專利名稱：鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3、其編碼蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的核酸和氨基酸序列及該基因的克隆方法。
背景技術(shù)：
鹽藻，又叫杜氏鹽藻(Dunaliella viridis)，它是一種無細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核綠藻，是已知的最耐鹽的真核生物。同時，它對光照、環(huán)境pH、溫度等變化造成的脅迫也能夠很好的耐受。因而被廣泛的用來研究植物對各種脅迫的反應(yīng)機制，特別是耐鹽脅迫的機制。
碳酸酐酶(CAcarbonic anhydrase)催化的是的可逆反應(yīng)。因為CO2和HCO3-之間的自然轉(zhuǎn)化是非常慢的，不足以滿足細(xì)胞代謝的需要，所以在生物代謝中，CA是必須的。鹽藻直接可以利用的碳源主要是CO2，在高鹽條件下，CO2的溶解度降低，這時細(xì)胞表面的碳酸酐酶可以將HCO3-轉(zhuǎn)換為CO2供細(xì)胞使用。碳酸酐酶對于鹽藻在脅迫條件下維持正常的生理活動是非常重要的，一般情況下它們都是受鹽誘導(dǎo)的，協(xié)助細(xì)胞抵抗高滲脅迫的耐鹽基因。對這一家族的研究有助于揭示鹽藻耐鹽的機理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供鹽藻碳酸酐酶3基因(DvCA3)具有SEQ NO 1所示的全長基因序列。
本發(fā)明的目的之二在于提供鹽藻碳酸酐酶3基因(DvCA3)具有SEQ NO 2所示的全長氨基酸序列。
本發(fā)明的目的之三在于提供鹽藻碳酸酐酶3基因(DvCA3)的克隆方法。
其特征在于該方法的具體步驟為a.以DCA3(+)-2、DCA3(-)-2為引物，采用PCR方法從鹽藻的BAC文庫中篩選出一個不同于已知碳酸酐酶的鹽藻基因組BAC克隆，該BAC克隆的大小為60kb；
b.將上述BAC克隆隨機打斷為2～4kb的小片段，裝入測序載體，構(gòu)建該BAC克隆的鳥槍文庫；c.大通量提取鳥槍文庫的質(zhì)粒DNA，在MegaBACE 4500上進行序列的測定；每個鳥槍質(zhì)粒利用M13正反向引物，進行雙向測序；d.在RedHat Linux平臺的并聯(lián)計算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列，構(gòu)建亞克隆并測序以填補出現(xiàn)在序列之中的缺口，最終得到鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的全長序列。
上述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于所述的篩選BAC克隆的PCR方法的程序為94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min；引物序列DCA3(+)-2ACG GTT GTT GGT GAT GGC AGDCA3(-)-2TTG AAC AAC TGC GCT GGG GA。
本發(fā)明將一個大小約為60kb的BAC質(zhì)粒構(gòu)建成鳥槍文庫，通過對文庫的測序和序列的拼接，得到了BAC質(zhì)粒所包含的鹽藻基因組全序列。利用www.softberry.com的基因預(yù)測程序(FGENSH，選用Chlamydomonas預(yù)測模式)，預(yù)測DvCA3的核酸和氨基酸序列。NCBI中的Blastn結(jié)果顯示，DvCA3是鹽藻碳酸酐酶家族的一個成員，該基因家族的功能主要是吸收環(huán)境中的CO2供細(xì)胞使用，在高鹽等逆境條件下，環(huán)境中的CO2含量降低，碳酸酐酶的大量表達，有助提高細(xì)胞利用CO2的能力，從而增強了細(xì)胞抗逆的能力。
利用RT-PCR的方法證明，本發(fā)明得到的DvCA3是一個表達的基因，并且受鹽的誘導(dǎo)高表達。相同情況下，環(huán)境鹽濃度越高，則DvCA3的表達豐度越高。所以該基因在鹽藻抗脅迫生理過程中具有重要的功能。


圖1為鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3在NCBI中的Blastn結(jié)果。圖中匹配到的三條序列都是鹽藻的碳酸酐酶(Dunaliella salina carbonic anhydrase)，它們在GenBank中的序列號及比對Score值如下所示
gi|29569134|gb|AY232669.1|Score954gi|23321337|gb|AF541983.1|Score870gi|6435824|gb|AF190735.2|AF190735 Score178圖2為鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的RT-PCR結(jié)果。
M100bp的maker1以低鹽濃度下的鹽藻RT產(chǎn)物為模板2以中等鹽濃度下的鹽藻RT產(chǎn)物為模板3以高鹽濃度下的鹽藻RT產(chǎn)物為模板4陰性對照，以水為模板上圖以DCA3(+)-2和DCA3(-)-2為引物，進行PCR反應(yīng)，目的PCR產(chǎn)物750bp。
