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一種同步擴(kuò)增檢測肝炎及艾滋病毒核酸的方法及試劑盒的制作方法

文檔序號:441360閱讀:425來源:國知局
專利名稱:一種同步擴(kuò)增檢測肝炎及艾滋病毒核酸的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于診斷試劑核酸診斷技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、適合于常規(guī)血液核酸篩查的同步提取和同步實(shí)時(shí)檢測肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)和艾滋病毒核酸的方法和試劑盒。
背景技術(shù)
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),超過一半國家沒有對獻(xiàn)血者獻(xiàn)出的血液進(jìn)行徹底檢驗(yàn),導(dǎo)致艾滋病、肝炎、瘧疾和梅毒等疾病在很多地方泛濫。全球每年增加的560萬名艾滋病毒攜帶者中,有5%至10%的人是經(jīng)由輸血或血液制品而感染的。在非洲兒童和婦女中病毒攜帶者,這一比例高達(dá)20%-25%。20世紀(jì)80年代以來,法國、日本、羅馬尼亞、美國、德國以及我國等都曾因血液篩查欠缺而導(dǎo)致過嚴(yán)重的后果。血液傳染病一旦在一個(gè)地方發(fā)生,往往會造成爆炸性傳播,因此輸血安全對人民的安全和社會的穩(wěn)定有著極其特殊的意義。臨床血液檢測也面臨日益劇增的檢測壓力。據(jù)WHO估計(jì),我國艾滋病感染人數(shù)到2010年將達(dá)到1000萬,并持續(xù)高速增長。我國有60%以上的人曾受到乙肝病毒的感染,最終有1/10左右的人成為乙肝表面抗原陽性。另外,在所有肝炎中慢性化程度最高的丙肝,發(fā)病人數(shù)也達(dá)到4000萬左右。
與血液安全的極端重要性相比,目前的檢測手段還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于社會的需要。目前對輸血安全性構(gòu)成嚴(yán)重威脅的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病(HIV)病毒主要采用酶免疫(EIA)法進(jìn)行檢測。雖然經(jīng)過了幾代的改良,在靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性等方面取得了長足的進(jìn)步,但作為一種間接滯后的檢測方法,它所檢測的是病毒所引發(fā)的人體抗體而不是病毒本身。故它不能夠消除對“窗口期”標(biāo)本的漏檢,所謂“窗口期”即在被感染早期,體內(nèi)還未產(chǎn)生抗體或抗體在檢測限以下,此時(shí)的血清學(xué)檢測一般為陰性。而HBV、HCV、HIV病毒感染產(chǎn)生抗體的窗口期又特別長,其中丙型肝炎病毒(HCV)的窗口期約為66-82天,乙型肝炎病毒(HBV)和人類免疫缺陷綜合癥病毒(即艾滋病)(HIV)的窗口期分別是大約59天和22天。另外,由于病毒的突變等事件的發(fā)生,也造成了部分免疫學(xué)方法檢測漏檢的可能。所以免疫學(xué)診斷方法存在固有的缺陷,不能杜絕漏檢。檢驗(yàn)方法的滯后已給輸血安全和臨床檢驗(yàn)帶來嚴(yán)重威脅。
近年來,核酸技術(shù)的發(fā)展和逐漸成熟為人們直接檢測病毒的存在提供了最有力的工具。核酸擴(kuò)增技術(shù)(Nucleic acid AmplificationTechnology,NAT)就是這一類技術(shù)的統(tǒng)稱。核酸檢測的是病毒基因本身,是在最根本的層面上對病毒的檢測。核酸檢測大大縮短了病毒檢出的窗口期,并具有極高的靈敏度、特異性、精密度和穩(wěn)定性。事實(shí)證明NAT檢測可將HBV,HCV和HIV感染的平均“窗口期”分別縮短25天、59天和11天,分別縮短“窗口期”45%、89%和50%。正因?yàn)槿绱耍絹碓蕉嗟膰艺J(rèn)識到血液核酸檢測的重要性,在西歐等國家作為強(qiáng)制性指標(biāo)在臨床輸血及血制品中執(zhí)行,同時(shí),美國,日本,歐盟已將NAT檢測納入獻(xiàn)血者的常規(guī)篩查項(xiàng)目。
國外已有多個(gè)單項(xiàng)核酸檢測產(chǎn)品投放市場。美國、澳大利亞、加拿大等國家相繼有產(chǎn)品問世。羅氏公司也開發(fā)了核酸診斷試劑盒。但這些試劑盒要么是開放型的PCR-ELISA檢測模式,要么操作繁瑣,易發(fā)生檢測污染,并且都是單個(gè)指標(biāo)單次檢測,這些缺陷使之很難適應(yīng)市場現(xiàn)狀的需要。分析這些核酸診斷試劑的現(xiàn)狀,存在著以下幾個(gè)嚴(yán)重不足1)試劑是開放式的,污染的可能性大;自動化程度低,而自動化和全封閉性是核酸檢測最關(guān)鍵的技術(shù)瓶頸。2)試劑為單項(xiàng)檢測的,沒有一個(gè)血篩試劑可以同步提取、同時(shí)實(shí)時(shí)檢測多種病毒核酸(如HBV,HCV,HIV),如FDA批準(zhǔn)的羅氏血液篩查試劑均為單項(xiàng)操作,使用的擴(kuò)增程序各不相同,檢測過程也不盡相同;FDA批準(zhǔn)的另一家GEN-PROBE公司所使用的TMA技術(shù)可以同時(shí)擴(kuò)增HCV與HIV,但不能同時(shí)擴(kuò)增HBV;另外檢測要么是不同管操作,各測各的;要么是同管操作,但一旦測定結(jié)果為陽性時(shí)卻不能分辨是HCV還是HIV。迄今為止,美國FAD只批準(zhǔn)過上述兩個(gè)產(chǎn)品可用于血液核酸篩查。3)操作繁瑣,重復(fù)性差,通量低,不適于臨床檢驗(yàn)和大規(guī)模的血液篩查。4)兼容性差,大多提供核酸提取試劑的廠家往往不提供擴(kuò)增檢測試劑或者二者不能很好的匹配,需要用戶調(diào)整甚至優(yōu)化;有的能同時(shí)提供匹配的試劑,卻又不一定適用于特定的核酸自動提取儀;即使上述條件得到滿足,用戶還要根據(jù)擴(kuò)增檢測試劑的要求選用指定的儀器如COBAS AMPLICOR等。5)試劑往往不是即用型的,例如使用前需要溶解干粉、在一些瓶瓶罐罐中加入指定量的乙醇或異丙醇等有機(jī)試劑,有的試劑使用前還有復(fù)雜的配制工作,稍有不慎就造成試驗(yàn)的徹底失敗。不同人員的操作還引入試劑準(zhǔn)備這一步驟的操作誤差;并且某些試劑一旦開封后或復(fù)溶后即使低溫保存有效期也只有幾天,尤不適于標(biāo)本量較少情況下的多批次反復(fù)使用。前述的種種狀況嚴(yán)重阻礙了血液核酸篩查在血站以及檢驗(yàn)檢疫等機(jī)構(gòu)的大規(guī)模使用,也不利于核酸檢測在大中型醫(yī)院檢驗(yàn)科室的廣泛應(yīng)用,成為血液篩查和臨床核酸檢驗(yàn)方法發(fā)展的瓶頸之一。
因此,本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)適合于常規(guī)血液核酸篩查的自動化、高通量、多項(xiàng)目的同步核酸提取和實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測技術(shù)平臺及可應(yīng)用于規(guī)?;a(chǎn)的性能穩(wěn)定、可操作性強(qiáng)、即用型試劑的試劑盒,并有相關(guān)的儀器、耗材與之匹配。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能同步提取HBV、HCV、HIV病毒的核酸、同步實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測HIV、HBV、HCV病毒核酸的試劑盒,以克服傳統(tǒng)蛋白檢測固有的缺陷和不足,同時(shí)彌補(bǔ)現(xiàn)有國內(nèi)外同類產(chǎn)品的諸多不足乃至方法學(xué)上無法解決的致命缺陷。
本發(fā)明提出一種能同步提取并同步實(shí)時(shí)測定血清或血漿標(biāo)本中HIV(艾滋病)、HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)病毒核酸是否存在的方法和試劑盒。按照本發(fā)明所述的方法包括以下四項(xiàng)相對獨(dú)立又相互關(guān)聯(lián)的內(nèi)容,并且提供了可選的組合以供完整實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的試劑盒。①本發(fā)明公開了一種基于雜交原理選用磁珠作為自動化介質(zhì),使用磁珠分離儀實(shí)現(xiàn)特異性同步捕獲多種病毒核酸的方法及其改良方法以及試劑,其特征是選用了與后續(xù)擴(kuò)增檢測中一條引物序列相一致的生物素修飾的寡核苷酸作為核酸提取試劑的捕獲探針,其優(yōu)點(diǎn)是既避免了漏檢又不干擾后續(xù)的PCR檢測。②本發(fā)明還公開一種新型RNA外標(biāo)(即陽性對照)和RNA內(nèi)對照(競爭性內(nèi)標(biāo))的快速加端PCR構(gòu)建及純化方法,尚未見于任何文獻(xiàn)報(bào)道或?qū)嵗龖?yīng)用,其特點(diǎn)是快速、高效,優(yōu)點(diǎn)是RNA制品中沒有模板DNA的污染或其污染低到無法檢測,尤其適合作為質(zhì)控全程監(jiān)測核酸提取、RT反應(yīng)、PCR擴(kuò)增檢測的有效性。③本發(fā)明還提出了設(shè)計(jì)綠色環(huán)保型試劑盒的基礎(chǔ)---陽性對照和內(nèi)對照的基因工程構(gòu)建法或PCR構(gòu)建法,使試劑盒內(nèi)的陽性對照和內(nèi)對照均無傳染性。④最后也最為關(guān)鍵的是本發(fā)明公開了一種適合于血液篩查的一步法單管雙酶多項(xiàng)聯(lián)合檢測的TaqMan PCR擴(kuò)增法,該體系含有UNG-dUTP“built-in”的防污染成分,所檢測的項(xiàng)目為HBV DNA、HCV RNA、HIVRNA三個(gè)病毒核酸,既有DNA,又有RNA,并且體系中帶有檢測假陰性發(fā)生與否的內(nèi)對照組份,本項(xiàng)發(fā)明最突出的優(yōu)點(diǎn)在于該檢測試劑的優(yōu)秀的靈敏度和特異性及各亞型的覆蓋率,并且不同亞型擴(kuò)增效率近似等效,使其能滿足血液核酸篩查極其苛刻的要求;其顯著的特點(diǎn)是使用廉價(jià)的雙酶(即含逆轉(zhuǎn)錄酶和耐熱DNA聚合酶)體系,區(qū)別于與Roche公司的r Tth或ZO5酶等單酶體系。顯而易見的,擯棄單酶體系原料昂貴的價(jià)格因素之外,單酶體系的優(yōu)化難度與雙酶體系的優(yōu)化難度是不可同日而語的。以往,使用相對廉價(jià)的雙酶體系用到對靈敏度、特異性、抗污染、多項(xiàng)目有要求的常規(guī)血液篩查中被多數(shù)人認(rèn)為是不可行的。
