專利名稱：一種基因工程菌、制備及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程菌，尤其是一種能夠高效表達(dá)人谷氨酸脫羧酶65或者硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白的基因工程菌，以及該基因工程菌的制備方法及其用途，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種嚴(yán)重的世界性疾病，發(fā)病率一直居高不下，目前全世界糖尿病患者總數(shù)近2億，估計(jì)到2010年將上升到2.2億，2025年將超過(guò)3億。在這龐大的糖尿病人群中，約有10％是I型糖尿病病人，并且大多數(shù)是青年人。其余90％的II型糖尿病人群中也有一部分是成人隱匿性自身免疫糖尿病患者(LADA)，這些患者有從II型糖尿病轉(zhuǎn)變?yōu)镮型糖尿病的傾向，從II型糖尿病人群中診斷出這些LADA患者將有助于患者進(jìn)行早期的干涉治療。
谷氨酸脫羧酶65(Glutamate Decarboxylase 65，以下用略寫為“GAD65”)是特異性催化L-谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸的一種酶，由585個(gè)氨基酸組成，分子量約為65KD，廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，在胰島、睪丸、卵巢、胸腺和胃中也有表達(dá)，而在人類胰島中只有GAD65表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)I型糖尿病是一種遺傳易感個(gè)體通過(guò)自身抗原介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所引起胰島β細(xì)胞破壞的自身免疫性疾病，GAD65是此免疫反應(yīng)關(guān)健的始動(dòng)靶抗原，針對(duì)GAD65的抗體GAD65-Ab早在I型糖尿病臨床發(fā)作前幾年或十幾年就已經(jīng)出現(xiàn)。迄今為止，GAD65-Ab是診斷I型糖尿病免疫指標(biāo)中最有效和特異的一個(gè)。
所以，用GAD65來(lái)檢測(cè)GAD65-Ab的存在可作為T1DM的預(yù)測(cè)和診斷手段；可應(yīng)用于從T2DM患者中鑒別出隱匿性T1DM患者，使患者能夠進(jìn)行早期干預(yù)治療；也可作為一種普查手段，用來(lái)發(fā)現(xiàn)T1DM的高危人群。
目前，采用從天然組織中分離純化以及人工化學(xué)合成的方法獲得大量人GAD65蛋白質(zhì)是不現(xiàn)實(shí)的。國(guó)外已經(jīng)有研究者嘗試在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞以及大腸桿菌等表達(dá)體系中嘗試表達(dá)天然重組人GAD65，但發(fā)現(xiàn)存在以下幾個(gè)缺點(diǎn)(1)人GAD65表達(dá)量很低，并且GAD65-Ab檢測(cè)方法設(shè)備要求高，僅能用于實(shí)驗(yàn)室分析；(2)人GAD65的表達(dá)主要以包涵體形式表達(dá)，且很難進(jìn)行正確的復(fù)性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沒(méi)有酶學(xué)活性和特異的針對(duì)I型糖尿病的免疫活性；(3)耗時(shí)費(fèi)力，花費(fèi)巨大，不適合中國(guó)國(guó)情?；谝陨蠋讉€(gè)方面，迫切需要研制國(guó)產(chǎn)化的高效低價(jià)的能夠廣泛應(yīng)用的制備人GAD65的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能用于制備人GAD65或者硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白的基因工程菌。
本發(fā)明的另一目的在于提供成本低廉、高效表達(dá)的能用于制備人GAD65或者硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白的基因工程菌的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供能生產(chǎn)人GAD65的基因工程菌的用途，并提供該基因工程菌生產(chǎn)人GAD65或者硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白的方法。
本發(fā)明所述的能用于制備人GAD65或者硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白的基因工程菌由重組質(zhì)粒和宿主菌構(gòu)成，其中宿主菌指的是大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中的任意一種，重組質(zhì)粒指的是含GAD65基因的質(zhì)粒pET-32a(+)。
本發(fā)明提供的基因工程菌的進(jìn)一步特征在于所述的重組質(zhì)粒是pET-32a(+)-PT7-TrxA-6×His-GAD65，其中，PT7是所述質(zhì)粒pET-32a(+)的啟動(dòng)子；TrxA是硫氧還蛋白；6×His是組氨酸純化標(biāo)簽。
本發(fā)明提供的一種高效表達(dá)重組人GAD65的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括設(shè)計(jì)Nest-PCR上游和下游引物，用PCR從人胰腺cDNA庫(kù)中擴(kuò)增人GAD65基因片斷，并通過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，其特征在于設(shè)計(jì)的PCR引物含腸激酶酶切位點(diǎn)，用PCR擴(kuò)增的人GAD65基因片段經(jīng)過(guò)限制型內(nèi)切酶酶切，克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得高效表達(dá)重組人GAD65的基因工程菌。
