專利名稱：一種磁性分選材料及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬磁性材料領(lǐng)域，更具體地，是涉及應用于生物樣品分離的磁性材料。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，磁性分離技術(shù)在生物樣品的分離中得到了廣泛的應用，其原理為在磁珠(粒徑＜5μm)的表面修飾上能識別、結(jié)合細胞、亞細胞物質(zhì)、細菌、病毒、核酸或蛋白等生物樣品的生物分子，構(gòu)成磁珠-生物分子復合物。用該復合物去捕獲目的生物樣品，再在外磁場作用下進行阻留從而實現(xiàn)分離。由于普通的永磁體磁場所產(chǎn)生的磁感應強度偏低，很難實現(xiàn)對目標分離物進行快速、高效的分選。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種磁性分選材料及其制備方法和應用，以克服現(xiàn)有技術(shù)中僅以普通的永磁體進行磁性分選，其磁場所產(chǎn)生的磁感應強度偏低，很難實現(xiàn)對目標分離物進行快速、高效的分選的不足。
技術(shù)方案本發(fā)明的構(gòu)思是選擇高磁導率、低矯頑力、低剩磁的材料作為磁分選的材料，并通過一定的工藝將其制備成形狀規(guī)則、尺寸統(tǒng)一的小球，將小球置于外磁場中，在小球表面的周圍便會產(chǎn)生高度不均勻的磁場，即高梯度磁場。因此當標記有超順磁性、鐵磁性或亞鐵磁性顆粒的生物樣品通過小球周圍時，便會被高效地阻留。
在此發(fā)明構(gòu)思之下，本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種磁性分選材料，其組分和重量百分比含量為鐵99.0-99.8％，碳0-0.04％，余量為雜質(zhì)；且其制成品矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導率μmax＝4000～9000。
上述的磁性分選材料，所說的組分和重量百分比含量優(yōu)選為含鐵量99.8％、含碳量0.01％，其余0.01％的質(zhì)量為雜質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種用于磁性分選的小球，其結(jié)構(gòu)和組成為(1)權(quán)利要求1所述的磁性分選材料組成的球體，直徑為0.01～1mm；(2)生物惰性高分子材料構(gòu)成的球體表面涂敷層，厚度為0.001～500μm；其中，所說的小球的矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導率μmax＝4000～9000。
上述的用于磁性分選的小球的一種優(yōu)選方案為，所說的生物惰性高分子材料選自聚氯化對二甲苯、聚二氯對二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡膠之中的一種或一種以上。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供上述的用于磁性分選的小球的制備方法，包括如下步驟(1)提供的熔化狀態(tài)的權(quán)利要求1所說的磁性分選材料；(2)以噴濺、離心或高空跌落的方法處理上述熔化材料；(3)利用液相的表面張力凝固成球狀微粒；(4)利用生物惰性高分子材料對小球進行表面涂敷，使其具有生物相容性。
上述的用于磁性分選的小球的制備方法的一種優(yōu)選方案為，所說的生物惰性高分子材料選自聚氯化對二甲苯、聚二氯對二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡膠之中的一種或一種以上。
上述的用于磁性分選的小球的制備方法的另一種優(yōu)選方案為，所說的制備方法還包括如下步驟(1)對凝固成形的小球進行粒徑篩選、密度篩選和圓度篩選；(2)利用退火反應消除小球的應力以提高磁導率后，再進行表面涂覆。
上述的用于磁性分選的小球的制備方法的再一種優(yōu)選方案為，所說的粒徑篩選的目標微粒直徑為0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm。
上述的用于磁性分選的小球的制備方法的又一種優(yōu)選方案為，所說的退火反應步驟為隨爐升溫400-900℃、控速升溫700-1000℃、保溫1-5小時、控速降溫400-900℃。
本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種所說的磁性分選材料的應用，即以磁性分選材料制成磁性分選小球，與標記有生物分子的磁性粒子組成磁性分選系統(tǒng)，其中，所說的生物分子為來自于動物、植物或微生物的細胞、核酸、蛋白質(zhì)或多糖。優(yōu)選方案為，所說的生物分子為核酸或抗體。
