專利名稱：一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物乳桿菌，特別是一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法。
背景技術(shù)：
乳酸菌是人體腸道中最重要的益生菌，其數(shù)量和組成對(duì)維持健康腸道環(huán)境和提高免疫功能起著關(guān)鍵作用。其主要作用在于可抑制有害菌群、維持腸道菌群平衡、保護(hù)腸粘膜屏障、代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，降低腸道pH，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，腹瀉便秘雙重調(diào)節(jié)。
乳酸菌在生產(chǎn)、保存及被服用過(guò)程中，都會(huì)面臨各種環(huán)境壓力，包括溫度、酸、滲透壓、氧、高壓及饑餓等惡劣條件的影響。這些因素都會(huì)影響菌的存活，從而影響其生理活性。雖然乳酸菌自身具有較強(qiáng)的耐酸性，大多數(shù)能在pH3的條件下生長(zhǎng)，但在pH3以下的條件下就表現(xiàn)出敏感性，而且隨著酸度的進(jìn)一步增加，死亡率會(huì)急劇上升。因此提高乳酸菌對(duì)環(huán)境酸壓力的耐受能力具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌耐酸能力的提高方法主要集中在耐酸菌株的篩選上。江川等采用模擬人體胃酸環(huán)境(pH＝3)方法從104株人胃腸道源乳桿菌中篩選得到3株具有較強(qiáng)耐酸性能菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法，它將為乳酸菌耐酸性提高提供一個(gè)具現(xiàn)實(shí)意義的方法，從而提高產(chǎn)品品質(zhì)，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架壽命。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于該植物乳桿菌為植物乳桿菌LP-Onlly，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加弱酸或弱酸鹽以提高植物乳桿菌細(xì)胞耐酸性。
該植物乳桿菌已于2004年12月6日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC(地址中國(guó)北京市海淀區(qū)中關(guān)村一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)保藏，并收到保藏登記號(hào)CGMCC NO 1258。其分類命名為植物乳桿菌，拉丁名Lactobacillusplantarum。植物乳桿菌LP-Onlly，其16S rRNA基因GeneBank(NCBI)序列登錄號(hào)為AY590777。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20～80mmol/L乙酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入50mmol/L乙酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10～20mmol/L丙酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10mmol/L丙酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10～20mmol/L正丁酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20mmol/L正丁酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20～80mmol/L乙酸鉀。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入50mmol/L乙酸鉀。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2mmol/L檸檬酸鉀或3mmol/L三聚磷酸鉀。


圖1是本發(fā)明方法中乙酸對(duì)植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖2是本發(fā)明方法中丙酸對(duì)植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖3是本發(fā)明方法中正丁酸對(duì)植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖4是本發(fā)明方法中乙酸鉀對(duì)植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖5是本發(fā)明方法中檸檬酸鉀對(duì)植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖6是本發(fā)明方法中三聚磷酸鉀對(duì)植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法，主要技術(shù)方案就是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加弱酸或弱酸鹽以提高植物乳桿菌細(xì)胞耐酸性。具體情況詳敘如下1.菌種植物乳桿菌LP-Onlly(Lactobacillus plantarum LP-Onlly)，為上海交大昂立股份有限公司研究院從健康嬰兒糞便中分離、鑒定并保存。