具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的基因工程菌的構(gòu)建方法，具體操作步驟如下第一步 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已知人GAD65的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性的Nest-PCR上游引物A1、A2和下游引物B1，其中上游引物A2中引入KpnI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和腸激酶酶切位點(diǎn)，下游引物B1中引入BamHI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
上游引物A15’-GCGACCTGCTCCAGTCTCCAAAG-3’上游引物A25’-TTAGGTACCGACGACGACGACAAGGCATCTCCGGGCTCT-3’KpnI 腸激酶酶切位點(diǎn)下游引物B15’-GCTGGATCCTGGAACAGCTTGGTGAGCA-3’BamHI
第二步 Nest-PCR擴(kuò)增人GAD65DNA片段以人胰腺cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech)為模板，用高保真Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增GAD65，先用上述初級(jí)引物A1、B1進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物，再以初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物作模板，用上述次級(jí)引物A2、B1進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到人GAD65DNA片段，電泳檢測(cè)，純化并回收備用。
第三步 構(gòu)建含人GAD65基因序列的基因工程菌用兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切第二步獲得的人GAD65 DNA片段，所述的兩種限制性內(nèi)切酶是KpnI和BamHI，純化回收小片段，用同樣兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pET-32a(+)，純化回收大片段，連接上述回收的小片段和大片段，得含人GAD65DNA片段的重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65，將重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，制得含人GAD65基因序列，即人GAD65 DNA基因工程菌，將該基因工程菌委托專業(yè)的生物技術(shù)公司測(cè)序，證實(shí)該基因工程菌含完整的重組人GAD65基因片段；第四步 構(gòu)建高效表達(dá)人GAD65的基因工程菌從第三步構(gòu)建好的基因工程菌抽提重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)，得到高效表達(dá)的人谷氨酸脫羧酶65的基因工程菌。
上述構(gòu)建涉及到的人胰腺cDNA文庫(kù)、質(zhì)粒pET-32a(+)，大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、Rosetta-gami(DE3)、限制性內(nèi)切酶BamHI、KpnI和高保真Pfu DNA聚合酶均可從市場(chǎng)購(gòu)得。委托合成所述得的引物序列和測(cè)序的生物技術(shù)公司是上海華諾生物技術(shù)有限公司。
本發(fā)明提供的高效表達(dá)重組人GAD65的基因工程菌的用途為用于生產(chǎn)可溶的具有活性的硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白。本發(fā)明通過(guò)以下的技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題，具體操作步驟如下第一步 液體培養(yǎng)將上述構(gòu)建好的高效表達(dá)人谷氨酸脫羧酶65的基因工程菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm＝0.4～1.0時(shí)，加入終濃度為0.4～1.0mM的IPTG進(jìn)行低溫16℃誘導(dǎo)表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)和積累可溶性表達(dá)的硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白；第二步 純化制得硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白離心收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，離心收集上清，進(jìn)行His.Tag親和層析，收集硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白組分，用截留分子量為5KD的Millipore Amicon Ultra-15超濾管將蛋白濃縮至2mg/mL；本發(fā)明提供的高效表達(dá)重組人GAD65的基因工程菌的用途為用于生產(chǎn)可溶的具有活性的重組人GAD65。具體技術(shù)方案是在上述生產(chǎn)可溶的具有活性的硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白的基礎(chǔ)上，用腸激酶酶解硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白，25℃下酶解過(guò)夜，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行His.Tag親和層析，收集穿透峰，冷凍干燥，得到重組人谷氨酸脫羧酶65。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比較顯著效果在于(1)通過(guò)基因工程技術(shù)的方法讓人谷氨酸脫羧酶65基因與硫氧還蛋白一起融合表達(dá)，提高了可溶性人谷氨酸脫羧酶65的表達(dá)量。