有益效果(1)發(fā)明使用的小球是以高磁導率、低矯頑力、低剩磁的新型的磁性材料作為主要成分，小球表面涂敷了一層生物惰性材料，是一種新材料的新應用。
(2)本發(fā)明采用特殊的制備工藝，制成的小球形狀規(guī)則、尺寸統(tǒng)一，一方面可以保證磁性分離小球結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，另一方面也可以有效地保護分離的樣品不被破壞。
(3)以粒徑較小0.01～0.1mm或0.1～0.2mm的鐵球作為分選微粒，可以產(chǎn)生梯度較大的磁場，適應于分離磁響應較弱的被磁性標記的生物樣品。
(4)本發(fā)明在制備小球過程中的粒徑篩選、密度篩選、圓度篩選和表面涂覆都采用了特別設(shè)計的工藝過程，對小球最后的分離性質(zhì)起到了決定性的作用。
(5)經(jīng)過退火處理的小球，其晶粒細化，組織均勻、硬度低，具有低矯頑力(Hc＝30～150A/m)和較高的最大磁導率(μmax＝4000～9000)，符合分離的要求。
(6)置于外磁場中，在小球表面的周圍便會產(chǎn)生高度不均勻的磁場，即高梯度磁場。利用該高梯度磁場可以對標記有超順磁性、鐵磁性或亞鐵磁性顆粒的生物樣品進行高效地收集，其余雜質(zhì)可簡單地被洗滌沖去，實現(xiàn)了特異的高效分離。
如本文所用，術(shù)語“磁導率”指表征磁介質(zhì)磁化能的物理量，當一個線圈中通過一定的電流時，由于磁介質(zhì)的存在而發(fā)生變化，各處磁感應強度都將較磁介質(zhì)不存在時的磁場強度增強幾倍或減弱到幾分之一(假定磁介質(zhì)是均勻的，而且充滿磁場所占的整個空間)。各種材料對磁場磁感應強度的影響即是用磁導率來量度物質(zhì)中某點的磁感應強度B與該點磁場強度之比(MKS單位制)為該物質(zhì)此時的磁導率μ。鐵磁質(zhì)磁導率很大，且隨外磁場強度變化。順磁質(zhì)和抗磁質(zhì)磁導率都很小，且不隨著外磁場變化。
如本文所用，術(shù)語“矯頑力”指鐵磁材料在反復磁化過程中，磁通密度B的變化始終落后于磁場強度H的變化，對應于外磁場增大與減小時相同的H值，會有不同的B值，這種不可逆現(xiàn)象稱為磁滯現(xiàn)象。當外加磁場強度H下降至零時，B值并不回到零而為稱為剩余磁感應強度，簡稱剩磁。為使B值回到零，必須加一個反向磁場強度Hc，Hc稱為矯頑磁場強度，俗稱矯頑力。矯頑力不僅與鐵磁質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，還依賴于鐵磁質(zhì)原先的磁化強度。矯頑力高低不同是軟磁材料和硬磁材料的重要區(qū)別之一，在制造變壓器鐵芯或電磁鐵時，需要選擇矯頑力較小的材料(如軟鐵，硅鋼)，制造永磁體時，需要選擇矯頑力大的材料(如鋁鎳鈷等)，以求盡可能保存磁性。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如化工產(chǎn)品手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上?；瘜W試劑廠。其他來源K562白血病細胞(上海細胞庫)、CD34單克隆抗體(美國CALTAG公司)和磁性納米粒子(來源為上海師范大學沈鶴柏，文獻沈鶴柏，汪友寶，楊海峰，等。DNA在磁性納米粒子表面的鍵合及表面增強拉曼光譜研究?？茖W通報，2003，48(21)，2252～2256)，Oligo-dT購自Promega公司。
實施例1
磁性分選小球的制備采用飛濺驟冷法制備。
取軟鐵材料三份，其組分和重量百分比含量分別為鐵99.0％+碳0.04％，鐵99.5％+碳0.001％，以及鐵99.8％+碳0.01％，余量均含極少量鋁、鈉、鋅、鉻、鎳、銅、錳等元素。使該三種材料在1500℃-1800℃高溫下熔化，熔化的軟鐵經(jīng)過3-50米/秒的速度噴濺、高空跌落或離心摔出法，利用液相的表面張力自動收縮成球狀，跌落水中，驟冷凝固成小鐵球。
實施例2粒度篩選實施例1所制備的三種材料的小球的粒徑大部分為0.2～1mm，鐵球粒徑不同，其磁學性質(zhì)也不同。本發(fā)明采用分樣篩進行粒度篩選挑選合適目數(shù)的分樣篩篩選目標粒度分別為0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm的小球。粒徑較大的鐵球0.2～1mm可用于處理大量樣品，適合于分離磁響應較強的被磁性標記的生物樣品。粒徑較小0.01～0.1mm或0.1～0.2mm的鐵球可以產(chǎn)生梯度較大的磁場，適應于分離磁響應較弱的被磁性標記的生物樣品。