1、本發(fā)明提供了一種基于雜交釣取原理,特異性同步捕獲提取HBV、HCV、HIV核酸的方法,其特征是選用了與后續(xù)擴(kuò)增檢測中一條引物序列相一致的生物素修飾的寡核苷酸作為核酸提取試劑的捕獲探針,其優(yōu)點(diǎn)是既避免了漏檢又不干擾PCR檢測理論上凡是PCR可以擴(kuò)增的片段均不會在標(biāo)本提取這一步由于捕獲探針序列設(shè)計(jì)的缺陷而漏掉,不僅因?yàn)橛糜跀U(kuò)增的引物序列的保守性與特異性經(jīng)受過嚴(yán)格的篩選及臨床實(shí)踐檢驗(yàn),更重要的是,凡是PCR可以擴(kuò)增的陽性標(biāo)本,一定可以為該探針?biāo)东@;另一方面,基于雜交捕獲法核酸純化的最后一步是高溫洗脫,難以避免生物素探針與鏈親和素包裹的磁珠分離而進(jìn)入洗脫液,有可能有μM級濃度的探針進(jìn)入洗脫液,如果探針的序列不是引物部分,就有可能作為冗余的寡核苷酸干擾PCR擴(kuò)增。反之,充其量不過是PCR反應(yīng)中引物比例不是等比例而已,這種特定情況下的PCR基本和等比例下的PCR沒有區(qū)別。另外,本項(xiàng)發(fā)明還提供了一種變通的通用捕集方法,即設(shè)計(jì)一段中間探針,無修飾的普通寡核苷酸(與后續(xù)的熒光PCR體系中的一條引物序列相一致)其3’端接有一連串的A如Oligo(d A)18-25,作為中間雜交的主干探針,使用生物素修飾的Oligo(d T)25作為通用雜交捕獲探針;中間探針的5’端核酸序列作為特異性識別標(biāo)本中的病毒核酸的“識別臂”,雜交并捕獲病毒核酸,而其3’端的Oligo(d A)18-25作為生物素化的Oligo(d T)25的識別位點(diǎn),為其所捕獲,最后雜交形成的復(fù)合體為鏈親和素包裹的磁珠所吸附,經(jīng)過洗滌液A,B,C的依次清洗,除去非特異雜交物及PCR/RT-PCR抑制物諸如糖類,變性蛋白,脂肪,高鹽或重金屬等雜質(zhì),最后磁珠進(jìn)入洗脫液經(jīng)過加熱,核酸模板從雜交復(fù)合體洗脫下來進(jìn)入洗脫液.而仍吸附著生物素化Oligo(d T)25廢磁珠經(jīng)儀器自動移走,洗脫液即可作為熒光PCR檢測的模板。該方法的優(yōu)點(diǎn)是生物素標(biāo)記的Oligo(d T)25是一致的,結(jié)合效率僅取決于設(shè)計(jì)的中間探針的雜交效率。本項(xiàng)發(fā)明還提供了另一種變通的方法,合成一條包含上述HBV、HCV、HIV特異探針序列的線形排列的寡核苷酸,作為一條三聯(lián)共同探針,中間可間隔有連接臂如3-8個(gè)T或A,生物素的修飾仍位于共同探針的5’端,這樣可以省去一些鏈親和素包裹磁珠的量,相應(yīng)可提高磁珠的量至過量,有利于檢測靈敏度的進(jìn)一步提高,尤其適合于磁珠使用量已經(jīng)飽和的測試(如多項(xiàng)目的提取),因?yàn)榇盆F吸附磁珠是有一個(gè)飽和度的,多于一定量就無法吸附干凈。本項(xiàng)發(fā)明并不排除上述方法的組合或復(fù)合組合,如合成一條包含上述HBV、HCV、HIV特異探針序列的線形排列的寡核苷酸,其3’端接有一連串的A如Oligo(d A)18-25,作為中間雜交的主干探針,使用生物素修飾的Oligo(d T)25作為通用雜交捕獲探針等。
使用上述雜交原理特異性提取純化的最顯著優(yōu)點(diǎn)在于提高了檢測的特異性,避免了PCR的假陽性。雖然PCR作為一種特異性極高的檢測方法,但是仍有一定比例的非污染因素造成的假陽性報(bào)道,排除了引物序列設(shè)計(jì)不合理的因素之后,被認(rèn)為與提取到的模板中含有大量的其它雜核酸有關(guān)。而特異性提取方法僅提取所研究的核酸從而避免了干擾因素。另外,該方法基于雜交原理,用于提取富含PCR抑制物質(zhì)如高血脂、高度溶血、黃疸、甚至肝素化血標(biāo)本均無干擾;而傳統(tǒng)的硅膠膜提取方法由于肝素與核酸相似均為富含負(fù)電荷的線形大分子,均易于吸附到硅膠膜上最后洗脫入洗脫液作為模板而抑制PCR/RT-PCR。常規(guī)血篩中由于日檢測標(biāo)本多、工作量大,即使PCR假陽性低到萬分之一,富含抑制物的標(biāo)本幾率為萬分之一,不到幾天就會遇到一個(gè),這樣既浪費(fèi)時(shí)間用于復(fù)測,又浪費(fèi)血,還有可能由于PCR抑制物存在導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。本項(xiàng)發(fā)明所公開的特異性同步提取方法結(jié)合下述的同步擴(kuò)增檢測試劑為血液篩查提供了雜交提取與TaqMan探針法PCR的雙重特異性保障,并有效去除了極其罕見標(biāo)本中可能含有的PCR抑制物,避免假陰性發(fā)生。
2、本發(fā)明還提供了一種新型RNA外標(biāo)(即陽性對照)和RNA內(nèi)對照(競爭性內(nèi)標(biāo))的快速加端生物素修飾引物的PCR構(gòu)建及純化方法,尚未見于任何文獻(xiàn)報(bào)道或?qū)嵗龖?yīng)用。其特點(diǎn)是快速、高效,RNA制品中沒有模板DNA的污染或其污染低到無法檢測。用于構(gòu)建RNA內(nèi)對照的引物,其5’加端并修飾有生物素,其中一條引物5’加端為附加有T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄啟動子識別位點(diǎn)序列??梢钥焖僦苽銻NA內(nèi)對照,當(dāng)PCR/RT-PCR獲得含有靶序列的DNA后,將鏈親和素包裹的磁珠直接加入,結(jié)合帶有生物素化的PCR產(chǎn)物,棄去液體,用PCR緩沖液洗滌2次后,加入轉(zhuǎn)錄緩沖液及T7 RNA聚合酶在37℃反應(yīng)50-60分鐘后用PCR緩沖液稀釋所得的轉(zhuǎn)錄出的RNA及原先的DNA模板復(fù)合物,熱變性后于冰上驟冷,DNA模板上帶有的生物素標(biāo)記被牢固結(jié)合于鏈親和素包裹的磁珠,而轉(zhuǎn)錄出的RNA不帶有生物素標(biāo)記而不能結(jié)合于磁珠,且由于變性使其與DNA模板完全分開,離心取上清或用磁鐵分離磁珠,剩下純凈的RNA制品,可以進(jìn)一步用乙醇沉淀濃縮純化。本方法用于構(gòu)建RNA外標(biāo)及RNA內(nèi)對照,只要一份陽性標(biāo)本提取物,一次PCR/RT-PCR或兩次PCR/RT-PCR,加上兩個(gè)小時(shí)的純化工作,即可制得純凈的RNA制品用作質(zhì)控。傳統(tǒng)的方法為PCR擴(kuò)增得到片段,純化后接入載體如T載體,挑陽性克隆提取質(zhì)粒并將重組質(zhì)粒酶切線性化,再純化,進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,再用DNA酶消化,再純化RNA。整個(gè)過程需要基因工程實(shí)驗(yàn)室的諸多設(shè)備,需要載體、感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶,需要培養(yǎng)細(xì)菌,整個(gè)流程耗時(shí)長。相比之下本發(fā)明公開的方法要簡捷快速得多,本方法最大的優(yōu)點(diǎn)還在于提供的RNA制品要遠(yuǎn)遠(yuǎn)純于傳統(tǒng)方法。因?yàn)槎唐蔚腄NA模板消化總是不徹底的,經(jīng)過多次消化及純化甚至使用柱法純化仍無濟(jì)于事,無RT對照PCR試驗(yàn)仍然檢測出數(shù)量可觀的DNA。而含有DNA的RNA對照很難真實(shí)地作為RNA病毒檢測的外對照或內(nèi)對照,因其不能真實(shí)反應(yīng)RT效率;如果以此為基礎(chǔ)建立定量對照,則存在定量不準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn),因?yàn)镽NA病毒檢測的是其RNA,而定量對照中含有DNA/RNA,勢必造成檢測不同步趨于失真,而難以作為病毒載量的定量質(zhì)控。
3、本發(fā)明還提出了設(shè)計(jì)綠色環(huán)保型試劑盒的基礎(chǔ)---陽性對照和內(nèi)對照的基因工程構(gòu)建法或PCR構(gòu)建法陽性對照的制備和內(nèi)對照的制備,陽性對照和內(nèi)對照的單獨(dú)使用或者混合使用-----根據(jù)客戶群的要求、儀器設(shè)備等硬件條件設(shè)計(jì)。本發(fā)明在生物安全性方面有顯著優(yōu)勢。
本發(fā)明根據(jù)所檢測病毒的核酸類型,體外制備無傳染性的核酸片段作為試劑盒的陽性對照(RNA外標(biāo))及內(nèi)對照(RNA內(nèi)標(biāo));陽性對照制備是將含有擴(kuò)增靶序列的核酸片段(如HBV為含有HBV C區(qū)的質(zhì)粒經(jīng)HCV為含有HCV 5’NCR區(qū)的質(zhì)粒,HIV為含有HIV GAG區(qū)的質(zhì)粒)經(jīng)酶切線性化DNA,再經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成RNA,并用DNA酶消化后純化得到RNA制品。當(dāng)然可使用本發(fā)明所述的方法快速構(gòu)建,這里只敘述一般的傳統(tǒng)方法的使用以強(qiáng)調(diào)作為綠色試劑盒的基礎(chǔ)不能在試劑盒中引入傳染性的因素,盡管其操作人員必須按照規(guī)程視為傳染性標(biāo)本的來操作。上述的HBV、HCV、HIV陽性對照既可單獨(dú)使用,又可混合使用,還可使用基因工程的方法將上述的三個(gè)片段組裝到一個(gè)載體中再線性化,體外轉(zhuǎn)錄后根據(jù)需要使用其DNA或RNA,或二者混合使用。