(2)通過(guò)在人谷氨酸脫羧酶65基因的DNA序列的N端加入His.Tag純化標(biāo)簽，只要進(jìn)行一次His.Tag親和層析，便可從發(fā)酵液中得到較純的人谷氨酸脫羧酶65基因融合蛋白，純化步驟簡(jiǎn)便，比傳統(tǒng)技術(shù)的多次層析更易于操作。
(3)只要進(jìn)行一次酶解便能得到不含有額外氨基酸的重組人谷氨酸脫羧酶65，純化極為簡(jiǎn)便，得率高。
(4)純化的硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白有生物活性，可以選擇不經(jīng)過(guò)腸激酶酶解去除硫氧還蛋白直接應(yīng)用，避免了腸激酶價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)。
因而用本發(fā)明提供的基因工程菌可用于生產(chǎn)重組人谷氨酸脫羧酶65或硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白，產(chǎn)量高，純化工藝簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本較低。


圖1是重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65的構(gòu)建示意圖。
圖2是基因工程菌表達(dá)重組人谷氨酸脫羧酶65的SDS-PAGE電泳圖。
圖3是重組人谷氨酸脫羧酶65的分離純化和酶切結(jié)果圖。
其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；2為硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白；3為硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白經(jīng)腸激酶酶解，4為純化后的重組人谷氨酸脫羧酶65。
圖4是硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白酶學(xué)活性檢測(cè)圖。
其中1為L(zhǎng)-谷氨酸鈉(L-MSG)和γ-氨基丁酸(γ-GABA)對(duì)照；2為硫氧還蛋白—人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白催化L-谷氨酸鈉脫羧反應(yīng)的反應(yīng)液；3為L(zhǎng)-谷氨酸鈉脫羧反應(yīng)底物液對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖，通過(guò)實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。說(shuō)明書和實(shí)施例中凡未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按常規(guī)條件進(jìn)行。
實(shí)施例1基因工程菌的制備第一步 引物設(shè)計(jì)根據(jù)已知人GAD65的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性的Nest-PCR上游引物A1、A2和下游引物B1，其中上游引物A2中引入KpnI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和腸激酶酶切位點(diǎn)，下游引物B1中引入BamHI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
上游引物A15’-GCGACCTGCTCCAGTCTCCAAAG-3’上游引物A25’-TTAGGTACCGACGACGACGACAAGGCATCTCCGGGCTCT-3’KpnI 腸激酶酶切位點(diǎn)下游引物B15’-GCTGGATCCTGGAACAGCTTGGTGAGCA-3’BamHI第二步 Nest-PCR擴(kuò)增人GAD65DNA片段以人胰腺cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech)為模板，用高保真Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增GAD65，先用上述初級(jí)引物A1、B1進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物，按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃，40s；54℃，40s；72℃，2min，循環(huán)28次后72℃延伸5min，獲得初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物。再以初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物作模板，用上述次級(jí)引物A2、B1進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到人GAD65DNA片段，PCR反應(yīng)體系中包含1μl模板，即初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物，2μl 10X Pfu buffer，1μl Pfu DNA聚合酶，1μl dNTP(2.5mmol/L each)，引物A2和B1各1μl，12μl無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，然后94℃40s，55℃40s，72℃2min，循環(huán)28次后72℃延伸5min。反應(yīng)產(chǎn)物用DNA Gel Extraction Kit回收。電泳檢測(cè)，純化并回收備用。