密度篩選小球的主要成分是鐵。在小球制備的過程中會出現(xiàn)氧化物含量較多或含有其它雜質(zhì)的小球，需要通過密度篩選來選擇質(zhì)量合格的小球。采用密度篩選器進行密度篩選，原理為利用小球在低阻力直線運動時所受一個持續(xù)恒定的與運動方向垂直的力，因密度有所差別，不同小球運動軌跡不同，通過針對一定運動軌跡的小球進行剔除，從而實現(xiàn)密度篩選。
圓度篩選小球應為形狀規(guī)則的球型，若形狀不規(guī)則，會破壞被分離的生物樣品，因此還需對小球進行圓度篩選，剔除形狀不規(guī)則的鐵球。采用圓度篩選器進行圓度篩選，原理為利用小球外形規(guī)整度與摩擦力之間的關(guān)系來篩選，球形規(guī)整度越高，小球與接觸面綜合摩擦力越低，待篩選的小球通過含一定高低落差的圓弧形軌道，圓度不規(guī)則的小球摩擦力大，能提供足夠向心力保證其始終在軌道內(nèi)運動，圓度規(guī)則的小球不能提供足夠向心力，被甩出軌道，由此篩選出圓度規(guī)則的小球。
實施例3
提高磁導率由驟冷產(chǎn)生的應力，使小球的磁學性質(zhì)不能滿足分選用料的要求。需要通過合適的退火工序，來消除應力，從而提高小鐵球的磁導率，降低其矯頑力。隨爐升溫至400-900℃、控制升溫至700-1000℃、保溫1-5小時，控速降溫至400-900℃，優(yōu)選隨爐升溫至800℃、控制升溫至900℃、保溫4小時，控速降溫至500℃。為了避免小球的氧化，小球的退火，在真空爐或氫氣氛圍中進行。經(jīng)過退火處理的小球，其晶粒細化，組織均勻、硬度低，具有低矯頑力(Hc＝30～150A/m)和較高的最大磁導率(μmax＝4000～9000)，符合分離用料的基本要求。其中，鐵99.8％+碳0.01％，余量為雜質(zhì)的材料性能最適合于磁性分離應用。
實施例4表面涂敷小球在潮濕空氣中容易氧化，并且易被腐蝕。因此不宜直接應用于生物樣品的分離，需要對其表面進行生物相容性的改性處理。本發(fā)明采用的辦法是在其表面均勻涂敷一層生物相容性的材料。選用的材料為聚氯化對二甲苯或聚二氯對二甲苯等高分子或天然高分子。
制備二甲苯聚合物的反應可分成兩步即二聚體熱解成活性中間體對二亞甲基苯(p-xylylene)和活性中間體的氣相沉積聚合。
1、工業(yè)上二甲苯聚合物的單體是對二亞甲基苯的環(huán)狀二聚體或其取代衍生物。二聚體最直接的合成方法是用二甲苯作原料，使其與水蒸氣于常壓下熱解(950℃)然后把熱解氣體驟冷到二甲苯溶劑中，即得到二聚體；在對二亞甲基苯二聚體苯環(huán)上的氫經(jīng)氯取代即可得氯代對二亞甲基苯二聚體。
2、二甲苯聚合物的制備包含兩個過程，即二聚體的熱解(680℃)和熱解中間體的氣相沉積聚合(常溫)。二聚體氣化后進入熱解區(qū)，其亞甲基—亞甲基鍵受熱斷裂形成二分子活性中間體(對二亞甲基苯)。該活性中間體在氣相時穩(wěn)定，但一旦在沉積室凝結(jié)就迅速聚合成高分子量固態(tài)膜。
以氯代二甲基苯聚合物涂覆物件時，被涂物件置于沉積室，并不斷旋轉(zhuǎn)以使聚合物膜在物件表面均勻分布。物件涂覆過程類似于金屬蒸鍍，擔不同的是金屬蒸鍍只能是視線式，而二甲苯聚合物則是彌散式，各個方位共性涂覆，這樣就使得任何復雜表面都可以均勻的涂覆上聚合物膜。聚合物膜厚度可以通過調(diào)節(jié)二聚體蒸發(fā)量來控制。此外，因沉積室溫度是常溫，從而可以使被涂覆物件免受熱破壞危險。沉積室尺寸可根據(jù)被涂物件大小而改變。
該涂覆層完全無針孔，涂層超薄，厚度為0.001～500μm，厚度均一。涂敷層具有極低的水汽透過率(對于去離子水的溶脹為零)和耐溶劑性，可抵抗強酸、強堿及各種溶劑侵蝕，對氧氣、氯氣、氮氣和二氧化碳等也具有較好的阻隔性，可有效抑制霉菌、細菌在表面繁殖生長。
實施例5從人臍帶血樣品中分離純化出CD34+細胞(即造血干細胞)本發(fā)明采用磁性納米粒子直接與CD34單克隆抗體連接，構(gòu)成磁性納米粒子—抗體復合物，將該復合物加入到需要分離的樣品中，由于CD34+細胞表面表達CD34抗原，抗原抗體之間有特異性反應，磁性納米粒子復合物便可以與目的細胞進行特異性結(jié)合，再將實施例4所制備的磁性分選小球加入待分離樣品內(nèi)，常規(guī)方法外加一磁場，利用小球產(chǎn)生的高強度、高梯度磁場吸引磁性納米粒子-CD34抗體-CD34+細胞復合物。經(jīng)PBS緩沖液(磷酸緩沖液)多次洗滌后，未經(jīng)磁標記的其他物質(zhì)被洗滌沖去，然后撤去外磁場，再用PBS緩沖液將CD34+細胞洗脫出來，免疫分析和顯微鏡檢測結(jié)果顯示分離效果良好，從而實現(xiàn)了CD34+細胞的分離、純化。