內(nèi)對照采用競爭性內(nèi)標(biāo),也就是與陽性對照一樣擁有相同的引物結(jié)合區(qū),但引物間隔區(qū)的核酸序列或排列不同,使其不能與檢測探針(陽性對照,可稱為外標(biāo)探針)結(jié)合,但能與內(nèi)標(biāo)探針結(jié)合。該內(nèi)對照可通過陽性對照模板的定點(diǎn)突變構(gòu)建,也可使用嵌段PCR的方法構(gòu)建。同樣,內(nèi)對照根據(jù)檢測病毒的核酸類型構(gòu)建成相應(yīng)的DNA或RNA,可單獨(dú)使用,也可混合使用,還可通過基因工程的方法或加端PCR的方法將三個(gè)內(nèi)對照片段組裝到一個(gè)片段中。總之,根據(jù)需要選擇最合適的方案,既講究內(nèi)對照對整個(gè)核酸提取過程、RT過程、PCR擴(kuò)增檢測過程的全程之有效監(jiān)控,又要講究它的引入不影響檢測的靈敏度;同時(shí)還要講究每個(gè)測試內(nèi)對照的引入量過高則不能真實(shí)反應(yīng)標(biāo)本受抑制的情況,如輕微抑制看不出;過低則內(nèi)對照的失敗率高,重復(fù)性差;一般選擇檢測靈敏度高2-20倍的內(nèi)對照量作為監(jiān)控,具體到實(shí)踐操作可以有變化。那么具體到應(yīng)用方案,將適當(dāng)量的內(nèi)對照加入到裂解液中參與核酸提取步驟中,這是一種標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施方案,但是并不排斥有的用戶直接在配置PCR反應(yīng)液時(shí)將內(nèi)對照加入,而在標(biāo)本提取過程中并不引入內(nèi)對照,這種作法也可實(shí)現(xiàn)標(biāo)本提取物中是否含有PCR/RT-PCR抑制物的有效監(jiān)測,因此也應(yīng)受到肯定。另外一些用戶由于熒光PCR儀為單通道檢測波長,無法使用內(nèi)標(biāo)探針檢測假陰性發(fā)生與否,雖然也可應(yīng)用本發(fā)明所提供的試劑盒,但對結(jié)果的判定應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。
4、本發(fā)明還提出一種實(shí)時(shí)同步多項(xiàng)檢測的基于TaqMan探針的RT-PCR擴(kuò)增法,其特點(diǎn)是使用單管的一步法RT-PCR雙酶體系試劑,多項(xiàng)檢測的項(xiàng)目既含DNA,又含RNA,所選用的抗污染體系為經(jīng)典的UNG-dUTP系統(tǒng)。所使用的一步法RT-PCR試劑為雙酶體系,即含逆轉(zhuǎn)錄酶和耐熱DNA聚合酶,逆轉(zhuǎn)錄酶不耐熱,RT溫度不能高于60℃,優(yōu)選方案為45-55℃,尤其是50℃。而該溫度下常規(guī)的基因工程制備的UNG(如目前市售的絕大多數(shù)的UNG)具有降解逆轉(zhuǎn)錄出來的含U的DNA(稱為U-DNA),因此不能使用該UNG,優(yōu)選方案為不耐熱的UNG如來自于嗜寒的海洋細(xì)菌BMTU3346(熱不穩(wěn)定的UNG/heat-labile UNGEC3.2.2.3Roche-來源于嗜寒菌BMTU3346、USB--源于Gadus morhau、Epicenter--源于Gadus morhau等,這些公司均有產(chǎn)品出售)。其特點(diǎn)是儲存于一定基質(zhì)中長期穩(wěn)定而一旦在PCR緩沖液中溫度為40℃時(shí)其半衰期僅兩分鐘,應(yīng)用時(shí)不需做特定的程序設(shè)置,因?yàn)樵赗T-PCR試劑和RNA模板的準(zhǔn)備工作中(混和時(shí))該酶就起作用,迅速將上次RT-PCR污染如殘留的U-DNA降解,最佳的反應(yīng)為20--30℃5-20分鐘。開始執(zhí)行RT-PCR時(shí),該UNG迅速失活而不影響RT或PCR。本發(fā)明的同步多項(xiàng)檢測試劑最突出的優(yōu)點(diǎn)在于該檢測試劑的優(yōu)秀的靈敏度和其特異性及各亞型的覆蓋率并且不同亞型擴(kuò)增效率近似等效。目前尚無一種報(bào)道使用雙酶單管RT-PCR體系引入抗污染方案并且能成功地用于多項(xiàng)對靈敏度有要求的同步檢測(即有DNA又有RNA),經(jīng)檢索只有一篇日本羅氏公司關(guān)于自動化的多檢Z05酶單酶RT-PCR TaqMan體系用于血篩的初步應(yīng)用報(bào)道,而其使用的為單酶體系,其缺點(diǎn)是顯而易見的,該體系價(jià)格昂貴且為該公司專利所有,難以推廣應(yīng)用;雙酶體系由于使用兩種廉價(jià)酶,由于兩種酶各自互成獨(dú)立體系,最優(yōu)反應(yīng)條件各不相同,而靈敏度高的雙酶單管RT-PCR體系一直在業(yè)界被公認(rèn)為具有一定難度的課題,同時(shí)其相對廉價(jià)的成本使得近年來相關(guān)學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。多項(xiàng)同檢同樣被認(rèn)為具有挑戰(zhàn)性的難題。
本發(fā)明優(yōu)秀的品質(zhì)很大程度上取決于所選用的HBV引物,HBV TaqMan探針;HCV引物,HCV TaqMan探針;HIV引物,HIV TaqMan探針序列。因此,本發(fā)明所公布的引物、探針序列毫無疑問應(yīng)當(dāng)受到所申請要求的權(quán)利保護(hù)之內(nèi)。
綜上所述,本發(fā)明在于提出一種測定HIV(艾滋病)、HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)病毒核酸的試劑盒,包括同步提取HBV-HCV-HIV核酸的磁珠提取試劑及一次性耗材,其中含有去抑制劑、裂解液、磁珠懸液、洗滌液A、洗滌液B、洗滌液C、洗脫液等,和HBV-HCV-HIV核酸擴(kuò)增試劑,其中含有RT-PCR反應(yīng)液、探針、酶混合物、陽性對照、陰性對照,和內(nèi)對照等。匹配儀器可使用上??迫A試驗(yàn)儀器系統(tǒng)所制造的KHB DP-1000、KHB DP-2000等,但不局限于這些,可能還有ROCHE的MagNA pure LC儀器、TECAN的與之相當(dāng)?shù)膬x器、ThermoLabsystem公司與之相當(dāng)?shù)膬x器、Beckman-Coulter與之相當(dāng)?shù)膬x器、ABI公司與之相當(dāng)?shù)膬x器等。
上述所提到的裂解液為裂解血清、血漿等體液標(biāo)本中病毒顆粒的硫氰酸胍溶液,具體為4-6M硫氰酸胍,20-50mM Tris,PH6.0-8.0,1-20%NP-40,1-20%TritonX-100,0.1-10%SDS,0.01-1μM生物素化探針(捕獲探針),1-10%聚合物等。其中捕獲探針為5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(對HBV)(SEQ.ID.NO.28),5’BIOTIN-agtacc aca agg cct ttcg-3’(對HCV)(SEQ.ID.NO.29),5’BIOTIN-cta tgt cac ttcccc ttg gtt ctc tc-3’(對HIV)(SEQ.ID.NO.30),可以委托上海生工或大連寶生物合成,純度為PAGE或HPLC;所述磁珠懸液為鏈親和素包裹的磁珠,具體為含有TWEEN20的超順磁材料的磁珠,表面包有均勻一層鏈親和素,直徑為0.1-10μM,含有BSA、NaN3等成分,如E.Merck公司、Roche公司、Invitrogen公司、Toyabo公司、Agowa公司、Chemogen公司、Promega公司、Seradyn公司生產(chǎn)的磁珠;所述洗滌液A、B、C均為含氯化鋰的緩沖溶液,具體為洗滌液ALiCI,Tris PH7.0,十二烷基磺酸鋰,防腐劑及Tween 20等分散劑,色素如品紅或其它染料等,其中LiCI的濃度可以從0.15M-3M,Tris濃度可以是10-100mM,PH可以為6.0-8.0,十二烷基磺酸鋰的濃度可以從1%,防腐劑可以是疊氮鈉或PROCLIN300、PROCLIN150、硫柳汞、抗生素等,Tween 20的濃度可以從0.001-0.1%;洗滌液B成分與洗滌液A相仿但不含十二烷基磺酸鋰,色素不同或不含色素;洗滌液C成分與洗滌液B相仿但LiCI的濃度降低(如為0.1-1M)且不含色素等;所述去抑制劑為含有蛋白酶的醇溶液,去抑制劑含有蛋白酶和甘油等;所述洗脫液為低鹽緩沖液或水,洗脫液DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液,加有Tween 20等分散劑和EDTA、NaN3、DTT等。
本發(fā)明中,標(biāo)本提取(裂解液中含有)所用的中間探針為5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(SEQ.ID.NO.15)和5’Biotin-Oligo(d T)25(SEQ.ID.NO.16)。
所述的引物乙肝病毒檢測引物針對乙型肝炎病毒核心區(qū)(C區(qū))的編碼基因中的一段基因片段,BF5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.1),BR5’-ttc tgc gacgcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.2)。丙肝病毒檢測引物針對丙型肝炎病毒基因序列的5’非翻譯區(qū),兩段引物序列為CF5’-cgg gag agc cat agt gg-3’(SEQ.ID.NO.4),CR5’-agtacc aca agg cct ttc g-3’(SEQ.ID.NO.5)。艾滋病毒檢測引物針對HIV gag區(qū)的基因序列,兩段引物序列為IF5’-gac atc aag cag cca tgc aaa t--3’(SEQ.ID.NO.7),IR5’-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(SEQ.ID.NO.8)。
所述探針為Taqman探針,包括內(nèi)標(biāo)(即內(nèi)對照)探針和三種病毒的檢測探針,分別由不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記或相同的熒光基團(tuán)標(biāo)記,但是至少內(nèi)標(biāo)探針的熒光基團(tuán)不同于檢測探針的熒光基團(tuán),而優(yōu)選的TaqMan探針為TaqMan-MGB探針或非熒光淬滅基團(tuán)的TaqMan探針,如BHQ-1或BHQ-2等。由于常規(guī)的TAMRA淬滅基團(tuán)為熒光淬滅基團(tuán),自身帶有熒光,在多重反應(yīng)中這種熒光干擾會相互疊加,而且其本身為一熒光基團(tuán)占據(jù)了儀器的一個(gè)通道,使多重檢測少去一重檢測;本發(fā)明中采用的探針序列為HBV探針為5′FAM(Ned)-cgacga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′(SEQ.ID.NO.3);HCV探針為5’FAM(Vic)-ctg cggaac cgg tga gta cac-NFQ-3’(SEQ.ID.NO.6);HIV探針為5’FAM(Fam)-cca tca atg aggaag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’(SEQ.ID.NO.9);內(nèi)標(biāo)探針為ICP5′Vic(Rox)-aac cttgga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’(SEQ.ID.NO.14)。