第三步 構(gòu)建含人GAD65基因序列的基因工程菌用兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切第二步中獲得的人GAD65 DNA片段，所述的兩種限制性內(nèi)切酶是KpnI和BamHI，純化回收小片段，用同樣兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pET-32a(+)，純化回收大片段，連接上述回收的小片段和大片段，得含人GAD65DNA片段的重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65，將重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，制得含人GAD65基因序列，即人GAD65DNA基因工程菌，將該基因工程菌委托專業(yè)的生物技術(shù)公司測(cè)序，證實(shí)該基因工程菌含完整的重組人GAD65基因片段；第四步 構(gòu)建高效表達(dá)人GAD65的基因工程菌從第三步構(gòu)建好的基因工程菌中抽提重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中，得到高效表達(dá)的人谷氨酸脫羧酶65的基因工程菌。
實(shí)施例2利用本發(fā)明的基因工程菌制備硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白一種高效表達(dá)人谷氨酸脫羧酶65的基因工程菌的應(yīng)用，即用所述的基因工程菌生產(chǎn)人谷氨酸脫羧酶65。下述的親和層析介質(zhì)為Ni-NTA His.Bind或His.Bind樹(shù)脂，購(gòu)自Novagen公司，下述的腸激酶，購(gòu)自MERCK公司。
第一步 液體培養(yǎng)將實(shí)施例1中構(gòu)建好的基因工程菌接種于20mL含100mg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，210rpm，培養(yǎng)至OD600＝0.6-1.0。5000rpm，4℃，離心5min，收集沉淀的菌體，4℃保存過(guò)夜。第二天用20mL含100mg/mL Amp的LB培養(yǎng)基重懸菌體，4％體積接種于400mL含100mg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中。37℃，210rpm，培養(yǎng)至OD600nm＝0.4～1.0。加入終濃度為0.4～1.0mM IPTG，16℃～20℃進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜(約12h)。將搖瓶置于冰上冰浴5min后，6000rpm，4℃，離心5-10min收集菌體。加100mL NTA-0或IDA-0Buffer重懸菌體，同時(shí)加入終濃度為0.2mg/mL的溶菌酶和1mM的PMSF。冰上放置30min，超聲波破碎菌體，12000rpm，4℃，離心30min，收集上清。
第二步 純化制得硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白上清用親和層析柱Ni-NTA His.Bind或His.Bind樹(shù)脂分離純化得融合蛋白TrxA-GAD65。用5倍樹(shù)脂體積的NTA-0或IDA-0Buffer平衡NTA/IDA-Resin。將樣品加到NTA/IDA-Resin中，分別用2倍樹(shù)脂體積的NTA/IDA-0，NTA/IDA-20，NTA/IDA-40，NTA/IDA-60，NTA/IDA-80，NTA/IDA-100，NTA/IDA-200，5倍樹(shù)脂體積的NTA/IDA-1000Buffer洗脫，分別收集穿透部分和各個(gè)組分的洗脫液，用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)洗脫情況。經(jīng)SDS-PAGE分析含有融合蛋白TrxA-GAD65組分的洗脫液用截留分子量為5KD-10KD的Millipore Amicon Ultra-15超濾管將蛋白脫鹽和濃縮，濃縮至2mg/mL以上。蛋白濃度用Lowry法測(cè)定。
實(shí)施例3利用本發(fā)明的基因工程菌制備人谷氨酸脫羧酶65在實(shí)施例3的第二步的基礎(chǔ)上制備人谷氨酸脫羧酶65。融合蛋白TrxA-GAD65用腸激酶酶切。每毫克融合蛋白加1個(gè)單位的腸激酶，25℃，振蕩，酶切約16h。酶切產(chǎn)物用親和層析柱Ni-NTA His.Bind或His.Bind樹(shù)脂分離。收集穿透峰和NTA/IDA-0的洗脫峰。合并這兩種組分，用5KD-10KD的MilliporeAmicon Ultra-15超濾管對(duì)GAD65脫鹽和濃縮。蛋白濃度用Lowry法測(cè)定。
實(shí)施例4人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脫羧酶65蛋白酶學(xué)活性檢測(cè)。