實施例6從K562白血病細胞中提取mRNA(信使RNA)取k562并加入細胞裂解液將其裂解，然后采用磁性納米粒子與Oligo-dT(連續(xù)T堿基的寡聚核苷酸)相連接，構(gòu)成磁性納米粒子-Oligo-dT復合物，將該復合物加入已裂解的k562細胞液中，利用Oligo-dT和mRNA之間的堿基互補原則將mRNA磁性標記，標記完畢后細胞液中加入實施例4所制備的磁性分選小球，并以常規(guī)方法外加一磁場，被標記的mRNA被細胞液內(nèi)的磁性分選小球的內(nèi)磁場高效阻留，其余物質(zhì)沖洗流出，再將阻留物清洗后撤去外磁場，然后依靠推塞提供的壓力用雙蒸水將納米粒子-mRNA洗脫出來。RT-PCR檢測mRNA分離效果良好，從而實現(xiàn)了mRNA的一步法提取、分離和純化。
權(quán)利要求
1.一種磁性分選材料，其組分和重量百分比含量為鐵99.0-99.8％，碳0-0.04％，余量為雜質(zhì)；且其制成品矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導率μmax＝4000～9000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性分選材料，其特征在于，所說的組分和重量百分比含量為鐵99.8％、碳0.01％，余量為雜質(zhì)。
3.一種用于磁性分選的小球，其結(jié)構(gòu)和組成為(1)由權(quán)利要求1所述的磁性分選材料組成的球體，直徑為0.01～1mm；(2)生物惰性高分子材料構(gòu)成的球體表面涂敷層，厚度為0.001～500μm；其中，所說的小球的矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導率μmax＝4000～9000。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于磁性分選的小球，其特征在于，所說的生物惰性高分子材料選自聚氯化對二甲苯、聚二氯對二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡膠之中的一種或一種以上。
5.權(quán)利要求3所述的用于磁性分選的小球的制備方法，包括如下步驟(1)提供的熔化狀態(tài)的權(quán)利要求1所說的磁性分選材料；(2)以噴濺、離心或高空跌落的方法處理上述熔化材料；(3)利用液相的表面張力凝固成球狀微粒；(4)利用生物惰性高分子材料對小球進行表面涂敷，使其具有生物相容性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于磁性分選的小球的制備方法，其特征在于，所說的生物惰性高分子材料選自聚氯化對二甲苯、聚二氯對二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡膠之中的一種或一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于磁性分選的小球的制備方法，其特征在于，所說的制備方法還包括如下步驟(1)對凝固成形的小球進行粒徑篩選、密度篩選和圓度篩選；(2)利用退火反應消除小球的應力以提高磁導率后，再進行表面涂覆。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于磁性分選的小球的制備方法，其特征在于，所說的粒徑篩選的目標微粒直徑分別為0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于磁性分選的小球的制備方法，其特征在于，所說的退火反應步驟為隨爐升溫400-900℃、控速升溫700-1000℃、保溫1-5小時、控速降溫400-900℃。
10.權(quán)利要求1所說的磁性分選材料的應用，即以磁性分選材料制成磁性分選小球，與標記有生物分子的磁性粒子組成磁性分選系統(tǒng)，其中，所說的生物分子為來自于動物、植物或微生物的細胞、核酸、蛋白質(zhì)或多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種磁性分選材料及其制備方法和應用。該材料其組分和重量百分比含量為鐵99.0－99.8％，碳0－0.04％，余量為雜質(zhì)；且其制成品矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導率μmax＝4000～9000。本發(fā)明還提供將該磁性材料加工成形狀均一小球的方法，小球具有高磁導率、低矯頑力、低剩磁的磁學特征。本發(fā)明還涉及以磁性分選材料制成磁性分選小球，與標記有生物分子的磁性粒子組成磁性分選系統(tǒng)的應用，可以簡單、有效、方便、快捷地分離各種細胞、亞細胞物質(zhì)、細菌、病毒、核酸或蛋白質(zhì)等生物樣品。
文檔編號C12N13/00GK1889203SQ20061002844
公開日2007年1月3日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者沈鶴柏, 周海清, 蘭天, 張詩淵 申請人:上海師范大學