所述RT-PCR反應(yīng)液為含有d ATP、d CTP、d GTP、d UTP、緩沖液、KCI、防腐劑和穩(wěn)定劑、上述引物等;所述酶混合物為多酶組份體系,具體含有逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNasin、熱不穩(wěn)定的UNG、RT-PCR促進(jìn)劑(如熱休克蛋白、gp32蛋白等)和酶穩(wěn)定劑(如各種糖類分子和表面活性劑,DTT,蛋白酶抑制劑)等;具體為RT-PCR反應(yīng)液buffer中含1.8Mm d NTPs(含d UTP),3.6mM DTT,3.5mM MgCl2,各0.4μM各引物(BF、BR、CF、CR、IF、IR)等;酶混合物0.6U/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,0.6U/μl熱啟動Taq DNA聚合酶,1U/μl RNasin;0.1U/μl UNG(heat-labile)等;探針10μM探針HBV Probe,HCV Probe,HIV Probe,5μM內(nèi)標(biāo)探針,穩(wěn)定劑及緩沖液。
所述陽性對照為含有部分HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA片段的混合物,均為擴(kuò)增目的基因外側(cè)的一段基因DNA或RNA,其中HBV陽性對照僅由一段DNA不含HBV RNA,HCV陽性片段僅有一段RNA不含HCV DNA,HIV陽性片段僅有一段RNA不含HIV DNA,三者混合物適當(dāng)稀釋后保存于核酸穩(wěn)定液中作為試劑盒的陽性對照;所述的內(nèi)對照為競爭性內(nèi)標(biāo)RNA,包含有檢測項(xiàng)目相同的引物結(jié)合區(qū),但與檢測項(xiàng)目的探針結(jié)合區(qū)不同,不能結(jié)合檢測探針,卻能結(jié)合內(nèi)標(biāo)探針。例如內(nèi)對照可以是含有一段HIV引物結(jié)合區(qū)的體外轉(zhuǎn)錄RNA,但是探針區(qū)域經(jīng)過突變(PCR突變法或其它基因工程手段)不能識別HIV探針,而可以識別試劑盒中的內(nèi)標(biāo)探針,該內(nèi)對照為RNA,不含DNA;所述的內(nèi)標(biāo)探針為一段人工合成的與檢測項(xiàng)目毫無關(guān)系的寡核苷酸,其5’的TaqMan修飾熒光基團(tuán)不同任一陽性對照的檢測探針的熒光基團(tuán),便于區(qū)分同一份標(biāo)本的檢測結(jié)果和內(nèi)對照結(jié)果,并且要求標(biāo)本檢測結(jié)果為陰性時(shí)內(nèi)對照的結(jié)果必須為陽性。所述陰性對照為正常獻(xiàn)血員的血漿。
本發(fā)明試劑盒的標(biāo)本處理所采用的是磁珠提取法。該技術(shù)使用鏈親和素磁珠(基于核酸雜交原理),由于DNA和RNA均有相同的雜交性能,所以一般認(rèn)為該方法對DNA及RNA有相同或近似的得率,通過多次洗滌后去除雜質(zhì),最后將核酸在低鹽或水中洗脫下來作為核酸擴(kuò)增檢測的模板??墒褂肒HB DP-1000或2000儀器,同時(shí)也不排除其它自動化儀器上的使用。將該技術(shù)應(yīng)用于本診斷試劑盒后,一方面避免了傳統(tǒng)方法中使用酚、氯仿、異戊醇等有毒試劑,另一方面引入機(jī)械化操作,高通量自動化操作或半自動化操作,減少了人為操作因素對結(jié)果的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過短時(shí)間的培訓(xùn)可以很快掌握其操作流程并領(lǐng)會其技術(shù)要領(lǐng),還可以根據(jù)本發(fā)明提供的內(nèi)容,加以少許的修改變通形成新的技術(shù)流程及試劑盒,但這些均落入本發(fā)明所聲稱的權(quán)利保護(hù)范圍以內(nèi)。
本發(fā)明的試劑盒中擴(kuò)增檢測所使用的為單管的一步法RT-PCR TaqMan雙酶體系,該技術(shù)采用逆轉(zhuǎn)錄酶如AMV或MMLV或SuperscriptI/SuperscriptII/SuperscriptIII或Ominiscript,耐熱DNA聚合酶采用Taq酶或金牌Taq酶或所謂的熱啟動Taq酶(如帶有其單克隆抗體的或化學(xué)修飾的或配基寡核苷酸預(yù)先失活的Taq酶),還可選用其它耐熱聚合酶如Tfl酶等。選用的PCR buffer為TRIS-HCI或TRIS-H2SO4或TRIS-HOAc或Good’s緩沖液Bicine、Tricine,含有氯化鉀,還可含有硫酸銨、二甲亞砜、甲酰胺、甘油、TMAC、尿素、gp32蛋白、甜菜堿、牛血清白蛋白、非離子表面活性劑、TWEEN-20、TRITON X-100、NP-40、Brij-35、聚乙二醇、PVP、DTT、Aptamer、魚精蛋白、HSA、SSB、Alpha Casine、拓?fù)洚悩?gòu)酶1和2、蔗糖、甘露糖、山梨醇、海藻糖、阿拉伯糖、聚蔗糖、糖原、明膠、鮭精DNA、小牛胸腺DNA、rRNA、tRNA、PolyA RNA、OLIGO(dT)、自行合成劑MP等附加劑。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的用于實(shí)時(shí)同步多項(xiàng)檢測、基于TaqMan探針的RT-PCR擴(kuò)增法,其特點(diǎn)是設(shè)計(jì)引物和探針序列特征為艾滋病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒所特有。其中,乙肝病毒的兩段引物序列為BF5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.1),BR5’-ttctgc gac gcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.2),探針采用Taqman探針類型,即在探針堿基兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán),HBV探針序列為5′FAM(Ned)-cga cga ggc agg acccct aga aga a-NFQ3′(SEQ.ID.NO.3)。
丙型肝炎病毒的兩段引物序列為CF5’-cgg gag agc cat agt gg-3’(SEQ.ID.NO.4),CR5’-agt acc aca agg cct ttc g-3’(SEQ.ID.NO.5),探針采用Taqman探針類型,即在探針堿基兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán),HCV探針序列為5’FAM(Vic)-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ-3’(SEQ.ID.NO.6)。
艾滋病毒的兩段引物序列為IF5’-gac atc aag cag cca tgc aaat--3’(SEQ.ID.NO.7),IR5’-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(SEQ.ID.NO.8)。探針采用Taqman探針,即在探針堿基兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。Taqman探針序列為5’FAM(Fam)-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’(SEQ.ID.NO.9)。內(nèi)標(biāo)探針為ICP5′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag agagaa-NFQ3’(SEQ.ID.NO.14)。
在PCR擴(kuò)增時(shí),熒光PCR儀對每個(gè)反應(yīng)管產(chǎn)生的熒光信號進(jìn)行檢測,信號強(qiáng)度超過檢測器閥值的報(bào)告為陽性,此時(shí)的PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(稱為CT)與標(biāo)本中模板含量有負(fù)對數(shù)的關(guān)系,為儀器所自動紀(jì)錄。實(shí)時(shí)熒光PCR儀可實(shí)現(xiàn)標(biāo)本模板擴(kuò)增整個(gè)過程的熒光信號變化圖,可以十分形象地判斷標(biāo)本的陰、陽性并能區(qū)分其強(qiáng)弱。
由于核酸檢測操作復(fù)雜,整個(gè)流程易受多種因素影響而可能使擴(kuò)增失敗,使試劑盒操用人員可能由此得出檢測標(biāo)本為陰性的錯誤結(jié)論。為避免此種情形的發(fā)生,必須在每個(gè)檢測管中設(shè)立對照即內(nèi)對照,這樣即使由于極罕見的錯誤如某一標(biāo)本管忘加模板了,內(nèi)對照即可監(jiān)測出,或者PCR儀某一孔溫度效率有問題,內(nèi)對照也可監(jiān)測出來。
本發(fā)明的試劑盒最優(yōu)組成中使用內(nèi)對照質(zhì)控系統(tǒng),即在裂解液中加入特定序列的內(nèi)對照RNA,與標(biāo)本共同經(jīng)過裂解、純化、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、TaqMan檢測各步驟。該內(nèi)對照序列含一與待測標(biāo)本無關(guān)的核酸片斷(如完全人工設(shè)計(jì)的隨即序列片斷或檢測項(xiàng)目探針序列的重排或一段質(zhì)粒如PUC18序列等),兩端含試劑盒中所用的引物序列,故可與待測標(biāo)本共用同一對引物擴(kuò)增。所用內(nèi)對照探針為特異性針對該段無關(guān)序列的Taqman探針。如果試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)本、內(nèi)對照均為陰性,則表明試驗(yàn)失敗,試驗(yàn)結(jié)果無效;試驗(yàn)結(jié)果的其它情形則可以發(fā)生而且試驗(yàn)結(jié)果有效。不含內(nèi)對照的試劑盒盡管缺少了一道質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),但不影響正常使用。
本發(fā)明的試劑盒作為一種定性檢測的試劑,但并不排除可以作為定量檢測的試劑。由于本發(fā)明所采用的方法為TaqMan PCR,只需引入外標(biāo)準(zhǔn)品即可成為定量分析的試劑盒,雖然血液核酸篩查的意義在于定性分析,側(cè)重于試劑的靈敏度和特異性;臨床檢測及藥物療效監(jiān)控則側(cè)重于定量,載量試驗(yàn)考究定量的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明的試劑盒需配合核酸磁珠提取儀及熒光PCR儀使用。
