg/kg。受試藥組給予r-hK1 30×10-3 PNAU/kg，0.1ml/100g。
2.4觀察指標 術后24h，先觀察并記錄動物的死亡情況，然后將動物斷頭取腦，把剝離完整的大腦放入-20℃冰 表2.24小時內(nèi)各組動物死亡計數(shù) 表3.尼莫地產(chǎn)組腦梗死百分比 n。
表2.24小時內(nèi)各組動物死亡計數(shù) 表3.尼莫地平組腦梗死百分比 如表2所示，尼莫地平組和r-hK1組24小時內(nèi)大鼠死亡率顯著低于模型組，提示r-hK1和尼莫地平均可降低急性腦梗動物的死亡。
表4.模型組腦梗死百分比 表5.r-hK1組腦梗死百分比 與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
如表6總結(jié)所示，與模型組比較，陽性對照藥尼莫地平能顯著地縮小腦梗死區(qū)面積和腦梗死區(qū)重量(P＜0.05)。受試藥r-hK1與模型組比較，能非常顯著地縮小腦梗死區(qū)面積和腦梗死區(qū)重量(P＜0.01)。實驗結(jié)果提示與尼莫地平類似，r-hK1對急性缺血性腦梗死具有治療作用。
DNA和蛋白質(zhì)的序列描述
SEQ-1序列的資料
(1).序列特征
a.長度714bp
b.類型核苷酸
c.拓撲學線性
(2).分子類型人胎腎cDNA
(3).序列描述SEQ-1
1 ATTGTGGGAG GCTGGGAGTG TGAGCAGCAT TCCCAGCCCT GGCAGGCGGC
51 TCTGTACCAT TTCAGCACTT TCCAGTGTGG GGGCATCCTG GTGCACCGCC
101 AGTGGGTGCT CACAGCTGCT CATTGCATCA GCGACAATTA CCAGCTCTGG
151 CTGGGTCGCC ACAACTTGTT TGACGACGAA AACACAGCCC AGTTTGTTCA
201 TGTCAGTGAG AGCTTCCCAC ACCCTGGCTT CAACATGAGC CTCCTGGAGA
251 ACCACACCCG CCAAGCAGAC GAGGACTACA GCCACGACCT CATGCTGCTC
301 CGCCTGACAG AGCCTGCTGA TACCATCACA GACGCTGTGA AGGTCGTGGA
351 GTTGCCCACC CAGGAACCCG AAGTGGGGAG CACCTGTTTG GCTTCCGGCT
401 GGGGCAGCAT CGAACCAGAG AATTTCTCAT TTCCAGATGA TCTCCAGTGT
451 GTGGACCTCA AAATCCTGCC TAATGATGAG TGCAAAAAAG CCCACGTCCA
501 GAAGGTGACA GACTTCATGC TGTGTGTCGG ACACCTGGAA GGTGGCAAAG
551 ACACCTGTGT GGGTGATTCA GGGGGCCCGC TGATGTGTGA TGGTGTGCTC
601 CAAGGTGTCA CATCATGGGG CTACGTCCCT TGTGGCACCC CCAATAAGCC
651 TTCTGTCGCC GTCAGAGTGC TGTCTTATGT GAAGTGGATC GAGGACACCA
701 TAGCGGAGAA CTCC
SEQ-2序列的資料
(1).序列特征
a.長度238氨基酸
b.類型氨基酸
c.拓撲學未知
(2).分子類型蛋白質(zhì)
(3).序列描述SEQ-2
1 IVGGWECEQH SQPWQAALYH FSTFQCGGIL VHRQWVLTAA HCISDNYQLW
51 LGRHNLFDDE NTAQFVHVSE SFPHPGFNMS LLENHTRQAD EDYSHDLMLL
101 RLTEPADTIT DAVKVVELPT QEPEVGSTCL ASGWGSIEPE NFSFPDDLQC
151 VDLKILPNDE CKKAHVQKVT DFMLCVGHLE GGKDTCVGDS GGPLMCDGVL
201 QGVTSWGYVP CGTPNKPSVA VRVLSYVKWI EDTIAENS
SEQ-3序列的資料
(1).序列特征
a.長度39nt
b.類型核苷酸
c.拓撲學線性
(2).分子類型人工合成序列
(3).序列描述SEQ-3
1 CATCTCGAGA AAAGAATTGT GGGAGGCTGG GAGTGTGAG 39
SEQ-4序列的資料
(1).序列特征
a.長度38nt
b.類型核苷酸
c.拓撲學線性
(2).分子類型人工合成序列
(3).序列描述SEQ-4
1 CATGCGGCCG CTTAGGAGTT CTCCGCTATG GTGTCCTC38
權(quán)利要求
1.一種由甲醇酵母(Pichiapastoris)系統(tǒng)高效分泌表達，并經(jīng)過發(fā)酵、純化過程制備且含有糖基化修飾的重組人激肽釋放酶-1(r-hK1)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的高效分泌表達，是指上罐發(fā)酵時所獲得的發(fā)酵上清中r-hK1的蛋白產(chǎn)量可達到1.2g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所制備的r-hK1的分子量范圍是28～32kDa，整個分子是一條含有238氨基酸殘基的多肽鏈，其N-端前15個氨基酸殘基為I-V-G-G-W-E-C-E-Q-H-S-Q-P-W-Q-，C-末端3個氨基酸殘基為-E-N-S，分子內(nèi)全部為甲醇酵母的N-型糖鏈修飾，其中糖類占整個糖蛋白的8.86～17.16％，蛋白的等電點(pI)約為4.0。r-hK1的基因及氨基酸序列分別為SEQ-1和SEQ-2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所制備的r-hK1，采用S-2266發(fā)色底物法確定的比活性為5.2 PNAU/mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所指的發(fā)酵是采用全鹽培養(yǎng)基，甲醇誘導表達r-hK1時的pH6.2，溫度為30℃，誘導時間50小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所指的純化是由疏水層析(Phenyl-SepharoseFF)捕獲、陰離子交換層析(Q-SepharoseFF)除去雜蛋白并濃縮目的蛋白r-hK1，以及凝膠過濾層析(Superdex-75)分段收集獲得高純度r-hK1這三步層析純化過程組成。其中Phenyl-Sepharose FF疏水層析的最適上樣條件是20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，最適洗脫條件是20mM PB，pH6.0，Q-Sepharose FF陰離子交換層析的上樣電導率不高于8.0mS/cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所制備的r-hK1可以顯著降低大鼠腦梗塞動物模型的死亡率。
全文摘要
本發(fā)明是采用基因工程的方法，在甲醇酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)中生產(chǎn)重組人激肽釋放酶－1(Recombinant Human Kallikrein－1，r－h(huán)K1)，對r－h(huán)K1的發(fā)酵和層析純化過程，特別是對其分子量、等電點、糖含量以及糖修飾類型等有關分子結(jié)構(gòu)特征進行了描述。通過對r－h(huán)K1體外、體內(nèi)活性的測定和試驗，表明r－h(huán)K1可望成為治療和預防腦梗塞的藥物。
文檔編號C12N9/00GK101092598SQ20061002775
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月19日
發(fā)明者黃秀東, 陳佩新, 王俊, 陳耀國, 袁靖宇, 王書生, 潘學工, 曹之舫 申請人:上海萬興生物制藥有限公司