2.培養(yǎng)基包括斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基。
3.培養(yǎng)方法一級(jí)種子培養(yǎng)從斜面培養(yǎng)基上挑二環(huán)菌至種子培養(yǎng)液中，50ml三角瓶裝液30ml，37℃培養(yǎng)16h。二級(jí)種子培養(yǎng)將一級(jí)種子液以萬(wàn)分之一的接種量接入種子培養(yǎng)液中，50ml三角瓶裝液30ml，37℃培養(yǎng)16h。發(fā)酵培養(yǎng)將二級(jí)種子液以萬(wàn)分之一的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，50ml三角瓶裝液30ml，37℃培養(yǎng)16h。
4.分析方法
(1)耐酸性能評(píng)價(jià)方法將發(fā)酵細(xì)胞以生理鹽水洗滌兩次后于pH2、37℃下90min，測(cè)細(xì)胞殘存率。
(2)活菌計(jì)數(shù)方法參見(jiàn)GB/T 4789.35-2003(乳酸菌飲料中的乳酸菌檢驗(yàn))。
實(shí)施例1在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入乙酸。
如圖1所示乙酸濃度(10mmol/L)對(duì)細(xì)胞耐酸性能較對(duì)照沒(méi)有提高；而乙酸濃度從10mmol/L增加到50mmol/L時(shí)，細(xì)胞耐酸性較對(duì)照就有了非常大的提高，在pH2、37℃下90min細(xì)胞殘存率約提高200倍；進(jìn)一步增加乙酸濃度(從50mmol/L增加到80mmol/L)細(xì)胞耐酸性明顯降低，但較對(duì)照也有較大提高。
實(shí)施例2在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入丙酸。
如圖2所示10mmol/L的丙酸濃度可使細(xì)胞耐酸性能得到較大提高，在pH2、37℃下90min細(xì)胞殘存率較對(duì)照約提高90倍；丙酸濃度從10mmol/L增加到20mmol/L時(shí)，細(xì)胞耐酸性基本一致；進(jìn)一步增加丙酸濃度(從20mmol/L增加到50mmol/L)細(xì)胞耐酸性急劇降低，此時(shí)，與對(duì)照相當(dāng)。
實(shí)施例3在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入正丁酸。
如圖3所示10mmol/L的正丁酸濃度使細(xì)胞耐酸性能得到較大提高，在pH2、37℃下90min，細(xì)胞殘存率較對(duì)照約提高120倍；進(jìn)一步增加正丁酸濃度(從10mmol/L增加到20mmol/L)，細(xì)胞耐酸性進(jìn)一步提高，在pH2、37℃下90min，細(xì)胞殘存率較對(duì)照約提高200倍；再增加正丁酸濃度(從20mmol/L增加到50mmol/L)，細(xì)胞耐酸性急劇降低，此時(shí)，與對(duì)照相當(dāng)。
實(shí)施例4在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入乙酸鉀。
如圖4所示乙酸鉀濃度(10mmol/L)對(duì)細(xì)胞耐酸性能較對(duì)照沒(méi)有提高；而乙酸濃度從10mmol/L增加到50mmol/L時(shí)，細(xì)胞耐酸性較對(duì)照有非常大的提高，在pH2、37℃下90min細(xì)胞殘存率約提高200倍；進(jìn)一步增加乙酸濃度(從50mmol/L增加到80mmol/L)細(xì)胞耐酸性明顯降低，但較對(duì)照也有較大提高。
實(shí)施例5在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入檸檬酸鉀。
如圖5所示2mmol/L的檸檬酸鉀濃度可使細(xì)胞耐酸性能得到較大提高，在pH2、37℃下90min細(xì)胞殘存率較對(duì)照約提高100倍；檸檬酸鉀濃度從2mmol/L增加到5mmol/L時(shí)，細(xì)胞耐酸性急劇降低；進(jìn)一步增加檸檬酸鉀濃度(從5mmol/L增加到10mmol/L)，細(xì)胞耐酸性基本一致，但較對(duì)照略有提高。
實(shí)施例6在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入三聚磷酸鉀。
如圖6所示1mmol/L的三聚磷酸鉀濃度對(duì)細(xì)胞耐酸性能較對(duì)照沒(méi)有提高；而三聚磷酸鉀濃度從1mmol/L增加到3mmol/L時(shí)，細(xì)胞耐酸性較對(duì)照有些提高，在pH2、37℃下90min細(xì)胞殘存率約提高5倍；三聚磷酸鉀濃度從3mmol/L增加到5mmol/L時(shí)，細(xì)胞耐酸性降低，此時(shí)，與對(duì)照相當(dāng)。
本發(fā)明方法的作用原理是乳酸菌耐酸是因?yàn)槠渥陨砜删S持細(xì)胞內(nèi)外的pH梯度，使細(xì)胞內(nèi)的pH不至于太低，但當(dāng)內(nèi)部的pH下降到超過(guò)一定的閾值，細(xì)胞功能將被抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