TrxA-GAD65或GAD65酶學(xué)活性檢測(cè)采用測(cè)定由L-谷氨酸鈉(L-MSG)脫羧生成γ-氨基丁酸(γ-GABA)的量的方法。10ul蛋白樣品溶液加入到100ul反應(yīng)底物溶液(50mM磷酸緩沖液，pH7.2，1mM EDTA，0.2mM 5’-PLP，20mML-MSG)中，混勻，37℃水浴，30分鐘-1小時(shí)，然后取出20ul反應(yīng)液，加入20ul50mM硼酸緩沖液，pH9.0，再加入4ul NBD-Cl(4mg/ml)，55℃水浴1小時(shí)，取3-4ul反應(yīng)液點(diǎn)薄層層析硅膠板進(jìn)行薄層層析，展層劑為正丁醇、乙酸和水的混合液體，其中正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1.5∶1，展層完畢后置硅膠板于紫外燈下，L-MSG及γ-GABA處將顯示綠色熒光。對(duì)熒光進(jìn)行光度掃描可以對(duì)生成的γ-GABA進(jìn)行定量。
實(shí)施例5采用人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脫羧酶65蛋白質(zhì)進(jìn)行I型糖尿病診斷檢測(cè)(ELISA方法)利用人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脫羧酶65蛋白質(zhì)免疫學(xué)活性檢測(cè)。
利用人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脫羧酶65蛋白質(zhì)能與I型糖尿病患者血清中的人谷氨酸脫羧酶65蛋白抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)，按以下步驟進(jìn)行a)人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脫羧酶65蛋白質(zhì)以CBS包被緩沖液做不同稀釋度，100ul/孔點(diǎn)樣與于酶標(biāo)孔中，放入濕盒內(nèi)，4℃包被過(guò)夜。
b)用PBST洗滌液(PBS pH7.4，0.05％Tween-20)300ul/孔振蕩洗滌三次，每次3-5min，棄盡液體。
c)加封阻液(PBS pH7.4，0.05％Tween-20，2％BSA或5％脫脂奶粉)200ul/孔，37℃濕盒孵育1小時(shí)。
d)重復(fù)步驟b。
e)加I型糖尿病患者血清100ul/孔，37℃濕盒孵育1小時(shí)。
f)重復(fù)步驟b。
g)加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG，100ul/孔，37℃濕盒孵育1小時(shí)。
h)重復(fù)步驟b。
i)加OPD顯色液(OPD 0.5g/L，溶于0.05mol/L檸檬酸緩沖液pH5.0，含0.06％H2O2v/v，現(xiàn)配現(xiàn)用)100ul/孔，25℃顯色30min。
j)50ul/孔終止液(2mol/L H2SO4)終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀490nm測(cè)量各孔吸光值。
以上ELISA測(cè)試中設(shè)置一個(gè)正常人血清對(duì)照。每個(gè)孔同時(shí)做兩個(gè)復(fù)孔，各樣品吸光值采用平均值以減少誤差。
重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65的測(cè)序結(jié)果如下，可以證實(shí)該基因工程菌含完整的重組人GAD65基因片段KpnI1 ttaggt accgac gac gac gac aag gca tct ccg ggc tct ggcAsp Asp Asp Asp LysAla Ser Pro Gly Ser GlyEnterokinas43 ttt tgg tct ttc ggg tcg gaa gat ggc tct ggg gat tcc gagPhe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Asp Ser Glu
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權(quán)利要求
1.一種基因工程菌，由重組質(zhì)粒和宿主菌構(gòu)成，其特征在于重組質(zhì)粒指的是含GAD65基因的質(zhì)粒pET-32a(+)，宿主菌指的是大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中的任意一種。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于重組質(zhì)粒是pET-32a(+)-PT7-TrxA-6×His-GAD65，其中，PT7是質(zhì)粒pET-32a(+)的啟動(dòng)子；TrxA是硫氧還蛋白；6×His是組氨酸純化標(biāo)簽。
3.一種基因工程菌的制備方法，其特征在于通過(guò)設(shè)計(jì)的PCR引物含腸激酶酶切位點(diǎn)，用PCR擴(kuò)增的人GAD65基因片段，經(jīng)過(guò)限制型內(nèi)切酶酶切，克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65，然后轉(zhuǎn)化到宿主菌中，制得的基因工程菌。
4.如權(quán)利要求3所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于包括如下步驟第一步引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)人GAD65的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性的Nest-PCR上游引物A1、A2和下游引物B1，其中上游引物A2中引入KpnI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和腸激酶酶切位點(diǎn)，下游引物B1中引入BamHI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；上游引物A15’-GCGACCTGCTCCAGTCTCCAAAG-3’上游引物A25’-TTA GCATCTCCGGGCTCT-3’KpnI腸激酶酶切位點(diǎn)下游引物B15’-GCT