下圖以Actin(+)和Actin(-)為引物，進行PCR反應(yīng)，目的PCR產(chǎn)物412bp。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆(Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd ed.)或植物分子生物學(xué)-實驗手冊(Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual，Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例一鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法1.鹽藻BAC文庫的篩選使用碳酸酐酶基因的特異性引物DCA3(+)-2、DCA3(-)-2，以PCR的方法從鹽藻的BAC文庫中篩選含有目的基因碳酸酐酶基因的BAC克隆。
引物序列DCA3(+)-2 ACG GTT GTT GGT GAT GGC AGDCA3(-)-2 TTG AAC AAC TGC GCT GGG GAPCR 程序94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min經(jīng)過多輪PCR反應(yīng)從鹽藻的BAC文庫中篩選得到一個插入片段約為60k的BAC克隆。
2.鳥槍文庫的構(gòu)建、測序及拼接將該BAC克隆的插入片段隨機打斷為2～4kb的小片段，裝入測序載體，構(gòu)建了該BAC克隆的鳥槍文庫。大通量提取鳥槍文庫的質(zhì)粒DNA，在MegaBACE 4500上進行序列的測定。每個鳥槍質(zhì)粒利用M13正反向引物，進行雙向測序。以該BAC克隆插入片段大小為60kb計算，以每個測序反應(yīng)得到可用序列為500bp，得到可用序列的成功率以75％來計算，按10倍覆蓋的要求，共測序768個鳥槍文庫質(zhì)粒，即8塊96孔板。
在RedHat Linux平臺的并聯(lián)計算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列。構(gòu)建亞克隆并測序以填補出現(xiàn)在序列之中的缺口。
通過以上工作，我們得到了一段約60k的鹽藻基因組序列。該序列包含了用來篩選的引物序列(DCA3(+)-2和DCA3(-)-2)。
實施例二DvCA3的Blastn比對利用www.softberry.com上的基因預(yù)測程序FGENESH(Chlamydomonas模式)對長度約60kb的鹽藻基因組序列進行預(yù)測，預(yù)測得到了9個基因，其中一個預(yù)測的基因包含了篩選的引物序列DCA3(+)-2和DCA3(-)-2，即從預(yù)測結(jié)果中獲得了碳酸酐酶3基因與其編碼的氨基酸序列。
在NCBI的核酸庫中，對預(yù)測的鹽藻碳酸酐酶3基因(DvCA3)進行Blastn比對，結(jié)果參見圖1。根據(jù)比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與DvCA3同源性最高的是3種鹽藻的碳酸酐酶序列。據(jù)此，我們推斷克隆得到的DvCA3基因是一個新的鹽藻碳酸酐酶基因。
實施例三RT-PCR驗證DvCA3在鹽藻中的表達情況以低鹽濃度、中等鹽濃度和高鹽濃度下的鹽藻RT產(chǎn)物為模板進行PCR，鑒定DvCA3在鹽藻中的表達情況。參見圖2。PCR程序如下94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min常量表達基因Actin的表達由于不受環(huán)境中鹽濃度的影響，所以在本實驗中作為內(nèi)參對照，圖2顯示了在低鹽濃度、中等鹽濃度和高鹽濃度下，以Actin(+)和Actin(-)為引物的PCR結(jié)果，3種條件下的PCR產(chǎn)物具有相同的亮度，證明了所使用的RT產(chǎn)物的模板量是相同的。
引物序列Actin(+) TGG CCT TGG ACT TTG AGC A
Actin(-) CAC ATC TGC TGG AAG GTG GA圖2中，上圖和下圖使用相同的模板量進行PCR反應(yīng)。下圖顯示了以Actin(+)和Actin(-)為引物的PCR反應(yīng)得到了大小為412bp的目的產(chǎn)物，條帶的亮度大致相同，說明了用于實驗的三種RT產(chǎn)物的模板量可以視為相同；上圖顯示了相同的模板量下，以DCA3(+)-2和DCA3(-)-2為引物的PCR結(jié)果，結(jié)果顯示，1、2、3泳道都得到了750bp的目的條帶，說明低鹽濃度，中等鹽濃度和高鹽濃度下鹽藻的碳酸酐酶3基因都有表達；條帶的亮度隨鹽濃度的增高而增強，說明了鹽藻的碳酸酐酶3基因在低鹽濃度，中等鹽濃度和高鹽濃度下的表達是逐漸增強的。
結(jié)果顯示，DvCA3是一個表達的基因，并且受鹽的誘導(dǎo)高表達。相同情況下，環(huán)境鹽濃度越高，則DvCA3的表達豐度越高。