本發(fā)明具有以下幾方面的優(yōu)勢(1)封閉性檢測,自動化程度高,減少了人工操作,避免了可能的污染和人為的誤差;(2)多種核酸病毒的同步提取,同步實(shí)時(shí)檢測;(3)靈敏度高,特異性好,精密度高,穩(wěn)定性好,便于操作;(4)適用于大規(guī)模高通量的血液篩查,如血液中心和血液制品生產(chǎn)企業(yè)開展核酸篩查,也可適用于大容量高效率的臨床核酸檢驗(yàn)。(5)整個(gè)流程時(shí)間短,能效比高。96個(gè)測試僅幾個(gè)小時(shí)就快速完成并報(bào)告可信度極高的結(jié)果。


圖1為Streptavidin磁珠捕獲核酸原理圖。
其中(A)為結(jié)合了生物索探針的磁珠結(jié)構(gòu)圖;(B)為雜交復(fù)合物為Streptavidin磁珠所捕獲,雜交復(fù)合物-磁珠被磁鐵所富集的示意圖;(C)為整個(gè)雜交捕獲磁珠的原理圖。
圖2為快速的DNA/RNA對照品構(gòu)建的示意3為快速的內(nèi)對照DNA/RNA質(zhì)控品構(gòu)建的示意圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 生物素修飾引物加端PCR法快速制備內(nèi)對照及陽性對照(綠色環(huán)保型試劑盒的基礎(chǔ)),1、HIV內(nèi)對照及陽性對照的制備如下1.1陽性對照的快速構(gòu)建委托上海生工合成以下引物,序列為5’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’(5’端斜體部分為T7 RNA pol啟動子區(qū),3’端為HIV GAG區(qū)的上游引物)(SEQ.ID.NO.10)5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(HIV GAG區(qū)的下游引物)(SEQ.ID.NO.11)取臨床上HIV核酸強(qiáng)陽性的標(biāo)本一份(或含HIV GAG基因的質(zhì)粒一份),用QIAamp ViralRNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸,嚴(yán)格按其使用說明書要求操作。抽提產(chǎn)物經(jīng)本發(fā)明建立的一步法RT-PCR試劑,用上述兩條引物擴(kuò)增,按下述循環(huán)參數(shù)操作50℃30分鐘---94℃4分鐘---94℃20秒、55℃20秒、循環(huán)30-40次,最后72℃5分鐘末延伸。
72℃30秒、可以取部分反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條160bp大小的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物中加入十倍體積的1XPCR Buffer,加入100-500μg的鏈親和素包裹的磁珠,混勻后室溫10分鐘,低速離心去上清,加入1XPCR Buffer 400μl洗滌磁珠2次,收集磁珠,使用RiboMAXTM Large ScaleRAN Production Systems-T7試劑盒(Promega公司)中的轉(zhuǎn)錄試劑如NTPs、Rnasin、DTT、轉(zhuǎn)錄緩沖液、T7 RNA Pol按照說明書加樣后,37℃轉(zhuǎn)錄1小時(shí),取出后同樣以1XPCRBuffer稀釋,但不洗滌而需要變性處理,可采用90℃熱變性或NaOH變性還可選用硫氰酸胍變性,最后離心將結(jié)合在磁珠上的模板DNA去除,取其上清于一新的潔凈離心管中,加入無水乙醇沉淀RNA,將轉(zhuǎn)錄基質(zhì)如NTPs等去除干凈,溶于RNA保護(hù)劑中。當(dāng)然還可使用DNA酶進(jìn)一步消化。所得到的RNA即為HIV RNA陽性對照母液,將其梯度稀釋于一定的液體中即可參與核酸提取、RT反應(yīng)、PCR TaqMan擴(kuò)增檢測全過程,作為試劑盒的生物安全的綠色的陽性對照。
1.2內(nèi)對照的構(gòu)建以上述構(gòu)建的陽性對照DNA為基礎(chǔ)(也可以一份臨床上HIV核酸強(qiáng)陽性的標(biāo)本為基礎(chǔ)),委托上海生工合成以下引物,序列為5’-AAC CTT GGA ACC TTG GAA CTG GAG AGA GAA gagtgcatccagtgcatgcag-3’(SEQ.ID.NO.12其5’端為HIV檢測探針序列重排而來,與檢測探針有相同的GC%,相似的Tm值;3’端為HIV陽性對照上毗鄰檢測探針3’端位置的核酸序列)5’-TTC TCT CTC CAG TTC CAA GGT TCC AAG GTT tct ctt taa tta aca ttt gc-3’(SEQ.ID.NO.13其5’端與SEQ.ID.NO.12的5’端互補(bǔ);3’端與HIV陽性對照上毗鄰檢測探針5’端位置的核酸序列互補(bǔ))以陽性對照DNA為PCR模板,分別以SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.13為一對引物和SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12為另一對引物去擴(kuò)增,使用的循環(huán)參數(shù)為94℃2分鐘---94℃10秒、45℃15秒、循環(huán)20次,最后72℃5分鐘末延伸。
72℃10秒、將上述兩種擴(kuò)增產(chǎn)物純化后混和并梯度稀釋,分別作為下一輪PCR的模板。該輪PCR使用SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.11作為引物對擴(kuò)增,程序同上,循環(huán)數(shù)增加到30-40個(gè)。此輪擴(kuò)增產(chǎn)物即為內(nèi)對照DNA,可以取部分產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條160bp(含有的HIVDNA134BP,另含T7RNA啟動子序列27BP)大小的條帶。同樣其磁珠純化、轉(zhuǎn)錄、保存均同上述的陽性對照(RNA),最后制備得HIV內(nèi)對照RNA純品??蓞⒖嫉腍IV序列如下,可參考的原理圖如附圖3。
gaca tcaagcagcc atgcaaatgt taattaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatagagtgcatcca gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatag(SEQ.ID.NO.25)2、HCV內(nèi)對照及陽性對照的制備如下2.1陽性對照的快速構(gòu)建委托上海生工合成以下引物,序列為5’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG cgg gag agc cat agt gg-3’(5’端斜體部分為T7 RNA pol啟動子區(qū),3’端為HCV NCR區(qū)的上游引物)(SEQ.ID.NO.17)5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’(HCV NCR區(qū)的下游引物)(SEQ.ID.NO.18)取臨床上HCV核酸強(qiáng)陽性的標(biāo)本一份(或含HCV 5’NCR的質(zhì)粒一份),用QIAamp ViralRNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸,嚴(yán)格按其使用說明書要求操作。抽提產(chǎn)物經(jīng)本一步法RT-PCR試劑,用上述兩條引物擴(kuò)增,按下述循環(huán)參數(shù)操作50℃30分鐘---94℃4分鐘---94℃20秒、50℃20秒、循環(huán)30-40次,最后72℃5分鐘末延伸。
72℃30秒、可以取部分反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條187bp亮帶。同1.1操作制備得到生物安全的綠色的陽性對照。
2.2內(nèi)對照的構(gòu)建以上述構(gòu)建的陽性對照DNA為基礎(chǔ),委托上海生工合成以下引物,序列為5’-AAC CTT GGA ACC TGG ACC GGG CGGAATTGCCAGGACGACCGGG-3’(SEQ.ID.NO.19其5’端為HCV檢測探針序列重排而來,與檢測探針有相同的GC%,相似的Tm值;3’端為HCV陽性對照上毗鄰檢測探針3’端位置的核酸序列)5’-CCC GGT CCA GGT TCC AAG GTT accactatggctctcc-3’(SEQ.ID.NO.20其5’端與SEQ.ID.NO.19的5’端互補(bǔ);3’端與HCV陽性對照上毗鄰檢測探針5’端位置的核酸序列互補(bǔ))以陽性對照DNA為PCR模板,分別以SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.20為一對引物和SEQ.ID.NO.18、SEQ.ID.NO.19為另一對引物去擴(kuò)增,使用的循環(huán)參數(shù)為94℃2分鐘---94℃10秒、45℃15秒、循環(huán)20次,最后72℃5分鐘末延伸。
72℃10秒、將上述兩種擴(kuò)增產(chǎn)物純化后混和并梯度稀釋,分別作為下一輪PCR的模板。該輪PCR使用SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18作為引物對擴(kuò)增,程序同上,循環(huán)數(shù)增加到30-40個(gè)。此輪擴(kuò)增產(chǎn)物即為內(nèi)對照DNA,可以取部分產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條187bp大小的條帶。同樣其磁珠純化、轉(zhuǎn)錄、保存均同上述的陽性對照(RNA),最后制備得HCV內(nèi)對照RNA純品??蓞⒖嫉腍CV序列如下,可參考的原理圖如附圖3。
C GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAGGACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCCGCGAGACTGC TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACT(SEQ.ID.NO.26)3、HBV內(nèi)對照及陽性對照的制備如下3.1陽性對照的快速構(gòu)建委托上海生工合成以下引物,序列為5’AGG GAG acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.21)(5’端斜體部分為無關(guān)序列,防止DNA降解從5’開始致使陽性對照的引物結(jié)合區(qū)降解,3’端為HBV的上游引物)5’AGG GAG ttc tgc gac gcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.22)(5’端斜體部分為無關(guān)序列,3’端為HBV的下游引物)