TGGAACAGCTTGGTGAGCA-3’BamHI第二步Nest-PCR擴(kuò)增人GAD65DNA片段以人胰腺cDNA文庫(kù)為模板，用高保真Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增GAD65，先用初級(jí)引物A1、B1進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物，再以初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物作模板，用次級(jí)引物A2、B1進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到人GAD65 DNA片段，純化并回收備用；第三步構(gòu)建含人GAD65基因序列的基因工程菌用兩種限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI雙酶切第二步獲得的人GAD65 DNA片段，純化回收小片段，再用KpnI和BamHI雙酶切質(zhì)粒pET-32a(+)，純化回收大片段，連接上述回收的小片段和大片段，得含人GAD65 DNA片段的重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65，將重組質(zhì)粒pET-32a-GAD65轉(zhuǎn)化到宿主菌制得人GAD65 DNA基因工程菌。
5.如權(quán)利要求3或者4所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于宿主菌是大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中的任意一種。
6.基因工程菌在制備硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的基因工程菌在制備硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白中的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟第一步液體培養(yǎng)將制備好的基因工程菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm＝0.4～1.0時(shí)，加入終濃度為0.4～1.0mM的IPTG進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)和積累可溶性表達(dá)的硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白；第二步純化制得硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白離心收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，離心收集上清，進(jìn)行His.Tag親和層析，收集硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白組分，用截留分子量為5KD的Millipore Amicon Ultra-15超濾管將蛋白濃縮至2mg/mL；
8.基因工程菌在制備重組人谷氨酸脫羧酶65中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的基因工程菌在制備重組人谷氨酸脫羧酶65中的應(yīng)用，其特征在于將硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白用腸激酶酶解硫氧還蛋白-人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白，25℃下酶解過(guò)夜，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行His.Tag親和層析，收集穿透峰，冷凍干燥，得到重組人谷氨酸脫羧酶65。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程菌，以及該基因工程菌的制備方法及其用途，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該基因工程菌由重組質(zhì)粒和宿主菌構(gòu)成，其中宿主菌指的是大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)或Rosetta－gami(DE3)中的任意一種，重組質(zhì)粒指的是含GAD65基因的質(zhì)粒pET32a(+)。該基因工程菌的構(gòu)建方法包括設(shè)計(jì)Nest－PCR上游和下游引物，用PCR從人胰腺cDNA庫(kù)中擴(kuò)增人GAD65基因片斷，并通過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌獲得高效表達(dá)重組人GAD65的基因工程菌。本發(fā)明提供的基因工程菌的用途為用于生產(chǎn)可溶的具有活性的硫氧還蛋白－人谷氨酸脫羧酶65融合蛋白，以及具有活性的重組人GAD65。具有表達(dá)量高、成本低，表達(dá)獲得的重組人谷氨酸脫羧酶融合蛋白直接就有酶學(xué)活性和免疫學(xué)活性，純化步驟簡(jiǎn)便，易于操作，得率高等顯著效果。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101054569SQ200610027929
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2006年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日
發(fā)明者馬明浩, 吳自榮, 黃靜, 胡榮章, 葉海峰, 金麗 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)