序列表<110>上海大學(xué)<120>鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3、其編碼蛋白及其克隆方法<160>2<210>1<211>6125<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>1agcagcgttc tggggtgtgt gtgtgtgtgt accagcaggg ctcctccaca aagagtgcct 60cttgacactg cggtgtgccc atgcgcggcg tgtccatgtc cccatggagc gcaagtgcgc 120gctgcaccac catgcaatgc tgaagcacac ctgcctggtc tgtccagatg agccaccaaa 180taagcgtaag ggccaaagga agggaaggaa ggaaaaaatg gacgcacttg cttcatggcc 240aattggctac atcccctttc cttgctgtcc gtggcgtggc tgcaaccaca cagcctgcag 300gggctaaagt ttaaagttag ggcggtgaag tctattgaat ggatttcctt gcaggtcaca 360aacatccaac cgtcctcctt atccagggta gtagcgctct ttccgcttct ccgctttctc 420ttgtccaatc ggaaaactta ttactttttt cagccacgtc actcattcat ccatccatcg 480gacacagcct cctcgtccca gttttgcgca ccgctatctg aaggtgcgtg tttccctgtt 540
tcccttgctg ctgctgcccc tgctgaacgc catcaggctg gcttgcgggc gagccatgag 600ggctcggttg gacggtggag gacatcgctg tgtgcggtgt ctggggcctg ctggcgtgtc 660ttcccccttt gagcagcacc tgcttgctgc accccacggt ggacctcctg cgagcgctgc 720gctgccccct gtgttgatgt gtcgctcgcg cgatggactg cgggtgctct tgtcgctcgt 780gtccaggagg aggcccagga ggatagggtc ctgttcctcc tgtctactac tcctcctgtc 840tggaacacac cggccaagag gagccttcca tcacacacat catctgcacc cttcacctag 900ctccatcctg ctggggcagg gtatgcacaa gctgttcttg ctgcctgcat ggagactgcc 960acctcatcac agcactgacc ccttacccgc cctgtcccac acccgcccac agatggcgcg1020cctcgcgctg ttaggcgccg cgctactatg cgccctggcg gtctcgacgc aaggtgagct1080cctgcacgct gtgaggggag ggagtgtcct gcttccactt aggcaacatg gaggaggagc1140aggaatcttt ccactcgttg caaacaacat caggaactgc atgtgccagc aggcaggcct1200gtgttgtgtg catgcatggt ttgcgctgcg cgtgcggggt caacagcaga caattgtgcc1260agggcactcg tttccctggc tctgctgtgg ccccatctgc tgcttgctga ctgcgtgcat1320tccttggaca agctgtctga tgtgcatttg tgcacaaagg ctctctgtga tgctgttcag1380gatgaggcgc agtatctgtt tctgtgtgtc atgcctacac acagacggag atgatttacc1440aagccattgt ttgcccttac atgcacctgc actcgcacag gtcaccctgg ctctgatgag1500gcctcaggca gaaagctctt ggactcgcac ttggtaagca tgcttccttt gttcaaagca1560agaaagataa aatggttggt ccacctgtat gctaggccag tctcgttaag tcttcagcac1620tatgtaagtg cacacctcag gttccttgct gaaaaggcat gctggatagc tgattttgct1680ctgcaaaatg gtgttatgag gtcagtatga tgttcaggtt gtgggcagga acttctttcc1740ttttttcacc tgcactgctt ccatgctggg tgggctcttg atacagtgag ctgcactctc1800agtgtttgtc tgtttgtttc ccagaaagaa agacatactg ggaggtgtct tgaatgatga1860aagggtagga cagggttaag gattgccctg cacattgtcc catgtttcag ctgaaattca1920gttttgagca tcccactttt ggtgttctca atgggctcgt cttatcaaaa tttgtgaggc1980aatttggtct gtctgcacct gttcaaagag atgcaaccgg tgtcgatgag gattccagct2040tgcttttaat gcagaatgac agaaaactga ccaggtgcac ctgggcatgc cctcaatgtg2100agctcataca caggtgctcc ctattacaaa gtgtctagtg ctgcttgaat ggggccttat2160gtttgagtgt gagaggagcg gtaaagatcc agcaaaacag ccagaaattc tactgattca2220gttagaagca tcctgttcct cacatattca tcatccattt caccccgttt gttgttttgc2280atacacctgg ttgggcagta tgtgggtggg ctcattttga gggacgcagc atgggtgaaa2340