取臨床上HBV核酸強(qiáng)陽性的標(biāo)本一份(或含HBV DNA的質(zhì)粒一份),用QIAamp ViralMini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸,嚴(yán)格按其使用說明書要求操作。抽提產(chǎn)物經(jīng)本試驗(yàn)室建立的PCR試劑,用上述兩條引物擴(kuò)增,按下述循環(huán)參數(shù)操作94℃2分鐘---94℃20秒、50℃20秒、循環(huán)30-40次,最后72℃5分鐘末延伸。
72℃30秒、可以取部分反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條131bp亮帶。使用膠回收純化試劑盒將電泳條帶回收純化即為HBV陽性對照母液,以DNA/RNA保存液梯度稀釋制備得到生物安全的綠色穩(wěn)定、合適濃度的陽性對照。
3.2內(nèi)對照的構(gòu)建以上述構(gòu)建的陽性對照DNA為基礎(chǔ),委托上海生工合成以下引物,序列為5’-TACGACGACGACGACGACGACGAGA gaactccc tcgcctcgc-3’(SEQ.ID.NO.23其5’端為HBV檢測探針序列重排而來,與檢測探針有相同的GC%,相似的Tm值;3’端為HBV陽性對照上毗鄰檢測探針3’端位置的核酸序列)5’-TCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTA tctaacaacagtagtttc-3’(SEQ.ID.NO.24其5’端與SEQ.ID.NO.23的5’端互補(bǔ);3’端與HBV陽性對照上毗鄰檢測探針5’端位置的核酸序列互補(bǔ))以陽性對照DNA為PCR模板,分別以SEQ.ID.NO.21、SEQ.ID.NO.24為一對引物和SEQ.ID.NO.23、SEQ.ID.NO.22為另一對引物去擴(kuò)增,使用的循環(huán)參數(shù)為94℃2分鐘---94℃10秒、45℃15秒、循環(huán)20次,最后72℃5分鐘末延伸。
72℃10秒、將上述兩種擴(kuò)增產(chǎn)物純化后混和并梯度稀釋,分別作為下一輪PCR的模板。該輪PCR使用SEQ.ID.NO.21和SEQ.ID.NO.22作為引物對擴(kuò)增,程序同上,循環(huán)數(shù)增加到30-40個(gè)。此輪擴(kuò)增產(chǎn)物即為內(nèi)對照DNA,可以取部分產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條131bp大小的條帶。使用膠回收純化試劑盒將電泳條帶回收純化即為HBV內(nèi)對照DNA母液,以本公司的DNA/RNA保存液梯度稀釋制備得到生物安全的綠色穩(wěn)定、合適濃度的HBV內(nèi)對照DNA??蓞⒖嫉腍BV序列如下,可參考的原理圖如附圖3。
tatagaccac caaatgcccc tatcttatca acacttccgg aaactactgttgttagacga cgaggcagga cccctagaag aagaactccc tcgcctcgca gacgaaggtctcaatcgccg cgtcgcagaa gatctcaatc
(SEQ.ID.NO.27)實(shí)施例2 標(biāo)本處理單元核酸提取的磁珠法及試劑配制基于雜交原理的標(biāo)本處理單元試劑組成包括裂解液4.8M硫氰酸胍,50mM Tris,PH7.0,NP-40,Triton X-100,SDS,生物素化探針,聚合物等。其中捕獲探針為5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(HBV)5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’(HCV)5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(HIV)磁珠懸液1mg/ml鏈親和素包裹的磁珠,含有防腐劑及Tween 20等分散劑洗滌液ALiCI,Tris PH7.0,十二烷基磺酸鋰,防腐劑及Tween 20等分散劑,色素等洗滌液BLiCI,Tris PH7.0,防腐劑及Tween 20等分散劑,色素等洗滌液CLiCI,Tris PH7.0,防腐劑及Tween 20等分散劑,色素等去抑制劑含有蛋白酶和甘油等洗脫液DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液,加有Tween 20等分散劑和EDTA、NaN3、DTT等內(nèi)參照約含有40000拷貝/ml內(nèi)參照RNA的溶液,使用時(shí)將其以1∶20的比例加入到裂解液中,在裂解液中的內(nèi)對照的濃度約為2000拷貝/ml,每個(gè)測試加入0.1ml的裂解液也就是200拷貝內(nèi)對照參與提取。擴(kuò)增由于僅取1/5的模板量參與RT-PCRTaqMan檢測,所以每個(gè)檢測管中內(nèi)對照RNA的參入量低于40拷貝。
操作流程取六塊專用96孔板(試劑盒提供),編號為①②③④⑤⑥。
在板①中用排槍或普通移液器加入20μl去抑制劑,加入待測標(biāo)本血清或血漿100μl,反復(fù)吸打1次左右,每加一個(gè)標(biāo)本換一個(gè)吸頭,注意應(yīng)使用帶濾芯的吸頭;最后加入裂解液100μl。
在板②中用排槍或普通移液器加入100μl磁珠懸液,注意使用磁珠懸液前一兩分鐘將其上下顛倒數(shù)次直到磁珠分散均勻不形成任何肉眼可見的沉淀為止。
在板③中用排槍或普通移液器加入200μl洗滌液A;板④中加入200μl洗滌液B;板⑤中加入200μl洗滌液C;板⑥中加入80μl洗脫液。
將上述六塊板分別按編號順序移入KHB DP-2000儀器操作艙的1-6號位,并在第4位的板④上移入專用板的深孔Tip Comb。
啟動KHB DP-2000儀上的“Start”鍵,使其執(zhí)行程序。
運(yùn)行大約需要70分鐘,結(jié)束后取出板①-⑥,其中板⑥中的液體即為核酸模板,板①-⑤為廢板,經(jīng)消毒后統(tǒng)一廢棄。
實(shí)施例3 核酸擴(kuò)增檢測單元單管的雙酶一步法RT-PCR TaqMan探針多檢體系的模式及試劑配制核酸擴(kuò)增檢測單元采用熒光TaqMan PCR,要求配合熒光PCR儀使用。其組份包括如下RT-PCR反應(yīng)液buffer中含1.8Mm d NTPs(含d UTP),3.6mM DTT,3.5mM MgCl2,引物BF、BR、CF、CR、IF、IR各0.4μM。
酶混合物0.6U/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,0.6U/μl熱啟動Taq DNA聚合酶,1U/μl RNasin;0.1U/μl UNG(heat-labile)等。
探針10μM探針HBV Probe,HCV Probe,HIV Probe,5μM內(nèi)標(biāo)探針,穩(wěn)定劑及緩沖液。
試劑配比及配制按照每測試RT-PCR反應(yīng)液∶酶混合物∶探針=8∶6∶1的比例配制成15μl/測試,加入核酸模板15μl即可上機(jī)擴(kuò)增實(shí)時(shí)檢測。
以ABI7500為例,儀器的擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置如下循環(huán)參數(shù)設(shè)定(可參照各類儀器的操作軟件進(jìn)行設(shè)置)

實(shí)施例4 檢測模式之一的應(yīng)用根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)硬件條件,本實(shí)例的用戶所使用的熒光PCR儀為雙通道的MJ Opticon2熒光PCR儀,優(yōu)選的檢測探針均用FAM熒光標(biāo)記,內(nèi)標(biāo)探針使用HEX標(biāo)記,內(nèi)對照優(yōu)選加入到RT-PCR試劑配制中而不在裂解液里加入。而RT-PCR/PCR反應(yīng)液中僅含各個(gè)檢測項(xiàng)目的引物,探針則每個(gè)項(xiàng)目為該項(xiàng)目的檢測探針和內(nèi)標(biāo)探針的混合物,內(nèi)對照選用包含三個(gè)檢測項(xiàng)目引物結(jié)合區(qū)、中間探針結(jié)合區(qū)為內(nèi)標(biāo)探針結(jié)合序列的共同的內(nèi)對照RNA。
待測標(biāo)本編號為P1,P2,P3..PN,另有2個(gè)對照品(陰性對照和陽性對照)參與平行實(shí)驗(yàn)。待測標(biāo)本中含有很低拷貝數(shù)的HBV DNA或HCV RNA或HIV RNA。其中弱陽性標(biāo)本P1為HBV DNA 1000拷貝/ML、P2為HCV RNA 1000拷貝/ML、P3為HIV RNA 1000拷貝/ML、P4系P1用陰性血漿十倍稀釋而來,P5系P2用陰性血漿十倍稀釋而來,P6系P3用陰性血漿十倍稀釋而來;P7系P1用陰性血漿二十倍稀釋而來,P8系P2用陰性血漿二十倍稀釋而來,P9系P3用陰性血漿二十倍稀釋而來;P10系P1用陰性血漿四十倍稀釋而來,P11系P2用陰性血漿四十倍稀釋而來,P12系P3用陰性血漿四十倍稀釋而來。

結(jié)果檢測標(biāo)本的內(nèi)對照均為陽性,而HBV標(biāo)本在載量為1000拷貝/ML、100拷貝/ML、50拷貝/ML、25拷貝/ML時(shí)均為陽性,而陰性對照、稀釋血漿等檢測結(jié)果為陰性。HCV標(biāo)本在載量為1000拷貝/ML、100拷貝/ML、50拷貝/ML時(shí)均為陽性,而25拷貝/ML、陰性對照、稀釋血漿等檢測結(jié)果為陰性。HIV標(biāo)本在載量為1000拷貝/ML、100拷貝/ML、50拷貝/ML、25拷貝/ML時(shí)均為陽性,而陰性對照、稀釋血漿等檢測結(jié)果為陰性。
實(shí)施例5 檢測模式之二的應(yīng)用本檢測模式為本發(fā)明的最佳體現(xiàn)選用四色乃至五色的熒光PCR儀如ABI7500,檢探針分別用FAM、VIC、NED熒光標(biāo)記,內(nèi)標(biāo)使用ROX標(biāo)記。內(nèi)對照在裂解液里加入。T-PCR反應(yīng)液中含各個(gè)檢測項(xiàng)目的引物,探針含各個(gè)項(xiàng)目的檢測探針和內(nèi)標(biāo)探針。內(nèi)對照選用包含HIV引物結(jié)合區(qū)、中間探針結(jié)合區(qū)為內(nèi)標(biāo)探針結(jié)合序列的內(nèi)對照RNA。標(biāo)本同實(shí)施例3,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與實(shí)施例3相同,但質(zhì)控更為嚴(yán)格,操作更為方便,檢測模式與標(biāo)本提取更加匹配,檢測通量更高。