眾所周知，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，60個(gè)以上與細(xì)胞穩(wěn)定性密切相關(guān)的基因在RpoS基因編碼產(chǎn)生σs蛋白控制下誘導(dǎo)啟動(dòng)，因此，穩(wěn)定期細(xì)胞耐熱和耐酸等性能主要取決于σs濃度，而σs濃度可通過(guò)提高RpoS轉(zhuǎn)錄水平或rpos mRNA翻譯水平或防止σs蛋白水解等手段來(lái)提高。研究表明，cAMP-CRP、UDP-glucose、EIIA、多磷酸鹽(polyphosphate)、ppGpp、HSL、電離度為4.8～4.9的弱酸鹽(如醋酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽等)、谷氨酸鈉、海藻糖及胞內(nèi)NADH向NAD的轉(zhuǎn)化率均可提高RpoS的轉(zhuǎn)錄水平；而細(xì)胞向高滲或酸性pH轉(zhuǎn)換、低溫、生長(zhǎng)達(dá)到一定細(xì)胞密度、一些蛋白如Hfq、HU、DksA、RprA等均可促進(jìn)rpos mRNA翻譯；突然的碳饑餓、滲透壓提高、酸性pH轉(zhuǎn)換、熱沖擊(如從30℃升至42℃ 20min)產(chǎn)生的熱激蛋白如DnaK、DnaJ、GrpE均可使σs穩(wěn)定；RssB-CIpXP途徑中的CIpXP蛋白酶負(fù)責(zé)σs水解，而Crl蛋白可促進(jìn)σs和RNA聚合酶的核心酶(E)結(jié)合，使σs避免與RssB結(jié)合被水解，從而提高σs活性。因此，可通過(guò)上述手段提高細(xì)胞內(nèi)σs濃度，從而提高細(xì)胞耐酸性。
本發(fā)明方法通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加弱酸(乙酸、丙酸及正丁酸)或弱酸鹽(乙酸鉀、檸檬酸鉀及三聚磷酸鉀)均可不同程度地提高植物乳桿菌細(xì)胞耐酸性；另外，乙酸和乙酸鹽對(duì)植物乳桿菌耐酸性提高作用基本一致，這表明弱酸鹽對(duì)細(xì)胞耐酸性的影響是通過(guò)其弱酸起作用的，而與其金屬離子沒(méi)有什么關(guān)系。本發(fā)明方法將為乳酸菌耐酸性提高提供一個(gè)具現(xiàn)實(shí)意義的方法，從而提高產(chǎn)品品質(zhì)，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架壽命。
權(quán)利要求
1.一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于該植物乳桿菌為植物乳桿菌LP-Onlly，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加弱酸或弱酸鹽以提高植物乳桿菌細(xì)胞的耐酸性能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20～80mmol/L乙酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入50mmol/L乙酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10～20mmol/L丙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10mmol/L丙酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10～20mmol/L正丁酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20mmol/L正丁酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20～80mmol/L乙酸鉀。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入50mmol/L乙酸鉀。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2mmol/L檸檬酸鉀或3mmol/L三聚磷酸鉀。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物乳桿菌，特別是一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法。該方法中的植物乳桿菌為植物乳桿菌LP－Onlly，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加弱酸或弱酸鹽以提高植物乳桿菌細(xì)胞耐酸性。本發(fā)明將為乳酸菌耐酸性能提高提供一個(gè)具現(xiàn)實(shí)意義的方法，從而提高產(chǎn)品品質(zhì)，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架壽命。
文檔編號(hào)C12N1/36GK1935981SQ200610028708
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月7日
發(fā)明者蘭先德, 范小兵, 張和春, 杭曉敏, 潘玉輝, 楊國(guó), 倪新華, 王勁松 申請(qǐng)人:上海交大昂立股份有限公司