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146 151 156Asp Met Gln Leu Thr Phe Glu Ser Glu Asn Leu Pro Gly Ala Gln Lys161 166 171 176Pro Gln Ile Arg Ile Pro Lys Ser Ala Asp Ser Leu Lys Thr Phe Thr181 186 191Pro Leu Gln Leu His Phe His His Phe Leu Ser Glu His Thr Val Asn196 201 206Gly Lys His Phe Pro Leu Glu Ala His Leu Val Met Lys Asp Glu Asp211 216 221Ser Asp Gln Leu Ala Val Ile Gly Ile Leu Tyr Glu Tyr Thr Glu Glu226 231 236Glu Thr Gln Asp Asp Pro Phe Ile Asp Arg Leu Gln Asp Leu Ala Lys241 246 251 256Asp Leu Val Ala Asn Gly Ala Ser Trp Gly Asp Asn Gly Val Asp Thr261 266 271Ser Ser Val Arg Pro Asp Phe Gln Ile Asp Val Arg Asp Asp Leu Leu276 281 286Pro Thr Glu Gly Thr Asn Pro Leu Ala His Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser291 296 301Leu Thr Thr Pro Pro Cys Asp Glu Arg Val Lys Trp Phe Val Phe Ala306 311 316Asn Thr Arg Lys Val Ser Pro Ala Gln Met Lys Val Phe Ala Asp Ala321 326 331 336Thr Leu Asn Ala His Pro Ser Ala Ala Ile Thr Asn Asn Arg Val Ile341 346 351Gln Pro Leu Asn Gln Arg Gln Val Tyr Asn Tyr Gly Val Ser Val356 361 36權(quán)利要求
1.鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3，其特征在于該基因具有SEQ NO 1所示的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的編碼蛋白，其特征在于該基因具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.以DCA3(+)-2、DCA3(-)-2為引物，采用PCR方法從鹽藻的BAC文庫中篩選出一個不同于已知碳酸酐酶的鹽藻基因組BAC克隆，該BAC克隆的大小為60kb；b.將上述BAC克隆隨機打斷為2～4kb的小片段，裝入測序載體，構(gòu)建了該BAC克隆的鳥槍文庫；c.大通量提取鳥槍文庫的質(zhì)粒DNA，在MegaBACE 4500上進行序列的測定；每個鳥槍質(zhì)粒利用M13正反向引物，進行雙向測序；d.在RedHat Linux平臺的并聯(lián)計算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列，構(gòu)建亞克隆并測序以填補出現(xiàn)在序列之中的缺口，最終得到鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的全長序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于所述的篩選BAC克隆的PCR方法的程序為94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，30cycles；72℃10min；引物序列DCA3(+)-2 ACG GTT GTT GGT GAT GGC AGDCA3(-)-2 TTG AAC AAC TGC GCT GGG GA。
全文摘要
本發(fā)明公開了鹽藻(Dunaliella viridis)碳酸酐酶3全長基因DvCA3的核酸序列、氨基酸序列、基因的克隆方法以及它在不同的環(huán)境鹽濃度下的表達情況。本發(fā)明所公開的全長基因為鹽藻(Dunaliella viridis)中的首次報道，對DvCA3的表達分析確證了該基因的表達受鹽誘導(dǎo)，并在鹽藻抗脅迫生理過程中具有重要的功能。
文檔編號C12N9/00GK1928091SQ20061002921
公開日2007年3月14日 申請日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者宋任濤, 許政暟, 李杉, 孫曉明, 張文文 申請人:上海大學(xué)