實(shí)施例6 檢測模式之三的應(yīng)用本檢測模式為實(shí)施例3與4的折衷方案儀器可用雙色熒光PCR儀,檢測的通量及嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)控與實(shí)施例4相同,但一旦出來陽性擴(kuò)增結(jié)果,不能區(qū)分哪個(gè)檢測項(xiàng)目為陽性。其優(yōu)選的要點(diǎn)為檢測探針均用FAM熒光標(biāo)記,內(nèi)標(biāo)使用HEX或VIC或NED或JOE或TET等標(biāo)記。內(nèi)對照在裂解液里加入。RT-PCR反應(yīng)液中含各個(gè)檢測項(xiàng)目的引物,探針含各個(gè)項(xiàng)目的檢測探針和內(nèi)標(biāo)探針。內(nèi)對照選用包含HIV引物結(jié)合區(qū)、中間探針結(jié)合區(qū)為內(nèi)標(biāo)探針結(jié)合序列的內(nèi)對照RNA。
標(biāo)本同實(shí)施例3,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與實(shí)施例3相同,質(zhì)控嚴(yán)格,操作方便,檢測模式與標(biāo)本提取相匹配,檢測通量高,但是HBV陽性或HCV陽性或HIV陽性或兩種同時(shí)陽性乃至三種共同陽性均不能知道。然而這在血液篩查中并不算得什么缺點(diǎn),因?yàn)檠Y的目的在于篩選出不合格的血液,不管哪種病毒核酸陽性或聯(lián)合陽性均為淘汰的血液。
實(shí)施例7 檢測模式之四的應(yīng)用合成下列核酸作為HBV、HCV、HIV、內(nèi)對照RNA的共同中間(捕獲)探針5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(99bp)純度PAGE或HPLC(SEQ.ID.NO.15)生物素化探針5’Biotin-Oligo(d T)25(SEQ.ID.NO.16)。
上述兩種探針同時(shí)配制在裂解液中,且有固定的比例,共同中間(捕獲)探針的量的優(yōu)化對提取靈敏度有決定性的作用。
試劑均同本發(fā)明的實(shí)施例2.1檢測流程同實(shí)施例2(標(biāo)本提取),檢測模式按實(shí)施例4,結(jié)果與實(shí)施例4檢測結(jié)果完全相同。
根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容,本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員無需過多實(shí)驗(yàn)即可對本發(fā)明所要求保護(hù)的血液篩查項(xiàng)目的試劑盒進(jìn)行實(shí)施,并達(dá)到預(yù)期效果。本發(fā)明公開的實(shí)施例僅是對本發(fā)明進(jìn)行描述,但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員用顯而易見的相似替代物或改造,或用某些在化學(xué)上或生物上結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的制劑替代在此描述的制劑,或?qū)Ρ景l(fā)明的有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行變動,但不超出本發(fā)明的精神、范圍和思想,均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
序列表SEQ.ID.NO.15’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’,SEQ.ID.NO.25’-ttc tgc gac gcg gcg a-3’,SEQ.ID.NO.35′FAM-cga cga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′,SEQ.ID.NO.45’-cgg gag agc cat agt gg-3’,SEQ.ID.NO.55’-agt acc aca agg cct ttc g-3’,SEQ.ID.NO.65′FAM-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ3′,SEQ.ID.NO.75′-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’,SEQ.ID.NO.85′-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’,SEQ.ID.NO.95′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’,SEQ.ID.NO.105’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’,SEQ.ID.NO.115’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’,SEQ.ID.NO.125’-AAC CTT GGA ACC TTG GAA CTG GAG AGA GAA gagtgcatccagtgcatgcag-3’,SEQ.ID.NO.135’-TTC TCT CTC CAG TTC CAA GGT TCC AAG GTT tct ctt taa tta aca ttt gc-3’,SEQ.ID.NO.145′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’,
SEQ.ID.NO.155’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′,SEQ.ID.NO.165’Biotin-Oligo(d T)25SEQ.ID.NO.175’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG cgg gag agc cat agt gg-3’SEQ.ID.NO.185’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’SEQ.ID.NO.195’-AAC CTT GGA ACC TGG ACC GGG CGGAATTGCCAGGACGACCGGG-3’,SEQ.ID.NO.205’-CCC GGT CCA GGT TCC AAG GTT accactatggctctcc-3’,SEQ.ID.NO.215’AGG GAG acc acc aaa tgc ccc tat-3’,SEQ.ID.NO.225’AGG GAG ttc tgc gac gcg gcg a-3’,SEQ.ID.NO.235’-TACGACGACGACGACGACGACGAGA gaactccc tcgcctcgc-3’,SEQ.ID.NO.245’-TCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTA tctaacaacagtagtttc-3’,SEQ.ID.NO.25gaca tcaagcagcc atgcaaatgt taattaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatagagtgcatcca gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatagSEQ.ID.NO.26C GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAGGACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCCGCGAGACTGC TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACTSEQ.ID.NO.275′FAM-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’,SEQ.ID.NO.28
5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’,SEQ.ID.NO.295’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttcg-3’,SEQ.ID.NO.305’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’。
權(quán)利要求
1.一種同步擴(kuò)增檢測肝炎及艾滋病毒核酸的方法,其特征在于包括基于雜交原理,選用磁珠作為自動化介質(zhì),采用磁珠分離儀進(jìn)行特異性同步捕獲HIV、HBV和HCV病毒核酸的方法,其中,選用與后續(xù)擴(kuò)增檢測中一條引物序列相一致的生物素修飾的寡核苷酸作為核酸提取試劑的捕獲探針;或者,設(shè)計(jì)一段中間探針,與后續(xù)的熒光PCR體系中的一條引物序列相一致的無修飾的寡核苷酸,在其3’端連接一串Oligo(dA)18-25,作為中間雜交的主干探針,使用生物素修飾的Oligo(dT)25作為通用雜交捕獲探針;或者,合成一條包含上述HBV、HCV、HIV特異探針序列的線形排列的寡核苷酸,作為一條三聯(lián)共同探針,其中間間隔連接3-8個(gè)T或A,生物素的修飾仍位于共同探針的5’端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于還包括RNA外標(biāo)和RNA內(nèi)對照的快速加端PCR構(gòu)建和純化方法,其中,用于構(gòu)建RNA內(nèi)對照或RNA外標(biāo)的引物,其5’加端并修飾生物素,其中一條引物5’加端為附加有T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄啟動子識別位點(diǎn)序列,當(dāng)PCR/PT-PCR獲得含有靶序列的DNA后,將鏈親和素包裹的磁珠直接加入,結(jié)合帶有生物素的PCR產(chǎn)物,棄去液體,用PCR緩沖液洗滌2次后,加入轉(zhuǎn)錄緩沖液及T7 RNA聚合酶,在37℃反應(yīng)50-60分鐘,然后用PCR緩沖液稀釋所得的轉(zhuǎn)錄出的RNA及原先的DNA模板復(fù)合物,熱變性后于冰上驟冷,DNA模板上帶有的生物素標(biāo)記被牢固結(jié)合于鏈親和素包裹的磁珠,而轉(zhuǎn)錄出的RNA不帶有生物素標(biāo)記而不能結(jié)合于磁珠,且由于變性使其與DNA模板完全分開,離心取上清或用磁鐵分離磁珠,剩下純凈的RNA制品,進(jìn)一步用乙醇沉淀濃縮純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于還包括試劑盒的RNA外標(biāo)和RNA內(nèi)對照的基因工程構(gòu)建法或PCR構(gòu)建法;其中,RNA外標(biāo)制備是將含有擴(kuò)增靶序列的核酸片斷經(jīng)酶切得到線性化DNA,再經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成RNA,并用DNA酶消化后經(jīng)純化得到RNA制品,這里的核酸片段,對于HBV為含有HBV C區(qū)的質(zhì)粒,對于HCV為含有HCV 5’NCR區(qū)的質(zhì)粒,對于HIV為含有HIV GAG區(qū)的質(zhì)粒;上述的HBV、HCV和HIV的陰性對照單獨(dú)使用或者混合使用,或者使用基因工程方法將上述3個(gè)核酸片段組裝到一個(gè)載體中再線性化,體外轉(zhuǎn)錄使用其DNA或RNA,或者2者混合使用;RNA內(nèi)標(biāo)采用陽性對照模板的定點(diǎn)突變構(gòu)建,或使用嵌段PCR方法構(gòu)建;并根據(jù)檢測病毒的核酸類型構(gòu)建成相應(yīng)的DNA或RNA,單獨(dú)使用或混合使用,或通過基因工程方法或加端PCR方法將3個(gè)內(nèi)對照片段組裝到一個(gè)片段中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法,其特征在于還包括實(shí)時(shí)同步多項(xiàng)檢測的基于TaqMan探的RT-PCR擴(kuò)增法,其中使用單管的一步法RT-PCR雙酶體系試劑,多項(xiàng)檢測的項(xiàng)目含有DNA和RNA,所選用的抗污染體系的為經(jīng)典的UNG-dUTP系統(tǒng);這里的雙酶體系為含有逆轉(zhuǎn)酷和耐熱DNA聚合酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述構(gòu)建RNA外標(biāo)和RNA內(nèi)對照的引物如下(1)HIV的陽性對照引物為SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.11,內(nèi)對照引物為SEQ.ID.NO.12和SEQ.ID.NO.13;(2)HCV的陽性對照引物為SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18,內(nèi)對照引物為SEQ.ID.NO.19和SEQ.ID.NO.20;(3)HBV的陽性對照引物為SEQ.ID.NO.21和SEQ.ID.NO.22,內(nèi)對照引物為SEQ.ID.NO.23和SEQ.ID.NO.24。
6.一種檢測艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎核酸的試劑盒,其特征在于包含去抑制劑、裂解液、磁珠懸液、洗滌液、洗脫液、內(nèi)對照、RT-PCR反應(yīng)液、酶混合物、熒光探針、陽性對照、陰性對照,其中,所述的去抑制劑為含蛋白酶的醇溶液;所述裂解液為裂解血清、血漿標(biāo)本中病毒顆粒的硫氰酸胍溶液;所述洗滌液為含氯化鈉的溶液;所述洗脫液為低鹽緩沖液或水;所述磁珠懸液含鏈親和素包裹磁珠;所述RT-PCR反應(yīng)液含HBV、HCV、HIV引物和dNTP及緩沖鹽溶液;所述熒光探針為Taqman探針;所述酶混合物為多酶組份體系;所述陽性對照為含有HBV、HCV、HIV擴(kuò)增目的基因外側(cè)的一段DNA或RNA;所述陰性對照為正常獻(xiàn)血員的血漿;所述內(nèi)對照為競爭性內(nèi)標(biāo)RNA,包含有檢測項(xiàng)目相同的引物結(jié)合區(qū),但與檢測項(xiàng)目的探針結(jié)合區(qū)不同,不能結(jié)合檢測探針卻能結(jié)合內(nèi)標(biāo)探針;其中PT-PCR反應(yīng)液中HBV引物為5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’,5’-ttc tgc gac gcg gcg a-3’,HBV的Taqman探針為5′FAM-cga cga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′,HCV引物為5’-cgg gag agc cat agt gg-3’,5’-agt acc aca agg cct ttc g-3’,HCV的Taqman探針為5′FAM-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ3′,HIV引物為5′-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’,5′-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’,HIV的Taqman探針為5′FAM-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’,內(nèi)標(biāo)探針為SEQ.ID.NO.14。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于使用與后續(xù)PCR檢測引物一致的生物素化寡核苷酸序列作為探針以雜交原理去同步提取純化血清或血漿標(biāo)本中的HBV DNA、HCVRNA、HIV RNA的磁珠法標(biāo)本處理試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于使用逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶雙酶單管一步法RT-PCR的TaqMan多項(xiàng)同檢體系,檢測項(xiàng)目包含DNA及RNA病毒;含有UNG-dUTP防污染組分;還含有內(nèi)對照作為每個(gè)測試的全程監(jiān)測質(zhì)控。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于使用生物素修飾的加端引物快速構(gòu)建、純化內(nèi)對照RNA、陽性對照RNA純RNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于所說的裂解液中含有標(biāo)本提取所用的生物素探針對于HBV為5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’,對于HCV為5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’,對于HIV為5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于所說裂解液中含有標(biāo)本提取所用的中間探針5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(SEQ.ID.NO.15)和5’Biotin-Oligo(dT)25(SEQ.ID.NO.16)。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于裂解液的組成為4-6M硫氰酸胍,20-50mM Tris,PH6.0-8.0,1-20%NP-40,1-20%Triton X-100,0.1-10%SDS,0.01-1μM生物素化探針,1-10%聚合物;其中捕獲探針為5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’對HBV,5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttcg-3’(對HCV),5’BIOTIN-cta tgt cacttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(對HIV),純度為PAGE或HPLC;所述磁珠懸液為含有TWEEN20的超順磁材料的磁珠,表面包有均勻一層鏈親和素,直徑為0.1-10μM,含有BSA、NaN3成分,所述去抑制劑為含有蛋白酶的醇溶液;所述洗脫液為低鹽緩沖液或水,洗脫液DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液,加有Tween 20分散劑和EDTA、NaN3和DTT。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于所述RT-PCR反應(yīng)液為buffer中含1.8Mm d NTPs,3.6mM DTT,3.5mM MgCl2,引物BF、BR、CF、CR、IF、IR各0.4μM。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于所述的酶混合液含有逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNasin、熱不穩(wěn)定的UNG、RT-PCR促進(jìn)劑和酶穩(wěn)定劑。
全文摘要
本發(fā)明屬診斷試劑核酸診斷技術(shù)領(lǐng)域,具體為一種同步提取并同步擴(kuò)增均相檢測肝炎和艾滋病毒核酸的方法和試劑盒。該方法包括以磁珠作為自動化介質(zhì),特異性同步捕獲HBV、CHV、HIV核酸的方法。RNA外標(biāo)和RNA內(nèi)標(biāo)快速加端生物素引物的PCR構(gòu)建和純化,實(shí)時(shí)同步多項(xiàng)檢測的基于Tagman探針的T-PCR擴(kuò)增法等。相應(yīng)的試劑盒包括去抑制劑、裂解液、磁珠懸液、洗滌液、洗脫液、內(nèi)對照、RT-PCR反應(yīng)液、酶混合物、熒光探針、陽性對照、陰性對照。本發(fā)明的的特點(diǎn)是單管操作,封閉性檢測,自動化程度高,多種病毒核酸同步提取,同步實(shí)時(shí)檢測;靈敏度高,特異性好,精密度高;適用于大規(guī)模血液篩查和大容量的臨床檢測。
文檔編號C12Q1/70GK1940087SQ200610030229
公開日2007年4月4日 申請日期2006年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者周科隆, 華錦彪, 王縵 申請人:上??迫A生物工程股份有限公司
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